VINE-seq
ভাইন-সেক (ভেসেল আইসোলেশন অ্যান্ড নিউক্লি এক্সট্রাকশন ফর সিকোয়েন্সিং) হল একক-নিউক্লি রেজোলিউশনে মানব মস্তিষ্কের মাইক্রোভেসেলের ভাস্কুলার এবং পেরিভাসকুলার কোষগুলিকে পৃথক এবং আণবিকভাবে চিহ্নিত করার একটি পদ্ধতি। এই কৌশলটি মস্তিষ্কের টিস্যু নমুনাগুলির একক কোষে যান্ত্রিক বিচ্ছিন্নতা, মাইক্রোভেসেলগুলির নিউক্লিয়াগুলিকে পৃথক করার জন্য ঘনত্ব গ্রেডিয়েন্ট সেন্ট্রিফিউগেশন এবং পরিস্রাবণ, সেলুলার জনসংখ্যার ফ্লুরোসেন্স-অ্যাক্টিভেটেড সেল বাছাই (এফএসি) এবং ড্রপলেট-ভিত্তিক একক-নিউক্লি আরএনএ সিকোয়েন্সিং (ড্রপ-এসএনআরএনএ-এসইকিউ) সহ বিভিন্ন পরিচিত পরীক্ষাগার-ভিত্তিক কৌশলগুলির সংমিশ্রণের মাধ্যমে অর্জন করা হয়। সামগ্রিকভাবে, এটি মস্তিষ্কের ভাস্কুলেচারে উপস্থিত বিভিন্ন ধরনের কোষের একটি একক-নিউক্লি ট্রান্সক্রিপ্টমিক প্রোফাইল তৈরি করে। একক-নিউক্লি ট্রান্সক্রিপ্টোমিক তথ্য প্রক্রিয়াকরণ এবং বিশ্লেষণের মাধ্যমে, মানব মস্তিষ্কের ভাস্কুলেচারের আণবিক প্রাকৃতিক দৃশ্য নির্মাণের জন্য কোষের প্রকারের মধ্যে এবং মধ্যে বৈচিত্র্যকে আলাদা করা যেতে পারে যা আগে করা হয়নি। পটভূমি মস্তিষ্কের স্বাস্থ্যের একটি কেন্দ্রীয় বৈশিষ্ট্য হল জটিল ভাস্কুলেচারের রক্ষণাবেক্ষণ যা মানুষের মস্তিষ্কে প্রয়োজনীয় বিপাক, অক্সিজেন, পুষ্টি এবং বর্জ্য পরিবহনে কাজ করে। ভাস্কুলেচারে ব্যাঘাত ঘটলে আলঝেইমার রোগ এবং স্ট্রোকের মতো স্নায়বিক ব্যাধি হতে পারে। ভাস্কুলেচারে এন্ডোথেলিয়াল কোষ, পেরিসাইট, অ্যাস্ট্রোসাইট এবং লিউকোসাইট সহ সীমাবদ্ধ নয় এমন বিভিন্ন ধরনের কোষের একটি বৈচিত্র্যময় গোষ্ঠী রয়েছে। যদিও বছরের পর বছর ধরে ভাস্কুলেচারে কোষীয় বৈচিত্র্য বোঝার অনেক প্রচেষ্টা হয়েছে, পদ্ধতিগত এবং প্রযুক্তিগত সীমাবদ্ধতা মস্তিষ্কের জটিল সত্তাকে ডিকোড করার আমাদের ক্ষমতাকে বাধা দিয়েছে। অতএব, এই জটিল পরিবেশে ভাস্কুলার এবং পেরিভাসকুলার কোষগুলির অসম্পূর্ণ বৈশিষ্ট্যের কারণে স্নায়বিক ব্যাধিগুলির জন্য আমাদের চিকিত্সার বিকল্পগুলি অপর্যাপ্ত। একক-কোষ আর. এন. এ সিকোয়েন্সিং (এস. সি. আর. এন. এ-এস. কিউ)-এর সাম্প্রতিক অগ্রগতির মাধ্যমে, ইঁদুরের মস্তিষ্কের ভাস্কুলেচারের আণবিক অ্যাটলাসকে ডিকোড করা হয়েছে এবং মানুষের মস্তিষ্কে পাওয়া কোষের প্রকারের মধ্যে বৈচিত্র্যময় প্রকৃতি ধীরে ধীরে উন্মোচিত হয়েছে। এই অর্জনগুলি সত্ত্বেও, মুরিন মস্তিষ্কের ভাস্কুলেচার মানব মস্তিষ্কের ভাস্কুলেচারকে সম্পূর্ণরূপে পুনর্বিবেচনা করতে পারে না যা অনুবাদমূলক সম্ভাবনার উদ্বেগের দিকে পরিচালিত করে। উপরন্তু, মানুষের মস্তিষ্কের এস. সি. আর. এন. এ-বর্গের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করা পূর্ববর্তী অনেক গবেষণায় ভাস্কুলেচারে কোষীয় বৈচিত্র্যকে চিহ্নিত করা হয়নি। ভাইন-সেক নামে একটি অভিনব পদ্ধতি প্রবর্তন করে, একটি গবেষণা গোষ্ঠী মস্তিষ্কের মাইক্রোভেসেল থেকে অক্ষত নিউক্লিয়াসকে পৃথক করার একটি পদ্ধতি তৈরি করেছে। এটি সম্পন্ন করার জন্য, তাদের নিউক্লিয়াসের ক্ষতি না করে মাইক্রোভেসেলগুলিকে ঘিরে থাকা এক্সট্রাসেলুলার ম্যাট্রিক্স (ইসিএম) অপসারণের চ্যালেঞ্জ অতিক্রম করতে হয়েছিল। হিপোক্যাম্পাস এবং কর্টেক্স থেকে হিমায়িত মস্তিষ্কের টিস্যুতে ভাইন-সেক ব্যবহার করে, তারা একক-নিউক্লি রেজোলিউশনে মানব মস্তিষ্কের ভাস্কুলেচারে বিভিন্ন ধরনের কোষের প্রথম বৈশিষ্ট্য প্রদান করে। মানব মস্তিষ্কের ভাস্কুলেচারের বিশদ বিবরণ দেওয়ার জন্য ভাইন-সেক একটি অভিনব পদ্ধতি। এটি মস্তিষ্কের মধ্যে ভাস্কুলার এবং পেরিভাসকুলার কোষের ধরণের একটি অ্যাটলাস রচনা করার জন্য একক-নিউক্লিওটাইড ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্সের সাথে পরীক্ষাগার পদ্ধতির সংমিশ্রণ ব্যবহার করে। নিম্নলিখিত পদক্ষেপগুলি ভাইন-সেক প্রোটোকলের ভিত্তির বিশদ বিবরণ দেয়ঃ প্রোটোকলের প্রাথমিক অংশে স্প্লেনোসাইট বিচ্ছিন্নতা এবং নমুনা পরিষ্কার-পরিচ্ছন্নতা থেকে অভিযোজিত পদ্ধতি রয়েছে। ভাইন-সেকের জন্য, মানব মস্তিষ্কের টিস্যু প্রাথমিকভাবে ময়নাতদন্তের পরে বের করা হয়। গবেষকরা হিপোক্যাম্পাস এবং উচ্চতর সামনের কর্টেক্স থেকে মস্তিষ্কের টিস্যু বের করেন। টিস্যু নমুনাগুলি সম্পূর্ণরূপে মিশ্রিত না হওয়া পর্যন্ত এবং কোনও দৃশ্যমান টিস্যু অবশিষ্ট না থাকা পর্যন্ত সমজাতীয় করা হয়। এইচ. বি. এস. এস-এ নমুনাগুলি 32 শতাংশ ডেক্সট্রান দ্রবণের সঙ্গে মিশ্রিত করা হয়। ঘনীভূত ভাস্কুলেচারযুক্ত একটি পেলেট দিয়ে সেলুলার স্তরগুলি পৃথক করার জন্য 20 মিনিটের জন্য 4,400 গ্রামে সেন্ট্রিফিউগেশন করা হয়। মায়েলিন এবং প্যারেনকাইমাল কোষের অবশিষ্ট স্তরগুলি পেলেটকে বিরক্ত না করে অ্যাসপিরেটেড হয়। পেলেটগুলি ডেক্সট্রান দ্রবণে পুনরায় স্থগিত করা হয়। সেলুলার ধ্বংসাবশেষ থেকে পেলেটকে আরও জীবাণুমুক্ত করার জন্য পিবিএস দিয়ে একাধিক ধোয়া হয়। মাইক্রোভেসেলগুলি উন্মুক্ত করা হয় এবং অবশিষ্ট কোষীয় ধ্বংসাবশেষ অপসারণ করা হয়। মাউস স্প্লেনোসাইটগুলি বের করার জন্য নকশাকৃত একটি পদ্ধতি অভিযোজিত হয়েছিল এবং অবশিষ্ট ভাস্কুলার কোষ থেকে নিউক্লিয়াসকে বিচ্ছিন্ন করতে সহায়তা করার জন্য সঞ্চালিত হয়েছিল। নিউক্লিয়াস থেকে ভাস্কুলার কোষগুলিকে আলাদা করার জন্য 10 মিনিটের জন্য 500 গ্রামে সেন্ট্রিফিউগেশন করা হয় এবং লাইসিস বাফার, আরএনএজ ইনহিবিটর এবং ইডিটিএ-মুক্ত প্রোটিজ ইনহিবিটরের দ্রবণে পুনরায় স্থগিত করা হয়। নিউক্লিয়াসগুলি তারপর গ্লাস ডাউন্সার ব্যবহার করে সমজাতীয় করা হয়। সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে নমুনাগুলি আরও একবার ছিদ্র করা হয়। অবশিষ্ট কোষীয় ধ্বংসাবশেষ এবং উপজাতগুলি সুক্রোজ গ্রেডিয়েন্ট ওয়াশ এবং ফ্লুরোসেন্স-অ্যাক্টিভেটেড সেল সার্টিং (এফ. এ. সি. এস) ব্যবহার করে হ্রাস করা হয়। ছুরিগুলি বিশুদ্ধ করা হয় যাতে উচ্চমানের তথ্য পাওয়া যায়। অবশিষ্ট নিউক্লিয়াসের জন্য ফ্লো সাইটোমেট্রি ব্যবহার করা হয়। এই কৌশলটি ভাস্কুলার নিউক্লিয়াসের ভৌত এবং রাসায়নিক বৈশিষ্ট্য নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়। ফ্লো সাইটোমেট্রি-র পরীক্ষাগার সঞ্চালনগুলি প্রত্যাশিত মান থেকে 3.4 গুণ বেশি অনুমান করা হয়েছে। এর প্রতিক্রিয়ায়, গবেষকরা প্রতি নমুনায় প্রায় 10,000 নিউক্লিয়াস পাওয়ার জন্য আরও নিউক্লিয়াসকে পৃথক ও সাজান। প্রবাহ বাছাইয়ের পরে, ড্রপলেট-ভিত্তিক এস. এন. আর. এন. এ-এস. কিউ গ্রন্থাগারগুলি সম্পাদন করতে প্রতি নমুনায় 10,000 নিউক্লিয়াসের প্রয়োজন হয়। ড্রপলেট-ভিত্তিক এস. এন. আর. এন. এ-সেক লাইব্রেরিগুলি সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য প্রস্তুত করা হয়। পিসিআর-এর 15টি চক্রের পরে পর্যাপ্ত সিডিএনএ পাওয়া যায়। গবেষকরা সফলভাবে নোভাসেক 6000-এর এস4 লেনে ভাস্কুলার নিউক্লিয়াসকে সিকোয়েন্স করেছেন। অ্যাপ্লিকেশন মস্তিষ্কের ম্যাপিং তাদের পরীক্ষা-নিরীক্ষা এবং প্রতিলিপিগত বিশ্লেষণের মাধ্যমে, ভাইন-সেকের লেখক এবং নির্মাতারা আবিষ্কার করেছেন যে পদ্ধতিগুলির সিরিজ সুস্থ মানব মস্তিষ্কের টিস্যুতে ধমনীতে উপস্থিত ভাস্কুলার এন্ডোথেলিয়াল এবং মসৃণ পেশী কোষগুলির প্রতিলিপিগত অভিব্যক্তি ব্যাখ্যা করতে সক্ষম হয়েছিল। উপরন্তু, ভাইন-সেক ম্যাট্রিক্স পেরিসাইট এবং পরিবহন পেরিসাইট নামে পেরিসাইটের দুটি অভিনব উপ-জনসংখ্যা ক্যাপচার করতে সক্ষম হয়েছিল যা যথাক্রমে ইসিএম মড্যুলেশন এবং ট্রান্সমেম্ব্রেন পরিবহনে জড়িত থাকতে পারে। আলঝেইমার রোগ ভাইন-সেক ব্যবহার করে, এই গবেষকরা আলঝেইমার রোগে (এডি) মানুষের মস্তিষ্কের ভাস্কুলেচারের আণবিক ভিত্তি উন্মোচন করতে সহায়তা করতে সক্ষম হন। তারা দেখিয়েছেন যে AD-সম্পর্কিত জিনগুলি ভাস্কুলার কোষের প্রকারগুলিতে অত্যন্ত প্রকাশিত হয়েছিল এবং সাধারণ মস্তিষ্কের নমুনার তুলনায় AD মস্তিষ্কের নমুনায় এন্ডোথেলিয়াল কোষ, মসৃণ পেশী কোষ এবং পেরিভাসকুলার ফাইব্রোব্লাস্ট কোষের প্রচুর পরিমাণে জিন অভিব্যক্তি পরিবর্তন বা ক্ষতি হয়। আরও প্রয়োগগুলি ভাইন-সেক মূলত মানব মস্তিষ্কের ভাস্কুলেচার ম্যাপ করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছিল, কারণ বর্তমানে কোনও আণবিক মানচিত্র বিদ্যমান নেই। 2021 সালে ভাইন-সেক প্রবর্তনকারী গবেষণাপত্রের প্রাক-মুদ্রণ উপলব্ধ হওয়ার পর থেকে, আণবিক মানচিত্রটি মস্তিষ্কের ভাস্কুলেচার সম্পর্কে আমাদের জ্ঞান সম্প্রসারণে অবদানের জন্য স্বীকৃত হয়েছে যা মস্তিষ্কের রোগ সম্পর্কে আরও গভীর অধ্যয়নের অনুমতি দেবে এবং সম্ভাব্যভাবে অতিক্রম করবে মস্তিষ্কে ওষুধ সরবরাহের চ্যালেঞ্জ। ভাইন-সেক দ্বারা উত্পন্ন তথ্যের কিছু প্রয়োগ এডি, ডিমেনশিয়া, ইস্কেমিক স্ট্রোক এবং মস্তিষ্কে গুরুতর কোভিড-19-এর প্রভাবের প্যাথোজেনেসিস সম্পর্কে আমাদের জ্ঞানকে আরও বাড়িয়ে তুলতে অবদান রেখেছে। সুবিধা ও অসুবিধাগুলি পূর্ববর্তী একক-নিউক্লিয় বিচ্ছিন্নতা কৌশলগুলির তুলনায় সেরেব্রোভাসকুলার নিউক্লিয়াগুলিকে পৃথক করে রাখা পূর্ববর্তী একক-নিউক্লিয় বিচ্ছিন্নতা কৌশলগুলি নিউক্লিয়াগুলির আরও ভাল বিচ্ছিন্নতার কারণে ভাস্কুলেচারে বিরল কোষগুলিকে ধরে রাখে হিমায়িত সংরক্ষণাগারভুক্ত মস্তিষ্কের টিস্যুতে প্রযোজ্য এনজাইম্যাটিক বিচ্ছিন্নতা এড়ানোর মাধ্যমে জিন অভিব্যক্তি পরিবর্তনের প্রভাবকে হ্রাস করে অসুবিধাগুলি কোষের প্রকারের বৈশিষ্ট্য পরিচিত পারমাণবিক চিহ্নিতকারীগুলিতে সীমাবদ্ধ নিউক্লিয়াগুলির বিচ্ছিন্নতার মাধ্যমে সাইটোপ্লাজমিক ট্রান্সক্রিপ্টমিক তথ্যের ক্ষতি আরএনএ-র পারমাণবিক ছিদ্র থেকে নিউক্লিয়াসের সম্ভাব্য ফুটো, এইভাবে কিছু গুরুত্বপূর্ণ আরএনএ প্রতিলিপি হারায় রেফারেন্স ডিএনএ সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি