Development and application of EST-derived SSR markers for bananas (<I>Musa nana Lour</I>.)

Keywords: 国家自然科学基金(编号：30460070)、海南省自然科学基金(编号：80436)、科技部科技基础条件平台(编号：2005DKA21000-5-001) banana, EST, EST-SSR, genetic diversity, cluster analysis

A total of 2 284 banana unigene sequences were mined, resulting in the identification of 122 SSRs in 110 sequences. Among them, there were 37 motifs the overall average length of SSRs was 20 bp. The trinucleotide repeats appeared to be the most abundant SSRs (47.6%), followed by dinucleotide repeats (33.1%), whereas the tetranucleotide repeats were less abundant. The rich repeats AG and AGG were predominant, accounting for 75.7% and 36% in dri-and tri-nucleotide repeats respectively. A total of 63 primer pairs were designed and tested against genomic DNA of Brazil. Forty-one primers could be validated as usable markers. Nineteen of these primers revealed moderate to high polymorphism information content (PIC) across 49 accessions. The polymorphic bands were ranged from 4 to 12, averagely 7.58. The mean PIC value was 0.7324, ranging from 0.3572 to 0.8744. Forty-nine banana varieties were separated into two major 第 30 卷 clusters closely corresponding with the genome composition by UPGMA analysis. The results showed that the EST-SSR markers were of great value in evaluation of banana germplasms. 

DNA 提取和银染的方法参照文献 [14] 。 
1.4 统计分析 统计条带时, 有带用"1"表示、无带用"0"表示、 缺失用"9"表示。采用 Nei 的方法计算相似系数： GS=2N ij /(N i +N j ), 当中的 N i 、N j 、N ij 分别表示第 i 个材料扩增带数、第 j 个材料的扩增带数、第 i 和第 j 个 材 料 扩 增 的 共 有 带 数 [15] 。 计 算 多 态 信 息 量 (Polymorphism information content PIC)为 PIC=1- Σp i 2 ,
其中 p i 表示第 i 个条带的频率 [16] 。 用 UPGMA (Unweight pair group method with arithemetic averages)方法, 应用 NTSYS-pc 2.10 软件 [17] 进行聚类分 析, 绘制树状图。 122 个 SSR, 占 EST 序列总数的 5.3%。这个比率较 高 于 甘 蔗 的 2.9% [18] 、 水 稻 的 4.7% [19] 、 棉 花 的 4.64% [20] , 但 远 低 于 大 白 菜 (10.4%) [21] 、 茶 树 (17.68%) [22] 、柑橘(21.56%) [23] 和咖啡(17.3%) [24] 等。 这种差异可能是物种间的真实 SSR 信息差异或各个 
2 结果与分析 2.1 香蕉 EST-SSR 的开发 在搜索的总长为 1 322.716 kb 的 2 282 条香蕉 EST 序列中, 共检测出分布于 110 条 EST 中的 122 个 SSR, 占全部 EST 的 4.8%, 出现频率为 5.3%, 其 中含 1 个 SSR 的序列有 99 条, 含 2 个 SSR 的序列 有 10 条, 含 3 个 SSR 的序列有 1 条。SSR 长度在 15～36 bp 之间, 平均长度为 20 bp。在所检测含有 SSR 的 EST 序列中, 二核苷酸重复单元的有 37 条, 占所检出总数的 33 
个 ; SSR 引 物 的 多 态 信 息 含 量 (PIC) 为 0.3572~0.8744, 平 均 0.7324, 最 低 的 是 引 物 EST-SSR36, 最高的是引物 EST-SSR79。图 1 所示 为引物 EST-SSR01 和 EST-SSR36 在 49 个品种(系) 上的扩增图谱。 用筛选好的引物对香蕉品种进行聚类分析(图 12 
物种在 GenBank 中可用来分析的 EST 数量不同, 用 来搜索 SSR 的软件的不同算法及所设定的参数不同 造成的。 从 目 前 报 道 的 结 果 来 看 , 大 多 数 植 物 的
EST-SSR 都是以三核苷酸重复基元为主。甘蔗 [18] 、 棉花 [20] 、大白菜 [21] 、小麦 [25] 的 EST 中三核苷酸重 复在检出的所有 SSR 中所占比例最大(不计单核苷 酸重复), 分别为 90%、54.8%、33.15%、78%。Cardle 
等 [26] 在对水稻、玉米、大豆、番茄、棉花、杨树和 拟南芥的 EST 序列分析后发现, 在 EST-SSR 中, 最 多 的 是 三 核 苷 酸 重 复 类 型 , 其 次 是 二 核 苷 酸 。
Varshney 等 [27] 在大麦、小麦、玉米、燕麦、黑麦、 高粱和水稻等主要的禾谷类作物的 EST 序列分析中 发现, 三核苷酸重复出现次数最多(54%～78%), 其 次为二核苷酸重复(17%～40%)。本研究与前人研究 结果一致, 三核苷酸重复是香蕉 EST 中的主要类型, 占 SSR 总数的 46.7%。 AAG/CTT 是香蕉三核苷酸重 复中出现频率最高的, 占 36%, 这与大白菜 [21] , 茶 树 [22] , 柑橘 [23] , 咖啡 [24] , 拟南芥 [26] , 大豆 [28] 等中的 情形相一致。而在禾谷类作物水稻、高粱、大麦和 玉米中, CCG 是三核苷酸重复中的主要类型。本研 究结果进一步验证了 Gao 等 [28] 认为在双子叶植物中 AAG/CTT 重复丰度很高的推测。研究发现, 在二核 苷酸重复 SSR-ESTs 中, 含 AG/TC 重复单元的最 多,而含 GC/CG 重复单元的数量最少 [19,22~25] 

到 1 , 3 讨 论 3 . 1

 1331 ), 这些引物可以把 49 个品种在相似系数 0.63 的水 平区分为两个类群：第Ⅰ类群香蕉品种的基因型构 成为 BB、ABB、ABBB、AABB、AAAB; 第Ⅱ类群香 蕉品种的基因型构成为 AAA 和 AAAA, 分类结果与 基因型的组成类型基本一致。第Ⅰ类群品种间的相 似系数范围为 0.5541 到 0.9054; 第Ⅱ类群为 0.7162 其中洪都拉斯(1)、 洪都拉斯(2) 、 洪都拉斯(3)、 洪都拉斯(4)和 M-931 等 5 个品种之间, 高脚青芽蕉、 高脚顿地雷、华农甜蕉和华农 15 号 4 个品种之间, 以及台蕉和北蕉两个品种的相似系数都为 1, 可见 这些 EST-SSR 引物还不能区分这些基因型为 AAA 的 香蕉品种。 香蕉 EST-SSR 分布频率、特点 本研究首次分析了香蕉 EST 中 SSR 分布, 并初 步探讨了 EST-SSR 在香蕉品种分类与鉴定研究中 的可行性。在对 2 282 条香蕉 EST 进行搜索发现了 


图 1 。 3 . 3

 133 引物 EST-SSR01(A) 和 EST-SSR36(B)在 49 个香蕉材料中的扩增结果 Fig. 1 Amplified results of 49 accessions by using EST-SSR01(A) and EST-SSR36 (B) 图 2 49 个香蕉品种的聚类图 Fig. 2 Dendrogram of banana varieties based on the SSR data种 含 B 基 因 型 的 品 种 。 宁 淑 萍 等 [9] 利 用 10 对 Genomic-SSR 引物对 14 个香蕉主栽品种和 33 个 INIBAP 引进品种进行分析, 发现不能完全区分基因 型为 AAA 的品种, 本研究也遇到了类似的问题, 这 可能是由于 AAA 型品种是经过体细胞突变选育而来, 其遗传组成变化非常有限的结果。 香蕉基因型是 Simmonds 等 [29] 根据形态特征进 行 评 分 来 划 分 的 , 也 就 是 采 用 数 量 分 类 学 进 行 鉴 定。本研究以 EST-SSR 引物进行分析的结果显示, 所有香蕉品种可以分为两大类群, 一组含 B 基因组, 一组不含 B 基因组, 这基本与Simmonds 形态分类的 结果相一致, 也说明了 EST-SSR 引物在鉴定香蕉种 质亲缘关系中的有效性。但是, 我们也发现聚类分 析中的第Ⅰ类群中, 含 B 基因组的香蕉遗传多样性 第 7 期 王静毅等: 香蕉 EST-SSRs 标记的开发与应用 939 丰富, 特别是 ABB 基因型被聚类到多个组中, 比 Simmonds 形态分类结果分的更清晰香蕉 EST-SSR 研究利用的展望 利用基因组开发 SSR 程序复杂和高费用是限制 SSR 开发的主要因素。用香蕉 EST 开发 SSR 引物是 一种经济且实用的开发途径。EST-SSR 引物起源于 表达序列, 这可能会为这些表达序列标签所产生的 功能基因进行精确地标记, 可以鉴定出一些重要性 状。 目前 EST-SSR 引物已经被用于遗传多样性分析、 品种鉴定、遗传作图、基因发掘等。本实验结果也 证明了香蕉 EST-SSR 标记对分析香蕉资源和品种鉴 定是可行的。截至 2007 年 6 月 28 日, 数据库中的 香蕉 EST 序列已达 9 056 条, 我们正在对这些新增 的香蕉 EST 序列作进一步的分析, 以期从中开发出 更多 EST-SSR 标记, 加速和促进香蕉 EST 资源的开 发利用、绘制遗传图谱、及芭蕉科植物种属间分子 标记转移扩增和遗传多样性分析等方面的研究。 参考文献(References): 


Table 1 Banana varieties for SSR ananlysis

 1 
	1 材料和方法
	1.1 材料
	实验材料取自中国热带农业科学院热带作物品
	种资源研究所香蕉种质圃(表 1), 采取健壮植株的细
	嫩卷筒叶, 用液氮冷冻后放入-70℃冰箱保存备用。

Table 2 Number and frequency of repeat types in SSR-ESTs

 2 
	重复核苷酸数 Number of repeats	SSR-ESTs 数量(条) Number of SSR-ESTs	占所有 SSR-ESTs 的 百分比 % of SSR-ESTs with SSRs	SSR 数目 Number of SSR	占全部 SSR 比例 Proportion in all SSRs (%)	出现频率 Frequency	平均分布频率 Average dis-tance (1/kb)
	二核苷酸	37	33.6	41	33.6	1.8	32.26
	Dinucleotide						
	三核苷酸	49	45.5	57	46.7	2.5	22.42
	Trinucleotide						
	四核苷酸	5	4.5	5	4.1	0.2	264.54
	Tetranucleotide						
	五核苷酸	9	8.2	9	7.4	0.4	146.97
	Pentanucleotide						
	六核苷酸	10	8.2	10	8.2	0.4	146.97
	Hexanucleotide						
	SSR-ESTs 总数	110	100	122	100		10.75
	Total numbers						

.6%; 含三核苷酸重复单元的有 49 条, 占所检出总数的 45.5%(表 2), 这两种核苷酸 重复单元占多数, 合计占所有检出总数的 79.1%。 四、五、六核苷酸的 SSR 数量较少, 三者共占所有 检出总数的 20.9%。在含有二核苷酸重复单元的香 蕉 EST 序列中, GA/TC 重复单元最多, 约占 75.5%; 三核苷酸重复单元的香蕉 EST 序列中, 以 AAG/CTT 重复单元最多, 其次是 GCA/CGT、 CCT/GGA 和 CCG/GGC(表 3)。 表 2 SSR-ESTs 序列中不同重复核苷酸数的数量及百分比 表 3 SSR-ESTs 序列中不同重复类型及其数量和百分比 
Table 3 Frequency, number and type of SSRs in SSR-ESTs

 3 
	重复核苷酸数 Number of repeats	重复单元 SSR motif	EST 数量(条) Number of EST	百分比 Percentage (%)
	二核苷酸	GA/TC	28	75.7
	Dinucleotide	AT/TA	8	21.6
		GT/AC	1	2.7
		GC/CG	0	0
	三核苷酸	CCA/TGG	3	8.0
	Trinucleotide	CCG/CGG	6	12.0
		CAA/TTG	1	2.0
		AAG/CTT	18	36.0
		CCT/AGG	7	14.0
		ATT/AAT	2	4.0
		GCA/TGC	8	16.0
		ATG/CAT	2	4.0
		TCG/CGA	1	2.0
		GAC/GTC	1	2.0

2.2 EST-SSR 引物的应用本研究利用多态性好且稳定的引物 19 对(表 4), 对 49 个香蕉品种进行 PCR 扩增, 共检测出 144 个扩 增条带, 其中 141 个具多态性, 每对引物扩增条带 数目范围为 4～12 个, 平均 7.58, 以引物 EST-SSR20 和 EST-SSR36 最少, 为 4 个, 引物 EST-SSR23 最多, 为 
Table 4 Information of 19 primers

 4 
	引物名称	引物序列	重复类型	预期产物	扩增产物	扩增带数	多态性条带数	多态信息含量
	Marker name	Primer sequence (5′ →3′ )	SSR motif	Expected product (bp)	Product size range (bp)	No. of bands	No. of polymorphic bands	PIC
	EST-SSR01	F: ATCTTGTAGACTCGGTGGTG R: GGTATGCATTCAGTCCATTT	(TTC) 6	152	141-353	11	11	0.8516
	EST-SSR09	F: CACGAACAGACTGAGTTGAG R: GAGGATGGTGATGTAGAGGA	(AG) 8	262	239-425	6	6	0.7801
	EST-SSR10	F: GCAGGAATCATTCACAAGAT R: TAGCAAGGTGTCAAAGGTCT	(AGA) 10 ; (CAG) 5 ;(GGA) 5	348	315-510	5	4	0.6016
	EST-SSR14	F: GGAATATTCACCAGCTCTCA R: GACTGGACCATGCATTACTT	(TC) 9	178	163-300	12	12	0.8507
	EST-SSR18	F: AATTGCAGGAAGATCAACTG R: AACATGTCTTTGACACCCTC	(TTC) 7	212	203-279	6	6	0.7423
	EST-SSR20	F: GCAGTGGTAGGTAGCTTGAC R: GGCAGCTCAACCATACTATT	(TCT) 6	218	226-293	4	4	0.664
	EST-SSR23	F: TTCACTGAATACCTCAAGGG R: GCCTTGCTCATACAATGATAC	(AG) 11	117	100-306	12	12	0.807
	EST-SSR24	F: ACATCTACAATGGCGATTTC R: TAATGAATCTGTAGGACCCG	(CCT) 6	166	155-215	5	4	0.6661
	EST-SSR26	F: AAAGCTCATTCTAAGAGGCA R: TGTCTCGTTTATCTCGGTCT	(GCA) 6	215	169-299	7	7	0.7724
	EST-SSR29	F: CCGTGTTACAGATTGTATTCC R: AGGTAGTCGCCATATGTCTC	(GA) 16	240	214-264	5	5	0.7742
	EST-SSR36	F: CTTCTCTTGCTTGAATTGCT R: GAACACCACTGAACACACAT	(GATGCT) 4 ; (TGC) 6	125	92-125	4	4	0.3572
	EST-SSR48	F: TTCCCTAGTCTCGTTCCTCT R: GCTGGACTCCTCCAAATTC	(TC) 13	106	85-110	6	5	0.7917
	EST-SSR52	F: CGTTAAAGGTTTGGAAAGAG R: GAAGGTAACGAAGCTGACAC	(GA) 16	198	170-307	8	8	0.7809
	EST-SSR53	F: TCCAGGTCTTTAATAGCAGC R: TCCCGTTCAATTAGTCCTTA	(TGC) 6	367	365-540	9	9	0.8589
	EST-SSR57	F: GTTCCCACTTCCCTGTTC R: CAAGAACCCATCAAGAAGTC	(CCT) 7	239	235-377	8	8	0.8062
	EST-SSR60	F: TACTACATCCTTGCCACCTC R: CCCACAACGATAAACACAC	(AT) 9	169	138-320	9	9	0.744
	EST-SSR64	F: AACTGTCTGTCTGTCGCTCT R: ACTGGAATCAACATTTGGAG	(CACTG) 4	241	220-400	6	6	0.4216
	EST-SSR67	F: CACTCTTTGTCGTGCAAC R: GTGAAACGAATGGGATTTAG	(CTT) 8	138	125-183	10	10	0.7699
	EST-SSR79	F: GCTCACCAAATCCATCAG R: TTAAGGACAACAGGAGGAGA	(TC) 9	147	135-300	11	11	0.8744

, 实验 的结果也证明了这一点。 3.2 香蕉 EST-SSR 引物的应用性 香蕉 EST-SSR 引物在检测香蕉栽培品种遗传关 系是有效的, 可以基本反映出实验材料的遗传组成 情况。本研究开发的 EST-SSR 引物能区分香蕉含 B 基因组和不含 B 基因组的品种, 并能很好地鉴定各 表 4 19 对多态引物信息表 
和农业部南亚热作专项(2007)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30460070 ) , Natural Science Foundation of Hainan Province (No.80436), the National Facilities and Information Infrastructure for Science and Technology (No. 2005 DKA21000-5-001) and Ministry of Agricultural Special Foundation of South Asia for Tropical Plant (2007) ] 作者简介: 王静毅(1978-), 女, 博士研究生
Jing-Yi Wang, Chen Ye-Yuan, Wei-Liang Liu, W U Yao-Ting
Development and application of EST-derived SSR markers for bananas (<I>Musa nana Lour</I>.)