Ribose-seq
রাইবোজ-সেক একটি ম্যাপিং কৌশল যা জেনেটিক্স গবেষণায় জিনোমিক ডিএনএতে এম্বেডেড রাইবোনিউক্লিওটাইড, বিশেষত রাইবোনিউক্লিওসাইড মনোফসফেটস (আরএনএমপি)-এর সম্পূর্ণ প্রোফাইল নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়। অন্তর্নির্মিত রাইবোনিউক্লিওটাইডগুলি কোষে ডি. এন. এ-তে সবচেয়ে সাধারণ পরিবর্তন বলে মনে করা হয় এবং জিনোমিক ডি. এন. এ-তে তাদের উপস্থিতি জিনোমের স্থিতিশীলতাকে প্রভাবিত করতে পারে। সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে মাউসের ডিএনএ-তে রাইবোনিউক্লিওটাইড রোগের প্যাথলজিকে প্রভাবিত করতে পারে, জিনোমিক ডিএনএ-তে রাইবোনিউক্লিওটাইডের অন্তর্ভুক্তি চিকিৎসা জেনেটিক্স গবেষণার একটি গুরুত্বপূর্ণ লক্ষ্য হয়ে উঠেছে। রাইবোজ-সেক বিজ্ঞানীদের ইউক্যারিওটিক বা প্রোক্যারিওটিক ডিএনএতে অন্তর্ভুক্ত রাইবোনিউক্লিওটাইডের সঠিক অবস্থান এবং প্রকার নির্ধারণ করতে সহায়তা করে। এই কৌশলটি রাইবোনিউক্লিওটাইডের 2 'প্রান্তে পাওয়া অতিরিক্ত হাইড্রক্সিল গ্রুপের (ওএইচ) উপস্থিতিকে কাজে লাগায়, যা ডিএনএকে বিকৃত ও অস্থিতিশীল করতে পারে। এই কৌশলটি জর্জিয়া ইনস্টিটিউট অফ টেকনোলজির গবেষকদের একটি দলের সহযোগিতার মাধ্যমে তৈরি করা হয়েছিল যার মধ্যে রয়েছে ফ্রান্সেস্কা স্টোরিসি এবং কিয়ুং ডুক কোহ (বর্তমানে ক্যালিফোর্নিয়া সান ফ্রান্সিসকো বিশ্ববিদ্যালয়ে) এবং কলোরাডো বিশ্ববিদ্যালয়ের আনশুটজ মেডিকেল স্কুলের জে হেসেলবার্থ। নিউক্লিক অ্যাসিড হল প্রয়োজনীয় ম্যাক্রোমোলিকুল যা সমস্ত জীবের মধ্যে জিনগত তথ্য বহন করে। এই জৈব পলিমারগুলি নিউক্লিওটাইড মনোমার নিয়ে গঠিত, যা জৈব অণু যা একটি ফসফেট গ্রুপ, একটি নাইট্রোজেনযুক্ত ক্ষার এবং একটি পাঁচ-কার্বন চিনি (রাইবোনিউক্লিওটাইডগুলিতে রাইবোজ এবং ডিঅক্সিরাইবোনিউক্লিওটাইডগুলিতে ডিঅক্সিরাইবোজ) নিয়ে গঠিত। যদিও রাইবোনিউক্লিওটাইডগুলি সাধারণত রাইবোনিউক্লিক অ্যাসিডে (আরএনএ) অবস্থিত, তবে এগুলি ডিওক্সিরাইবোনিউক্লিক অ্যাসিডে (ডিএনএ) পাওয়া যায়। 1973 সালে লরেন্স গ্রসম্যান, রবার্ট ওয়াটসন এবং জেরোম ভিনোগ্রাড দ্বারা মাউস এবং মানব কোষ থেকে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএতে ডিএনএ-তে এম্বেড করা রাইবোনিউক্লিওসাইড মনোফসফেটস (আরএনএমপি)-এর প্রথম আবিষ্কার হয়। 2006 সালে, সিজোস্যাকারোমাইসেস পম্পের ("ফিশন ইস্ট") পারমাণবিক ডিএনএতে আরএনএমপি-র উপস্থিতি নিশ্চিত করা হয়েছিল এবং তারপর থেকে অন্যান্য প্রজাতির অনুসন্ধান অব্যাহত রয়েছে। ডি. এন. এ-তে রাইবোনিউক্লিওটাইডের অন্তর্ভুক্তি একাধিক গবেষণায় এমন প্রক্রিয়াগুলি চিহ্নিত করা হয়েছে যার মাধ্যমে রাইবোনিউক্লিওটাইডগুলি ডি. এন. এ-তে যোগ করা, অপসারণ করা বা তৈরি করা যেতে পারে। প্রাথমিকভাবে, ডি. এন. এ সংশ্লেষণ প্রক্রিয়ার সময় রাইবোনিউক্লিওটাইডগুলি ডি. এন. এ-তে অন্তর্ভুক্ত করা হয়। ডি. এন. এ প্রতিলিপি শুরু করার জন্য, সংক্ষিপ্ত আর. এন. এ প্রাইমারগুলি পরিপূরক ডি. এন. এ-তে সংশ্লেষিত হয় যাতে প্রাথমিক প্রতিলিপি এনজাইম, ডি. এন. এ পলিমারেজগুলির পরবর্তী বাঁধাই এবং প্রতিলিপি ক্রিয়ার অনুমতি দেওয়া যায়। সাধারণত, এই প্রাইমারগুলি নিউক্লিজ এনজাইম, আরএনএসেস এইচ বা ফ্ল্যাপ স্ট্রাকচার-নির্দিষ্ট এন্ডোনিউক্লিজ 1 (এফইএন1) দ্বারা অপসারণ করা হয়। এইভাবে, ক্ষণস্থায়ী আর. এন. এম. পি-র মোটামুটি পরিমাণ রয়েছে যা আর. এন. এ প্রাইমারের আকারে ডি. এন. এ-তে উপস্থিত থাকে এবং পরে অপসারণ করা হয়। ডি. এন. এ প্রতিলিপি তৈরি শুরু হওয়ার পরে, আর. এন. এম. পি ডি. এন. এ পলিমারেজ দ্বারা ডি. এন. এ-তে সম্পূর্ণরূপে অন্তর্ভুক্ত করা যেতে পারে এবং এটি প্রতি 1,000 ডিঅক্সিরাইবোনিউক্লিওটাইডের মধ্যে 1 টিরও বেশি রাইবোনিউক্লিওটাইড সহ ডি. এন. এ-তে রাইবোনিউক্লিওটাইড অন্তর্ভুক্তির প্রধান প্রক্রিয়াটির প্রতিনিধিত্ব করে। এম্বেডেড আরএনএমপিগুলি প্রায়শই রাইবোনিউক্লিওটাইড এক্সিশন মেরামত (আরইআর) প্রক্রিয়া দ্বারা অপসারণের জন্য লক্ষ্য করা হয়। যাইহোক, যদি আরইআর সঠিকভাবে কাজ না করে, তবে এটি ডিএনএতে এমবেডেড আরএনএমপি-র আরও স্থায়ী উৎস হয়ে উঠতে পারে। আরেকটি প্রক্রিয়া যার মাধ্যমে ডি. এন. এ-তে আর. এন. এম. পি-র উদ্ভব হতে পারে তা হল অক্সিডেটিভ স্ট্রেসের মাধ্যমে, যা ডি. এন. এ-তে ডিঅক্সিরাইবোজ ইউনিটকে রাইবোজে পরিবর্তন করে। যদিও আরইআর পথটি ডিএনএ থেকে আরএনএমপি অপসারণের জন্য সবচেয়ে কার্যকর প্রক্রিয়া, রাইবোনিউক্লিওটাইডগুলি 3 '-5' এক্সোন্যুক্লিয়াস ক্রিয়াকলাপের মাধ্যমেও অপসারণ করা যেতে পারে যা ডিএনএ প্রতিলিপির সময় ডিএনএ পলিমারেজের প্রুফরিডিং ক্রিয়াকলাপ দ্বারা পরিচালিত হয়। অতিরিক্ত আরএনএমপি অপসারণ পদ্ধতির মধ্যে রয়েছে আইসোমেরেজ এনজাইম, টোপোআইসোমেরেজ I দ্বারা মধ্যস্থতা করা ছেদন। ডি. এন. এ-তে রাইবোনিউক্লিওটাইডের পরিণতি যদি অপসারণ ও প্রতিস্থাপন না করা হয়, ডি. এন. এ-তে রাইবোনিউক্লিওটাইডগুলি কোষীয় প্রক্রিয়াগুলিতে কাঠামোগত, রাসায়নিক এবং কার্যকরী প্রভাব ফেলতে পারে। যেমন টি. এন. দ্বারা প্রথম স্বীকৃত। 1993 সালে জ্যাসিহ্রি এবং অন্যান্যরা, রাইবোনিউক্লিওটাইডের উপস্থিতি ডিএনএর হেলিকাল আকারকে বি ফর্ম থেকে এ ফর্মে পরিবর্তন করতে পারে। এটি, অন্যান্য বেশ কয়েকটি রাসায়নিক পরিণতি ছাড়াও, ডি. এন. এ-র সাথে প্রোটিনের বন্ধনকে প্রভাবিত করতে পারে এবং ক্রোমাটিন গতিবিদ্যা, ডি. এন. এ প্রতিলিপি, প্রতিলিপি, মেরামত এবং অর্ধবীজীবিচ্ছেদের মতো প্রক্রিয়াগুলির জন্য প্রভাব ফেলতে পারে। উপরন্তু, কিছু ডিএনএ পলিমারেজ ডিএনএ প্রতিলিপির সময় এমবেডেড আরএনএমপিগুলিকে বাইপাস করতে অক্ষম হয়, যা আরএনএমপি-র দীর্ঘ স্ট্র্যান্ডযুক্ত স্থানগুলিতে আরও তীব্র হয়। এটি প্রতিলিপির চাপ সৃষ্টি করতে পারে যা সম্ভাব্যভাবে প্রতিলিপি, ক্রোমোজোম পৃথকীকরণ এবং ভবিষ্যতের প্রতিলিপিতে হস্তক্ষেপ করতে পারে। উপরন্তু, আরইআর প্রক্রিয়ায় কিছু উপজাত বা ব্যর্থতা সম্ভাব্যভাবে ডিএনএ বিরতি, পুনর্বিন্যাস এবং জিনোম অস্থিতিশীলতার কারণ হতে পারে। রাইবোনিউক্লিওটাইড ম্যাপিং 2015 সালের মধ্যে, ডি. এন. এ-তে আর. এন. এম. পি-কে অন্তর্ভুক্ত করার জন্য কিছু প্রক্রিয়া, এর পরিণতি এবং আনুমানিক হার ক্রমবর্ধমানভাবে স্পষ্ট হয়ে উঠছিল। যাইহোক, জিনোম জুড়ে আরএনএমপি-র অবস্থান সনাক্ত করার জন্য একটি কৌশলের এখনও অভাব ছিল। পরবর্তী প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির ক্রমবর্ধমান অ্যাক্সেসযোগ্যতা মূলত জিনোমিক ডিএনএ জুড়ে আরএনএমপিগুলির আরও সুনির্দিষ্ট সনাক্তকরণের লক্ষ্যে অগ্রগতি সহজতর করেছে। 2015 সালে, কিয়ুং ডুক কোহ, সত্য বালাচন্দর, জে আর হেসেলবার্থ এবং ফ্রান্সেসকা স্টোরিসি ডিএনএ-তে আরএনএমপি-র পদ্ধতিগত প্রোফাইলিংয়ের জন্য একটি নতুন উন্নত কৌশল রাইবোজ-সেক উপস্থাপন করেছিলেন। তারা মাইটোকন্ড্রিয়াল এবং পারমাণবিক ডিএনএ জুড়ে আরএনএমপি-র জিনোম-ব্যাপী পরিচয়, ফ্রিকোয়েন্সি এবং স্থানীয়করণ নথিভুক্ত করতে স্যাকারোমাইসেস সেরেভিসিয়া জিনোমে রাইবোজ-সেক প্রয়োগ করেছিলেন। এই অনুসন্ধানগুলি শেষ পর্যন্ত জিনোম জুড়ে আরএনএমপি অন্তর্ভুক্তির নিদর্শন সম্পর্কে নতুন অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে। রাইবোজ-সেকের সমান্তরালে, ডিএনএ-তে এম্বেড করা আরএনএমপি-র সাইটগুলি ক্যাপচার করার জন্য আরও তিনটি কৌশল তৈরি করা হয়েছিলঃ এমরিবো-সেক, হাইডেন-সেক এবং পু-সেক। রাইবোজ-সেক পদ্ধতিটি উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিংয়ের প্রস্তুতিতে রাইবোনিউক্লিওটাইডগুলি ক্যাপচার এবং ট্যাগ করার জন্য বেশ কয়েকটি অনন্য বৈশিষ্ট্য ব্যবহার করে। আরএনএমপি সাইটগুলিকে সরাসরি লক্ষ্য করার জন্য, লেখকরা একটি ক্ষার চিকিত্সা প্রক্রিয়া ব্যবহার করেছিলেন যা আরএনএমপি সাইটগুলিতে ডিএনএকে বিকৃত করে এবং বিভক্ত করে। রাইবোনিউক্লিওটাইডগুলিতে উপস্থিত অতিরিক্ত হাইড্রক্সিল গ্রুপের কারণে এই অঞ্চলে অণুর আপেক্ষিক সংবেদনশীলতা দ্বারা এই স্থানগুলিতে ফাটলের নির্দিষ্টতা চালিত হয়। পিসিআর পরিবর্ধন করার আগে এই ছোট ছোট টুকরোগুলির স্থিতিশীলতা এবং সমৃদ্ধকরণ এবং টি5 এক্সোন্যুক্লিয়াস পরিপাক থেকে সুরক্ষার জন্য, একক আটকে থাকা ডিএনএ টুকরোগুলি-যার মধ্যে আগ্রহের আরএনএমপি এবং একটি অনন্য আণবিক সনাক্তকরণ নম্বর রয়েছে-একক আটকে থাকা ডিএনএ (এসএসডিএনএ) বৃত্ত গঠনের জন্য স্ব-সীমাবদ্ধ। একটি আরএনএমপি এবং একটি ডিএনএ প্রান্তের বন্ধন সহজতর করার জন্য, কোহ এট আল। 2 '-ফসফেট (আর. এন. এম. পি পার্শ্ব)-কে 5'-ফসফেট (ডি. এন. এ পার্শ্ব)-এর সাথে আবদ্ধ করার অনুমতি দেওয়ার জন্য আরাবিডোপসিস থালিয়ানা টিআর. এন. এ লিগাজ (এ. টি. আর. এন. এল)-এর স্বতন্ত্র বন্ধন ক্রিয়াকে কাজে লাগান। পরিশেষে, এই কৌশল থেকে সমগ্র উৎপাদিত গ্রন্থাগারের উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং সমস্ত ক্যাপচার করা এমবেডেড আরএনএমপি-র জিনোমিক স্থানাঙ্ক চিহ্নিত করে। 2019 সালে, স্টোরিসি ল্যাব রাইবোজ-বর্গের জন্য একটি হালনাগাদ এবং আরও অনুকূলিত প্রোটোকল উপস্থাপন করেছে। পরিবর্তনগুলির মধ্যে রয়েছে ছোট আণবিক বারকোড অ্যাডাপ্টার, ছোট টুকরো, পরিবর্তিত পিসিআর সেটিংস এবং জেল থেকে কাটা এবং শুদ্ধ করার জন্য সামঞ্জস্যপূর্ণ আকারের পরিসীমা ব্যবহার করা। সামগ্রিকভাবে, এটি পরামর্শ দেওয়া হয়েছিল যে উন্নত প্রোটোকল বড় জিনোমে প্রয়োগের জন্য পদ্ধতির দক্ষতা যথেষ্ট পরিমাণে বাড়িয়ে তুলতে পারে। পদ্ধতি প্রস্তুতি জিনোমিক ডি. এন. এ নিষ্কাশন আগ্রহের কোষ থেকে জিনোমিক ডি. এন. এ উত্তোলনের জন্য প্রথমে যান্ত্রিক বা রাসায়নিক পদ্ধতি ব্যবহার করে কোষগুলিকে বিচ্ছিন্ন করতে হবে। এটি প্রতিটি কোষের নিউক্লিয়াস থেকে ডি. এন. এ মুক্ত করে, যার ফলে এটি শুদ্ধ এবং পরিমাপ করা যায়। রাইবোজ-সেক প্রোটোকলের জন্য মোট 10ইউজি ডিএনএ প্রয়োজন। রাইবোজ-সেকিউ অ্যাডাপ্টারের প্রস্তুতি রাইবোজ-সেকিউ অ্যাডাপ্টরটি একটি ডিটি (ডিঅক্সিরাইবোন্যুক্লিয়টাইড থাইমিন), তারপরে একটি অ্যানিলিং সিকোয়েন্স, দুটি প্রাইমার সিকোয়েন্স এবং একটি অনন্য আণবিক শনাক্তকারী (ইউএমআই) নিয়ে গঠিত। রাইবোজ-সেক অ্যাডাপ্টার প্রস্তুত করতে, তিনটি অলিগোনিউক্লিওটাইড (অলিগোস) একটি দ্রবণে যোগ করা হয় এবং 95-100 ডিগ্রি সেলসিয়াসে উত্তপ্ত করা হয়। এই তাপমাত্রায়, অলিগো সিকোয়েন্সগুলি একে অপরের প্রতি অনুরক্ত হয়, যা রাইবোজ-সেক্ অ্যাডাপ্টরগুলির একটি সাসপেনশন তৈরি করে। লবণাক্ত ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড রাইবোজ-সেকিউ অ্যাডাপ্টারের পরিমাণ তারপর পরিমাপ করা হয়। রাইবোজ-সেকিউ-এর জন্য 10 ইউএম ঘনত্ব প্রয়োজন। জিনোমিক ডি. এন. এ-র রাইবোজ-সেক ফ্র্যাগমেন্টেশন ব্লান্ট-এন্ডেড রিস্ট্রিক্শন এনজাইম ডাইজেশন ব্যবহার করে খণ্ডিত করা হয়। পরিপাকের পরে, খণ্ডিত ডিএনএ শুদ্ধ এবং পরিমাপ করা হয়। আরএনএমপি ক্যাপচার কৌশলের (আরইএসসিওটি) জন্য সীমাবদ্ধতা এনজাইম সেট এবং সংমিশ্রণ অপ্টিমাইজেশন সরঞ্জামগুলি আরএনএমপি ক্যাপচার হার সর্বাধিক করার জন্য তৈরি করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ দ্রবণে 500-থেকে 3,000-বিপি জিনোমিক টুকরোগুলির জনসংখ্যা রয়েছে যার গড় আকার ~ 1.5 কেবি। পরবর্তী ডি. এ-টেলিং এবং অ্যাডাপ্টর লাইগেশনের জন্য 10ইউজি খণ্ডিত জিনোমিক ডি. এন. এ প্রয়োজন হয়। ডি. এ-টেলিং এবং অ্যাডাপ্টার লাইগেশন ডি. এ অণুগুলি প্রতিটি খণ্ডের লেজের সাথে আবদ্ধ থাকে, যা রাইবোজ-সেকিউ অ্যাডাপ্টারের ডি. টি-কে পরবর্তী ধাপে তার সংশ্লিষ্ট ডি. এ লেজকে আবদ্ধ করতে দেয়। এই প্রক্রিয়া অনুসরণ করে, ডি. এ-লেজের ডি. এন. এ বিশুদ্ধ করা হয় এবং জল দিয়ে বের করে দেওয়া হয়। রাইবোজ-সেক অ্যাডাপ্টার, যার র্যান্ডমাইজড 8-বেস ইউনিক মলিকিউলার আইডেন্টিফায়ার (ইউএমআই) এবং একক ডিটি ওভারহ্যাং রয়েছে, তারপর রাতারাতি 15 ডিগ্রি সেলসিয়াসে সমাধানটি শীতল করে লক্ষ্য খণ্ডের ডিএ প্রান্তে সংযুক্ত করা হয়। তারপর নমুনাটি শুদ্ধ করা হয় এবং ক্ষার চিকিত্সার জন্য প্রস্তুত করা হয়। ক্ষার চিকিত্সা ক্ষার চিকিত্সার সময়, ডাবল স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ (ডি. এস. ডি. এন. এ)-কে সোডিয়াম হাইড্রক্সাইড দিয়ে চিকিত্সা করা হয়, যা একটি শক্তিশালী ক্ষার, ডি. এস. ডি. এন. এ-কে বিকৃত করতে এবং এমবেডেড রাইবোনিউক্লিওটাইড সাইটে ডি. এন. এ-কে বিভক্ত করে। এটি উন্মুক্ত দুটি প্রান্ত সহ একক-আটকে থাকা ডিএনএ (এসএসডিএনএ) টুকরো তৈরি করেঃ একটি 2′, 3′-সাইক্লিক ফসফেট প্রান্ত এবং একটি বিপরীত 5′-হাইড্রক্সিল প্রান্ত। তারপর ক্ষারীয় দ্রবণটি নিরপেক্ষ করা হয় এবং এস. এস. ডি. এন. এ শুদ্ধ করা হয়। সেলফ-লাইগেশন (সার্কুলারাইজেশন) এরপরে, এস. এস. ডি. এন. এ-যুক্ত দ্রবণটি আরাবিডোপসিস থালিয়ানা টি. আর. এন. এ লাইগেজ (এ. টি. আর. এন. এল. 24) দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়। এ. টি. আর. এন. এল আর. এন. এ-র 2 ', 3'-চক্রীয় ফসফেট প্রান্তকে 2 '-ফসফেটে রূপান্তরিত করে এ. থালিনানা আর. আর. এন. এ পরিপক্কতায় সহায়তা করে এবং এগুলিকে আর. এন. এ বা ডি. এন. এ-র 5'-ফসফেট প্রান্তে সংযুক্ত করে। এ. টি. আর. এন. এল-কে এস. এস. ডি. এন. এ দ্রবণে প্রবর্তন করা এস. এস. ডি. এন. এ-র স্ব-বন্ধনকে অনুঘটক করে কারণ 2 ', 3' চক্রাকার ফসফেট শেষ হয় একই এস. এস. ডি. এন. এ স্ট্র্যান্ডের 5 'ফসফেট প্রান্তে। ফলস্বরূপ চক্রাকার এস. এস. ডি. এন. এ কাঠামোগুলিতে লক্ষ্যযুক্ত এম্বেডেড রাইবোনিউক্লিওটাইড ক্রম, একটি ইউ. এম. আই এবং অলিগো ক্রম থাকে যা বৃত্তাকার এস. এস. ডি. এন. এ কাঠামোর বাকি অংশ তৈরি করে। রৈখিক এস. এস. ডি. এন. এ অপসারণ স্ব-বন্ধন দ্বারা নির্মিত বৃত্তাকার এস. এস. ডি. এন. এ কাঠামো টি5 এক্সোনিউক্লিজ উৎসেচক দ্বারা অবক্ষয় প্রতিরোধী। তবে, অনিবন্ধিত, রৈখিক এসএসডিএনএ নয়। অতএব, পণ্যগুলি এবং অবশিষ্ট ডি. এন. এ-র টুকরোগুলিকে টি5 এক্সোন্যুক্লিয়াসের সাথে চিকিত্সা করা অনির্বাচিত, রৈখিক এস. এস. ডি. এন. এ স্ট্র্যান্ডগুলিকে নির্বাচিতভাবে অবনমিত করে, যখন স্ব-আবদ্ধ এস. এস. ডি. এন. এ বৃত্তগুলিকে অক্ষত রাখে। এইভাবে, অবাঞ্ছিত রৈখিক এস. এস. ডি. এন. এ খণ্ডগুলি অবনমিত হয় এবং শুধুমাত্র সফলভাবে আবদ্ধ এস. এস. ডি. এন. এ বৃত্তগুলি অবশিষ্ট থাকে। 2 'ফসফেট অপসারণ পিসিআর সম্ভব হওয়ার আগে, এস. এস. ডি. এন. এ বৃত্তের সংযুক্ত সংযোগস্থলে 2' ফসফেট গ্রুপগুলি অবশ্যই অপসারণ করতে হবে। এটি সম্পন্ন করার জন্য, বৃত্তাকার এস. এস. ডি. এন. এ দ্রবণটি 2 'ফসফোট্রান্সফেরেজ, টি. পি. টি 1 দিয়ে চিকিত্সা করা হয়, যা লাইগেশন জংশনে অবশিষ্ট 2' ফসফেটকে সরিয়ে দেয়। পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশন (পিসিআর) রাইবোজ-বর্গ অনুসরণ করে, পিসিআর পরিবর্ধন ব্যবহার করে প্রতিটি এস. এস. ডি. এন. এ বৃত্তে পরিবর্ধন করা হয়। পিসিআর-এর প্রথম রাউন্ডে, সিকোয়েন্সিং প্রাইমারগুলি দ্রবণে প্রবর্তন করা হয় এবং এসএসডিএনএ বৃত্তগুলি প্রশস্ত করা হয়। নির্বাচিত সিকোয়েন্সিং প্রাইমারগুলি অবশ্যই পছন্দের টার্গেট লাইব্রেরির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ হতে হবে। বিস্তারিত জানতে অ্যাপ্লিকেশন বিভাগ দেখুন। পিসিআর-এর দ্বিতীয় রাউন্ডে, আরও নির্দিষ্ট সিকোয়েন্সিং প্রাইমার চালু করা হয় এবং এসএসডিএনএ বৃত্তগুলি আরও প্রশস্ত করা হয়। পলিয়াক্রিলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস (পিএজিই) রাইবোজ-সেক লাইব্রেরির উপস্থিতি নিশ্চিত করতে এবং ইতিবাচক ও নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণগুলি পরীক্ষা করার জন্য সঞ্চালিত হয়। সিকোয়েন্সিংয়ের আগে রাইবোজ-সেক লাইব্রেরি শুদ্ধ করতে আকার নির্বাচন এবং জেল পরিশোধন জেল পরিশোধন ব্যবহার করা হয়। এই পর্যায়ে, আগ্রহের লক্ষ্য আকারের সীমার বাইরে থাকা টুকরোগুলি অপসারণ করতে দৈর্ঘ্য অনুসারে টুকরোগুলি নির্বাচন করা হয়। ডাউনস্ট্রিম অ্যাপ্লিকেশনের জন্য ব্যবহার আগ্রহের ক্রমগুলি ক্যাপচার এবং শুদ্ধ করার পরে, নমুনাগুলি ক্রমবদ্ধ করা যেতে পারে এবং ডাউনস্ট্রিম অ্যাপ্লিকেশনের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে। বিস্তারিত জানতে অ্যাপ্লিকেশন বিভাগ দেখুন। বিভিন্ন পরিস্থিতিতে এবং বিভিন্ন ইউক্যারিওটিক প্রজাতির অনেক ধরনের কোষের জন্য রাইবোজ-সেক প্রয়োগ করা যেতে পারে (দেখুনঃ সুবিধা এবং সীমাবদ্ধতা)। প্রাথমিক চরিত্রায়ন রাইবোজ-সেক প্রথম ব্যবহার করেছিলেন কোহ এবং অন্যান্যরা। (2015) মাইটোকন্ড্রিয়াল এবং পারমাণবিক ডি. এন. এ-তে আর. এন. এম. পি-র অবস্থান চিহ্নিত করার জন্য আর. এন. এ. এস-এইচ2-এর ঘাটতি (আর. এন. এইচ201ডি. এম) বাডিং ইস্ট। তারা দেখেছেন যে আরএনএমপিগুলি পারমাণবিক জিনোমে 0.449 আরএনএমপি প্রতি কিলোবেসে (কেবি) এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনোমে 19.5 আরএনএমপি প্রতি কেবি উপস্থিত ছিল। উপরন্তু, কোহ এবং অন্যান্য। (2015) ডি. এন. এ-তে আর. সি এবং আর. জি অন্তর্ভুক্ত করার জন্য বিদ্যমান একটি আপাত পক্ষপাত সনাক্ত করতে সক্ষম হয়েছিল। তাঁরা দেখেছেন যে, ইস্ট কোষে, আর. সি এবং আর. জি জিনোমিক ডি. এন. এ-তে আর. এ এবং আর. ইউ-এর চেয়ে বেশি ফ্রিকোয়েন্সিতে ধরে রাখা হয়, যা সমস্ত ক্ষারকের সংশ্লিষ্ট প্রত্যাশিত ফ্রিকোয়েন্সির তুলনায় বেশি। বেস টাইপ নির্বিশেষে, আরএনএমপিগুলি প্রায়শই পারমাণবিক এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ উভয় ক্ষেত্রেই ডিএ-এর অবিলম্বে নিম্নমুখী স্থানে উপস্থিত ছিল। আরএনএমপি অন্তর্ভুক্তির জন্য অনেক অতিরিক্ত "হটস্পট" নির্দিষ্ট জিনোমিক বৈশিষ্ট্যগুলির ক্ষেত্রেও চিহ্নিত করা হয়েছিল (যেমন। নির্দিষ্ট জিন স্থান, স্ট্র্যান্ড বা ক্রোমোসোমাল অঞ্চলে)। বহু-প্রজাতির তুলনা প্রাথমিক বৈশিষ্ট্যের উপর প্রসারিত, বালাচন্দর এবং অন্যান্য। (2020) তাদের রাইবোজ-সেক প্রোটোকল অপ্টিমাইজ করেছে এবং তিনটি খামির প্রজাতির একাধিক স্ট্রেনের মাইটোকন্ড্রিয়াল এবং পারমাণবিক ডিএনএ জুড়ে আরএনএমপি ম্যাপ করার জন্য একটি বায়োইনফরম্যাটিক্স সরঞ্জামের (রাইবোজ-ম্যাপ, https://github.com/agombolay/ribose-map এ উপলব্ধ) সাথে একত্রে এটি ব্যবহার করেছেঃ স্যাকারোমাইসেস সেরেভিসিয়া, স্যাকারোমাইসেস প্যারাডক্সাস এবং স্কিজোস্যাকারোমাইসেস পোম্বে। এই প্রজাতি এবং স্ট্রেনের প্রতিটি থেকে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএতে (এমটিডিএনএ), এটি প্রদর্শিত হয়েছিল যে প্রদত্ত জিনোমিক অবস্থানে যে ধরনের আরএনএমপি অন্তর্ভুক্ত করা হয় তা ডিএনএমপি দ্বারা সবচেয়ে বেশি প্রভাবিত হয় যা তাৎক্ষণিক উজানের অবস্থানে (-1) অবস্থিত। একাধিক জিনোম জুড়ে রাইবোজ-বর্গ ব্যবহার করে, বালাচন্দর এবং অন্যান্যরা। ইস্ট স্ট্রেন এবং প্রজাতির মধ্যে বিভিন্ন মিল এবং পার্থক্যও ব্যাখ্যা করতে সক্ষম হয়েছিল। সমস্ত স্ট্রেনের এম. টি. ডি. এন. এ-তে আর. এন. এম. পি নিদর্শনগুলি আর. ইউ-এর কম ফ্রিকোয়েন্সি দেখায়; তবে, এস. প্যারাডক্সাস এবং এস. সেরেভিসিয়া আরসি-র জন্য পছন্দ নির্দেশ করে যেখানে এস. পোম্বে আরজি-র জন্য পছন্দ নির্দেশ করে। পারমাণবিক ডিএনএ-তে, তিনটি খামির প্রজাতি মূলত একই রকম ছিল। উপরন্তু, আরএনএমপিগুলি সংক্ষিপ্ত-নিউক্লিওটাইড পুনরাবৃত্তির ক্রমগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ হয়েছিল। রাইবোজ-সেকের এই প্রয়োগটি আরএনএমপি অন্তর্ভুক্তির নিদর্শনগুলির বৈশিষ্ট্যকরণ এবং ক্রম প্রসঙ্গে এই প্রক্রিয়ার সম্ভাব্য চালকদের সনাক্তকরণের অনুমতি দেয়। ইস্ট জিনোমের বাইরে একটি অ-ইস্ট প্রজাতিতে পরিচালিত প্রথম রাইবোনিউক্লিওটাইড ম্যাপিং গবেষণায়, রাইবোজ-সেক ব্যবহার করা হয়েছিল রাইবোজ-ম্যাপের সাথে একত্রে নিউক্লিয়ার, মাইটোকন্ড্রিয়াল এবং ক্লোরোপ্লাস্ট জিনোম জুড়ে আরএনএমপি ম্যাপ করতে ক্ল্যামিডোমোনাস রিন্হার্ডটি, একটি সালোকসংশ্লেষক এককোষী সবুজ শৈবাল। এই প্রজাতির মাইটোকন্ড্রিয়াল এবং ক্লোরোপ্লাস্ট ডি. এন. এ-তে, আর. এ-গুলি অন্যান্য ঘাঁটির তুলনায় অগ্রাধিকারের সাথে অন্তর্ভুক্ত বলে মনে হয়েছিল, যেখানে পারমাণবিক ডি. এন. এ আর. জি এবং আর. সি অন্তর্ভুক্তির প্রতি পক্ষপাত দেখিয়েছে। সমস্ত সি. রেইনহার্ডটি অর্গানেলে, আরইউ ধারাবাহিকভাবে সবচেয়ে কম প্রতিনিধিত্বকারী আরএনএমপি ছিল, যা ইস্ট মাইটোকন্ড্রিয়া থেকে প্রাপ্ত ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। ইস্ট প্রোফাইলের মতো, সি. রেইনহার্ড্টিতে আরএনএমপি-র অন্তর্ভুক্তি ডিএনএমপি অবিলম্বে উজানে (অবস্থান-1) দ্বারা সবচেয়ে বেশি প্রভাবিত হয়। এই পরিবেশে, রাইবোজ-সেকের প্রয়োগ প্রথমবারের মতো এই প্রজাতিতে আরএনএমপি অন্তর্ভুক্তি বিতরণ এবং নিদর্শন সনাক্ত করার অনুমতি দেয়। রাইবোজ-সেকিউ-এর সুবিধা এবং সীমাবদ্ধতা রাইবোজ-সেকিউ বিশেষভাবে ডি. এন. এ-তে এম্বেডেড রাইবোনিউক্লিওটাইডগুলিকে লক্ষ্য করে এবং আর. এন. এ প্রাইমার বা ওকাজাকি টুকরোগুলি ক্যাপচার করে না, তাই এটি অত্যন্ত হস্তান্তরযোগ্য এবং কার্যকরভাবে বিভিন্ন ধরনের জিনোমিক ডি. এন. এ-তে এম্বেডেড রাইবোনিউক্লিওটাইডগুলিকে লক্ষ্য করতে পারে। অতএব, রাইবোজ-সেক মানসম্মত পদ্ধতির প্রয়োজন ছাড়াই ছোট জিনোমিক অণু বা বড় পারমাণবিক জিনোম সহ বিভিন্ন ধরনের জিনোমে আরএনএমপি ম্যাপিংয়ের অনুমতি দেয়। উপরন্তু, রাইবোজ-সেকের নির্দিষ্টতা এমন পরিস্থিতিতেও আরএনএমপি-র ম্যাপিংয়ের অনুমতি দেয় যেখানে ডিএনএ পরিবেশগত চাপের সংস্পর্শে আসে যা বিরতি এবং/অথবা অ্যাবাসিক সাইট তৈরি করে ডিএনএ-কে ক্ষতি করে। রাইবোজ-সেক উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য অ্যাডাপ্টারে ইউএমআই ব্যবহার করে যা সিকোয়েন্সিং রিডগুলির অনুমান সম্পাদন করতে দেয় এবং এইভাবে আরএনএমপি হটস্পটগুলির আরও সঠিক সনাক্তকরণের ব্যবস্থা করে। রাইবোজ-সেক খামির কোষের জন্য নির্দিষ্ট নয়; এই কৌশলটি সম্ভাব্যভাবে যে কোনও প্রজাতির যে কোনও কোষে প্রয়োগ করা যেতে পারে, যা এটিকে বেশিরভাগ জীবের মধ্যে আরএনএমপি-র অবস্থান এবং প্যাটার্ন ব্যাখ্যা করার জন্য একটি দরকারী সরঞ্জাম করে তোলে। রাইবোজ-সেক সাধারণ পরীক্ষাগার সরঞ্জাম এবং বিকারক ব্যবহার করে যা উৎস থেকে পাওয়া মোটামুটি সহজ, যা এটিকে অনেক আণবিক জীববিজ্ঞান পরীক্ষাগারে ব্যবহারের জন্য একটি অ্যাক্সেসযোগ্য কৌশল করে তোলে। রাইবোজ-সেকিউ-এর সীমাবদ্ধতা যেহেতু এটি একক আরএনএমপি-কে লক্ষ্য করে, তাই রাইবোজ-সেকিউ দীর্ঘ রাইবোনিউক্লিওটাইড ট্র্যাক্ট ধরতে পারে না। অতএব, রাইবোজ-সেক আরএনএ প্রাইমার বা ওকাজাকি টুকরোগুলির ম্যাপিংয়ের জন্য উপযুক্ত কৌশল হবে না, যা ডিএনএ প্রতিলিপি বা বিরতির সময় গঠিত হতে পারে। জিনোমিক ডিএনএ থেকে আরএনএমপি লাইব্রেরি প্রস্তুত করতে রাইবোজ-সেক প্রায় 4 দিন সময় নেয়। প্রটোকলটিও তুলনামূলকভাবে জটিল, যার জন্য একাধিক ধাপের প্রয়োজন হয়। পরিপূরক পদ্ধতি রাইবোজ-ম্যাপ রাইবোজ-ম্যাপ হল বড়, জটিল আরএনএমপি কাঁচা সিকোয়েন্সিং ডেটাসেটগুলির প্রক্রিয়াকরণ এবং বিশ্লেষণের জন্য একটি বায়োইনফরম্যাটিক সরঞ্জাম। রাইবোজ-ম্যাপ রাইবোজ-সেক, এমরিবোসেক, পু-সেক, অ্যালক-হাইডেন-সেক এবং আরএইচআইআই-হাইডেন-সেকের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। (দেখুনঃ আরএনএমপি ক্যাপচারের জন্য অন্যান্য কৌশল)। আরইএসসিওটি (রিস্ট্রিকশন এনজাইম সেট অ্যান্ড কম্বিনেশন অপ্টিমাইজেশন টুলস) একটি গণনামূলক পদ্ধতি যা আরএনএমপি-ক্যাপচার করা অঞ্চলগুলির জিনোমিক কভারেজ গণনা করে এবং তারপর আরই সেটগুলিকে অপ্টিমাইজ করে এবং আরএনএমপি ক্যাপচার হার সর্বাধিক করার জন্য সর্বোচ্চ কভারেজ সহ আরই সেট নির্বাচন করে। আরএনএমপি ক্যাপচার এমরিবোসেক-এর জন্য অন্যান্য কৌশলঃ 5 'দিক থেকে এমবেডেড আরএনএমপি-র উজানে ডিঅক্সিরাইবোনিউক্লিয়টাইড ক্যাপচার করতে হিউম্যান আরএনএজ এইচ2 এবং টি4 কুইক লিগাজ ব্যবহার করে। আর. এইচ. আই. আই-হাইডেন-সেকঃ এসচেরিচিয়া কোলাই আর. এন. এস এইচ. আই এবং টি4 আর. এন. এ লিগাজ ব্যবহার করে তার 5 'দিক থেকে এমবেডেড আর. এন. এম. পি ক্যাপচার করে। আর. এইচ. আই. আই-হাইডেন-সেক একটি আর. এন. এম. পি এবং ওকাজাকি টুকরো দিয়ে শেষ হওয়া ডি. এন. এ ক্রমটিও ধরতে পারে। পু-সেকঃ 3 'দিক থেকে এমবেডেড আরএনএমপি-র ডিঅক্সিরাইবোনিউক্লিওটাইড ডাউনস্ট্রিম ক্যাপচার করতে ক্ষারীয় অবস্থা এবং টি4 আরএনএ লিগাজ ব্যবহার করে। ওকাজাকির টুকরোগুলি ধরতে পারে। অ্যাল্ক-হাইডইন-সেকঃ 3 'দিক থেকে এমবেডেড আরএনএমপি-র ডিঅক্সিরাইবোনিউক্লিওটাইড ডাউনস্ট্রিম ক্যাপচার করতে ক্ষারীয় অবস্থা এবং টি4 আরএনএ লিগাজ ব্যবহার করে। ওকাজাকির টুকরোগুলিও ধরতে পারে। আর. আই. এস. কিউ-সেক (রাইবোনিউক্লিওটাইড স্ক্যানিং কোয়ান্টিফিকেশন সিকোয়েন্সিং): আর. এন. এম. পি-র উজানের প্রতিবেশী ডিঅক্সিরাইবোনিউক্লিওটাইড ধরার জন্য পরম পরিমাণ নির্ধারণ ব্যবহার করে। তথ্যসূত্র রাইবোনিউক্লিয়াস জেনেটিক ম্যাপিং