Peptide-Induced Budding and Leakage Behavior of Giant Vesicles

Keywords: Peptide, Giant vesicle, Budding, Leakage

孙建波 夏玉琼 于秋红 梁德海 * (北京大学化学与分子工程学院, 北京分子科学国家实验室, 北京 100871) 摘要: 细胞膜与膜蛋白之间的相互作用与生命中许多过程息息相关. 以巨型脂质体(GUV)和多肽分别作为细 胞膜和膜蛋白的简化模型, 我们设计了四种仅包含亮氨酸(L)和赖氨酸(K)的多肽, 即K 14 、(KL 2 KL 2 K) 2 、 (KL 2 KL 3 ) 2 和K 6 L 8 , 并对比研究了它们与中性和负电性脂质体的相互作用. 电荷密度最高的K 14 只是涂层在脂质体 表面, 不破其囊泡结构, 但能够引起负电性脂质体发生微相分离, 属建设性相互作用. 能够形成两亲性α螺旋的 

No.10 
孙建波等: 多肽诱导的巨型脂质体出芽和泄露行为 

Fig. 1 Fig. 2 KFig. 3 K 6 L 8

 12368 Fig.1 Comparison of 3D helical wheel diagram of the four peptidesBlue and red spheres represent leucine and lysine, respectively. 


图5 K 6 L 8 Fig. 5 Fig. 6

 6856 Fig.5 Outward budding process (A) and 3D reconstruction (B) for neutral GUV (POPC) caused by K 6 L 8 




  




  


Table 1 Peptide sequence

 1 
	1986		
	1 引 言	疏水相互作用, 可以仅选取带电和疏水两种氨基酸
	在生理环境中, 细胞膜无时无刻不在进行着构	组成的多肽序列来进行研究, 这会使得问题更进一
	象变化, 如融合、出芽和内吞等. 这些构象变化决	步简化. 在本文中, 我们利用正电的赖氨酸(K)和疏
	定着细胞的运动、分裂、神经元轴细胞的延伸、	水的亮氨酸(L), 自主设计了四种长度为14个残基的
	囊泡运输等生物功能. 1 细胞从外界环境摄取营养物	氨基酸序列(表1), 对比研究了它们与中性和负电性
	质, 以及排除废物也离不开构象变化. 靶向药物的	巨型脂质体(GUV)的相互作用, 原位跟踪动力学, 并
	开发和基因治疗的首要问题就是要解决细胞的摄	初步评价多肽序列与膜变形的关系.
	取问题, 这与细胞膜的内吞是密切相关的. 细胞膜		
	的构象变化在很大程度上是由膜蛋白来控制的. 例	2 实验部分	
	如, 发动蛋白会与肌醇头基磷脂分子发生特异性结	2.1 样 品	
	合而形成螺旋状寡聚体, 从而把膜的拓扑结构限制	钙黄绿素购于Sigma Aldrich公司, 纯度> 99%.
	成管状. 2 内吞过程中涉及的网格蛋白、 3 COPI与	二棕榈酰磷脂酰-N-磺化丽丝胺罗丹明的铵盐(Rh-
	COPII 4 则是通过自身聚集形成特定结构从而导致	DPPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、
	膜进行弯曲. 研究还发现, 固有曲率为锥形的跨膜	1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂磷脂酰甘油 (POPG)、二
	蛋白, 如烟碱样乙酰胆碱受体的跨膜结构域 5,6 或具	棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二棕榈酰磷脂酰甘油
	有电压依赖性的K + 通道蛋白, 会倾向于插入到与其	(DPPG)的有机溶液购于Avanti Polar Lipids公司, 纯
	相匹配的曲率膜中, 通过与附着蛋白发生进一步聚	度> 99%. 多肽Ac-KKKKKKLLLLLLLL-amide
	集, 从而改变细胞膜局部曲率. 7	(K 6 L 8 ), Ac-KLLKLLKKLLKLLK-amide (KL 2 KL 2 K) 2 ,
	膜蛋白本身结构复杂, 很难溶于水, 其功能一	Ac-KLLKLLLKLLKLLL-amide (KL 2 KL 3 ) 2 和Ac-
	般只有和膜相互作用时才体现出来, 这些都阻碍了	KKKKKKKKKKKKKK-amide (K 14 ) 购自吉尔生化
	人们对膜蛋白及其与膜作用机理的深入认识. 近年	公司(上海, 纯度> 98%). 实验用水为Milli-Q(Millipore)
	来发展起来的分而治之(divide and conquer)的策 略 8,9 很好地缓解了这一困境. 分而治之的基本思想	超纯水(电阻率为18.2 MΩ cm). ¢ 2.2 巨型脂质体(GUV)的制备
	就是把蛋白分割成不同序列的多肽, 分别进行研究,	巨型脂质体采用电形成法, 22 在由两层氧化铟
	然后把结果综合起来, 这使得问题大幅度简化. 在	锡(ITO)玻璃和厚度为2 mm的聚二甲基硅氧烷
	此基础上人们开发并研究了抗菌肽、 10 跨膜肽、 11	(PDMS)构成的腔室内制备. 装置的细节可参见
	穿膜肽 12,13 与融合肽等. 14 更进一步, 利用组成已知的	Dimitrov和Angelova 23 的工作. ITO玻璃依次用甲醇
	脂质体来代替细胞膜, 15 人们初步研究了这些多肽	溶液冲洗三次, 甲醇/氯仿溶液超声20 min, 氯仿溶
	以及聚多肽 16,17 与脂质体 18 的相互作用. 19 例如, 融合	液超声20 min, 甲醇超声20 min, 纯净水超声20 min,
	肽能够部分插入到脂质体膜中, 外露的部分能够通	最后自然晾干. 利用95%氯仿/5%乙腈的混合溶剂配
	过coil-coil作用 20 导致脂质体发生融合, 成功模拟了 体内snare蛋白的功能. 13 当多肽的α螺旋程度降低时,	¢ 置浓度为3.75 mg mL -1 的磷脂溶液. 在800 r min -1 、 ¢ 1 min的条件下将0.8 mL磷脂溶液旋涂在尺寸为50
	它对脂质体的破坏作用会显著下降. 21 这些研究对	mm × 50 mm × 1.1 mm的ITO玻璃上. 24 把ITO玻璃与
	于揭示细胞膜与蛋白作用的机理都是有帮助的.	PDMS组装成腔室, 25 °C预热10 min后, 往腔室中加
	但是到目前为止, 人们对多肽和脂质体膜的相 互作用研究还处在初级阶段, 对于一些机理的认识	入预热过的0.1 mol L -1 蔗糖溶液进行水化, 期间施 ¢ 加2.0 V、10 Hz的正弦交流电压. 4 h后, 电压调节为
	还存在争议, 例如穿膜肽的作用机理还不清楚, 多		
	肽序列和膜变形的关系还没有建立起来. 尽管多肽		表1 多肽序列
	与膜蛋白相比, 缺少了三级和四级结构, 但是可调		
	因素仍然很多, 包括氨基酸序列、二级结构、多肽	Name	Sequence
		(KL 2 KL 3 ) 2	Ac-KLLKLLLKLLKLLL-amide
	的长度、电荷密度和分布、疏水比例等. 这些因素	(KL 2 KL 2 K) 2	Ac-KLLKLLKKLLKLLK-amide
	都会对多肽与脂质体膜的作用效果带来影响.	K 14	Ac-KKKKKKKKKKKKKK-amide
	多肽与脂质体膜之间主要是静电相互作用和	K 6 L 8	Ac-KKKKKKLLLLLLLL-amide

Acta Phys. -Chim. Sin. 2015 Vol.31 3.0 V、5 Hz, 并持续1 h. 采用这种方法分别制备POPC 和POPC/POPG 摩尔比为4 : 1的巨型脂质体. 脂质体 3.1 多肽的二级结构 在水溶液中只有疏水比例较高的(KL 2 KL 3 ) 2 形 成α螺旋结构, 其它多肽均为无规结构. 而在疏水环 境中除了K 14 为无规结构以外, 其余多肽均以α螺旋 结构(含量> 50%)为主. 26 图1对比了四种多肽的三维 (3D)螺旋轮示意图. 其中K 14 也绘成了α螺旋结构以 方便对比. 从图1可以清楚地看到带电氨基酸和疏 水氨基酸的比例和分布. 3.2 K 14 与巨型脂质体作用 在四种多肽中, K 14 全部由正电氨基酸残基构成, (图2(C))图中可以清晰地观察到荧光分布的非均匀 性. 微相分离主要是因为K 14 与负电磷脂发生强的静 电吸引时, 会引起负电磷脂的聚集和重新分布, 从 而产生负电磷脂富集区和贫瘠区. 仅存在静电相互 作用时, 脂质体不会发生变形, 与文献 27 中的报道是 一致的. 3. 
3 (KL 2 KL 2 K) 2 和(KL 2 KL 3 ) 2 与巨型脂质体作用

  
		(KL 2 KL 2 K) 2 和(KL 2 KL 3 ) 2 在疏水环境中都能够形
		成两亲性α螺旋(图1). 二者的主要区别是带电氨基
		酸和疏水氨基酸的数目比例不同, 前者为6/8, 而后
		者为4/10.
		图3对比了(KL 2 KL 2 K) 2 和(KL 2 KL 3 ) 2 与中性
		GUV相互作用的结果. 在两种情况下, 环境中的钙
		黄绿素都进入到GUV内部, 表明发生了泄露. 在
		(KL 2 KL 2 K) 2 存在下, 泄露是逐渐发生的, 没有观察到
		诱导期的存在, 且最终GUV发生破裂(图3(A)); 而在
		(KL 2 KL 3 ) 2 存在下, 泄露存在诱导期, 速度也很慢, 但
	图1 四种多肽序列3D螺旋轮的对比图	整体膜并没有被破坏(图3(B)). 图3(C)对比了二者的
		动力学曲线, 利用指数增长模型对曲线进行拟合,
		结果显示(KL 2 KL 2 K) 2 和(KL 2 KL 3 ) 2 引起的特征泄露时
		间分别为145和178 s, 说明疏水比例较低的多肽



  仅有亮氨酸和赖氨酸构成的多肽, 由于序列和 电荷比的不同, 能够引起脂质体发生相变、泄露和 出芽等过程. 以静电相互作用为主的K 14 主要作用在 GUV的表面, 囊泡结构保存了完整性. 利用这种吸 附作用可以开发物理涂层多肽来改变脂质体的性 能, 32 因此这种作用可以认为是建设性的. 两亲性多 肽(KL 2 KL 2 K) 2 与(KL 2 KL 3 ) 2 能够引起脂质体发生泄露 和破裂, 泄露的动力学可以通过改变序列和疏水比 进行调控, 这种破坏性作用有助于开发高效抗菌肽. 而K 6 L 8 既具有破坏性作用, 也能够以吸附在表面和 插入到膜内的方式诱发出芽行为. 因此, 这种构象 变化行为是建设性和破坏性作用竞争的结果. 我们 预测调控多肽在脂质体表面的竞争作用能够引起 更多的构象变化行为. 考虑到K 6 L 8 和(KL 2 KL 2 K) 2 具 有相同的氨基酸组成, 只是序列分布不同, 二者与 脂质体作用的差异可归结为在膜中插入的深度和 作用强度不同. 这些结论对于了解膜蛋白的作用机 理是很有帮助的. 


	28,29
	结合K 6 L 8 的疏水残基分布, 推断向外出芽的机理如
	下: 多肽吸附到脂质体表面后增加了吸附区域的线
	张力, 导致线张力大于弯曲能, 且同时多肽中疏水
	的L 8 嵌段插入到中性GUV膜中, 但由于其长度只有
	膜厚度的一半, 因而造成巨型脂质体外层膜面积增
	加, 发生出芽. 30,31
	当K 6 L 8 与负电GUV相互作用时, 观察到了快速
	破裂的过程(图6). 这是由于K 6 L 8 与负电GUV的静电
	吸附能力太强, 大量表面活性剂形成胶束状结构,
	对GUV的膜造成了溶解型破坏.
	4 结 论

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China
Jian-Bo. Sun, Yu-Qiong. Xia, Qiu-Hong. Yu, De-Hai. Liang
Peptide-Induced Budding and Leakage Behavior of Giant Vesicles