Misa del Papa Marcelo
Las sesiones tercera y de clausura del Concilio de Trento sucedieron en 1562–63, en las cuales se discutió el uso de la música polifónica en la Iglesia católica. El interés residía en dos cuestiones: primero, el uso de música inaceptable, como las canciones seculares proporcionadas con letras religiosas (contrafacta) o las misas basadas en canciones con letras sobre beber y galanteos; y segundo, si la imitación en música polifónica obscurecía las palabras de la misa, interfiriendo con la devoción del oyente. Se debatió si la polifonía tendría que ser prohibida en el culto, y algunos de las publicaciones auxiliares por asistentes del concilio advierten contra estos problemas. Aun así, ninguno de las proclamaciones oficiales del Concilio menciona la música polifónica, exceptuando un mandato contra el uso de música que era, en las palabras del Concilio, "lasciva o impura".
Polifonía del siglo XVI
El posterior auge de la polifonía, de valor excepcional por su perfección formal y por su rica inspiración, aconteció principalmente en Italia. En las escuelas romanas y venecianas, siguiendo las sendas que habían abierto los maestros flamencos que en ellas enseñaron, florecieron en el siglo XVI los grandes madrigalistas. En Venecia, al amparo de la basílica de San Marcos, se encuentra a Andrea Gabrieli (1510-1586) y a su nieto Giovanni Gabrieli (1557-1612); en Roma, en los medios de la corte pontificia y de la "Schola Cantorum" de San Pedro, al sin par Giovanni Pierluigi da Palestrina (1525-1594), autor de madrigales profanos y religiosos, y de casi un centenar de misas.