Paired-end tag
পেয়ার্ড-এন্ড ট্যাগগুলি (পিইটি) (কখনও কখনও "পেয়ার্ড-এন্ড ডিট্যাগগুলি", বা কেবল "ডিট্যাগগুলি") একটি ডিএনএ খণ্ডের 5 'এবং 3' প্রান্তের সংক্ষিপ্ত ক্রম যা যথেষ্ট অনন্য যে তারা (তাত্ত্বিকভাবে) জিনোমে কেবল একবার একসাথে বিদ্যমান, তাই তাদের মধ্যে ডিএনএর ক্রমটি অনুসন্ধানের সময় (যদি পূর্ণ-জিনোম সিকোয়েন্স ডেটা উপলব্ধ থাকে) বা আরও সিকোয়েন্সিংয়ের পরে উপলব্ধ করে (যেহেতু ট্যাগ সাইটগুলি প্রাইমার অ্যানিলিং সাইট হিসাবে কাজ করার জন্য যথেষ্ট অনন্য)। পেয়ার্ড-এন্ড ট্যাগগুলি (পিইটি) পিইটি লাইব্রেরিতে বিদ্যমান এবং মধ্যবর্তী ডিএনএ অনুপস্থিত থাকে, অর্থাৎ, একটি পিইটি একটি সংক্ষিপ্ত 5 'লিঙ্কার সিকোয়েন্স, একটি সংক্ষিপ্ত 5' সিকোয়েন্স ট্যাগ, একটি সংক্ষিপ্ত 3 'সিকোয়েন্স ট্যাগ এবং একটি সংক্ষিপ্ত 3' লিঙ্কার সিকোয়েন্স নিয়ে গঠিত জিনোমিক বা সিডিএনএ-র একটি বৃহত্তর অংশকে "প্রতিনিধিত্ব করে"। এটি ধারণাগতভাবে দেখানো হয়েছিল যে 13টি বেস জোড়া ট্যাগগুলিকে অনন্যভাবে ম্যাপ করার জন্য যথেষ্ট। যাইহোক, অনন্যভাবে ম্যাপিং রিডের জন্য দীর্ঘ ক্রমগুলি আরও ব্যবহারিক। পিইটি তৈরি করতে ব্যবহৃত এন্ডোনিউক্লিয়াসগুলি (নীচে আলোচনা করা হয়েছে) দীর্ঘ ট্যাগ (18/20 বেস জোড়া এবং 25/27 বেস জোড়া) দেয় তবে 50-100 বেস জোড়ার ক্রমগুলি ম্যাপিং এবং ব্যয় দক্ষতা উভয়ের জন্যই সর্বোত্তম হবে। অনেক ডিএনএ টুকরো থেকে পিইটি বের করার পরে, দক্ষ সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য এগুলি একসাথে সংযুক্ত (সংযুক্ত) করা হয়। গড়ে, 20-30 ট্যাগগুলি স্যাঙ্গার পদ্ধতির সাথে ক্রমবদ্ধ করা যেতে পারে, যার পড়ার দৈর্ঘ্য দীর্ঘ। যেহেতু ট্যাগ সিকোয়েন্সগুলি সংক্ষিপ্ত, তাই পৃথক পিইটিগুলি পরবর্তী প্রজন্মের সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য উপযুক্ত যার সংক্ষিপ্ত পঠন দৈর্ঘ্য এবং উচ্চতর থ্রুপুট রয়েছে। পিইটি সিকোয়েন্সিংয়ের প্রধান সুবিধাগুলি হল শুধুমাত্র ছোট টুকরোগুলি সিকোয়েন্স করে, জিনোমে কাঠামোগত রূপগুলি সনাক্ত করে এবং একক ট্যাগের তুলনায় জিনোমের সাথে সারিবদ্ধ করার সময় নির্দিষ্টতা বৃদ্ধি করে, যার মধ্যে ডিএনএ খণ্ডের শুধুমাত্র একটি প্রান্ত জড়িত। পিইটি গ্রন্থাগার নির্মাণ সাধারণত দুটি সাধারণ পদ্ধতিতে প্রস্তুত করা হয়ঃ ক্লোনিং ভিত্তিক এবং ক্লোনিং-মুক্ত ভিত্তিক। ক্লোনিং ভিত্তিক খণ্ডিত জিনোমিক ডিএনএ বা আগ্রহের পরিপূরক ডিএনএ (সিডিএনএ) প্লাজমিড ভেক্টরগুলিতে ক্লোন করা হয়। ক্লোনিং সাইটগুলি অ্যাডাপ্টার সিকোয়েন্সের সাথে পার্শ্বযুক্ত যা এন্ডোনিউক্লিয়াসের জন্য সীমাবদ্ধতা সাইট ধারণ করে (নীচে আলোচনা করা হয়েছে)। সন্নিবেশগুলি প্লাজমিড ভেক্টরের সাথে সংযুক্ত করা হয় এবং পৃথক ভেক্টরগুলি তারপর ই. কোলাইতে রূপান্তরিত হয় যা পিইটি লাইব্রেরি তৈরি করে। প্লাজমিডকে শুদ্ধ করে এবং ভেক্টরের প্রান্তে দুটি ছোট ক্রম রেখে নির্দিষ্ট এন্ডোনিউক্লিজ দিয়ে হজম করে পিইটি সিকোয়েন্স পাওয়া যায়। আন্তঃআণবিক (পাতলা) অবস্থার অধীনে, ভেক্টরগুলি পুনরায় বৃত্তাকার এবং সংযুক্ত করা হয়, যা ভেক্টরের মধ্যে শুধুমাত্র ডিট্যাগগুলি রেখে যায়। ক্লোনটির অনন্য ক্রমগুলি এখন একসঙ্গে জোড়া দেওয়া হয়েছে। পরবর্তী প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং কৌশলের উপর নির্ভর করে, পিইটি সিকোয়েন্সগুলি একবচন, ডাইমারাইজড বা দীর্ঘ শৃঙ্খলে সংযুক্ত করা যেতে পারে। ক্লোনিং-মুক্ত ভিত্তিক ক্লোনিং-এর পরিবর্তে, এন্ডোনিউক্লিজ সিকোয়েন্স ধারণকারী অ্যাডাপ্টারগুলি খণ্ডিত জিনোমিক ডিএনএ বা সিডিএনএ-র প্রান্তে সংযুক্ত করা হয়। অণুগুলি তখন স্ব-বৃত্তাকার হয় এবং এন্ডোনিউক্লিজ দিয়ে হজম হয়, পিইটি মুক্ত করে। সিকোয়েন্সিংয়ের আগে, এই পিইটিগুলি অ্যাডাপ্টারের সাথে সংযুক্ত করা হয় যার সাথে পিসিআর প্রাইমারগুলি পরিবর্ধন করার জন্য অ্যানিল করে। গ্রন্থাগারের ক্লোনিং ভিত্তিক নির্মাণের সুবিধা হল এটি ভবিষ্যতের ব্যবহারের জন্য টুকরোগুলি বা সিডিএনএ অক্ষত রাখে। তবে, নির্মাণ প্রক্রিয়াটি ক্লোনিং-মুক্ত পদ্ধতির তুলনায় অনেক দীর্ঘ। গ্রন্থাগার নির্মাণের বৈচিত্র্যগুলি পরবর্তী প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং সংস্থাগুলি তাদের নিজ নিজ প্রযুক্তির সাথে সামঞ্জস্য রেখে তৈরি করেছে। এন্ডোনিউক্লিয়াস অন্যান্য এন্ডোনিউক্লিয়াসের বিপরীতে, এম. এম. ই. আই (টাইপ আই. আই. এস) এবং ইকো. পি. 15. আই (টাইপ 3) সীমাবদ্ধতা এন্ডোনিউক্লিয়াসগুলি তাদের লক্ষ্য বাঁধাই সাইটগুলির ডাউনস্ট্রিম কেটে দেয়। এম. এম. ই. আই <আই. ডি1> বেস জোড়া ডাউনস্ট্রিম কেটে দেয় এবং ইকোপি15আই <আই. ডি2> বেস জোড়া ডাউনস্ট্রিম কেটে দেয়। যেহেতু এই সীমাবদ্ধতা এনজাইমগুলি অ্যাডাপ্টারে অবস্থিত তাদের লক্ষ্য ক্রমগুলিতে আবদ্ধ হয়, তারা ভেক্টরগুলিকে কেটে ছেড়ে দেয় যা তাদের সাথে সংযুক্ত খণ্ড বা সিডিএনএ-এর সংক্ষিপ্ত ক্রম ধারণ করে, পিইটি তৈরি করে। পিইটি অ্যাপ্লিকেশন ডিএনএ-পিইটিঃ যেহেতু পিইটি ট্যাগগুলির মধ্যে সংযোগের প্রতিনিধিত্ব করে, জিনোম রি-সিকোয়েন্সিংয়ে পিইটি ব্যবহারের একক রিডের ব্যবহারের তুলনায় সুবিধা রয়েছে। এই অ্যাপ্লিকেশনটিকে পেয়ারওয়াইজ এন্ড সিকোয়েন্সিং বলা হয়, যা কথ্য ভাষায় ডাবল-ব্যারেল শটগান সিকোয়েন্সিং নামে পরিচিত। জিনোমের একটি একক স্থানে এই জুটির অর্ধেককে অনন্যভাবে নোঙর করা অন্য অর্ধেকের ম্যাপিংয়ের অনুমতি দেয় যা অস্পষ্ট। অস্পষ্ট পাঠগুলি হল সেগুলি যা একাধিক স্থানে মানচিত্র তৈরি করে। এই বর্ধিত দক্ষতা সিকোয়েন্সিংয়ের খরচ হ্রাস করে কারণ এই দ্ব্যর্থহীন সিকোয়েন্সগুলি বা রিডগুলি সাধারণত বাতিল করা হয়। পিইটি সিকোয়েন্সের সংযোগ কাঠামোগত বৈচিত্র্য সনাক্ত করার অনুমতি দেয়ঃ সন্নিবেশ, মুছে ফেলা, অনুলিপি, বিপরীতমুখী, স্থানান্তর। পিইটি গ্রন্থাগার নির্মাণের সময়, টুকরোগুলি একটি নির্দিষ্ট আকারের হতে পারে। ম্যাপিংয়ের পরে, পিইটি সিকোয়েন্সগুলি একে অপরের থেকে ধারাবাহিকভাবে একটি নির্দিষ্ট দূরত্ব দূরে থাকবে বলে আশা করা হচ্ছে। এই দূরত্ব থেকে একটি অসঙ্গতি পিইটি সিকোয়েন্সের মধ্যে একটি কাঠামোগত বৈচিত্র্য নির্দেশ করে। উদাহরণস্বরূপ (ডানদিকে চিত্র): সিকোয়েন্সড জিনোমের একটি মুছে ফেলার ফলে সেই মানচিত্রটি রেফারেন্স জিনোমে প্রত্যাশার চেয়ে আরও দূরে পড়বে কারণ রেফারেন্স জিনোমে ডিএনএর একটি অংশ থাকবে যা সিকোয়েন্সড জিনোমে উপস্থিত থাকবে না। চিপ-পিইটিঃ ক্রোমাটিন ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন (চিপ) এবং পিইটি-র সম্মিলিত ব্যবহার আগ্রহের প্রোটিন দ্বারা আবদ্ধ ডিএনএর অঞ্চলগুলি সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়। উৎপাদিত পাঠের অস্পষ্টতা হ্রাস করে একক পাঠ ক্রমের তুলনায় চিপ-পিইটি-র সুবিধা রয়েছে। চিপ সংকরণের (চিপ-চিপ) তুলনায় সুবিধা হল যে সংকরণ টাইলিং অ্যারেগুলির পরিসংখ্যানগত সংবেদনশীলতা নেই যা ক্রম পাঠে থাকে। তবে, চিপ-পিইটি, চিপ-সেক এবং চিপ-চিপ সবই অত্যন্ত সফল হয়েছে। চিয়া-পিইটিঃ ক্রোমাটিন মিথস্ক্রিয়া বিশ্লেষণে পিইটি সিকোয়েন্সিংয়ের প্রয়োগ। এটি প্রোটিন উপাদান দ্বারা আবদ্ধ ডিএনএ উপাদানগুলির মধ্যে নতুন দীর্ঘ-পরিসীমা মিথস্ক্রিয়া খুঁজে বের করার জন্য একটি জিনোম-ব্যাপী কৌশল। ইস্ট্রোজেন-চিকিত্সা করা মানব স্তন অ্যাডেনোকার্সিনোমা কোষে ইস্ট্রোজেন রিসেপ্টর α (ER-α) দ্বারা আবদ্ধ ক্রোমাটিনের মধ্যে মিথস্ক্রিয়ার একটি মানচিত্র তৈরি করার জন্য ফুলউড এবং অন্যান্যরা (2009) প্রথম চিয়া-পিইটি তৈরি করেছিলেন। চিয়া-পিইটি হল মিথস্ক্রিয়া এবং উচ্চ-ক্রমের ক্রোমাটিন কাঠামো বিশ্লেষণ করার একটি নিরপেক্ষ উপায় কারণ এটি অজানা ডিএনএ উপাদানগুলির মধ্যে মিথস্ক্রিয়া সনাক্ত করতে পারে। বিপরীতে, জিনোমের একটি নির্দিষ্ট লক্ষ্য অঞ্চলের সাথে জড়িত মিথস্ক্রিয়া সনাক্ত করতে 3সি এবং 4সি পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়। চিয়া-পিইটি আরএনএ-পিইটি-র মাধ্যমে ফিউশন জিন খুঁজে বের করার অনুরূপ যে জোড়া ট্যাগগুলি জিনোমের বিভিন্ন অঞ্চলে মানচিত্র তৈরি করে। যাইহোক, চিয়া-পিইটি-তে আরএনএ-পিইটি-র মতো দুটি জিনোমিক অঞ্চলের মধ্যে প্রাকৃতিকভাবে ঘটে যাওয়া ফিউশনের পরিবর্তে বিভিন্ন জিনোমিক অঞ্চলে অবস্থিত বিভিন্ন ডিএনএ টুকরোগুলির মধ্যে কৃত্রিম বন্ধন জড়িত থাকে। আরএনএ-পিইটিঃ এই অ্যাপ্লিকেশনটি ট্রান্সক্রিপ্টোম অধ্যয়নের জন্য ব্যবহৃত হয়ঃ প্রতিলিপি, জিন কাঠামো এবং জিন অভিব্যক্তি। পিইটি লাইব্রেরিটি সম্পূর্ণ দৈর্ঘ্যের সিডিএনএ ব্যবহার করে তৈরি করা হয়, তাই ডিট্যাগগুলি পৃথক প্রতিলিপির 5 'ক্যাপড এবং 3' পলিএ লেজ স্বাক্ষরকে উপস্থাপন করে। অতএব, আরএনএ-পিইটি ট্রান্সক্রিপশন ইউনিটের সীমানা চিহ্নিত করার জন্য বিশেষভাবে কার্যকর। এটি বিকল্প ট্রান্সক্রিপশন স্টার্ট সাইট এবং জিনের পলিঅ্যাডেনাইলেশন সাইটগুলি সনাক্ত করতে সহায়তা করবে। আরএনএ-পিইটি ফিউশন জিন এবং ট্রান্স-স্প্লাইসিং সনাক্ত করতেও ব্যবহার করা যেতে পারে, তবে তাদের মধ্যে পার্থক্য করার জন্য আরও পরীক্ষা-নিরীক্ষা প্রয়োজন। প্রতিলিপির সীমানা খুঁজে বের করার অন্যান্য পদ্ধতির মধ্যে রয়েছে সিঙ্গল-ট্যাগ কৌশল সিএজিই, এসএজিই এবং সবচেয়ে সাম্প্রতিক সুপারসেজ, সিএজিই এবং 5 'এসএজিই ট্রান্সক্রিপশন স্টার্ট সাইটগুলিকে সংজ্ঞায়িত করে এবং 3' এসএজিই পলিঅ্যাডেনাইলেশন সাইটগুলিকে সংজ্ঞায়িত করে। এই পদ্ধতিগুলির তুলনায় পিইটি সিকোয়েন্সিংয়ের সুবিধাগুলি হল যে পিইটি প্রতিলিপির উভয় প্রান্ত চিহ্নিত করে এবং একই সময়ে, জিনোমে ফিরে ম্যাপ করার সময় আরও নির্দিষ্টতা প্রদান করে। সি. ডি. এন. এ-গুলির ক্রমবিন্যাস খুব বিস্তারিতভাবে প্রতিলিপির কাঠামো প্রকাশ করতে পারে, তবে এই পদ্ধতিটি আর. এন. এ-পি. ই. টি ক্রমবিন্যাসের তুলনায় অনেক বেশি ব্যয়বহুল, বিশেষত পুরো প্রতিলিপিটি চিহ্নিত করার জন্য। আরএনএ-পিইটি-র প্রধান সীমাবদ্ধতা হল প্রতিলিপির অভ্যন্তরীণ এক্সনের সংগঠন সম্পর্কিত তথ্যের অভাব। অতএব, আরএনএ-পিইটি বিকল্প স্প্লাইসিং সনাক্ত করার জন্য উপযুক্ত নয়। উপরন্তু, যদি ক্লোনিং পদ্ধতি ব্যবহার করা হয় তবে পিইটি তৈরি করার আগে সিডিএনএ লাইব্রেরি তৈরি করুন, সিডিএনএগুলি যা ক্লোন করা কঠিন (দীর্ঘ প্রতিলিপির ফলে) কম কভারেজ থাকবে। একইভাবে, নিম্ন অভিব্যক্তি স্তর সহ প্রতিলিপি (বা প্রতিলিপি আইসোফর্ম) সম্ভবত কম প্রতিনিধিত্ব করা হবে। তথ্যসূত্র আণবিক জীববিজ্ঞান পরীক্ষাগার কৌশল আণবিক জীববিজ্ঞান কৌশল ডিএনএ সিকোয়েন্সিং