コレラ菌
このような時代背景の中で、1881年にインドで発生したコレラ（第5次パンデミック）は徐々に広がりを見せ、1883年にはエジプトに到達して流行を起こした。これに対して、ドイツ政府はコッホとガフキー()を中心にした調査団を、フランス政府はルイ・パストゥール（）の弟子にあたるエミール・ルー（）を中心とした調査団を、それぞれアレクサンドリアに派遣して、その原因究明に臨ませた。実験動物を用いてコレラ菌を分離しようとしたフランスの調査団に対し、コッホらは患者の腸管で増殖している菌を観察、分離培養することを試み、コレラ患者の糞便にコレラの原因菌と思われるコンマ型をした細菌の存在を見出した。なおフランス側の手法は成果なく終わったが、これは後に判ったことであるが、コレラ菌はヒト以外のほとんどの動物ではコレラを起こさないためであった。
コッホの原則
その後、固形培地による細菌の純培養技術の確立など、研究技術の進歩により、1876年にコッホは初めて炭疽菌の分離および純培養に成功した。さらにそれを動物に接種して炭疽を起こせること、その病巣部から再び炭疽菌が分離できることを明らかにした。これが、単なる現象論のみでなく科学的な実証実験によって病気と病原体との因果関係を証明した最初の報告である。コッホは以後、同じ方法論で結核菌やコレラ菌を発見し、ヘンレの原則はコッホの原則に取り込まれて病原体の同定法として確立されることになる。これ以降、数多くの病原体がコッホの原則に則って発見され、医学微生物学は急激な進歩を遂げた。