«Если завтра война»: Коммерческой медицине панацея не нужна!
Предисловие редакции
В катастрофические для науки 90-е годы в пущинском Институте биофизики клетки РАН было сделано удивительное открытие. Оказалось, что один из ферментов, вырабатывающийся клетками организма лабораторных животных, обладает фантастическими защитными свойствами. Это фермент, который называется пероксиредоксин, удалось получить генно-инженерным методом. Если его вводили лабораторным животным до или через несколько часов после таких несовместимых с жизнью воздействий, как ожог кожи или дыхательного тракта, получение смертельной дозы облучения и пр., то большая часть животных выживала. Уже через год группе исследователей во главе с профессором Владимиром Новоселовым удалось доказать, что подобное вещество вырабатывается и в организме человека.
Прошло 20 лет. Клинические испытания пероксиредоксина так и не начаты, несмотря на то, что внедрение этого препарата в медицинскую практику спасло бы сотни тысяч жизней онкологических больных, которым можно было бы значительно увеличить интенсивность лучевой терапии, раненых, умирающих от тяжелых ожогов и ран, людей с ишемическими поражениями внутренних органов и многими другими заболеваниями.
«О необходимости срочного проведения клинических испытаний нового антиоксиданта и радиопротектора»
Доклад доктора биологических наук, профессора Владимира Ивановича Новоселова и кандидата биологических наук Марса Галиевича Шарапова (Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино) на секции «Создание национальной системы контроля, управления и защиты от загрязнений воздуха — приоритетная задача Года экологии» научно-практической конференции «Экологические угрозы и национальная безопасность России», которая прошла в Москве в Международном независимом эколого-политологическом университете имени Н. Н. Моисеева (Академия МНЭПУ) 14−16 сентября 2016 года.
В настоящее время считается общепризнанным, что многие патологические процессы в организме человека сопровождаются мощным окислительным стрессом — гиперпродукцией активных форм кислорода (АФК), и этот стресс является одним из основных поражающих факторов при развитии различных патологий. АФК чрезвычайно токсичны и способны разрушать все важнейшие биологические макромолекулы — нуклеиновые кислоты, белки, липиды. Гиперпродукция АФК в организме связана как с действием внешних факторов (радиация, озон, аэрозоли и т.п.), так и с нарушением функционирования собственной антиоксидантной системы, которое наблюдается при многих патологических процессах в организме.
Примечание редакции
Об опасности приземного (тропосферного) озона читайте статью «Приземный озон в России: чем он опасен», а о российской технологии оперативного снижения уровня загрязнения уличного воздуха (в том числе и озоном) — статью «Система управления погодой должна быть международной».
Окислительный стресс является причиной или следствием развития многих социально значимых заболеваний, среди которых заболевания сердечно — сосудистой и дыхательной системы занимают лидирующие позиции (см. Рис.1). Коррекция или нормализация окислительно-восстановительного состояния организма будет способствовать и скорейшему восстановлению, и в конечном счете выздоровлению.
Широкий спектр тяжелых заболеваний, в патогенезе которых важную роль играет окислительный стресс, заставляет искать пути эффективной нейтрализации повышенного уровня активных форм кислорода, так как в подавляющем числе случаев ситуацию можно существенно скорректировать, используя антиоксидантные препараты. В медицине широко используются лекарственные препараты антиоксидантного действия как природного, так и синтетического происхождения (токоферол, цистеин, аскорбиновая кислота и т.д.). Однако в большинстве случаев они оказываются относительно малоэффективными и используются как дополнительные лекарственные препараты или как профилактическое средство. Основной причиной данной ситуации является относительно слабая эффективность используемых соединений в нейтрализации активных форм кислорода. Это стимулировало исследования в поисках принципиально новых препаратов антиоксидантного действия. Одним из перспективных направлений может быть использование ферментов-антиоксидантов, так как эффективность этих ферментов на несколько порядков выше, чем антиоксидантная активность широко используемых низкомолекулярных соединений.
Основными активными формами кислорода являются супероксид радикал и различные гидропероксиды. Для их нейтрализации в организме существует целый набор ферментов, обеспечивающих нейтрализацию этих активных форм кислорода, и среди этих ферментов особое место занимают пероксиредоксины, которые способны нейтрализовать практически все типы активных форм кислорода.
Пероксиредоксины — это древнее семейство ферментов, которые встречаются, начиная от бактерий и заканчивая животными, и одним из представителей пероксиредоксинов является идентифицированный в нашем Институте секреторный пероксиредоксин 6 (Prx6), который является основным антиоксидантом в органах дыхания, сосудах, эпидермисе кожи (в норме в трахее и бронхах пероксиредоксин 6 обеспечивает до 70−80% нейтрализации гидропероксидов).
Пероксиредоксины (Prx) — семейство селен-независимых пероксидаз. У млекопитающих обнаружено 6 представителей семейства пероксиредоксинов (Prx1-Prx6), среди которых Prx6 обладает наиболее широким спектром нейтрализуемых перекисных субстратов как органической, так и неорганической природы. Кроме того, при кислых значениях рН Prx6 проявляют активность фосфолипазы А2. Prx6 вовлечен в передачу внутри‑ и межклеточных сигналов. Для Prx6 в модельныx экспериментах на животныx показана выcокая эффективноcть пpи лечении патологий, сопровождающихся окислительным стрессом.
В нашей лаборатории в модельныx экcпеpиментаx на животных показана высокая эффективноcть пероксиредоксина 6 пpи лечении патологий, сопровождающихся окислительным стрессом. Мы использовали следующие модели (см. Рис.3):
- химический и термический ожоги верхних дыхательных путей,
- резаные раны,
- действие аэроионов и дыма на верхние дыхательные пути,
- тотальное радиационное поражение,
- ишемия-реперфузия внутренних органов (сердце, почки, тонкий кишечник).
Несмотря на кажущиеся внешние отличия в объектах и постановке экспериментов, на молекулярном уровне все эти модели имеют общее начало — это окислительный стресс, который является главной причиной патологического процесса. Кратко рассмотрим результаты по этим работам.
Модель химического ожога верхних дыхательных путей
Подобные ситуации могут быть на химических производствах при чрезвычайных ситуациях или при длительном пребывании в экологически неблагоприятных районах с превышенными значениями ПДК вредных веществ. На этой модели животное помещалось на 15 мин в атмосферу насыщенных паров соляной кислоты, что приводило к полному разрушению эпителия трахеи и бронхов.
В то же время, если спустя некоторое время после химического ожога непосредственно в трахею вводили раствор пероксиредоксина, эпителий верхних дыхательных путей сохранялся. Гистологический анализ трахеи показал, что введение пероксиредоксина 6 более чем на 90% сохраняет реснитчатый эпителий трахеи, в то время как в контроле с ожогом данный эпителий практически отсутствует.
Необходимо отметить, что высокий терапевтический эффект Prx6 наблюдается также при позднем введении препарата — спустя 3−4 часа после химического ожога. Аналогичные результаты были получены при термических ожогах верхних дыхательных путей или при токсическом действии аэроионов.
Модель химического ожога кожи или резаной раны
В этих моделях раствор пероксиредоксина 6 наносился непосредственно на пораженную поверхность кожи.
При этом скорость заживления раны увеличивалась в несколько раз, а образующийся при этом шрам был в 3−5 раз меньше (Рис.4).
Модель тотального радиационного поражения
Особое место среди патологий, связанных с окислительным стрессом, занимает поражение организма ионизирующим излучением (лучевая болезнь). Ионизирующее излучение сопровождается резким увеличением количества АФК в организме, что связано в первую очередь с радиолизом воды. Поэтому была поставлена цель — оценить радиозащитный потенциал пероксиредоксина 6.
Исследована выживаемость 6-недельных самцов мышей при их облучении рентгеновскими лучами при летальных дозах (5−10 Гр). Перед облучением внутривенно вводили пероксиредоксин 6, то есть исследовалась радиопротекторная эффективность данного препарата. Средняя продолжительность жизни контрольных облученных мышей составила около 7 суток, а максимальное время дожития — не более 12 дней. Введение пероксиредоксина 6 до воздействия рентгеновского излучения существенно увеличило выживаемость мышей. Через 7 дней после облучения у контрольных мышей терялась подвижность, были нарушения в структуре шерсти, глаз и т.д. (см. Рис.5). Крысы, которым был введен пероксиредоксин 6, чувствовали себя нормально. Около 95% животных остались живыми даже после 30 дней.
Пероксиредоксин 6 является мощным радиопротектором, и его эффективность одинакова или выше, чем у применяемых в настоящее время радиопротекторов. В то же время наиболее существенным конкурентным отличием пероксиредоксина от используемых радиопротекторных препаратов является отсутствие токсичности и побочных эффектов.
Например, такие радиопротекторы, как колоний-стимулирующий фактор, при курсовом введении способны стимулировать рост опухолей, введение интерлейкина-1 часто вызывает существенное повышение температуры, тошноту, рвоту, головные боли и усталость. Сульфгидрильные препараты как радиопротекторы эффективны в дозах, близких к остротоксичным.
Известно, что гибель мышей при действии ионизирующей радиации в дозах 10 Гр и выше наступает в результате поражения кишечника — гастероэнтерологический синдром, сопровождающийся бактериальными инфекциями, перитонитом и так далее, поэтому продолжительность жизни мышей после таких высоких доз радиации составляет не более недели. При этом наблюдается массовая гибель эпителиальных клеток и деструкция тонкого кишечника.
В связи с этим было проведено исследование влияния пероксиредоксина 6 на морфологию тонкого кишечника мышей, облученных в дозе 10 Гр. При гистологическом исследовании участка тонкого кишечника облученных мышей выявлено острое поражение кишечной стенки. У подавляющего большинства животных радиационное поражение приводит к полной потере архитектуры кишечной стенки, что отражается в деструкции слизистой, подслизистой и мышечной оболочек кишки. Введение в кровь пероксиредоксина 6 перед облучением повышает устойчивость этих клеток к радиационным повреждениям, что в существенной мере предотвращает их гибель. В частности, отмечается сохранность клеток эпителия кишечных ворсинок и крипт.
Таким образом, Prx6 в существенной степени уменьшает тяжесть радиационно-индуцированных повреждений тонкого кишечника (Рис.6).
В основе радиозащитных свойств пероксиредоксина 6, с одной стороны, лежит способность к нейтрализации АФК, а с другой стороны — способность к активации сигнально-регуляторных клеточных механизмов восстановления нарушенного окислительно-восстановительного гомеостаза, что было подтверждено с помощью исследований по влиянию экзогенного пероксиредоксина 6 на экспрессию генов ключевых белков-регуляторов, отвечающих за важнейшие функции в клетке.
Пероксиредоксин 6 может рассматриваться как потенциально перспективное радиозащитное средство для уменьшения рисков повреждающего воздействия ионизирующего излучения на организм млекопитающих, причем радиопротекторные свойства пероксиредоксина 6 могут быть использованы не только для защиты от повреждающего воздействия ионизирующей радиации, например, в техногенных катастрофах, но и для коррекции радиационных рисков, обусловленных применением радионуклидной терапии в онкологии.
Следует отметить еще один аспект. Известно, что летальный исход мелких лабораторных животных (мышей и крыс) при действии ионизирующей радиации в диапазоне доз от 3 до 10 Гр наступает из-за гемопоэтического синдрома в результате массовой гибели клеток костного мозга. Это сопровождается также опустошением депо стволовых клеток костного мозга, в результате которого происходит изменение содержания форменных элементов периферической крови.
Было исследовано влияние внутривенного введения раствора пероксиредоксина 6 на содержание лейкоцитов, гранулоцитов и тромбоцитов в периферической крови мышей, облученных в дозе 7 Гр. В группах облученных животных, не получавших пероксиредоксин 6, количество лейкоцитов к шестому дню эксперимента уменьшилось на ~95% и ~80% соответственно. В дальнейшем в группе облученных мышей количество лейкоцитов и гранулоцитов продолжало уменьшаться вплоть до их смерти (острая лучевая болезнь). В группе животных, которым вводили Prx6 перед облучением, начиная с 8-го дня после облучения, количество лейкоцитов стало увеличиваться и к 30-му дню полностью нормализовалось.
Таким образом, установлено, что Prx6 в существенной степени уменьшает тяжесть радиационно-индуцированной лейкопении.
Модель ишемически-реперфузионных поражений
Значительная часть исследований нашей лаборатории посвящена ишемически-реперфузионным поражениям внутренних органов. Ишемия — патологический процесс, который развивается при снижении уровня кровотока в органе на 50% от его нормальных значений, что приводит к развитию гипоксии. Однако более губительным для клеток является не отсутствие кислорода в тканях органов, а его появление после длительной ишемии — реперфузия. Опасность реперфузионного поражения связана с резким повышением концентрации кислорода в ткани, что способствует резкой генерации избыточного количества активных форм кислорода и приводит существенному повреждению ишемизированной ткани. С проблемой ишемически-реперфузионного поражения связаны многие клинические случаи: ишемическое поражение органов, поражения сосудов после образования тромбов, послеоперационные осложнения, когда во время операций временно прекращается кровоток в оперируемом органе и так далее.
Особое место проблема ишемически-реперфузионного поражения занимает в трансплантологии при подключении трансплантируемого органа донора к кровотоку реципиента.
Особенно чувствительными органами к ишемически-реперфузионному поражению являются почки, и особенно кишечник, ввиду их обильного кровоснабжения. На Рис.7 показана типичная картина тонкого кишечника крысы через три часа после перевязки сосудов брыжейки в течение одного часа (ишемия) и двух часов последующего восстановления кровотока (реперфузии).
В нашей лаборатории проводятся интенсивные исследования по использованию экзогенных пероксиредоксинов для защиты именно этих органов от окислительного стресса. В модельных экспериментах временно отключалось кровоснабжение почек или тонкого кишечника крыс путем перевязки кровеносных сосудов, питающих эти органы (почечные артерии для почки или сосуды брыжейки для кишечника). Нами было показано, что восстановление кровотока существенно разрушает ткани как почки, так и кишечника, что приводит к очень тяжелым последствиям, включая гибель животных. Так, при ишемии-реперфузии обеих почек к третьему дню эксперимента выживает лишь 20% мышей.
Внутривенное введение экзогенного пероксиредоксина 6 перед прекращением кровотока в исследуемых органах практически полностью исключало поражение тканей этих органов.
В случае почек более чем в два раза увеличилась выживаемость, нормализовались показатели мочевины в крови экспериментальных животных, гистологический и иммуногистохимический анализ показал сохранению почечной ткани в корковом слое. Аналогичные результаты показаны и на моделях ишемически-реперфузионного поражения тонкого кишечника.
Перспективы применения
Несмотря на выдающиеся протекторные свойства пероксиредоксинов, эти показатели можно существенно улучшить с помощь методов генной инженерии. Например, увеличение эффективности доставки пероксиредоксинов внутрь клетки путем модификации их структуры с помощью PTD пептидов, увеличение времени их циркуляции в кровотоке с помощью перфторуглеродов, расширение субстратной специфичности (спектра нейтрализуемых АФК) путем создания химерных белков, обладающих совмещенными антиоксидантными активностями.
Например, в нашей лаборатории создан и исследуется химерный пероксиредоксин с совмещенной супероксиддисмутазной и пероксидазной активностью, который может нейтрализовать практически все типы активных форм кислорода.
Исследованием свойств пероксиредоксинов наша лаборатория занимается уже 20 лет, однако до сегодняшнего дня были проведены только лабораторные исследования, позволившие понять фундаментальные механизмы защитного действия пероксиредоксинов.
К сожалению, несмотря на высокий потенциал применения пероксиредоксинов, до сих пор не были проведены доклинические испытания, что напрямую связано с недостатком финансирования такого рода работ. Однако мы надеемся, что эта ситуация исправится, и эти испытания будут проведены.