Sat.1 hat einen Monat vor dem Start der zweiten Staffel am 7. Mai einen Einblick in die neuen Geschichten von «Die Landarztpraxis» gewährt. Unter anderem hat man für die 80 neuen Folgen Diane Willems («Verbotene Liebe», «Familie Dr. Kleist») verpflichtet, die als Dr. Fabian Kroiß' kleine Schwester Isabelle "Isa" Kroiß auftritt. Zwischen den beiden Geschwistern herrschte 20 Jahre lang Funkstille, nachdem sie nach einem öffentlichen Streit jäh Wiesenkirchen verlassen hatte. Nach 20 Jahren in Chicago, wo sie als Kinderärztin arbeitete, taucht die als selbstbewusst beschriebene Frau plötzlich am Schliersee auf und will sich mit ihrem Vater Georg (Christian Hoening) aussprechen.
Fabian (Oliver Franck) hat sie gebeten, in der Praxis auszuhelfen, während er sich von seinem Unfall erholt. Was allerdings niemand ahnt: Isa ist verheiratet, hat sich aber von ihrem Mann getrennt – und die beiden sind nicht im Guten auseinandergegangen. Kaum in Wiesenkirchen angekommen, trifft die Kinderärztin auf ihren Jugendschwarm, den Bergretter Lukas, und muss mit ihm einen verletzten Jungen retten. Lukas wird von Michael Raphael Klein («In aller Freundschaft», «Sankt Maik») verkörpert. Lukas kehrt nach zwei Jahren in das fiktive Örtchen in Süddeutschland zurück, nachdem er einen schweren Schicksalsschlag verarbeiten musste. Er heuert wieder bei seinem Kumpel Max (Alexander Koll) im Bergretter-Team an.
Als dritten Neuzugang präsentierte Sat.1 Sophie Melbinger, die die Rolle der Marie Raichinger übernimmt. Sie ist die Ex-Frau von Max und Mutter des gemeinsamen Sohnes Basti (Simon Lucas), die sie vor 15 Jahren verlassen und sich daraufhin nie mehr gemeldet hatte. Damals hatte sie ihre Gründe, die jedoch niemand kennt. Nun möchte sie Basti wiedersehen. Aber kommt Marie wirklich mit guten Absichten? Max hat seine Zweifel.
Neben Hauptdarstellerin Caroline Frier kehren auch Katharina Hirschberg als Tochter Leo, Katrin Anne Heß als Fabian Noch-Ehefrau Alexandra und Marion Mathoi als Arzthelferin Resi in ihre Rollen zurück. Außerdem stehen Rosetta Pedone, Antonio Putignano, Gioele Viola und Fenja Gerhardter vor den Kameras von filmpool entertainment.