پیوند فسفودی‌استر
برای اینکه زنجیره‌های فسفودیستر شکل بگیرند و نوکلئوتیدها به هم متصل شوند، تری‌فسفات‌ها یا دی‌فسفات‌ها از ساختار نوکلئوتیدها در حضور آنزیم کاتالیزور شکسته می‌شود. وقتی که یک تک‌فسفات یا جفت‌فسفات (که پیروفسفات نامیده می‌شود) در واکنش کاتالیزوری بشکند، رشته‌های فسفودی‌استر شکل می‌گیرند.
تعیین توالی به‌وسیله پیروفسفات
این کار با استفاده از مهره‌های مغناطیسی آغشته به استرپتاویدین (نوعی پروتئین) و دی‌ان‌ای-پلی‌مراز یک دی‌ان‌ای نوترکیب فاقد فعالیت اگزونوکلئاز از '۳ به '۵ (رجوع شود به سمت و سو) صورت می‌گیرد. ترکیبی از سه آنزیم دی‌ان‌ای-پلی‌مراز، سولفوری‌لاز و آنزیم لوسیفراز، و نوکلئوتید نوکلئوزید تری‌فسفات به تک‌رشتهٔ دی‌ان‌ای اضافه می‌شود تا توالی آن بدست آید و پیوستن نوکلئوتیدها بوسیلهٔ سنجش میزان تابش دریافتی توسط آن‌ها مشخص می‌شود.