پیوند فسفودی‌استر
برای اینکه زنجیره‌های فسفودیستر شکل بگیرند و نوکلئوتیدها به هم متصل شوند، تری‌فسفات‌ها یا دی‌فسفات‌ها از ساختار نوکلئوتیدها در حضور آنزیم کاتالیزور شکسته می‌شود. وقتی که یک تک‌فسفات یا جفت‌فسفات (که پیروفسفات نامیده می‌شود) در واکنش کاتالیزوری بشکند، رشته‌های فسفودی‌استر شکل می‌گیرند.
توالی‌یابی
اساس این تکنیک استفاده از آنالوگ‌های شیمیایی نوکلئوتیدی بود که فاقد گروه OH بر روی کربن ′3 خود برای گسترش زنجیره DNA هستند و نمی‌توانند با ′5 فسفات بعدی خود واکنش دهند. بنابراین هنگامی که در زنجیره در حال تکثیر اسید نوکلئیک قرار گیرند واکنش متوقف خواهد شد. ترکیب ddNTPها همراه با غلظت‌های مشخص از dNTP استاندارد در واکنش سنتز دی‌ان‌ای منجر به تولید رشته‌های دی‌ان‌ای با طول‌های مختلف می‌شود (تولید رشته‌هایی که تنها در یک نوکلئوتید تفاوت طول دارند). این تکنیک نیازمند دی‌ان‌ای تک رشته‌ای به عنوان الگو است که با استفاده از فاژمیدها حاصل می‌شود. DNA تک رشته‌ای به همراه سایر مواد مورد نیاز سنتز DNA به چهار لوله آزمایش که هر کدام حاوی یک نوع باز ddNTP است انتقال داده می‌شود ddNTP به طور تصادفی توسط آنزیم دی‌ان‌ای پلیمراز به رشته در حال ساخت افزوده می‌شوند. نهایتا‌ً در هر لوله آزمایش قطعاتی با طول مختلف تولید می‌شود. قطعات تولید شده بر روی ژل پلی آکریل آمید اجرا می‌شوند و با استفاده از اتورادیوگراف بر روی ژل ظاهر می‌شوند. دقت، قدرت و سهولت در روش خاتمه زنجیره یا توالی‌یا‌بی سنگر باعث شد این تکنیک برای سال‌های متمادی مورد استفاده قرار گیرد.