Interference reflection microscopy
ইন্টারফেরেন্স রিফ্লেকশন মাইক্রোস্কোপি (আই. আর. এম), যা প্রসঙ্গের উপর নির্ভর করে রিফ্লেকশন ইন্টারফেরেন্স কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপি (আর. আই. সি. এম) বা রিফ্লেকশন কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপি (আর. সি. এম) নামেও পরিচিত, একটি অপটিক্যাল মাইক্রোস্কোপি কৌশল যা কাচের পৃষ্ঠে কোনও বস্তুর চিত্র গঠনের জন্য হস্তক্ষেপের প্রভাবকে কাজে লাগায়। সংকেতের তীব্রতা হল কাচের পৃষ্ঠের সাথে বস্তুর সান্নিধ্যের একটি পরিমাপ। এই কৌশলটি একটি (ফ্লুরোসেন্ট) লেবেল ব্যবহার না করে কোষের ঝিল্লিতে ঘটনাগুলি অধ্যয়নের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে যেমনটি টিআইআরএফ মাইক্রোস্কোপির ক্ষেত্রে হয়। ইতিহাস এবং নাম 1964 সালে, অ্যাডাম এস. জি কার্টিস ইন্টারফেরেন্স রিফ্লেকশন মাইক্রোস্কোপি (আই. আর. এম) শব্দটি উদ্ভাবন করেন, যা কোষ জীববিজ্ঞানের ক্ষেত্রে ভ্রূণের চিক হার্ট ফাইব্রোব্লাস্ট অধ্যয়নের জন্য ব্যবহার করা হয়। তিনি সংযুক্ত স্থান এবং ফাইব্রোব্লাস্টের দূরত্ব দেখার জন্য আই. আর. এম ব্যবহার করেছিলেন, উল্লেখ করে যে কাচের সাথে যোগাযোগ বেশিরভাগ কোষের পরিধি এবং সিউডোপোডিয়ার মধ্যে সীমাবদ্ধ ছিল। 1975 সালে, জোহান সেবাস্তিয়ান প্লোয়েম আই. আর. এম-এর একটি উন্নতি প্রবর্তন করেন (একটি বইয়ের অধ্যায়ে প্রকাশিত), যা তিনি রিফ্লেকশন কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপি (আর. সি. এম) নামে অভিহিত করেন। অপটিক্যাল সিস্টেমে বিপথগামী আলোকে আরও কমাতে একটি তথাকথিত অ্যান্টি-ফ্লেক্স উদ্দেশ্য এবং ক্রস পোলারাইজার ব্যবহার করা হল উন্নতি। বর্তমানে, এই প্রকল্পটি মূলত রিফ্লেকশন ইন্টারফেরেন্স কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপি (আরআইসিএম) হিসাবে উল্লেখ করা হয়, যার নামটি 1979 সালে বেরিটার-হান এবং কনরাড বেক দ্বারা চালু করা হয়েছিল। তবে, আই. আর. এম শব্দটি কখনও কখনও আর. আই. সি. এম সেটআপকে বর্ণনা করে। কৌশলটি বর্ণনা করার জন্য ব্যবহৃত নামগুলির বহুত্ব কিছু বিভ্রান্তি সৃষ্টি করেছে এবং 1985 সালের প্রথম দিকে ভার্সুয়েরেন দ্বারা আলোচনা করা হয়েছিল। বেরিটার-হান এবং কনরাড বেক এই কৌশলটিকে ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপির সাথে সম্পর্কযুক্ত করেছেন, যা দেখায় যে বিভিন্ন স্তন্যপায়ী কোষের রেখা নির্দিষ্ট ফোকাল আঠালো স্থানে কাচের স্তরের সাথে লেগে থাকে। তত্ত্ব সংযুক্ত কোষের একটি চিত্র তৈরি করতে, একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলো একটি পোলারাইজারের মধ্য দিয়ে প্রবাহিত হয়। এই রৈখিক মেরুকৃত আলো উদ্দেশ্যের দিকে একটি বিম স্প্লিটার দ্বারা প্রতিফলিত হয়, যা নমুনার উপর আলোকে কেন্দ্রীভূত করে। কাচের পৃষ্ঠটি একটি নির্দিষ্ট মাত্রায় প্রতিফলিত হয় এবং মেরুকৃত আলোকে প্রতিফলিত করে। যে আলো কাচ দ্বারা প্রতিফলিত হয় না তা কোষে প্রবেশ করবে এবং কোষের ঝিল্লি দ্বারা প্রতিফলিত হবে। তিনটি পরিস্থিতি ঘটতে পারে। প্রথমত, যখন ঝিল্লিটি কাচের কাছাকাছি থাকে, তখন কাচ থেকে প্রতিফলিত আলো তরঙ্গদৈর্ঘ্যের অর্ধেক স্থানান্তরিত হয়, যাতে ঝিল্লি থেকে প্রতিফলিত আলো কাচের পর্যায় থেকে প্রতিফলিত আলোর তুলনায় একটি পর্যায় পরিবর্তন করে এবং তাই একে অপরকে বাতিল করে দেয় (হস্তক্ষেপ)। এই হস্তক্ষেপের ফলে চূড়ান্ত ছবিতে (চিত্রের বাম দিকের ক্ষেত্রে) একটি গাঢ় পিক্সেল তৈরি হয়। দ্বিতীয়ত, যখন ঝিল্লিটি কাচের সাথে সংযুক্ত থাকে না, তখন কাচ থেকে প্রতিফলিত আলোর তুলনায় ঝিল্লি থেকে প্রতিফলনের একটি ছোট পর্যায় পরিবর্তন হয় এবং তাই তারা একে অপরকে বাতিল করবে না, যার ফলে ছবিতে একটি উজ্জ্বল পিক্সেল তৈরি হয় (চিত্রের সঠিক ক্ষেত্রে)। তৃতীয়ত, যখন কোনও নমুনা থাকে না, তখন শুধুমাত্র কাচ থেকে প্রতিফলিত আলো সনাক্ত করা হয় এবং চূড়ান্ত ছবিতে উজ্জ্বল পিক্সেল হিসাবে প্রদর্শিত হবে। প্রতিফলিত আলো বিম স্প্লিটারে ফিরে যাবে এবং একটি দ্বিতীয় পোলারাইজারের মধ্য দিয়ে যাবে, যা ডিটেক্টরে (সাধারণত একটি সিসিডি ক্যামেরা) পৌঁছানোর আগে ছড়িয়ে ছিটিয়ে থাকা আলোকে সরিয়ে চূড়ান্ত ছবি তৈরি করবে। পোলারাইজারগুলি বিক্ষিপ্ত আলো হ্রাস করে দক্ষতা বাড়াতে পারে; তবে একটি সংবেদনশীল ডিজিটাল ক্যামেরা সহ একটি আধুনিক সেটআপে এগুলির প্রয়োজন হয় না। তত্ত্ব প্রতিফলন প্রতিসরণ সূচকের পরিবর্তনের কারণে ঘটে, তাই প্রতিটি সীমানায় আলোর একটি অংশ প্রতিফলিত হবে। প্রতিফলনের পরিমাণ প্রতিফলন সহগ দ্বারা দেওয়া হয়, নিম্নলিখিত নিয়ম অনুসারেঃ প্রতিফলনশীলতা হল প্রতিফলিত আলোর তীব্রতা () এবং আগত আলোর তীব্রতার () অনুপাতঃ কাচের জন্য সাধারণ প্রতিসরাঙ্ক ব্যবহার করে (1.50-1.54, তালিকা দেখুন), জল (1.31, তালিকা দেখুন), কোষের ঝিল্লি (1.48) এবং সাইটোসল (1.35), প্রতিটি ইন্টারফেস দ্বারা প্রতিফলিত আলোর ভগ্নাংশ গণনা করা যেতে পারে। প্রতিসরণ সূচকগুলির মধ্যে পার্থক্য বাড়ার সাথে সাথে প্রতিফলনের পরিমাণ বৃদ্ধি পায়, যার ফলে কাচের পৃষ্ঠ এবং কালচার মাধ্যমের মধ্যে ইন্টারফেস থেকে একটি বড় প্রতিফলন ঘটে (প্রায় জলের সমানঃ 1.31-1.33)। এর মানে হল যে একটি কোষ ছাড়া চিত্রটি উজ্জ্বল হবে, যখন কোষটি সংযুক্ত থাকে, মাঝারি এবং ঝিল্লির মধ্যে পার্থক্য একটি বড় প্রতিফলন ঘটায় যা পর্যায়ে সামান্য স্থানান্তরিত হয়, যা কাচ দ্বারা প্রতিফলিত আলোর সাথে হস্তক্ষেপ ঘটায়। যেহেতু মাঝারি-ঝিল্লি ইন্টারফেস থেকে প্রতিফলিত আলোর প্রশস্ততা বিচ্ছুরণের কারণে হ্রাস পায়, তাই সংযুক্ত অঞ্চলটি গাঢ় দেখাবে তবে সম্পূর্ণ কালো হবে না। যেহেতু নমুনার উপর কেন্দ্রীভূত আলোর শঙ্কু আপতিত আলোর বিভিন্ন কোণের জন্ম দেয়, তাই হস্তক্ষেপের নিদর্শনগুলির একটি বিস্তৃত পরিসর রয়েছে। যখন নিদর্শনগুলি 1 তরঙ্গদৈর্ঘ্যের (শূন্য-ক্রমের প্রান্ত) চেয়ে কম পরিবর্তিত হয়, তখন নিদর্শনগুলি একত্রিত হয়, যার ফলে তীব্রতা বৃদ্ধি পায়। এটি 1 এর চেয়ে বেশি সংখ্যাসূচক অ্যাপারচার সহ একটি উদ্দেশ্য ব্যবহার করে প্রাপ্ত করা যেতে পারে। প্রয়োজনীয়তা আই. আর. এম ব্যবহার করে কোষের ছবি তোলার জন্য একটি অণুবীক্ষণ যন্ত্রের কমপক্ষে নিম্নলিখিত উপাদানগুলির প্রয়োজন হয়ঃ 1) একটি আলোর উৎস, যেমন হ্যালোজেন ল্যাম্প, 2) একটি অপটিক্যাল ফিল্টার (যা তরঙ্গদৈর্ঘ্যের একটি ছোট পরিসর অতিক্রম করে), এবং 3) একটি বিম স্প্লিটার (যা 50 শতাংশ প্রতিফলিত করে এবং নির্বাচিত তরঙ্গদৈর্ঘ্যের 50 শতাংশ প্রেরণ করে)। আলোর উৎসকে উচ্চ তীব্রতার আলো তৈরি করতে হবে, কারণ বিম স্প্লিটার এবং নমুনা নিজেই প্রচুর আলো হারিয়ে ফেলবে। বিভিন্ন তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ফলে বিভিন্ন আইআরএম চিত্র তৈরি হয়; বেরিটার-হান এবং সহকর্মীরা দেখিয়েছেন যে তাদের পিটিকে 2 কোষের জন্য, 546 এনএম তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলো 436 এনএম তরঙ্গদৈর্ঘ্যের নীল আলোর তুলনায় ভাল বৈপরীত্য ঘটায়। আই. আর. এম-এর মৌলিক তত্ত্বের অনেক সংশোধন করা হয়েছে, যার বেশিরভাগই চিত্র গঠনের দক্ষতা এবং ফলন বৃদ্ধি করে। বিম স্প্লিটার এবং নমুনার মধ্যে পোলারাইজার এবং এক চতুর্থাংশ তরঙ্গ প্লেট স্থাপন করে, রৈখিক মেরুকৃত আলোকে বৃত্তাকার মেরুকৃত আলোতে রূপান্তরিত করা যেতে পারে এবং পরে আবার রৈখিক মেরুকৃত আলোতে রূপান্তরিত করা যেতে পারে, যা সিস্টেমের দক্ষতা বাড়ায়। বৃত্তাকার মেরুকরণ নিবন্ধটি এই প্রক্রিয়াটি বিস্তারিতভাবে আলোচনা করে। উপরন্তু, একটি দ্বিতীয় পোলারাইজার অন্তর্ভুক্ত করে, যা প্রথম পোলারাইজারের তুলনায় 90° ঘোরানো হয়, বিপথগামী আলোকে ডিটেক্টরে পৌঁছাতে বাধা দেওয়া যেতে পারে, যা সংকেত এবং শব্দের অনুপাত বৃদ্ধি করে (ভার্সুয়েরেন-এর চিত্র 2 দেখুন)। জৈবিক প্রয়োগ জৈবিক নমুনা অধ্যয়নের জন্য আই. আর. এম ব্যবহার করার বিভিন্ন উপায় রয়েছে। কৌশলটির ব্যবহারের প্রাথমিক উদাহরণগুলি কোষের আনুগত্য এবং কোষ স্থানান্তরের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করে। ভেসিকেল ফিউশন আরও সম্প্রতি, ক্রোমাফিন কোষে এক্সোসাইটোসিস অধ্যয়নের জন্য কৌশলটি ব্যবহার করা হয়েছে। ডি. আই. সি ব্যবহার করে ছবি তোলা হলে, ক্রোমাফিন কোষগুলি ছোট ছোট প্রোট্রুশন সহ গোলাকার কোষ হিসাবে উপস্থিত হয়। যখন আই. আর. এম ব্যবহার করে একই কোষের ছবি তোলা হয়, তখন কাচের উপর কোষের পদচিহ্ন স্পষ্টভাবে ছোট ছোট প্রোট্রুশন সহ একটি অন্ধকার অঞ্চল হিসাবে দেখা যায়। যখন ভেসিকলগুলি ঝিল্লির সাথে মিশে যায়, তখন সেগুলি অন্ধকার পদচিহ্নগুলির মধ্যে ছোট হালকা বৃত্ত হিসাবে প্রদর্শিত হয় (ডান প্যানেলের উপরের কোষে উজ্জ্বল দাগ)। আই. আর. এম ব্যবহার করে ক্রোমাফিন কোষে ভেসিকল ফিউশনের একটি উদাহরণ চলচ্চিত্র 1-এ দেখানো হয়েছে। 60 মিলিমিটার পটাসিয়ামের সঙ্গে উদ্দীপনার পরে, ঘন কোর গ্রানুলের এক্সোসাইটোসিসের ফলে ক্রোমাফিন কোষের অন্ধকার পদচিহ্নগুলির ভিতরে একাধিক উজ্জ্বল দাগ দেখা দিতে শুরু করে। যেহেতু আই. আর. এম-এর একটি ফ্লুরোসেন্ট লেবেলের প্রয়োজন হয় না, তাই এটি অন্যান্য ইমেজিং কৌশলগুলির সাথে মিলিত হতে পারে, যেমন এপিফ্লোরেসেন্স এবং টিআইআরএফ মাইক্রোস্কোপি ভেসিকেল এক্সোসাইটোসিস এবং এন্ডোসাইটোসিসের সাথে প্রোটিন গতিবিদ্যা অধ্যয়ন করতে পারে। ফ্লুরোসেন্ট লেবেলের অভাবের আরেকটি সুবিধা হল ফটোটক্সিসিটি হ্রাস করা। আরও পড়ার রেফারেন্স কোয়ান্টিটেটিভ রিফ্লেকশন ইন্টারফেরেন্স কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপি (আরআইসিএম) ইন সফট ম্যাটার অ্যান্ড সেল অ্যাডিশন, লরেন্ট লিমোজিন এবং খেয়া সেনগুপ্ত, কেমফিজচেম 2009,10,2752-2768। আলবার্ট আইনস্টাইন কলেজ অফ মেডিসিন অন আইআরএম রিফ্লেক্টেড কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি অন নিকন মাইক্রোস্কোপিইউ অপটিক্যাল মাইক্রোস্কোপি কৌশল ভিডিও ক্লিপ সম্বলিত নিবন্ধ