Kanon Alkitab
Pada awal abad ke-3, teolog Kristen seperti Origen dari Aleksandria mungkin telah menggunakan (atau setidaknya telah akrab dengan) 27 kitab yang sama dengan yang terdapat dalam edisi-edisi Perjanjian Baru modern, meskipun masih ada pertentangan atas kanonisitas beberapa tulisan tersebut (lihat pula Antilegomena). Demikian pula dari sekitar abad ke-2, fragmen Muratori menunjukkan bahwa ada satu set tulisan-tulisan Kristen yang agak mirip dengan apa yang sekarang menjadi Perjanjian Baru, yang mana mencakup keempat Injil dan menentang keberatan atasnya. Jadi, sementara ada suatu ukuran yang baik tentang perdebatan dalam Gereja perdana atas kanon Perjanjian Baru, tulisan-tulisan penting tersebut telah diterima oleh hampir semua kalangan Kristen pada pertengahan abad ke-3.
Kodeks Vaticanus
Naskah ini dalam volume , disusun dalam lima lembaran besar atau masing-masing sepuluh lembar, mirip dengan Codex Marchalianus atau Codex Rossanensis; tetapi tidak seperti Codex Sinaiticus yang pengaturannya terdiri dari tiga atau empat lembaran besar. Secara keseluruhan terdiri dari suatu volume kuarto tunggal dengan 759 lembaran halus dan rapuh. Jumlah "quire" sering ditemukan pada marjin.
Asalnya diperkirakan terdiri dari 830 lembaran perkamen, tetapi tampaknya 71 lembaran telah hilang. Yang terlestarikan sekarang adalah Perjanjian Lama, terdiri dari 617 lembaran, dan Perjanjian Baru, 142 lembaran. Kertas perkamen halus dan tipis. Ukuran halaman adalah ; meskipun aslinya dapat saja lebih besar. Kodeks ini ditulis dalam tiga kolom per halaman, dengan 40–44 baris per halaman, dan 16–18 huruf per baris. Dalam kitab-kitab puisi Perjanjian Lama, hanya ada dua kolom per halaman. Dalam Taurat, Yosua, Hakim-hakim, Rut, dan Kitab 1 Raja-raja 1:1–19:11 ada 44 baris per kolom; dalam Kitab 2 Tawarikh 10:16–26:13 ada 40 baris per kolom; dan dalam Perjanjian Baru selalu 42 baris per kolom.
Naskah ini adalah salah satu dari sangat sedikit naskah Perjanjian Baru yang ditulis dalam tiga kolom per halaman, yaitu selain Uncial 048 dan Uncial 053.