Buscando innovaciones en las proteínas de plasma porcino para una producción de carne más sustentable
Introducción
Introducción
México ocupa el noveno lugar en producción de carne de cerdo en el mundo. Una parte importante de esa carne se produce en regiones con escasez de agua como el Noroeste de la República, donde destaca la industria tecnificada, dedicada, en gran medida, a la exportación de cortes especiales hacia diferentes regiones de Asia. Un problema que genera esta industria y al que pudiera no estársele dando gran atención, es la contaminación que generan sus sub-productos. El que ha llamado nuestra atención durante más de 15 años, es la sangre. Por cada canal de 95 kg, se generan de 3 a 4 L de sangre (BREF, 2005) que, en la mayoría de los casos, se descarga con las aguas residuales, contaminando los suelos y la cada vez más escasa agua de la Nación.
La contaminación que produce la sangre de sacrificio animal al agua, depende de su carga biológica y de la frecuencia de las descargas. La demanda bioquímica de oxígeno (DBO) nos indica la cantidad de oxígeno presente en un cuerpo de agua, que debe utilizarse, para oxidar a la materia biológica que la está contaminado y de esta forma, regenerar al sistema. Este oxígeno demandado se "roba" a la vida acuática y cuando se agota, la contaminación puede acumularse hasta secar los cuerpos de agua (Neri y col., 2007). Entre todos los subproductos de la producción de carne, la sangre es la que aporta la mayor DBO (140-200 g de oxígeno/litro de sangre). Si ésta no se desecha al drenaje, la contaminación producida por las plantas de sacrificio podría reducirse hasta en un 40 % (Signorini, 2006).
La producción de harina de sangre es una de las alternativas que se aplica en México para aprovechar este subproducto. Esta harina se utiliza como fertilizante o como alimento para ganado. En el último caso, la digestibilidad de las proteínas es baja y la susceptibilidad al enranciamiento de las grasas presentes, alta. Ello debido a las altas temperaturas que se utilizan durante el proceso. En tal sentido, consideramos que la búsqueda de alternativas innovadoras para valorar a las proteínas de la sangre, es una actividad, cuyos frutos podrían contribuir a hacer la industria de la producción de la carne de cerdo, más rentable y sustentable. Los estudios se han venido realizando en Sonora y en Coahuila a partir de sangre de cerdo obtenida de una Planta de sacrificio Tipo Inspección Federal que cuenta con un Sistema de Análisis de Puntos Críticos de Control HACCP integrado. Desde el inicio se llevó a cabo un programa de análisis bacteriológicos para garantizar la ausencia de patógenos y la efectividad de las buenas prácticas de manufactura durante el manejo y transformación de la sangre. También se ha descartado la presencia de virus, mediante análisis realizados en la Universidad Nacional Autónoma de México.
El primer paso: las inmunoglobulinas
Las inmunoglobulinas (Ig`s) son glicoproteínas de defensa que protegen a los organismos vertebrados del ataque de patógenos. En el cerdo, las Ig´s provenientes de la sangre de sacrificio, actúan de manera efectiva como sustituto de calostro; confieren inmunidad pasiva, contribuyen al desarrollo del sistema inmune mucosal y actúan como profilácticos en la prevención de diarreas en lechones neonatos y recién destetados (Gatnau y Zimmerman, 1991). Esto es importante si se considera que los lechones nacen sin anticuerpos y al tiempo del destete, no ha madurado su sistema inmune. La fuente comercial de inmunoglobulinas para los cerdos es el plasma sanguíneo deshidratado. Por tanto, el primer objetivo fue buscar una manera efectiva de separar inmunoglobulinas en un solo paso, para hacer preparaciones homogéneas. Se probaron diferentes principios cromatográficos eligiendo al final, la cromatografía de interacción hidrofóbica; un proceso que separa las inmunoglobulinas en condiciones suaves que garantizan la estabilidad moléculas de las Ig´s y por tanto, su función biológica. Se sintetizaron y probaron 3 matrices cromatográficas (Sefarosa HA, Novarosa PEI HA y Novarosa HA). En promedio, la capacidad de las matrices para capturar Ig´s fue: para Sefarosa HA, de 4.1 mg/mL de matriz, para Novarosa EDA HA, de 3.3 mg/mL de matriz y para Novarosa PEI HA de 0.56 mg/mL de matriz. En síntesis, el proceso consistió en aplicar suero porcino en presencia de sal, a las columnas cromatográficas empacadas con las respectivas matrices. La sal promueve la adsorción de las inmunoglobulinas en la matriz y deja pasar al resto de las proteínas. El proceso (lavado) continua hasta que todas las otras proteínas se han eliminado. Posteriormente, las Ig´s se desprenden o eluyen de la matriz, eliminando la sal del medio y colectan por separado (Ramos-Clamont et al., 2006).
Se continuó trabajando las matrices más efectivas, estudiando el tipo de Ig´s que se podían separar. Como se observa en la Tabla 1, la Sefarosa HA tuvo la capacidad de separar el total de la IgG y de la IgA y el 55 % de la IgM. Por esta razón fue la matriz seleccionada para escalar el proceso a nivel laboratorio a fin de producir preparaciones líquidas estables o polvos de Ig´s liofilizados con solubilidad del 90 a 95 % a pH cercano a la neutralidad; sin patógenos bacterianos. Las pruebas de sero-neutralización para la detección de los virus porcinos: Ojo Azul, Aujeszky, parvovirus porcino, gastroenteritis transmisible y síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), resultaron negativas lo que indica que las preparaciones cuentan con una excelente calidad microbiológica producto de las estrictas medidas de calidad impuestas en la granja y en el sacrificio, además de las buenas prácticas de manufactura seguidas durante la separación cromatográfica y las operaciones de preparación de los concentrados.
¿Y ahora qué hacemos con la albúmina?
Al tiempo de continuar con la investigación con las Ig´s, surgió la pregunta de que hacer con la fracción de lavado compuesta por 95-97 % de albúmina. Es la proteína más abundante del suero sanguíneo de los organismos vertebrados y es también la más caracterizada bioquímicamente. Posee una masa molecular promedio de 66.5 kDa. Su principal función es la fijación y el transporte de pequeñas moléculas orgánicas, endógenas o exógenas como hormonas, ácidos grasos, vitaminas, antibióticos, etc. También participa en la fijación y el transporte de minerales.
El primer paso fue obtener albúmina porcina (PSA, por sus siglas en inglés) en polvo (figura 1A). Su análisis proximal indico 97% de proteína, 1.2 % de minerales (sin que se detectara la presencia de hierro) y 0.4 % de lípidos. El análisis cromatográfico para determinar la composición de aminoácidos mostró que la albúmina porcina es una excelente fuente de histidina, leucina y lisina; mientras que los aminoácidos limitantes fueron la metionina y el triptofano (Ramos-Clamont et al., 2003). La solubilidad fue mayor del 90%, la estabilidad de emulsión similar a las que imparten las proteínas de suero lácteo y la capacidad espumante similar a la de las proteínas del huevo (Ramos-Clamont y Vázquez-Moreno, 2006). Después de obtener esta información se decidio desarrollar diferentes alimentos incorporando albúmina porcina en galletas, panes, panqués y productos cárnicos. Todos ellos resultaron con una alta calidad microbiológica. Los productos más aceptados por niños y adultos según los análisis sensoriales fueron panques de chocolates en los que se sustituía parte de la harina por PSA o parte del huevo por PSA. Los panquecitos (peso total 70 g) en los que se sustituyó 8 % de la harina de trigo con PSA mostraron un aumento del doble del contenido proteíco con respecto a los controles. Además, un aporte de 70% de la metionina, 82% de la treonina y 95% de la lisina requeridas por niños de 6 a 12 años según la FAO y la OMS. En el caso de todos los demás aminoácidos esenciales, el aporte fue mayor o igual al requerimiento indicado por estas instituciones. La miga (figura 1B) y textura de los panes no se vio afectada. Este tipo de productos, amplaimente aceptados en los análisis sensoriales realizados, podrían contribuir a combatir la desnutrición infantil.
Búsqueda de aplicaciones glicoterapeúticas para la PSA
Una de las alicaciones más prometedoras que hemos encontrado para la albúmina sérica porcina es para la obtención de neoglicanos que sean capaces de prevenir o combatir infecciones bacterianas. La adherencia a la superficie celular intestinal, mediada por reconocimiento lectina-carbohidrato, es una de las tácticas más comunes de las bacterias, para unirse e infectar a los mamíferos (Sharon, 2006). Además, representa un paso crucial para el inicio de la infección (Ofek et al., 2003). Por ello, el bloqueo de estas adhesinas, con carbohidratos que mimeticen a sus receptores naturales, podría ser una estrategia adecuada para evitar infecciones en cerdos y otros animales.
La prevención de la infección mimetizando receptores naturales es un concepto que se basa en la investigación de la acción de componentes de algunas sustancias naturales. Por ejemplo la leche humana y el arándano, contienen glicanos que inhiben la adhesión de diferentes microorganismos (Sharon, 2006). Uno de los principales problemas que enfrenta la glicoterapia es la disponibilidad de glicanos en cantidad suficiente (Sharon, 2006). La síntesis de estos carbohidratos complejos se lleva a cabo a nivel celular en el retículo endoplasmático y en el aparato de Golgi . La disponibilidad de las enzimas específicas para llevarla a cabo a nivel industrial es muy baja. Por otro lado, las síntesis químicas son costosas y regioespecíficas. Además, los carbohidratos libres son en muchos casos inactivos cuando se suministran por vía oral y sensibles al ataque de enzimas glicosidasas in vivo (Ofek et al., 2003).
Una posible alternativa al problema de disponibilidad de glicanos es la síntesis de neoglicanos utilizando la reacción de Maillard (Sarabia-Sainz et al., 2009). Particularmente la albúmina glicada con lactosa (PSA-Glc β 1-4 Gal) ha demostrado inhibir la unión de E. coli K88 a las mucinas intestinales del lechón y a enterocitos de lechón infectados con este patógeno (Sarabia-Sainz et al., 2017). El principio se muestra en la figura 2A.
Se probó que neoglicanos de PSA-Glcβ1-4 Gal pueden inhibir la adhesión de las tres variantes antigénicas de E. coli K88 a las mucinas obtenidas del duodeno y yeyuno del lechón. La inhibición dependió del número de lactosas unidas a la albúmina y del tipo de variante antigénica. La PSA-Glcβ1-4Gal logró inhibir in vitro en un 50 % la adhesión de E. coli K88 a las mucinas de duodeno del lechón y un 40 % a los enterocitos del lechón. Las adhesinas que presentaron mayor afinidad por la PSA-Glcβ1-4 Gal son las de E. coli K88ab (Sarabia-Sainz et al., 2011). Lo anterior representa una ventaja ya que esta variante es una de las más frecuentes en Norteamérica (Francis, 2002).
La reacción de Maillard, estudiada por primera vez por Louis-Camille Maillard en 1912, es la descripción general de una serie de reacciones complejas debidas a la reacción de grupos amino libres, de las proteínas, con grupos carbonilo, provenientes de azúcares reductores. Se favorece bajo condiciones de deshidratación, a altas temperaturas, pH alcalinos (primeras etapas) y con las concentraciones adecuadas de reactivo. Los compuestos iniciales de la reacción de Maillard son identificados como productos de Amadori cuyas características son:
a) Se sintetizan en ausencia de enzimas.
b) Interviene una base de Schiff formada con un aldehído mas una amina primaria.
c) Diferentes factores como el tiempo y la temperatura promueven la evolución de los compuestos de Amadori diversos compuestos avanzados de la glicación; entre estos destacan: complejos covalentes, compuestos polimerizados, compuestos escindidos, entre otros.
Para poder obtener neoglicanos de albúmina porcina eficientes en el bloqueo de adhesinas microbianas, la reacción entre la PSA y la lactosa u otros carbohidratos no reductores que sean reconocidos por el patógeno, debe producir compuestos de Amadori y no proceder hacia otras reacciones de Maillard. Por tanto, la parte complicada de la investigación fue encontrar las condiciones óptimas de tiempo, temperatura y pH. Una vez encontrados se estan produciendo otros neoglicanos a partir de la conjugación de PSA con galactooligosacáridos probióticos, quitosanos y dextranos, a fin de probar su efecto en la inhibición de diferentes patógenos. Con ello se busca encontrar una aplicación farmacológica a al albúmina porcina.
Sistemas de Liberación Controlada
Las formas convencionales de administrar los medicamentos son, tabletas, soluciones inyectables y cremas tópicas, entre otras. Para ser efectivas estas formulaciones deben alcanzar niveles séricos determinados. Algunos fármacos presentan un rango terapéutico estrecho y por ello deben suministrarse en dosis repetidas. Esto origina que la concentración del medicamento en la sangre fluctúe entre niveles demasiado bajos para ser eficientes y demasiado altos como para provocar toxicidad. Además, cuando el medicamento es administrado en forma libre, se absorbe y distribuye provocando que solo una fracción del mismo fármaco llegue al lugar donde se requiere .Para un manejo eficiente de la terapia, los medicamentos deben administrarse al organismo de tal forma que puedan ser liberados de manera controlada, para que las concentraciones del medicamento se sostengan durante un periodo prolongado, reduciendo la necesidad de administrar dosis repetidamente.
Una manera de obtener una liberación controlada de un medicamento es cargarlo en nanopartículas. La nanopartículas de albúmina sérica, se han aplicado al diagnóstico de diversas patologías como cáncer del tejido mamario, edema pulmonar, artritis reumatoide, entre otras. Para mejorar la efectividad de los neoglicanos producidos en nuestro laboratorio, se investigó la formación de nanoparticulas biodirigidas cargadas con diferentes antibióticos y su reconocimiento por E. coli K88, mediante la estrategia esquematizada en la Figura 2B. Actualmente, realizamos estudios con nanopartículas de albúmina glicada con lactosa, que son reconocidas por receptores presentes en el hígado. El objetivo es cargarlas con agentes anticancerígenos para biodirigirlos hacia tumores hepáticos.
En conclusión, las proteínas séricas obtenidas de la sangre del sacrificio del cerdo, presentan una amplia gama de aplicaciones alimentarias y farmacológicas, que revaloran a un subproducto subutilizado en México y que en el peor de los casos, contamina nuestro entorno. Escalar estas aplicaciones, requerira de un esfuerzo conjunto entre la industria y la academia.
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