Identification of SSR Markers Linked to Oil Content in Peanut (<I>Arachis hypogaea</I> L.) through RIL Population and Natural Population

Keywords: Peanut (Arachis hypogaea L.), Oil content, SSR, Marker assisted selection

Oil content has been an important quality trait for peanut. However, the progress in genetic improvement of oil content is slow. This is mainly due to the complex genetic basis, the high cost in oil content testing, and difficulty in phenotypic selection because of environmental influence. Therefore, marker assisted selection (MAS) is necessary for oil content improvement in peanut breeding. In the present study, F 8 RILs derived from a cross of Yuanza 9102×Zhonghua 5 were selected as materials. Ten RILs with extremely low oil content (about 52.91% on an average), twelve RILs with extremely high oil content (about 58.85% on an average) and the two parental lines were used to screen 631 simple sequence repeat (SSR) primers. Thirteen polymorphic bands of seven SSR primers were able to distinguish the extremely high and low oil content lines. Subsequently, the seven SSR primers were used to genotype the total RIL population. Based on the statistics of the SSR data from 20 lines with low oil content (less than 55%) and 45 lines with high oil content (more than 56%), we identified that a SSR marker, 2A5-250/240, was tightly linked to the oil content trait. The band 2A5-250 appeared almost in all low oil content lines with the match rate of 95.0%, while the band 2A5-240 appeared almost in all high oil content lines with the match rate of 88.9%. Detection of the marker 2A5-250/240 was conducted in 11 high oil (55.93% on an average) and 11 low oil (48.41% on an average) content peanut cultivars. The results showed that the match rates of the band 2A5-250 to low oil content materials and 2A5-240 to high oil content materials was 90.9% and 63.6%, respectively. In addition, the band 2A5-240 appeared in 10 of the 19 wild peanut (Arachis) lines 作 物 学 报 第 37 卷 with high oil content (about 58.60%). The results based on the analyses using RIL and natural populations demonstrated that the SSR marker 2A5-250/240 was useful for marker-assisted selection of oil content in peanut. 

花生是世界范围内广泛栽培的油料作物, 我国

花生总产的 60%用于榨油 [1] 。花生油含有多种抗衰 老成分, 尤其以单不饱和脂肪酸、白藜芦醇、β-植 物固醇、叶酸和微量元素锌 5 种抗衰老成分最为突 出, 是营养学界公认的具有预防心脑血管疾病功效 的食用油 [2] 。近年来, 我国花生生产得到了长足的 发展, 但由于生产上推广的花生品种含油量普遍偏 低, 导致产油量不高。目前生产上推广的 30 个主要 花生品种的平均含油量为 51.40%, 大粒型高产品种 的含油量多数在 50%以下 [3] 。 近年来, 我国已培育出 少量含油量达 55%左右的品种应用于生产, 但这些 含油量相对较高的品种一般为珍珠豆型, 荚果较小, 
产量潜力较低。因此, 提高花生的油分含量成为育 种家们追求的目标。 花 生 含 油 量 属 数 量 遗 传 性 状 , 受 环 境 影 响 较
大 [1,[4][5][6] , 鉴定和选择比较困难。 传统的含油量测试技 术繁琐, 费用较高, 而且经过抽提及含油量测试后, 的基因连锁的 QTL 区域的 SSR 分子标记, 筛选出目 的单株 [7] 。 这样既可以选择理想单株, 又可以缩短育 种年限, 通过这种方法可以更好更快地培育出一些 高产、优质、抗病的花生品种。分子标记技术在油 菜、大豆等油料作物的高油育种中广泛应用, 已确 定了多个与油菜、 大豆油脂含量相关的 QTL [8][9][10][11][12][13] , 部 分 QTL 可解释油菜油脂含量表型的变异。目前通过 分子标记辅助选择技术已经找到若干个与花生性状 相关联的分子标记 [14][15][16][17][18][19][20][21] , 如种皮深紫色 [14] 、抗北方 根结线虫病 [15] 、抗黄曲霉 [16] 、耐干旱胁迫 [17] 、晚斑 病抗性 [18][19] 、 锈病抗性 [18,20] 、 黄曲霉侵染抗性 [21] 
料 及 制 品 质 量 监 督 检 验 检 测 中 心 , 按 照 GB/T 14488.1-93 标准测试。 1.2 DNA 提取 选取供试材料幼嫩无病虫害的叶片, 用 CTAB 法提取基因组 DNA。用 1%琼脂糖凝胶电泳和紫外 分光光度计检测 DNA 的纯度和浓度, 全部 DNA 浓 度均调至 50 ng µL -1 , 保存于-20℃冰箱备用。 1.3 SSR 扩增 引物序列由国际半干旱研究所(ICRISAT)生物
技术实验室提供和文献查询所得 [23][24][25][26][27][28][29] , 由上海生工 公司和 Invitrogen 公司合成。依照本实验室建立的 优化体系进行 PCR 反应 [30] , 反应总体积 RIL 家系的含油量范围为 50.85%~62.11%, 23% The lanes in turn: J25, J27, J28, J29, J30, J31, J33, J34, J35, J36, J37, J38, J39, J40, J41, J42, J43, J44, J45, J48, J49, J50, J51, J52, J53, J54, J55, J56, J58, J59, J60, J61, J62, J63, J64, J65, J66, J67, J68, J69, J70, J71, J72, J73, J74, J75, J76, J77, J78, J79, J80, J81, J82, J83, J84. 栽培种花生较为丰富的多态性 [25,28] , 但与其他物种 
7 对 SSR 引物所扩增(图 1), 其中标记 2A5-250、 14F4-230、PM375-125、AC2B3-340、TC11A2-300、 TC9F10-280 为 大 部 分 低 油 材 料 所 拥 有 , 标 记 2A5-240 、 14F4-220 、 PM375-110 、 AC2B3-350 、 TC11A2-280、TC9F10-270、11H1-175 为大部分高 油材料所拥有, 初步推断这 7 对 SSR 标记可能与含 油量相关。 图 1 引物 2A5 在 RIL 群体含油量极端材料中的扩增
的 家 系含 油量 低 于 55%, 49%的 家 系含 油 量高 于 56%。因此, 将 RIL 群体的含油量<55%的家系定为 低油材料, 含油量>56%的家系定为高油材料。 为确 认标记的可靠性, 用这 7 对差异引物在 F 8 RIL 群体 中的 20 份低油材料(含油量<55%)和 45 份高油材料 (含油量>56%)中进行 SSR 扩增(图 2), 验证结果表 明(表 2), 引物 2A5 区分低油材料和高油材料检测 符合率较高, 标记 2A5-250 在 RIL 群体低油材料中 的检测符合率为 95.0%, 标记 2A5-240 在 RIL 群体 高油材料中的检测符合率为 88.9%, 其他 6 对引物在 RIL 群 体 中验 证 结 果 较 差 , 低 油 材料 的 符 合 率 为 60.0%~75.
- ＋ ＋ ＋ - - - ＋ - - ＋ ＋ - J2 50.85 ＋ - ＋ - ＋ - - ＋ - - ＋ ＋ - J5 52.76 - ＋ ＋ ＋ - - - - - - ＋ - ＋ J6 53.43 ＋ ＋ ＋ ＋ - - - ＋ - - ＋ ＋ - J8 58.33 - ＋ ＋ ＋ - - - ＋ - ＋ ＋ ＋ - J11 58.63 - ＋ ＋ ＋ - - ＋ - - - - - ＋ J12 58.90 - ＋ ＋ ＋ - - ＋ - - ＋ - ＋ ＋ J14 58.47 - ＋ ＋ ＋ - - - ＋ - ＋ ＋ ＋ - J19 53.84 - ＋ - ＋ - ＋ - ＋ - - ＋ ＋ - J26 53.04 - ＋ - - - ＋ ＋ - ＋ - - - ＋ J32 53.68 ＋ ＋ - ＋ - ＋ - ＋ ＋ - ＋ - - J46 51.33 ＋ - - - ＋ ＋ ＋ - ＋ ＋ - - - J47 53.71 ＋ - - ＋ - ＋ - - ＋ - ＋ - ＋ J57 53.60 ＋ - - - ＋ ＋ ＋ - ＋ ＋ - - ＋ J64 60.64 ＋ - - - ＋ ＋ - ＋ ＋ ＋ ＋ - - J72 58.69 ＋ - ＋ ＋ - - ＋ - ＋ - - - - J77 58.08 ＋ - - - ＋ ＋ ＋ - ＋ ＋ - - ＋ J85 58.93 ＋ - ＋ - ＋ - ＋ - ＋ ＋ - - ＋ J91 59.07 - ＋ ＋ - ＋ - ＋ - - ＋ - ＋ ＋ J92 59.87 ＋ - - - ＋ ＋ ＋ - - ＋ - ＋ ＋ J97 58.97 ＋ - - - ＋ ＋ ＋ - - ＋ - ＋ ＋ J111 58.46 ＋ - - - ＋ ＋ ＋ - ＋ ＋ - -
该标记与低油材料的符合率为 90.9%。 经 t 检验, 含 有标记 2A5-250 和标记 2A5-240 栽培种花生的含油 量达极显著差异水平。扩增结果表明, 在栽培种花 生 资 源 材 料 中 能 够 检 测 到 含 油 量 标 记 2A5-250/ 240。 进一步以 19 份高油(平均含油量为 58.60%, 变 异 范 围 为 57.12%~62.9%)野 生 花 生 为 材 料 , 鉴 定 2A5-240 的检测效率, 以高油材料 J64、J92 为对照, 扩增结果如图 4 
( 油 菜 、 水 稻 等 ) 相 比 , 花 生 的 多 态 性 仍 偏 低 。
Varshney 等 [17] 利用 1 145 对 SSR 引物构建栽培种花 生遗传图谱, 只有 12.6%能在亲本间检测出多态性。 Khedikar 等 [18] 在研究栽培种花生晚斑病和锈病 QTL 定位分析中发现, 栽培种花生的 SSR 引物多态性仅 有 6.15%。 本研究中, 选用 631 对 SSR 引物, 筛选有 间的杂交, 而很少吸收利用外来种质, 造成花生栽 培种质的遗传基础相对狭窄, DNA 多态性偏低 [31] 。 因此, 在花生的分子育种中, 还需大量开发分子标 记, 尤其是新型标记 [32] 。 在花生目标性状 SSR 分子标记研究方面, 国内 外主要集中在遗传性相对简单的质量性状(如抗病 性)上。Khedikar 等 [18] 利用 SSR 标记确定了 11 个与 花生晚斑病抗性相关的 QTL, 12 个与花生锈病抗性 相关的 QTL, 其中 QTLrust01 可解释表型变异的 6.9%~55.2%。洪彦彬等 [14] 通过遗传分析发现深紫色 种皮受一对不完全显性主效基因控制, 经过 SSR 引 
物 的 筛 选 , 发 现 控 制 该 性 状 的 基 因 与 SSR 标 记
PM93/630-600 连锁, 遗传距离为 5.4 cM。王辉等 [15] 利用分离群体采用 SSR 技术和 BSA 分析方法, 获得 与花生北方根结线虫病抗性基因连锁的 2 个 SSR 分 子标记 S32-380 和 S89-140, 标记与抗病基因间的遗 传距离分别为 4.421 cM 和 7.404 cM。洪彦彬等 [16] 发现标记 pPGSseq19D9 与黄曲霉抗性关联度最高, 
Pearson 相关系数达 0.913, 标记 pPGSseq19D9 的扩 增带型能直接区分抗感品种, 初步推断 pPGSseq- 19D9 可 能 与 一 个 贡 献 率 较 大 的 抗 黄 曲 霉 基 因 连 锁。 有 关 花 生 含 油 量 遗 传 研 究 报 道 较 少 , 禹 山 林
等 [5] 认为花生种子含油量由 2 对加性-显性-上位性 主基因+加性-显性多基因共同控制。陈四龙等 [6] 认 为不同亲本组合的花生含油量基因遗传特点差异明 显, 有 2 个杂交组合分离世代 F 2 符合主基因+多基 因遗传特征, 其含油量遗传受 1 对加性-显性主基因 +加性-显性-上位性多基因控制; 另外 2 个杂交组合 F 2 符 合 多 基 因 遗 传 特 征 。 廖 伯 寿 等 [22] 认 为 远 杂 9102×中花 5 号杂交后代衍生的重组近交系群体的 含油量受 2 对具抑制作用主基因+加性多基因控制。 Upadhyaya 等 [33] 也指出花生含油量性状受加性效应 和显性效应的共同控制。Wynne 等 [34] 认为因花生属 自花授粉作物, 加性效应可以被纯合的基因固定下 来。但是, 也有研究指出控制含油量遗传的显性基 因效应较强 [35] 。这些结果表明, 花生含油量遗传基 

Fig. 1

 1 Amplification results of polymorphic primer 2A5 1: J6; 2; J1; 3: J32; 4: J5; 5: J8; 6: J2; 7: J46; 8: J47; 9: J57; 10: J11; 11; J12; 12: J14; 13: J64; 14: J19; 15: J26; 16: J72; 17: J77; 18: J85; 19: J92; 20: J97; 21: J111; 22: J91. 


图 3 含油量标记

 3 2A5-250/240 在栽培花生品种资源中的检测 Fig. 3 Detection of marker 2A5-250/240 in 22 cultivated peanuts 1: zh.h4029; 2: Zhonghua 16; 3: zh.h0084; 4: zh.h3364; 5: zh.h4097; 6: zh.h4008; 7: zh.h3429; 8: Zhonghua 5; 9: Zhonghua 8; 10: zh.h2319; 11: zh.h0768; 12: Zhonghua 10; 13: Honghua 1; 14: Zhonghua 12; 15: zh.h2292; 16: zh.h2614; 17: zh.h3901; 18: zh.h4319; 19: zh.h4038; 20: zh.h0815; 21: zh.h0582; 22: zh.h0781. 


。

  从图 4 看, 虽然野生花生扩增出的 条带数比栽培种花生多, 但标记 2A5-250/240 依然 清晰可见。其中, 10 份高油野生花生能够检测到标 记 2A5-240 的存在, 结果进一步表明, 标记 2A5-240 与花生高油相关。 3 讨论 花生栽培种是异源四倍体(2n=4x=40), 其形态、 生理、 农艺性状存在丰富的变异, 但是, 早前的研究 表明, 栽培种花生的 DNA 多态性贫乏。近年来, 随 着多种标记的开发和应用, 发现 SSR 技术能检测到 


图 4

 4 含油量标记 2A5-250/240 在高油野生种花生资源中的检测 Fig. 4 Detection of marker 2A5-250/240 in 19 wild Arachis species with high oil content 1: A. spegazzina; 2: A. duranensis; 3: A. villosa; 4: A. macedoi; 5: A. hoehnei; 6: A. sp; 7: A. duranensis; 8: A. cryptotamica; 9: A. monticola; 10: A. rigonii; 11: A. rigonii; 12: A. sp; 13: A. stenophylla; 14: A. macedoi; 15: A. sp; 16: A. monticola; 17: A. villasa; 18: A. monticola; 19: A. sp; CK: J64, J92. 多 态 性 的 引 物 70 对 , 栽 培 种 花 生 的 多 态 率 仅 有 11.1%, 与前人的研究结果一致。花生栽培种 DNA 多态性水平偏低可能有两个方面的原因: (1)生产上 应用的花生栽培品种是野生种经栽培驯化而来, 二 倍体野生花生的多倍体化造成大量的野生种的等位 基因丢失。 (2)育种过程中, 只注重一些优良品种(系) 


础复杂得 1

 1 个与花生含油量相关的 SSR 分子标记 2A5-250/ 240, 其中扩增片段 2A5-250 为低油花生材料(含油 量<55%)所拥有, 片段 2A5-240 为高油花生材料(利用 RIL 群体和自然群体检测与花生含油量相关的 SSR 标记 1973 


2 结果与分析 2.1 RIL 群体中与含油量相关 SSR 标记的鉴定

  
	第 11 期	黄 莉等: 利用 RIL 群体和自然群体检测与花生含油量相关的 SSR 标记	1969
	10×buffer 1.0 µL, 25 mmol L -1 MgCl 2 0.8 µL, 10~20	
	ng 基因组 DNA, 10~40 pmol L -1 引物对, 300~400	
	μmol L -1 dNTP 和 0.8~1.2 U Taq DNA 聚合酶。反应	
	程序为 Touch Down 程序。PCR 产物经 95℃变性的	
	6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 用银染法染色。	
	1.4 数据分析		
	由于花生为异源四倍体物种, 基因组中有大量	
	重复、同源序列, 基因组结构复杂, 难以区分标记	
	等位基因。本研究将相同片段大小的谱带记作一个	
	标记位点, 有带记作 1, 无带记作 0。	
			10 µL, 含

根据 RIL 群体的含油量变异及分布, 挑选 10 份 低 含 油 量 材 料 ( 平 均 含 油 量 52.91%, 变 异 范 围 50.85%~53.84%)和 12 份高含油量材料(平均含油量 58.85%, 变异范围 56.88%~60.64%)以及亲本, 进行 SSR 引物多态性筛选。 试验选用 631 对 SSR 引物, 得 到多态性引物 70 对, 多态性比率为 11.1%。每对多 态性引物产生 1~7 条差异条带, 70 对多态性引物中 共检测到差异条带 183 个, 其中 46 对引物分别扩增 出 1~2 条差异带, 24 对引物分别扩增出 2~7 条差异 带。统计结果表明, 70 对差异引物扩增出的 183 个 差异条带中有 13 个差异条带能够有效区分 22 份材 料中的高油材料和低油材料(表 1), 13 个差异条带为 
Table 1 SSR markers associated with oil content 家系

 1 
		油量有关。
		2.2 标记 2A5-250/240 在自然群体中的鉴定
		由于栽培种花生资源中含油量高于 56%的材料
		较少, 本研究将含油量>55%的栽培种花生资源作定
		为高油材料, 含油量<55%的栽培种花生作为低油材
		料。用引物 2A5 对 22 份栽培种花生种质资源进行
		扩增, 扩增结果如图 3 所示。 在 11 份高油(平均含油
		量为 55.93%, 变异范围为 55.34%~57.07%)花生品种
		资源材料中, 有 7 份材料检测到标记 2A5-240, 其中
		有 2 份材料不仅扩增出片段 2A5-240, 还扩增出片
	0%, 高油材料的符合率为 44.4%~75.6%。	段 2A5-250, 标记与高油材料的符合率为 63.6%, 有
	进一步统计引物 2A5 在 RIL 群体中的扩增结果,	4 份材料检测到仅有片段 2A5-250。标记 2A5-250
	表明扩增出 2A5-250 条带的材料的含油量平均值为	在 11 份低 油 (平 均 含 油 量 为 48.41%, 变异范围为
	54.43%, 变 异 范 围 为 50.85%~58.98% 。 扩 增 出	47.67%~49.01%)品 种 资 源 材 料 中 的 检 出 率 较 高 ,

2A5-240 条带的材料的含油量平均值为 57.33%, 变 异范围为 54.01%~60.64%。经 t 检验, 含有标记 2A5-250 和标记 2A5-240 材料的含油量差异达极显 著水平。 这些结果表明, 标记 2A5-250/240 与花生含 在 10 份低油材料中发现该标记, 其中有 1 份材料 不仅检测到标记 2A5-250, 还检测到标记 2A5-240, 表 1 与含油量相关的 SSR 标记 
Table 2 Validation of SSR primers associated with oil content in the RILs population 引物名称

 2 
	＋

第 11 期 黄 莉等: 利用 RIL 群体和自然群体检测与花生含油量相关的 SSR 标记 1971 表 2 与含油量相关的 SSR 引物在 RIL 群体中的验证 图 2 引物 2A5 在 RIL 群体中的扩增 Fig. 
2 Amplification of marker 2A5-250/240 in the RIL population
Li Huang, Xin-Yan Zhao, Wen-Hua Zhang, Zhi-Ming Fan, Xiao-Ping Ren, Bo-Shou Liao, Hui-Fang Jiang, Yu-Ning Chen
Identification of SSR Markers Linked to Oil Content in Peanut (<I>Arachis hypogaea</I> L.) through RIL Population and Natural Population