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The Study on toxicity and biological activities of Aconiti ciliare tuber Pharmacopuncture in Rats 초오 약침 개발을 위한 백서 독성 연구 및 생리활성에 대한 연구
Author: Lee Sangkwan, Ahn Seong-Hun, Kim Sungha, Song Bong-Keun, Kim Sungchul
Publish: Journal of Pharmacopuncture Volume 14, Issue1, p25~33, 30 March 2011
We investigate toxicity of Aconiti ciliare tuber and antioxidant activity of Aconiti ciliare tuber Pharmacopuncture to develop safe Aconiti ciliare tuber Pharmacopuncture and find out the effect.
In order to investigate toxicity of Aconiti ciliare tuberm, we administered Aconiti ciliare tuberm orally to rats and examined the survival rate, comparing with the survival rate of rats administered by Radix aconitum simmered with Semen Glycine and Radix Glycyrrhizae. We examined the in vitro biological activity of Aconiti ciliare tuber Pharmacopuncture, including the total polyphenol content, and ABTS radical scavenging.
Aconiti ciliare tuber , Pharmacopuncture , toxicity test , antioxidant activity , biological activity
草烏는 미나리아재비과에 속한 다년생 초본인 야생종의 바꽃 및 동속 근연식물의 塊根이고 附子는 재배종 바꽃의 괴근에 부생한 子根이다1). 약재의 형태와 재배산지에 따라서 용어가 다르게 쓰였는데 직접 재배한 것을 川烏라고 하고 야생은 초오라 하며, 烏頭는 부자의 母根이고 부자는 側根인 子根으로 나뉘나 현실적으로 천오와 초오에 대해 명확한 구별을 하지 못하고 있으며1) 실험적으로 모근과 자근의 성분 분포나 약리효능이 크게 차이가 나지 않아 현재 시중에는 오두와 부자 또한 구분 없이 사용되고 있다.
한의학적으로 초오는 溫裏祛寒의 약재로 性이 大熱, 有毒하고 味가 大辛하다. 초오의 歸經은 肝, 胃, 肺經이고 附子는 心, 脾, 腎經이나 그 효능은 回陽救逆, 去風濕, 散寒止痛으로 유사하다1). 초오의 성분은 alkaloid가 약 0.5% 함유되어 있고 aconitine 계열의 hypaconitine, acotinine, mesaconitine, talatisamine 등이 함유되어 있으며, atisine 계열의 atisine, songorine, kobusine, ignavine, napilline 등이 있다2).
초오의 mesaconitine, hypaconitine 등의 diester ditenpene alkaloids(DDA)는 신경근육접합부에서 아세틸콜린이 결합해야할 수용체와 결합하여 호흡근 마비가 발생하고 대표적인 독성성분인 aconitine은 심근세포의 Na+-Ca+교환을 통해 세포내 Ca2+를 증가시켜 심방과 심실의 전도저하를 초래하여 부정맥을 발생시키고3-4), 과량복용하면 심실 이소성박동, 심실빈박, 심실세동 등이 발생하므로 방실간 전도장애를 수반하는 심장질환에 사용하지 않으며 간독성이 있어 간장 질환자, 임산부에게는 사용을 금해야 한다5).
초오의 수치에 있어서는 전통적인 가온법과 현대적인 가압가습열법이 있으며 4시간 정도 탕전하면 alkaloids의 함량이 53~73% 소실되고 5시간 탕전했을 때는 1/58로 독성이 감소한다는 보고가 있다6).
이번 실험연구에서 법제를 통해 안전한 초오 약침을 개발하기 위해 乾草烏와 附子?(黑順片)를 경구투여한 후 백서의 치사량과 LD50을 조사한 후 5시간의 탕전과정과 보료(감초, 흑두)를 첨가해서 만든 법제 초오환을 원료로 해서 대한약침학회 무균실에서 수증기 증류법으로 법제초오 약침을 만들어 유효성을 가늠할 수 있는 백서의 생리활성도를 관찰하여 보고하는 바이다.
This study was supported by Korean Pharmacopuncture Institute(KPI-10-04).
Ⅱ. 재료 및 방법
실험동물로는 다물사이언스(대전, 한국)에서 구입한 수컷과 암컷 동수 ICR mice (36주령, 25-35g)가 사용되었다. 모든 동물들은 실험동물 사용에 대한 국제기준에 따라서 사육되었으며 모든 실험은 원광대학교 동물 윤리 위원회와 실험동물의 관리와 이용에 관한 NIH 가이드라인에 따라 수행되었다. 동물은 온도 22±1℃, 상대습도 55±10%의 조건에서 12시간 주기로 주야를 바꿔주면서 한 케이지에 3-4마리씩 soft bedding으로 사육하였다. 동물들은 실험 시작하기 전 적어도 2주일 동안 이러한 환경에서 적응하면서 사육되었다. 실험하기 전 및 실험 기간에 동물들은 사료와 물을 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다.
2. 법제 초오 약침 조제
법제 초오 약침은 대한약침학회 연구실 무균실(Clean Room)에서 수증기 증류법으로 제조하였다.(Fig. 1.)
500g의 법제 해독 초오환(5시간의 전탕과 감초와 흑두를 보료로 사용) 약재를 잘 우러날 수 있도록 작은 크기로 분쇄하여 채반에 담아 ultra pure water (3차증류수기)에 세척한다.
반응조 하부에 약재를 넣고 약재의 부피를 고려하여 3차 증류수를 부어서 impellar, 반응 조하부, 반응조상부 냉각관(환류, 증류), 분액 여두를 설치하고, controller를 setting한 뒤 약 80-90분 동안 약재를 불린다.
약재의 불림이 끝나면 105℃로 120분간 전탕한다.
전탕이 끝나면 호스의 위치를 증류 냉각관 쪽으로 바꿔주어서 흐르게 하면 냉각수 순환위치가 바뀜에 따라서 반응 조 내부에서만 순환하던 기체가 냉각수에 의해 액체화 되어, 분액여두로 한 방울씩 받아지게 된다.
5) 무기 염류의 침강
추출이 끝나 받아진 약침액은 무기염류를 침강시키기 위해서 하루 동안 냉장 보관한다.
6) 등장액 및 pH조절
무기염류를 침강시킨 약침을 상층액을 분리하여 얻어낸다. 추출물을 pH7.25~7.35 가 되게 조절하고, 약전소금(NaCl)을 첨가하여 0.9% 등장액이 되게 한다.
filter장치를 준비하고 여과지를 깔아서 음압을 이용하여 0.1㎛까지 여과 한다.
8) 소분 및 멸균
멸균된 20CC vial병에 여과된 팔강약침을 자동분주기로 10CC 바이엘 병에 넣은 후 capping 한 다음 고압증기멸균기에 넣어 30분간 고압 멸균한다. 조제된 법제 해독 초오 약침액은 냉장보관해서 사용한다.
3. 재료 및 시약
두 번째 항산화 실험 연구는 대한약침학회에서 조제한 법제 해독 초오 약침을 사용하였다.
Naringin, Aluminum Chloride, sodium carbonate, gallic acid, Folin-Ciocalteu's phenol reagent, potassium persulfate, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2‘-azino-bis -3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid(ABTS), 2,2-‘Azobis(2- methylpropion -amidine) dihydrochloride, Trolox, pyrogallol, ascorbic acid, sodium nitrite, citrate buffer, acetic acid, naphty-lamine, Tris-base, dimethyl sulfoxide (DMSO) 등은 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, sulfanilic acid는 1급 시약(Kanto chemical, Japan)을 사용하였다.
1) 건초오와 부자 흑순편과의 독성 비교실험
실험용 쥐는 각각 10마리씩 무작위로 세 군으로 분류되었다. 첫 번째 군은 대조군으로 생리식염수만 주입하였고, 두 번째 군은 초오탕(전남생약협동조합 공급)을 구강으로 투입한 군이며 세 번째 군은 감두탕으로 법제한 부자 흑순편(黑順片, 동경종합상사 공급)을 24시간 간격으로 매일 15일 동안 구강투여한 군이다. 단기간의 생존을 관찰하기 위해 하루에 2g/kg의 용량을 투약하고 24시간동안 주의 깊게 관찰하였다. 만일 동물들이 살아있다면 매일 2g/kg씩 증량하면서 15g/kg까지 도달하도록 까지 투약하였다. 모든 동물들은 장시간 생존을 확인하기 위해 15일간 관찰을 지속하였다.
2) 총 페놀 함량 측정
초오 약침의 총 폴리페놀 함량은 Dewanto7)의 방법에 따라 Folin-ciacalteu rearent가 초오 약침의 폴리페놀 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다. 초오 약침액 시료 100㎕에 Folin-Ciocalteau's phenol regent 100㎕을 넣고 혼합하여 실온에서 3분간 정치한 뒤 2% Na2CO3 용액 100㎕을 가하여 혼합 한 후 실온에서 1시간 방치시키고 750nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀함량을 정량분석하기 위해 표준물질인 gallic acid를 증류수에 녹여 일정한 농도별로 조제하고 시료와 동일한 방법으로 실험하여 검량선을 작성하고 시료의 총 페놀 함량을 측정하였다.
3) ABTS radical 소거능 측정
ABTS radical을 이용한 항산화능의 측정은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성되는 ABTS free radical이 샘플 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 Venden Berg8) 등의 방법을 변형하여 측정하였다.
1mM의 AAPH는 100mM의 PBS buffer에 녹인 2.5mM의 ABTS와 혼합한 후 68℃의 항온수조에서 30분간 반응 시켰다. ABTS 용액의 농도는 734nm에서 흡광도가 0.8±0.1 정도가 되도록 조정하였다. 농도별로 희석한 초오 약침액의 시료 20㎕와 980㎕ ABTS 용액을 37℃ water bath에서 15분간 반응시킨 후 734nm에서 감소하는 흡광도의 정도를 측정하였으며 이때 양성대조군은 Trolox 100㎍/㎖을 사용하였다.
ABTS radical 소거능은 다음과 같이 측정하였다.
ABTS scavenging ability (%) =
시료 처리군 흡광도 / 무처리군 흡광도 × 100
통계분석검사는 건초오와 부자흑순편 감두탕의 실험에서 LD50 값은 GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA)의 통계적인 방법을 통해 수행하였다. 생리활성에 관한 실험연구에서 데이터는 Mean±SEM으로 나타내었으며 p값이 0.05보다 작으면 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.
1) 건초오와 부자 흑순편과의 독성 비교실험
감초와 흑두를 보료인 감두탕으로 법제한 부자 흑순편의 LD50은 9.0g/kg이 구해졌으나 오히려 건초오탕은 치사량이 더 낮아서 LD50은 15g/kg까지 나타나지 않아 그 이상으로 추정되었다(Fig. 2).
2) 총 폴리페놀 함량 측정
해독 초오 약침의 총 페놀 함량을 측정한 바는 Table.1과 같다. 해독 초오 약침의 폴리페놀 함량은 초오 약침액의 농도 별 500㎕/㎖, 1㎖/㎖, 초오 약침액 원액 순으로 0.03㎎/L, 0.53 ㎎/L, 2.31㎎/L로 나타났다.
3) ABTS radical 소거능 측정
해독 초오 약침액의 ABTS free radical 소거활성을 측정한 결과는 Fig. 3과 같다.
ABTS free radical 소거활성 법에서 표준물질로 사용되는 trolox는 100㎍/㎖에서 90.2% 의 소거능을 보여 Rice-Evans9) 등, Kim10) 등의 결과와 일치하였고, 해독 초오 약침액 농도별에 따른 소거 활성은 각각의 농도 250㎕/㎖, 500㎕/㎖, 1㎖/㎖, 초오 약침액 원액에서 1.45%, 2.35%, 3.15%, 10.26%로 농도 의존적으로 나타났다.
IV. 고찰 및 결론
초오는 回陽補火, 散寒除濕 등의 효능이 있어 陰盛格陽, 心腹冷痛, 脾泄冷利, 脚氣水腫, 風寒濕痺, 陰疽瘡漏, 沈寒痼冷 등에 활용된다11).
초오의 성분은 diterpene계의 alkaloid인 aconitine, mesaconitine, hypaconitine, jesaconitine 등은 독성이 강하지만 진통효과가 있으며, 비 alcaloid 성분인 higenamine과 coryneine은 강심작용을 한다12). 그 밖에 약리작용으로는 체온상승, 말초 혈액순환 개선, 항염효과가 있다고 알려져 있다13-14).
부자에 대한 실험연구로는 주15) 등은 부자의 진통, 소염작용에 대한 실험적 보고를, 주16) 등은 부자를 경구 투여하여 궤양시 진통 작용이 뛰어남을 보고하였고, 양17) 등은 부자, 건강 및 육계 등의 온열 약을 배합하여 심율, 동정주기, TSH측정 및 LH측정 등을 통하여 자율신경계와 뇌하수체, 부신, 성선 및 갑상선 등에 영향이 있음을 보고하였다.
정18) 등은 흰쥐의 足蹠에 adjuvant 관절염을 유발하여 부자약침을 자침하고 부종, 혈장 내 serotonin, 백혈구, 적혈구, 혈색소 등을 관찰하여 유의한 결과를 보고하였으며, 이19) 등은 흰쥐의 척수에 직접 손상을 가하여 족삼리에 부자약침을 투여하고 간독성 및 행동결과를 관찰하여 실험군에서 약간 빠른 운동회복성을 보고하였으나, 간독성검사에서 유의한 ALT, ALP, AST 상승을 보고하였다.
정20) 등은 2형 당뇨모델 생쥐에서 부자약침 투여군이 혈당을 의미 있게 감소시켰으며, 인슐린 분비세포의 면역반응 역시 증가하였다고 보고하였다.
이5) 등은 부자약침이 정상 흰쥐의 체중감소를 유발하며, 혈청 total cholestesterol, HDL-cholesterol, triglyceride의 감소를 가져오며, 간독성 검사에서 AST와 ALT의 수치 증가가 관찰되었다고 보고하였다.
부자와 초오는 한의학적 문헌고찰을 통해서 임상 효능 면에서는 별 차이가 없게 기록되었으나 실험연구를 통해서 독성은 초오가 부자보다 더 강한 것으로 나타났다21).
초오와 부자를 임상에서 응용할 때는 일반적으로 陽虛인 전신기능쇠약증에 사용하는데, 脈沈遲 · 無力 · 細弱, 畏寒 · 四肢不溫 · 腰膝酸軟, 尿量過多· 陽虛泄瀉, 面色蒼白·唇色淡白·多涎 · 舌苔白?·舌質?大, 그 밖에 下肢浮腫 · 嗜眠 · 自汗 · 陽? 등에 사용한다5). 陰證의 水腫(陰水)에 사용하는데, 전신기능쇠약증상을 수반하는 水腫이 "水" 이며, 慢性腎炎 이나 心不全 에서 흔히 볼 수 있다. 이 경우에는 뚜렷한 脾腎陽虛 의 症狀이 있어서 일반적인 이수제만으로는 효과가 없으므로, 반드시 부자·건강 등의 약물을 첨가하여 전신적인 기능 주로 혈액순환기능을 개선시켜, 溫腎祛寒 하고 溫脾利水에 의하여 부종을 제거해야 한다5).
약리작용으로는 강심, 진통, 소염, 뇌하수체와 부신피질계에 대한 작용 등이 있는데, 강심작용은 심장의 수축력을 강화하여 shock나 心不全時에 부자의 강심작용에 의해 전신의 순환기능을 촉진하고 심혈관기능을 개선하며 유효성분은 非 alkaloid 성분(higenamine, coryneine)으로 일반적으로 강심작용은 煎熟해도 파괴되지 않는다. 그 다음으로 진통작용이 있는데, 진통작용은 실험에 의하면 aconitine 분해산물에 일정의 진통작용이 있다. 소염작용도 있는데, 실험적인 관절염에 대하여 뚜렷한 소염작용이 있었다. 또한, 뇌하수체와 부신피질계에 대하여 흥분작용이 있는데, 熟附子片의 煎劑는 rat 부신내의 ascorbic acid 함유량을 저하시키고 뇨중 17-KS의 배설을 증가시키며 말초혈중의 호산구를 감소시킨다. 이 밖에 어떤 종류의 부신피질기능부전환자에 대하여 corticotropin樣 작용이 있다5).
부자를 사용할 때 주의할 점이 있는데 熱證에는 금기이다. 脈實數 或은 洪大, 大便熱結, 高熱, 內熱外寒(眞熱假寒)으로 이는 熱證이므로 부자를 투여하면 熱象이 더 심해져서 口鼻出血하고 심한 경우 경련 등의 반응이 일어나기 때문이다. 일반적으로 심근장애?간기능장애 환자에게는 부자를 쓰지 않는 것이 좋으며, 임산부에게는 일반적으로 금기이다. 중독증상은 사지마비?현훈?쇠약감?발한?流涎?오심 등이며, 심한 경우는 부정맥?혈압저하?경련?의식장애를 일으킨다. 경증에는 온수공급과 휴식 등의 일반적인 처치를 하나, 중증에는 위세척과 atropin 주사가 필요하다. 또한 부자는 貝母?瓜蔞仁?白及?半夏?白? 과의 배합을 금기한다22).
이번 실험연구에서는 법제를 통한 안전한 해독 초오 약침을 개발하기 위해 원광대 광주한방병원에서 일반적으로 원내 사용하고 있는 乾草烏와 附子?(黑順片)를 경구 투여한 후 백서의 치사량과 LD50을 조사한 후 5시간의 탕전과정과 보료(감초, 흑두)를 첨가해서 만든 법제 초오환을 원료로 해서 대한약침학회 무균실에서 수증기 증류법으로 법제 초오 약침을 만들어 백서의 생리활성도와 안전성을 관찰하여 그 결과를 분석하였다.
건초오와 감초와 흑두인 감두탕을 보료로 사용해 만든 시판용 부자 흑순편과의 독성 비교실험에서 감초와 흑두(감두탕)를 보료로 사용한 부자 흑순편의 LD50은 9.0g/kg이 구해졌으나 오히려 건초오탕은 치사량이 더 낮아서 LD50은 15g/kg까지 나타나지 않아 그 이상으로 추정되었다(Fig. 2). 이 결과는 김23)에 의하면 초오 추출물을 생쥐에 경구투여를 한 실험에서 초오의 LD50은 10g/kg 이상이었다는 결과와 유사하다. 다른 연구결과와 다른 내용으로 일반적으로 법제를 해서 사용하면 독성을 90%가지 떨어 질 수 있다는 연구결과들이 발표되었으나 실제로 시판된 부자 포는 독성이 건초오보다 더 강한 것으로 나타났다. 따라서 향후 시중에서 시판되는 여러 종류의 부자포에 대한 정밀한 분석이 필요할 것으로 생각되며 이러한 결과는 법제가 완전치 못해 나타난 결과로 보인다. 두 번째 실험연구는 시판용 법제 부자가 아닌 건초오를 자가로 감두탕을 사용해서 시간을 5시간으로 엄수하고 탕전한 자가 법제용 초오환(일명, 해독 초오환)을 만들어 사용해서 실험을 진행하였다.
페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로 다양한 분자량을 가진다. 이들은 phenol hydroxyl을 가지기 때문에 단백질 및 거대분자들과 결합하는 성질을 가지며, 항산화효과 및 항균활성 등의 다양한 생리황설을 나타낸다. 일반적으로 항산화 활성을 나타내는 것은 페놀성 화합물이 작용하는 것으로 알려져 있으며24-26) 항산화 활성이 증가함에 따라 총 페놀성 함량도 증가한다. 해독 초오 약침의 항산화 효과를 보기 위해서 해독 초오 약침의 폴리페놀 함량은 초오 약침액의 농도 별 500㎕/㎖, 1㎖/㎖, 초오 약침액 원액 순으로 0.03㎎/L, 0.53 ㎎/L, 2.31㎎/L로 나타났다. ABTS 항산화 측정법은, DPPH와 같은 radical 소거법에 의한 항산화능 측정법이라는 점에서는 같지만 화학반응을 통해 free radical이 유발된 용액에 시료를 넣어 항산화를 측정한다는 점에서 다르다. 또한 free radical을 유발하여 용액을 준비할 때 시간이 소모되지만 항산화 측정 실험에서는 빠른 결과를 볼 수 있는 장점이 있다. DPPH는 pH, 빛과 온도에 영향을 받는 반면에 ABTS는 pH의 변화에 민감하게 작용하지 않는 장점이 있다27).
ABTS법은 다른 간접적인 방법 중에서 가장 많이 사용되는 방법이다. 이 방법은 Miller28)등에 의해서 1993년에 처음으로 고안된 것으로 시료의 생리활성을 측정하기 위해 사용되었지만 이후 식품과 천연 수용성 페놀성 물질을 시험하기 위래 널리 응용되었다. 이 방법은 페놀성 화합물을 함유한 시료의 첨가로 인해 2,2‘-azinobis(3-ethyl-benzo-thiaziline -6-sulfonate, ABTS)가 산화되어 라디칼 양이온(radidal-cation)인 ABTS?+가 생성되고 이것의 분해를 측정하여 항산화 활성을 계산하는 방법이다. ABTS는 600-750nm의 범위에서 강한 흡수를 보여주며 이로 인해 분광 분석으로 쉽게 측정할 수 있다. 페놀성 화합물이 없을 경우 ABTS는 비교적 안정하지만, 페놀성 화합물과 같은 수소공여체(H-donor)와는 강렬하게 반응하여 무색의 ABTS로 변환된다. 따라서 항산화 활성은 페놀성 화합물을 함유한 시료와 반응하여 소비된 ABTS의 양을 측정한다. 해독 초오 약침액의 소거 활성은 각각의 농도 250㎕/㎖, 500㎕/㎖, 1㎖/㎖, 초오 약침액 원액에서 1.45%, 2.35%, 3.15%, 10.26%로 농도 의존적으로 나타났다. 이는 항산화효과가 약침 중에서 현재까지 가장 높게 발표된 오공약침보다 1/10이하의 수준으로 실험용 초오 약침은 강한 항산화 작용을 나타내지는 못하는 것으로 분석 되었다. 따라서 향이 들어 있는 한약재에서 이용하는 수증기 증류 추출법이 아닌 에탄올 추출법이나 다른 방식의 추출법을 사용하여 분말형태나 농축액 혼합형태 등 고농도의 초오 약침을 만들어 재차 항산화작용과 안전성에 대한 연구를 진행할 필요가 있겠다.
약침제제를 실제 임상에 활용하기 위해서 제법의 규격화, 약효의 검증, 약리작용의 해석, 투여용량의 객관화와 아울러 안전성 검토가 선행되어야 한다. 향후 해독 초오 약침을 인체에 상용화하기 위해서는 급만성 독성실험을 통해 연구기간 중에 백서의 일반증상, 안구 증상, 체중변화, 혈액학적 검사, 뇨 검사 등 동물의 안전성 검사와 아울러 사람을 대상으로 한 안전성 검사가 선행되어야 할 것으로 사료된다.
[Fig. 1.] Diagramed manufacture processing of detoxification Aconiti ciliare tuber
[Fig. 2.] Percent survival rate graph of Aconiti ciliare tuber and Radix Aconitum simmered with Semen Glycine and Radix Glycyrrhizae
[Table 1.] Contents of total polyphenol by Aconiti ciliare tuber Pharmacopuncture fluid.
[Fig. 3.] ABTS radical scavenging activity of Aconiti ciliare tuber Pharmacopuncture fluid.
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[ Fig. 1. ]  Diagramed manufacture processing of detoxification Aconiti ciliare tuber
[ Fig. 2. ]  Percent survival rate graph of Aconiti ciliare tuber and Radix Aconitum simmered with Semen Glycine and Radix Glycyrrhizae
[ Table 1. ]  Contents of total polyphenol by Aconiti ciliare tuber Pharmacopuncture fluid.
[ Fig. 3. ]  ABTS radical scavenging activity of Aconiti ciliare tuber Pharmacopuncture fluid.
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