Ribonucleoprotein Networks Analyzed by Mutational Profiling
মিউটেশনাল প্রোফাইলিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা রাইবোনিউক্লিওপ্রোটিন নেটওয়ার্ক (আরএনপি-এমএপি) হল নিউক্লিওটাইড রেজোলিউশনে আরএনএ-প্রোটিন নেটওয়ার্ক এবং প্রোটিন বাঁধাই সাইটগুলি অনুসন্ধান করার একটি কৌশল। আরএনপি সমাবেশ এবং কার্যকারিতা সম্পর্কে তথ্য জৈবিক প্রক্রিয়াগুলির আরও ভাল বোঝার সুবিধার্থে করতে পারে। আরএনপি-এমএপি এনএইচএস-ডায়াজিরিন (এসডিএ) ব্যবহার করে, যা একটি হেটেরো-বাইফাংশানাল ক্রসলিঙ্কার, আরএনএ-আবদ্ধ প্রোটিনগুলিকে জায়গায় হিমায়িত করতে। একবার আর. এন. এ-প্রোটিন ক্রস লিঙ্ক তৈরি হয়ে গেলে, এম. এ. পি বিপরীত প্রতিলিপি প্রোটিন-আবদ্ধ আর. এন. এ-গুলিকে বিপরীতভাবে প্রতিলিপি করার পাশাপাশি আর. এন. এ-প্রোটিন ক্রস লিঙ্কের জায়গায় মিউটেশন প্রবর্তন করার জন্য পরিচালিত হয়। সি. ডি. এন. এ-র ক্রম ফলাফল প্রোটিন-আর. এন. এ মিথস্ক্রিয়া নেটওয়ার্ক এবং প্রোটিন বাঁধাই সাইট উভয় সম্পর্কে তথ্য প্রকাশ করে। কৌশলগত উপাদান আর. এন. এ-এম. এ. পি-তে তিনটি প্রধান উপাদান রয়েছেঃ রাইবোনিউক্লিওপ্রোটিন (আর. এন. পি): আর. এন. এ এবং আর. এন. এ-বাইন্ডিং প্রোটিন (আর. বি. পি) দ্বারা গঠিত কমপ্লেক্স, এন. এইচ. এস-ডায়াজিরিন (এস. ডি. এ): একটি কোষ পারগম্য ক্রসলিংকিং বিকারক। এসডিএ-তে দুটি প্রতিক্রিয়াশীল গোষ্ঠী রয়েছে-একটি ডায়াজিরিন এবং একটি সাক্সিনিমিডাইল এস্টার। সাক্সিনিমিডাইল এস্টার এবং অ্যামাইন গোষ্ঠীর মধ্যে প্রতিক্রিয়া (যেমন। লাইসিনের পার্শ্ব শৃঙ্খলের ফলে পেপটাইড বন্ধন (বা অ্যামাইড বন্ধন) তৈরি হয়। যখন 365 এনএম তরঙ্গদৈর্ঘ্য সহ ইউভি আলোর সংস্পর্শে আসে, তখন নিউক্লিওটাইড রাইবোস এবং ঘাঁটির প্রতি একটি মধ্যবর্তী বিস্তৃত প্রতিক্রিয়াশীল তৈরি হয়। ফলস্বরূপ, এস. ডি. এ লিঙ্কার দ্বারা প্রোটিনগুলি আর. এন. এ-র সঙ্গে সংযুক্ত হয়। মিউটেশনাল প্রোফাইলিং (এম. এ. পি): প্রোটিন-আর. এন. এ বাইন্ডিং সাইটে পরিবর্তিত অবশিষ্টাংশগুলিকে অন্তর্ভুক্ত করার জন্য শিথিল বিশ্বস্ততার সাথে বিপরীত প্রতিলিপি ব্যবহার করে একটি পদ্ধতি। কর্মপ্রবাহ দীর্ঘ-তরঙ্গদৈর্ঘ্য ইউভি এবং এসডিএ বিকারকগুলি প্রথমে লাইসিন (বা আর্জিনিন) অবশিষ্টাংশের অ্যামাইন গোষ্ঠী এবং সাক্সিনিমিডাইল এস্টারগুলির মধ্যে অ্যামাইড বন্ধন তৈরি করে আরএনএ-র সাথে প্রোটিন অবশিষ্টাংশগুলিকে ক্রসলিঙ্ক করার জন্য জীবিত কোষগুলিতে সরবরাহ করা হয়। এরপরে, ক্রসলিঙ্কযুক্ত আরএনপি ধারণকারী কোষগুলি লাইসেড করা হয় এবং আরএনএ-আবদ্ধ প্রোটিনগুলি পেপটাইড সংযোজনগুলিতে হজম হয়। এমএপি বিপরীত প্রতিলিপি তারপর পেপটাইড অ্যাডডাক্ট-প্ররোচিত মিউটেশনের মাধ্যমে প্রোটিন-আরএনএ বাঁধাই সাইটগুলিকে লেবেল করার জন্য সঞ্চালিত হয়। মিউটেশন-যুক্ত সি. ডি. এন. এ পণ্যের ক্রমবিন্যাস মিউটেশন সাইটগুলি (বা আর. এন. পি-এম. এ. পি সাইটগুলি) প্রকাশ করবে এবং আর. এন. পি-এম. এ. পি সাইটগুলির মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক 3-নিউক্লিওটাইড উইন্ডো ব্যবহার করে গণনামূলকভাবে নির্ধারিত হয়। বিশ্লেষণ আরএনপি-এমএপি সাইট সনাক্তকরণ আরএনপি-এমএপি সাইটগুলিকে প্রোটিন আবদ্ধ নিউক্লিওটাইড হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়। এসডিএ এবং ইউভি চিকিত্সা এবং ইউভি শুধুমাত্র চিকিত্সা করা নমুনা ক্রম রিডগুলি সারিবদ্ধ করা হয় এবং রূপান্তরগুলি শেপম্যাপার 2 সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে গণনা করা হয়। একটি নিউক্লিওটাইডের জন্য এস. ডি. এ বা আর. এন. পি-এম. এ. পি প্রতিক্রিয়াশীলতা হল ক্রস লিঙ্কযুক্ত (এস. ডি. এ এবং ইউ. ভি চিকিত্সা) মিউটেশন ফ্রিকোয়েন্সি এবং আন-ক্রস লিঙ্কযুক্ত (শুধুমাত্র ইউ. ভি) মিউটেশন ফ্রিকোয়েন্সির অনুপাত। ডিফারেনশিয়াল মিউটেশনাল সিগনেচার ব্যবহার করে, পরিচিত কাঠামোর রাইবোনিউক্লিওপ্রোটিন বিশ্লেষণ থেকে প্রাপ্ত প্রতিটি আরএনএ নিউক্লিওটাইডের (ইউ, এ, সি এবং জি) সর্বজনীন স্বাভাবিককরণের কারণ এবং প্রান্তিকের উপর ভিত্তি করে আরএনপি-এমএপি সাইটগুলি চিহ্নিত করা হয়। একটি নিউক্লিওটাইডকে আরএনপি-এমএপি সাইট হিসাবে চিহ্নিত করা হয় যদি এটি তিনটি ফিল্টার পাস করেঃ এসডিএ + ইউভি-ট্রিটেড নমুনায় মিউটেশন ইভেন্টের সংখ্যা ইউভি-ট্রিটেড নমুনার চেয়ে কমপক্ষে 50 বেশি। সাইটের প্রতিক্রিয়াশীলতা অবশ্যই নিউক্লিওটাইড-নির্ভর সীমা () অতিক্রম করতে হবে যা অভিজ্ঞতাগতভাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়ঃ যেখানে নিউক্লিওটাইড ইউ, এ, সি, বা জি একটি> 10এ গ্রুপে নিউক্লিওটাইডের 90 শতাংশ প্রতিক্রিয়াশীলতা মান দ্বারা সংজ্ঞায়িত পটভূমি সীমা হল সমস্ত নিউক্লিওটাইডের জন্য সমস্ত প্রতিক্রিয়াশীলতার মধ্যমা যা সমস্ত নিউক্লিওটাইডের জন্য প্রতিক্রিয়াশীলতার মানক বিচ্যুতি গণনা করা জেড-ফ্যাক্টর শূন্যের চেয়ে বেশি গণনা করা জেড-ফ্যাক্টরকে সংজ্ঞায়িত করা হয়, যেখানে এসডিএ এবং ইউভি দিয়ে চিকিত্সা করা নিউক্লিওটাইডের রূপান্তর হার এবং শুধুমাত্র ইউভি দিয়ে চিকিত্সা করা নিউক্লিওটাইডের রূপান্তর হার, যেখানে চিকিত্সা (এসডিএ + ইউভি বা ইউভি শুধুমাত্র) প্রোটিন-আরএনএ মিথস্ক্রিয়া নেটওয়ার্ক। আরএনপি-এমএপি পারস্পরিক সম্পর্ক আরএনপি-এমএপি সাইটগুলি থেকে স্বাধীন আরএনএ-র সাথে প্রোটিন বাঁধাইয়ের একটি পরিপূরক পরিমাপ প্রদান করে। রিংম্যাপার নামে পরিচিত একটি জি-টেস্ট কাঠামো ব্যবহার করে এগুলি চিহ্নিত করা হয়। আর. এন. পি-এম. এ. পি পারস্পরিক সম্পর্কের জন্য একটি একক আর. এন. এ অণুর প্রয়োজন হয় যাতে কমপক্ষে দুটি আন্তঃসংযোগ তৈরি হয় এবং তিনটি পরিস্থিতির যে কোনও একটি থেকে উদ্ভূত হয়ঃ একটি প্রোটিন একটি আর. এন. এ-র দুটি স্থানে আবদ্ধ হয় দুটি প্রোটিন যা একটি আর. এন. এ-তে দুটি স্থানে মিথস্ক্রিয়া করে এবং আবদ্ধ হয় দুটি প্রোটিন একটি সমন্বিত সমাবেশ প্রক্রিয়া দ্বারা একটি আর. এন. এ-তে দুটি স্থানে জমা হয় আর. এন. পি-এম. এ. পি পারস্পরিক সম্পর্ক ব্যবহার করে, প্রোটিন-আর. এন. এ মিথস্ক্রিয়া সাইটগুলির একটি নেটওয়ার্ক পাওয়া যায় এবং তারপরে কার্যকরী বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে। সম্পর্কিত পদ্ধতি ক্রস-লিঙ্কিং ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন (সিএলআইপি) সিএলআইপি ইউভি ক্রস-লিঙ্কিং এবং ইমিউনোপ্রিসিপিটেশনকে একত্রিত করে আরএনএ-র সাথে প্রোটিনের মিথস্ক্রিয়া বিশ্লেষণ করে। সি. এল. আই. পি-ভিত্তিক কৌশলগুলি জিনোম-ওয়াইড স্কেলে আগ্রহের আর. এন. এ বাইন্ডিং প্রোটিন বাইন্ডিং সাইটগুলির মানচিত্র তৈরি করতে সক্ষম। অনেকগুলি সি. এল. আই. পি-ভিত্তিক পদ্ধতি রয়েছে যার মধ্যে রয়েছেঃ এইচ. আই. টি. এস-সি. এল. আই. পি (ক্রসলিংকিং ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন বা সি. এল. আই. পি-এস. কিউ দ্বারা বিচ্ছিন্ন আর. এন. এ-র উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং) পি. এ. আর-সি. এল. আই. পি (ফটোঅ্যাকটিভেটেবল রাইবোনিউক্লিওসাইড-বর্ধিত ক্রস-লিঙ্কিং এবং ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন) আই. সি. এল. আই. পি (ইন্ডিভিজুয়াল নিউক্লিওটাইড-রেজোলিউশন ক্রস-লিঙ্কিং এবং ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন) ই. সি. এল. আই. পি (বর্ধিত ক্রস-লিঙ্কিং এবং ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন তারপরে উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং) এস. সি. এল. আই. পি (সিম্পল ক্রস-লিঙ্কিং এবং ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন) মাস স্পেকট্রোমেট্রি কোয়ান্টিটেটিভ মাস স্পেকট্রোমেট্রি (এম. এস) লেবেলিং এমএস পদ্ধতিতে স্থিতিশীল আইসোটোপ লেবেলের ডিফারেনশিয়াল ব্যবহার বা নমুনা এবং নিয়ন্ত্রণে প্রোটিনের রাসায়নিক ট্যাগিং জড়িত। এটি লেবেলযুক্ত পেপটাইডের অনুপাতের মাধ্যমে সমৃদ্ধকরণ স্কোর এবং প্রকৃত বাঁধাই অংশীদার পেতে ব্যবহৃত হয়। লেবেল-মুক্ত এমএস পদ্ধতিগুলি নমুনা এবং নিয়ন্ত্রণে প্রোটিন সনাক্ত করতে সক্ষম। অনির্দিষ্ট প্রোটিনের জন্য সত্যিকারের বাঁধাই অংশীদারদের আলাদা করার জন্য, অ-পরিমাণগত এমএস থেকে বর্ণালী গণনা তথ্যের পাশাপাশি ব্যবহৃত বিশ্লেষণাত্মক সরঞ্জামগুলি সত্যিকারের আর. বি. পি-আর. এন. এ মিথস্ক্রিয়ার সম্ভাবনা স্কোর করতে ব্যবহৃত হয় সুবিধা এবং সীমাবদ্ধতা সুবিধা আর. এন. পি-এম. এ. পি বাইন্ডিং সাইটের ঘনত্ব এবং মিথস্ক্রিয়া প্রোটিনের পূর্ববর্তী জ্ঞান থেকে স্বাধীন আন্তঃসংযোগের মাধ্যমে কার্যকরীভাবে গুরুত্বপূর্ণ আর. এন. এ-প্রোটিন বাঁধাই নেটওয়ার্কগুলি প্রকাশ করতে সহায়তা করতে পারে। বিশ্লেষণের নিরপেক্ষ প্রকৃতির কারণে, আরএনপি-এমএপি প্রজাতির মধ্যে সংরক্ষিত আরএনএ-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া সনাক্ত করতে সক্ষম। আরএনপি-এমএপি বড় নন-কোডিং আরএনএ বা এমনকি ভাইরাল আরএনএ-তে কার্যকরীভাবে গুরুত্বপূর্ণ উপাদানগুলির বৈশিষ্ট্যকরণকে সহজতর করতে সক্ষম। সীমাবদ্ধতা একটি স্বতন্ত্র কৌশল হিসাবে, আরএনপি-এমএপি প্রোটিন-আরএনএ বাঁধাই প্রক্রিয়া বা প্রোটিন পরিচয় নির্ধারণ করতে ব্যবহার করা যায় না। এটি করার জন্য, আরএনপি-এমএপি অবশ্যই অন্যান্য কৌশল যেমন সিএলআইপি এবং মাস স্পেকট্রোমেট্রি ব্যবহার করতে হবে। আরএনপি-এমএপি বিশ্লেষণের জন্য অত্যন্ত উচ্চ পঠন-গভীরতার প্রয়োজন। আরএনপি-এমএপি সাইটগুলি সনাক্ত করতে, 1000x সিকোয়েন্সিং কভারেজ প্রয়োজন, যেখানে আরএনপি-এমএপি পারস্পরিক সম্পর্ক সাইটগুলির জন্য 10,000x সিকোয়েন্সিং কভারেজ প্রয়োজন। দূরবর্তী (> 500 নিউক্লিওটাইড) আরএনপি-এমএপি সাইটগুলির মধ্যে আরএনপি-এমএপি পারস্পরিক সম্পর্ক চিহ্নিত করার ক্ষমতার উপর গুরুতর সীমাবদ্ধতা রয়েছে। এটি এমএপি বিপরীত প্রতিলিপি প্রক্রিয়া (500-600 নিউক্লিওটাইড) এবং সিকোয়েন্সিং যন্ত্র ক্লাস্টারিং (<1,000 নিউক্লিওটাইড)-এর সীমাবদ্ধতার কারণে হয়। রেফারেন্স জেনেটিক্স কৌশল আরএনএ