スペインによるアメリカ大陸の植民地化
パナマ地峡には16世紀初頭にやクリストファー・コロンブスが訪れていた。は1508年に（、パナマ）を与えられると、1510年にとを建設。1513年にバスコ・ヌーニェス・デ・バルボアの探検により、太平洋が「発見」された。パナマには総督府が置かれ、1519年にによってシウダー・デ・パナマが建設された。
1517年にフランシスコ・エルナンデス・デ・コルドバはユカタン半島にマヤ文明を発見し、翌年にはフアン・デ・グリハルバがメキシコを探検しアステカ文明（メキシコ）を発見した。
メキシコシティ
1519年にスペイン人のエルナン・コルテス (Hernán Cortés) のメキシコ征服によりテノチティトランは破壊され、その上に現在のヨーロッパ（スペイン）風の都市としてメキシコシティが築かれた。16世紀にはテスココ湖の干拓が行われ、湖はメキシコシティの東部にのみ残ることとなった。1535年にはヌエバ・エスパーニャ副王領が創設されてメキシコシティはその首都となり、北アメリカ大陸南部からカリブ海にかけてを管轄することとなった。この時代にはソカロ広場を中心として現在のメキシコシティの中心部が形成された。1551年9月21日には現在のメキシコ国立自治大学の前身である王立メキシコ大学が新大陸で2番目に古い大学として創設された。スペインの植民地時代を通じてメキシコシティは成長を続け、18世紀には人口は10万人に達した。