Francesco Bagnaia suona la carica al Mugello e autografa il miglior tempo dell'importante turno di prequalifiche che chiude la giornata d'apertura del weekend del Gran Premio d'Italia. La prima punta Ducati chiude il suo time attack con il tempo di un minuto, 44 secondi e 938 millesimi. Bagnaia dovrà però scontare tre posizioni di penalità in griglia per un "impeding" ai danni di Alex Marquez. Alle spalle del due volte campione del mondo ci sono nell'ordine il sorprendente Alex Rins con la Yamaha ufficiale (staccato di 273 millesimi) e Pedro Acosta con la GasGas Tech3 (+0.388), vittime di due scivolate per fortua incruente in altrettanti turni di prove. Top five anche per Miguel Oliveira con la Aprilia clienti di Trackhouse (+0.402) e per Marc Marquez con la Ducati Gresini, a soli cinque millesimi dal collega portoghese. Accedono direttamente alla fase calda delle qualifiche del sabato dalla sesta alla decima casella della classifica dei tempi anche Enea Bastianini con la seconda GP24 Ducati Lenovo, il leader della classifica generale Jorge Martin, Alex Marquez (Ducati Gresini) e le due Aprilia del team ufficiali di Maverick Vinales (che era stato il più veloce del turno d'apertura) e di Aleix Espargarò.
Resta fuori dalla top ten (e dovrà quindi guadagnarsi nel Q1 l'accesso alla caccia alla pole) Fabio Quartararo con l'altra Yamaha factory. Il Diablo manca la missione per soli diciannove millesimi.... a favore di Aleix Espargarò. Niente da fare invece anche per le Ducati VR46, per le tre KTM ufficiali schierate al Mugello dalla Casa austriaca e per Franco Morbidelli che aveva brillato nel primo turno di prove libere con la Ducati Prima Pramac: quidicesimo tempo a 821 millesimi da Bagnaia per il pilota italobrasiliano. VR46 e KTM erano rimaste fuori dalla top ten anche nel primo turno di prove libere. Fabio Di Giannantonio e Marco Bezzecchi chiudono rispettivamente dodicesimo e quattordicesimo. In casa KTM Red Bull, Brad Binder occupa la tredicesima casella, Jack Miller e la wild card Pole Espargarò sono undo dietro all'altro in diciassettesima e diciottesima posizione.
Per quanto riguarda gli altri piloti italiani impegnati nel GP di casa, Lorenzo Savadori chiude ventiduesimo con la terza Aprilia RS-GP del team ufficiale ad un secondo e otto decimi dalla vetta, mentre Luca Marini è ventiquattresimo e ultimo con la Honda HRC e un ritardo superiore ai due seconda Bagnaia.