徳川慶勝
その年、池田屋事件が発生し、これに憤慨した長州藩が京都の軍事的奪回を図るため禁門の変（蛤御門の変）を引き起こす。しかし、これに失敗して長州藩は朝敵となり、幕府が長州征伐（第一次長州征討）を行うこととなる。征討軍総督には初め紀州藩主・徳川茂承が任じられたが慶勝に変更され、慶勝は薩摩藩士・西郷吉之助を大参謀として出征した。この長州征伐では長州藩が恭順したため、慶勝は寛大な措置を取って京へ凱旋した。しかしその後、長州藩は再び勤王派が主導権を握ったため、第二次長州征討が決定する。慶勝は再征に反対し、茂徳の征長総督就任を拒否させ、上洛して御所警衛の任に就いた。長州藩は秘密裏に薩摩藩と同盟を結んでおり（薩長同盟）、幕府軍を藩境の各地で破った。
長州征討
大政委任を確認した元治国是は長州処分を幕府の専権事項に含んだが、朝廷も国事に関して幕府諸藩へ命令を出すことができるとした。朝廷、幕府、諸藩のパワーバランスの上に成り立つ体制下では大政委任が空文化する恐れもあり、一橋慶喜、会津藩主兼京都守護職松平容保は大奥や保守派大名の影響力が大きい江戸城から将軍徳川家茂を引き離し、畿内長期滞在態勢で公武一和を推進しようとした。しかし幕閣は第一次長州征伐の後フランスの後押しもあり強硬な姿勢をとり、朝廷からの再三の上洛要請も遷延策で無視をした。長州処分も諸藩を動員し長門周防を取り囲めば藩主父子は自ら出頭してくるとの見込みであり、最終処分案は慶応2年（1866年）1月21日まで決まらないまま事態は推移した。