Polony sequencing
পোলনি সিকোয়েন্সিং একটি সস্তা কিন্তু অত্যন্ত সঠিক মাল্টিপ্লেক্স সিকোয়েন্সিং কৌশল যা সমান্তরালে লক্ষ লক্ষ অচল ডিএনএ সিকোয়েন্স "পড়তে" ব্যবহার করা যেতে পারে। এই কৌশলটি প্রথম হার্ভার্ড মেডিকেল স্কুলের ডাঃ জর্জ চার্চের দল তৈরি করেছিল। অন্যান্য সিকোয়েন্সিং কৌশলের বিপরীতে, পোলনি সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তি অবাধে ডাউনলোডযোগ্য, ওপেন সোর্স সফ্টওয়্যার এবং প্রোটোকল সহ একটি উন্মুক্ত প্ল্যাটফর্ম। এছাড়াও, এই কৌশলের হার্ডওয়্যারটি সহজেই একটি সাধারণভাবে উপলব্ধ এপিফ্লোরেসেন্স মাইক্রোস্কোপি এবং একটি কম্পিউটার-নিয়ন্ত্রিত ফ্লোসেল/ফ্লুইডিক্স সিস্টেমের সাথে সেট আপ করা যেতে পারে। পোলনি সিকোয়েন্সিং সাধারণত পেয়ার্ড-এন্ড ট্যাগ লাইব্রেরিতে সঞ্চালিত হয় যে ডিএনএ টেমপ্লেটের প্রতিটি অণু 135 বিপি দৈর্ঘ্যের এবং দুটি 17-18 বিপি পেয়ার্ড জিনোমিক ট্যাগ পৃথক এবং সাধারণ সিকোয়েন্স দ্বারা পার্শ্বযুক্ত। এই কৌশলটির বর্তমান পঠন দৈর্ঘ্য প্রতি এম্পলিকনে 26টি বেস এবং প্রতি ট্যাগে 13টি বেস, প্রতিটি ট্যাগে 4-5টি বেসের ব্যবধান রেখে যায়। ওয়ার্কফ্লো পোলনি সিকোয়েন্সিংয়ের প্রটোকলকে তিনটি প্রধান অংশে ভাগ করা যেতে পারে, যা হল পেয়ারড এন্ড-ট্যাগ লাইব্রেরি নির্মাণ, টেমপ্লেট পরিবর্ধন এবং ডিএনএ সিকোয়েন্সিং। জোড়া লাগানো শেষ-ট্যাগ গ্রন্থাগার নির্মাণ এই প্রটোকলটি এলোমেলোভাবে পরীক্ষিত জিনোমিক ডিএনএকে একটি শক্ত আকারের বিতরণে কাটা দিয়ে শুরু হয়। ছেঁড়া ডি. এন. এ অণুগুলি তারপর শেষ মেরামত এবং এ-লেজের চিকিৎসার জন্য ব্যবহার করা হয়। শেষ মেরামতের চিকিৎসা ডি. এন. এ-র যে কোনও ক্ষতিগ্রস্ত বা অসামঞ্জস্যপূর্ণ প্রসারিত প্রান্তকে 5 '-ফসফোরিলেটেড এবং ব্লান্ট-এন্ড ডি. এন. এ-তে রূপান্তরিত করে, যা তাৎক্ষণিক ব্লান্ট-এন্ড লাইগেশন সক্ষম করে, যখন এ-টেলিং চিকিত্সা শিয়ারড ডি. এন. এ-র 3' প্রান্তে একটি এ যোগ করে। 1 কেবি দৈর্ঘ্যের ডিএনএ অণুগুলি 6 শতাংশ টিবিই পেজ জেলের উপর লোড করে নির্বাচন করা হয়। পরবর্তী ধাপে, ডিএনএ অণুগুলিকে টি-লেজ 30 বিপি দীর্ঘ সিন্থেটিক অলিগোনিউক্লিওটাইডস (টি30) দিয়ে বৃত্তাকার করা হয়, যার মধ্যে দুটি বাহ্যিক-মুখী এম. এম. ই. আই স্বীকৃতি সাইট রয়েছে এবং ফলস্বরূপ বৃত্তাকার ডি. এন. এ ঘূর্ণায়মান বৃত্তের প্রতিলিপির মধ্য দিয়ে যায়। বর্ধিত বৃত্তাকার ডি. এন. এ অণুগুলি তারপর এম. এম. ই. আই (টাইপ II-এর সীমাবদ্ধতা এন্ডোনিউক্লিজ) দিয়ে পচানো হয় যা তার শনাক্তকরণ স্থান থেকে একটি দূরত্বে কেটে যায়, <আই. ডি1> বিপি ট্যাগ (দৈর্ঘ্যে ≈ 70 বিপি) দ্বারা পার্শ্বযুক্ত টি30 খণ্ডটি মুক্ত করে। পেয়ার্ড-ট্যাগ অণুগুলিকে ইপিসিআর (ইমালসন পিসিআর) প্রাইমার অলিগোনিউক্লিওটাইডস (এফডিভি2 এবং আরডিভি2) তাদের উভয় প্রান্তে আবদ্ধ করার আগে শেষ-মেরামত করা প্রয়োজন। ফলস্বরূপ 135 বিপি গ্রন্থাগার অণুগুলি আকার-নির্বাচিত এবং নিক অনুবাদ করা হয়। সবশেষে, লাইব্রেরি উপাদানের পরিমাণ বাড়াতে এবং একক ধাপে বহিরাগত বন্ধন পণ্যগুলি নির্মূল করতে পিসিআর-এর সাথে 135 বিপি পেয়ারড এন্ড-ট্যাগ লাইব্রেরি অণুগুলিকে প্রশস্ত করুন। ফলস্বরূপ ডিএনএ টেমপ্লেটে একটি 44 বিপি এফডিভি সিকোয়েন্স, একটি 17-18 বিপি প্রক্সিমাল ট্যাগ, টি30 সিকোয়েন্স, একটি 17-18 বিপি ডিস্টাল ট্যাগ এবং একটি 25 বিপি আরডিভি সিকোয়েন্স রয়েছে। টেমপ্লেট পরিবর্ধন ইমালসন পিসিআর মোনো-আকারের, প্যারাম্যাগনেটিক স্ট্রেপ্টাভিডিন-লেপা পুঁতিগুলি ডুয়াল বায়োটিন ফরওয়ার্ড প্রাইমারের সাথে আগে থেকে লোড করা থাকে। স্ট্রেপ্টাভিডিনের বায়োটিন-এর প্রতি খুব দৃঢ় অনুরাগ রয়েছে, এইভাবে সামনের প্রাইমারটি পুঁতির পৃষ্ঠে দৃঢ়ভাবে আবদ্ধ হবে। এরপরে, প্রি-লোডেড পুঁতি, পিসিআর মিশ্রণ, ফরোয়ার্ড এবং রিভার্স প্রাইমার এবং পেয়ারড এন্ড-ট্যাগ লাইব্রেরি দিয়ে একটি জলীয় পর্যায় প্রস্তুত করা হয়। এটি মিশ্রিত করা হয় এবং ইমালসন তৈরি করতে একটি তেল পর্যায়ের সাথে ভোর্টেক্স করা হয়। আদর্শভাবে, তেলের ইমালশনে জলের প্রতিটি ফোঁটায় একটি পুঁতি এবং একটি টেমপ্লেট ডিএনএ অণু থাকে, যা পিসিআর সম্পাদন করে মিলিলিটার-স্কেল ভলিউমের মধ্যে লক্ষ লক্ষ অ-মিথস্ক্রিয়া বিস্তারের অনুমতি দেয়। ইমালসন ব্রেকিং পরিবর্ধন করার পরে, আইসোপ্রোপ্যানল এবং ডিটারজেন্ট বাফার (10 মিলিমিটার ট্রিস পিএইচ 7.5,1 মিলিমিটার ইডিটিএ পিএইচ 8.0,100 মিলিমিটার এনসিএইচ, 1 শতাংশ (ভি/ভি) ট্রাইটন এক্স-100,1 শতাংশ (ডাব্লু/ভি) এসডিএস) ব্যবহার করে পূর্ববর্তী ধাপ থেকে ইমালসন ভাঙ্গা হয়, তারপরে একাধিক ভোর্টেক্সিং, সেন্ট্রিফিউজিং এবং চৌম্বকীয় বিচ্ছেদ হয়। ফলস্বরূপ সমাধানটি হল খালি, ক্লোনাল এবং নন-ক্লোনাল পুঁতির একটি সাসপেনশন, যা ইমালশন ফোঁটাগুলি থেকে উদ্ভূত হয় যার প্রাথমিকভাবে যথাক্রমে শূন্য, এক বা একাধিক ডিএনএ টেমপ্লেট অণু থাকে। বর্ধিত পুঁতিটি পরবর্তী ধাপে সমৃদ্ধ করা যেতে পারে। পুঁতি সমৃদ্ধকরণ বর্ধিত পুঁতির সমৃদ্ধকরণ একটি বৃহত্তর, কম ঘনত্বের, অ-চৌম্বকীয় পলিস্টাইরিন পুঁতির সংকরকরণের মাধ্যমে অর্জন করা হয় যা একটি বায়োটিনিলেটেড ক্যাপচার অলিগোনিউক্লিওটাইডস (ডিএনএ সিকোয়েন্স যা ইপিআর পরিবর্ধন সিকোয়েন্সের পরিপূরক) দিয়ে প্রি-লোড করা হয়। এরপরে মিশ্রণটি সেন্ট্রিফিউজ করা হয় যাতে বিবর্ধিত এবং ক্যাপচার পুঁতির জটিল অংশটি অপ্রচলিত পুঁতির থেকে আলাদা করা যায়। পরিবর্ধিত, ক্যাপচার বিড কমপ্লেক্সের ঘনত্ব কম এবং এইভাবে সুপারনেট্যান্টের মধ্যে থাকবে যখন অপ্রচলিত পুঁতিগুলি একটি পেলেট গঠন করে। সুপারনেট্যান্টটি পুনরুদ্ধার করা হয় এবং NaOH দিয়ে চিকিত্সা করা হয় যা জটিলটিকে ভেঙে দেবে। চৌম্বকীয় বিভাজিত পুঁতিগুলি চৌম্বকীয় পৃথকীকরণের মাধ্যমে অ-চৌম্বকীয় ক্যাপচার পুঁতি থেকে পৃথক করা হয়। এই সমৃদ্ধকরণ প্রটোকলটি পাঁচগুণ বর্ধিত পুঁতি সমৃদ্ধ করতে সক্ষম। বিড ক্যাপিং বিড ক্যাপিংয়ের উদ্দেশ্য হল একটি "ক্যাপিং" অলিগোনিউক্লিওটাইড সংযুক্ত করা যা অপ্রচলিত সামনের ই. পি. সি. আর প্রাইমার এবং টেমপ্লেট ডি. এন. এ-র আর. ডি. ভি সেগমেন্ট উভয়েরই 3 'প্রান্তে থাকে। যে ক্যাপটি ব্যবহার করা হচ্ছে তা একটি অ্যামিনো গ্রুপ যা ফ্লুরোসেন্ট প্রোবগুলিকে এই প্রান্তগুলিতে এবং একই সাথে সংযুক্ত হতে বাধা দেয়, যা অ্যামিনোসিলেনেটেড ফ্লো সেল কভারস্লিপের সাথে টেমপ্লেট ডিএনএর পরবর্তী সংযোগে সহায়তা করে। কভারস্লিপ অ্যারেয়িং প্রথমে, কভারস্লিপগুলি ধুয়ে ফেলা হয় এবং অ্যামিনোসিলেন-ট্রিটমেন্ট করা হয়, যা পরবর্তী সময়ে টেম্প্লেট ডি. এন. এ-র সমযোজী সংযোগকে সক্ষম করে এবং যে কোনও ফ্লুরোসেন্ট দূষণ দূর করে। বর্ধিত, সমৃদ্ধ পুঁতিগুলি অ্যাক্রিলামাইডের সাথে মিশ্রিত করা হয় এবং একটি টেফলন-মাস্কযুক্ত মাইক্রোস্কোপ স্লাইড দ্বারা গঠিত একটি অগভীর ছাঁচে ঢেলে দেওয়া হয়। অবিলম্বে, অ্যামিনোসিলেন-ট্রিটেড কভারস্লিপটি অ্যাক্রিলামাইড জেলের উপরে রাখুন এবং 45 মিনিটের জন্য পলিমারাইজ হতে দিন। এরপরে, স্লাইড/কভারস্লিপ স্ট্যাকটি উল্টে দিন এবং জেল থেকে মাইক্রোস্কোপ স্লাইডটি সরিয়ে ফেলুন। সাইলেন-ট্রিটেড কভারস্লিপগুলি জেলের সাথে সমযোজীভাবে আবদ্ধ হবে এবং মাইক্রোস্কোপ স্লাইডের পৃষ্ঠের টেফলন অ্যাক্রিলামাইড জেল থেকে স্লাইডকে আরও ভালভাবে অপসারণ করতে সক্ষম করবে। কভারস্লিপগুলি তখন ফ্লো সেল বডির সাথে আবদ্ধ হয় এবং যে কোনও সংযুক্ত নয় এমন পুঁতি অপসারণ করা হবে। ডি. এন. এ সিকোয়েন্সিং পোলনি সিকোয়েন্সিংয়ের জৈব রসায়ন মূলত লিগাজ এবং পলিমারেজগুলির বৈষম্যমূলক ক্ষমতার উপর নির্ভর করে। প্রথমত, অ্যাঙ্কর প্রাইমারের একটি সিরিজ কোষের মধ্য দিয়ে প্রবাহিত হয় এবং 17-18 বিপি প্রক্সিমাল বা ডিস্টাল জিনোমিক ডিএনএ ট্যাগের অবিলম্বে 3 'বা 5' প্রান্তে সিন্থেটিক অলিগোনিউক্লিয়টাইড সিকোয়েন্সগুলিতে সংকরিত হয়। এরপরে, ডিজেনেরেট নন-অ্যামারদের জনসংখ্যার প্রতি অ্যাঙ্কর প্রাইমারের একটি এনজাইম্যাটিক লাইগেশন প্রতিক্রিয়া সঞ্চালিত হয় যা ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক দ্বারা চিহ্নিত করা হয়। ভিন্নভাবে লেবেলযুক্ত নন-অ্যামারঃ 5 'সাই5-এন. এন. এন. এন. এন. এন. এন. টি 5' সাই3-এন. এন. এন. এন. এন. এন. এন. এন. 5 'টেক্সাস রেড-এন. এন. এন. এন. এন. এন. এন. সি 5' 6 এফ. এ. এম-এন. এন. এন. এন. এন. এন. এন. জি ফ্লুরোফোর-ট্যাগযুক্ত নন-অ্যামারগুলি ডিজেনারেট প্রাইমারের মতো কৌশল অনুসারে ট্যাগ সিকোয়েন্সগুলিতে ডিফারেনশিয়াল সাফল্যের সাথে অ্যানিল, তবে পলিমারেসে জমা দেওয়ার পরিবর্তে, নন-অ্যামারগুলি নির্বাচিতভাবে সংলগ্ন ডি. এন. এ-অ্যাঙ্কর প্রাইমারের সাথে সংযুক্ত করা হয়। ফ্লুরোফোর অণুর স্থিরকরণ একটি ফ্লুরোসেন্ট সংকেত প্রদান করে যা নির্দেশ করে যে জিনোমিক ডিএনএ ট্যাগে অনুসন্ধানের অবস্থানে একটি এ, সি, জি বা টি আছে কিনা। চার রঙের ইমেজিংয়ের পরে, অ্যাঙ্কর প্রাইমার/নন-অ্যামার কমপ্লেক্সগুলি ছিঁড়ে ফেলা হয় এবং অ্যাঙ্কর প্রাইমার প্রতিস্থাপন করে একটি নতুন চক্র শুরু হয়। ফ্লুরোসেন্টলি ট্যাগ করা নন-অ্যামারগুলির একটি নতুন মিশ্রণ চালু করা হয়েছে, যার জন্য অনুসন্ধানের অবস্থানটি জিনোমিক ডিএনএ ট্যাগে আরও একটি বেস স্থানান্তরিত করা হয়। 5 'সাই5-এন. এন. এন. এন. এন. এন. টি. এন. 5' সাই3-এন. এন. এন. এন. এন. এন. এন. 5 'টেক্সাসরেড-এন. এন. এন. এন. এন. এন. এন. 5' 6 এফ. এ. এম-এন. এন. এন. এন. এন. এন. এন. 5 'থেকে 3' দিকে সাতটি ঘাঁটি এবং 3 'প্রান্ত থেকে ছয়টি ঘাঁটি এই পদ্ধতিতে অনুসন্ধান করা যেতে পারে। চূড়ান্ত ফলাফল হল প্রতিটি ট্যাগের মাঝখানে 4-বেস থেকে 5-বেস ফাঁক সহ প্রতি দৌড়ে 26 টি বেস (জোড়া ট্যাগের প্রতিটি থেকে 13 টি বেস) পড়ার দৈর্ঘ্য। বিশ্লেষণ এবং সফ্টওয়্যার পোলনি সিকোয়েন্সিং প্রতি দৌড়ে লক্ষ লক্ষ 26 টি রিড তৈরি করে এবং এই তথ্যকে স্বাভাবিক করা এবং ক্রমে রূপান্তরিত করা প্রয়োজন। চার্চ ল্যাব দ্বারা তৈরি সফ্টওয়্যার দ্বারা এগুলি করা যেতে পারে। সমস্ত সফ্টওয়্যার বিনামূল্যে এবং ওয়েবসাইট থেকে ডাউনলোড করা যেতে পারে। যন্ত্র এই কৌশলে ব্যবহৃত সিকোয়েন্সিং যন্ত্রটি সাধারণত উপলব্ধ ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ এবং একটি কম্পিউটার নিয়ন্ত্রিত ফ্লোসেল দ্বারা স্থাপন করা যেতে পারে। 2005 সালে প্রয়োজনীয় যন্ত্রগুলির দাম ছিল প্রায় 130,000 মার্কিন ডলার। একটি ডেডিকেটেড পোলনি সিকোয়েন্সিং মেশিন, পলোনেটর, 2009 সালে তৈরি করা হয়েছিল এবং ডোভার দ্বারা 170,000 মার্কিন ডলারে বিক্রি হয়েছিল। এটি ওপেন সোর্স সফ্টওয়্যার, বিকারক এবং প্রোটোকল বৈশিষ্ট্যযুক্ত এবং ব্যক্তিগত জিনোম প্রকল্পে ব্যবহারের উদ্দেশ্যে করা হয়েছিল। শক্তি এবং দুর্বলতা পোলনি সিকোয়েন্সিং একটি সাধারণভাবে উপলব্ধ, সস্তা যন্ত্রের উপর ভিত্তি করে ডিএনএ সিকোয়েন্সিংয়ের একটি উচ্চ থ্রুপুট এবং উচ্চ সর্বসম্মত নির্ভুলতার অনুমতি দেয়। এছাড়াও, এটি একটি খুব নমনীয় কৌশল যা বিএসি (ব্যাকটেরিয়াল কৃত্রিম ক্রোমোজোম) এবং ব্যাকটেরিয়াল জিনোম সিকোয়েন্সিংয়ের পাশাপাশি এসএজিই (জিন এক্সপ্রেশনের ক্রমিক বিশ্লেষণ) ট্যাগ এবং বারকোড সিকোয়েন্সিং সহ পরিবর্তনশীল প্রয়োগকে সক্ষম করে। উপরন্তু, পোলনি সিকোয়েন্সিং কৌশলটি একটি উন্মুক্ত ব্যবস্থা হিসাবে জোর দেওয়া হয় যা তৈরি করা সফ্টওয়্যার, প্রোটোকল এবং বিকারক সহ সবকিছু ভাগ করে নেয়। যাইহোক, যদিও কাঁচা তথ্য অধিগ্রহণ 786 গিগাবাইট পর্যন্ত অর্জন করা যেতে পারে তবে সংগৃহীত 10,000 বিটের মধ্যে মাত্র 1 বিট তথ্য কার্যকর। এই কৌশলের আরেকটি চ্যালেঞ্জ হল পৃথক লক্ষ্যগুলির আপেক্ষিক সম্প্রসারণের অভিন্নতা। অ-অভিন্ন পরিবর্ধন সিকোয়েন্সিংয়ের দক্ষতা হ্রাস করতে পারে এবং এই কৌশলটিতে সবচেয়ে বড় বাধা হিসাবে পোস্ট করা যেতে পারে। পোলনি সিকোয়েন্সিং 1990 এবং 2000-এর দশকের শেষের দিক থেকে পোলনি প্রযুক্তির একটি উন্নয়ন। 2003 সালে একক-বেস এক্সটেনশন ব্যবহার করে সিটু পোলোনিতে সিকোয়েন্স করার জন্য পদ্ধতিগুলি তৈরি করা হয়েছিল যা 5-6 বেস রিড অর্জন করতে পারে। 2005 সালের মধ্যে, বিদ্যমান পোলনি সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তি বিকাশের জন্য এই প্রাথমিক প্রচেষ্টাগুলি পুনর্বিবেচনা করা হয়েছিল। পোলনি সিকোয়েন্সিংয়ের অত্যন্ত সমান্তরাল সিকোয়েন্সিং-বাই-লাইগেশন ধারণাগুলি এ. বি. আই সলিড সিকোয়েন্সিংয়ের মতো পরবর্তী সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির ভিত্তিতে অবদান রেখেছে। রেফারেন্স বাহ্যিক লিঙ্ক ডিএনএ সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি জেনেটিক্স কৌশল