Hot start PCR
হট স্টার্ট পিসিআর হল প্রচলিত পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশন (পিসিআর)-এর একটি পরিবর্তিত রূপ যা ঘরের (বা শীতল) তাপমাত্রায় অ-নির্দিষ্ট ডিএনএ পরিবর্ধনের কারণে অবাঞ্ছিত পণ্য এবং প্রাইমার ডাইমারের উপস্থিতি হ্রাস করে। উচ্চ ফলন অর্জনের জন্য পিসিআর পদ্ধতির অনেক বৈচিত্র্য এবং পরিবর্তন করা হয়েছে; হট স্টার্ট পিসিআর তার মধ্যে একটি। হট স্টার্ট পিসিআর প্রচলিত পিসিআর-এর মতো একই নীতি অনুসরণ করে-এটি একটি একক আটকে থাকা টেমপ্লেট থেকে ডিএনএ সংশ্লেষ করতে ডিএনএ পলিমারেজ ব্যবহার করে। যাইহোক, এটি অতিরিক্ত উত্তাপ এবং পৃথকীকরণ পদ্ধতি ব্যবহার করে, যেমন টাক পলিমারেজের বন্ধনকে নিষ্ক্রিয় বা বাধা দেওয়া এবং টাক পলিমারেজের দেরিতে সংযোজন, পণ্যের ফলন বাড়ানোর পাশাপাশি উচ্চতর নির্দিষ্টতা এবং সংবেদনশীলতা প্রদান করে। অ-নির্দিষ্ট বন্ধন এবং প্রাইমার ডাইমারগুলির প্রাইমিং বা গঠন ডিনেচুরেশনের পরে প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি সম্পূর্ণ করে হ্রাস করা হয়। উচ্চ তাপমাত্রায় প্রতিক্রিয়া মিশ্রণগুলি সম্পূর্ণ করার কিছু উপায়ের মধ্যে রয়েছে এমন পরিবর্তন যা নিম্ন তাপমাত্রায় ডিএনএ পলিমারেজ ক্রিয়াকলাপকে অবরুদ্ধ করে, পরিবর্তিত ডিওক্সিরাইবোনিউক্লিয়টাইড ট্রাইফসফেট (ডিএনটিপি) ব্যবহার এবং বিকৃতি হওয়ার পরে প্রয়োজনীয় বিকারকগুলির মধ্যে একটির শারীরিক সংযোজন। এই অতিরিক্ত পদ্ধতির মাধ্যমে, হট স্টার্ট পিসিআর অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনগুলির পরিমাণ হ্রাস করতে সক্ষম যা স্বাভাবিকভাবেই নিম্ন তাপমাত্রার সময় ঘটে-যা প্রচলিত পিসিআর-এর জন্য একটি সমস্যা হিসাবে রয়ে গেছে। এই পরিবর্তনগুলি সামগ্রিকভাবে কাজ করে যাতে দ্রবণে নির্দিষ্ট এনজাইমগুলি নিষ্ক্রিয় থাকে বা সর্বোত্তম অ্যানিলিং তাপমাত্রায় না পৌঁছানো পর্যন্ত বাধাগ্রস্ত হয়। অ-নির্দিষ্ট পিসিআর পণ্য গঠনে বাধা দেওয়া, বিশেষত প্রাথমিক চক্রগুলিতে, পিসিআর দ্বারা পরিবর্ধন সংবেদনশীলতায় যথেষ্ট বৃদ্ধি ঘটে। পিসিআর বা আরটি-পিসিআর-এর ডায়াগনস্টিক প্রয়োগের ক্ষেত্রে এটি অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। ব্যাকগ্রাউন্ড পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশন (পিসিআর) একটি আণবিক জীববিজ্ঞান কৌশল যা নির্দিষ্ট ডিএনএ বিভাগগুলিকে বিভিন্ন মাত্রায় প্রশস্ত করতে ব্যবহৃত হয়। ডি. এন. এ-র নির্দিষ্ট অংশগুলি তিনটি প্রক্রিয়ায় পরিবর্ধিত হয়, ডিনেচুরেশন, অ্যানিলিং এবং এক্সটেনশন-যেখানে ডি. এন. এ স্ট্র্যান্ডগুলি প্রাইমারগুলি বাঁধার আগে ঘরের তাপমাত্রা থেকে সর্বোত্তম তাপমাত্রায় তাপমাত্রা বাড়িয়ে পৃথক করা হয় এবং পলিমারেজ নিউক্লিওটাইডগুলিকে টেমপ্লেট স্ট্র্যান্ডের সাথে সারিবদ্ধ করে। এটি ডিএনএ পলিমারেজ ব্যবহার করে, যা কম তাপমাত্রায় সামান্য সক্রিয় থাকে। প্রচলিত পিসিআর-এ, প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি ঘরের তাপমাত্রায় সম্পন্ন হয় এবং ডিএনএ পলিমারেজ ক্রিয়াকলাপের কারণে, প্রাইমারগুলি প্রাইমার ডাইমার বা অ্যানিয়াল থেকে ডিএনএ গঠন করতে পারে। পিসিআর প্রক্রিয়া চলাকালীন, ডিএনএ পলিমারেজ ডিএনএর যে কোনও অংশকে আবদ্ধ প্রাইমারের সাথে প্রসারিত করবে, লক্ষ্য পণ্য তৈরি করবে তবে অনির্দিষ্ট পণ্যও তৈরি করবে যা ফলন হ্রাস করে। হট স্টার্ট পিসিআর-এ, কিছু বিকারক আলাদা রাখা হয় যতক্ষণ না মিশ্রণটি নির্দিষ্ট অ্যানিলিং তাপমাত্রায় উত্তপ্ত হয়। এটি অ্যানিলিংয়ের সময় হ্রাস করে, যার ফলে অ-নির্দিষ্ট ডিএনএ সম্প্রসারণের সম্ভাবনা এবং বিকৃতি হওয়ার আগে অ-নির্দিষ্ট প্রাইমার বাঁধনের প্রভাব হ্রাস পায়। প্রচলিত পিসিআর-এ, সর্বোত্তম অ্যানিলিং তাপমাত্রার (50-65 ডিগ্রি সেলসিয়াস) নিচে কম তাপমাত্রার ফলে লক্ষ্য পরিবর্তন হয় যেমন অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন যেখানে প্রাইমারগুলি অ-নির্দিষ্টভাবে নিউক্লিক অ্যাসিডের সাথে আবদ্ধ হবে। এই অ-নির্দিষ্ট প্রাইমার কমপ্লেক্সগুলি, যা মিশ্রণে অতিরিক্ত, প্রাইমার ডাইমার এবং মিস-প্রাইমিংয়ের মতো উপ-পণ্যগুলির সংশ্লেষণের কারণ। মিস-প্রাইমিং ব্যাপকভাবে বাধাগ্রস্ত করে এবং পরিবর্ধন জন্য লক্ষ্য ক্রমের সাথে সক্রিয়ভাবে প্রতিযোগিতার মাধ্যমে পিসিআর পরিবর্ধন দক্ষতা হ্রাস করে। একইভাবে, প্রাইমার ডাইমারগুলি জটিল গঠন করে যা প্রাপ্ত অনুলিপি সংখ্যা সম্প্রসারণের পরিমাণ হ্রাস করে। এটি হট স্টার্ট পিসিআর প্রয়োগ করে নিয়ন্ত্রণ করা যেতে পারে যা সর্বোত্তম তাপমাত্রা পূরণ না হওয়া পর্যন্ত প্রাইমার এক্সটেনশনগুলিকে অবরুদ্ধ করার অনুমতি দেয়। হট স্টার্ট পিসিআর-এ, গুরুত্বপূর্ণ বিকারকগুলি (যেমন ডিএনএ পলিমারেজ এবং ম্যাগনেসিয়াম কোফ্যাক্টর) পিসিআর মিশ্রণে প্রতিক্রিয়া করতে বাধা দেওয়া হয় যতক্ষণ না শারীরিক পৃথকীকরণ বা রাসায়নিক পরিবর্তনের মাধ্যমে সর্বোত্তম তাপমাত্রা পূরণ করা হয়। হট স্টার্ট পিসিআর তখনও ঘটতে পারে যখন টাক পলিমারেজ প্রতিরোধ/নিষ্ক্রিয় করা হয় বা এর সংযোজন সর্বোত্তম অ্যানিলিং তাপমাত্রা পর্যন্ত বিলম্বিত হয়, ডিওক্সিরাইবোনিউক্লিওটাইড ট্রাইফসফেট পরিবর্তনের মাধ্যমে বা কেজিং এবং গৌণ কাঠামোর কারসাজির মাধ্যমে প্রাইমারগুলি সংশোধন করে। হট স্টার্ট পিসিআর প্রায়শই প্রচলিত পিসিআর-এর বিপরীতে একটি ভাল পদ্ধতি যেখানে প্রতিক্রিয়া মিশ্রণে ডিএনএর কম ঘনত্ব থাকে, ডিএনএ টেমপ্লেট অত্যন্ত জটিল, বা যদি পিসিআর-এ অলিগোনিউক্লিওটাইড প্রাইমারের বেশ কয়েকটি জোড়া থাকে। পদ্ধতি হট স্টার্ট পিসিআর এমন একটি পদ্ধতি যা কম তাপমাত্রায় ডিএনএ পলিমারেজ সম্প্রসারণকে প্রতিরোধ করে যাতে উৎপাদনের ক্ষতি হ্রাস করার জন্য অ-নির্দিষ্ট বন্ধন প্রতিরোধ করা যায়। হট স্টার্ট পিসিআর পিসিআর-এর গরম করার পদক্ষেপ না হওয়া পর্যন্ত সীমিত বিকারকগুলির মাধ্যমে অ-নির্দিষ্ট বাঁধনের পরিমাণ হ্রাস করে-একটি প্রতিক্রিয়ায় টাক ডিএনএ পলিমারেজকে সীমাবদ্ধ করে প্রতিক্রিয়াটিকে প্রাথমিকভাবে সীমাবদ্ধ করে। অ-নির্দিষ্ট বন্ধন প্রায়শই প্রাইমার ডাইমার এবং ভুল-প্রাথমিক/মিথ্যা প্রাথমিক লক্ষ্যের দিকে পরিচালিত করে। এগুলি পরিবর্তিত পদ্ধতির মাধ্যমে সংশোধন করা যেতে পারে যেমনঃ টাক ডি. এন. এ পলিমারেজ এনজাইম সংযুক্ত অ্যান্টিবডি/টাক ডি. এন. এ পলিমারেজ অ্যান্টিবডিগুলির সাথে জটিল তাক ডি. এন. এ পলিমারেজ নিষ্ক্রিয়করণ/প্রতিরোধঃ এনজাইম সংযুক্ত অ্যান্টিবডিগুলি টাক ডি. এন. এ পলিমারেজকে নিষ্ক্রিয় করে। অ্যান্টিবডিগুলি পলিমারেজের সাথে সংযুক্ত এবং আবদ্ধ হয়, প্রাথমিক ডিএনএ পরিবর্ধন প্রতিরোধ করে যা কম তাপমাত্রায় ঘটতে পারে। একবার সর্বোত্তম অ্যানিলিং তাপমাত্রা পূরণ হয়ে গেলে, অ্যান্টিবডিগুলি হ্রাস এবং বিচ্ছিন্ন হতে শুরু করবে, প্রতিক্রিয়ায় টাক ডিএনএ পলিমারেজকে মুক্ত করবে এবং পরিবর্ধন প্রক্রিয়া শুরু করতে দেবে। প্ল্যাটিনাম টাক ডিএনএ পলিমারেজ এবং অ্যাকুস্টার্ট টাক ডিএনএ পলিমারেজ (উভয়ই যথাক্রমে লাইফ টেকনোলজিস এবং কোয়ান্টা বায়োসায়েন্সে আয়ুব রাশচিয়ান দ্বারা বিকশিত) বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ অ্যান্টিবডি ভিত্তিক হট স্টার্ট টাক ডিএনএ পলিমারেজের উদাহরণ। এই টাক ডিএনএ পলিমারেজগুলি টাক ডিএনএ পলিমারেজের জন্য নির্দিষ্ট মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডিগুলির মিশ্রণের সাথে প্রাক-জটিল। মোমের পুঁতিগুলিঃ তাপমাত্রার উপর নির্ভরশীল মোমের পুঁতিগুলি তাক ডিএনএ পলিমারেজ এবং বাকি পিসিআর উপাদানগুলির মধ্যে একটি শারীরিক বাধা তৈরি করে। একবার তাপমাত্রা 70 ডিগ্রি সেলসিয়াসের উপরে বৃদ্ধি পেলে, প্রথম চক্রের বিকৃতি ধাপের সময়, মোমের পুঁতি গলে যায়, যার ফলে টাক ডিএনএ পলিমারেজ বাধা অতিক্রম করে এবং বিক্রিয়ায় মুক্তি পায়-পরিবর্ধন প্রক্রিয়া শুরু করে। মোম স্তরটি তারপর পরিবর্ধন পর্যায়ে প্রতিক্রিয়া মিশ্রণের শীর্ষে চলে যায় এবং পরে বাষ্প বাধা হিসাবে কাজ করে। অত্যন্ত নির্দিষ্ট অলিগোনিউক্লিওটাইডঃ অলিগোনিউক্লিওটাইড হল নিউক্লিক অ্যাসিডের ছোট পলিমার যা সহজেই আবদ্ধ হয়। অত্যন্ত নির্দিষ্ট অলিগোনিউক্লিওটাইড, যেমন অ্যাপ্টামার, কম তাপমাত্রায় টাক ডিএনএ পলিমারেজের সাথে আবদ্ধ হয় যা এটিকে মিশ্রণে নিষ্ক্রিয় করে তোলে। শুধুমাত্র উচ্চ তাপমাত্রায় অলিগোনিউক্লিওটাইডগুলি টাক থেকে আলাদা হয়ে যায় যার ফলে এটি প্রতিক্রিয়া করতে পারে। এগুলি হট স্টার্ট পিসিআর-এর জন্য সবচেয়ে কার্যকর পদ্ধতি, এনজাইম সংযুক্ত অ্যান্টিবডি এবং বিশেষত অত্যন্ত নির্দিষ্ট অলিগোনিউক্লিওটাইড পদ্ধতিগুলি প্রক্রিয়াগুলির সময় সবচেয়ে উপযুক্ত যার জন্য একটি সংক্ষিপ্ত নিষ্ক্রিয়তার সময় প্রয়োজন। যাইহোক, অন্যান্য পদ্ধতিগুলি প্রয়োগ করা হয় যেমনঃ টাক ডিএনএ পলিমারেজ প্রিহিটিংয়ের দেরিতে সংযোজনঃ পিসিআর মেশিনটি আগে থেকে গরম করা হয় যখন উপাদানগুলি বরফের উপর মিশ্রিত করা হয় এবং তারপরে সর্বোত্তম তাপমাত্রায় পৌঁছানোর পরে অবিলম্বে পিসিআর মেশিনে স্থাপন করা হয়। এটি প্রয়োজনীয় ওয়ার্ম-আপ প্রক্রিয়াটি দূর করবে, প্রাইমারগুলির অ-নির্দিষ্ট অ্যানিলিং হ্রাস করবে এবং নিশ্চিত করবে যে মিশ্রণে যে কোনও মিস পেয়ারড প্রাইমার আলাদা করা হয়েছে। হিমায়িত করাঃ হিমায়িত করা অনেকটা মোমের পুঁতির মতো শারীরিক পৃথকীকরণের একটি রূপ হিসাবে কাজ করে। প্রাইমার্স, টেমপ্লেট স্ট্র্যান্ড, জল এবং ডিঅক্সিরাইবোনিউক্লিয়টাইড ট্রাইফসফেট (ডিএনটিপি) ধারণকারী প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি টাক পলিমারেজের আগে হিমায়িত হয় এবং অবশিষ্ট পিসিআর উপাদানগুলি হিমায়িত মিশ্রণের উপরে যোগ করা হয়। এটি অ-নির্দিষ্ট বন্ধন রোধ করার জন্য কাজ করে। পরে তাক যোগ করাঃ প্রতিক্রিয়া মিশ্রণে পিসিআর-এর উপাদানগুলি তাক যোগ না করেই প্রস্তুত এবং উত্তপ্ত করা হয়। সর্বোত্তম তাপমাত্রায় পৌঁছানোর পরেই তাককে পরে মিশ্রণে প্রবর্তন করা হয়। যাইহোক, এই পদ্ধতিটি সবচেয়ে কম নির্ভরযোগ্য এবং উপাদানগুলির দূষণ ঘটাতে পারে। আরেকটি পদ্ধতি হল ডিঅক্সিরাইবোনিউক্লিওটাইড ট্রাইফসফেট মধ্যস্থ হট স্টার্ট পিসিআর যা একটি সুরক্ষা গোষ্ঠীর মাধ্যমে নিউক্লিওটাইড ঘাঁটিগুলিকে পরিবর্তন করে। ডিঅক্সিরাইবোনিউক্লিওটাইড ট্রাইফসফেট (ডিএনটিপি) পরিবর্তন হট স্টার্ট ডিএনটিপি রাসায়নিকভাবে পরিবর্তন করা যেতে পারে যাতে 3 প্রধান টার্মিনাসের একটি তাপ সংবেদনশীল সুরক্ষা গোষ্ঠী অন্তর্ভুক্ত করা যায়। এই পরিবর্তনটি নিউক্লিওটাইডগুলিকে তাক পলিমারেজের সাথে টেমপ্লেট স্ট্র্যান্ডের সাথে আবদ্ধ হতে বাধা দেবে যতক্ষণ না সর্বোত্তম তাপমাত্রায় পৌঁছানোর পরে, সুরক্ষা গোষ্ঠীটি তাপ সক্রিয়করণ পদক্ষেপের সময় অপসারণ করা হবে। হট স্টার্ট ডিএনটিপি, ডিএ, ডিটি, ডিসি এবং ডিজি প্রাকৃতিক নিউক্লিওটাইডগুলিকে প্রতিস্থাপন করে। চারটি পরিবর্তিত নিউক্লিওটাইড ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়, তবে, পূর্ববর্তী গবেষণা দেখায় যে প্রাকৃতিক নিউক্লিওটাইডগুলির মধ্যে একটি বা দুটি পরিবর্তিত ডিএনটিপি দিয়ে প্রতিস্থাপন করা অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন যাতে না ঘটে তা নিশ্চিত করার জন্য যথেষ্ট হবে। নিউক্লিক অ্যাসিডের আরেকটি রাসায়নিক পরিবর্তন হল তাপ-বিপরীতমুখী সমযোজী পরিবর্তনের মাধ্যমে যা আগ্রহের টেমপ্লেটে প্রাইমারগুলির সংকরকরণকে বাধা দেয়। গুয়ানোসিন অ্যামিনো গ্রুপ গ্লাইঅক্সালের সাথে মিথস্ক্রিয়া করে ডিজি গঠন করে। পরিবর্তিত প্রাইমার গৌণ কাঠামোঃ কিছু গৌণ কাঠামো প্রাইমারের কার্যকারিতাকে বাধাগ্রস্ত করতে পারে। উদাহরণস্বরূপ, চুলের পিন কাঠামো সহ অলিগোনিউক্লিওটাইডগুলি প্রাইমার হিসাবে দক্ষতার সাথে কাজ করতে পারে না। যাইহোক, অ্যানিলিং তাপমাত্রায় প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি গরম করার পরে প্রাইমারটি একটি গঠন পরিবর্তনের মধ্য দিয়ে যাবে যা প্রাইমারকে পরিবর্তে একটি রৈখিক কাঠামো তৈরি করতে দেয়, যা প্রাইমারকে লক্ষ্য বিভাগের সাথে সংযুক্ত করতে এবং পিসিআর শুরু করতে সক্ষম করে। প্রকৃতপক্ষে, 'ডাবল-বাবল' প্রাইমার নামে পরিচিত হেয়ারপিন প্রাইমারগুলির আরও স্থিতিশীল বিন্যাস রয়েছে, যা হেড টু টেল হোমোডিমার বিন্যাস গঠন করে যা বিপরীত-প্রতিলিপি এবং হট-স্টার্ট পিসিআর উভয়ের জন্যই ব্যবহার করা যেতে পারে। ফটোকেমিক্যালি অপসারণযোগ্য খাঁচাঃ একটি কেজিং গ্রুপ যা একটি সুরক্ষা গোষ্ঠী যা ফটোকেমিক্যালি অপসারণযোগ্য, যেমন কেজ থাইমাইডিন ফসফোরামিডাইট, একটি অলিগোনিউক্লিওটাইড প্রাইমারের মধ্যে অন্তর্ভুক্ত করা হয়। এটি ইউভি বিকিরণ (365 এনএম) ব্যবহারের মাধ্যমে প্রাইমারের কার্যকারিতা সক্রিয় এবং নিষ্ক্রিয় করার অনুমতি দেয়। অতএব, অ্যানিলিং তাপমাত্রায় পৌঁছানোর পরে প্রাইমারগুলি সক্রিয় করা যেতে পারে। পিসিআর-এ ম্যাগনেসিয়াম ম্যাগনেসিয়ামের নিয়ন্ত্রিত সংযোজন প্রয়োজন এবং এটি একটি সহ-ফ্যাক্টর হিসাবে কাজ করে কারণ টাক পলিমারেজ ম্যাগনেসিয়াম নির্ভরশীল। স্ট্যান্ডার্ড বাফার বিকারকগুলিতে ম্যাগনেসিয়াম এবং ফসফেটের ঘনত্ব বৃদ্ধি একটি ম্যাগনেসিয়াম অবক্ষেপ তৈরি করে, যা প্রতিক্রিয়ার জন্য একটি উষ্ণ সূচনা প্রদান করে কারণ তাপীয় সাইক্লিং পর্যায়ে ডিএনএ পলিমারেজের জন্য কোনও ম্যাগনেসিয়াম নেই। তাপীয় সাইক্লিংয়ের সময়, ম্যাগনেসিয়াম আবার দ্রবণে দ্রবীভূত হবে এবং পলিমারেজকে স্বাভাবিকভাবে কাজ করার অনুমতি দেওয়ার জন্য উপলব্ধ হবে। সুবিধা হট স্টার্ট পিসিআর সুবিধাজনক কারণ এটির কম পরিচালনার প্রয়োজন হয় এবং দূষণের ঝুঁকি হ্রাস করে। হট স্টার্ট পিসিআর রাসায়নিকভাবে পরিবর্তিত বা অ্যান্টিবডি ভিত্তিক হতে পারে যা পদ্ধতির বিভিন্ন সুবিধা প্রদান করে। রাসায়নিকভাবে পরিবর্তিত হট স্টার্ট পিসিআর-এ, পদ্ধতিটি ঘরের তাপমাত্রায় নেওয়া যেতে পারে এবং পিসিআর প্রক্রিয়া শুরু হওয়ার আগে প্রাইমারগুলিকে একে অপরের সাথে আবদ্ধ হতে বাধা দেওয়ার পাশাপাশি অ-নির্দিষ্ট প্রাইমিংকে সীমাবদ্ধ করে প্রাইমার-ডাইমারগুলির গঠনকে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করে। একইভাবে, হট স্টার্ট পিসিআর টেমপ্লেট সিকোয়েন্সের সাথে প্রাইমারের বন্ধনকে বাধা দেয় যার কম সমরূপতা রয়েছে যা ভুল প্রাইমিংয়ের দিকে পরিচালিত করে। এটি কঠোর অবস্থার কারণে নির্দিষ্টতা এবং সংবেদনশীলতার উন্নতি করতে পারে, পাশাপাশি লক্ষ্যযুক্ত খণ্ডের পণ্যের ফলনও বাড়িয়ে তুলতে পারে। অ্যান্টিবডি ভিত্তিক হট স্টার্ট পিসিআর-এ, সাইক্লিং প্রক্রিয়া চলাকালীন প্রাথমিক ডিনেচুরেশন ধাপের পরে পলিমারেজ সক্রিয় হয়, তাই প্রয়োজনীয় সময় হ্রাস পায়। এটি একটি উচ্চ নির্দিষ্টতার দিকেও পরিচালিত করে। সীমাবদ্ধতার পাশাপাশি, হট স্টার্ট পিসিআর-এরও সীমাবদ্ধতা রয়েছে যা পদ্ধতিটি বাস্তবায়নের আগে অবশ্যই বিবেচনা করা উচিত। হট স্টার্ট পিসিআর-এর জন্য প্রচলিত পিসিআর-এর বিপরীতে দীর্ঘ সময়ের জন্য তাপ সংযোজন প্রয়োজন, তাই, টেমপ্লেট ডিএনএ ক্ষতিগ্রস্ত হওয়ার জন্য বেশি সংবেদনশীল। গরম করার সময় বৃদ্ধির অর্থ হ 'ল পদ্ধতিটি ওয়ান টিউব, সিঙ্গেল বাফার রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন-পিসিআর পদ্ধতির মতো নির্দিষ্ট পদ্ধতির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ নয় যার জন্য বিপরীত প্রতিলিপি পদক্ষেপের জন্য কম তাপমাত্রার প্রয়োজন হয়। রাসায়নিকভাবে পরিবর্তিত হট স্টার্ট পিসিআর-এ, ডিএনএ-র পরিবর্ধন প্রক্রিয়া নেতিবাচকভাবে প্রভাবিত হতে পারে প্রথমত পলিমারেজ সক্রিয় করার জন্য প্রয়োজনীয় পুনরায় সক্রিয়করণের সময় উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধির কারণে এবং দ্বিতীয়ত যদি লক্ষ্য ডিএনএ টেমপ্লেটের দৈর্ঘ্য খুব দীর্ঘ হয়। অ্যান্টিবডি ভিত্তিক পদ্ধতিতে, প্রতিটি এনজাইমের জন্য একটি ভিন্ন অ্যান্টিবডি প্রয়োজন এবং তাই প্রক্রিয়াটি সম্পাদনের খরচ বেশি। এছাড়াও প্রমাণ রয়েছে যে অনেক বাণিজ্যিক হট স্টার্ট এনজাইমের প্রকৃতপক্ষে বিকৃতি হওয়ার আগে কিছু স্তরের ক্রিয়াকলাপ থাকে এবং খুব কম সরবরাহকারীই এই অবশিষ্ট ক্রিয়াকলাপের জন্য পরীক্ষা সম্পর্কে কোনও তথ্য সরবরাহ করে। এর মানে হল যে হট স্টার্ট এনজাইমগুলির জন্য দায়ী সুবিধাগুলি উপলব্ধি করা যাবে না, বা সর্বোপরি ব্যাচ বা প্রস্তুতকারকের মধ্যে পরিবর্তিত হবে। তথ্যসূত্র পলিমারেজ শৃঙ্খল বিক্রিয়া