De novo transcriptome assembly
ডি নোভো ট্রান্সক্রিপ্টোম সমাবেশ হল একটি রেফারেন্স জিনোমের সহায়তা ছাড়াই একটি ট্রান্সক্রিপ্টোম তৈরি করার ডি নোভো সিকোয়েন্স সমাবেশ পদ্ধতি। ভূমিকা নতুন সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির বিকাশের ফলে, 2008 থেকে 2012 সালের মধ্যে সিকোয়েন্সিং-এর খরচ ব্যাপকভাবে কমেছে। মেগাবেজ এবং জিনোম প্রতি, খরচ যথাক্রমে 1/100,000 তম এবং 1/10,000 তম দামে নেমে আসে। এর আগে, শুধুমাত্র বৈজ্ঞানিক গবেষণার জন্য ব্যাপক আগ্রহ এবং উপযোগিতার জীবের প্রতিলিপিগুলি ক্রমবদ্ধ করা হয়েছিল; তবে, 2010-এর দশকে উন্নত উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং (পরবর্তী প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং নামেও পরিচিত) প্রযুক্তিগুলি ব্যয়-এবং শ্রম-কার্যকর উভয়ই, এবং এই পদ্ধতির মাধ্যমে অধ্যয়নরত জীবের পরিসীমা প্রসারিত হচ্ছে। পরবর্তীকালে ছোলা, প্ল্যানারিয়ান, পারহ্যাল হাওয়াইয়েন্সিসের পাশাপাশি নীল কুমির, কর্ন সাপ, দাড়িওয়ালা ড্রাগন এবং লাল কানের স্লাইডারের মস্তিষ্কের জন্য ট্রান্সক্রিপ্টোম তৈরি করা হয়েছে। অ-মডেল জীবগুলিকে পরীক্ষা করা "আকর্ষণীয় অঙ্গসংস্থানগত উদ্ভাবনের বৈচিত্র্য"-এর অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াগুলির মধ্যে অভিনব অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে যা পৃথিবীতে জীবনের প্রাচুর্যকে সক্ষম করেছে। প্রাণী ও উদ্ভিদের মধ্যে, সাধারণ মডেল জীবের মধ্যে যে "উদ্ভাবনগুলি" পরীক্ষা করা যায় না তার মধ্যে রয়েছে অনুকরণ, পারস্পরিকতা, পরজীবীবাদ এবং অযৌন প্রজনন। ডি নোভো ট্রান্সক্রিপ্টোম সমাবেশ প্রায়শই অ-মডেল জীব অধ্যয়নের পছন্দের পদ্ধতি, কারণ এটি একটি জিনোম তৈরির চেয়ে সস্তা এবং সহজ, এবং বিদ্যমান জিনোম ছাড়া রেফারেন্স-ভিত্তিক পদ্ধতি সম্ভব নয়। এই জীবগুলির প্রতিলিপিগুলি এইভাবে নতুন প্রোটিন এবং তাদের আইসোফর্মগুলি প্রকাশ করতে পারে যা এই ধরনের অনন্য জৈবিক ঘটনার সাথে জড়িত। ডি নোভো বনাম রেফারেন্স-ভিত্তিক সমাবেশ একত্রিত প্রতিলিপিগুলির একটি সেট প্রাথমিক জিন অভিব্যক্তি অধ্যয়নের অনুমতি দেয়। ট্রান্সক্রিপ্টোম অ্যাসেম্বলি কম্পিউটার প্রোগ্রামের বিকাশের আগে, ট্রান্সক্রিপ্টোম ডেটা প্রাথমিকভাবে একটি রেফারেন্স জিনোমের উপর ম্যাপিং করে বিশ্লেষণ করা হত। যদিও জিনোম সারিবদ্ধকরণ প্রতিলিপি ক্রমগুলি চিহ্নিত করার একটি শক্তিশালী উপায়, তবে এই পদ্ধতিটি বিকল্প স্প্লাইসিংয়ের মতো এমআরএনএ প্রতিলিপির কাঠামোগত পরিবর্তনের ঘটনাগুলির জন্য অ্যাকাউন্ট করতে অক্ষমতার কারণে অসুবিধাজনক। যেহেতু একটি জিনোমে সমস্ত ইন্ট্রন এবং এক্সনের সমষ্টি থাকে যা একটি প্রতিলিপিতে উপস্থিত থাকতে পারে, তাই স্প্লাইসড রূপগুলি যা জিনোমের সাথে ক্রমাগত সারিবদ্ধ হয় না তা প্রকৃত প্রোটিন আইসোফর্ম হিসাবে ছাড় দেওয়া যেতে পারে। এমনকি যদি একটি রেফারেন্স জিনোম পাওয়া যায়, ডি নভো অ্যাসেম্বলি করা উচিত, কারণ এটি রেফারেন্স জিনোম অ্যাসেম্বলিতে অনুপস্থিত জিনোমের অংশগুলি থেকে প্রতিলিপি করা প্রতিলিপিগুলি পুনরুদ্ধার করতে পারে। ট্রান্সক্রিপ্টোম বনাম জিনোম সমাবেশ জিনোম সিকোয়েন্স কভারেজ স্তরের বিপরীতে-যা ডি. এন. এ-র নন-কোডিং ইন্ট্রন অঞ্চলে পুনরাবৃত্ত বিষয়বস্তুর ফলে এলোমেলোভাবে পরিবর্তিত হতে পারে-ট্রান্সক্রিপ্টোম সিকোয়েন্স কভারেজ স্তরগুলি সরাসরি জিন অভিব্যক্তির মাত্রা নির্দেশ করতে পারে। এই পুনরাবৃত্ত ক্রমগুলি জিনোম সমাবেশে কনটিগগুলির গঠনে অস্পষ্টতা তৈরি করে, অন্যদিকে ট্রান্সক্রিপ্টোম সমাবেশ কনটিগগুলিতে অস্পষ্টতা সাধারণত স্প্লাইসড আইসোফর্ম বা জিন পরিবারের সদস্যদের মধ্যে সামান্য বৈচিত্র্যের সাথে মিলে যায়। জিনোম অ্যাসেম্বলার বিভিন্ন কারণে ট্রান্সক্রিপ্টোম অ্যাসেম্বলিতে সরাসরি ব্যবহার করা যায় না। প্রথমত, জিনোম সিকোয়েন্সিংয়ের গভীরতা সাধারণত জিনোম জুড়ে একই থাকে, তবে প্রতিলিপির গভীরতা পরিবর্তিত হতে পারে। দ্বিতীয়ত, উভয় স্ট্র্যান্ডই সর্বদা জিনোম সিকোয়েন্সিংয়ে সিকোয়েন্স করা হয়, তবে আরএনএ-সেকিউ স্ট্র্যান্ড-নির্দিষ্ট হতে পারে। তৃতীয়ত, ট্রান্সক্রিপ্টোম সমাবেশ আরও চ্যালেঞ্জিং কারণ একই জিন থেকে ট্রান্সক্রিপ্ট রূপগুলি এক্সন ভাগ করতে পারে এবং দ্ব্যর্থহীনভাবে সমাধান করা কঠিন। পদ্ধতি আর. এন. এ-সেক একবার কোষ থেকে আর. এন. এ বের করে বিশুদ্ধ করা হলে, এটি একটি উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং সুবিধায় পাঠানো হয়, যেখানে এটি একটি সিডিএনএ লাইব্রেরি তৈরি করার জন্য প্রথমে বিপরীত প্রতিলিপি করা হয়। এই সিডিএনএ তারপর সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য ব্যবহৃত প্ল্যাটফর্মের উপর নির্ভর করে বিভিন্ন দৈর্ঘ্যে বিভক্ত করা যেতে পারে। নিম্নলিখিত প্রতিটি প্ল্যাটফর্ম লক্ষ লক্ষ সংক্ষিপ্ত পাঠের ক্রমবদ্ধ করার জন্য একটি ভিন্ন ধরনের প্রযুক্তি ব্যবহার করেঃ 454 সিকোয়েন্সিং, ইলুমিনা এবং সলিড। অ্যাসেম্বলি অ্যালগরিদম সিডিএনএ সিকোয়েন্স রিডগুলি একটি সংক্ষিপ্ত রিড ট্রান্সক্রিপ্ট অ্যাসেম্বলি প্রোগ্রামের মাধ্যমে প্রতিলিপিতে একত্রিত করা হয়। সম্ভবত, প্রতিলিপিগুলির মধ্যে কিছু অ্যামিনো অ্যাসিডের বৈচিত্র্য যা অন্যথায় অনুরূপ বিভিন্ন প্রোটিন আইসোফর্ম প্রতিফলিত করে। এটিও সম্ভব যে তারা একই জিন পরিবারের মধ্যে বিভিন্ন জিনের প্রতিনিধিত্ব করে, বা এমনকি জিনগুলি যা পরিবর্তনের মাত্রার উপর নির্ভর করে শুধুমাত্র একটি সংরক্ষিত ক্ষেত্র ভাগ করে নেয়। বেশ কয়েকটি সমাবেশ কর্মসূচি পাওয়া যায় (অ্যাসেম্বলার দেখুন)। যদিও এই প্রোগ্রামগুলি সাধারণত জিনোম একত্রিত করতে সফল হয়েছে, ট্রান্সক্রিপ্টোম সমাবেশ কিছু অনন্য চ্যালেঞ্জ উপস্থাপন করে। যেখানে একটি জিনোমের জন্য উচ্চ সিকোয়েন্স কভারেজ পুনরাবৃত্তিমূলক সিকোয়েন্সের উপস্থিতি নির্দেশ করতে পারে (এবং এইভাবে মুখোশযুক্ত হতে পারে), একটি ট্রান্সক্রিপ্টোমের জন্য, তারা প্রাচুর্য নির্দেশ করতে পারে। উপরন্তু, জিনোম সিকোয়েন্সিংয়ের বিপরীতে, ট্রান্সক্রিপ্টোম সিকোয়েন্সিং স্ট্র্যান্ড-নির্দিষ্ট হতে পারে, ইন্দ্রিয় এবং অ্যান্টিসেন্স ট্রান্সক্রিপ্ট উভয়ের সম্ভাবনার কারণে। পরিশেষে, সমস্ত স্প্লাইসিং আইসোফর্মগুলি পুনর্গঠন এবং আলাদা করা কঠিন হতে পারে। শর্ট রিড অ্যাসেম্বলাররা সাধারণত দুটি মৌলিক অ্যালগরিদমের মধ্যে একটি ব্যবহার করেঃ ওভারল্যাপ গ্রাফ এবং ডি ব্রুইন গ্রাফ। স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সড রিডের জন্য ডিজাইন করা বেশিরভাগ অ্যাসেম্বলারের জন্য ওভারল্যাপ গ্রাফ ব্যবহার করা হয়। প্রতিটি জোড়া পাঠের মধ্যে ওভারল্যাপগুলি গণনা করা হয় এবং একটি গ্রাফে সংকলিত হয়, যেখানে প্রতিটি নোড একটি একক ক্রম পাঠের প্রতিনিধিত্ব করে। এই অ্যালগরিদমটি ডি ব্রুইন গ্রাফের তুলনায় গণনামূলকভাবে বেশি নিবিড় এবং উচ্চ মাত্রার ওভারল্যাপের সাথে কম রিড একত্রিত করতে সবচেয়ে কার্যকর। ডি ব্রুইন গ্রাফগুলি কে-1 ক্রম সংরক্ষণের উপর ভিত্তি করে কে-মার্সকে (সাধারণত 25-50 বিপি) সারিবদ্ধ করে কনটিগ তৈরি করে। কে-মার্সরা দ্রুত হ্যাশিংয়ের অনুমতি দেয় এমন পঠন দৈর্ঘ্যের চেয়ে ছোট তাই ডি ব্রুইন গ্রাফের ক্রিয়াকলাপগুলি সাধারণত কম গণনামূলকভাবে নিবিড় হয়। কার্যকরী টীকা একত্রিত প্রতিলিপিগুলির কার্যকরী টীকা নির্দিষ্ট আণবিক ক্রিয়া, কোষীয় উপাদান এবং জৈবিক প্রক্রিয়াগুলির অন্তর্দৃষ্টি দেয় যেখানে অনুমানমূলক প্রোটিনগুলি জড়িত থাকে। ব্লাস্ট2জিও (বি2জি) জিন অন্টোলজি ভিত্তিক ডেটা মাইনিংকে সিকোয়েন্স ডেটা টীকা করতে সক্ষম করে যার জন্য এখনও কোনও জিও টীকা উপলব্ধ নেই। এটি একটি গবেষণা সরঞ্জাম যা প্রায়শই অ-মডেল প্রজাতির কার্যকরী জিনোমিক্স গবেষণায় নিযুক্ত করা হয়। এটি একটি অ-অপ্রয়োজনীয় প্রোটিন ডাটাবেসের (এনসিবিআই-তে) বিরুদ্ধে একত্রিত কনটিগগুলি বিস্ফোরণ করে কাজ করে, তারপরে ক্রমের সাদৃশ্যের ভিত্তিতে তাদের টীকা দেয়। গোয়ানা হল পশু এবং কৃষি উদ্ভিদ জিন পণ্যগুলির জন্য নির্দিষ্ট আরেকটি গো অ্যানোটেশন প্রোগ্রাম যা একইভাবে কাজ করে। এটি জিও অ্যানোটেশন এবং বিশ্লেষণের জন্য গণনামূলক সরঞ্জামগুলির কিউরেটেড, সর্বজনীনভাবে অ্যাক্সেসযোগ্য স্যুটের অ্যাগবেস ডাটাবেসের অংশ। টীকা দেওয়ার পরে, কেইজিজি (কিয়োটো এনসাইক্লোপিডিয়া অফ জিনস অ্যান্ড জিনোমস) ট্রান্সক্রিপ্টোমে ধরা পড়া বিপাকীয় পথ এবং আণবিক মিথস্ক্রিয়া নেটওয়ার্কগুলির দৃশ্যায়ন সক্ষম করে। জিও শর্তাবলীর জন্য টীকা দেওয়ার পাশাপাশি, এই প্রতিলিপিগুলি থেকে প্রাপ্ত প্রোটিনের অ্যামিনো অ্যাসিড ক্রমের পূর্বাভাস দেওয়ার জন্য ওপেন রিডিং ফ্রেমগুলির (ওআরএফ) জন্যও কনটিগগুলি পরীক্ষা করা যেতে পারে। আরেকটি পদ্ধতি হল প্রোটিন ক্ষেত্রের বিবরণ দেওয়া এবং নির্দিষ্ট জিনের পরিবর্তে জিন পরিবারের উপস্থিতি নির্ধারণ করা। যাচাইকরণ এবং গুণমান নিয়ন্ত্রণ যেহেতু একটি সু-সমাধানকৃত রেফারেন্স জিনোম খুব কমই পাওয়া যায়, তাই কম্পিউটার-একত্রিত কনটিগগুলির গুণমান যাচাই করা যেতে পারে সেগুলি তৈরি করতে ব্যবহৃত রিডগুলির সাথে একত্রিত সিকোয়েন্সগুলির তুলনা করে (রেফারেন্স-মুক্ত), অথবা এমআরএনএ প্রতিলিপিতে পাওয়া সংরক্ষিত জিন ডোমেনের সিকোয়েন্সগুলিকে ট্রান্সক্রিপ্টোম বা ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত প্রজাতির জিনোমের সাথে সারিবদ্ধ করে (রেফারেন্স-ভিত্তিক)। ট্রান্সরেট এবং ডিটোনেটের মতো সরঞ্জামগুলি এই পদ্ধতিগুলির মাধ্যমে সমাবেশের মানের পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের অনুমতি দেয়। আরেকটি পদ্ধতি হল পূর্বাভাসকৃত প্রতিলিপির জন্য পিসিআর প্রাইমার ডিজাইন করা, তারপর সিডিএনএ লাইব্রেরি থেকে সেগুলিকে প্রশস্ত করার চেষ্টা করা। প্রায়শই, ব্যতিক্রমী সংক্ষিপ্ত পাঠগুলি ফিল্টার করা হয়। সংক্ষিপ্ত ক্রমগুলি (<40 অ্যামিনো অ্যাসিড) কার্যকরী প্রোটিনগুলির প্রতিনিধিত্ব করার সম্ভাবনা কম, কারণ তারা স্বাধীনভাবে ভাঁজ করতে এবং হাইড্রোফোবিক কোর তৈরি করতে অক্ষম। এই মেট্রিকগুলির পরিপূরক, জিনের পরিমাণগত মূল্যায়ন সমাবেশের গুণমান সম্পর্কে অতিরিক্ত অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে। এই পদক্ষেপটি সম্পাদন করার জন্য, এমন সরঞ্জামগুলি ব্যবহার করা যেতে পারে যা সংরক্ষিত জিনের উপর ভিত্তি করে প্রত্যাশিত জিন স্থানের মডেল তৈরি করে, যেমন বুস্কো। ইউক্যারিওটদের জন্য, সিইজিএমএও ব্যবহার করা যেতে পারে, যদিও এটি 2015 সাল থেকে আনুষ্ঠানিকভাবে আর সমর্থিত নয়। সমাবেশকারী নিম্নলিখিতটি সমাবেশ সফ্টওয়্যারের একটি আংশিক সংকলন যা প্রতিলিপি তৈরি করতে ব্যবহৃত হয়েছে এবং বৈজ্ঞানিক সাহিত্যেও উদ্ধৃত করা হয়েছে। সেকম্যান এনজেন এসওএপিডেনোভো-ট্রান্স এসওএপিডেনোভো-ট্রান্স হল এসওএপিডেনোভো 2 কাঠামো থেকে উত্তরাধিকারসূত্রে প্রাপ্ত একটি ডি নোভো ট্রান্সক্রিপ্টোম অ্যাসেম্বলার, যা বিকল্প স্প্লাইসিং এবং বিভিন্ন অভিব্যক্তি স্তরের সাথে ট্রান্সক্রিপ্টোম একত্রিত করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছে। অ্যাসেম্বলারটি এসওএপিডেনোভো 2-এর তুলনায় পূর্ণ দৈর্ঘ্যের প্রতিলিপি সেট তৈরি করার আরও বিস্তৃত উপায় সরবরাহ করে। ভেলভেট/ওসিস ভেলভেট অ্যালগরিদম প্রতিলিপিগুলি একত্রিত করতে ডি ব্রুইন গ্রাফ ব্যবহার করে। সিমুলেশনে, ভেলভেট প্রোক্যারিওটিক তথ্য এবং স্তন্যপায়ী ব্যাকটেরিয়ার কৃত্রিম ক্রোমোজোম (বিএসি)-এ 3-কেবি এন50 ব্যবহার করে 50-কেবি এন50 দৈর্ঘ্য পর্যন্ত কনটিগ তৈরি করতে পারে। এই প্রাথমিক প্রতিলিপিগুলি ওসিসে স্থানান্তরিত হয়, যা প্রতিলিপি আইসোফর্ম তৈরি করতে পেয়ার্ড এন্ড রিড এবং লং রিড তথ্য ব্যবহার করে। ট্রান্স-এ. বি. আই. এস. এস. এ. বি. আই. এস. এস একটি সমান্তরাল, পেয়ার্ড-এন্ড সিকোয়েন্স অ্যাসেম্বলার। ট্রান্স-এবাইএসএস (অ্যাসেম্বলি বাই শর্ট সিকোয়েন্সেস) হল এবাইএসএস-একত্রিত ট্রান্সক্রিপ্টোম কনটিগস বিশ্লেষণের জন্য পাইথন এবং পার্ল ভাষায় লেখা একটি সফ্টওয়্যার পাইপলাইন। এই পাইপলাইনটি কে মানগুলির বিস্তৃত পরিসর জুড়ে উত্পন্ন সমাবেশগুলিতে প্রয়োগ করা যেতে পারে। এটি প্রথমে ডেটাসেটকে অপ্রয়োজনীয় সংযোগগুলির ছোট সেটে হ্রাস করে এবং এক্সন-স্কিপিং, নভেল এক্সন, ধরে রাখা ইন্ট্রন, নভেল ইন্ট্রন এবং বিকল্প স্প্লাইসিং সহ স্প্লাইসিং ইভেন্টগুলি চিহ্নিত করে। ট্রান্স-এবিওয়াইএসএস অ্যালগরিদমগুলি জিন অভিব্যক্তির মাত্রা অনুমান করতে, সম্ভাব্য পলিঅ্যাডেনাইলেশন সাইটগুলির পাশাপাশি প্রার্থী জিন-ফিউশন ইভেন্টগুলি সনাক্ত করতে সক্ষম। ট্রিনিটি ট্রিনিটি প্রথমে ক্রমের তথ্যকে বেশ কয়েকটি ডি ব্রুইন গ্রাফে বিভক্ত করে, প্রতিটি একক জিন বা লোকাসে প্রতিলিপিগত বৈচিত্র্যের প্রতিনিধিত্ব করে। এরপরে এটি পূর্ণ দৈর্ঘ্যের স্প্লাইসিং আইসোফর্মগুলি বের করে এবং প্রতিটি গ্রাফ থেকে প্যারালগাস জিন থেকে প্রাপ্ত প্রতিলিপিগুলিকে আলাদা করে। ট্রিনিটি তিনটি স্বাধীন সফ্টওয়্যার মডিউল নিয়ে গঠিত, যা ক্রমানুসারে প্রতিলিপি তৈরি করতে ব্যবহৃত হয়ঃ ইঞ্চওয়ার্ম আরএনএ-সেক তথ্যকে প্রতিলিপি ক্রমে একত্রিত করে, প্রায়শই একটি প্রভাবশালী আইসোফর্মের জন্য পূর্ণ দৈর্ঘ্যের প্রতিলিপি তৈরি করে, তবে তারপরে বিকল্পভাবে বিভক্ত প্রতিলিপির অনন্য অংশগুলি রিপোর্ট করে। ক্রাইসেলিস ইঞ্চওয়ার্ম কনটিগগুলিকে গুচ্ছবদ্ধ করে এবং প্রতিটি গুচ্ছের জন্য সম্পূর্ণ ডি ব্রুইন গ্রাফ তৈরি করে। প্রতিটি ক্লাস্টার একটি প্রদত্ত জিনের (বা একটি পরিবার বা জিনের সেট যা একটি সংরক্ষিত ক্রম ভাগ করে নেয়) সম্পূর্ণ প্রতিলিপিগত জটিলতার প্রতিনিধিত্ব করে। ক্রাইসেলিস তখন এই পৃথক গ্রাফগুলির মধ্যে সম্পূর্ণ পঠন সেটটি বিভাজন করে। প্রজাপতি তারপর পৃথক গ্রাফগুলি সমান্তরালভাবে প্রক্রিয়া করে, গ্রাফের মধ্যে পাঠের পথগুলি সন্ধান করে, শেষ পর্যন্ত বিকল্পভাবে বিভক্ত আইসোফর্মগুলির জন্য পূর্ণ দৈর্ঘ্যের প্রতিলিপিগুলি রিপোর্ট করে এবং প্যারালগাস জিনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ প্রতিলিপিগুলি টিজ করে। আরও দেখুন ট্রান্সক্রিপ্টোম ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স হিউম্যান-ট্রান্সক্রিপ্টোম ডাটাবেস ফর অল্টারনেটিভ স্প্লাইসিং (এইচ-ডিবিএএস) ইউনিজিন ফুল-প্যারাসাইটস এক্সোম সিকোয়েন্সিং রেফারেন্স বায়োইনফরম্যাটিক্স সিস্টেমস বায়োলজি কম্পিউট্যাশনাল বায়োলজি ওমিক্স