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Timofey N. Komarov, Igor E. Shohin, Margarita A. Tokareva, Olga A. Archakova, Dana S. Bogdanova, Alexandra A. Aleshina, Natalia S. Bagaeva, Veronika V. Davydanova – Center of Pharmaceutical Analytics LLC, 117246, Russia, Moscow
Die Entwicklung neuer Medikamente erfordert auch, neue analytische Methoden zu finden, um Therapien zu überwachen sowie den Weg eines Arzneimittels zu kontrollieren, wie es in den Körper gelangt, dort aufgenommen und verdaut wird, die so genannte Pharmakokinetik. Die Methoden müssen arbeits- und kosteneffizient sein. Dabei kommt es auch auf das Zusammenspiel der einzelnen Komponenten eines Analysesystems an, also etwa dem Chromatograph und der optimalen Säule.
Die HPLC mit zahlreichen Nachweismethoden wird wirksam eingesetzt, um den Arzneimittelgehalt in biologischen Flüssigkeiten zu bestimmen. Eine der schwierigsten Aufgaben in der Praxis ist die chromatographische Trennung von unzureichend zurückgehaltenen Verbindungen, wie es etwa bei Arzneimittelwirkstoffen auf einer Chromatographiesäule der Fall ist. Valganciclovir und Ganciclovir sind Beispiele für derartige Wirkstoffe; beide werden gegen Herpesviren eingesetzt – Ganciclovir als Infusion und Valganciclovir in verschiedener Darreichungsform.
Die HPLC als moderne Analysetechnik ist weit verbreitet zur Bestimmung des Medikamentengehalts in biologischen Flüssigkeiten. Abhängig von den chromatographischen Bedingungen und dem verwendeten Detektor ist es möglich, Substanzen mit unterschiedlichen Eigenschaften zu trennen und zu identifizieren – insbesondere auch Substanzen mit ähnlicher Struktur.
Eine der herausforderndsten Aufgaben in der Praxis ist es, Arzneimittel aufzutrennen, die auf einer klassischen RP-Chromatographiesäule wenig zurückgehalten werden. Zahlreiche chromatographische Verfahren lassen sich für diesen Zweck einsetzen, wie HILIC (hydrophile Interaktions-Chromatographie) und Ionenaustausch-Säulen oder Ionenpaar-Reagenzien als Elutionsmittel. Diese Herangehensweisen können sich aber als ineffektiv erweisen, wenn ein Massenspektrometer als Detektor genutzt wird, oder wenn die Arzneimittelmessungen in komplexen biologischen Matrizes erfolgen. Der Fall Valganciclovir (VAL, Abbildung 1) und Ganciclovir (GAN, Abbildung 2) verdeutlicht diese Situation.
Abbildung 1: Chemische Struktur von Valganciclovir
Ursprünglich als Medikament zur Behandlung einer Zytomegalievirus-Infektion entwickelt, wurde bald entdeckt, dass Ganciclovir in vitro andere Herpesviren hemmen konnte (menschliche Herpesviren vom Typ 1 und 2, Epstein-Barr-Viren, Windpockenviren, menschliches Herpesvirus Typ 6 etc.). [1] Normalerweise wurde Ganciclovir intravenös nur im Verlauf der Therapie verabreicht. Mit dem neuen Vorläufermedikament namens Valganciclovir gelang es, die Bioverfügbarkeit zu steigern. Valganciclovir metabolisiert leicht zu Ganciclovir, das dann therapeutisch wirksam wird. [2, 3]
Tabelle 1: Log P und pKa für Valganciclovir, Ganciclovir und Acyclovir
Diese Eigenschaften müssen bei der Entwicklung einer Analysemethode inklusive Probenaufbereitung und Trenntechnik berücksichtigt werden.
Die bisherigen Analyseverfahren nutzten die HPLC mit UV-Detektion [7, 8, 9] und mit einem Massenspektrometer gekoppelt. [10] Beide Verfahren waren nicht in der Lage, Valganciclovir und Ganciclovir simultan zu messen, sondern jeweils nur eine der Verbindungen.
Optimale Trennung der Substanzen mit MS-Nachweis
Ein UHPLC Nexera XR gekoppelt mit einem LCMS-8040-Tandemmassenspektrometer (beide von Shimadzu) wurden verwendet. Methanol (UHPLC-Grade) wurde von J. T. Backer bezogen, Acetonitril (LCMS-Grade) von Biosolve, Ameisensäure (rein 98 %) und wässrige Ammoniaklösung (Grade „für Analyse“) von PanReac. Deionisiertes Wasser wurde über ein „Milli-Q“-System von Millipore hergestellt. Valganciclovirhydrochlorid (USP Referenzstandard, 99,2 %), Ganciclovir (USP Referenzstandard, 97,5 %) und als interner Standard Acyclovir (ACI; USP Referenzstandard, 94,6 %) wurden eingesetzt, um Stammlösungen durch Auflösen in Methanol anzusetzen. Gemischte GAN- und VAL-Arbeitslösungen und eine ACI-Arbeitslösung wurden durch Verdünnung der Stammlösungen auf die benötigten Plasmakonzentrationen (Tabelle 2) mit gleichem Lösungsmittel hergestellt. Stamm- und Arbeitslösungen sowie intakte Blutplasmaproben wurden bis zur Verwendung tiefgekühlt bei -45 oC aufbewahrt.
Tabelle 2: Konzentrationen der Zielsubstanzen für Kalibtrationsniveaus
10 ul Acyclovir-Arbeitslösung wurden zu 200 ul einer Kalibrationsprobe in ein 2 ml Eppendorf Zentrifugenröhrchen zugefügt, anschließend 600 ul Acetonitril zugegeben, für 10 Sekunden gevortext, dann 15 min lang bei 13.500 rpm zentrifugiert. Der sich ergebende Überstand wurde in Fläschchen überführt und in einen Autosampler gegeben.
Shim-Pack GWS C18 (5 µm; 150 x 4,6 mm)
0,1 % Ameisensäure in Wasser mit 0,08 % Ammoniak (v/v)
0,1 % Ameisensäure, 10 % Wasser in Acetonitril mit
0,08 % Ammoniak (v/v)
Der Gradient ist aus Tabelle 3 ersichtlich
Mobile Phase A, %
Mobile Phase B, %
355,20 m/z → 152,05 m/z
255,80 m/z → 152,00 m/z; 255,80 m/z → 134,90 m/z
226,00 m/z → 152,00 m/z; 226,00 m/z → 134,95 m/z
0,00 – 7,00 min
Eine chromatographische Trennmethode für Valganciclovir und Ganciclovir zu entwickeln, ist aufgrund ihrer geringen Retention auf „klassischen“ Octadecyl-Säulen eine Herausforderung. Ein Einsatz von Säulen mit Aminogruppen lieferte keine gute Retention und keine korrekte Trennung von VAL und GAL. Eine Idee bestand darin, C18-Säulen mit unterschiedlichem Gesamtkohlenstoffgehalt (Tabelle 4) zu testen.
Die besten Ergebnisse wurden mit einer Shim-Pack GWS-Säule mit geringstem Gesamtkohlenstoffgehalt erzielt. Trotz der unwesentlichen Retention von Valganciclovir und Ganciclovir auf dieser Säule, waren die chromatographischen-Peaks vom Totvolumen getrennt, und die Methode erfüllte die regulatorischen Anforderungen für eine Validierung, einschließlich der „Selektivitäts“-Parameter.
Die Methode wurde validiert gemäß Richtlinien zur Arzneimittelprüfungen [12] sowie der FDA- [13] und EMA-Richtlinien [14] für folgende Parameter: Selektivität, Matrixeffekt, Kalibrationskurve, Genauigkeit und Präzision, Rückgewinnung, untere Quantifizierungsgrenze, Verschleppung und Stabilität.
Sechs intakte, aus unterschiedlichen Quellen gezogene Plasmaproben ebenso wie intakte Plasmaproben wurden getestet; sie waren mit Arbeitslösungen von Valganciclovir und Ganciclovir (5 bzw. 50 ng/ml) versetzt. Zusätzlich wurden intakte Plasmaproben mit Hämolyse und Proben mit erhöhtem Lipidgehalt analysiert. Im Falle von plasma-freien Chromatogrammen (Abbildung 3) überschritt die Intensität der Peaks mit der gleichen Retentionszeit wie die Zielsubstanzen keine 20 % des Signals bei der LLOQ (Lower Limit Of Quantification) und 5 % des internen Standardsignals.
Abbildung 3: Chromatogramm Plasma-Leerprobe
50 × 2 mm, 5 µm
Phenomenex Luna NH2 50 × 3 mm, 5 µm
50 × 4,6 mm, 3,5 µm
100 × 2 mm, 3 µm
150 × 4,6 mm, 5 µm
Tabelle 4: Einige Eigenschaften der in dieser Studie eingesetzten Chromatographie-Säulen
Proben mit Zugabe von Arbeitslösungen von Valganciclovir, Ganciclovir und Acyclovir ebenso wie dotierte Plasmaproben wurden untersucht, um einen Matrixeffekt abzuschätzen. Der Matrixeffekt wurde für niedrige (L) und hohe (H) Konzentrationsniveaus (siehe Tabelle 2) von Valganciclovir und Ganciclovir und für eine Konzentration von 1.000 ng/ml Acyclovir bewertet. Die Ergebnisse zeigen Tabelle 5 und 6.
Mf von GAL (Level L)
Mf von ACI (Level L)
Normalisierter Mf (Level L)
Mf von GAL (Level H)
Mf von ACI (Level H)
Normalisierter Mf (Level H)
Tabelle 5: Der Matrixfaktor der Valganciclovir-Berechnungen, normalisiert mit dem IS-Matrixfaktor
Mf von GAL (Level L)
Mf von ACI (Level L)
Normalisierter Mf (Level L)
Mf von GAL (Level H)
Mf von ACI (Level H)
Normalisierter Mf (Level H)
Tabelle 6: Der Matrixfaktor der Ganciclovir-Berechnungen, normalisiert mit dem IS-Matrixfaktor
Neun intakte Plasmaproben, versetzt mit Acyclovir, Valganciclovir und Ganciclovir entsprechend der Konzentrationsniveaus 1-9 (siehe Tabelle 2) wurden analysiert, um eine Kalibration zu erzeugen. Die Kurven für Valganciclovir (Peakflächenverhältnis zu Konzentrationsverhältnis) und Ganciclovir (gleiche Koordinaten) werden in Abbildung 5 bzw. 6 gezeigt. Die ermittelten Korrelationskoeffizienten entsprechen den Bestimmungen (> 0,99). Ein Chromatogramm der Probe mit der Konzentrationsstufe 9 ist in Abbildung 4 zu sehen.
Abbildung 5: Die Kalibrationskurve mit Wiedergabe der Abhängigkeit des Peakflächen-Verhältnisses von Valganciclovir zu Acyclovir gegenüber dem Konzentrationsverhältnis von Valganciclovir zu dem Acyclovir im Plasma
Abbildung 6: Die Kalibrationskurve mit Wiedergabe der Abhängigkeit des Peakflächen-Verhältnisses von Ganciclovir zu Acyclovir gegenüber dem Konzentrationsverhältnis von Ganciclovir zu dem Acyclovir im Plasma
Abbildung 4: Chromatogramm einer Plasmaprobe der Stufe 9
Abbildung 7: Chromatogramm der LLOQ-Plasmaprobe
Versetzte Plasmaproben bei LLOQ-, hohen, mittleren und niedrigen Konzentrationsniveaus ( siehe Tabelle 2) wurden betrachtet, um Genauigkeit und Präzision der entwickelten Methode abzuschätzen. Fünf unterschiedliche Proben für jede Konzentrationsstufe wurden anhand einer dreifachen Injektion geprüft. Genauigkeit und Präzision wurden innerhalb eines Laufs und unter den Läufen (zwei und drei Läufe) untersucht; Daten zeigt Tabelle 7. Die erhaltenen Werte der relativen Standardabweichung (Präzision) und der relative Fehler (Genauigkeit) entsprechen den Bestimmungen (nicht mehr als 20 % am LLOQ-Niveau, nicht mehr als 15 % bei anderen Niveaus).
Tabelle 7: Genauigkeit und Präzision des Verfahrens
Drei versetzte Plasmaproben bei niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationsbereichen ebenso wie QC-Proben wurden für die Abschätzung der Rückgewinnungsrate getestet. Und zusätzlich die Plasmaproben mit Hämolyse und erhöhtem Lipidgehalt überprüft. Erzielte Ergebnisse zeigt Tabelle 8. Entsprechend der Bestimmungen sollte eine Rückgewinnung 100 % nicht erreichen. Es ist jedoch notwendig, eine effiziente und reproduzierbare Extraktion von Zielsubstanzen aus biologischen Matrizes sicherzustellen. RSD des Rückgewinnungswerts sollte 15 % nicht überschreiten.
Rückgewinnung (Level L), %
Rückgewinnung (Level M), %
Rückgewinnung (Level H), %
Tabelle 8: Berechnung der Valganciclovir- und Ganciclovir-Rückgewinnung bei L-, M-, H-Niveaus aus unterschiedlichen biologischen Matrizes
Das LLOQ-Level wurde basierend auf Linearitäts-, Genauigkeits- und Präzisionsdaten bestimmt. Die minimalen Valganciclovir- und Ganciclovir-Konzentrationen im Plasma, für die es möglich ist, VAL und GAL mit RSD- und E-Werten von nicht mehr als 20 % zu quantifizieren, wurden für die Methode als LLOQ festgelegt. Der LLOQ betrug 5,00 ng/ml für Valganciclovir und 50,00 ng/ml für Ganciclovir. Chromatogramme von in Plasma enthaltenem VAL und GAL am LLOQ-Niveau sind in Abbildung 7 wiedergegeben. Die Nachweisgrenze von Valganciclovir lag bei etwa 0,93 ng/ml und die von Ganciclovir bei etwa 0,73 ng/ml (Signal/Rauschverhältnis ca. 3:1).
Die kurzzeitige Stabilität der aufbereiteten Proben (Autosampler- und Bench-Top-Stabilität) wurde bei niedrigen und höheren Konzentrationsniveaus bestätigt, ebenso die Lösungsstabilität der Zielsubstanzen anhand von drei Frost-Auftau-Zyklen sowie ihre Langzeitstabilität (Aufbewahrung für 30 und 59 Tage bei einer Temperatur von -45 °C).
Es gab keine Peaks mit einer Retention der Zielsubstanzen im Chromatogramm, wenn Plasma-Leerproben nach den Kalibrationsproben mit den höchsten Konzentrationen von Valganciclovir und Ganciclovir analysiert wurden.
Eine LC-MS/MS-Methode zur Bestimmung von Valganciclovir und Ganciclovir in menschlichem Plasma wurde entwickelt und validiert. Geprüfte Konzentrationsbereiche im Plasma lagen bei 5-1.000 ng/ml für Valganciclovir und 50-10.000 ng/ml für Ganciclovir. Dies erlaubt es, die Methode für pharmakokinetische Untersuchungen sowie für die therapeutische Arzneimittelüberwachung einzusetzen.
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