Terminal amine isotopic labeling of substrates
টার্মিনাল অ্যামাইন আইসোটোপিক লেবেলিং অফ সাবস্ট্রেটস (টি. এ. আই. এল. এস) হল পরিমাণগত প্রোটিওমিক্সের একটি পদ্ধতি যা প্রতিটি প্রোটিনের এন-টার্মিনাল টুকরোগুলির (এন-টার্মিনাল পেপটাইড) উপর ভিত্তি করে নমুনার প্রোটিন সামগ্রী চিহ্নিত করে এবং নমুনার মধ্যে প্রোটিনের প্রাচুর্যের পার্থক্য সনাক্ত করে। এন-টার্মিনাল পেপটাইডের উপর ভিত্তি করে অন্যান্য পদ্ধতির মতো, এই পরীক্ষাটি ট্রিপসিন ব্যবহার করে প্রোটিনগুলিকে টুকরো টুকরো করে এবং এন-টার্মিনাল পেপটাইডগুলিকে (মূল প্রোটিনের এন-টার্মিনি ধারণকারী টুকরো) অন্যান্য টুকরো থেকে (অভ্যন্তরীণ ট্রিপ্টিক পেপটাইড) পৃথক করে। টেলস অভ্যন্তরীণ ট্রিপ্টিক পেপটাইডগুলি সনাক্ত করে এবং অপসারণ করে এন-টার্মিনাল পেপটাইডগুলিকে পৃথক করে। এই নেতিবাচক নির্বাচন টি. এ. আই. এল. এস পদ্ধতিকে প্রদত্ত নমুনার সমস্ত এন-টার্মিনি সনাক্ত করার অনুমতি দেয়। এন-টার্মিনাল পেপটাইডগুলি সনাক্ত করার জন্য এন-টার্মিনাসের মুক্ত অ্যামিনো গ্রুপের উপর নির্ভর করে এমন বিকল্প পদ্ধতিগুলি কিছু এন-টার্মিনি সনাক্ত করতে পারে না কারণ সেগুলি "প্রাকৃতিকভাবে অবরুদ্ধ" (অর্থাৎ। প্রাকৃতিক প্রোটিনের একটি মুক্ত অ্যামিনো গ্রুপ নেই)। টি. এ. আই. এল. এস পদ্ধতির বেশ কয়েকটি প্রয়োগ রয়েছে যার মধ্যে রয়েছে নতুন সাবস্ট্রেট এবং প্রোটিজেস সনাক্তকরণ (যার একটি অজানা এবং বিস্তৃত নির্দিষ্টতা রয়েছে) এবং প্রোটিনের সমাপ্তি সংজ্ঞায়িত করার একটি উপায় যা প্রোটিন টীকাকে সক্ষম করে। ক্যান্সারের মতো রোগে বিভিন্ন সংজ্ঞায়িত জৈবিক পথের সাথে প্রোটিজগুলিকে যুক্ত করতে টি. এ. আই. এল. এস ব্যবহার করা যেতে পারে, যাতে রোগের অবস্থার সাথে জড়িত সাবস্ট্রেট এবং প্রোটিজগুলি সম্পর্কে আরও স্পষ্ট ধারণা পাওয়া যায়। মেথড টেলস হল এন-টার্মিনাল পেপটাইডের লেবেলিং এবং বিচ্ছিন্নকরণের জন্য একটি 2ডি বা 3ডি প্রোটিওমিক্স ভিত্তিক পরীক্ষা, যা ব্রিটিশ কলম্বিয়া বিশ্ববিদ্যালয়ের একটি গোষ্ঠী দ্বারা তৈরি করা হয়েছে। টি. এ. আই. এল. এস পদ্ধতিটি একাধিক প্রোটিজ চিকিত্সা করা কোষের তুলনা এবং প্রোটিওম কোষ নিয়ন্ত্রণের জন্য তৈরি করা হয়েছে। টিস্যু, ফাইব্রোব্লাস্ট, ক্যান্সার কোষ এবং তরল নিঃসরণ সহ বিভিন্ন উৎস থেকে নমুনা সংগ্রহ করা যেতে পারে। এই পরীক্ষাটি আল্ট্রাফিল্ট্রেশনের মাধ্যমে অভ্যন্তরীণ ট্রিপ্টিক পেপটাইডগুলি অপসারণ করে এন-টার্মিনাল পেপটাইডগুলিকে পৃথক করে দেয় এবং লেবেলযুক্ত পরিপক্ক এন-টার্মিনাল এবং নিও-এন-টার্মিনাল পেপটাইডগুলিকে টেন্ডেম মাস স্পেকট্রোমেট্রি (এমএস/এমএস) দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়। এই নেতিবাচক নির্বাচন টি. এ. আই. এল. এস পদ্ধতিকে প্রদত্ত নমুনার সমস্ত এন-টার্মিনি সনাক্ত করার অনুমতি দেয়। এন-টার্মিনাল পেপটাইডগুলি পৃথক করার জন্য এন-টার্মিনাসের মুক্ত অ্যামিনো গ্রুপের উপর নির্ভর করে এমন বিকল্প পদ্ধতিগুলি প্রাকৃতিকভাবে অবরুদ্ধ এন-টার্মিনি সনাক্ত করতে পারে না কারণ তাদের একটি মুক্ত অ্যামিনো গ্রুপ নেই। টি. এ. আই. এল. এস-এর পরীক্ষার জন্য পেপটাইডের শুধুমাত্র ছোট নমুনা প্রয়োজন (<আই. ডি. 1> ইউ. জি), প্রোটিজগুলির সাথে ব্যবহার করা যেতে পারে যার অজানা বা বিস্তৃত নির্দিষ্টতা রয়েছে এবং নমুনা লেবেলিংয়ের জন্য বিভিন্ন পদ্ধতি সমর্থন করে। যাইহোক, এটি দুই বা ততোধিক ভিন্ন এবং অনন্য পেপটাইড (মূল পরিপক্ক এন-টার্মিনাসগুলির মধ্যে একটি এবং/অথবা ক্লিভেজ সাইটের মাধ্যমে এক বা একাধিক নিও-এন-টার্মিনাল পেপটাইড) দ্বারা 50 শতাংশ প্রোটিনকে চিহ্নিত করে যা স্বাধীন জৈবিক ঘটনাগুলির প্রতিনিধিত্ব করে না তাই পরিমাপের জন্য গড় করা যায় না। একক পেপটাইড-ক্ষার এন-টার্মিনোম বিশ্লেষণের জন্য ফলাফল যাচাই করতেও অসুবিধা হয়। একটি নিয়ন্ত্রণ নমুনা (স্বাভাবিক প্রোটোলাইটিক ক্রিয়াকলাপ প্রদর্শন) এবং একটি চিকিত্সা করা নমুনা (যা এই উদাহরণে একটি অতিরিক্ত প্রোটোলাইটিক ক্রিয়াকলাপ প্রদর্শন করে) তুলনা করে ডাইমিথাইলেশন-টেলস পরীক্ষার জন্য নিম্নলিখিত পদক্ষেপগুলি রয়েছে। প্রোটিওম-ওয়াইড প্রোটিওলাইসিস চিকিত্সা করা নমুনায় অতিরিক্ত প্রোটিওলিটিক ক্রিয়াকলাপ সহ চিকিত্সা করা এবং নিয়ন্ত্রণ করা উভয় নমুনায় ঘটে। প্রোটিজের নিষ্ক্রিয়তা এবং প্রোটিনের বিকৃতি এবং হ্রাস। স্থিতিশীল আইসোটোপ দিয়ে লেবেল করা। এটি নিয়ন্ত্রণ নমুনায় উদ্ভূত পেপটাইডগুলিকে চিকিত্সা করা নমুনায় উদ্ভূত পেপটাইডগুলির থেকে আলাদা করার অনুমতি দেয় যাতে তাদের আপেক্ষিক প্রাচুর্যের তুলনা করা যায়। এই উদাহরণে, প্রাথমিক অ্যামাইনের রিডাক্টিভ ডাইমিথাইলেশন দ্বারা লেবেলিং প্রয়োগ করা হয় যা চিকিত্সা করা নমুনার জন্য ভারী বা নিয়ন্ত্রণের জন্য হালকা ব্যবহার করে। এই বিক্রিয়াটি সোডিয়াম সায়ানোবোরোহাইড্রাইড দ্বারা অনুঘটকিত হয় এবং লেবেলযুক্ত মিথাইল গোষ্ঠীগুলিকে লাইসিন-অ্যামাইন এবং প্রোটিন এবং প্রোটিজ ক্লিভেজ পণ্যগুলির এন-টার্মিনিতে মুক্ত (জিএনএ)-অ্যামিনো গোষ্ঠীর সাথে সংযুক্ত করে। প্রতিক্রিয়াশীল অ্যামিনো গোষ্ঠীগুলিকে অবরুদ্ধ করা। এটি অভ্যন্তরীণ ট্রিপ্টিক পেপটাইডগুলিকে প্রক্রিয়াটির পরে সনাক্ত করার অনুমতি দেয় কারণ তারা প্রতিক্রিয়াশীল অ্যামিনো গ্রুপের সাথে একমাত্র পেপটাইড হবে। এই উদাহরণে লেবেলিং প্রতিক্রিয়া (রিডাক্টিভ ডাইমিথাইলেশন) প্রতিক্রিয়াশীল অ্যামিনো গোষ্ঠীগুলিকেও অবরুদ্ধ করে। পুলিং। লেবেলযুক্ত দুটি প্রোটিওম এখন মিশ্রিত। এটি নিশ্চিত করে যে নমুনাগুলি পরবর্তী সমস্ত পদক্ষেপে একইভাবে চিকিত্সা করা হয় যাতে দুটি নমুনার প্রোটিনের আপেক্ষিক পরিমাণ আরও সঠিকভাবে পরিমাপ করা যায়। ট্রিপসিনাইজেশন। এটি প্রতিটি প্রোটিনকে টুকরো টুকরো করে দেয়। মূল প্রোটিনের লেবেলযুক্ত এন-টার্মিনি অবরুদ্ধ থাকে, অন্যদিকে নতুন অভ্যন্তরীণ ট্রিপ্টিক পেপটাইডগুলির একটি মুক্ত এন-টার্মিনাস থাকে। নেতিবাচক নির্বাচন। ট্রিপ্টিক পেপটাইড বাঁধাইয়ের জন্য নির্দিষ্ট একটি হাইপারব্র্যাঞ্চড পলিগ্লিসারল এবং অ্যালডিহাইড (এইচপিজি) পলিমার নমুনায় যোগ করা হয় এবং তাদের মুক্ত এন-টার্মিনির মাধ্যমে সদ্য উত্পন্ন ট্রিপ্টিক পেপটাইডগুলির সাথে প্রতিক্রিয়া জানায়। উপরের ধাপ 3-এর মতো, এই বিক্রিয়াটি সোডিয়াম সায়ানোবোরোহাইড্রাইড দ্বারা অনুঘটকিত হয়। ডাইমিথাইলেটেড লাইসিনের অ্যাসিটিলেটেড এবং আইসোটোপিকভাবে লেবেলযুক্ত প্রোটিন পেপটাইড এবং নিও (নতুন)-এন-টার্মিনাল পেপটাইডগুলি নিষ্ক্রিয় থাকে এবং আল্ট্রাফিল্ট্রেশন ব্যবহার করে পলি-অভ্যন্তরীণ ট্রিপ্টিক পেপটাইড কমপ্লেক্স থেকে পৃথক করা যেতে পারে। এলিউটেড আনবাউন্ড প্রোটিনগুলি এন-টার্মিনাল পেপটাইড এবং নিও-এন-টার্মিনাল পেপটাইডের সাথে অত্যন্ত ঘনীভূত হয়। এই বাদ দেওয়া নমুনাটি তারপর পরিমাপ করা হয় এবং এমএস/এমএস দ্বারা বিশ্লেষণ সম্পন্ন করা হয়। টি. এ. আই. এল. এস-এর চূড়ান্ত ধাপে বায়োইনফরমেটিক্স জড়িত। একটি হায়ারার্কিক্যাল সাবস্ট্রেট উইনোয়িং প্রক্রিয়া ব্যবহার করে যা একটি পেপটাইড আইসোটোপ পরিমাপ এবং নির্দিষ্ট বায়োইনফরম্যাটিক অনুসন্ধানের মানদণ্ড দ্বারা ব্যাকগ্রাউন্ড প্রোটিওলাইসিস পণ্য এবং নন-ক্লিভড প্রোটিন থেকে বৈষম্য করে। প্রকার টি. এ. এল. এস-এর প্রকারগুলি প্রোটিন এবং প্রোটিজ ক্লিভেজ পণ্যগুলির অ্যামিনো গ্রুপগুলিকে ব্লক এবং লেবেল করার জন্য ব্যবহৃত পদ্ধতিতে পৃথক হয়। এই অ্যামিনো গোষ্ঠীগুলির মধ্যে রয়েছে লাইসিন-অ্যামাইন এবং প্রোটিনের এন-টার্মিনির মুক্ত (গাং)-অ্যামিনো গোষ্ঠী। ডাইমিথাইলেশন-টেলস পদ্ধতি হল একটি রাসায়নিক লেবেলিং ভিত্তিক পদ্ধতি যা অ্যামাইন-প্রতিক্রিয়াশীল আইসোটোপিক বিকারক ব্যবহার করে এক ধাপে সঞ্চালিত হয়। দুটি নমুনার লেবেলিং 12CH2-ফর্মালডিহাইড (হালকা) বা 13CD2-ফর্মালডিহাইড (ভারী) ব্যবহার করে এবং অনুঘটক হিসাবে সোডিয়াম সায়ানোবোরোহাইড্রাইড ব্যবহার করে। এই পদ্ধতির সুবিধা হল এটি শক্তিশালী, দক্ষ এবং সাশ্রয়ী। নিয়ন্ত্রণ এবং প্রোটিজ চিকিত্সা করা নমুনাগুলির জন্য লেবেলিং পদ্ধতি অবশ্যই তাদের একত্রিত করার আগে আলাদাভাবে করা উচিত এবং এটি প্রতি পরীক্ষায় দুটি নমুনার মধ্যে সীমাবদ্ধ, যা একই সাথে একাধিক নমুনা অধ্যয়ন করার প্রয়োজন হলে একটি অসুবিধা হতে পারে। সেল কালচারে অ্যামিনো অ্যাসিডের সাথে স্থিতিশীল আইসোটোপ লেবেলিং (এস. আই. এল. এ. সি) একটি পদ্ধতি যা ভিভোতে করা যেতে পারে। এই পদ্ধতিটি সমস্ত কোষ কালচার পরীক্ষাগারে ব্যবহার করা যেতে পারে এবং এটি নিয়মিতভাবে ব্যবহৃত লেবেলিং কৌশল। এই বিপাকীয় লেবেলিং জৈবিক নমুনায় প্রদত্ত প্রোটিজের প্রতিরোধ এবং এক্স ভিভো প্রক্রিয়াকরণের বিশ্লেষণকে সক্ষম করে। রাসায়নিক লেবেলের তুলনায় এই বিপাকীয় লেবেলিং পদ্ধতিটি ব্যবহার করার একটি সুবিধা হল যে এটি সিরাম প্রোটিনের মতো দূষক থেকে তদন্ত করা প্রকৃত কোষীয় উদ্ভূত প্রোটিনের মধ্যে নির্ভরযোগ্য, দ্রুত এবং দক্ষ বৈষম্যের অনুমতি দেয়। পাঁচটি পর্যন্ত মাল্টিপ্লেক্স নমুনা বিশ্লেষণের জন্য এস. আই. এল. এ. সি টেইল ব্যবহার করা যেতে পারে। এস. আই. এল. এ. সি চিকিৎসাগতভাবে প্রাসঙ্গিক মানুষের নমুনার জন্য উপযুক্ত নয় যা বিপাকীয়ভাবে লেবেল করা যায় না। এসআইএলএসি একটি ব্যয়বহুল পদ্ধতি এবং বেশিরভাগ পরীক্ষাগারের জন্য এটি একটি সম্ভাব্য বিকল্প নাও হতে পারে। রিলেটিভ অ্যান্ড অ্যাবসলিউট কোয়ান্টিফিকেশন (আই. টি. আর. এ. কিউ) পদ্ধতি বা আই. টি. আর. এ. কিউ-টি. এ. আই. এল. এস-এর জন্য আইসোবারিক ট্যাগ একযোগে একাধিক নমুনার পরিমাণ নির্ধারণ করতে সক্ষম করে। এই পদ্ধতিতে চার-এবং আট-প্লেক্স আই. টি. আর. এ. কিউ বিকারক ব্যবহার করে মাল্টিপ্লেক্স পরীক্ষায় 4-8টি নমুনা থেকে একযোগে বিশ্লেষণ করার ক্ষমতা রয়েছে। এই পদ্ধতিটি নমুনাগুলির উচ্চ নির্ভুলতা সনাক্তকরণ এবং পরিমাণ প্রদান করে এবং নমুনা প্রতিলিপির আরও পুনরুত্পাদনযোগ্য বিশ্লেষণের অনুমতি দেয়। অন্যান্য আইট্র্যাক পদ্ধতির মতো, আইট্র্যাক-টেলসের জন্য একটি মাল্ডি মাস স্পেকট্রোমিটার এবং ব্যয়বহুল আইট্র্যাক বিকারক প্রয়োজন। বিকল্প পদ্ধতি এন টার্মিনি এবং প্রোটিওলাইসিস পণ্য অধ্যয়নের জন্য বেশ কয়েকটি বিকল্প পদ্ধতি রয়েছে। অ্যামাইনের অ্যাসিটাইলেশন অনুসরণ করে ট্রিপ্টিক ডাইজেশন এবং মুক্ত এন-টার্মিনাল পেপটাইডের বায়োটিনিলেশন মুক্ত লাইসিন এবং এন-টার্মিনি লেবেল করার জন্য রাসায়নিক (অ্যাসিটাইলেশন) ব্যবহার করে। অবরুদ্ধ এন-টার্মিনি তারপর নেতিবাচকভাবে নির্বাচিত হয়। যাইহোক, প্রাকৃতিকভাবে মুক্ত অভ্যন্তরীণ এন-টার্মিনি এবং অবরুদ্ধ এন-টার্মিনি অ্যাসিটিলেশনের পরে আলাদা করা যায় না। এই পদ্ধতিতে আইসোটোপিক লেবেলিং ব্যবহার করা হয় না, তাই ফলাফলের পরিমাণ নির্ধারণ করা কঠিন। এছাড়াও, পরীক্ষামূলক এবং পটভূমি প্রোটিওলাইসিস পণ্যগুলির মধ্যে পার্থক্য করা কঠিন। লাইসিন গুয়ানিডিনেশন অনুসরণ করে এন-টার্মিনির বায়োটিনিলেশন লাইসিনের অবশিষ্টাংশ এবং ট্যাগ মুক্ত এন-টার্মি ব্লক করতে একটি রাসায়নিক ব্যবহার করে। তারপর ট্যাগ করা মুক্ত এন-টার্মিনি নির্বাচন করা হয়। এই পদ্ধতির নেতিবাচক দিকটি হল প্রাকৃতিকভাবে অবরুদ্ধ এন-টার্মিনি ক্যাপচার করতে না পারার কারণে নন-ক্লিভড পেপটাইড ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত মডেলে ফলাফলগুলি প্রয়োগ করা যায় না। যেহেতু এতে আইসোটোপিক লেবেলিং জড়িত নয়, তাই ফলাফলগুলি পরিমাপ করা যায় না। ক্লিভেজ সাইটটিও ইতিমধ্যে লেবেল করার জন্য পরিচিত হতে হবে। এন-টার্মিনির সাবটিলিগেজ বায়োটিনিলেশন এন-টার্মিনাল পেপটাইডের এনজাইম্যাটিক লেবেলিং ব্যবহার করে, তবে লাইসিন ব্লকিং রাসায়নিক ব্যবহার করে না। লাইসিন ব্লকিং ছাড়া, অনেক ক্লিভড এন-টার্মিনাল পেপটাইড সনাক্তকরণের জন্য খুব ছোট হবে। ফলাফলগুলি সাবটিলিগেসের বৈশিষ্ট্যের উপর অত্যন্ত নির্ভরশীল হতে পারে তাই পক্ষপাতদুষ্ট হতে পারে। এই পদ্ধতিটি প্রাকৃতিকভাবে অবরুদ্ধ এন-টার্মিনি ক্যাপচার করে না এবং আইসোটোপিক লেবেলিংও ব্যবহার করে না তাই ফলাফলগুলি পরিমাপ করা কঠিন হবে। এন-টার্মিনির আই. টি. আর. এ. কিউ-লেবেলিং এন-টার্মিনির লেবেল করার জন্য আই. টি. আর. এ. কিউ ব্যবহার করে। নিও-এন-টার্মিনি পেপটাইডগুলি সিলিকো দিয়ে নির্বাচিত করা হয়। এই কৌশলটির নেতিবাচক দিকটি হল মাল্ডি মাস স্পেকট্রোমিটারের প্রয়োজন এবং প্রয়োজনীয় আইট্রাক বিকারকগুলি ব্যয়বহুল। এই পদ্ধতিটি প্রাকৃতিকভাবে অবরুদ্ধ এন-টার্মিনি ক্যাপচার করে না। পুরো প্রক্রিয়াটির জন্য 50-100 মিলিগ্রাম পেপটাইডের নমুনা প্রয়োজন হবে। সম্মিলিত ভগ্নাংশ তির্যক ক্রোমাটোগ্রাফি (সিওএফআরএডিআইসি) প্রাকৃতিকভাবে অবরুদ্ধ এন-টার্মিনি এবং প্রোটিজ উত্পন্ন নিও-এন-টার্মিনির জন্য বিভিন্ন লেবেলিংয়ের অনুমতি দেয়। সমস্ত অবরুদ্ধ এন-টার্মিনি নেতিবাচকভাবে নির্বাচিত হয়। তবে এই প্রক্রিয়ায় অনেক রাসায়নিক প্রক্রিয়াকরণ, ক্রোমাটোগ্রাফি এবং ভর বর্ণালীবিদ্যার প্রয়োজন হয়। সর্বোত্তম পৃথকীকরণের ফলাফলগুলি অ্যামিনো অ্যাসিড পরিবর্তনের উপর নির্ভর করে যেমন মেথিওনাইন জারণ পরিচালনা করার সময় ঘটে না। এই পদ্ধতিতে প্রতি নমুনায় 150টি এমএস/এমএস বিশ্লেষণের প্রয়োজন হয় তবে ভর বর্ণালী পরিমাপের জন্য নমুনাগুলি একত্রিত করা যেতে পারে (এবং বিশ্লেষণের সংখ্যা হ্রাস করা যেতে পারে)। এই কৌশলটি অজানা বা বিস্তৃত নির্দিষ্টতা সহ প্রোটিয়াসের জন্য ব্যবহার করার জন্য উপযুক্ত। আরও দেখুন এস. আই. এল. এ. সি আই. টি. আর. এ. কিউ রেফারেন্স প্রোটিওমিক্স মাস স্পেকট্রোমেট্রি