Spectroscopie de fluorescence
La spectroscopie de fluorescence est une technique courante d'analyse en chimie organique et biochimie. Elle est également utilisée depuis quelques années dans le domaine du traitement de l'eau pour suivre le traitement des eaux potables et des eaux usées. En effet, la présence de matière organique portant des fluorophores permet d'obtenir des spectres 3D (Longueur d'onde d'excitation - Longueur d'onde d'émission - intensité de fluorescence) qui permet de caractériser la qualité d'une eau.
Perte de fluorescence induite par photoblanchiment
Avant que le photoblanchiment puisse avoir lieu, on doit injecter une protéine fluorescente dans les cellules (on utilise généralement une GFP), ce qui va permettre aux protéines ciblées d'émettre de la fluorescence et ainsi de pouvoir les suivre au cours du processus. Ensuite, on doit définir une région d'intérêt ; cette région d'intérêt initiale contient généralement la cellule en entier ou bien plusieurs cellules. En FLIP, le photoblanchiment a lieu juste en dehors de cette région d'intérêt, c'est pourquoi une région de photoblanchiment doit également être définie. On doit enfin déterminer une troisième région, celle où la mesure se fera. Un certain nombre de balayages initiaux doit être fait afin de d'identifier la fluorescence avant le photoblanchiment. Ces balayages serviront de contrôles auxquels on comparera les balayages photoblanchis. À la suite de cela, le photoblanchiment peut enfin avoir lieu. Entre chaque "pulse" de blanchiment, il est nécessaire de laisser du temps au matériel fluorescent pour revenir à son état initial. Il est également important de prendre plusieurs balayages de la région d'intérêt immédiatement après chaque pulse de blanchiment pour étude complémentaire approfondie. Le changement du niveau de fluorescence dans la région d'intérêt peut ensuite être quantifié de trois façons différentes. La plus commune est de choisir l'emplacement, la taille et le nombre de régions d'intérêt en se basant sur une inspection visuelle des groupes d'images à disposition. Les deux autres, plus récentes mais plus fiables, consistent soit à détecter des zones de mobilité de sonde différente sur base d'image individuelle, soit à modéliser physiquement la perte de fluorescence des corps en mouvement.