Optical mapping
অপটিক্যাল ম্যাপিং হল ডি. এন. এ-র একক, দাগযুক্ত অণু থেকে ক্রমবদ্ধ, জিনোম-প্রশস্ত, উচ্চ-রেজোলিউশন সীমাবদ্ধতা মানচিত্র নির্মাণের একটি কৌশল, যাকে "অপটিক্যাল ম্যাপ" বলা হয়। কোনও জীবের অজানা ডিএনএ বরাবর সীমাবদ্ধতা এনজাইম সাইটগুলির অবস্থান ম্যাপিং করে, ফলস্বরূপ ডিএনএ টুকরোগুলির বর্ণালী সম্মিলিতভাবে সেই ক্রমের জন্য একটি অনন্য "ফিঙ্গারপ্রিন্ট" বা "বারকোড" হিসাবে কাজ করে। মূলত 1990-এর দশকে ডাঃ ডেভিড সি শোয়ার্জ এবং এনওয়াইইউ-তে তাঁর গবেষণাগার দ্বারা বিকশিত এই পদ্ধতিটি তখন থেকে মাইক্রোবিয়াল এবং ইউক্যারিওটিক জিনোম উভয়ের জন্য অনেক বড় আকারের সিকোয়েন্সিং প্রকল্পের সমাবেশ প্রক্রিয়ার অবিচ্ছেদ্য অংশ। পরবর্তী প্রযুক্তিগুলি অপটিক্যাল ম্যাপিং তৈরি করার জন্য ডিএনএ গলন, ডিএনএ প্রতিযোগিতামূলক বাঁধাই বা এনজাইম্যাটিক লেবেলিং ব্যবহার করে। প্রযুক্তি আধুনিক অপটিক্যাল ম্যাপিং প্ল্যাটফর্মটি নিম্নরূপ কাজ করেঃ জিনোমিক ডিএনএ লাইসেড কোষ থেকে প্রাপ্ত হয় এবং অপটিক্যাল ম্যাপিংয়ের জন্য বড় জিনোমিক অণুগুলির একটি "লাইব্রেরি" তৈরি করার জন্য এলোমেলোভাবে শিয়ার করা হয়। ডিএনএর একটি একক অণু প্রসারিত (বা প্রসারিত) হয় এবং চার্জ মিথস্ক্রিয়ার কারণে একটি ফ্লুরোসেন্ট মাইক্রোস্কোপের অধীনে একটি স্লাইডে রাখা হয়। ডি. এন. এ অণুটি অতিরিক্ত সীমাবদ্ধতা এনজাইম দ্বারা হজম হয়, যা নির্দিষ্ট পরিপাক স্থানে বিভক্ত হয়। ফলস্বরূপ অণুর টুকরোগুলি পৃষ্ঠের সাথে সংযুক্ত থাকে। খণ্ডের প্রান্তগুলি ক্লিভেজ সাইটগুলিতে পিছনে টানা হয় (রৈখিক ডিএনএর স্থিতিস্থাপকতার কারণে), যা মাইক্রোস্কোপের অধীনে সনাক্তযোগ্য ফাঁকগুলি রেখে যায়। আন্তঃক্যালটিং রঞ্জক দ্বারা দাগযুক্ত ডি. এন. এ-র টুকরোগুলি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি দ্বারা দৃশ্যমান হয় এবং সমন্বিত ফ্লুরোসেন্সের তীব্রতা পরিমাপ করে আকার দেওয়া হয়। এটি একক অণুর একটি আলোকীয় মানচিত্র তৈরি করে। পৃথক অপটিক্যাল মানচিত্রগুলি একটি ঐকমত্য, জিনোমিক অপটিক্যাল মানচিত্র তৈরি করতে একত্রিত করা হয়। অপটিক্যাল ম্যাপিং প্ল্যাটফর্মের ইতিহাস প্রারম্ভিক সিস্টেম ডিএনএ অণুগুলি একটি কভার স্লিপ এবং একটি মাইক্রোস্কোপ স্লাইডের মধ্যে বিকশিত গলিত অ্যাগারোজে স্থির করা হয়েছিল। ডি. এন. এ বসানোর আগে রেস্ট্রিকশন এনজাইমকে গলিত অ্যাগারোজের সাথে প্রাক-মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং ম্যাগনেসিয়াম যোগ করে ক্লিভেজ শুরু হয়েছিল। আধানযুক্ত পৃষ্ঠ ব্যবহার করে জেল ম্যাট্রিক্সের মধ্যে স্থির হওয়ার পরিবর্তে, ডিএনএ অণুগুলি একটি ধনাত্মক আধানযুক্ত পৃষ্ঠে স্থিতিশীল তড়িৎ মিথস্ক্রিয়া দ্বারা জায়গায় রাখা হয়েছিল। রেজোলিউশন এমনভাবে উন্নত হয়েছে যে ~ 30 কেবি থেকে 800 বিপি পর্যন্ত ছোট টুকরোগুলি আকার নিতে পারে। স্বয়ংক্রিয় ব্যবস্থা সমান্তরাল এনজাইম্যাটিক প্রক্রিয়াকরণের জন্য একটি স্লাইডে একাধিক একক অণু (যেমন একটি মাইক্রো অ্যারে) সনাক্ত করার জন্য একটি স্বয়ংক্রিয় স্পটিং সিস্টেমের বিকাশ ও সংহতকরণ, চিত্র অধিগ্রহণের জন্য স্বয়ংক্রিয় ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি, চিত্র পরিচালনা করার জন্য চিত্র মিছিল দৃষ্টি, অপটিক্যাল মানচিত্র নির্মাণের জন্য অ্যালগরিদম, প্রচুর পরিমাণে ডেটা প্রক্রিয়াকরণের জন্য ক্লাস্টার কম্পিউটিং মাইক্রোফ্লুইডিক্স ব্যবহার করে উচ্চ-থ্রুপুট সিস্টেম পর্যবেক্ষণ করে যে একক অণু দিয়ে চিহ্নিত মাইক্রো অ্যারে বড় জিনোমিক ডিএনএ অণুর জন্য ভাল কাজ করে না, মাইক্রোফ্লুইডিক ডিভাইসগুলি সমান্তরাল মাইক্রো চ্যানেলের একটি সিরিজ ধারণকারী নরম লিথোগ্রাফি ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল। ন্যানোকোডিং প্রযুক্তি ব্যবহার করে পরবর্তী প্রজন্মের ব্যবস্থা অপটিক্যাল ম্যাপিংয়ের একটি উন্নতি, যাকে "ন্যানোকোডিং" বলা হয়, ন্যানোকনফিনেমে দীর্ঘায়িত ডিএনএ অণুগুলিকে আটকে রেখে থ্রুপুট বাড়ানোর সম্ভাবনা রয়েছে। তুলনা অন্যান্য ম্যাপিং কৌশল ঐতিহ্যবাহী ম্যাপিং কৌশলের তুলনায় ওএম-এর সুবিধা হল এটি ডিএনএ খণ্ডের ক্রম সংরক্ষণ করে, যেখানে সীমাবদ্ধতা ম্যাপিং ব্যবহার করে ক্রমটি পুনর্গঠন করা প্রয়োজন। উপরন্তু, যেহেতু মানচিত্রগুলি সরাসরি জিনোমিক ডিএনএ অণু থেকে তৈরি করা হয়, তাই ক্লোনিং বা পিসিআর শিল্পকর্মগুলি এড়ানো হয়। যাইহোক, প্রতিটি ওএম প্রক্রিয়া এখনও ফলস পজিটিভ এবং নেগেটিভ সাইট দ্বারা প্রভাবিত হয় কারণ প্রতিটি অণুর মধ্যে সমস্ত সীমাবদ্ধতা সাইটগুলি বিভক্ত করা হয় না এবং কিছু সাইট ভুলভাবে কাটা হতে পারে। বাস্তবে, একই জিনোমিক অঞ্চলের অণু থেকে একাধিক আলোকীয় মানচিত্র তৈরি করা হয় এবং সর্বোত্তম ঐকমত্যের মানচিত্র নির্ধারণের জন্য একটি অ্যালগরিদম ব্যবহার করা হয়। অন্যান্য জিনোম বিশ্লেষণ পদ্ধতি জিনোমের মধ্যে বড় আকারের জিনোমিক বৈচিত্র্য (যেমন ইনডেল, ডুপ্লিকেশন, ইনভার্সন, ট্রান্সলোকেশন) সনাক্ত করার বিভিন্ন পদ্ধতি রয়েছে। অন্যান্য বিভাগের পদ্ধতির মধ্যে রয়েছে মাইক্রো-অ্যারে, পালসড-ফিল্ড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস, সাইটোজেনেটিক্স এবং পেয়ারড-এন্ড ট্যাগ ব্যবহার করা। ব্যবহার প্রাথমিকভাবে, অপটিক্যাল ম্যাপিং সিস্টেম ব্যাকটেরিয়া, পরজীবী এবং ছত্রাকের সম্পূর্ণ-জিনোম সীমাবদ্ধতা মানচিত্র তৈরি করতে ব্যবহৃত হয়েছে। এটি ব্যাকটেরিয়ার জিনোমগুলিকে স্ক্যাফোল্ড এবং বৈধ করতেও ব্যবহৃত হয়েছে। অ্যাসেম্বলির জন্য স্ক্যাফোল্ড হিসাবে কাজ করার জন্য, পরিচিত সিকোয়েন্স ডেটা ব্যবহার করে সিলিকোতে সীমাবদ্ধ সাইটগুলির জন্য একত্রিত সিকোয়েন্স কনটিগগুলি স্ক্যান করা যেতে পারে এবং সেগুলিকে একত্রিত জিনোমিক অপটিক্যাল মানচিত্রে সারিবদ্ধ করা যেতে পারে। বাণিজ্যিক সংস্থা, অপজেন মাইক্রোবিয়াল জিনোমের জন্য অপটিক্যাল ম্যাপিং প্রদান করেছে। বৃহত্তর ইউক্যারিওটিক জিনোমের জন্য, শুধুমাত্র ডেভিড সি. শোয়ার্জ ল্যাব (বর্তমানে ম্যাডিসন-উইসকনসিনে) ইঁদুর, মানুষ, চাল এবং ভুট্টার জন্য অপটিক্যাল মানচিত্র তৈরি করেছে। অপটিক্যাল সিকোয়েন্সিং একটি একক অণু ডিএনএ সিকোয়েন্সিং কৌশল যা সিকোয়েন্স-বাই-সিন্থেসিস অনুসরণ করে এবং অপটিক্যাল ম্যাপিং প্রযুক্তি ব্যবহার করে। এস. এম. আর. টি সিকোয়েন্সিংয়ের মতো অন্যান্য একক আণবিক সিকোয়েন্সিং পদ্ধতির মতো, এই কৌশলটি প্রাথমিক নমুনা এবং ডি. এন. এ-র একাধিক অনুলিপি সিকোয়েন্স করার পরিবর্তে একটি একক ডি. এন. এ অণু বিশ্লেষণ করে। সংশ্লেষণের সময়, ফ্লোরোক্রোম-লেবেলযুক্ত নিউক্লিওটাইডগুলি ডিএনএ পলিমারেজ ব্যবহারের মাধ্যমে অন্তর্ভুক্ত করা হয় এবং ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি দ্বারা ট্র্যাক করা হয়। এই কৌশলটি মূলত 2003 সালে ডেভিড সি শোয়ার্জ এবং অরবিন্দ রামনাথন দ্বারা প্রস্তাবিত হয়েছিল। অপটিক্যাল সিকোয়েন্সিং চক্র নিম্নলিখিত অপটিক্যাল সিকোয়েন্সিং প্রক্রিয়ার প্রতিটি চক্রের একটি সংক্ষিপ্ত বিবরণ। প্রথম ধাপঃ ডি. এন. এ বারকোডিং কোষগুলি জিনোমিক ডি. এন. এ মুক্ত করার জন্য লাইজ করা হয়। এই ডিএনএ অণুগুলি অপ্রচলিত, মাইক্রোফ্লুইডিক চ্যানেলযুক্ত অপটিক্যাল ম্যাপিং পৃষ্ঠে স্থাপন করা হয় এবং ডিএনএকে চ্যানেলগুলির মধ্য দিয়ে প্রবাহিত হতে দেওয়া হয়। এই অণুগুলি তারপর অপটিক্যাল ম্যাপিং কৌশলের মাধ্যমে জিনোমিক স্থানীয়করণের অনুমতি দেওয়ার জন্য সীমাবদ্ধতা এনজাইম দ্বারা বারকোড করা হয়। এই ধাপগুলির জন্য "প্রযুক্তি"-র উপরের বিভাগটি দেখুন। পদক্ষেপ 2: মাউন্ট করা ডি. এন. এ অণুগুলিকে এলোমেলোভাবে নিক করার জন্য টেম্পলেট নিকিং ডি. এন. এ. এস-1 যোগ করা হয়। তারপর ডি. এন. এ. এস-1 অপসারণের জন্য একটি ধোয়া করা হয়। প্রতি টেমপ্লেটে ঘটে যাওয়া নিক্সের গড় সংখ্যা ডিএনএজ-1-এর ঘনত্বের পাশাপাশি ইনকিউবেশন সময়ের উপর নির্ভর করে। ধাপ 3: ফাঁক গঠন টি7 এক্সোন্যুক্লিয়াস যোগ করা হয় যা ডিএনএ অণুর নিক্স ব্যবহার করে ফাঁকগুলিকে 5 '-3' দিকে প্রসারিত করে। অতিরিক্ত মাত্রায় ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড বিরতি এড়াতে T7 এক্সোনিউক্লিজের পরিমাণ অবশ্যই সতর্কতার সাথে নিয়ন্ত্রণ করতে হবে। পদক্ষেপ 4: ফ্লোরোক্রোম সংযোজন ডিএনএ পলিমারেজ প্রতিটি ডিএনএ অণু বরাবর একাধিক গ্যাপড সাইটে ফ্লোরোক্রোম-লেবেলযুক্ত নিউক্লিওটাইড (এফডিএনটিপি) অন্তর্ভুক্ত করতে ব্যবহৃত হয়। প্রতিটি চক্রের সময়, প্রতিক্রিয়া মিশ্রণে এক ধরনের এফ. ডি. এন. টি. পি থাকে এবং সেই নিউক্লিওটাইড প্রকারের একাধিক সংযোজন করার অনুমতি দেয়। এরপরে ইমেজিং এবং এফ. ডি. এন. টি. পি যোগের পরবর্তী চক্রের প্রস্তুতির জন্য অনিগমিত এফ. ডি. এন. টি. পিগুলি অপসারণের জন্য বিভিন্ন ওয়াশ করা হয়। পদক্ষেপ 5: ইমেজিং এই পদক্ষেপটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করে ফাঁক অঞ্চলে অন্তর্ভুক্ত ফ্লোরোক্রোম-লেবেলযুক্ত নিউক্লিওটাইডের সংখ্যা গণনা করে। ধাপ 6: ফটোব্লিচিং ফ্লোরোক্রোমকে উত্তেজিত করতে ব্যবহৃত লেজার আলোকসজ্জাও এখানে ফ্লোরোক্রোম সংকেত ধ্বংস করতে ব্যবহৃত হয়। এটি মূলত ফ্লোরোক্রোম কাউন্টারটি পুনরায় সেট করে এবং পরবর্তী চক্রের জন্য কাউন্টারটি প্রস্তুত করে। এই পদক্ষেপটি অপটিক্যাল সিকোয়েন্সিংয়ের একটি অনন্য দিক কারণ এটি প্রকৃতপক্ষে নিউক্লিওটাইডের ফ্লুরোক্রোম লেবেলটি অন্তর্ভুক্ত করার পরে সরিয়ে দেয় না। ফ্লোরোক্রোম লেবেলটি অপসারণ না করা সিকোয়েন্সিংকে আরও সাশ্রয়ী করে তোলে, তবে এর ফলে ধারাবাহিকভাবে ফ্লোরোক্রোম লেবেলগুলি অন্তর্ভুক্ত করার প্রয়োজন হয় যার ফলে লেবেলগুলির স্থূলতার কারণে সমস্যা হতে পারে। ধাপ 7: ধাপ 4-6 পুনরাবৃত্তি করুন ধাপ 4-6 একটি প্রতিক্রিয়া মিশ্রণ ব্যবহার করে ধাপ 4 দিয়ে পুনরাবৃত্তি করা হয় যাতে প্রতিবার একটি ভিন্ন ফ্লোরোক্রোম-লেবেলযুক্ত নিউক্লিওটাইড (এফ. ডি. এন. টি. পি) থাকে। পছন্দসই অঞ্চলটি ক্রমবদ্ধ না হওয়া পর্যন্ত এটি পুনরাবৃত্তি করা হয়। অনুকূলকরণের কৌশল একটি উপযুক্ত ডি. এন. এ পলিমারেজ বেস সংযোজন ধাপের দক্ষতার জন্য গুরুত্বপূর্ণ এবং অবশ্যই বেশ কয়েকটি মানদণ্ড পূরণ করতে হবেঃ ধারাবাহিক অবস্থানে এফ. ডি. এন. টি. পি দক্ষতার সাথে অন্তর্ভুক্ত করার ক্ষমতা 3 '-5' এক্সোন্যুক্লিয়াসের অভাব এবং নতুন অন্তর্ভুক্ত এফ. ডি. এন. টি. পি অপসারণ রোধ করতে প্রুফরিডিং ক্রিয়াকলাপের অভাব ভুল-সংযোজনগুলি হ্রাস করতে উচ্চ বিশ্বস্ততা টেমপ্লেটগুলিতে ভাল ক্রিয়াকলাপ যা পৃষ্ঠে মাউন্ট করা হয় (যেমন। অপটিক্যাল ম্যাপিং পৃষ্ঠ) উপরন্তু, বিভিন্ন ফ্লোরোক্রোমের জন্য বিভিন্ন পলিমারেজ পছন্দ, ফ্লোরোক্রোম-নিউক্লিওটাইডের উপর লিঙ্কারের দৈর্ঘ্য এবং বাফার কম্পোজিশনগুলিও বেস সংযোজন প্রক্রিয়াটিকে অনুকূল করতে এবং পরপর এফডিএনটিপি সংযোজনগুলির সংখ্যা সর্বাধিক করার জন্য বিবেচনা করা গুরুত্বপূর্ণ কারণ। সুবিধা একক-অণু বিশ্লেষণ যেহেতু ন্যূনতম ডিএনএ নমুনা প্রয়োজন, তাই নমুনা প্রস্তুতির প্রক্রিয়াকে সহজতর করার জন্য সময়সাপেক্ষ এবং ব্যয়বহুল পরিবর্ধন পদক্ষেপ এড়ানো হয়। বড় ডিএনএ অণু টেমপ্লেট (~ 500 কেবি) বনাম ছোট ডিএনএ অণু টেমপ্লেট (<1 কেবি) যদিও বেশিরভাগ পরবর্তী প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির লক্ষ্য হল প্রচুর পরিমাণে ছোট সিকোয়েন্স রিড, এই ছোট সিকোয়েন্স রিডগুলি ডি নভো সিকোয়েন্সিং প্রচেষ্টা এবং জিনোম পুনরাবৃত্তি অঞ্চলগুলিকে বোঝা কঠিন করে তোলে। অপটিক্যাল সিকোয়েন্সিং সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য বড় ডিএনএ অণু টেমপ্লেট (~ 500 কেবি) ব্যবহার করে এবং এগুলি ছোট টেমপ্লেটের তুলনায় বেশ কয়েকটি সুবিধা প্রদান করেঃ এই বড় ডিএনএ টেমপ্লেটগুলি আত্মবিশ্বাসের সাথে তাদের জিনোমিক স্থানীয়করণ নির্ধারণ করতে "ডিএনএ বারকোড" করা যেতে পারে। অতএব, যে কোনও ক্রম যা বড় টেমপ্লেট থেকে নেওয়া হয় তা উচ্চ মাত্রার আত্মবিশ্বাসের সাথে জিনোমে ম্যাপ করা যেতে পারে। আরও গুরুত্বপূর্ণ বিষয় হল, উচ্চ পুনরাবৃত্তি অঞ্চল থেকে ক্রম পাঠগুলি আরও বেশি আত্মবিশ্বাসের সাথে স্থাপন করা যেতে পারে যেখানে সংক্ষিপ্ত পাঠগুলি উচ্চ পুনরাবৃত্তি অঞ্চলে ম্যাপিং অনিশ্চয়তায় ভুগছে। একটি রেফারেন্স জিনোমের সাথে একক-অণু বারকোডগুলি সারিবদ্ধ করার জন্য অপটিক্যাল ম্যাপিং এবং ন্যানোকোডিংয়ের মতো বিশেষ অ্যালগরিদম এবং সফ্টওয়্যার তৈরি করা হয়েছে। একাধিক ক্রম একই বড় টেমপ্লেট অণু থেকে পড়ে। এই একাধিক ক্রমটি ডি নোভো সমাবেশের জটিলতা হ্রাস করে, জিনোমিক পুনর্বিন্যাস অঞ্চলগুলিকে অস্পষ্ট করে এবং "কোনও সমাবেশ ত্রুটি থেকে অভ্যন্তরীণভাবে মুক্ত"। ক্রম অর্জনের সাথে বড় ডিএনএ আণবিক টেমপ্লেটগুলির আণবিক বারকোডিং বিস্তৃত এবং নির্দিষ্ট জিনোমিক বিশ্লেষণ সরবরাহ করে অসুবিধা একক অণু ডিএনএ সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য বর্তমান পরবর্তী প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তি দ্বারা প্রদত্ত অপ্রয়োজনীয় পঠন কভারেজ থেকে আত্মবিশ্বাসের সাথে মেলে উচ্চ স্তরের নির্ভুলতার প্রয়োজন। একই অবস্থানে উভয় স্ট্র্যান্ডে নিক্সের ফলে সিকোয়েন্স-বাই-সিন্থেসিসের সময় কম টেমপ্লেট হয়। ফ্লোরোক্রোম-লেবেলযুক্ত নিউক্লিওটাইডগুলি অন্তর্ভুক্তির পরে অপসারণ করা হয় না এবং এই ভারী লেবেলগুলির কারণে, একাধিক সংযোজন কঠিন হতে পারে। রেফারেন্স বাহ্যিক লিঙ্ক অপজেন অপটিক্যাল ম্যাপিং সলিউশন ডাঃ ডেভিড সি. শোয়ার্জ ল্যাব বায়োফিজিক্স জিনোমিক্স কৌশল মাইক্রোস্কোপি আণবিক জীববিজ্ঞান