Bicinchoninic acid assay
বাইসিনকোনিনিক অ্যাসিড অ্যাসে (বিসিএ অ্যাসে), যা স্মিথ অ্যাসে নামেও পরিচিত, পিয়ার্স কেমিক্যাল কোম্পানির পল কে স্মিথের পরে, যা এখন থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিকের অংশ, লরি প্রোটিন অ্যাসে, ব্র্যাডফোর্ড প্রোটিন অ্যাসে বা বায়ুরেট বিকারক-এর মতো একটি দ্রবণে প্রোটিনের মোট ঘনত্ব নির্ধারণের জন্য একটি বায়োকেমিক্যাল অ্যাসে। মোট প্রোটিনের ঘনত্ব প্রোটিন ঘনত্বের অনুপাতে নমুনা দ্রবণের রঙ পরিবর্তন করে সবুজ থেকে বেগুনি রঙে প্রদর্শিত হয়, যা পরে কালারিমেট্রিক কৌশল ব্যবহার করে পরিমাপ করা যেতে পারে। বিসিএ পরীক্ষা 1989 সালে পিয়ার্স কেমিক্যাল কোম্পানি দ্বারা পেটেন্ট করা হয়েছিল এবং পেটেন্টের মেয়াদ 2006 সালে শেষ হয়েছিল। প্রক্রিয়া একটি স্টক বিসিএ দ্রবণে পিএইচ 11.25 সহ অত্যন্ত ক্ষারীয় দ্রবণে নিম্নলিখিত উপাদানগুলি থাকেঃ বাইসিনকোনিনিক অ্যাসিড, সোডিয়াম কার্বনেট, সোডিয়াম বাইকার্বোনেট, সোডিয়াম টার্ট্রেট এবং কপার (II) সালফেট পেন্টাহাইড্রেট। বিসিএ পরীক্ষা মূলত দুটি প্রতিক্রিয়ার উপর নির্ভর করে। প্রথমত, প্রোটিনের পেপটাইড বন্ধন কপার (II) সালফেট থেকে কিউ2 + আয়নকে কিউ1 + (তাপমাত্রার উপর নির্ভরশীল প্রতিক্রিয়া)-এ হ্রাস করে। কিউ2 +-এর পরিমাণ হ্রাস দ্রবণে উপস্থিত প্রোটিনের পরিমাণের সাথে আনুপাতিক। এরপরে, প্রতিটি কিউ1 + আয়ন সহ বাইসিনকোনিনিক অ্যাসিডের দুটি অণু চিলেট হয়, যা একটি বেগুনি রঙের জটিল গঠন করে যা 562 এনএম তরঙ্গদৈর্ঘ্যে আলোকে দৃঢ়ভাবে শোষণ করে। বাইসিনকোনিনিক অ্যাসিড কিউ1 + কমপ্লেক্স প্রোটিন নমুনায় সিস্টিন/সিস্টিন, টাইরোসিন এবং ট্রিপ্টোফান পার্শ্ব শৃঙ্খলের উপস্থিতি দ্বারা প্রভাবিত হয়। উচ্চ তাপমাত্রায় (37 থেকে 60 ডিগ্রি সেলসিয়াস), পেপটাইড বন্ধন বিক্রিয়া জটিল গঠনে সহায়তা করে। উচ্চ তাপমাত্রায় বিসিএ অ্যাসে ইনকিউবেট করার পরামর্শ দেওয়া হয় অ্যাসে সংবেদনশীলতা বাড়ানোর উপায় হিসাবে এবং অসম অ্যামিনো অ্যাসিড গঠনের কারণে সৃষ্ট বৈচিত্র্যগুলি হ্রাস করার জন্য। একটি দ্রবণে উপস্থিত প্রোটিনের পরিমাণ শোষণ বর্ণালী পরিমাপ করে এবং জ্ঞাত ঘনত্বের প্রোটিন দ্রবণের সাথে তুলনা করে পরিমাপ করা যেতে পারে। সীমাবদ্ধতা বিসিএ পরীক্ষা হ্রাসকারী এজেন্ট এবং ধাতব চেলেটারের সাথে মূলত অসঙ্গতিপূর্ণ, যদিও ট্রেস পরিমাণ সহ্য করা যেতে পারে। বিসিএ পরীক্ষাটি সাধারণ ঝিল্লি লিপিড এবং ফসফোলিপিডগুলিতেও সাড়া দেয় বলে জানা গেছে। অ্যাসে ভ্যারিয়েন্ট বিসিএ অ্যাসের কয়েকটি বিকল্প ভ্যারিয়েন্ট রয়েছেঃ অরিজিনাল বিসিএ অ্যাসে স্মিথ যেমন বর্ণনা করেছেন, অরিজিনাল বিসিএ অ্যাসে একটি দ্বি-উপাদান প্রোটোকল। দুটি বিকারক "ঘরের তাপমাত্রায় অনির্দিষ্টকালের জন্য স্থিতিশীল"। কমপক্ষে দুইজন বাণিজ্যিক বিক্রেতার কাছ থেকে আধুনিক (সম্ভবত সঠিক বা অত্যন্ত অনুরূপ) সূত্র পাওয়া যায়। বিসিএ ওয়ার্কিং সলিউশনটি 50ঃ1 অনুপাতে রিজেন্ট এ এবং রিজেন্ট বি মিশ্রিত করে তৈরি করা হয় এবং সাপ্তাহিক (এটি মাঝারিভাবে স্থিতিশীল) বা প্রয়োজন অনুযায়ী প্রস্তুত করা যেতে পারে। বিকারক এ 1 শতাংশ ডাব্লু/ভি বিসিএ-না 2 (সিএএসঃ 979-88-4) 2 শতাংশ ডাব্লু/ভি না 2 সিও 3 · এইচ 2 ও (সিএএসঃ 5968-11-6) 0.16% ডাব্লু/ভি না 2 টার্ট্রেট (সিএএসঃ 868-18-8) 4 শতাংশ ডাব্লু/ভি নাওএইচ (সিএএসঃ 1310-73-2) 0.95% ডাব্লু/ভি নাহকো 3 (সিএএসঃ 144-55-8) পিএইচ সামঞ্জস্য করতে 50 শতাংশ নাওএইচ বা কঠিন নাহকো 3 যোগ করুন। উল্লেখযোগ্যভাবে, স্মিথ ইসাতিন এবং অ্যাসিটয়েনের পিফিৎজিঙ্গার বিক্রিয়ার মাধ্যমে তাদের নিজস্ব বিসিএ সংশ্লেষিত করেছিলেন, কেওএইচ-এর পরিবর্তে নাওএইচ প্রতিস্থাপন করেছিলেন তবে অন্যথায় লেসিন এবং হেনজের সিন্থেটিক পদ্ধতি অনুসরণ করেছিলেন, কারণ সেই সময়ের বাণিজ্যিক বিক্রেতাদের কাছ থেকে পাওয়া বিসিএ তাদের ব্যবহারের জন্য খুব অশুদ্ধ ছিল। পরীক্ষার জন্য পর্যাপ্ত পরিমাণে বিশুদ্ধ করার জন্য 70 ডিগ্রি সেলসিয়াস জল থেকে তাদের সংশ্লেষিত বিসিএ-র কমপক্ষে তিনটি ধারাবাহিক পুনর্বিন্যাস প্রয়োজন ছিল। বিকারক বি 4% ডাব্লু/ভি কিউএসও 4 · 5 এইচ 2 ও মাইক্রো বিসিএ পরীক্ষা (পাতলা সমাধানের জন্য) বিসিএ মাইক্রো বিসিএ পরীক্ষা একটি 3-উপাদান প্রোটোকল যা বায়ুরেট প্রতিক্রিয়া, বিসিএ এবং তামা (II) বিকারকগুলির ঘনীভূত স্টক ব্যবহার করে। এটি মূল বিসিএ পরীক্ষার ~ 2-40 মাইক্রোগ্রাম/এমএল বনাম 20-2000 মাইক্রোগ্রাম/এমএল এর উন্নত সংবেদনশীলতার অনুমতি দেয়। যাইহোক, এটির একটি ভিন্ন, এবং সাধারণত আরও সংবেদনশীল, অ-প্রোটিন উপাদানগুলির হস্তক্ষেপ রয়েছে। মাইক্রো বিসিএ পরীক্ষার জন্য কিট কমপক্ষে দুইজন বাণিজ্যিক বিক্রেতার কাছ থেকে পাওয়া যায়। উল্লেখযোগ্যভাবে, "মাইক্রো বিসিএ রিজেন্ট অ্যান্ড প্রোটোকল"-এর গঠন ও ব্যবহার স্মিথের মূল পাণ্ডুলিপিতে বর্ণনা করা হয়েছিল এবং আধুনিক কিটগুলি সম্ভবত একটি সঠিক বা অত্যন্ত অনুরূপ সূত্র নিয়ে গঠিত। প্রোটোকলটিতে মাইক্রো-রিজেন্ট বি এবং কপার সলিউশন 25:1 মিশিয়ে মাইক্রো-রিজেন্ট সি (এমসি) তৈরি করা হয়, যা বালুচর স্থিতিশীল নয় এবং সদ্য প্রস্তুত করা উচিত, এবং তারপরে মাইক্রো-রিজেন্ট এ-এর সাথে এমসি 1:1 মিশিয়ে চূড়ান্ত (এছাড়াও অস্থির) অ্যাসে কার্যকরী সমাধান তৈরি করা হয়। মাইক্রো-রিজেন্ট এ, মাইক্রো-রিজেন্ট বি এবং কপার সলিউশন ঘরের তাপমাত্রায় অনির্দিষ্টকালের জন্য স্থিতিশীল। মাইক্রো-রিজেন্ট এ (এমএ) 8 শতাংশ ডাব্লু/ভি না2সিও3·এইচ2ও (সিএএসঃ 5968-11-6) 1.6 শতাংশ ডাব্লু/ভি নাওএইচ (সিএএসঃ 1310-73-2) 1.6 শতাংশ ডাব্লু/ভি না2 টার্ট্রেট (সিএএসঃ 868-18-8) (উপরের মূল বিসিএ অ্যাসেতে রিজেন্ট এ হিসাবে 10x ঘনত্ব) পিএইচকে 11.25 মাইক্রো-রিজেন্ট বি (এমবি) 4 শতাংশ ডাব্লু/ভি বিসিএ-না2 (সিএএসঃ 979-88-4) (উপরের বিসিএ অ্যাসেতে রিজেন্ট এ হিসাবে 4x ঘনত্ব) কপার এস যদিও এটি হ্রাসকারী এজেন্টগুলির সাথে বৃহত্তর সামঞ্জস্যের অনুমতি দেয়, তবে পরীক্ষার অন্যান্য অ-প্রোটিন উপাদানগুলির থেকে আলাদা হস্তক্ষেপ প্রোফাইল রয়েছে। র্যাপিড গোল্ড বিসিএ এই ধরনের বিসিএ পরীক্ষা শুধুমাত্র থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক থেকে পাওয়া যায় বলে মনে হয়। জানা গেছে যে এটি "একটি অনন্য [মালিকানাধীন] তামার চেলেটারের সাথে ঐতিহ্যবাহী বিসিএ প্রোটিন অ্যাসের মতো একই তামার হ্রাস পদ্ধতি ব্যবহার করে। ", যা 562 এনএম এর পরিবর্তে 480 এনএম এ শোষণ করে। এই প্রোপ্রাইটর চিলেটর এবং অনুমিত অপ্টিমাইজড বায়ুরেট প্রতিক্রিয়া গঠন মূল বিসিএ পরীক্ষার 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস + ইনকিউবেশন ছাড়াই দ্রুত (<5 মিনিট) ফলাফল সরবরাহ করতে সহায়তা করে। তবে অ্যাসের অন্যান্য অ-প্রোটিন উপাদানগুলির থেকে আলাদা হস্তক্ষেপ প্রোফাইল রয়েছে। পিয়ার্স কোয়ান্টিটেটিভ কালারিমেট্রিক পেপটাইড অ্যাসে (বর্তমানে থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিকের মালিকানাধীন এবং উপলব্ধ) একটি অনুরূপ বা অভিন্ন 480 এনএম শোষণকারী মালিকানাধীন তামা চেলেটার ব্যবহার করে বলে মনে হয়। আরও দেখুন বিউরেট টেস্ট ব্র্যাডফোর্ড অ্যাসে কলয়েডাল গোল্ড প্রোটিন অ্যাসে রেফারেন্স এক্সটার্নাল লিঙ্ক ওপেনওয়েটওয়্যার বিসিএ অ্যাসে কেমিস্ট্রি বায়োকেমিস্ট্রি পদ্ধতি কেমিক্যাল টেস্ট ডিঃ বিসিনকোনিন্সুর