Illumina dye sequencing
ইলুমিনা ডাই সিকোয়েন্সিং হল একটি কৌশল যা ডি. এন. এ-তে বেস জোড়ার সিরিজ নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়, যা ডি. এন. এ সিকোয়েন্সিং নামেও পরিচিত। বিপরীতমুখী সমাপ্ত রসায়ন ধারণাটি প্যারিসের পাস্তুর ইনস্টিটিউটে ব্রুনো ক্যানার্ড এবং সাইমন সরফাতি উদ্ভাবন করেছিলেন। এটি কেম্ব্রিজ বিশ্ববিদ্যালয়ের শঙ্কর বালাসুব্রমনিয়ান এবং ডেভিড ক্লেনারম্যান দ্বারা বিকশিত হয়েছিল, যারা পরবর্তীকালে সোলেক্সা প্রতিষ্ঠা করেছিলেন, যে সংস্থাটি পরে ইলুমিনা দ্বারা অধিগ্রহণ করা হয়েছিল। এই সিকোয়েন্সিং পদ্ধতিটি বিপরীতমুখী ডাই-টার্মিনেটরের উপর ভিত্তি করে তৈরি যা একক নিউক্লিওটাইডগুলি ডিএনএ স্ট্র্যান্ডের উপর ধুয়ে সনাক্ত করতে সক্ষম করে। এটি পুরো-জিনোম এবং অঞ্চল সিকোয়েন্সিং, ট্রান্সক্রিপ্টোম বিশ্লেষণ, মেটাজেনমিক্স, ছোট আরএনএ আবিষ্কার, মিথাইলেশন প্রোফাইলিং এবং জিনোম-ওয়াইড প্রোটিন-নিউক্লিক অ্যাসিড মিথস্ক্রিয়া বিশ্লেষণের জন্যও ব্যবহার করা যেতে পারে। সংক্ষিপ্ত বিবরণ এটি তিনটি মৌলিক ধাপে কাজ করেঃ পরিবর্ধন, ক্রম এবং বিশ্লেষণ। প্রক্রিয়াটি বিশুদ্ধ ডিএনএ দিয়ে শুরু হয়। ডিএনএ খণ্ডিত হয় এবং অ্যাডাপ্টারগুলি যুক্ত করা হয় যার মধ্যে এমন অংশ থাকে যা পরিবর্ধন, ক্রমবিন্যাস এবং বিশ্লেষণের সময় রেফারেন্স পয়েন্ট হিসাবে কাজ করে। পরিবর্তিত ডিএনএ একটি প্রবাহ কোষে লোড করা হয় যেখানে পরিবর্ধন এবং সিকোয়েন্সিং হবে। প্রবাহ কোষে ন্যানোওয়েল থাকে যা টুকরোগুলি বের করে দেয় এবং অতিরিক্ত ভিড়ের ক্ষেত্রে সহায়তা করে। প্রতিটি ন্যানোওয়েলে অলিগোনিউক্লিওটাইড থাকে যা অ্যাডাপ্টারগুলিকে সংযুক্ত করার জন্য একটি নোঙ্গর বিন্দু প্রদান করে। একবার টুকরোগুলি সংযুক্ত হয়ে গেলে, ক্লাস্টার জেনারেশন নামে একটি পর্যায় শুরু হয়। এই পদক্ষেপটি ডি. এন. এ-র প্রতিটি খণ্ডের প্রায় এক হাজার কপি তৈরি করে এবং ব্রিজ এম্প্লিফিকেশন পি. সি. আর দ্বারা করা হয়। এরপরে, প্রাইমার এবং পরিবর্তিত নিউক্লিওটাইডগুলি চিপে ধুয়ে ফেলা হয়। এই নিউক্লিওটাইডগুলির একটি বিপরীতমুখী ফ্লুরোসেন্ট ব্লকার রয়েছে তাই ডিএনএ পলিমারেজ ডিএনএ খণ্ডে একবারে কেবল একটি নিউক্লিওটাইড যুক্ত করতে পারে। সংশ্লেষণের প্রতিটি রাউন্ডের পরে, একটি ক্যামেরা চিপের একটি ছবি তোলে। একটি কম্পিউটার নির্ধারণ করে যে ফ্লুরোসেন্ট ট্যাগের তরঙ্গদৈর্ঘ্য দ্বারা কোন বেস যোগ করা হয়েছিল এবং চিপের প্রতিটি স্থানের জন্য এটি রেকর্ড করে। প্রতিটি রাউন্ডের পরে, অ-সংশ্লেষিত অণুগুলি ধুয়ে ফেলা হয়। তারপরে 3 'ফ্লুরোসেন্ট টার্মিনাল ব্লকিং গ্রুপটি অপসারণ করতে একটি রাসায়নিক ডিবলকিং পদক্ষেপ ব্যবহার করা হয়। সম্পূর্ণ ডিএনএ অণুটি সিকোয়েন্স না হওয়া পর্যন্ত প্রক্রিয়াটি চলতে থাকে। এই প্রযুক্তির সাহায্যে জিনোম জুড়ে হাজার হাজার স্থান বিশাল সমান্তরাল সিকোয়েন্সিংয়ের মাধ্যমে একবারে সিকোয়েন্স করা হয়। পদ্ধতি জিনোমিক লাইব্রেরি ডিএনএ শুদ্ধ করার পরে একটি ডিএনএ লাইব্রেরি, জিনোমিক লাইব্রেরি তৈরি করা প্রয়োজন। দুটি উপায়ে একটি জিনোমিক লাইব্রেরি তৈরি করা যেতে পারে, সোনিকেশন এবং ট্যাগমেন্টেশন। ট্যাগমেন্টেশনের মাধ্যমে, ট্রান্সপোজেসগুলি এলোমেলোভাবে ডিএনএকে 50 থেকে 500 বিপি খণ্ডের মধ্যে আকারে কেটে দেয় এবং একই সাথে অ্যাডাপ্টর যোগ করে। জিনোমিক ডি. এন. এ-কে খণ্ডিত করতে সোনিকেশন ব্যবহার করে একটি জেনেটিক লাইব্রেরি তৈরি করা যেতে পারে। অতিস্বনক শব্দ তরঙ্গ ব্যবহার করে সোনিকেশন ডি. এন. এ-কে একই আকারে বিভক্ত করে। সোনিকেশনের পরে ডান এবং বাম অ্যাডাপ্টারগুলিকে টি7 ডিএনএ পলিমারেজ এবং টি4 ডিএনএ লাইগেজ দ্বারা সংযুক্ত করতে হবে। যে স্ট্র্যান্ডগুলিতে অ্যাডাপ্টারগুলি সংযুক্ত থাকে না সেগুলি ধুয়ে ফেলা হয়। অ্যাডাপ্টারের তিনটি ভিন্ন অংশ রয়েছেঃ কঠিন সহায়তার পরিপূরক ক্রম (প্রবাহ কোষে অলিগোনিউক্লিওটাইড), বারকোড ক্রম (সূচক) এবং সিকোয়েন্সিং প্রাইমারের জন্য বাঁধাই স্থান। সূচকগুলি সাধারণত ছয়টি বেস জোড়া লম্বা হয় এবং নমুনাগুলি সনাক্ত করতে ডিএনএ সিকোয়েন্স বিশ্লেষণের সময় ব্যবহৃত হয়। সূচকগুলি 96 টি পর্যন্ত বিভিন্ন নমুনা একসাথে চালানোর অনুমতি দেয়, এটি মাল্টিপ্লেক্সিং নামেও পরিচিত। বিশ্লেষণের সময়, কম্পিউটার একই সূচকের সাথে সমস্ত পাঠকে একত্রিত করবে। ইলুমিনা একটি "সংশ্লেষণ দ্বারা ক্রম" পদ্ধতি ব্যবহার করে। এই প্রক্রিয়াটি একটি অ্যাক্রিলামাইড-লেপা কাচের প্রবাহ কোষের ভিতরে ঘটে। প্রবাহ কোষে অলিগোনিউক্লিওটাইড (ছোট নিউক্লিওটাইড ক্রম) থাকে যা কোষের নীচে আবরণ করে এবং ক্রমবিন্যাসের সময় ডিএনএ স্ট্র্যান্ডগুলিকে ধরে রাখার জন্য এগুলি শক্ত সমর্থন হিসাবে কাজ করে। যেহেতু খণ্ডিত ডিএনএ প্রবাহ কোষের উপর ধুয়ে ফেলা হয়, উপযুক্ত অ্যাডাপ্টার পরিপূরক কঠিন সমর্থনের সাথে সংযুক্ত হয়। সেতু সম্প্রসারণ একবার সংযুক্ত হলে, গুচ্ছ উৎপাদন শুরু হতে পারে। লক্ষ্য হল ডি. এন. এ-র শত শত অভিন্ন স্ট্র্যান্ড তৈরি করা। কিছু সামনের স্ট্র্যান্ড হবে; বাকি, বিপরীত। এই কারণেই ডান এবং বাম অ্যাডাপ্টার ব্যবহার করা হয়। সেতু সম্প্রসারণের মাধ্যমে গুচ্ছ তৈরি করা হয়। ডিএনএ পলিমারেজ ডিএনএর একটি স্ট্র্যান্ড বরাবর চলে যায়, তার পরিপূরক স্ট্র্যান্ড তৈরি করে। মূল স্ট্র্যান্ডটি ধুয়ে ফেলা হয়, কেবল বিপরীত স্ট্র্যান্ডটি রেখে যায়। বিপরীত স্ট্র্যান্ডের শীর্ষে একটি অ্যাডাপ্টার ক্রম রয়েছে। ডিএনএ স্ট্র্যান্ড বাঁক নেয় এবং অলিগোর সাথে সংযুক্ত হয় যা শীর্ষ অ্যাডাপ্টার ক্রমের পরিপূরক। পলিমারাসগুলি বিপরীত স্ট্র্যান্ডের সাথে সংযুক্ত থাকে এবং এর পরিপূরক স্ট্র্যান্ড (যা মূলটির সাথে অভিন্ন) তৈরি করা হয়। এখন ডাবল স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ-কে বিকৃত করা হয় যাতে প্রতিটি স্ট্র্যান্ড পৃথকভাবে প্রবাহ কোষে নোঙ্গর করা অলিগোনিউক্লিওটাইড ক্রমের সাথে সংযুক্ত হতে পারে। একটি হবে বিপরীত স্ট্র্যান্ড এবং অন্যটি হবে সামনের স্ট্র্যান্ড। এই প্রক্রিয়াকে ব্রিজ এম্প্লিফিকেশন বলা হয় এবং এটি একবারে ফ্লো সেল জুড়ে হাজার হাজার ক্লাস্টারের ক্ষেত্রে ঘটে। ক্লোনাল পরিবর্ধন বারবার, ডিএনএ স্ট্র্যান্ডগুলি বাঁকবে এবং কঠিন সমর্থনের সাথে সংযুক্ত হবে। ডি. এন. এ পলিমারেজ একটি নতুন স্ট্র্যান্ডকে সংশ্লেষিত করে একটি ডাবল স্ট্র্যান্ডেড সেগমেন্ট তৈরি করবে এবং এটি বিকৃত করা হবে যাতে একটি অঞ্চলের সমস্ত ডি. এন. এ স্ট্র্যান্ড একটি একক উৎস থেকে আসে (ক্লোনাল পরিবর্ধন)। গুণমান নিয়ন্ত্রণের উদ্দেশ্যে ক্লোনাল পরিবর্ধন গুরুত্বপূর্ণ। যদি কোনও স্ট্র্যান্ডের একটি বিজোড় ক্রম পাওয়া যায়, তবে বিজ্ঞানীরা বিপরীত স্ট্র্যান্ডটি পরীক্ষা করে দেখতে পারেন যে এটির একই অদ্ভুততার পরিপূরক রয়েছে কিনা। সামনের এবং বিপরীত স্ট্র্যান্ডগুলি শিল্পকর্মের বিরুদ্ধে সুরক্ষার জন্য চেক হিসাবে কাজ করে। যেহেতু ইলুমিনা সিকোয়েন্সিং ডিএনএ পলিমারেজ ব্যবহার করে, তাই বেস প্রতিস্থাপন ত্রুটি দেখা গেছে, বিশেষ করে 3 'প্রান্তে। ক্লাস্টার প্রজন্মের সাথে যুক্ত শেষ রিডগুলি একটি ত্রুটি ঘটেছে তা নিশ্চিত করতে পারে। বিপরীত এবং সামনের স্ট্র্যান্ডগুলি একে অপরের পরিপূরক হওয়া উচিত, সমস্ত বিপরীত রিডগুলি একে অপরের সাথে মিলে যাওয়া উচিত এবং সমস্ত সামনের রিডগুলি একে অপরের সাথে মিলে যাওয়া উচিত। যদি একটি রিড তার প্রতিরূপগুলির সাথে যথেষ্ট মিল না থাকে (যার সাথে এটি একটি ক্লোন হওয়া উচিত), একটি ত্রুটি ঘটতে পারে। কিছু গবেষণাগারের বিশ্লেষণে 97 শতাংশ সাদৃশ্যের ন্যূনতম সীমা ব্যবহার করা হয়েছে। সংশ্লেষণের মাধ্যমে ক্রম ক্লোনাল পরিবর্ধন শেষে, সমস্ত বিপরীত স্ট্র্যান্ডগুলি প্রবাহ কোষ থেকে ধুয়ে ফেলা হয়, কেবল সামনের স্ট্র্যান্ডগুলি রেখে যায়। একটি প্রাইমার সামনের স্ট্র্যান্ড অ্যাডাপ্টার প্রাইমার বাঁধাই সাইটের সাথে সংযুক্ত হয় এবং একটি পলিমারেজ ডিএনএ স্ট্র্যান্ডে একটি ফ্লুরোসেন্টলি ট্যাগ করা ডিএনটিপি যোগ করে। ফ্লুরোফোর ব্লকিং গ্রুপ হিসাবে কাজ করার কারণে প্রতি রাউন্ডে শুধুমাত্র একটি বেস যুক্ত করা যেতে পারে; তবে, ব্লকিং গ্রুপটি বিপরীতমুখী। চার রঙের রসায়ন ব্যবহার করে, চারটি ভিত্তির প্রত্যেকটির একটি অনন্য নির্গমন রয়েছে এবং প্রতিটি বৃত্তের পরে, যন্ত্রটি রেকর্ড করে যে কোন ভিত্তি যোগ করা হয়েছিল। একবার রঙটি রেকর্ড করা হলে ফ্লুরোফোর ধুয়ে ফেলা হয় এবং আরেকটি ডিএনটিপি ফ্লো সেলের উপর দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয় এবং প্রক্রিয়াটি পুনরাবৃত্তি করা হয়। নেক্সটসেক এবং পরে মিনিসেক-এর প্রবর্তন দিয়ে শুরু করে, ইলুমিনা একটি নতুন দুই রঙের সিকোয়েন্সিং রসায়ন চালু করে। নিউক্লিওটাইডগুলি দুটি রঙের মধ্যে একটি (লাল বা সবুজ), কোনও রঙ ("কালো") বা উভয় রঙের সংমিশ্রণ (লাল এবং সবুজ রঙের মধ্যে মিশ্রণ হিসাবে কমলা প্রদর্শিত) দ্বারা আলাদা করা হয়। একবার ডিএনএ স্ট্র্যান্ডটি পড়া হয়ে গেলে, যে স্ট্র্যান্ডটি সবেমাত্র যোগ করা হয়েছিল তা ধুয়ে ফেলা হয়। তারপর, সূচক 1 প্রাইমার সংযুক্ত হয়, সূচক 1 ক্রমকে পলিমারাইজ করে এবং ধুয়ে ফেলা হয়। স্ট্র্যান্ডটি আবার একটি সেতু গঠন করে এবং ডিএনএ স্ট্র্যান্ডের 3 'প্রান্তটি প্রবাহ কোষের একটি অলিগোর সাথে সংযুক্ত হয়। সূচক 2 প্রাইমার সংযুক্ত হয়, ক্রমকে পলিমারাইজ করে এবং ধুয়ে ফেলা হয়। একটি পলিমারেজ খিলানযুক্ত স্ট্র্যান্ডের উপরে পরিপূরক স্ট্র্যান্ডকে ক্রমবদ্ধ করে। এগুলি আলাদা হয়ে যায় এবং প্রতিটি স্ট্র্যান্ডের 3 'প্রান্তটি অবরুদ্ধ থাকে। সামনের স্ট্র্যান্ডটি ধুয়ে ফেলা হয় এবং সংশ্লেষণ দ্বারা ক্রম প্রক্রিয়াটি বিপরীত স্ট্র্যান্ডের জন্য পুনরাবৃত্তি করে। তথ্য বিশ্লেষণ একবারে লক্ষ লক্ষ ক্লাস্টারের জন্য সিকোয়েন্সিং ঘটে এবং প্রতিটি ক্লাস্টারে ডিএনএ সন্নিবেশের ~ 1,000 অভিন্ন অনুলিপি থাকে। ক্রমের তথ্য বিশ্লেষণ করা হয় ওভারল্যাপিং অঞ্চলগুলির সাথে টুকরোগুলি খুঁজে বের করে, যাকে বলা হয় কনটিগস, এবং সেগুলিকে সারিবদ্ধ করে। যদি একটি রেফারেন্স ক্রম জানা যায়, তবে বৈকল্পিক সনাক্তকরণের জন্য কনটিগগুলি এর সাথে তুলনা করা হয়। এই পিসমিল প্রক্রিয়াটি বিজ্ঞানীদের সম্পূর্ণ ক্রমটি দেখতে দেয় যদিও একটি অবিচ্ছেদ্য ক্রমটি কখনও চালানো হয়নি; যাইহোক, যেহেতু ইলুমিনা পড়ার দৈর্ঘ্য খুব দীর্ঘ নয় (হাইসেক সিকোয়েন্সিং প্রায় 90 বিপি দীর্ঘ পড়ার দৈর্ঘ্য তৈরি করতে পারে), এটি সংক্ষিপ্ত ট্যান্ডেম পুনরাবৃত্তি অঞ্চলগুলি সমাধান করার জন্য একটি সংগ্রাম হতে পারে। এছাড়াও, যদি ক্রমটি ডি নভো হয় এবং একটি রেফারেন্স বিদ্যমান না থাকে, তবে পুনরাবৃত্ত অঞ্চলগুলি ক্রম সমাবেশে অনেক অসুবিধা সৃষ্টি করতে পারে। অতিরিক্ত অসুবিধাগুলির মধ্যে রয়েছে ভুল পলিমারেজ, চিমেরিক সিকোয়েন্স এবং পিসিআর-বায়াস দ্বারা বেস প্রতিস্থাপন (বিশেষত 3 'রিডের শেষে), যার সবগুলিই একটি ভুল সিকোয়েন্স তৈরিতে অবদান রাখতে পারে। অন্যান্য সিকোয়েন্সিং পদ্ধতির সাথে তুলনা এই কৌশলটি স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিংয়ের মতো ঐতিহ্যবাহী সিকোয়েন্সিং পদ্ধতির তুলনায় বেশ কয়েকটি সুবিধা প্রদান করে। স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য দুটি বিক্রিয়া প্রয়োজন, একটি ফরওয়ার্ড প্রাইমারের জন্য এবং অন্যটি বিপরীত প্রাইমারের জন্য। ইলুমিনার বিপরীতে, স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং ডিএনএ খণ্ডের ক্রম নির্ধারণ করতে ফ্লুরোসেন্ট লেবেলযুক্ত ডাইডিওক্সিন্যুক্লিওসাইড ট্রাইফসফেট (ডিডিএনটিপি) ব্যবহার করে। ডি. ডি. এন. টি. পি-তে 3 'ও. এইচ গ্রুপ অনুপস্থিত থাকে এবং ডি. এন. এ সংশ্লেষণ স্থায়ীভাবে বন্ধ হয়ে যায়। প্রতিটি বিক্রিয়া নলের মধ্যে ডিএনএ পলিমারেজ এবং প্রাইমারের পাশাপাশি ডিএনটিপি এবং ডিডিএনটিপি যোগ করা হয়। ডি. ডি. এন. টি. পি-র সঙ্গে ডি. ডি. এন. টি. পি-র অনুপাত গুরুত্বপূর্ণ কারণ টেমপ্লেট ডি. এন. এ-কে সম্পূর্ণরূপে সংশ্লেষিত করা প্রয়োজন, এবং ডি. ডি. এন. টি. পি-র আধিক্য ডি. এন. এ টেমপ্লেটের একই আকার এবং অবস্থানের একাধিক টুকরো তৈরি করবে। যখন ডি. এন. এ পলিমারেজ একটি ডি. ডি. এন. টি. পি যোগ করে তখন খণ্ডটি শেষ হয়ে যায় এবং একটি নতুন খণ্ড সংশ্লেষিত হয়। সংশ্লেষিত প্রতিটি খণ্ড শেষটির চেয়ে একটি করে নিউক্লিওটাইড দীর্ঘ। একবার ডিএনএ টেমপ্লেট সম্পূর্ণরূপে সংশ্লেষিত হয়ে গেলে, টুকরোগুলি ক্যাপিলারি ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা পৃথক করা হয়। ক্যাপিলারি টিউবের নীচে একটি লেজার ফ্লুরোসেন্ট লেবেলযুক্ত ডি. ডি. এন. টি. পি-কে উত্তেজিত করে এবং একটি ক্যামেরা নির্গত রঙ ধারণ করে। ইলুমিনা ডাই সিকোয়েন্সিংয়ের স্বয়ংক্রিয় প্রকৃতির কারণে একবারে একাধিক স্ট্র্যান্ড সিকোয়েন্স করা এবং দ্রুত প্রকৃত সিকোয়েন্সিং ডেটা অর্জন করা সম্ভব। স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিংয়ের সাথে, শুধুমাত্র একটি স্ট্র্যান্ড একবারে সিকোয়েন্স করা যায় এবং তুলনামূলকভাবে ধীর হয়। ইলুমিনা অন্যান্য সিকোয়েন্সিং কৌশলগুলির দ্বারা প্রয়োজনীয় একাধিক, ব্যয়বহুল এনজাইমের বিপরীতে শুধুমাত্র ডিএনএ পলিমারেজ ব্যবহার করে। পাইরোসেকুয়েন্সিং)। রেফারেন্স ডিএনএ সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি