Carbono-14
El método de datación por radiocarbono es la técnica basada en isótopos más fiable para conocer la edad de muestras orgánicas de menos de años. Está basado en la ley de decaimiento exponencial de los isótopos radiactivos. El isótopo carbono-14 (C) es producido de forma continua en la atmósfera como consecuencia del bombardeo de átomos de nitrógeno por rayos cósmicos. Este isótopo creado es inestable, por lo que, espontáneamente, se transmuta en nitrógeno-14 (N). Estos procesos de generación-degradación de C se encuentran prácticamente equilibrados, de manera que el isótopo se encuentra homogéneamente mezclado con los átomos no radiactivos en el dióxido de carbono de la atmósfera. El proceso de fotosíntesis incorpora el átomo radiactivo en las plantas, de manera que la proporción C/C en estas es similar a la atmosférica. Los animales incorporan, por ingestión, el carbono de las plantas. Ahora bien, tras la muerte de un organismo vivo no se incorporan nuevos átomos de C a los tejidos, y la concentración del isótopo va decreciendo conforme va transformándose en N por decaimiento radiactivo.
Vía de 4 carbonos
En investigaciones subsecuentes, Hatch y Slack iniciaron el proceso de descifrar la vía de C4. Postularon y confirmaron el rol de la PEP carboxilasa en la fijación primaria de CO, descubrieron la Piruvato, fosfato dicinasa vegetal, algo antes encontrada en bacterias, así como la malato deshidrogenasa dependiente de NADP previamente desconocida. Además, investigaron la localización de estos, así como de otras enzimas en las células del mesófilo y la vaina del fascículo. En ese momento, se pensaba que los ácidos dicarboxílicos tetracarbonados debían transferir un átomo de carbono a algún precursor. Para formar triosa fosfato en una reacción de percarboxilación. Sin embargo, más tarde, cuando se descubrió que la enzima descarboxilante NADP-málica se localiza en grandes cantidades en las células de la vaina, quedó claro que el CO entraría en el ciclo de Calvin como resultado de la re-fijación, y esta hipótesis se descartó. En 1970, Hatch y Slack, en una reunión internacional en Canberra, presentaron un esquema detallado de la fotosíntesis C4 del tipo NADP-malato deshidrogenasa, donde la audiencia sugirió que esta vía sirve para concentrar el CO en las células de la vaina. La importancia de este mecanismo de bombeo para la supresión de la actividad oxigenasa y fotorrespiración de Rubisco se hizo evidente solo en los siguientes años.