Deterministic Barcoding in Tissue for Spatial Omics Sequencing
একটি টিস্যু নমুনার মধ্যে স্থানিক জিন অভিব্যক্তি হেটেরোজেনিসিটি অধ্যয়নের জন্য একটি মাল্টি-ওমিক্স পদ্ধতি তৈরি করতে 2020 সালে রং ফ্যান এবং সহকর্মীরা ইয়েল বিশ্ববিদ্যালয়ে স্প্যাটিয়াল ওমিক্স সিকোয়েন্সিং (ডিবিআইটি-এসইকিউ)-এর জন্য টিস্যুতে নির্ধারিত বারকোডিং তৈরি করেছিলেন। এই পদ্ধতিটি তাজা বা হিমায়িত ফর্মালডিহাইড-স্থির টিস্যু নমুনায় প্রায় একক-কোষ রেজোলিউশনে সহ-ম্যাপিং এমআরএনএ এবং প্রোটিন স্তরের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে। ডিবিআইটি-এসইকিউ পরবর্তী প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং (এনজিএস) এবং মাইক্রোফ্লুইডিক্স ব্যবহার করে। এই পদ্ধতিটি একটি টিস্যু নমুনার একযোগে স্থানিক প্রতিলিপি এবং প্রোটিওমিক বিশ্লেষণের অনুমতি দেয়। প্রতি পিক্সেলে সনাক্তযোগ্য জিনের সংখ্যা বৃদ্ধি, সেলুলার রেজোলিউশন বৃদ্ধি এবং বাস্তবায়নের সহজতার মাধ্যমে উচ্চ-সংজ্ঞা স্থানিক ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স (এইচ. ডি. এস. টি) এবং স্লাইড-সে. কিউ-এর মতো পূর্ববর্তী স্থানিক ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স অ্যাপ্লিকেশনের উপর ডিবি. আই. টি-সে. কিউ উন্নতি করে। বহুকোষী ব্যবস্থায় প্রয়োগগুলি প্রতিটি পৃথক কোষের কার্যকারিতা তাদের স্থানিক অবস্থান এবং আশেপাশের দ্বারা প্রভাবিত হয়। সুতরাং, একটি স্থানিক প্রেক্ষাপটে একটি টিস্যু জুড়ে এমআরএনএ এবং প্রোটিন উভয় মাত্রা প্রোফাইল করার জন্য ডিবিআইটি-সেকিউ-এর বাস্তবায়ন অনেক জৈবিক প্রক্রিয়া সম্পর্কে আরও ভাল বোঝার দিকে পরিচালিত করতে পারে। ডিবিআইটি-এসইকিউ-কে অনকোলজি, ডেভেলপমেন্টাল বায়োলজি এবং প্যাথলজির মতো বিভিন্ন ক্ষেত্রে ব্যবহার করা যেতে পারে। বিকাশমূলক জীববিজ্ঞানে ব্যবহার কীভাবে অর্গানোজেনেসিস ঘটে তা আরও ভালভাবে বোঝার দিকে পরিচালিত করতে পারে এবং অনকোলজিতে এটি টিউমারজেনেসিস এবং অগ্রগতিতে বৈচিত্র্যের ভূমিকা সম্পর্কে আরও অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে। পদ্ধতি DBiT-SEQ একটি সুনির্দিষ্টভাবে নিয়ন্ত্রিত প্যাটার্নে অলিগোনিউক্লিওটাইড বারকোড সরবরাহ করতে একটি মাইক্রোফ্লুইডিক্স সিস্টেম ব্যবহার করে। এ1বি1, এ1বি2 ইত্যাদি লেবেলযুক্ত বিভাগ জুড়ে অনন্য বারকোডগুলির একটি গ্রিড তৈরি করতে সিস্টেমটি অলিগোনিউক্লিওটাইড বারকোডগুলির দুটি সেট (এ1-এ50 এবং বি1-বি50) লম্বভাবে প্রয়োগ করে। যন্ত্র প্রস্তুতির জন্য ডিবিআইটি-সেকিউ-এর বারকোডগুলি সরবরাহ করার জন্য একটি বিশেষভাবে তৈরি মাইক্রোফ্লুইডিক্স যন্ত্রের প্রয়োজন হয়। মাইক্রোফ্লুইডিক্স মাইক্রন স্কেলে তরলের সুনির্দিষ্ট পরিচালনা করতে সক্ষম করে। ডিবিআইটিসেক যন্ত্রটি সিলিকন ওয়েফার ছাঁচে পলিডিমিথাইলসিলোক্সেন (পিডিএমএস) ঢালাই ব্যবহার করে প্রস্তুত করা হয়। যন্ত্রটি ব্যবহারকারীকে কোনও বিশেষ সরঞ্জাম ছাড়াই ম্যাক্রো স্কেলে উপযুক্ত চ্যানেলে তরল বিকারক জমা করার অনুমতি দেয়। এই বিকারকগুলি তারপর টিস্যু বিভাগের পৃষ্ঠ জুড়ে 10,25 বা 50 মাইক্রোমিটার প্রশস্ত চ্যানেলের মাধ্যমে ভ্যাকুয়াম দ্বারা টানা হয়। ডিবিআইটি-সেকিউ যন্ত্রের অন্যান্য উপাদানগুলি হল দুটি পিডিএমএস জলাধার এবং টিস্যুতে যন্ত্রের ফ্লাশ ধরে রাখার জন্য একটি এক্রাইলিক ক্ল্যাম্প ব্যবস্থা। টিস্যু প্রস্তুতি এবং অ্যান্টিবডি স্টেনিং ডিবিআইটি-এসইকিউ-এর একটি সুবিধা হল টিস্যু ফিক্সিং নামে পরিচিত একটি প্রক্রিয়ায় ফর্মালডিহাইডের সাথে সংরক্ষিত টিস্যু স্লাইডে এটি ব্যবহার করার ক্ষমতা, যা অন্যান্য স্থানিক ওমিক পদ্ধতির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ নয়। টিস্যুগুলি হিমায়িত, স্থির এবং খুব পাতলা স্লাইসে বিভক্ত করা হয় যা কাচের স্লাইডে লাগানো থাকে। যদি নমুনায় প্রোটিন সম্পর্কে তথ্য চাওয়া হয়, তবে টিস্যুতে প্রথমে অ্যান্টিবডি-প্রাপ্ত ডিএনএ ট্যাগ (এডিটি) দিয়ে দাগ দেওয়া হয়। এডিটিগুলি একটি অ্যান্টিবডি নিয়ে গঠিত যা একটি অলিগোনিউক্লিওটাইডের সাথে সংযুক্ত থাকে যার মধ্যে একটি অনন্য বারকোড ক্রম এবং একটি পলি-এ লেজ ক্রম থাকে। পলি-এ লেজটি বারকোড এ-তে পলি-টি ক্রম দ্বারা স্বীকৃত হবে, যা এটিকে একটি স্থানিক অবস্থানের সাথে যুক্ত করতে সক্ষম করবে। বারকোডিং অ্যান্টিবডি দাগ দেওয়ার পরে (যদি ইচ্ছা হয়), প্রথম মাইক্রোফ্লুইডিক্স চিপ ব্যবহার করে টিস্যু নমুনায় 50টি বারকোডের প্রথম সেট প্রয়োগ করা হয়। প্রতিটি 'এ' প্রাইমারের একটি অনন্য বারকোড সিকোয়েন্স, একটি লাইগেশন লিঙ্কার এবং একটি পলি টি সিকোয়েন্স থাকে। পলি-টি ক্রমটি টিস্যু নমুনায় এবং আগে প্রয়োগ করা এডিটিগুলিতে এমআরএনএ-তে পলি-এ লেজের সাথে আবদ্ধ হয়। বিপরীত প্রতিলিপি তারপর বারকোড এবং এমআরএনএ বা অ্যান্টিবডি ট্যাগ ক্রম ধারণকারী প্রথম সিডিএনএ স্ট্র্যান্ড তৈরি করে। চিপ বি তারপর একই টিস্যু স্লাইডে প্রয়োগ করা হয়। চিপ বি প্রথমটির লম্বভাবে বারকোডগুলির দ্বিতীয় সেট সরবরাহ করবে, একটি গ্রিড প্যাটার্ন তৈরি করবে। প্রতিটি 'বি' অলিগোনিউক্লিওটাইডে একটি অনন্য বারকোড ক্রম, একটি পিসিআর হ্যান্ডেল, একটি লাইগেশন লিঙ্কার এবং সিডিএনএ পরিশোধন করার জন্য বায়োটিন থাকে। লিগশন লিঙ্কার সিকোয়েন্সগুলি বারকোড এ এবং বি-কে একক ডিএনএ স্ট্র্যান্ডে একত্রিত করতে ব্যবহৃত হয়। অবশেষে, একটি লিসিস ধাপ টিস্যু থেকে সিডিএনএ বের করে একটি পুল করা নমুনায় সমস্ত বারকোডেড স্ট্র্যান্ড ধারণ করে। গ্রন্থাগার প্রস্তুতি এবং সিকোয়েন্সিং ধাপ 3-এ উত্পাদিত সিডিএনএ লাইসেট স্ট্রেপ্টাভিডিন পুঁতি ব্যবহার করে শুদ্ধ করা হয় যা বারকোড বি-তে বায়োটিনকে চিনতে পারে। পরিপূরক সিডিএনএ স্ট্র্যান্ডটি বিপরীত প্রতিলিপি দ্বারা সংশ্লেষিত হয়, তারপরে পিসিআর পরিবর্ধন এবং গ্রন্থাগারের চূড়ান্ত পরিশোধন করা হয়। গ্রন্থাগারটি পরবর্তী প্রজন্মের (ইলুমিনা) সিকোয়েন্সিং ব্যবহার করে সিকোয়েন্স করা হয়। তথ্য বিশ্লেষণ বারকোড থেকে প্রাপ্ত স্থানিক তথ্যের সুনির্দিষ্ট সংযোগ সক্ষম করতে প্রতিটি বারকোডিং ধাপের আগে, সময় এবং পরে টিস্যু স্লাইডের ছবি তোলা হয়। প্রতিটি এম. আর. এন. এ ক্রমের সাথে বারকোডগুলিকে সংযুক্ত করা টিস্যুর একটি স্থানিক ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স মানচিত্র সরবরাহ করে। যদিও এটি একটি একক-কোষ পদ্ধতি নয়, 10টি ইউএম চ্যানেল প্রতি বর্গক্ষেত্রে মাত্র 1 থেকে 2টি কোষ ধারণ করে, যা কাছাকাছি-একক-কোষ রেজোলিউশন তৈরি করে। এডিটি ক্রমগুলি স্থানিক প্রোটিওমিক তথ্য ধারণ করে যা প্রতিলিপিগত তথ্যের সাথে তুলনা করা যেতে পারে। নির্দিষ্ট কোষের জনসংখ্যা দুটি উপায়ে চিহ্নিত করা যেতে পারে। প্রথমত, প্রতিটি কোষের প্রকারের জন্য পূর্ববর্তী একক-কোষ আরএনএ-সেকিউ (এসসিআরএনএ-সেকিউ) প্রোফাইলের সাথে ট্রান্সক্রিপ্টোমের মিল রেখে। দ্বিতীয়ত, স্পেসিয়াল ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন (স্প্যাটিয়ালডিই) ব্যবহার করে, একটি প্যাটার্ন স্বীকৃতি সফ্টওয়্যার যা এসসিআরএনএ-এসইকিউ ডেটা ছাড়াই টিস্যুর প্রকারকে আলাদা করতে পারে। সুবিধা এবং সীমাবদ্ধতা ডিবিআইটি-এসইকিউ এমআরএনএ এবং প্রোটিনের সহ-ম্যাপিংয়ের অনুমতি দিয়ে অন্যান্য স্থানিক-ওমিক্স কৌশলগুলির তুলনায় একটি সুবিধা প্রদান করে। এটি বিশ্লেষণের জন্য ট্রান্সক্রিপ্টোমিক এবং প্রোটিওমিক তথ্য উভয়ই সরবরাহ করে। কৌশলটি সহজেই প্রয়োগ করা যেতে পারে এবং গবেষকের চাহিদা এবং আগ্রহের প্রোটিনের সাথে খাপ খাইয়ে নেওয়া যেতে পারে। এই পদ্ধতিটি এইচ অ্যান্ড ই এবং ইমিউনোস্টেইন টিস্যু নমুনার পাশাপাশি ফর্মালডিহাইড-স্থির টিস্যু নমুনার ক্ষেত্রে সফলভাবে ব্যবহার করা যেতে পারে। বারকোডিংয়ের জন্য ব্যবহৃত চ্যানেলগুলি 10 মাইক্রোমিটার, 25 মাইক্রোমিটার এবং 50 মাইক্রোমিটার থেকে রেজোলিউশনের প্রয়োজনীয়তার জন্য সামঞ্জস্য করতে পরিবর্তন করা যেতে পারে। সীমাবদ্ধতা ডিবিআইটি-এসইকিউ-এর রেজোলিউশনে একক কোষের রেজোলিউশন নেই, তবে এটি একক কোষের রেজোলিউশনের কাছাকাছি। পিক্সেলের আকারের একটি তাত্ত্বিক সীমা ~ 5 মাইক্রোমিটার, যা একটি একক কোষ পর্যবেক্ষণের একক বা ভগ্নাংশের জন্য যথেষ্ট ছোট কিন্তু প্রয়োগ করা হয়নি। বর্তমান চ্যানেল কনফিগারেশনের সাথে একটি টিস্যুতে ম্যাপিং এলাকার একটি আকার সীমাবদ্ধতা রয়েছে, 10 মাইক্রোমিটার চ্যানেল ব্যবহার করে এটি টিস্যুর শুধুমাত্র 1 মিমি × 1 মিমি এলাকা ম্যাপ করার অনুমতি দেয়। এই সীমাবদ্ধতা কাটিয়ে উঠতে অতিরিক্ত বারকোডিং চ্যানেল যুক্ত করা যেতে পারে আচ্ছাদিত এলাকা বাড়ানোর জন্য। সংক্ষেপে টিস্যুগুলি কোষের বৈচিত্র্যময় জনসংখ্যার দ্বারা গঠিত। এই কোষগুলি কীভাবে একসাথে কাজ করে এবং টিস্যুতে প্রতিটি কোষের প্রকারের ভূমিকা ক্যান্সার গবেষণা এবং বিকাশমূলক জীববিজ্ঞানের মতো ক্ষেত্রে গুরুত্বপূর্ণ। একক কোষের ওমিক্স প্রযুক্তির অগ্রগতি এই জটিল পরিবেশগুলি বোঝার জন্য আমাদের প্রচেষ্টাকে উন্নত করেছে, তবে স্থানিক তথ্যের উল্লেখযোগ্য অভাব রয়েছে। স্থানিক ওমিক্সের আবির্ভাবের ফলে এটি উন্নত হয়েছে। ডিবিআইটি-এসইকিউ স্থির বা তাজা টিস্যু বিভাগ থেকে স্থানিক প্রতিলিপি এবং প্রোটিওমিক তথ্য পাওয়ার জন্য একটি অ্যাক্সেসযোগ্য পদ্ধতি প্রদান করে। 10, 25 বা 50 মাইক্রোমিটার রেজোলিউশনের সাথে, ডিবিআইটি-এসইকিউ প্রায় একক কোষ রেজোলিউশন সরবরাহ করে এবং অত্যন্ত বিশেষায়িত ইমেজিং সরঞ্জামের প্রয়োজন ছাড়াই স্থানিক ওমিক্স ডেটা সরবরাহ করে। রেফারেন্স ওমিক্স ডিএনএ বারকোডিং