Tandem affinity purification
ট্যান্ডেম অ্যাফিনিটি পিউরিফিকেশন (টিএপি) হল প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া অধ্যয়নের জন্য একটি ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন-ভিত্তিক পিউরিফিকেশন কৌশল। লক্ষ্য হল একটি কোষ থেকে শুধুমাত্র আগ্রহের প্রোটিন বের করা, যা জটিলভাবে অন্য যে কোনও প্রোটিনের সাথে মিথস্ক্রিয়া করে। টিএপি দুই ধরনের অ্যাগারোজ পুঁতি ব্যবহার করে যা আগ্রহের প্রোটিনের সাথে আবদ্ধ হয় এবং যা সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে সেল লাইসেট থেকে পৃথক করা যেতে পারে, জড়িত কমপ্লেক্সগুলিকে বিরক্ত, বিকৃত বা দূষিত না করে। আগ্রহের প্রোটিনকে পুঁতির সাথে বাঁধতে সক্ষম করার জন্য, এটি একটি ডিজাইন করা টুকরো, টিএপি ট্যাগ দিয়ে ট্যাগ করা হয়। মূল টিএপি পদ্ধতিতে অধ্যয়নরত প্রোটিনের সি-টার্মিনাসের সাথে টিএপি ট্যাগের সংমিশ্রণ জড়িত। টিএপি ট্যাগ তিনটি উপাদান নিয়ে গঠিতঃ একটি ক্যালমোডুলিন বাইন্ডিং পেপটাইড (সিবিপি), টিইভি প্রোটিজ ক্লিভেজ সাইট এবং দুটি প্রোটিন এ ডোমেন, যা আইজিজির সাথে শক্তভাবে আবদ্ধ হয় (একটি টিএপি ট্যাগকে এক ধরনের এপিটোপ ট্যাগ তৈরি করে)। টি. এ. পি নীতি প্রথম প্রকাশিত হওয়ার পর থেকে আরও অনেক ট্যাগ/বিড/ইলুয়েন্ট সংমিশ্রণের প্রস্তাব দেওয়া হয়েছে। বৈকল্পিক ট্যাগ এই ট্যাগটি সি-টার্মিনাল টিএপি ট্যাগ নামেও পরিচিত কারণ একটি এন-টার্মিনাল সংস্করণও পাওয়া যায়। যাইহোক, বর্ণিত পদ্ধতিটি একটি সি-টার্মিনাল ট্যাগের ব্যবহার ধরে নেয়, যদিও পদ্ধতির পিছনের নীতিটি এখনও একই। 1990-এর দশকের শেষের দিকে ইউরোপীয় আণবিক জীববিজ্ঞান গবেষণাগারে কর্মরত একটি গবেষণা দল টিএপি ট্যাগিং উদ্ভাবন করেছিল (রিগাউট এট আল, 1999, পুইগ এট আল, 2001) এবং প্রোটিওম অনুসন্ধানের জন্য একটি নতুন সরঞ্জাম হিসাবে প্রস্তাব করা হয়েছিল। এটি দলটি বেশ কয়েকটি প্রোটিন কমপ্লেক্স (রিগাউট এট আল, 1999, ক্যাস্পারি এট আল) চিহ্নিত করতে ব্যবহার করেছিল। 1999, বুভেরেট ও অন্যান্য, 2000, পুইগ ও অন্যান্য, 2001)। এই কৌশলটির প্রথম বড় আকারের প্রয়োগ 2002 সালে হয়েছিল, যেখানে গবেষণা দলটি প্রোটিওমিক্স সংস্থা সেলজোমের বিজ্ঞানীদের সহযোগিতায় একটি খামির কোষে 230 টিরও বেশি মাল্টি-প্রোটিন কমপ্লেক্সের মিথস্ক্রিয়ার একটি ভিজ্যুয়াল মানচিত্র তৈরি করতে কাজ করেছিল। উদ্ভিদে টি. এ. পি ট্যাগ প্রযুক্তি ব্যবহারের প্রথম সফল রিপোর্ট আসে 2004 সালে (রোহিলা ও অন্যান্য, 2004,) প্রসেস এমন কয়েকটি পদ্ধতি রয়েছে যাতে হোস্ট কোষে ফিউশন প্রোটিন প্রবর্তন করা যেতে পারে। যদি হোস্টটি খামির হয়, তবে একটি পদ্ধতি হতে পারে প্লাজমিড ব্যবহার করা যা শেষ পর্যন্ত হোস্টের মধ্যে ফিউশন প্রোটিনকে অনুবাদ করবে। যে পদ্ধতিই ব্যবহার করা হোক না কেন, ফিউশন প্রোটিনের অভিব্যক্তি তার প্রাকৃতিক স্তরের যতটা সম্ভব কাছাকাছি রাখা ভাল। একবার ফিউশন প্রোটিন হোস্টের মধ্যে অনুবাদ করা হলে, এটি অন্যান্য প্রোটিনের সাথে যোগাযোগ করবে, আদর্শভাবে টিএপি ট্যাগ দ্বারা প্রভাবিত না হওয়া পদ্ধতিতে। পরবর্তীকালে, ট্যাগ করা প্রোটিন (তার বাঁধাই অংশীদারদের সাথে) একটি অ্যাফিনিটি নির্বাচন প্রক্রিয়া ব্যবহার করে পুনরুদ্ধার করা হয়। প্রথম ধরনের পুঁতি যুক্ত করা হয় ইমিউনোগ্লোবুলিন জি দিয়ে, যা টিএপি ট্যাগের বাইরের প্রান্তে আবদ্ধ হয়। আগ্রহের প্রোটিন সহ পুঁতিগুলি সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে লাইসেট থেকে পৃথক করা হয়। প্রোটিনগুলি তারপর একটি এনজাইম (টিইভি প্রোটিজ) দ্বারা পুঁতি থেকে মুক্তি পায় যা মাঝখানে টিইভি ক্লিভেজ সাইটে ট্যাগটি ভেঙে দেয়। এই প্রথম পরিশোধন ধাপের পরে, মুক্তিপ্রাপ্ত প্রোটিনে একটি দ্বিতীয় ধরনের পুঁতি (ক্যালমোডুলিনের সাথে লেপা) যোগ করা হয় যা প্রোটিনের উপর থাকা টিএপি ট্যাগের অবশিষ্ট অংশের সাথে বিপরীতভাবে আবদ্ধ হয়। পুঁতিগুলি আবার সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা পৃথক করা হয়, আরও দূষকের পাশাপাশি টিইভি প্রোটিজ অপসারণ করে। অবশেষে, পুঁতিগুলি ই. জি. টি. এ দ্বারা মুক্ত করা হয়, যা শুধুমাত্র আগ্রহের প্রোটিন, তার আবদ্ধ প্রোটিন অংশীদার এবং টি. এ. পি ট্যাগের অবশিষ্ট সিবিপি টুকরো ধারণকারী নেটিভ এলিউয়েটকে পিছনে ফেলে যায়। প্রোটিনের বন্ধনকারী অংশীদারদের সনাক্ত করতে জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস এবং মাস স্পেকট্রোমেট্রি ব্যবহার করে নেটিভ এলিউয়েটকে বিশ্লেষণ করা যেতে পারে। উপকারিতা এই পদ্ধতির একটি সুবিধা হল জটিল গঠন সম্পর্কে পূর্ব জ্ঞান ছাড়াই ভিভোতে প্রোটিন অংশীদারদের প্রকৃত পরিমাণ নির্ধারণ করা যেতে পারে। এটি কার্যকর করাও সহজ এবং প্রায়শই উচ্চ ফলন প্রদান করে। প্রোটিন প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া অধ্যয়নের অন্যতম বাধা হ 'ল লক্ষ্য প্রোটিনের দূষণ, বিশেষত যখন আমাদের এটি সম্পর্কে কোনও পূর্ব জ্ঞান নেই। টিএপি লক্ষ্য প্রোটিন শুদ্ধ করার জন্য একটি কার্যকর এবং অত্যন্ত নির্দিষ্ট উপায় প্রদান করে। পরপর দুটি অ্যাফিনিটি পিউরিফিকেশনের পরে, এলিউটে দূষিত পদার্থ ধরে রাখার সম্ভাবনা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পায়। অসুবিধাগুলি তবে, এমনও সম্ভাবনা রয়েছে যে কোনও প্রোটিনে যুক্ত একটি ট্যাগ তার মিথস্ক্রিয়া অংশীদারদের সাথে নতুন প্রোটিনের বন্ধনকে অস্পষ্ট করতে পারে। উপরন্তু, ট্যাগটি প্রোটিন অভিব্যক্তির মাত্রাও প্রভাবিত করতে পারে। অন্যদিকে, ট্যাগটি যথেষ্ট পরিমাণে অ্যাফিনিটি পুঁতির সংস্পর্শে নাও আসতে পারে, তাই ফলাফলগুলি তির্যক হয়। টি. ই. ভি প্রোটিজ দ্বারা প্রোটিনগুলি বিভক্ত হওয়ার সম্ভাবনাও থাকতে পারে, যদিও টি. ই. ভি প্রোটিজের উচ্চ নির্দিষ্টতার কারণে এটি ঘন ঘন হওয়ার সম্ভাবনা নেই। উপযুক্ততা যেহেতু এই পদ্ধতিতে কমপক্ষে 2 রাউন্ড ধোয়া জড়িত, তাই এটি ক্ষণস্থায়ী প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া স্ক্রিনিংয়ের জন্য উপযুক্ত নাও হতে পারে, ইস্ট টু-হাইব্রিড পদ্ধতির মতো নয় বা ফটো-রিঅ্যাকটিভ অ্যামিনো অ্যাসিড অ্যানালগগুলির সাথে ইন ভিভো ক্রসলিংকিংয়ের মতো নয়। যাইহোক, এটি স্থিতিশীল প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া পরীক্ষার জন্য একটি ভাল পদ্ধতি এবং প্রোটিন কমপ্লেক্সটি কতবার শুদ্ধ করা হয় তা নিয়ন্ত্রণ করে বিভিন্ন মাত্রার তদন্তের অনুমতি দেয়। প্রয়োগ 2002 সালে, টিএপি ট্যাগটি মাল্টিপ্রোটিন কমপ্লেক্সগুলিকে চিহ্নিত করে ইস্টের প্রোটিওমিক্সকে পদ্ধতিগতভাবে বিশ্লেষণ করার জন্য একটি বড় আকারের পদ্ধতিতে মাস স্পেকট্রোমেট্রি দিয়ে প্রথম ব্যবহার করা হয়েছিল। সমীক্ষায় 491টি কমপ্লেক্স প্রকাশ করা হয়েছে, যার মধ্যে 257টি সম্পূর্ণ নতুন। বাকিরা অন্যান্য গবেষণা থেকে পরিচিত ছিল, কিন্তু এখন কার্যত তাদের সবকটিতেই নতুন উপাদান পাওয়া গেছে। তারা একটি জটিল নেটওয়ার্কে কার্যকরীভাবে সমস্ত প্রোটিন উপাদান সম্পর্কিত একটি মানচিত্র তৈরি করেছে। অন্যান্য অনেক প্রোটিওমিক বিশ্লেষণেও টিএপি ট্যাগ ব্যবহার করা হয়। ই. এম. বি. ও (ডিজাইমবস্কি, 2004)-এর একটি গবেষণায় পারমাণবিক প্রাক-এম. আর. এন. এ ধারণ এবং স্প্লাইসিংয়ের জন্য প্রয়োজনীয় একটি নতুন জটিল সনাক্ত করা হয়েছে। তারা আরও 3টি সাবইউনিট (স্নু17পি, বাড13পি এবং পিএমএল1পি) নিয়ে গঠিত একটি অভিনব ট্রাইমেরিক কমপ্লেক্সকে শুদ্ধ করেছে এবং দেখেছে যে এই সাবইউনিটগুলি কার্যকারিতার জন্য প্রয়োজনীয় নয়, তবে প্রাক-এমআরএনএ-র দক্ষ স্প্লাইসিং (ইন্ট্রন অপসারণ)-এর জন্য প্রয়োজনীয়। 2006 সালে, ফ্লেশার এবং অন্যান্যরা। ইউক্যারিওটিক রাইবোসোমাল কমপ্লেক্সের সাথে যুক্ত প্রোটিনগুলি পদ্ধতিগতভাবে চিহ্নিত করা হয়েছে। তারা ইস্ট রাইবোসোমাল কমপ্লেক্সগুলি সনাক্ত করতে বহুমুখী মাস স্পেকট্রোমেট্রি প্রোটিওমিক স্ক্রিন ব্যবহার করেছিল এবং তারপরে এই সমস্ত প্রোটিনকে কার্যকরীভাবে সংযুক্ত করতে টিএপি ট্যাগিং ব্যবহার করেছিল। অন্যান্য এপিটোপ-ট্যাগ সংমিশ্রণ মাল্টিপ্রোটিন কমপ্লেক্সগুলির টেন্ডেম-অ্যাফিনিটি পরিশোধন নীতিটি রিগাউট এট আল-এর মূল কাজে ব্যবহৃত সিবিপি এবং প্রোটিন এ ট্যাগের সংমিশ্রণে সীমাবদ্ধ নয়। (1999)। উদাহরণস্বরূপ, স্তন্যপায়ী কোষ থেকে অসংখ্য প্রোটিন কমপ্লেক্স শুদ্ধ করার জন্য নাকাতানি গোষ্ঠী 2000 সাল থেকে ফ্ল্যাগ-এবং এইচ. এ-ট্যাগের সংমিশ্রণ ব্যবহার করে আসছে। টিএপি নীতি প্রকাশিত হওয়ার পর থেকে আরও অনেক ট্যাগ সংমিশ্রণের প্রস্তাব দেওয়া হয়েছে। তথ্যসূত্র জৈব রাসায়নিক পৃথকীকরণ প্রক্রিয়া প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া মূল্যায়ন