ChIP-exo
চিআইপি-এক্সো হল একটি ক্রোমাটিন ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন ভিত্তিক পদ্ধতি যেখানে জিনোমের সাথে আগ্রহের একটি প্রোটিন (ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর) আবদ্ধ হয়। এটি চিপ-সেক প্রটোকলের একটি পরিবর্তন, যা বাঁধাই সাইটগুলির রেজোলিউশনকে শত শত বেস জোড়া থেকে প্রায় একটি বেস জোড়ায় উন্নত করে। এটি প্রোটিন-আবদ্ধ ডি. এন. এ-র স্ট্র্যান্ডগুলিকে 5 '-3' দিকে প্রোটিন বাঁধাই সাইটের অল্প সংখ্যক নিউক্লিওটাইডের মধ্যে হ্রাস করার জন্য এক্সোনিউক্লিয়াস ব্যবহার করে। এক্সোনিউক্লিজ-ট্রিটেড প্রান্তের নিউক্লিওটাইডগুলি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং, মাইক্রো অ্যারে এবং পিসিআর-এর কিছু সংমিশ্রণ ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়। এই ক্রমগুলি তারপর জিনোমের অবস্থানগুলি সনাক্ত করতে জিনোমে ম্যাপ করা হয় যেখানে প্রোটিন আবদ্ধ হয়। প্রোটিন-ডিএনএ মিথস্ক্রিয়া সনাক্ত করতে 1984 সাল থেকে ক্রোমাটিন ইমিউনোপ্রেসিপিটেশন (চিআইপি) কৌশল ব্যবহার করা হচ্ছে। ফলাফলের মান উন্নত করতে চিআইপি-তে অনেক বৈচিত্র রয়েছে। এরকম একটি উন্নতি, চিপ-অন-চিপ (চিপ-চিপ), মাইক্রো অ্যারে প্রযুক্তির সাথে চিপকে একত্রিত করে। এই কৌশলটির সীমিত সংবেদনশীলতা এবং নির্দিষ্টতা রয়েছে, বিশেষত ভিভোতে যেখানে মাইক্রো-অ্যারেগুলি পারমাণবিক বগিতে উপস্থিত হাজার হাজার প্রোটিন দ্বারা সীমাবদ্ধ থাকে, যার ফলে মিথ্যা পজিটিভের উচ্চ হার হয়। এরপরে আসে চিপ-সিকোয়েন্সিং (চিপ-সেক), যা উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিংয়ের সাথে চিপকে একত্রিত করে। যাইহোক, কাটা ডিএনএ টুকরোগুলির বৈচিত্র্যময় প্রকৃতি নির্দিষ্টতা সীমিত করে ±300 বেস জোড়ার মধ্যে বাঁধাই সাইটগুলিকে ম্যাপ করে। দ্বিতীয়ত, দূষিত ডিএনএ একটি গুরুতর সমস্যা উপস্থাপন করে কারণ খুব কম জেনেটিক লোকাই আগ্রহের প্রোটিনের সাথে ক্রস-লিঙ্কযুক্ত, যা কোনও অ-নির্দিষ্ট জিনোমিক ডিএনএকে পটভূমির শব্দের একটি উল্লেখযোগ্য উৎস করে তোলে। এই সমস্যাগুলি সমাধানের জন্য, রি এবং পুঘ চিআইপি-এক্সো বিকাশের জন্য ক্লাসিক নিউক্লিয়াস সুরক্ষা মূল্যায়ন সংশোধন করেছিলেন। এই নতুন চিপ কৌশলটি একটি ল্যাম্বডা এক্সোন্যুক্লিয়াসের উপর নির্ভর করে যা শুধুমাত্র অবনমিত হয়, এবং সমস্ত, 5′-3′ দিকে অবরুদ্ধ ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ। সংক্ষেপে, আগ্রহের একটি প্রোটিন (একটি এপিটোপ ট্যাগ সহ একটি ইঞ্জিনিয়ারিং ইমিউনোপ্রিসিপিটেশনের জন্য দরকারী হতে পারে) ফর্মালডিহাইড ব্যবহার করে একটি জিনোম জুড়ে তার প্রাকৃতিক বাঁধাই অবস্থানের সাথে ভিভোতে ক্রস লিঙ্ক করা হয়। তারপর কোষগুলি সংগ্রহ করা হয়, ভাঙ্গা হয় এবং ক্রোমাটিন শিয়ার করা হয় এবং সোনিকেশন দ্বারা দ্রবীভূত হয়। একটি অ্যান্টিবডি তারপর ক্রস লিঙ্কযুক্ত ডিএনএ সহ আগ্রহের প্রোটিনকে ইমিউনোপ্রিসিপিট করতে ব্যবহার করা হয়। ডি. এন. এ. পি. সি. আর অ্যাডাপ্টারগুলি তারপর প্রান্তে সংযুক্ত করা হয়, যা এক্সোন্যুক্লিয়াস পরিপাকের পরে দ্বিতীয় স্ট্র্যান্ড ডি. এন. এ সংশ্লেষণের জন্য একটি প্রাথমিক বিন্দু হিসাবে কাজ করে। ল্যাম্বডা এক্সোন্যুক্লিয়াস তারপর 5 'প্রান্ত থেকে ডাবল ডিএনএ স্ট্র্যান্ডগুলি হজম করে যতক্ষণ না প্রোটিন-ডিএনএ সমযোজী মিথস্ক্রিয়ার সীমানায় হজম বন্ধ হয়ে যায়। বেশিরভাগ দূষিত ডিএনএ দ্বিতীয় একক-স্ট্র্যান্ড নির্দিষ্ট এক্সোনিউক্লিজ যোগ করার মাধ্যমে অবনমিত হয়। ক্রস-লিঙ্কিং বিপরীত হওয়ার পরে, পিসিআর অ্যাডাপ্টারের প্রাইমারগুলি ডাবল স্ট্রেন্ডেড ডিএনএ গঠনের জন্য প্রসারিত করা হয় এবং একটি দ্বিতীয় অ্যাডাপ্টার এক্সোন্যুক্লিয়াস পরিপাক বন্ধের সঠিক অবস্থান চিহ্নিত করতে 5 'প্রান্তে সংযুক্ত করা হয়। গ্রন্থাগারটি তখন পিসিআর দ্বারা পরিবর্ধিত হয় এবং পণ্যগুলি উচ্চ থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং দ্বারা চিহ্নিত করা হয়। এই পদ্ধতিটি যে কোনও জিনোমের মধ্যে যে কোনও প্রোটিন বাইন্ডিং সাইটের জন্য একক বেস জোড়া পর্যন্ত রেজোলিউশনের অনুমতি দেয়, যা চিপ-চিপ বা চিপ-সেকের তুলনায় অনেক বেশি রেজোলিউশন। উপকারিতা চিপ-এক্সো প্রোটিন বাঁধাইয়ের অবস্থানগুলি সনাক্ত করতে একক বেস পেয়ার রেজোলিউশন পর্যন্ত ছাড়তে দেখা গেছে। এটি চিআইপি-সেকিউ-এর বিপরীতে যা শুধুমাত্র ±300 বেস জোড়া দিয়ে একটি প্রোটিনের বাঁধাই স্থান সনাক্ত করতে পারে। নন-প্রোটিন-বাউন্ড ডিএনএ টুকরোগুলির দূষণের ফলে চিআইপি পরীক্ষায় মিথ্যা পজিটিভ এবং নেগেটিভের উচ্চ হার হতে পারে। এই প্রক্রিয়ায় এক্সোন্যুক্লিয়াসের সংযোজন কেবল বাইন্ডিং-সাইট কলিংয়ের রেজোলিউশনকেই উন্নত করে না, তবে সিকোয়েন্সিংয়ের আগে দ্রবণ থেকে দূষিত ডিএনএ সরিয়ে দেয়। নিউক্লিওটাইড খণ্ডের সাথে অদক্ষভাবে আবদ্ধ প্রোটিনগুলি চিপ-এক্সো দ্বারা সনাক্ত হওয়ার সম্ভাবনা বেশি। উদাহরণস্বরূপ, এটি পূর্বে আবিষ্কৃত সাইটগুলির তুলনায় আরও বেশি সিটিসিএফ ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর বাইন্ডিং সাইটগুলির স্বীকৃতির অনুমতি দিয়েছে। উচ্চ রেজোলিউশন এবং কম পটভূমির কারণে, চিপ-এক্সো ব্যবহার করার সময় সিকোয়েন্সিং কভারেজের কম গভীরতার প্রয়োজন হয়। সীমাবদ্ধতা যদি একটি প্রোটিন-ডিএনএ কমপ্লেক্সের একটি একক বাঁধাই ঘটনার মধ্যে ক্রস-লিঙ্কিংয়ের একাধিক অবস্থান থাকে, তবে এটি এমনভাবে প্রদর্শিত হতে পারে যেন একাধিক স্বতন্ত্র বাঁধাই ঘটনা রয়েছে। এটি সম্ভবত একই ঘটনার মধ্যে উপলব্ধ বাঁধাই সাইটগুলির একটিতে এই প্রোটিনগুলি বিকৃত এবং ক্রস-লিঙ্ক হওয়ার ফলে ঘটে। প্রোটিনটি কোন সাইটে ক্রস-লিঙ্ক করা হয়েছে তার উপর নির্ভর করে এক্সোন্যুক্লিয়াস তখন আবদ্ধ সাইটগুলির একটিতে থামবে। যে কোনও চিপ-ভিত্তিক পদ্ধতির মতো, এই কৌশলটি ব্যবহার করার জন্য আগ্রহের প্রোটিনের জন্য একটি উপযুক্ত অ্যান্টিবডি উপলব্ধ করা প্রয়োজন। অ্যাপ্লিকেশন রি এবং পুঘ ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরগুলির একটি ছোট সংগ্রহের উপর বিশ্লেষণ করে চিপ-এক্সো প্রবর্তন করেঃ রিব 1, গ্যাল 4, পিএইচডি 1, খামিরের মধ্যে র্যাপ 1 এবং মানুষের মধ্যে সিটিসিএফ। রিব1 সাইটগুলি প্রায়শই ক্লাস্টারে পাওয়া যেত এবং এই ক্লাস্টারগুলিতে প্রত্যাশার চেয়ে 10 গুণ বেশি দখল ছিল। ক্লাস্টারে গৌণ সাইটগুলি একটি প্রাথমিক বাঁধাই সাইট থেকে ~ 40 বিপি পাওয়া গেছে। গ্যাল 4-এর বাইন্ডিং মোটিফগুলি চারটি নিউক্লিওটাইডের মধ্যে তিনটির জন্য একটি শক্তিশালী পছন্দ দেখিয়েছিল, যা গ্যাল 4 এবং বাদ দেওয়া নিউক্লিওটাইডের মধ্যে একটি নেতিবাচক মিথস্ক্রিয়ার পরামর্শ দেয়। পিএইচডি1 তিনটি ভিন্ন মোটিফকে স্বীকৃতি দেয় যা পিএইচডি1-এর বাঁধাই মোটিফের অস্পষ্টতার পূর্ববর্তী প্রতিবেদনগুলি ব্যাখ্যা করে। র্যাপ1 চারটি মোটিফ শনাক্ত করতে দেখা গেছে। এই প্রোটিন দ্বারা আবদ্ধ রাইবোসোমাল প্রোটিন জিনের একটি শক্তিশালী ঐকমত্য ক্রম সহ একটি নির্দিষ্ট মোটিফ ব্যবহার করার প্রবণতা ছিল। অন্যান্য জিনগুলি প্রায়শই দুর্বল ঐকমত্য মোটিফের ক্লাস্টার ব্যবহার করত, সম্ভবত অনুরূপ দখল অর্জনের জন্য। সি. টি. সি. এফ-এর বাইন্ডিং মোটিফ চারটি "মডিউল" নিযুক্ত করে। আবদ্ধ সিটিসিএফ সাইটগুলির অর্ধেক মডিউল 1 এবং 2 ব্যবহার করে, বাকিরা চারটির কিছু সংমিশ্রণ ব্যবহার করে। এটি বিশ্বাস করা হয় যে সি. টি. সি. এফ এই মডিউলগুলির বিভিন্ন সংমিশ্রণ সনাক্ত করতে তার দস্তা আঙ্গুলগুলি ব্যবহার করে। রি এবং পুঘ স্যাকারোমাইসেস জিনোমের প্রাক-সূচনা জটিল (পিআইসি) কাঠামো এবং সংগঠন বিশ্লেষণ করেছেন। চিপ-এক্সো ব্যবহার করে, তারা অন্যান্য আবিষ্কারের মধ্যে, টাটা-কম বলে রিপোর্ট করা প্রবর্তকদের মধ্যে টাটার মতো বৈশিষ্ট্যগুলি সঠিকভাবে সনাক্ত করতে সক্ষম হয়েছিল। আরও দেখুন ক্রোমাটিন ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন চিপ-সিকোয়েন্সিং চিপ-অন-চিপ প্রোটিন-ডিএনএ মিথস্ক্রিয়া রেফারেন্স বাহ্যিক লিঙ্ক উচ্চ সংজ্ঞায় ডিএনএ-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া উচ্চ-রেজোলিউশন ক্রোমাটিন ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন বাঁধাই ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর সমাধান গুরুত্বপূর্ণ জিন-রেগুলেশন প্রোটিন নতুন পদ্ধতি দ্বারা পিনপয়েন্ট করা সেক্সোরঃ চিআইপি-এক্সোতে উচ্চ-রেজোলিউশন প্রোটিন-ডিএনএ মিথস্ক্রিয়া উন্মোচন করার জন্য একটি আর/বায়োকন্ডাক্টর প্যাকেজ আণবিক জীববিজ্ঞান আণবিক জীববিজ্ঞান কৌশল জিনোমিক্স ডিএনএ সিকোয়েন্সিং বায়োইনফরম্যাটিক্স