ScGET-seq
একক-কোষ জিনোম এবং এপিজেনোম বাই ট্রান্সপোসেস সিকোয়েন্সিং (এসসিজিইটি-এসইকিউ) হল খোলা এবং বন্ধ ক্রোমাটিন প্রোফাইলিংয়ের জন্য একটি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি। ট্রান্সপোসেজ-অ্যাক্সেসযোগ্য ক্রোমাটিনের জন্য একক-কোষ পরীক্ষার বিপরীতে সিকোয়েন্সিং (এসসিএটিএসি-এসইকিউ), যা শুধুমাত্র সক্রিয় ইউক্রোমাটিনকে লক্ষ্য করে। এস. সি. জি. ই. টি-এস. ই. কিউ নিষ্ক্রিয় হেটেরোক্রোমাটিন পরীক্ষা করতেও সক্ষম। এটি টিএনএইচ ব্যবহারের মাধ্যমে অর্জন করা হয়, যা হেটেরোক্রোমাটিন প্রোটিন-1-আলফা (এইচপি-1) এর ক্রোমোডোমেইন (সিডি) কে টিএন5 ট্রান্সপোসেজের সাথে সংযুক্ত করে তৈরি করা হয়। টিএনএইচ তারপর হিস্টোন 3 লাইসিন 9 ট্রাইমিথাইলেশন (এইচ3কে9মে3) কে লক্ষ্য করতে সক্ষম হয়, যা হেটেরোক্রোমাটিনের একটি চিহ্নিতকারী। আকিন থেকে আর. এন. এ বেগ, যা কোষীয় বিকাশের সময় জিন অভিব্যক্তির পরিবর্তনের গতিবিদ্যা অনুমান করতে স্প্লাইসড এবং আনস্প্লাইসড আর. এন. এ অনুপাত ব্যবহার করে, এস. সি. জি. ই. টি-এস. ই. কিউ থেকে প্রাপ্ত টি. এন. এইচ থেকে টি. এন. 5 সংকেতের অনুপাত ক্রোমাটিন বেগ গণনা করতে ব্যবহার করা যেতে পারে, যা কোষীয় বিকাশের পথের সময় ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসযোগ্যতার গতিবিদ্যা পরিমাপ করে। ইতিহাস প্রতিলিপিগত নিয়ন্ত্রণ ক্রোমাটিন অবস্থার সাথে দৃঢ়ভাবে যুক্ত। ক্রোমাটিন যা উন্মুক্ত, বা প্রতিলিপির জন্য অনুমোদিত, জিনোমের শুধুমাত্র 2-3% তৈরি করে, তবে প্রতিলিপি ফ্যাক্টর বাঁধাই সাইটগুলির 94.4% অন্তর্ভুক্ত করে। বিপরীতভাবে, আরও শক্তভাবে প্যাক করা ডিএনএ বা হেটেরোক্রোমাটিন জিনোম সংগঠন এবং স্থিতিশীলতার জন্য দায়ী। কোষীয় পৃথকীকরণ প্রক্রিয়া চলাকালীন ক্রোমাটিনের ঘনত্বও পরিবর্তিত হয়, তবে সরাসরি হেটেরোক্রোমাটিন পরীক্ষা করার জন্য উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং পদ্ধতির অভাব রয়েছে। অনেক জিনোমিক-সম্পর্কিত রোগ যেমন ক্যান্সার তাদের এপিজেনোমের পরিবর্তনের সাথে অত্যন্ত যুক্ত। বিশেষত ক্যান্সারগুলি একক-কোষের বৈচিত্র্য দ্বারা চিহ্নিত করা হয়, যা মেটাস্ট্যাসিস এবং চিকিত্সা প্রতিরোধকে চালিত করতে পারে। এই প্রক্রিয়াগুলির অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াগুলি এখনও বেশিরভাগ ক্ষেত্রেই অজানা, যদিও একক-কোষ এপিজেনোমিক্স সহ একক-কোষ প্রযুক্তির আবির্ভাব তাদের ব্যাখ্যায় ব্যাপক অবদান রেখেছে। 2015 সালে, এটিএসি-এসইকিউ, যা টিএন5 ট্রান্সপোসেজকে টুকরো টুকরো করে ব্যবহার করে এবং সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য অ্যাক্সেসযোগ্য ক্রোমাটিন বা ইউক্রোমাটিনকে ট্যাগ করে, একক-কোষ রেজোলিউশনে সম্ভবপর হয়ে ওঠে। প্রতিটি কোষের মধ্যে ক্রোমাটিন কাঠামো এবং গতিশীলতার আরও বিস্তৃত চেহারা প্রদান করে হেটেরোক্রোমাটিন সম্পর্কে তথ্য সরবরাহ করে এস. সি. জি. ই. টি-এস. ই. কিউ এই প্রযুক্তিটি তৈরি করে। পদ্ধতি নমুনা প্রস্তুতি এস. সি. জি. ই. টি-এস. ই. কিউ-এর জন্য নমুনা প্রস্তুতি শুরু হয় প্রারম্ভিক উপাদানের জন্য উপযুক্ত একটি পদ্ধতি ব্যবহার করে কোষ থেকে নিউক্লিয়াসের সাসপেনশন পাওয়ার মাধ্যমে। পরবর্তী পদক্ষেপটি হল টিএনএইচ ট্রান্সপোসেজ তৈরি করা। টিএন5 হল একটি ট্রান্সপোসেজ যা নিউক্লিওসোম (ওপেন ক্রোমাটিন) দ্বারা আবদ্ধ নয় এমন জিনোমিক অঞ্চলে অ্যাডাপ্টারগুলিকে কেটে এবং সংযুক্ত করে। এইচপি-1এ এইচপি1 পরিবারের একটি সদস্য এবং এইচ3কে9মি3-কে চিনতে এবং বিশেষভাবে বাঁধতে সক্ষম। এর ক্রোমোডোমেইন এই ক্রোমাটিন পরিবর্তনকে শনাক্ত করার জন্য একটি ইনডিউসড-ফিট প্রক্রিয়া ব্যবহার করে। তিনটি পলি-টাইরোসিন-গ্লাইসিন-সেরিন (টি. জি. এস) সংযোগকারী ব্যবহার করে ক্রোমোডোমেইন ধারণকারী এইচ. পি-1এ-এর প্রথম 112টি অ্যামিনো অ্যাসিডকে টি. এন. 5-এর সঙ্গে যুক্ত করলে টি. এন. এইচ ট্রান্সপোসেজ তৈরি হয়, যা এইচ3কে9মি3 দ্বারা চিহ্নিত হেটেরোক্রোমাটিনকে লক্ষ্য করতে সক্ষম। গ্রন্থাগার প্রস্তুতি একক-কোষ এ. টি. এ. সি-এস. ই. কিউ-এর জন্য একটি পরিবর্তিত প্রোটোকল ব্যবহার করে করা হয়, যেখানে নিউক্লিয়াস সাসপেনশন ক্রমানুসারে প্রথমে টি. এন. 5 ট্রান্সপোসেস এবং তারপর টি. এন. এইচ-এর সাথে ইনকিউবেট করা হয়। তথ্য বিশ্লেষণ তথ্য বিশ্লেষণের লক্ষ্যগুলি হ 'লঃ ক্লাস্টারিং ব্যবহার করে স্বতন্ত্র কোষের জনসংখ্যা চিহ্নিত করা এবং বৈশিষ্ট্যযুক্ত করা জিনোম জুড়ে ক্রোমাটিনের অ্যাক্সেসিবিলিটি প্রোফাইল করতে অনুলিপি-সংখ্যার রূপ এবং একক-নিউক্লিওটাইড রূপগুলির পূর্বাভাস দেওয়ার জন্য প্রাক-প্রক্রিয়াকরণ পোস্ট-সিকোয়েন্সিং, রিডগুলিকে বহুগুণিত করা এবং উপযুক্ত রেফারেন্স জিনোমে ম্যাপ করা প্রয়োজন। ডুপ্লিকেট রিডগুলি চিহ্নিত করা হয় এবং সরানো হয়। "চূড়া", বা ম্যাপ করা রিডের সংখ্যায় সমৃদ্ধ ডি. এন. এ-র অঞ্চলগুলি চিহ্নিত করা হয়। গুণমান নিয়ন্ত্রণ করা হয়, এবং কম সংখ্যক রিড বা কয়েকটি সনাক্ত বৈশিষ্ট্যযুক্ত কোষগুলি ফিল্টার করা হয়। চারটি গণনা ম্যাট্রিক্স (ম্যাট্রিক্স যেখানে প্রতিটি কলাম একটি কোষ এবং প্রতিটি সারি একটি বৈশিষ্ট্য) তৈরি করা হয়ঃ টিএন5-ডিএইচএস, টিএন5-কমপ্লিমেন্ট, টিএনএইচ-ডিএইচএস এবং টিএনএইচ-কমপ্লিমেন্ট, যা অ্যাক্সেসযোগ্য এবং কম্প্যাক্টড ক্রোমাটিন থেকে সংকেত উপস্থাপন করে। বিশ্লেষণ মাত্রা হ্রাস, ভিজ্যুয়ালাইজেশন এবং ক্লাস্টারিং প্রতিটি ম্যাট্রিক্স ভাগ করা অঞ্চল থেকে ফিল্টার করা হয় এবং তারপর স্বাভাবিক করা হয় এবং লগ 2 রূপান্তরিত হয়। প্রধান উপাদান বিশ্লেষণ (পি. সি. এ) ব্যবহার করে রৈখিক মাত্রা হ্রাস করা হয়। কোষের গোষ্ঠীগুলি কে-এনএন অ্যালগরিদম এবং লাইডেন অ্যালগরিদম ব্যবহার করে চিহ্নিত করা হয়। পরিশেষে, ম্যাট্রিক্স ফ্যাক্টরাইজেশন এবং ইউএমএপি হ্রাস ব্যবহার করে চারটি ম্যাট্রিক্স একত্রিত করা হয়। কোষ শনাক্তকরণ টীকা দুটি পদ্ধতি রয়েছেঃ এ. টি. এ. সি শিখরগুলির বৈশিষ্ট্য টীকা উপর ভিত্তি করে টীকা এবং রেফারেন্স এস. সি. আর. এন. এ-এস. ই. কিউ তথ্যের সাথে একীকরণের উপর ভিত্তি করে টীকা। প্রয়োগ বর্তমান টিএন5 থেকে টিএনএইচ সংকেতের অনুপাত ব্যবহার করে, ক্রোমাটিন পুনর্নির্মাণ কতটা দ্রুত এবং কোন দিকে হচ্ছে তা বর্ণনা করে পরিমাণগত মান গণনা করা যেতে পারে (ক্রোমাটিন বেগ)। সর্বাধিক গতিশীল অঞ্চলগুলিকে পৃথক করে এবং কোন ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরগুলি সেখানে আবদ্ধ করে তা চিহ্নিত করে, ক্রোমাটিন বেগ একটি প্রদত্ত কোষের মধ্যে ঘটে যাওয়া গতিশীল এপিজেনেটিক প্রক্রিয়া এবং সেই প্রক্রিয়াগুলিতে বিভিন্ন ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরের অবদান অনুমান করতে ব্যবহার করা যেতে পারে। ভবিষ্যতের ক্রোমাটিন পুনর্নির্মাণ জিন অভিব্যক্তির পরিবর্তনের আগে এবং কোষীয় পরিবর্তনের গতিপথ এবং প্রক্রিয়াগুলির বোঝাপড়া বাড়ায়। সুতরাং, মাল্টিমোডাল তথ্যের সংহতকরণের জন্য প্ল্যাটফর্ম এবং সরঞ্জামগুলি সক্রিয় গবেষণার ক্ষেত্র আরএনএ বেগের সাথে ক্রোমাটিন বেগের সংহতকরণের মাধ্যমে সাময়িক এবং দিকনির্দেশক উপাদানগুলিকে অন্তর্ভুক্ত করার প্রস্তাব দেওয়া হয়েছে যাতে পৃথকীকরণের পথ সম্পর্কে আরও তথ্য প্রকাশ করা যায়। সীমাবদ্ধতা এস. সি. জি. ই. টি-এস. ই. কিউ-এর কিছু সীমাবদ্ধতা রয়েছে যেমন এস. সি. এ. টি. এ. সি-এস. ই. কিউ। উভয় প্রক্রিয়ার জন্যই কার্যকর কোষ থেকে নিউক্লিয়াসের নমুনা এবং উচ্চ কোষীয় কার্যকারিতা প্রয়োজন। কম কোষীয় কার্যকারিতা উচ্চ পটভূমি ডিএনএ দূষণের দিকে পরিচালিত করে যা সঠিকভাবে খাঁটি জৈবিক সংকেত উপস্থাপন করে না। উপরন্তু, এসসিএটিএসি-এসইকিউ এবং এসসিজিইটি-এসইকিউ তথ্যের অস্পষ্টতা এবং কোলাহলপূর্ণ প্রকৃতি বিশ্লেষণকে চ্যালেঞ্জিং করে তোলে এবং এই তথ্যটি কীভাবে সর্বোত্তমভাবে পরিচালনা করা যায় সে সম্পর্কে এখনও কোনও ঐকমত্য নেই আরেকটি সীমাবদ্ধতা হল যে এসসিজিইটি-এসইকিউ-এর এখনও বাল্ক জিনোম সিকোয়েন্সিং দ্বারা এসএনভি ফলাফলের বৈধতা প্রয়োজন। যদিও বাল্ক এক্সোম সিকোয়েন্সিং এবং এসসিজিইটি-এসইকিউ ফলাফলের মধ্যে মিউটেশনের একটি উচ্চ সম্পর্ক রয়েছে, এসসিজিইটি-এসইকিউ সমস্ত এক্সোম এসএনভি ক্যাপচার করতে ব্যর্থ হয়। তথ্যসূত্র আণবিক জীববিজ্ঞান কৌশল