Keywords: Dr Ivana Bjelobaba, viši naučni saradnik, Univerzitet u Beogradu, Institut za biološka istraživanja "Siniša Stanković", Dr Nadežda Nedeljković, redovni profesor, Univerzitet u Beogradu, Biološki fakultet astrocytes, adenosine, equilibrative nucleoside transporter, traumatic brain injury, ectonucleotidases, cell culture, purinergic signaling

Prof dr Aleksandri Isaković se zahvaljujem na sugestijama koje su dodatno oblikovale ovaj rad. Takođe, hvala na razgovorima tokom (nažalost) malobrojnih susreta na konferencijama koji su bili inspiracija za neke delove ove teze. 
Dr Danijeli Laketi hvala na tome što je bila izvanredan asistent, divna koleginica, prijatelj, i konačno član Komisije. 
Dr Danijeli Savić hvala na tome što me je naučila radu u kulturi, na sjajnom timskom radu u laboratoriji, na svim savetima i svim kafama, na beskrajnim razgovorima (posebno onim kojima smo radovale mobilne operatere), a najviše na iskrenosti. 
Posebnu zahvalnost dugujem Jasmini Savić na tome što me je učila UPLC metodi, na njenoj predanosti, na tome što je radila sa mnom na delu ove teze kao da je njena. Hvala joj što je podelila sa mnom svoj entuzijazam prema nauci, cveću i vožnji. 
Dr Sanji Peković hvala na pomoći kad god je ista bila potrebna, na savetima, i dobroj atmosferi i smehu. 
Veliko hvala mojim koleginicama bez kojih bi u laboratoriji (u najmanju ruku) bilo dosadno; Ireni, Ivi, Sanji i Anji hvala na kolegijalnosti, prijateljstvu, sjajnoj atmosferi. 
Posebno se zahvaljujem prof dr Markus Kipp-u na prilici da radim i učim u njegovom timu u Ahenu. Hvala Timu, Katharini i Jonu na tome što sam se u njihovoj laboratoriji osećala kao u svojoj. Hvala im i na prijateljstvu koje je po svoj prilici dugoročno. 

I UVOD

Koncept purinske signalizacije je prvi put predstavio Geoffry Burnstock 1972. godine [1]. Ideja da je najvažniji energetski molekul, adenozin trifosfat (ATP), posrednik u međućelijskoj komunikaciji je osporavana narednih 20 godina. 
Burnstock je otišao i korak dalje, hrabro sugerišući da je ATP kotransmiter, što je bilo u suprotnosti sa tada široko prihvaćenim Dejlovim principom -jedan nerv jedan transmiter [2]. Devedesetih godina, nakon što su purinski receptori farmakološki identifikovani i klonirani, ideja purinske signalizacije konačno biva u potpunosti prihvaćena od strane naučne javnosti [3,4]. Do danas je objavljeno preko 19 500 radova u oblasti purinske signalizacije u različitim oblastima, uključujući i fiziologiju biljaka. 
Signalizacija adeninskim nukleotidima i nukleozidima, koji svoje dejstvo ostvaruju preko P1 i P2 receptora, je evolutivno vrlo konzervirana. Takođe, neosporna je njihova uloga u orkestriranju fizioloških stanja kao što su embrionalno i rano postnatalno razviće, sinaptička plastičnost i različite kognitivne funkcije [5]. Osim toga, nukleotidi i nukleozidi su važni učesnici u patološkim procesima vezanim za traumatsku povredu centralnog nervnog sistema, ishemiju, neurodegenerativne bolesti, neuroinflamaciju, epilepsiju i neuropatski bol [6]. 
Posebno mesto u patologiji nervnog sistema pripada adenozinu, pre svega zbog njegovih neuroprotektivnih svojstava. Upravo zato brojne komponente adenozinskog signalnog sistema predstavljaju potencijalne mete farmakoloških manipulacija. 
Ova doktorska teza, kao nastavak prethodnih istraživanja naše grupe, daje doprinos boljem razumevanju adenozinskog signalnog sistema nakon traumatske povrede mozga, sa posebnim osvrtom na ulogu astrocita u kruženju adenozina. 

Komponente adenozinskog sistema 1.Adenozin u centralnom nervnom sistemu

Nukleozid adenozin (Ado) je prisutan u svim ćelijama i telesnim tečnostima živih organizama gde ostvaruje raznovrsne fiziološke efekte. Uloga Ado kao senzora metaboličkog stanja i modulatora bioloških funkcija u brojnim tipovima ćelija, tkivima, organima i fiziološkim procesima je dobro poznata ali mehanizmi njegovog delovanja nisu u potpunosti razjašnjeni. Ado ima važne uloge u kardiovaskularnom sistemu [7], CNS-u [8][9][10][11][12], prenosu informacija o oštećenju tkiva i medijaciji osećaja bola [13], gastro-intestinalnom traktu [14], i imunskom sistemu [15]. U srcu i mozgu, delovanje Ado je u najvećoj meri zasnovano na kontroli nadražljivosti. 
U CNS-u Ado se ponaša kao neuromodulator, kontrolišući mnoge funkcije mozga uključujući budno stanje i spavanje, lokomociju, anksioznost, kogniciju i memoriju [16]. Produkcija Ado, i unutar i vanćelijska, je usko povezana sa energetskim procesima; do povećanja vanćelijskog nivoa Ado dolazi tokom pojačanog utroška energije u ćeliji. U fiziološkim uslovima, Ado se u vanćelijskoj sredini nalazi u niskim nanomolarnim koncentracijama (30-300nM) [17]. 
Metabolički stres povezan sa patološkim događajima u CNS-u, vodi brzom povećanju vanćelijskog Ado do 10-50 µM [18]. Vanćelijski Ado svoje efekte ispoljava modifikujući potencijal membrane i sledstveno tome, sinaptičku transmisiju [19]. Disfunkcija u signalizaciji posredovanoj Ado u CNS-u je povezana sa mnogim neuropatijama, posebno sa moždanim udarom, epilepsijom, Parkinsonovom bolešću, depresijom, anksioznošću i šizofrenijom [20]. 

Signalizacija adenozinom i adenozinski receptori

Efekti Ado su posredovani P1 familijom membranskih receptora. Do sada su identifikovana četiri receptora spregnuta sa proteinom G -A1, A2A, A2B i A3 (Slika 1). Inhibitorni receptori, A1 i A3, inhibiraju adenil ciklazu, to jest smanjuju nivo cAMP-a [21]. U CNS-u najzastupljeniji su A1 i A2A receptori [16,19]. Slika 1. Šematski prikaz P1 receptora. A1 i A3 receptori su inhibitorni, a svoje efekte ostvaruju aktivirajući βγ subjedinicu Gi zavisne kaskade. Njihova aktivacija vodi efluksu K + i smanjenju ekscitabilnosti neurona. A2A i A2B su spregnuti sa Gs proteinima, i njihova aktivacija rezultuje povećanju unutarćelijskog cAMP i aktivaciji PKA. Takođe je primećen porast unutarćelijskog Ca 2+ nakon aktivacije A2B receptora uparenspregnutog sa Gq proteinom. Modifikovano prema R. Elaine Bucheimer i Joel Linden-u [22]. 

A1 receptor

U poređenju sa drugim podtipovima Ado receptora, A1 receptor ima najveći afinitet za Ado i snažno je eksprimiran na neuronima kore, hipokampusa, malog mozga i u dorzalnoj sivoj masi kičmene moždine [16]. A1 se, osim na neuronima [23,24], eksprimira i na astrocitima [25], mikrogliji [26] i oligodendrocitima [27]. 
Aktivacija A1 receptora izaziva smanjenje aktivnosti ekscitatornih sinapsi, pokretanjem Gi i Go zavisnih puteva i smanjenju aktivnosti adenil ciklaze [19,28]. Aktivacija A1 receptora s jedne strane dovodi do hiperpolarizacije neurona otvaranjem K + kanala kao i do inaktivacije nekoliko tipova presinaptičkih Ca 2+ kanala, što rezultira smanjenim oslobađanjem neurotransmitera kao što su glutamat, acetilholin, dopamin, noradrenalin i serotonin. Pored smanjene nadražljivosti, inhibicija adenil ciklaze vodi i smanjenju metaboličkih procesa u neuronima [17,[29][30][31]. Povećanje koncentracije vanćelijskog Ado i njegovo delovanje preko A1 receptora bi moglo predstavljati neuroprotektivni pristup u tretmanima ishemije, traume i sličnih patoloških stanja. 

A2A receptor

Prisustvo A2A receptoraje posebno izraženo u nekim tkivima, kao što su imunske ćelije, endotel ili glatke mišićne ćelije krvnih sudova. Takođe, iRNK za A2A je u visokoj meri prisutna u slezini, oku, skeletnim mišićima, srcu, plućima, i materici [32,33]. U CNS-u sisara, A2A receptor je visoko eksprimiran u dopaminom bogatim regionima, kao što su strijatum, globus pallidus, nucleus accumbens, olfaktrone tuberkule [34]. A2A receptor je vezan za stimulatorni Gs protein što, po aktivaciji receptora, vodi stimulaciji adenil ciklaze. Stimulacija A2A receptora aktivira Ca 2+ kanale, Na + kanale i NMDA receptore u strijatumu [35][36][37]. Aktivacija A2A receptora takođe je povezana sa povećanim oslobađanjem glutamata, acetilholina i serotonina [19]. Za razliku od A1 posredovane neuroprotekcije, A2A agonisti doprinose povredi u ishemičnim i ekscitotoksičnim modelima i smatra se da se ekscitotoksična smrt neurona, u izvesnoj meri može pripisati aktivnosti A2A [17,38]. 
A2A signalizacija se dovodi u vezu sa nizom oboljenja kao što su Parkinsonova, Hantingtonova i Alcahjmerova bolest, zatim šizofrenija, fobije, depresija, i bipolarni poremećaji. 

A2B receptor

A2B receptori se mogu naći na svim ćelijama i imaju nizak afinitet za Ado. 
Iako je nisko eksprimiran, A2B je široko rasprostranjen u mozgu [32]. 
A2B je takođe ekscitatorni receptor, koji povećava aktivnost adenil ciklaze aktivirajući Gq i Gs proteine [39]. U CNS-u ovaj receptor može stupiti u interakciju sa inflamatornim citokinima prilikom traumatske povrede mozga (TBM) i u [40]. 
Fiziološke uloge A2B receptora su opisane u astrocitima, fibroblastima, gastrointestinalnom traktu, i krvnim sudovima. 

A3 receptor

A3 receptor je poznat po svojoj specifičnoj distribuciji i ekspresiji u različitim vrstama. Tako je, na primer, A3 najzastupljeniji kod ovce, zatim čoveka a najmanje je prisutan kod glodara. Pri tome, farmakološki profil A3 receptora kod ljudi je sličniji onome kod ovce [41,42]. Kod čoveka, ekspresija A3 je vrlo visoka u plućima i jetri dok je najniža u aorti i mozgu [42]. U CNS-u, A3 receptor je eksprimiran na neuronskim i glijskim ćelijama [43]. Umerena ekspresija je nađena u malom mozgu i hipokampusu a nešto niža u drugim delovima mozga [44]. A3 receptor je spregnut sa inhibitornim Giα2, Giα3 i Gq/11 proteinima, i negativno utiče na aktivnost adenil ciklaze [45]. Aktivacija A3 receptora stimuliše fosfolipazu C (PLC) i povećava nivoe inozitol 3-fosfata (IP3) i unutarćelijskog Ca 2+ . U poređenju sa ostalim adenozinskim receptorima, najmanje se zna o A3 receptoru. Što se tiče neuroprotekcije, pokazano je da A3 receptor ima funkcionalnu vezu sa A1 receptorom: aktivacija A3 receptora dovodi do prekida inhibicije ekscitatorne transmisije posredovane A1 receptorom [46]. Smatra se da A3 receptor može imati dvojnu prirodu po pitanju neuroprotekcije i neurodegeneracije: dodavanje A3 agonista kod pustinjskog miša značajno pojačava posledice ishemije, iako hronična stimulacija ima zaštitnu ulogu u modelu moždanog udara, dok kod A3-nokaut miševa pokazana smanjena sposobnost neuroprotekcije [47,48]. In vitro studije takođe govore u prilog neuroprotektivnog efekta nakon aktivacije A3niske koncentracije agonista ovog receptora, IB-MECA, su iskazale protektivno svojstvo u primarnim kortikalnim kulturama podvrgnutim deprivaciji kiseonika i glukoze [48]. Ipak, više koncentracije IB-MECA aktiviraju kaspaze i indukuju apoptozu astrocita [49] ili neurona u kulturi [50]. 

Transport adenozina

Vanćelijski Ado može nastati vanćelijskom defosforilacijom ATP i drugih adeninskih nukleotida od strane ekto-nukleotidaza ili oslabađanjem Ado iz ćelija putem transportera. 
Unutarćelijska produkcija Ado se bazira na tri moguća izvora: adenozinski nukleotidi, cAMP ili S-adenozilhomocistein (SAH). Najveći deo Ado nastaje defosforilacijom ATP do AMP posredstvom citosolnih nukleotidaza. Nešto manje je poreklom od reverzibilne konverzije SAH do Ado delovanjem SAH hidrolaze ili konverzijom cAMP do Ado fosfodiesterazama [51]. 
Sve je više dokaza koji ukazuju na važnost nukleozidnih transportera (NT) u regulaciji vanćelijske koncentracije Ado. Jednom formiran, Ado se brzo uklanja iz vanćelijskog miljea pasivnim ili aktivnim transportom preko NT-ova, podeljenih na ekvilibrišuće nukleozidne transportere (ENT) i koncentrišuće nukleozidne transportere (CNT) [52][53][54]. 

Ekvilibrišući nukleozidni transporteri

Do danas su opisana klonirana i identifikovana kod čoveka, pacova i miša četiri tipa ENT, [55][56][57][58]. ENT posreduju u pasivnom, dvosmernom transportu olakšanom difuzijom različitih purina i pirimidina kroz ćelijske membrane. Pre identifikacije specifičnih gena, ENT su klasifikovani prema osetljivosti na nitrobenziltioinozin (NBPMR): es (NBPMR osetljivi) i ei (NBPMR neosetljivi) [59]. 

ENT1

U klasičnoj nomeklaturi, ENT1 je identifikovan kao "es"", to jest, nitrobenziltioinozin (NBMPR) osetljiv transporter i označen kao SLC29A1 [60]. 
ENT1 je inhibiran pri nanomolarnim koncentracijama NBMPR kao i u prisustvu dipiridamola (DPM) i dilazepa [60]. ENT1 je takođe inhibiran tirozin-i serin/treonin-kinaznim inhibitorima [61] ali i niskopotentim benzodiazepinima [62]. Humani ENT1 (hENT1) transportuje širok spektar purina ili piramidina ali ne i uridin [55,56,63]. Poznato je da hENT1 može igrati važnu ulogu u transportu pojedinih lekova, kao na primer antitumorskih i antiviralnih nukleozidnih lekova [52,64]. Ekspresija ENT1 je primećena na membrani mnogih tipova ćelija ali i na jedarnoj [62] i mitohondrijskoj membrani [65]. Distribucija hENT1 korelira sa distribucijom A1 receptora u ljudskom mozgu [66]. U CNS-u glodara i čoveka najveći procenat ENT1 je nađen u čeonoj i temenoj kori; umereno prisutan u talamusu i bazalnim ganglijama, dok je najslabije eksprimiran u hipokampusu i malom mozgu [66]. 

ENT2

ENT2 (hENT2; SLC29A2) je NBMPR neosetljiv ("ei" transporter), i za razliku od ENT1, inhibira se u prisustvu mikromolarnih koncentracija NBMPR. Inhibitori ENT2 su isti kao i za ENT1, sa nekim razlikama u potenciji. ENT2 je takođe široko selektivan za purine i pirimidine, i transportuje HX i druge nukleobaze [55,56,60,67]. Pored toga, pokazano je da antivirusni i antitumorski nukleozidni i nukleobazni analozi u ćeliju ulaze kroz hENT2 [68,69]. 
Iako se ENT2 ko-eksprimira sa ENT1, aktivnost ENT2 je znatno manja. 
Pored toga, farmakologija i fiziologija ENT2 je daleko manje poznata, najviše zbog toga što ne postoji selektivni farmakološki agens za ENT2. ENT2 se nalazi u mnogim tkivima, uključujući srce, placentu, timus, pankras, prostatu [56,70]. U CNS-u, hENT2 distribucija je potvrđena u talamusu, meduli, ponsu i malom mozgu [66,71]. 

ENT3

ENT3 (hENT3; SLC29A3) se ne eksprimira na ćelijskoj membrani, već je uglavnom lokalizovan na lizozomima [57,72,73] i mitohondrijama [74]. 
Zanimiljvo je pomenuti da proteinska sekvenca ENT3 sadrži hidrofilni Nterminalni region sačinjen od 51 aminokiselinskog ostatka, koji je karakterističan za endozomske i lizozomske sekvence. Uklanjanjem ove sekvence dolazi do izmeštanja ENT3 na ćelijsku membranu [57,75]. Inhibitori hENT1, NBMPR, DPM ili diltazem, nemaju uticaja na hENT3 [57]. hENT3 transportuje mnoge purinske i pirimidinske nukleozide uključujući adenin, ali ne i HX. Pored toga, hENT3 vrši transport hemoterapeutskih i antitumorskih lekova kao što su kladribin i fludarabin [57]. hENT3 je u najvećoj meri eksprimiran u placenti, ali je potvrđena njegova ekspresija i u mozgu [57,76]. Aktivnost hENT3 je zavisna od protona, tako da je transporter funkcionalan pri niskim pH vrednostima, što odgovara njegovoj lokalizaciji na lizozomima. Iako je nedovoljno proučena, uloga ENT3 bi mogla da bude u recikliranju nukleozida i nukleobaza poreklom od degradiranih nukleinskih kiselina [72]. 

ENT4

ENT4 (hENT4; SLC29A4) je genetski najudaljeniji od ostalih podtipova ENT. 
Eksprimira se na membrani ćelija srca i mozga, i pokazano je da iskazuje mali afinitet ka transportu Ado [58,60,77]. Transport nukleozida ovim transporterom se aktivira pri niskim pH. ENT4 nije blokiran mikromolarnim koncentracijama NBMPR, iako je delimično inhibiran DPM ili dilazepom [58]. U srcu, ENT4 može doprineti regulaciji koncentracija Ado nakon ishemije, kada se pH sredine pomera ka kiselim vrednostima [58]. U CNS-u ekspresija ENT4 je uglavnom detektovana na neuronima i u neuropilima [78]. Imunohistohemijom je pokazano prisustvo ENT4 u kori prednjeg mozga, hipokampusu, bazalnim ganglijama, malom mozgu, talamusu i hipotalamusu miša [78]. 
Iako se do skora mislilo da su od četiri tipa ENT, samo ENT1 i ENT2 eksprimirani u mozgu [71,79,80], novije studije su pokazale da se i ENT3 i ENT4 eksprimiraju u moždanom tkivu. Međutim, zbog opisanih specifičnosti ENT3 iENT4, kao i njihove manje zastupljenosti, nije upotpunosti opisan njihov doprinos transportu nukleozida u CNS-u. Mnogo više pažnje je do sada posvećeno ispitivanju uloge ENT1 i ENT2, posebno nakon što je pokazano da se tokom događaja kao što je ishemija, intraćelijski ATP brzo troši što vodi formiranju Ado koji napušta ćelije putem ENT1 i ENT2 [31]. Dr Parkison i saradnici su tokom poslednjih godina pokazali da u hipoksičnim uslovima u kulturi neuroni otpuštaju Ado, dok astrociti doprinose formiranju Ado putem e-5NT [81]. S a druge strane, in vitro studije iste grupe rađene na presecima hipokampusa u kulturi su pokazale da neuronski transporter ENT1 posreduje preuzimanju vanćelijskog Ado u hipoksiji/ishemiji [53,[82][83][84]. Neslaganja u rezultatima dobijenim u različitim eksperimentalnim postavkama ostavljaju otvorenim pitanje koji tip moždanih ćelija i u kojoj meri doprinosi kruženju adenozina nakon povrede. 

Koncentrišući nukleozidni transporteri (CNT)

Druga familija nukleozidnih transportera predstavlja koncentrišuće nukleozidne transportere (CNT; SLC28) koju čine tri podtipa CNT1, CNT2 i CNT3 [52]. Zajedno sa ENT, CNT igraju ulogu u transportu purina, pirimidina i nukleozidnih analoga (lekova). Dok su ENT posrednici dvosmerne translokacije purina kroz membranu, CNT-ovi posreduju jednosmeran transport purina i pirimidina. Ovo je energetski zahtevan proces, koji se obavlja uz utrošak natrijumovog jona [85][86][87]. CNT podležu konformacionoj promeni zavisnoj od Na + ili H + , što je praćeno vezivanjem i prenosom supstrata [86,87]. Odnos razmene natrijuma za nukleozid kod hCNT1/2 je 1:1 [85,87], dok su hCNT3 potrebna dva jona natrijuma (2:1) po molekulu nukleozida [88]. 
Svaki podtip CNT ima specifične afinitete prema različitim supstratima ali su svi CNT sposobni da transportuju uridin. Čovečji CNT1 je selektivan za pirimidinske nukleozide, pa iako može da veže Ado sa visokim afinitetom, ne može da ga translocira kroz membranu [85,89]. hCNT2 je selektivan za purinske nukleozide, dok hCNT3 transportuje i purinske i pirimidinske nukleozide [86,88,90,91]. Sva tri CNT vrše transport antitumorskih i antivirusnih nukleozidnih analoga (lekova). 
Distribucija CNT varira u zavisnosti od podtipa, ali sva tri CNT su eksprimirana u mozgu. CNT3 ima široku rasprostranjenost, dok CNT1/2 se mahom nalaze u unutarćelijskim odeljcima [88,92]. U CNS-u CNT1 je visoko eksprimiran u kori mozga, nešto manje u horoidnom pleksusu, hipotalamusu i hipokampusu, i najmanje u strijatumu pacova [93]. Ekspresija CNT2 u mozgu je ujednačena [93,94]. In vitro kulture mišjih neurona i astrocita su pokazale da je CNT2 prisutan na ova dva tipa glijskih ćelija [69,80]. Kod miša [76] i čoveka [88], 
CNT3 je slabo eksprimiran u mozgu, dok u pacovskim kulturama neurona i astrocita CNT3 nije detektovan [69]. 

Metabolizam adenozina

Ado se metaboliše posredstvom dva enzima -adenozin deaminazom (ADA) i adenozin kinazom (AK). Deaminacijom nastaje inozin (Ino), čije su ćelijske koncentracije u fiziološkim uslovima obično bliske koncentracijama Ado. 
Drugi put uključuje adenozin kinazu (AK), koja fosforiliše Ado do AMP. Aktivnost AK zahteva magnezijum i ATP [95], pa do inhibicije AK dolazi kada su koncentracije Mg 2+ i ATP niske [96] ili kada su koncentracije Ado visoke [97]. 
ADA ireverzibilno deaminuje Ado do Ino (Slika 2). U CNS-u, ADA je u najvećoj meri eksprimirana u horoidnom pleksusu, hipotalamusu, mirisnoj kvržici i gornjim kvržicama srednjeg mozga, a manje u hipokampusu i žuljevitom telu [98]. Takođe je zapaženo da je aktivnost ADA daleko veća u primarnim kulturama astrocitima nego neurona [99,100]. Kod čoveka postoje tri izoforme ADA -dve solubilne (ADA1 i ADA2) i ekto-enzim (ekto-ADA) [101,102]. 
Ranije se smatralo da produkti metabolizma Ado nemaju značajnije uloge. 
Ipak za Ino se danas zna da poseduje imunomodulatorne i neuroprotektivne efekte [103]. Kao i Ado, Ino je uključen u vanćelijsku signalizaciju, kako u fiziološkim tako i u patološkim procesima. Ino se može formirati unutar ili van ćelije. U prvom slučaju, visoki nivoi unutarćelijskog ili vanćelijskog Ado (asocirani sa ćelijskim stresom usled ishemije ili hipoksije) se deaminacijom prevode u Ino [104]. U drugom slučaju, Ino nastaje kao produkt aktivnosti ekto-ADA ili defosforilacijom inozin monofosfat (IMP) ekto-5`-nukleotidazom (e-5NT) [105]. Transport Ino iz vanćelijskog ili unutarćelijskog prostora je posredovan koncentrišućim ili ekvilibrišućim nukleozidnim transporterima (CNT ili ENT). Za ove transportere Ado i Ino su kompetitivni supstrati [106]. Kao Ado, i vanćelijske koncentracije Ino se povećavaju u metabolički stresnim stanjima, kao što su inflamacija ili ishemija [44,107]. Slika 2. Metabolizam Ado. Ado je supstrat za enzim ADA, koji ga konvertuje do Ino. Ino se dalje može metabolisati purin-nukleozid fosforilazom do HX, koji dalje ksantin oksidaza prevodi u X. 
Inozinski receptori do sada nisu indentifikovani; ipak pokazano je da mikromolarne koncentracije Ino aktiviraju A2A i A3 receptore [108][109][110]. Postoji nekoliko radova koji sugerišu da Ino doprinosi neuroprotekciji utičući na bolje preživljavanje astrocita u kulturi nakon deprivacije glukoze i kiseonika [111], kao i da Ino promoviše izrastanje aksona nakon povrede kod pacova [112]. Pored toga, smatra se da je Ino potencijalni kandidat u terapiji multiple skleroze [113], 
Turetovog sindroma [114] i moždane ishemije. 
Inozin je supstrat za enzim purin-nukleozid fosforilazu (PNP), koji konvertuje Ino do hipoksantina (HX) i ribozo-1-fosfata (Slika 2). HX se dalje može metabolisati dalje ksantin-oksidazom do ksantina (X) ili, alternativno, može biti konvertovan do IMP posredstvom hipoksantin-guanin fosforibozil transferaze (HPGRT). Zabeleženo je da su tokom moždane ishemije nivoi HX povećani, ali je pokazano i da HX nema neuroprotekivna svojstva [111]. Sasvim suprotno, pokazano je da akumulacija HX doprinosi oksidativnom stresu nakon reoksigenacije tkiva; visoki nivoi HX su verovatno posledica povećanog utroška energije koja rezultira visokim nivoom metabolizma purina [115]. 

Purinski nukleotidi u centralnom nervnom sistemu

Dok sam ATP ima ekscitatorne efekte, njegovom degradacijom van ćelije se akumulira Ado koji povećava inhibitorni tonus u CNS-u [116][117][118]. U različitim regionima CNS-a, ATP je prisutan u različitim koncentracijama van ćelije, koje varijaju od 2 do 4 mmol/kg [119]. 
ATP se otpušta u vanćelijsku sredinu posredstvom nekoliko do sada prepoznatih mehanizama: 1) egzocitozom, 2) vezikularnim nukleotidnim transporterom (VNUT) iz neurona ali i iz astrocita [120,121], 3), kao kotransmiter sa drugim neurotransmiterima [122][123][124], 4) ATP-vezujućim kasetnim transporterima, 5) koneksinima ili paneksinima (hemikanali), 6) voltažno-zavisnim anjonskim kanalima, 7) dilatiranim P2X7 receptorima [125,126]. ATP i ostali adeninski nukleotidi u vanćelijskom prostoru predstavljaju supstrate za nekoliko familija ektonukleotidaza: ekto-nukleotid-5`-trifosfat difosfohidrolaze (e-NTPDaza), ekto-nukleozidpirofosfataze i/ili fosfodisteraza (e-NPP), alkalne fosfataze i ekto-5' nukleotidaze (e-5NT). Ovi ekto-enzimi imaju ključnu ulogu u kontroli purinske signalizacije određujući dostupnost liganada za P1 i P2 receptore. 

Signalizacija purinskim nukleotidima i purinski receptori

Efekti adeninskih jedinjenja na biološke funkcije su pokazani još 1929-te godine [127], i vremenom je utvrđeno da među purinima adenozin trifosfat (ATP) i adenozin (Ado) ostvaruju najznačajnije efekte. 
Pored toga što je sinonim za izvor energije u ćelijama, ATP je jednako važan signalni molekul. Iako se dugo smatralo da je prisustvo ATP u vanćelijskom prostoru usko povezano sa patološkim procesima, danas se zna da je signalizacija ATP-om u velikoj meri prisutna i u fiziološkim uslovima. U nervnom sistemu, ATP je prepoznat kao kotransmiter i neurotransmiter [2,5,21]. ATP se "pakuje" u vezikule i otpušta u sinaptički prostor samostalno ili sa drugim neurotransmiterima (na primer sa gama-aminobuternom kiselinom (GABA), glutamatom, dopaminom, noradrenalinom) [125,128]. Iz glijskih ćelija, osim vezikularne egzocitoze, ATP-a se oslobađa posredstvom transportera, hemikanala ili dilatiranih P2X7 receptora [21,125,128,129]. ATP i ostali purini se takođe otpuštaju iz oštećenih i umirućih ćelija i predstavljaju signal ćelijske smrti [21]. 
Nakon što se nađe u vanćelijskom prostoru, ATP biva brzo hidrolizovan od strane enzima ektonukleotidaza [130] do adenozin difosfata (ADP), adenozin monofosfata (AMP) i konačno Ado. Ovaj proces je fiziološki veoma važan jer su produkti ove degradacije molekuli koji takođe učestvuju u purinskoj signalizaciji. 
Štaviše, orkestracija svih učesnika u purinskoj signalizaciji utiče na vanćelijske koncentracije purina i samim tim na odgovor ćelija koji se ostvaruje aktivacijom dve klase purinskih receptora (Slika 3). Metabotropni P1 receptori su rezervisani za adenozin, dok se nukleotidni P2 receptori dele na dve podklase: P2Y i P2X receptore [107]. Slika 3. Šematski prikaz učesnika purinske transmisije.ATP se u vanćelijskoj sredini može naći posredstvom hemikanala paneksina (Panx), gde ostvaruje efekte preko P2 receptora i predstavlja supstrat za ektonukleotidaze (ENTPD, ENPP), koje vrše hidrolizu do ADP, AMP, i konačno adenozina (Ado). U vanćelijskoj sredini, Ado preko P1 receptora pokreće kaskadu reakcija u zavisnosti od tipa adenozinskog receptora koji je izražen na membrani. Ado se transportuje shodno koncentracionom gradijentu putem ENT, ili u ćeliju (uz utrošak Na + ) putem CNT. Adenozin deaminaza (ADA) vrši deaminaciju Ado do inozina (Ino), koji takođe predstavlja supstrat za nukleozidne transportere. Ino biva konvertovan do hipoksantina (HX) purin-nukleozid fosforilazom (PNP) , a ksantin oksidaza (XO) dalje prevodi HX u ksantin (X). 

P2X receptori

P2X receptori su ligand-zavisni jonski kanali, propustljivi za Ca 2+ , Na + i K + [21,107]. Do danas je klonirano i farmakološki identifikovano sedam podtipova, P2X1-7, koji dele 30-50% homologije u sekvenci. P2X receptore čine tri subjedinice koje formiraju homo-ili heteromultimere [131,132]. U mozgu P2X receptori su u najvećoj meri eksprimirani na neuronima, zatim astrocitima i oligodendrocitima [5]. 
Po aktivaciji, P2X receptori posreduju u ulasku Ca 2+ u neurone, izazivaju depolarizaciju membrane [133] i iniciraju Ca 2+ zavisnu signalizaciju [134], uključujući i oslobađanje neurotransmitera [135]. Propustljivost za kalcijum zavisi od kombinacije subjedinica, to jest od toga koji je podtip P2X receptora aktiviran. Aktivacija P2X receptora se smatra važnom u regulaciji sinaptičke plastičnosti [134]. 

P2Y receptori

Familija P2Y receptora obuhvata metabotropne receptore, funkcionalno spregnute sa proteinom G. U zavisnosti od proteinske sekvence i tipa proteina G za koji su vezani razlikuje se osam podtipova P2Y [136]. Prva podgrupa (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, i P2Y11) je spregnuta za Gq/G11 koji aktivira PLC, IP3 i pokreće unutarćelijsku Ca 2+ signalizaciju [21]. Druga podgrupa (P2Y12, P2Y13, i P2Y14) je vezana za Gi/o, i aktivacijom ovih receptora dolazi do smanjenja nivoa adenil ciklaze i menjajući signalizaciju posredovanu cikličnim AMP-om (cAMP) [136,137]. Ligandi P2Y receptora pored ATP uključuju i ADP, UTP i UDP, šećerne nukleotide, ali i skoro identifikovane cisteinil-leukotriene [128]. P2Y receptori su veoma zastupljeni u CNS-u, i na neuronima i na astrocitima [138]. Kao i kod P2X receptora, i P2Y mogu formirati homo-ili heterodimere sa drugim podtipovima P2Y receptora [139] ili P1 receptorima [140]. P2Y receptori interferiraju i sa signalnim putevima nishodno od receptora spregnutih sa tirozin-kinazom, kao što su Trk receptori za neurotrofine [141,142]. 

Vanćelijski metabolizam purinskih nukeleotida e-NTPDaze

Do danas je opisano 8 tipova e-NTPDaza, od kojih su samo e-NTPDaze 1-3 i 8 membranski enzimi. e-NTPDaza1 (CD39, ekto-apiraza, ekto-ATP difosforilaza) kao supstrate koristi ATP ili ADP [143,144] defosforilišući ih do AMP. e-NTPDaza1 se može naći na mikroglijskim, endotelnim kao i glatkim mišićnim ćelijama [145]. Naši prethodni rezultati ukazali su na to da je osim na mikrogliji e-NTPDaza1 ispoljena i na neuronima [146]. U CNS-u visoko je eksprimirana u talamusu, putamenu, i hipokampusu [147]. e-NTPDaza2 je selektivna za ATP i identifikovana je na progenitorima neurona i ne-mijelinizirajućim Švanovim ćelijama [148]. Aktivnost e-NTPDaze2 je najveća u oblasti dentatnog girusa, subventrikularne zone i rostralnog migratornog puta [147]. e-NTPDaza3 koristi ATP i ADP kao supstrate, i uglavnom je eksprimirana u hipotalamusu i korteksu [147]. Podtipovi e-NTPDaza5 i 6 su locirani u citosolu ćelije, a 4 i 7 se nalaze na luminalnoj strani Goldžijevog aparata, lizozoma i autofagih vakuola [149,150]. 

e-NPPaze

Danas je poznato sedam varijanti e-NPP enzima, sa širokom supstratnom specifičnošću u hidrolizi pirofosfatnih i fosfodiestarskih veza. Tri člana ove familije (1-3) defosforilišu ATP, ADP, nikotinamid adenin dinukletid (NAD + ) i dinukleotid polifosfate. Kod čoveka, e-NPPaza1-3 su eksprimirani u većini tkiva. U CNS-u, e-NPPaza1 je lociran na endotelu moždanih kapilara ali ne i na astrocitima ili neuronima [151]. Ekspresija e-NPPaze2 u CNS-u je ograničena na ćelije horoidnog pleksusa, cerebrospinalnu tečnost [152] i nezrele oligodendrocite [147,153]. E-NPPaza3 je detektovan na glijskim ćelijama tokom razvića, zatim u prekursorima ali ne i u zrelim astrocitima [154]. 

Alkalna fosfataza

AP je najmanje proučena familija ektonukleotidaza. Široko je eksprimirana i takođe poseduje široku supstratnu specifičnost i može da hidrolizuje nukleozid 5'tri-, di-, monofosfate [143,155]. AP hidrolizuje ATP do Ado uz oslobađanje neorganskog fosfata. AP mogu biti membranski enzimi, ukotvljeni za membranu glikozil-fosfatidilinozitol (GPI) vezom, ili solubilne u serumu. Druge izoforme AP, kao što je tkivno-nespecifična AP (TNAP), su široko eksprimirane u CNS [147,156,157]. Fiziološka uloga TNAP u kontroli prometa Ado je još uvek pod znakom pitanja. Iako je optimalna aktivnost enzima na baznim pH, on takođe može da hidrolizuje ATP do Ado i na fiziološkim pH. Skorašnja studija je pokazala da inhibicija TNAP levamizolom u olfaktornom bulbusu miša smanjuje komunikaciju između neurona i astrocita [158]. Prema ovome, može se zaključiti da TNAP igra značajnu a još uvek nedovoljno ispitanu ulogu u signalizaciji purinima. 

Ekto-5'-nukleotidaza (e-5NT, CD73)

U mozgu, e-5NT je mahom locirana na membrani astrocita, mikroglije i oligodendrocita [159,160]. Ovaj enzim ima visok afinitet za AMP i kompetitivno je inhibiran sa ATP, ADP i α,β-metilen adenozin difosfatom (AOPCP) [143,161]. e-5NT je ukotvljen za membranu GPI vezom, ili vanćelijski solubilan nakon isecanja fosfatidil-inozitol fosfolipazom C [155,162,163]. e-5NT igra centralnu ulogu u generisanju vanćelijskog Ado od otpuštenih adeninskih nukleotida u mozgu. U CNS-u, e-5NT je opisan kao marker oligodendrocita [164][165][166], astrocita i aktivirane mikroglije [165][166][167]. U nezrelim neuronima, e-5NT je eksprimirana tokom razvića [168]. Iz naših rezultata je takođe očigledno da je e-5NT eskprimirana i na neuronima [146]. 
Smatra se da u ishemičnim stanjima e-5NT ima protektivnu ulogu, generisanjem Ado koji ograničava aktivnost ekscitatornih neurotransmitera i samim tim sprečava neuronsku smrt [169]. Naši prethodni rezultati su pokazali da e-5NT ispoljava bifazne promene u aktivnosti i ekspresiji nakon ubodne povrede kore mozga u vidu ranog smanjenja [170], praćeno ushodnom regulacijom ekspresije i aktivnosti enzima do 2 nedelje nakon povrede [171,172]. Takođe smo pokazali da nakon povrede kore mozga dolazi do gubitka e-5NT na membrani neurona i povećanja ekspresije u e-5NT-pozitivnim reaktivnim astrocitima [171]. 

Traumatska povreda mozga

Naše razumevanje procesa koji se nalaze u osnovi traumatske povrede mozga (TPM) je danas svakako daleko bolje nego pre jedne decenije. Ipak, i dalje postoji jaz između znanja i domena kliničke upotrebe. Iako je procena neurološkog ishoda i saniranje povrede danas na daleko višem nivou, mnogi prognostički i terapijski pristupi i dalje nisu klinički ispitani ili se retko koriste. TPM stoga ostaje jedan od vodećih uzroka invaliditeta i smrtnosti među radno sposobnim stanovništvom razvijenih zemalja i globalno predstavlja, ne samo ozbiljan medicinski, već i ozbiljan ekonomski problem [173]. 
TPM karakterišu dve faze -primarna i sekundarna povreda. Primarna povreda je rezultat delovanja mehaničke sile, koja je zapravo okidač kaskade reakcija koje su objedinjene u koncept sekundarne povrede. Sekundarna povreda evoluira tokom vremena i može trajati danima i mesecima, uzrokujući dalja oštećenja u mozgu i degeneraciju neurona. Stoga se TPM može smatrati hroničnim oboljenjem a sekundarna povreda glavnom terapeutskom metom [174]. 
Sekundarna povreda predstavlja kombinaciju ishemičnih, inflamatornih i citotoksičnih procesa. Jedan od najznačajnijih faktora koji uzrokuju sekundarnu povredu mozga je preterano oslobađanje ekscitatornih aminokiselina kao što su glutamat i aspartat [175,176]. Inflamatorni procesi traju od nekoliko dana do više nedelja, u zavisnosti od veličine i mesta povrede, i često nisu ograničeni na mozak, već imaju sistemske efekte. Najvažniji molekuli u ovoj kaskadi su faktori rasta, kateholamini, neurokini, citokini i hemokini [177]. 

Glijski ožiljak

Jedan od događaja u danima nakon povrede CNS-a je formiranje glijskog ožiljka kojim se oštećeno mesto izoluje od okolnog tkiva. Nekoliko ćelijskih tipova, astrociti, mikroglija i prekursori oligodendrocita, odgovaraju na povredu proliferacijom, povećanom ekspresijom specifičnih ćelijskih markera i morfološkim promenama [175]. Glijski ožiljak je rezultat upravo procesa koji se zove reaktivna glioza. Iako sprečava širenje sekundarne povrede, glijski ožiljak istovremeno predstavlja barijeru koja sprečava regeneraciju aksona na mestu lezije. 
Prve ćelije na mestu povrede su makrofagi, a kroz 24 časa dolazi do aktivacije mikroglije [178]. Aktivna ameboidna mikroglija, zajedno sa makrofagima učestvuje u otklanjanju debrisa. 
Najvažnije mesto u nastanku glijskog ožiljka imaju astrociti (Slika 4). Oni zamenjuju mikrogliju oko lezije i upravo ove ćelije formiraju tkivo barijere. Poznate uloge reaktivnih astrocita su brojne i obuhvataju ograničavanje ozleđenog tkiva i restrikciju inflamacije, stimulaciju oporavka krvno-moždane barijere, zaštitu neurona i oligodendrocita, ali i neurotoksičnost, inhibiciju regeneracije aksona [176,177]. 
Slika 4. Reaktivna astroglioza. Astrociti (crveno)obeleženi GFAP-om su prisutni u kori mozga pacova (A). Nakon povrede, astrociti prelaze u reaktivnu formu, dele se i morfološki menjaju, i migriraju na mesto povrede (B). Tokom vremena, reaktivni astrociti formiraju glijski ožiljak, koji onemogućava neurone da premoste povredu (C). 
Reaktivni astrociti se odlikuju visokim sadržajem glijskog fibrilarnog kiselog proteina (GFAP) kao i drugim indtermedijarnim filamentima kao što je vimentin. GFAP i vimentin imaju važnu ulogu u procesu reaktivne astroglioze. 
Pokazano je da dupli "knockout" miševi (GFAP -/-, VIM -/-) ne mogu da formiraju normalan fenotip CNS-a kao ni glijski ožiljak nakon povrede [179]. 
Pored pomenutog, u astrocitima je zabeležena ushodna regulacija drugih proteina, uključujući hondroitin sulfat proteoglikane (CSPG) [180][181][182]. U adultnom mozgu, CSPG su neophodni, s obzirom da održavaju strukturu vanćelijskog matriksa, stabilizuju sinapse i pravilno grananje aksona, te tako doprinose plastičnosti [183,184]. Smatra se da svi tipovi moždanih ćelija doprinose produkciji ovih fizioloških nivoa CSPG [184]. Međutim, u patološkim stanjima, dolazi do izražene ushodne regulacije CSPG i ona je uglavnom pripisana aktivaciji astrocita [185]. 

Modeli traumatske povrede mozga

U poslednjih nekoliko decenija uložen je napor da se uspostave adekvatni animalni modeli TPM. U najvećem broju istraživanja u ovom polju koriste se glodari, pre svega zbog sličnosti koje dele sa čovekom u funkcionalnoj organizaciji kortikalnih i subkortikalnih struktura, ekonomičnosti i odgovarajuće dužine životnog veka i vremena generacije. 
Brojni in vivo i in vitro modeli opisani su sa ciljem da se rasvetle patobiološki procesi koji su osnova TPM i testiraju potencijalni tretmani. Imajući u vidu da je TPM kompleksno oboljenje, ovi modeli se međusobno razlikuju shodno aspektu TPM koji se ispituje. In vivo modeli orijentisani su ka ispitivanju i tretmanu sekundarne povrede, koja je u najvećoj meri okarakterisana procesom reaktivne astroglioze. Ubodna lezija somatosenzornog korteksa pacova, animalni in vivo model TPM koji je odabran za ovaj rad, spada u kategoriju akutne povrede koja podrazumeva neposrednu mehaničku ozledu lobanje i mozga [186]. Ova povreda nema očigledne uticaje na promene u ponašanju životinje, a karakteriše se umerenom astrogliozom (Slika 4). 
Brojni in vitro modeli su takođe osmišljeni kako bi se reprodukovale karakteristike od interesa u izolovanom sistemu i dozvolile manipulacije, monitoring na više nivoa u realnom vremenu, u kontrolisanim uslovima [187,188]. 
Jedan od takvih modela je i je i povreda ćelijskog jednosloja skarifikacijom (engl. 
"scratch wound" esej, SW), isprva ustanovljen kao ponovljiv, jeftin test za analizu ćelijske migracije in vitro [189]. SW model je ubrzo široko prihvaćen u ispitivanju različitih aspektata odgovora astrocita na mehaničku povredu [190][191][192][193]. Stoga je i u ovom radu detaljnije ispitan i korišćen SW model u kulturi primarnih kortikalnih astrocita pacova. 

Uloga adenozina u povredi i oporavku centralnog nervnog sistema

Astrociti se smatraju ključnim regulatorima endogenog adenozina [194,195]. Astrociti predstavljaju veliki izvor ATP-a koji se može osloboditi u sinaptički prostor [196,197], gde se brzo metaboliše ektonukleotidazama do adenozina [54,128]. U svojim pionirskim eksperimentima na retini pacova, Newman je pokazao da aktivacija glijskih ćelija smanjuje aktivnost neurona koji iskazuju spontanu aktivnost [198]. Ovaj efekat se gubi nakon dodavanja antagonista A1 receptora ili inhibitora ekto-ATP-aza [199]. Ovi rezultati su demonstrirali da aktivirani astrociti mogu da inhibiraju neurone otpuštanjem ATP, odnosno njegovom konverzijom u Ado ektonukleotidazama i aktivacijom adenozinskih receptora na neuronima. 
U elegantnoj seriji eksperimenata Haydon i saradnici su pokazali da je ATP poreklom od astrocita regulator sinaptičke veze i plastičnosti [197]. U ovim eksperimentima autori su selektivno eksprimirali dominantno-negativni SNARE domen u astrocitima miševa i time blokirali gliotransmisiju, uključujući i otpuštanje ATP-a. Kod kontrolnih miševa, astrociti su tonično suprimirali sinaptičku transmisiju otpuštanjem ATP-a kao prekursora Ado, dok je ovaj efekat izostao kod transgenih miševa. 
Ovi i slični rezultati na temu kontrolisanog otpuštanja ATP kroz lizozomalnu egzocitozu od strane astrocita [121], ukazuju na to da astrocitiregulacijom otpuštanja prekursora Ado, to jest ATP-a -igraju važnu i suštinsku ulogu u regulaciji koordinacije sinaptičke veze, plastičnosti, i sinaptičkih mreža [197,200]. 
Još jedan potencijalan mehanizam koji bi mogao da reguliše vanćelijske koncentracije Ado je mehanizam posredovan NT. Astrociti poseduju dva tipa ekvilibrišućih transportera, ENT1 i ENT2, [71], koji omogućavaju brzo uspostavljanje ravnoteže vanćelijskog i unutarćelijskog nivoa Ado [194,195]. 
Korišćenjem tehnike mikrodijalize pokazano je da inhibitori transportera (DPM, NBMPR i lidoflazin) povećavaju vanćelijske koncentracije Ado u strijatumu pacova [201]. U in vitro studijama je pokušano da se dođe do odgovora koje tip moždanih ćelija doprinosi kruženju adenozina putem ENT. Tako je pokazano da neuroni u kulturi otpuštaju Ado u hipoksičnim uslovima, a ovaj efekat je poništen dodavanjem DPM. Međutim, sasvim suprotan efekat je primećen u hipokampalnim slajs kulturama i in vivo studijama -neuroni su putem hENT1 
preuzimali Ado iz vanćelijske sredine [82]. S obzirom na značajnu eskpresiju ENT1 i ENT2 na astrocitima, ostaje nepoznato kakva je uloga ovih transportera u putu adenozina posredovanom astrocitima. 
Za razliku od neurotransmitera za čije ponovno preuzimanje iz sinaptičkog prostora odvija uz utrošak energije, takav sistem ne postoji za Ado. Nasuprot, unutarćelijski [202] astrocitni enzim AK izgleda da kompenzuje tu ulogu, u vidu metabolički aktivnog sistema za preuzimanje Ado [203]. 
Dok se mozak razvija, AK je prisutna primarno u neuronima, međutim u adultnom mozgu ekspresija AK je karakteristika citosola astrocita. Vanćelijski Ado se NT-ima preuzima u astrocite, gde biva fosforilisana u AMP od strane AK. Iako AK nije studirana u TPM, pokazano je da je AK značajan faktor u mnogim neurološkim poremećajima [194]. Tako je, na primer, u ishemiji ushodna regulacija AK povezana sa lošim ishodom [204], dok su hronične bolesti kao što je epilepsija povezane sa astrogliozom i ushodnom regulacijom AK u brojnim modelima [195]. 
Pokazano je da astrocitna AK reguliše bazalne sinaptičke nivoe Ado i kao i one zabeležene pri epileptičnim napadima, ali ne i otpuštanje Ado u hipokampusu zavisno od neuronske aktivnosti [205,206]. 
Ako uzmemo u obzir da su astrociti važni regulatori gotovo svih neuroloških (fizioloških i patoloških) procesa, očigledno je da je važno razjasniti koji put i pod kojim uslovima astrociti koriste u orkestriranju vanćelijskih koncentracija Ado. Upravo ovaj mehanizam bi mogao da predstavlja mesto terapije nakon TPM ali i u drugim oboljenjima CNS-a. Pored toga, astrociti su sastavni deo tripartitne sinapse, te bi se rasvetljavanjemnačinana koje astrociti regulišu nivoe neuromodulatora Adodoprinelo razumevanju jednog od najvažnijih pitanja neuronauka -plastičnosti CNS-a. 

II Ciljevi rada

Imajući u vidu uloge adenozina u fiziološkim i patofiziološkim procesima u CNS-u, zadatak ove doktorske teze je bio da se ustanovi uticaj mehaničke povrede kore mozga na funkciju komponenti adenozinskog sistema. U tom smislu, definisani su sledeći ciljevi: 
 S obzirom

Ubodna lezija leve somatosenzorne kore -in vivo model povrede

Životinje su anestezirane zoletilom (Virbac) prema instrukcijama proizvođača. Potom je životinji fiksirana glava u stereotaksičkom ramu a prednji deo glave obrijan kako bi se oslobodio pristup koži. Nakon operativnog zahvata na koži, reza dužine oko 1.5 cm, na lobanji je određen položaj somatosenzornog korteksa prema stereotaksičkom atlasu. Unilateralna ubodna lezija izvedena je zubarskom bušilicom sa nastavkom promera 1 mm, po sledećim koordinatama: 1.5 mm iza bregme, 2.5 mm levo od središnje linije i 2 mm u dubinu (slika 5). 
Koža glave zašivena je hirurškim koncem. U postoperativnom periodu životinje su držane po dve u kavezu. 

Priprema životinjskog tkiva

Za analizu genske ekspresije uzeto je po četiri pacova iz svake grupe. 
Odmah nakon transkardijalne perfuzije hladnim fiziološkim rastvorom, mozak je izolovan iz lobanje i korteksi su izdvojeni na ledu, izolovano je kortikalno tkivo mozga ozleđenih životinja oko centra lezije, površine ~4 mm 2 . Kod lažno operisanih šam i kontrolnih životinja uzorkovana je jednaka, odgovarajuća površina levog korteksa. Nakon određivanja mase, tkivo je zamrznuto u tečnom azotu i do izolacije čuvano na -80 °C . 
Za imunoblot analizu su uzete po četiri životinje iz svake grupe. Procedura izolacije tkiva je bila ista kao i u prethodno opisanoj pripremi tkiva za analizu genske ekspresije. Nakon izolacije i merenja, tkivo korteksa je homogenizovano teflonskim homogenizerom sa 20 zaveslaja na ledu, u 10 težinskih zapremina RIPA pufera (Tabela 2) u koji je na 10 ml dodata po jedna tableta komercijalno nabavljenog koktela proteaznih inhibitora (Mini Protease Inhibitors Coctail, Boehringer M, Nemačka). Nakon 30 minuta inkubacije na ledu, lizati su centrifugirani (30 minuta na 14 000 x g na 4°C), posle čega su supernatanti odliveni i do dalje analize čuvani na -80°C. 

Određivanje koncentracije proteina

Koncentracija ukupnih proteina određena je metodom po Pierce-u pomoću komercijalno nabavljenog kompleta, prema uputstvu proizvođača. Koncentracija uzoraka određena je izna osnovu standardne krive dobijene upotrebom poznatih koncentracija proteina goveđeg serum albumina. Za gensku, FACS i UPLC analizu, kao i za LDH test vijabilnosti, ćelije su sađene u gustini od 8 x 10 5 po bunariću u pločama sa 6 bunarića u 2 ml kDMEM-a. 

Priprema ćelijske kulture

Za test vijabilnosti MTT esejem, ćelije su zasejane u gustini od 12 500 po bunariću, u mikrotitar pločama sa 96-otvora, u 200 µl kDMEM. 
Astrociti su izolovani i zasejani u odgovarajućim posudama i odgovarajućem broju, kao što je navedeno u prethodnom odeljku, a potom su inkubirani u CO2 inkubatoru na 37 °C tokom 1-2 dana. Pre skarifikacije ili tretmana, astrocitima je ukidan FCS iz medijuma (inkubacija sa 0,1% FCS u DMEM-u) kako bi se zaustavila ćelijska deoba. Nakon 24 h po ukidanju FCS-a, ćelije su tretirane na sledeći način: 

Skarifikacija ćelijskog monosloja

Skarifikacija astrocitnog jednosloja izvršena je sterilnim nastavkom za pipetu (200 ul), povlačenjem 3 paralelne linije preko ćelijskog jednosloja (Slika 6). 
Nakon toga medijum je zamenjen, a astrociti su vraćeni u inkubator tokom 0.5, 1, 4, 8, 24 ili 48 sata. 

Tretmani ćelija

Astrocitne kulture su tretirane adenozinom (Ado), u koncentraciji od 50 μM, ATP-om u koncentraciji od 100 μM, ENT-inhibitorom dipiridamolom (DPM) u koncentraciji od 5 μM i selektivnim antagonistom A1 receptora (8-Ciklopentil-1,3dipropilksantin, DPCPX) u koncentraciji od 1 μM. Sva razblaženja su pravljena u medijumu sa 0.1% FCS-om, i dodavana ćelijama uz zamenu medijuma. Za DPM i DPCPX su korišćeni pre-tretmani u istim koncentracijama kao i kod tretmana, u trajanju od 30 minuta. Nakon pre-tretmana, medijum zamenjen sa odgovarajućim tretmanom i astrociti su držani u inkubatoru 4 ili 24 sata. 
Hemijski izazvana hipoksija je vršena upotrebom kobalt-hlorida (CoCl2) pri koncentraciji od 300 μM. CoCl2 je rastvaran u medijumu sa 0.1% FCS-om i dodavan ćelijama uz zamenu medijuma, nakon čega su ćelije vraćane u inkubator tokom 4 sata. 

Izolacija RNK

Ukupna RNK izolovana je iz tkiva levog korteksa eksperimentalnih životinja (masa oko 100 mg), dodavanjem TRIzol reagensa (monofazni rastvor fenola i guanidin-izotiocijanata) prema uputstvu proizvođača. 

SDS-poliakril amid elektroforeza i razdvajanje proteina za imunoblot analizu


Western blot analiza

Nakon transfera proteina, postupak imunoblot analize se odvijao na sledeći način: 


Imunohistohemijsko obeležavanje tkiva

Nakon transkardijalne perfuzije hladnim fiziološkim rastvorom i 4% PFA, mozgovi su brzo i pažljivo izolovani iz lobanja pacova i imerziono fiksirani u 4% paraformaldehidu u 0,1 M fosfatnom puferu, pH 7. Statistička obrada rezultata je dobijena iz 3 nezavisna eksperimenta, sa po 3-5 uzoraka po grupi analiziranih u duplikatu. 

Tečna hromatografija ultra-visokih performansi


Identifikacija i određivanje koncentracije adenozina i njegovih metabolita u ćelijskom medijumu

Za svaki ispitivani metabolit najpre je određeno vreme zadržavanja na koloni, primenom komercijalnih standarda. Radna razblaženja standarda su pravljena po uputstvu proizvođača, a konačna u ćelijskom medijumu (DMEM) kako bi profili hromatograma bio što bliži onima poreklom od uzoraka. 

Statistička analiza podataka

Rezultati su prikazivani kao srednja vrednost ± standardna greška iz najmanje tri nezavisna eksperimenta od kojih je svaki uzveden u triplikatu. Za analizu statističke značajnosti razlike između dobijenih rezultata korišćena je analiza varijanse (ANOVA), praćena Tukey-ovim testom za višestruka poređenja. 
Vrednosti parametra P manja od 0.05, 0.01 i 0.001 smatrane su statistički značajnim. 

IV Rezultati

Vodeći se prethodno određenim ciljevima, u ovom radu su ispitivane promene u ekspresiji i funkciji komponenti adenozinskog sistema u modelu povrede mozga pacova i povrede astrocitnog sloja skarifikacijom. Posebna pažnja posvećena je ekspresiji ekvilibrišućih nukleozidnih transportera, kao i promenama koncentracije vanćelijskog adenozina i njegovih metabolita nakon povrede astrocitnog jednosloja. 

Promene ekspresije komponenti adenozinskog signalnog sistema u modelu povrede mozga pacova


Analiza ENT1 ekspresije na genskom i proteinskom nivou

Rezultati analize genske ekspresije za ENT1 nakon povrede mozga prikazani su na Slici 8. 
Dva dana nakon povrede nivo ekspresije transkripta za ENT1 smanjio se upola (0.06 ± 0.01, P < 0.01) u odnosu na odgovarajuću šam kontrolu (0.11 ± 0.02). 
Sedam dana nakon povrede, nivo iRNK za ENT1 povećao se približno dva puta (0.24 ± 0.02, P < 0.001) u odnosu na šam kontrolu (0.13 ± 0.04). 
Za anti-ENT1 antitelo dobijena je jedna specifična traka na 62 kDa, i reprezentativni imunoblot za ENT1 u uzorcima korteksa prikazan je na slici 9A. 
Rezultati ove analize su pokazali da se količina ENT1 proteina dvostruko smanjila dva dana nakon ubodne lezije, kao i da je nivo ENT1 ostao nizak i sedmog dana nakon povrede u odnosu na fiziološku kontrolu (Slika 9B). Nije bilo značajnih razlika u ekspresiji ENT1 u šam kontrolama u odnosu na fiziološku kontrolu (podaci nisu prikazani). S obzirom na to da su naša prethodna istraživanja pokazala da ekto-5'nukleotidaza prati sličan obrazac ekspresije kao i ENT1, urađeno je dvojno imunofluorescentno bojenje na ENT1 i ekto-5'-nukleotidazu (Slika 12). 

Analiza ENT2 ekspresije na genskom i proteinskom nivou

Rezultati analize genske ekspresije za ENT2 nakon povrede mozga pacova prikazani su na Slici 13. 
Analiza ekspresije gena za ENT2 je pokazala je da 2 dana nakon povrede (0.29 ± 0.05, P < 0.01, Slika 13) dolazi do smanjenja ekspresije transkripta u odnosu na odgovarajuću šam kontrolu (0.47 ± 0.04), dok se sedam dana nakon povrede nivo iRNK vratio na vrednost šam kontrole (0.52 ± 0.06). 
Kako bi se opisala ekspresija ENT2 u datim vremenima nakon povrede korteksa pacova, urađena je imunoblot analiza. Za anti-ENT2 antitelo dobijena je jedna specifična traka na 50 kDa (Slika 14A). Nije bilo značajnih razlika u ekspresiji ENT2 u šam kontrolama u odnosu na fiziološku kontrolu (podaci nisu prikazani). 
U poređenju sa fizološkom kontrolom, ekspresija ENT2 proteina je bila značajno niža u uzorcima izolovanim iz ozleđenih korteksa dva i sedam dana nakon povrede (Slika 14B). 

Slika 13. Analiza genske ekspresije za ENT2 .

Ekspresija iRNK za ENT2 je određena qRT-PCR analizom. Nivoi transkripata svake grupe su prikazani relativno u odnosu na nivo transkripta za β-aktin. Rezultati prikazani stubićima su predstavljeni kao srednje vrednosti ± SEM 4 uzorka po grupi (n = 4). Nivo statističke značajnosti između grupa: **P < 0.01. 
Ekspresija i ćelijska distribucija ENT2 ispitana je imunohistohemijski. 
Između fizioloških i preseka šam kontrola nije bilo uočljive razlike (rezultati nisu prikazani), tako da su sva poređenja ozleđenih grupa vršena u odnosu na preseke dobijene iz kontrolnih zivotinja. 
Lokalizacija ENT2 na neuronima u kori ispitana je dvojnim bojenjem na ENT2 u kombinaciji sa NeuN, kao markerom tela neurona i DAPI fluorescentne boje koja obeležava jedra svih ćelija (Slika 15). Dobijeni rezultati su potvrdili da je ENT2 eksprimiran na neuronima u korteksu kontrolnih životinja (Slika 15A-C, strelice), obeležavajući membranu i citoplazmu nervnih ćelija (Slika 15D-F, strelice). Dva dana nakon povrede, ENT2 imunoreaktivnost na neuronima slabi (Slika 15G-I, strelice), a isto se primećuje i sedmog dana nakon povrede (Slika 15J- Dvojno imunofluorescentno bojenje na ENT2 (zeleno) i GFAP (crveno) urađeno je kako bi se bolje opisala distribucija ENT2 na reaktivnim astrocitima. 
Ovi rezultati su prikazani panelom na Slici 16. Na kontrolnim presecima ENT2 je eksprimiran na retkim kortikalnim astrocitima (Slika 16A-D, strelica). Dva dana nakon povrede veći broj GFAP pozitivnih astrocita u neposrednoj blizini lezije intezivnije je obeležen na ENT2 (Slika 16E-H, strelice). Sedmog dana nakon povrede, ENT2 + astrociti bili su brojniji (Slika 16I-K, strelice). ENT2 se jasno ispoljava na telu i nastavcima astrocita, a na većem uveličanju se moglo primetiti da se ne nalazi samo na membrani već i u citoplazmi astrocita (Slika 16L, strelica). 

Slika 16. Dvojno imunohistohemijsko obeležavanje ENT2 (zeleno) i markera astrocita GFAP (crveno) nakon povrede. Jedra su obeležena DAPI bojom (plavo).

A-D: Na kontrolnim presecima ENT2 se eksprimira na retkim astrocitima. 

Analiza genske ekspresije za NTPD1-3, NPP1-2 i e-5NT

Na Slici 18 predstavljeni su rezultati ekspresije transkripata za ektonukleotidaze NTPD-aza1-3, NPP1-3 i e-5NT. Analiza genske ekspresije je pokazala da su sva tri ispitivana proteoglikana -fosfakan, neurokan i brevikan, eksprimirani u mešovitoj glijskoj kulturi astrocita i mikroglije (Slika 25 Ekspresija iRNK za ENT1 je određena qRT-PCR analizom. Nivoi transkripata svake grupe su prikazani relativno u odnosu na nivo transkripta za ciklofilin-A. Rezultati prikazani stubićima su srednje vrednosti ± SEM iz tri nezavisna eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: **P < 0.01; # P < 0.001. 
µM), (Slika 29). Rezultati su pokazali da tretman ATP-om povećava ekspresiju ENT1 za 60% (0.13 ± 0.02, P< 0.01) u poređenju sa kontrolom (0.08 ± 0.005). 

Slika 28. Analiza genske ekspresije za ENT1 4 i 24 h nakon Ado, DPM ili DPCPX tretmana .

Ekspresija iRNK za ENT1 je određena qRT-PCR analizom. Nivoi transkripata svake grupe su prikazani relativno u odnosu na nivo transkripta za ciklofilin-A. Rezultati prikazani stubićima su srednje vrednosti ± SEM iz tri nezavisna eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: *P < 0.05; ** P < 0.01. 
Na Slici 30 prikazano je dvojno imunofluorescentno bojenje na ENT1 (zeleno) i vimentin (crveno) i kontrastno bojenje jedara primenom fluorescentne DAPI boje (plavo) kod kontrolnih i ćelija izloženih skarifikaciji. 
Imunocitohemijska analiza je pokazala da je ENT1 u velikoj meri eksprimiran na vimentin-pozitivnim astrocitima (Slika 30A-C). Na većem uveličanju (Slika 30D-F), primećuje se da je specifična reakcija prisutna na membrani astrocita. 
Nakon skarifikacije moglo se videti intezivnije obeležavanja nastavaka astrocitima neposredno oko mesta povrede (Slika 30G-L) u poređenju sa kontrolnim ćelijama gde je ENT1 prisutan mahom na telima ćelija. 
Imunocitohemijsko obeležavanje nije ukazalo na promene u intezitetu ekspresije ENT1 nakon skarifikacije. Slično kao i kod ENT1, imunocitohemijska analiza je pokazala da je ENT2 u velikoj meri eksprimiran na vimentin-pozitivnim astrocitima (Slika 35A-C). Na većem uveličanju (Slika 35D-F), vidi se da je ENT2 prisutan na membrani astrocita. 
Nakon skarifikacije primećuje se intezivnije obeležavanja astrocitnih nastavaka, neposredno oko mesta povrede (Slika 35J-L). Na osnovu imunocitohemijske analize nije bilo moguće zaključiti više o promeni inteziteta ekspresije ENT2 (Slika 35G-L). 

Slika 34. Analiza genske ekspresije za ENT2 24 h nakon ATP tretmana .

Ekspresija iRNK za ENT2 je određena qRT-PCR analizom. Nivoi transkripata svake grupe su prikazani relativno u odnosu na nivo transkripta za ciklofilin-A. Rezultati prikazani stubićima su predstavljeni kao srednje vrednosti ± SEM iz tri nezavisna eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: ** P < 0.01. 

Slika 35. Dvojno imunohistohemijsko obeležavanje ENT2 (zeleno) i vimentina (crveno) 24 h nakon skarifikacije. Jedra su obeležena DAPI bojom (plavo).

A-C: ENT2 imunofluorescencija je intezivno obeležava ćelijska tela astrocita. D-F: Veće uveličanje ukazuje na membransku distribuciju ENT2 na astrocitima. G-I: ENT2 je intenzivno eksprimiran na astrocitima na ivici povrede, a uočava se snažna imunoreakcija na izduženim nastavcima astrocita koji izrastaju prema mestu povrede blizu mesta povrede. J-L: Nakon skarifikacije, ENT2 je prisutan na nastavncima astrocita u blizini mesta povrede. Dužine skala: 30 μm i 10 μm. Imunocitohemijska analiza je pokazala da astrociti u kulturi eksprimiraju e-5NT(Slika 40A-C). Na većem uveličanju (Slika 40D-F), vidi se da je e-5NT prisutan uglavnom na ćelijskim telima astrocita. 
Nakon skarifikacije primećuje se znatno intezivnije obeležavanja tela astrocita i nastavaka reaktivnih astrocita, kao i mnogo intenzivnija ekspresija vimentina na astrocitima u blizini mesta skarifikacije. astrocitnih nastavaka u odnosu na telo, neposredno oko mesta povrede, što se posebno vidi na većem uveličanju (Slika 40G-L). 

Slika 39. Analiza genske ekspresije za e-5NT 24 h nakon ATP tretmana .

Ekspresija iRNK za e-5NT je određena qRT-PCR analizom. Nivoi transkripata svake grupe su prikazani relativno u odnosu na nivo transkripta za ciklofilin-A. Rezultati prikazani stubićima su predstavljeni kao srednje vrednosti ± SEM iz tri nezavisna eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: 

FACS analiza ekspresije HIF-1α u astrocitima

Kako bi se ispitala promena ekspresije transkripcionog faktora HIF-1α 4h 

Promene koncentracija inozina u ćelijskom medijumu nakon skarifikacije ili tretmana

Slika 47 predstavlja prikaz promene koncentracije inozina u ćelijskom medijumu 4, 8 i 24 sata nakon skarifikacije. Koncentracija inozina u svim ispitivanim vremenskim tačkama značajno pada 4 h nakon povrede (0.065 ± 0.005, P< 0.05) u odnosu na kontrolu (0.16 ± 0.03), i taj trend je nastavljen 8 sati (0.055 ± 0.015, P< 0.01) i 24 sata kasnije (0.065 ± 0.035, P< 0.001) u odnosu na odgovarajuće kontrolu (0.255 ± 0.005, 2.055 ± 0.015). 

Slika 46. Promene koncentracije Ado u ćelijskom medijumu 4 i 24 h nakon DPX ili DPCPX tretmana astrocita.

Srednje vrednosti koncentracije Ado su prikazane belim stubićima u kontrolnim grupama, svetlosivim u DPM tretiranim grupama, a tamnosivi stubići prikazuju srednje vrednosti grupa nakon DPCPX tretmana. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti ± SEM (µM) iz 3 nezavisna UPLC eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: **P < 0.01. 
Promene u koncentraciji inozina u ćelijskom medijumu praćene su i 4 i 24 sata nakon DPM ili DPCPXtretmana (Slika 48). Značajna promena koncentracije inozina u vidu dvostrukog povećanja (0.31 ± 0.04, P< 0.01) je zabeležena 4 sata nakon DPM tretmana u poređenju sa odgovarajućom kontrolom (0.16 ± 0.03). 
Tretman DPCPX je doveo do smanjenja koncentracije inozina nakon 4 sata (0.063 ± 0.007, P< 0.01), što se nastavilo i 24 sata kasnije (1.85 ± 0.12, P< 0.05) u odnosu na kontrolu (2.055 ± 0.015). 

Slika 47. Promene koncentracije Ino u ćelijskom medijumu u različitim vremenskim intervalima nakon skarifikacije astrocita.

Beli stubići predstvaljaju srednje vrednosti koncentracije Ino u kontrolnim grupama, a sivi stubići prikazuju srednje vrednosti Ino grupa koje su izložene skarifikaciji. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti ± SEM (µM) iz 3 nezavisna UPLC eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: *P < 0.05; **P < 0.01; # P < 0.001. 

Promene koncentracija hipoksantina u ćelijskom medijumu nakon skarifikacije ili tretmana

Jedina značajna promena u koncentraciji hipoksantina nakon skarifikacije je zabeleženo značajno smanjenje 8 h nakon povrede ćelijskog jednosloja (3.16 ± 0.02, P< 0.01) u poređenju sa kontrolom (4.47 ± 0.15), (Slika 49). 

Slika 48. Promene koncentracije Ino u ćelijskom medijumu 4 i 24 h nakon DPX ili DPCPX tretmana astrocita.

Srednje vrednosti koncentracije Ino su prikazane belim stubićima u kontrolnim grupama, svetlosivim u DPM tretiranim grupama, a tamnosivi stubići prikazuju srednje vrednosti grupa nakon DPCPX tretmana. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti ± SEM (µM) iz 3 nezavisna UPLC eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: *P < 0.05; **P < 0.01. 
Na Slici 50 je prikazan uticaj tretmana DPM i DPCPX na promenu koncentracija HX nakon 4 i 24 h. Značajno smanjenje HX je zabeleženo 24 h nakon DPM tretmana (4.95 ± 0.17, P< 0.05) u poređenju sa kontrolom (5.91 ± 0.20). 

Slika 49. Promene koncentracije HX u ćelijskom medijumu u različitim vremenskim intervalima nakon skarifikacije astrocita.

Beli stubići predstvaljaju srednje vrednosti koncentracije HX u kontrolnim grupama, a sivi stubići predstavljaju srednje vrednosti HX grupa koje su izložene skarifikaciji. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti ± SEM (µM) iz 3 nezavisna UPLC eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: **P < 0.01. 

Promene koncentracija ksantina u ćelijskom medijumu nakon skarifikacije ili tretmana astrocita

Na Slici 51 su prikazane promene koncentracije ksantina u različitim vremenima nakon skarifikacije. Značajno smanjenje koncentracije ksantina za oko 30% je primećeno 8 sati nakon povrede (0.54 ± 0.01, P< 0.05) u poređenjusa kontrolom (0.85 ± 0.035). Ovaj trend se održao i 24 h nakon povrede (4.95 ± 0.125, P< 0.001) u odnosu na odgovarajuću kontrolu (7.52 ± 0.22). 

Slika 50. Promene koncentracije HX u ćelijskom medijumu 4 i 24 h nakon DPX ili DPCPX tretmana astrocita.

Srednje vrednosti koncentracije HX su prikazane belim stubićima u kontrolnim grupama, svetlosivim u DPM tretiranim grupama, a tamnosivi stubići prikazuju srednje vrednosti grupa nakon DPCPX tretmana. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti ± SEM (µM) iz 3 nezavisna UPLC eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: *P < 0.05. 
Dalje su praćene i promene u koncentraciji ksantina u ćelijskom medijumu nakon izlaganja DPM ili DPCPX (Slika 52). I DPM i DPCPX su izazvali značajno smanjenje (50% i 25%) u koncentraciji ksantina 4 sata nakon tretmana (0.14 ± 0.01, P< 0.01; 0.23 ± 0.01, P< 0.05) u poređenju sa kontrolom (0.32 ± 0.03). Značajne promene nisu uočene nakon 24 h ni pod jednim tretmanom. 

Slika 51. Promene koncentracije X u ćelijskom medijumu u različitim vremenskim intervalima nakon skarifikacije astrocita.

Beli stubići predstvaljaju srednje vrednosti koncentracije X u kontrolnim grupama, a sivi stubići predstavljaju srednje vrednosti X grupa koje su izložene skarifikaciji. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti ± SEM (µM) iz 3 nezavisna UPLC eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: *P < 0.05; # P < 0.001. 

Uticaj DPM na nivoe vanćelijskog Ado i njegovih metabolita, 4 i 24h nakon SW

Blokiranjem ENT-ova dipiridamolom ispitali smo u kojoj meri ovi nukleozidni transporteri doprinose regulaciji vanćelijskog Ado, Ino, HX i X, 4 (Slika 49) i 24 (Slika 53) sata nakon skarifikacije astrocitnog jednosloja. 
Četiri sata nakon skarifikacije nivo vanćelijskog Ado (0.31 ± 0.05, P< 0.05) u odnosu na kontrolu (0.21 ± 0.04). Nakon tretmana DPM, ovaj efekat se poništava, to jest nivoi Ado su niži za oko 30% (0.24 ± 0.02, P< 0.01) u odnosu na kontrolnu grupu tretiranu DPM (0.33 ± 0.03). 

Slika 52. Promene koncentracije X u ćelijskom medijumu 4 i 24 h nakon DPX ili DPCPX tretmana astrocita.

Srednje vrednosti koncentracije X su prikazane belim stubićima u kontrolnim grupama, svetlosivim u DPM tretiranim grupama, a tamnosivi stubići prikazuju srednje vrednosti grupa nakon DPCPX tretmana. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti ± SEM (µM) iz 3 nezavisna UPLC eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: *P < 0.05; **P < 0.01. P< 0.01), dok nakon DPM tretmana rastu (0.36 ± 0.08, P< 0.001) u odnosu na kontrolu (0.16 ± 0.02). Vanćelijske koncentracije Ino se značajno snižavaju 4 h nakon skarifikacije i tretmana DPM (0.15 ± 0.02, P< 0.001) za oko 60% u odnosu na DPM tretiranu kontrolu (0.36 ± 0.08). 
U odnosu na DPM tretman (2.17 ± 0.29), koncentracije HX su bile smanjene za oko 30% nakon skarifikacije u kombinaciji sa DPM tretmanom (1.48 ± 0.10, P< 0.01). 
Tretman DPM smanjuje koncentraciju vanćelijskog ksantina za oko 50% u odnosu na kontrolu, ali se ne menja nakon skarifikacije i DPM tretmana. 
Dvadeset četiri časa nakon tretmana DPM koncentracije Ado, HX i X se smanjuju za oko 30% u odnosu na kontrolu. Kombinacija tretmana DPM i skarifikacije, ne utiče na vanćelijske koncentracije Ado, Ino, HX i X u odnosu na tretman DPM (Slika 54). 

Slika 53. Uticaj DPM na vanćelijske koncentracije Ado i njegovih metabolita, 4h nakon skarifikacije.

Srednje vrednosti koncentracijaAdo, Ino, Hx i X, su prikazane belim stubićima u kontrolnim grupama (K), svetlosivim u grupama podvrgnutim skarifikaciji (SW), tamnosivim u DPM tretiranim grupama (K+DPM), a crni stubići prikazuju srednje vrednosti grupa nakon skarifikacije i DPM tretmana (SW+DPM). Poređenje grupa je vršeno u odnosu na kontrolu, dok je linijama označena statistčka značajnost dobijena poređenjem K+DPM i SW+DPM grupa. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti ± SEM (µM) iz 2 nezavisna UPLC eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: *P < 0.05; **P < 0.01; # P < 0.001. serija dodatnih eksperimenata pod tretmanom CoCl2. Primenjen je CoCl2tretman (30 µM) u trajanju od 4h, nakon čega je procenjena vijabilnost ćelija. Potom su urađene FACS i UPLC analize, a rezultati iz dva nezavisna eksperimenata sa po tri uzorka po grupi su prikazani u daljem tekstu. 

Određivanje citotoksičnog efekta CoCl2 tretmana

Citotoksični potencijal 30 µM CoCl2 u kulturi ćelija ispitivan je primenom LDH testa 4 sata nakon tretmana glijskog jednosloja, (Slika 55). LDH test je pokazao da primenjeni tretman CoCl2 nije uticao na preživljavanje ćelija. 

Analiza membranske ekspresije ENT1, ENT2 i e-5NT na astrocitima protočnom citofluorimetrijom (FACS) nakon CoCl2 tretmana

Kako bi se kvantitativno odredile promene u ekspresiji odabranih komponenti adenozinskog sistema, urađena je FACS analiza 4 h nakon tretmana Slika 55. Uticaj CoCl2 na ćelijsku vijabilnost. Uticaj 30 µMCoCl2 tretmana nakon 4 h na vijabilnost ćelija u kulturi određen je LDH testom. Svi efekti predstavljeni su kao procenat otpuštanja LDH u odnosu na apsolutnu kontrolu (100%) maksimalnog otpuštanja LDH iz liziranih ćelija. Rezultati prikazani stubićima su srednje vrednosti ± SEM iz 3 uzorka po grupi. 

V Diskusija

Traumatska povreda mozga uzrokuje strukturne i funkcionalne promene u nervnom sistemu, koje, između ostalih, uključuju narušavanje krvno-moždane barijere, pad energetskog metabolizma, hipoksiju i oksidativni stres [208]. 
Pokretanje velikog broja različitih procesa, čija međusobna interakcija zavisi i od tipa i obima povrede, čini TPM kompleksnom bolešću koja je još uvek bez adekvatne terapije [174]. 
Mehanička povreda dovodi do oslobađanja velike količine nukleotida i nukleozida, a pre svega ATP i Ado, i uslovljava promene u signalizaciji purinima koje se mogu održavati danima i nedeljama nakon TPM [209]. Usled ishemije ili hipoksije, vanćelijski Ado se akumulira i uzrokuje brzu depresiju evociranih sinaptičkih potencijala, delujući neuroprotektivno [17,210,211]. Uprkos značajnom broju podataka na ovu temu, malo se zna o izvorima Ado tokom povreda mozga. Sudbina Ado poreklom od astrocita ispitana je u in vivo i in vitro modelu povrede, genskom i proteinskom analizom ekspresije odabranih komponenti adenozinskog sistema. Pored toga, korišćenjem UPLC metode analiziran je sadržaj astrocitnog medijuma i analizirane su koncentracije purina nakon skarifikacije, ali i pod delovanjem specifičnih inhibitora, kao što je DPM, potentan i nespecifičan blokator ENT [212,213]. DPCPX je upotrebljen kako bi se ispitao uticaj signalizacije A1 receptora na ekspresiju i funkciju ENT1/2 i e-5NT. Potrebno je naglasiti da je funkcija razmatrana posredno, s obzirom na to da tehnički nismo bili u mogućnosti da upotrebimo odgovarajući esej aktivnosti ENT1/2. Veliki broj podataka o nukleozidnim transporterima iz literature je "nedorečen" usled nedostatka adekvatnih, i pre svega specifičnih, blokatora. S obzirom na to da je prepoznata važnost NT u kruženju Ado, ali i njihova potencijalna uloga u transportu nukleozidnih analoga (lekova), intenzivno se traga za novim i potentnim inhibitorimaa NT [214]. 

Skarifikacija astrocitnog jednosloja kao model povrede studija ekspresije hondroitin-sulfatnih proteoglikana

Iako se in vitro modeli ne mogu posmatrati kao zamena za in vivo modele, oni ipak imaju prednost jer omogućavaju ispitivanje izolovanih fenomena. Uz to, in vitro modeli se uglavnom lako uspostavljaju, ekonomični su, sa daleko manje etičkih izazova, ponovljivi i bolje kontrolisani, pa predstavljaju dobru platformu za ispitivanje lekova [187,215,216]. Stoga su in vitro modeli TPM vredan alat u izučavanju patobiologije povrede mozga i uvek postoji potreba da se bolje definišu. 
Reaktivna astroglioza je događaj koji karakteriše sve tipove moždane povrede. Tipično biohemijsko obeležje reaktivne astroglioze je povećana ekspresija intermedijarnog filamenta GFAP-a [188,217]. Međutim podaci iz literature govore da se in vitro povrede astrocita unekoliko razlikuju u ovom smislu i zabeleženi su oprečni rezultati u poređenju sa rezultatima in vivo. Na primer, rezultati iz eksperimenata sa hemijskim tretmanima astrocita (di-butril ciklični AMP, interleukin-1β ili makrofagni kondicioni medijum) ne govore o značajnim promenama ekspresije GFAP-a [188]. Sa druge strane, porast ekspresije GFAP na nivou proteina za oko 70% je primećen u modelu povrede astrocita skarifikacijom koja je oštetila oko 37% ćelijskog jednosloja [218]. Takođe je objavljen podatak da 24 h nakon SW, pojedini astrociti u blizini mesta povrede iskazuju povećanu GFAP imunoreaktivnost [191]. Nasuprot ovome, Yang i saradnici su radili sukcesivne imunoblot analize nakon SW povrede astrocitnog jednosloja, i nisu registrovali promene u sadržaju GFAP proteina do petog dana [193]. Naši rezultati ukazuju na to da su iRNK nivoi za GFAP nepromenjeni 4h nakon SW. Ipak, imunocitohemijska analiza je pokazala pojačan signal poreklom od GFAP na astrocitima oko mesta skarifikacije. Takođe, astrociti u blizini mesta povrede su morfološki odgovarali reaktivnim astrocitima -hipertrofirano ćelijsko telo i dugački nastavci. Slični rezultati su ranije objavljeni u modelu mehaničkog "istezanja" diferenciranih astrocita u kulturi sa fibroblastima moždanica, kada se povećanja u sadržaju GFAP na nivou imunofluorescence nisu podudarala sa rezultatima PCR analize (de novo GFAP ekspresija) [219]. Wanner i saradnici su u ovom radu razmatrali mogućnost da akumulacija GFAP u nastavcima astrocita može biti zapravo rezultat kontrakcije ćelije i rearanžmana citoskeletnih elemenata. 
Uzevši u obzir navedeno, ovi rezultati bi mogli značiti da analiza GFAP jednom metodom i u jednoj vremenskoj tački nije pouzdan marker aktivacije astrocita in vitro. 
Iz in vivo studija je takođe poznato da TPM dovodi do akumulacije CSPG, koji doprinose formiranju barijere i sprečavaju regeneraciju aksona i inervaciju mesta povrede [182,220,221]. Upravo se reaktivni astrociti smatraju primarnim izvorom ovih inhibitornih proteina [185]. Prethodne studije su pokazale da se svi članovi CSPG familije pojačano sintetišu nakon povrede CNS-a [222,223], iako se ove promene razlikuju u zavisnosti od ispitivane strukture i vremenske tačke nakon povrede [224]. S obzirom na to da su fosfakan, brevikan i neurokan prepoznati kao markeri formiranja ožiljka nakon povrede, cilj ove studije je bio da se odredi dinamika njihove ekspresije u in vitro modelu povrede astrocita. Skarifikacija astrocitnog jednosloja povećava ekspresiju neurokana i fosfakana, dok se nivoi transkripta za brevikan smanjuju nakon skarifikacije. Dalje, sva tri CSPG su eksprimirana u astrocitima, dok mikroglija nije bila obeležena ni na jedan od tri ispitivana proteoglikana. Najzastupljeniji je bio transkript za neurokan, zatim fosfakan, a najmanje zastupljen je bio transkript za brevikan. Naši rezultati ukazuju na to da kortikalni astrociti u kulturi produkuju neurokan i da povreda skarifikacijom uzrokuje značajno povećanje iRNK za neurokan, što je u skladu sa rezultatima dobijenih iz prethodnih in vitro [225] i in vivo studijama [181,224,226]. 
Druga važna komponenta CSPG familije, fosfakan, je snažno ushodno regulisan nakon različitih povreda CNS-a in vivo [176,227,228]. Iako su neke studije ukazale na nishodnu regulaciju fosfakana neposredno nakon povrede [224], mi smo pokazali da je fosfakan pojačano eksprimiran 4h nakon skarifikacije. Ovaj nalaz je u skladu sa prethodno objavljenim rezultatima povrede astrocita in vitro [219]. Rezultati ICC analize su dali više informacija o lokalizaciji fosfakana i neurokana, pa je tako zabeležena imunoreaktivnost ova dva proteoglikana u citosolu astrocita u kontroli. Nakon skarifikacije jače bojenje je bilo vidljivo u nastavcima astrocita u neposrednoj blizini mesta povrede, što je u skladu sa prethodnim rezultatima [219]. Iako je i in vitro i in vivo potvrđeno da su astrociti glavni izvor brevikana [229][230][231], rezultati qRT-PCR analize naših kultura ukazuju na to da je transkript za brevikan daleko manje zastupljen u poređenju sa iRNK za fosfakan ili neurokan. 
Važno je, međutim, naglasiti da je skarifikacija dovela do smanjenja iRNK za brevikan na polovinu vrednosti u odnosu na kontrolu. Sličan pad u sadržaju iRNK i proteina za brevikan je primećen u različitim in vivo modelima nakon povrede mozga [230,232] ili kičmene moždine [233]. 

Uticaj skarifikacije astrocitnog sloja i različitih tretmana na vanćelijsku koncentraciju Ado i njegovih metabolita

Najmanje dva aspekta generisanja vanćelijskog Ado u patološkim stanjima zahtevaju pažnju 1) relativan doprinos različitih ćelijskih tipova, i 2) da li Ado nastaje vanćelijskom hidrolizom adeninskih nukleotida ili biva oslobođen iz ćelije. 
Kada se jednom nađe u vanćelijskom prostoru, Ado se preuzima u ćelije istim nukleozidnim transporterima koji posreduju u njegovom otpuštanju, transportujući Ado u zavisnosti od njegovog koncentracionog gradijenta. 
U više navrata je pokazano da se ATP i Ado otpuštaju iz ćelija u fiziološkim i posebno u patološkim stanjima [234]. Efluks Ado je posredovan ENT i tradicionalno posmatran kao autokrini protektivni mehanizam koji smanjuje neuronsku aktivnost u stanjima narušene homeostaze [235]. Isprva se mislilo da je tokom hipoksije većina akumuliranog vanćelijskog Ado rezultat povećane akumulacije u ćelijama usled utroška ATP i oslobađanja u vanćelijski prostor putem ENT [236,237]. Ovaj koncept je počeo da se preispituje nakon analiza grupe Bruna Frenguelli-ja [238] koja je pokazala da se vanćelijski nivo Ado povećava, a ne smanjuje nakon inhibicije ENT. 
Koristeći in vitro model povrede, pokušali smo da damo odgovor na napred postavljena pitanja, analizirajući astrocitni medijum korišćenjem UPLC metode u kontrolnim uslovima, posle skarifikacije ili tretmana. 
Četiri sata nakon povrede detektovano je neznatno povećanje koncentracije Ado, praćeno značajnim smanjenjem koncentracije 24 h nakon skarifikacije astrocitnog jednosloja. 
Zanimljivo je da sami tretmani DPM i DPCPX nisu imali uticaja na promene koncentracija Ado 4h nakon povrede, a samo je DPCPX smanjio koncentraciju značajno 24 h kasnije. Opsežne studije Parkinson i saradnika su pokazale da neuroni u kulturi, a ne astrociti, otpuštaju Ado putem ENT [239]. Ipak, skorijom studijom je predloženo da su astrociti u kulturi takođe osetljivi na hipoksiju i da otpuštaju Ado [240], i tako ostvaruju neuroprotektivnu ulogu u stresnim situacijima. Imajući u vidu da su astrociti veoma otporni na hipoksiju i da mogu da prežive danima u značajno osiromašenim uslovima [241], ovakvi rezultati su bili iznenađujući. Fujita i saradnici [242] su objavili rad u kome navode da su takvi rezultati ipak posledica metodološke greške prilikom korišćenja hemiluminiscentnog eseja za detektovanje Ado [240,243]. Takođe, oni su pokazali da astrociti u kulturi ne otpuštaju Ado nakon izlaganja dvočasnovnoj hipoksiji [242], što je u skladu sa ranijim podacima [239]. S obzirom na to da su neuroni daleko osetljiviji od astrocita na uslove hipoksije i hipoglikemije [244] i da u energetski lošim uslovima brže "troše" ATP, verovatnije je da upravo ove ćelije dovode do povećanja vanćelijskih koncetracija Ado [99]. Naši rezultati se donekle slažu sa ovim konceptom, iako treba voditi računa da su mehanička povreda i ishemija/hipoksija različiti tipovi povrede CNS-a. 
Iako astrociti doprinose vanćelijskim koncentracijama ado aktivnošću e-5NT koja se pojačano eksprimira i na reaktivnim astrocitima [99,245], u prva 24 sata nakon povrede mozga pacova uočeno je smanjenje aktivnosti ovog enzima u perilediranom tkivu [246]. Inozin je opisan kao neuroprotektivni metabolit Ado, dok hipoksantin i ksantin nisu imali slične efekte na povredu astrocita [111]; stoga bi bilo važno detaljnije ispitati njegovo kruženja između unutar i vanćelijskog prostora nakon povrede, kao i signalizacije koju posreduje. 

Ekspresija i ćelijska distribucija ENT1 i ENT2

Adenozin moduliše i ekscitatornu i inhibitornu neurotransmisiju posredstvom P1 receptora, i njegov uticaj u CNS-u je u velikoj meri zavisan od vanćelijskih koncetracija. Ovo je posebno važno u patološkim uslovima, gde Ado iskazuje neuroprotektivno dejstvo [17,82,252,253]. S obzirom na to da Ado reguliše neuronsku aktivnost u fiziološkim i patološkim stanjima, mehanizam kontrole mora da omogući brze promene vanćelijskih koncetracija Ado [31,254]. 
Ovo se postiže na dva načina: 1) Ado se proizvodi hidrolizom AMP od strane e-5NT i/ili 2) koncentracije Ado su regulisane od strane ENT. 
Uzimajući u obzir da je Ado veoma važan signalni molekul, izučavan je prilično detaljno. Ipak, daleko manji broj studija se odnosi na ćelijsko poreklo Ado u mozgu; tu postoje različita mišljenja o poreklu Ado u vanćelijskom prostoru, koje se pripisuje ili enzimima ili transporterima [82]. 
ENT su tek nedavno privukli pažnju onih koji ispituju funkcije Ado u različitim patologijama CNS-a.Većina podataka vezanih za funkciju ENT dolazi iz studija koje se tiču toksičnosti alkohola [255][256][257][258], tako da je uloga ovih transportera u stanjima kao što je TPM nejasna. 
Lokalizacija ENT1 i ENT2 proučavana je u mozgu čoveka i nekoliko vrsta glodara, korišćenjem različitih pristupa [259]. Rezultati IHC analize u našem radu ukazuju da se u intaktnom mozgu ENT1 i ENT2 snažno eksprimiraju u kortikalnim neuronima pacova, što je u skladu sa nalazima Alanka i sar. [71] nastaje Ado koji ispoljava snažne anti-inflamatorne efekte [103,277], enzim se smatra veoma važnim faktorom kako u održanju homeostaze mozga, tako i u etiologiji brojnih poremećaja CNS [278]. 
Raniji rad naše grupe detaljno je ispitao funkciju i ekspresiju e-5NT nakon ubodne povrede mozga pacova, i uočio dvofazne promene ekspresije i aktivnosti e-5NT. Ove promene su se ogledale u akutnom smanjenju ekspresije i aktivnosti, praćene ushodnom regulacijom e-5NT koja se održala 2 nedelje nakon TPM [171,172]. Rezultati naših i studija drugih grupa, ukazuju na to da u patološkim stanjima e-5NT može služiti kao generator Ado [81,245,279]. Međutim, postoje i sasvim suprotni rezultati, koji su pokazali da e-5NT nije ključni faktor u regulaciji vanćelijskih nivoa adenozina u fiziološkim ili hipoksičnim uslovima na tkivnim presecima hipokampusa u kulturi [84]. Kontradiktorni rezultati slični ovima uslovili su potrebu da se dodatno razjasne alternativni izvori vanćelijskog Ado i uloga e-5NT. 
Ovde izloženi rezultati pokazuju da se profil ekspresije iRNK za e-5NT slaže sa ranije opisanom proteinskom ekspresijom in vivo -dva dana posle povrede nivoi iRNK su bliski onima u kontrolnim uzorcima, dok je povećanje ekspresije zabeleženo sedam dana nakon povrede. Ako uzmemo u obzir prethodne imunohistohemijske rezultate kojima smo pokazali porast e-5NT na astrocitima posle povrede [171], ushodnu regulaciju u genskoj ekspresiji 7 dana nakon povrede možemo pripisati reaktivnim astrocitima. 
S obzirom na rezultate prethodnih istraživanja naše grupe, takođe smo želeli da ispitamo eventualnu ko-ekspresiju e-5NT i ENT1, kao i e-5NT i ENT2. 
Oba transportera u kontrolnim uslovima se zajedno sa e-5NT eksprimiraju na neuronima. Ovo je posebno važno naglastiti, jer je izraženo mišljenje da je distribucija ovog enzima u centralnom nervnom sistemu pretežno vezana za gliju [165,166,168] te da je ekspresija e-5NT na kortikalnim neuronima niska [105,159]. 
Rezultati Bjelobabe i sar. [171] nedvosmisleno opovrgavaju ove tvrdnje, a ovdašnji rezultati dodatno potvrđuju snažnu ekspresiju e-5NT na neuronima. 
Nakon ubodne lezije e-5NT i ENT1/2 se eksprimiraju na brojnim, reaktivnim astrocitima u neposrednoj oblasti ozlede. Ovi rezultati idu u prilog hipotezi da su astrociti glavni regulatori vanćelijskih koncentracija Ado nakon povrede. Takođe ostavljaju mogućnost da se astrociti ponašaju kao generatori ali istovremeno i kao "odvod" za Ado. 
Iako je ushodna regulacija e-5NT višestruko pokazana u nekoliko in vivo modela povrede mozga, regulacije ekspresije e-5NT je ostala nepoznata. Rad Briševac i saradnika ispitao je efekte nekoliko pro-inflamatornih faktora, bakterijskog lipopolisahardinog endotoksina (LPS), faktora tumorske nekroze (TNF-α), interferona-γ (IFN-γ), glutamata (Glu) i vodonik prekoksida (H2O2), na e-5NT aktivnost, iRNA ekspresiju i zastupljenost membranske forme proteina na astrocitima u kulturi. Rezultati su pokazali da IFN-γ, LPS, Glu i H2O2 smanjuju dok TNF-α povećava e-5NT aktivnost [280]. Takođe, analiza genske ekspresije e-5NT i ekspresije na membrani su pokazali da različiti pro-inflamatorni faktori različito utiču na regulaciju e-5NT nivoa verovatno različitim mehanizmima [280]. 
Ovi rezultati su pokazali da različita ekspresija i funkcija e-5NT na astrocitima zavisi od različitih faza neuroinflamacije i oslikava suštinsku ulogu ovog enzima u regulaciji odgovora na inflamaciju u CNS. 
Rezultati naših istraživanja in vitro su pokazali da neposredno nakon skarifikacije, 0.5 i 1h, e-5NT je nishodno regulisana na nivou iRNK. Ovaj trend se menja 24 i 48 sata nakon povrede, kada je primećeno značajno povećanje iRNK e-5NT. Ovi rezultati su takođe u skladu sa rezultatima in vivo eksperimenata ovog rada, ali i ranijih nalaza naše grupe [171]. 
Zanimljivi rezultati su dobijeni i pod različitim tretmanima. Naime, nakon tretmana kulture astrocita adenozinom, ekspresija iRNK e-5NT se povećava u oba ispitivana vremena (4 i 24h). Tretman DPM i DPCPX utiče na ushodnu regulaciju iRNK za e-5NT, 24 sata nakon tretmana. 
Nekoliko ranijih studija se bavilo pitanjem genske regulacije e-5NT. 
Promotor e-5NT gena sadrži element aktiviran cAMP (CRE) [281], odnosno DNK motive koji regulišu transkripciju preko cAMP-zavisnog CRE-vezanog proteina (CREB) [282]. Aktivacija Ado preko A2A ili A2B receptora povećava unutarćelijske nivoe cAMP i sledstveno aktivira CREB [283]. Ovo sugeriše na mogućnost da je e-5NT regulisan od strane Ado, što je kasnije i potvrđeno u ćelijama endotela [284]. 
Pored toga, Stefanović i saradnici pokazali su da izlaganje mezangijskih ćelija analozima adenozina stimuliše aktivnost e-5NT preko A2 receptora [285]. Naši rezultati vezani za ekspresiju e-5NT nakon tretmana astrocita, iako se ne bave signalnim putevima direktno, idu u prilog opisanim nalazima. 

Ekspresija odabranih ektonukleotidaza nakon ubodne lezije kore mozga pacova

Studije genske ekspresije ostalih enzima ektonukleotidazne kaskade nakon ubodne povrede kore mozga pacova predstavljaju dopunu prethodno dobijenih rezultata naše grupe. Ranije smo pokazali da hidroliza ATP i ADP ima dvofazan profil, sa padom u prva 24 časa koji prati značajan rast aktivnosti do petnaestog dana nakon povrede [172]. Ovde prikazani rezultati ukazuju da e-NTPD-aza2 možda takođe doprinosi primećenim promenama u hidrolizi nukleotida, bar kada je u pitanju ATP hidroliza. Shodno ovde prezentovanim rezultatima, transkripti za e-NTPD-azu1 i e-NTPD-azu2 su najzastupljeniji od svih ispitivanih ektonukleotidaza u kori prednjeg mozga pacova. Pored toga, iRNK za e-NTPD-azu2 iskazuje dvofaznu promenu ekspresije, sa prvobitnom značajnom nishodnom regulacijom dva dana posle povrede i zatim izraženom ushodnom regulacijom sedam dana nakon povrede. Treba pomenuti da su vremenske tačke odabrane za ovu studiju odgovaraju početku (dva dana nakon lezije) i vrhuncu astroglioze (sedam dana nakon lezije). Dok je e-NTPD-aza1 povezana sa mikroglijom [145], e-NTPDaza2 je uglavnom pripisivana astrocitima [251], što su rezultati naše studije i potvrdili. Potrebno je primetiti da uvođenje ćelija C6 glioma koje prekomerno eksprimiraju e-NTPD-azu2 drastično povećava veličinu i malignost tumora. Stoga, bilo bi zanimljivo ispitati ulogu e-NTPD-aze2 u astrogliozi različitih patologija CNS-a. 
Sa druge strane, ekspresija e-NTPD-aze3 se ne menja sa povredom. Naši prethodni rezultati su takođe pokazali nisku ekspresiju ovog enzima na nivou proteina, koja je ostala nepromenjena nakon povrede [286]. Ovde izloženi rezultati takođe ukazuju na to da e-NTPD-aza3 ne doprinosi promenama u hidrolizi ATP i ADP nakon ubodne povrede mozga kod pacova [172]. 
U poređenju sa drugim ektonukleotidazama, e-NPP-aze su daleko manje ispitivane u patološkim stanjima i u CNS-u uopšte. Mi smo ispitivali imunohistohemijski distribuciju e-NPP-aze1 u kori mozga pacova, i pokazali da se ovaj enzim mahom eksprimira na neuronima [287]. Takođe smo pokazali da se na genskom nivou ekspresija e-NPP-aze1 smanjuje sedam dana posle povrede, što bi mogla da bude posledica degeneracije neurona. 
Zanimljivo je da se u našem modelu TPM, iRNK za e-NPP-azu2 ne menja posle povrede. Studije rađene nakon povrede hipokampusa kod pacova, u sličnim vremenskim tačkama (2 i 5 dana) su pokazale značajnu ushodnu regulaciju e-NPP-aze2 na nivou proteina u fibroznim astrocitima [153]. Moguće je da su posve različiti rezultati posledica manjeg sadržaja bele mase u našim uzorcima. Od svih ispitivanih NPP-aza, transkript za e-NPP-azu2 je najzastupljeniji, iako je ranije pokazano da je e-NPPaza2 na proteinskom nivou vrlo slabo eksprimirana i ograničena na IV sloj korteksa [153]. 
Ranije je pokazano da je transcript e-NPP3 prisutan u tkivu kore prednjeg mozga i na astrocitima tokom razvića [288], ali s obzirom na niske nivoe iRNK koje smo dobili qRT-PCR analizom, možemo zaključiti da E-NPP-aza3 ne doprinosi značajno kontroli vanćeliskih nivoa nukleotida. 
Uloga NPP enzima bi mogla biti region-specifična; na primer, e-NPP-aza1 ima najveću aktivnost u malom mozgu, hipotalamusu i hipokampusu [289] dok je distribucija E-NPP-aze2 ograničena na belu masu [153]. 

Ekspresija A1 receptora nakon in vivo i in vitro povrede i tretmana

Stimulacija adenozinskih receptora, od kojih su svi prisutni u astrocitima, modulira funkcije astrocita. Posebno je važno naglasiti da aktivacija A1 receptora vodi smanjenju proliferacije astrocita, pa se smatra da je proliferacija astrocita u fiziološkim uslovima pod toničnom inhibicijom [266]. 
Rezultati dobijeni in vivo su pokazali da je A1 receptor transkript visoko eksprimiran u kori mozga pacova, što je u skladu sa prethodnim nalazima [290]. A1 receptor takođe ima i najveći afinitet za adenozin u poređenju sa ostalim podtipovima [236]. A1 receptor ima protektivne uloge u kontekstu moždane povrede. Na primer, antagonisti A1 receptora značajno povećavaju ćelijsku smrt u CA1 regionu mišjeg modela ishemije [291]. Nedavno su dobijeni podaci da u mozgu [298] i u plućima [299], postoji jasna sprega između A2A receptora i ENT aktivnosti. Ovi radovi ukazuju na to da A2A receptor podstiče aktivnost ENT što vodi smanjenju vanćelijskog Ado. Dalje, ukazano je i na vezu između aktivacije A2A i e-5NT; primećeno je paralelno povećanje aktivnosti e-5NT i gustine A2A receptora i u fiziološkim [19] i u patološkim stanjima [294,300]. U različitim modelima je pokazano da patološki stimulusi kao što je hipoksija takođe uzrokuju paralelnu ushodnu regulaciju e-5NT i A2A [301][302][303], ističući povezanost ova dva proteina. 
Uzevši u obzir iznad izloženo i rezultate ekspresije ENT1, ENT2 i e-5NT nakon tretmana DPCPX, trebalo bi ispitati ulogu A2A u regulaciji ekspresije ovih komponenti adenozinskog sistema. 

Uticaj hemijski izazvane hipoksije kobalt-hloridom na aktivnosti komponenti adenozinskog signalnog sistema

Iako patologije CNS-a kao što su TPM i ishemija imaju dosta sličnosti, treba uzeti u obzir da se povrede međusobno mogu prilično razlikovati, posebno u zavisnosti od njihove težine i mehanizama koji ih odlikuju. Slično se može kazati i za in vitro povrede astrocita. 
Kako bismo uporedili rezultate dobijene skarifikacijom astrocita sa modelom hipoksije in vitro, hemijski smo indukovanu hipoksiju kobalt-hloridom (CoCl2). CoCl2 aktivira hipoksiju, i time specifične signalne puteve i transkripcione faktore [304][305][306]. Ranije je opisano da se CoCl2 aktivira signalizaciju posredovanu HRE (engl. hypoxia response element) promotorom i aktivira HIF-1α [121]. Pored toga, pokazano je ne samo da CoCl2 indukuje ekspresiju HIF-1α već i njegovu stabilizaciju [307][308][309][310]. Ovo je potvrđeno i kod astrocita u kulturi, gde CoCl2 indukuje ushodnu regulaciju HIF--1α [271]. Zbog svega navedenog tretman CoCl2 se smatra adekvatnim modelom hipoksije, jer ima dosta sličnosti sa pravom hipoksijom [311]. 
CoCl2 nije izazvao smrt ćelija četiri sata nakon tretmana, pa su svi dobijeni rezultati posmatrani kao efekat hipoksije, a ne kao posledica citotoksičnosti CoCl2. 
U skladu sa prethodnim nalazima, FACS analizom je potvrđeno značajno povećanje HIF--1α nakon tretmana CoCl2. 
FACS analiza je pokazala da CoCl2 nije doveo do promene ekspresije ENT1, ali zato je značajno povećao ekspresiju ENT2 i e-5NT. Sa druge strane, posledice skarifikacije u istoj vremenskoj tački nisu uticale na promene iRNK ili proteinske ekspresije ENT1/2, ili e-5NT. 
Iako je ranije objavljivano da HIF--1α utiče na nishodnu regulaciju ENT1 i ENT2 [274,275], naši rezultati nisu to pokazali. U oba modela povrede astrocita, SW i CoCl2, mi nismo utvrdili vezu između ekspresije HIF--1α i ENT1/ENT2 koja bi ukazivala na represiju ekspresije ovih transportera. Pored toga, u oba modela povrede kao i pod različitim tretmanima, rezultati idu u prilog hipotezi da su ENT1 i ENT2 regulisani različitim signalnim putevima. Sa druge strane, istovremeno povećanje e-5NT bi moglo zavisiti od povećanja HIF--1α, za koji je ranije pokazano da utiče na ushodnu regulaciju enzima [284]. 
Budući da skarfikacija dovodi do malog povećanja vanćelijskih koncentracija Ado, hteli smo da proverimo isti parametar nakon tretmana CoCl2. 
Četiri sata nakon izlaganja astrocita CoCl2, u medijumu je detektovan značajan porast koncentracije Ado. Raniji nalazi su ukazali da hipoksija u trajanju od dva sata ne dovodi do promene vanćelijskih koncentracija Ado u kulturi astrocita [242]. 
Međutim jedna ranija studija je uspela da detektuje Ado oslabađanje od astrocita u hipoksičnim uslovima, koji su okarakterisani kao vid teže ili intenzivnije hipoksije [312]. Astrociti sadrže velike količine glikogena i mogu preživeti duže vreme, i stoga manje zavise od nedostatka glukoze ili ATP [313,314]. Fujita u svom radu ističe da se dva sata hipoksije smatraju "srednje teškom" hipoksijom. 
Iznenađujući je rezultat UPLC analize medijuma koji pokazuje da se pored Ado povećala koncentracija X, ali ne i Ino i HX. S obzirom na to da su Ino i HX intermedijarne forme koje prethode X, ovaj nalaz ukazuje na povećanu aktivnost enzima PNP i XO, koji konvertuju Ino do HX, odnosno, HX do X, mahom od strane astrocita [83,315]. Hipoksantin se koristi u spasonosnom putu katalitičkom aktivnošću HGPRT u ili se razgrađuje aktivnošću XO, kojom nastaje X. In vitro studije su pokazale da neuroprotektivni efekat Ino zavisi od njegove dostupnosti tj. 
od aktivnosti PNP [244,316]. Takođe, ranije je pokazano da se aktivnost XO povećava nakon TPM [317], i povećava nivoe X na račun HX. Ipak, da bi se doneo bilo kakav zaključak bilo bi neophodno ispitati aktivnosti PNP i XO u kulturi astrocita izloženoj hemijskoj hipoksiji. 
U poređenju sa rezultatima dobijenim 4 sata nakon skarifikacije, hipoksija izazvana CoCl2 je sasvim drugačije uticala na ekspresiju ENT2 i e-5NT, kao i HIF--1α; sem toga povećanje vanćelijske koncentracije Ado je bilo daleko veće nego nakon skarifikacije u istoj vremenskoj tački. Ovi rezultati nedvosmisleno pokazuju da, iako po mnogo čemu slične, mehanička i hipoksična povreda mogu biti prilično različite i samim tim iziskivati drugačije terapeutske pristupe kada je u pitanju adenozinski sistem. 

VI Zaključci

U skladu sa zadatim ciljevima ove doktorske teze i dobijenim rezultatima izvedeni su sledeći zaključci: 
1. Traumatska povreda mozga u primenjenom modelu jednostrane ubodne lezije moždane kore dovodi do: 
a. Smanjenja ekspresije ENT1, ENT2 i e-5NT na nervnim ćelijama, kao i do povećanja ekspresije istih transportera i enzima na reaktivnim astrocitima u blizini mesta lezije. 
b. Povećanja ekspresije e-NTPD-aze1, prolaznog smanjenja i naknadnog povećanja ekspresije e-NTPDaze2, kao i do smanjenjenja ekspresije e-NPPaze1. 
c. Smanjenja ekspresije najzastupljenijeg adenozinskog receptora A1. Naučno istraživački rad Ane Parabucki je realizovan kroz projekte finansirane od strane Ministrastva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije. U periodu od 2008-2010. godine učestvovala je u realizaciji projekta "Interakcija glije i neurona u procesu oporavka nakon oštećenja centralnog nervnog sistema" (projekat 143005, rukovodilac prof dr Mirjana Stojiljković). Od 2011. godine učesnik je projekta "Ćelijska i molekulska osnova neuroinflamacije: potencijalna ciljna mesta za translacionu medicinu i terapiju" (projekat III41014, rukovodilac prof dr Mirjana Stojiljković). U okviru ovog projekta je i istraživački zadatak koji se odnosi na izradu njene doktorske teze pod mentorstvom dr Ivane Bjelobabe i prof dr Nadežde Nedeljković. Dobila je studentsku stipendiju od strane DAAD i na osnovu toga učila i usavršavala se na RWTH Aachen u laboratoriji prof Markusa Kippa u Ahenu, Nemačka. Takođe, učestvuje u realizaciji bilateralnog DAAD projekta sa Nemačkom (The role of ectonucleotidases in development of neuronal networks in the auditory brainstem: Immunohistochemical study in gerbils and geneticaly modified mice lacking P2Y1 or P2Y2 receptor", 2011 -2013). Od 2008. stručni je saradnik je Istraživačke Stanice Petnica. Takođe je aktivna u popularizaciji nauke u Srbiji i Crnoj Gori. Autor je 3 i koautor 7 radova u međunarodnim vodećim časopisima, kao i brojnih domaćih i međunarodnih saopštenja. 

Изјава о ауторству


Потписани


Slika 5 .

 5 Položaj ubodne lezije u levom somatosenzornom korteksu pacova 3.1. Eksperimentalne grupe Eksperimentalnim planom predviđene su tri grupe životinja. Prvu grupu činile su životinje koje su podvrgnute operativnom zahvatu, u kojem su zadobile povredu levog senzomotornog korteksa (L). U post-operativnom periodu, životinje nisu podvrgavane nikakvom tretmanu. Drugu grupu činile su životinje koje su podvrgnute anesteziji i rasecanju kože, ali ne i kraniotomiji. Ova grupa označena je kao lažno operisana grupa šam (Š) kontrola. Operisane životinje i šam kontrole žrtvovane su 2 dana (L2) i 7 dana (L7) nakon zahvata. Grupa intaktnih životinja odgovarajuće starosti poslužila je kao fiziološka kontrola (FK). Za svaku vremensku tačku i za grupu intaktne kontrole odvojeno je po 11 životinja. Sve životinje su žrtvovane prekomernom dozom anestetika i transkardijalno perfundovane hladnim fiziološkim rastvorom (za izolaciju RNK i proteina) i potom hladnim 4% PFA (za imunohistohemijsko obeležavanje). 




  Primarna mešovita glijska kultura astrocita i mikroglije dobijena je iz mozgova pacova starih do tri dana. Mozak je izolovan i uklonjene su moždane ovojnice, a hemisfere su isprane tri puta u hladnom i sterilnom PBS-u. Tkivo je zatim mehanički homogenizovano u 35-mm Petri posudama (3 do 4 hemisfere u 2 ml PBS-a). Homogenat je prebačen u tube zapremine 15 ml, staložen gravitacionom sedimentacijom, i ostavljen u rastvoru za disocijaciju 30 min u inkubatoru (37 °C / 5 % CO2). Po uklanjanju rastvora za disocijaciju, u homogenat je dodato 2 ml kDMEM zagrejanog na 37 °C uz dodatak DNaze I. Dalja mehanička homogenizacija izvršena je provlačenjem tkiva kroz staklene Pasterove pipete, čime je homogenat disociran do nivoa ćelija. Ovako pripremljeni ćelijski homogenati prebačeni su u T-75 flaskove za kulturu i u svaki je dodato 10 ml kDMEM-a (37°C). Ćelije su gajene u inkubatoru, na 37 °C u vlažnoj atmosferi sa 5 % CO2. Medijum je prvi put promenjen 4 dana nakon izolacije, a posle toga je menjan na svaka dva dana. Ovako pripremljena kultura je mešovita kultura mikroglije i astrocita. Deset do 14 dana nakon izolovanja, mikroglijske ćelije odvajane su od astrocita trešenjem flaska, nakon čega se veći deo mikroglije izdvaja sa medijumom, dok astrociti ostaju zalepljeni za podlogu zajedno sa manjim procentom mikroglijskih ćelija. Nakon 14 dana na svetlosnom mikroskopu se vrši procena konfluetnosti ćelija i eventualne kontaminacije. Ukoliko su astrociti pokrili dno flaska i nije uočena kontaminacija kulture, flaskovi su rasejavani u laminaru. Flaskovi su isprani PBS-om (da bi se odstranile slabo zalepljene ćelije i ostaci medijuma), i potom se izlažu delovanju tripsina u trajanju do 5 minuta (3 ml radnog rastvora tripsina), koji na temperaturi od 37°C raskida raskida međućelijske veze i veze ćelija sa podlogom flaska . Flaskovi sa tripsinom se odlažu u inkubatoru, i pod mikroskopom se proverava da li su se ćelije odlepile. Potom se u flaskove dodaje po 4 ml kDMEM-a (FCS prekida aktivnost tripsina), ukupna zapremina ćelijskog medijuma se pokupi i rasporedi u 50 ml tube, a zatim centrifugira na 500 × g tokom 5 minuta. Nakon što se supernatant odlije, talog svake tube se resuspenduje u po 20 ml kDMEM-a provlačenjem kroz 23G iglu. Pre rasejavanja, ćelije se prebrojavaju metodom bojenja sa supravitalnom bojom, tripan plavim. Broj ćelija je određen bojenjem u 0,4 % rastvoru tripan-plavog u Neubauer komorici za brojanje na invertnom mikroskopu. Tripan-plavo je boja koja prodire kroz ćelije koje su izgubile membranski integritet tj. mrtve ćelije. Na taj način, se vijabilne ćelije razlikuju od mrtvih ćelija u toku brojanja. Ćelije resuspendovane u kDMEM-u i pomešane su sa 0,4 % rastvorom tripan plavog u odnosu 1:1 (faktor dilucije = 2, razblaženje ćelija u odnosu na boju). Po 10 µl obojene ćelijske suspenzije ubrizgano je u obe izbrazdane Neubauer komorice i ćelije su prebrojane tokom perioda od tri do pet minuta. Svaka komorica ima devet kvadrata, a površina svakog kvadrata je 1 mm 2 . Ćelije su izbrojane u po četiri kvadrata obe komorice, na osnovu čega je dobijen prosečan broj ćelija po mm 2 . Zapremina koju ćelije zauzimaju preko jednog kvadrata je 1 µl. Broj vijabilnih ćelija/ml medijuma preračunat je prema sledećoj formuli: Za imunocitohemijske analize, ćelije su zasejane u gustini od 4 x 10 5 na okruglim 25-mm stakalcima u pločama sa 6 bunarića u 2 ml kDMEM-a. Prethodno, stakalca su prevučena PLL-om i sterilisana UV svetlom tokom 2 sata. 


Slika 6 . 1 . 2 .

 612 Šematski prikaz povrede skarifikacijom.Za eksperimente u ćelijskoj kulturi, ukupna RNK izolovana je iz 8 x 10 5 ćelija po eksperimentalnoj grupi, primenom peqGold reagensa i fenol/hloroform ekstrakcije. Ćelije su lizirane dodavanjem 800 µl peqGold-a i homogenizovane provlačenjem lizata kroz pipetu nekoliko puta. Homogenizovani uzorci su inkubirani 5 min na sobnoj temperaturi, a potom je dodato 160 µl hloroforma na 800 µl peqGold-a. Tube su vorteksovane dok rastvor nije postao beo, a potom je usledila desetominutna inkubacija na ledu. Uzorci su zatim centrifugirani 5 min na 12 000 × g, na 4 °C. Smeša se na taj način razdvaja na žutu fenol-hloroformsku fazu, interfazu i gornju bezbojnu vodenu fazu u kojoj se nalaze RNK molekuli.Gornja faza iznosi oko 50% volumena zapremine peqGold-a korišćenog za homogenizaciju. Gornja faza je preneta u nove tubice u koje je dodato 400 µl izopropanola, a potom su tubice snažno izvorteksovane. Uzorci su inkubirani 15 min na ledu, a onda centrifugirani 5 min na 12 000 × g, na 4 °C. RNK se na ovaj način staložila na dnu tubica u vidu beličastog taloga. Specifikacija rastvora korišćenih za izolaciju RNK data je u Tabeli 3. Postupak izolacije se sastojao iz sledećih koraka: Homogenizacijatkivo je lizirano dodavanjem 1 ml TRIzola na 100 mg tkiva i homogenizovano u staklenom homogenizeru. Ovako lizirani i homogenizovani uzorci se mogu čuvati do mesec dana na -70 °C. Razdvajanje faza -homogenizovani uzorci su inkubirani 5 min na sobnoj temperaturi, da bi nukleoproteinski kompleksi u potpunosti disosovali, a potom je dodato 200 µl hloroforma na 1 ml TRIzola. Tube su vorteksovane dok rastvor nije postao beo, a potom je usledila desetominutna inkubacija na ledu. Uzorci su potom centrifugirani 5 min na 12000 g, na 4 °C. Smeša se na taj način razdvaja na žutu fenol-hloroformsku fazu, interfazu i gornju bezbojnu vodenu fazu u kojoj se nalaze RNK molekuli. Gornja faza iznosi oko 50% zapremine TRIzola korišćenog za homogenizaciju. 




  Blokiranje nespecifičnih mesta rađeno je inkubacijom PVDF membrane u rastvoru za blokiranje -5% BSA u TBS-T puferu;  Inkubacija u primarnom antitelu preko noći na +4°C (razblaženja su data u Tabeli 5). Sva antitela razblaživana su u TBS-T-u;  Ispiranje nevezanih primarnih antitela u TBS-T-u (3 × 10 min);  Inkubacija u sekundarnom antitelu (1 h), razblaživanom u TBS-T-u (razblaženja su data u Tabeli 6);  Ispiranje nevezanih sekundarnih antitela u TBS-T-u (3 × 10 min).PVDF membrane su inkubirane na električnoj mešalici da bi se obezbedilo podjednako vezivanje primarnih i sekundarnih antitela. Nakon poslednjeg ispiranja, membrane su inkubirane u rastvoru luminola (Tabela 2), koji reaguje sa molekulom HRP ostatkom na sekundarnom antitelu i emituje svetlosni signal koji se prenosi na fotografski film (Kodak). Filmovi su razvijani i fiksirani (Ilford) u mračnoj komori, i nakon sušenja skenirani.Intenzitet signala dobijenih na autoradiografskom filmu je kvantifikovan denzitometrijski, korišćenjem programskog paketa za analizu signala (ImageQuant 5.0). Vrednosti dobijene za ciljne proteine su normalizovane u odnosu na vrednosti koje su dobijene za odgovarajući aktin, koji je služio kao merilo ravnomerno nanete količine proteina. Tako dobijene relativne vrednosti ekspresije proteina su dalje korišćene za statističku obradu rezultata i njhovo grafičko predstavljanje. 


Slika 8 .Slika 9 .Slika 10 .

 8910 Analiza genske ekspresije za ENT1 i ENT2 .Ekspresija iRNK za ENT2 je određena qRT-PCR analizom. Nivoi transkripata svake grupe su prikazani relativno u odnosu na nivo transkripta za β-aktin. Rezultati prikazani stubićima su predstavljeni kao srednje vrednosti ± SEM 4 uzorka po grupi (n = 4). Nivo statističke značajnosti između grupa: **P < 0.01, # P < 0.001. imunohistohemije. Između fizioloških preseka i preseka šam kontrola nije bilo uočljive razlike (rezultati nisu prikazani), tako da su sva poređenja ozleđenih grupa vršena u odnosu na preseke dobijene iz kontrolnih životinja. Primenom imunofluorescetnog bojenja na ENT1 u kombinaciji sa imunofluorescentnim bojenjem na NeuN (koji specifično obeležava tela neurona) ili fluorescentnog bojenja na DAPI (koji obeležava jedra) ispitan je relativni udeo ekspresije ENT1 na neuronima u odnosu na druge tipove ćelija, a rezultati su prikazani na Slici 10. Utvrđeno je da na kontrolnim presecima većina NeuN pozitivnih ćelija (crveno) eksprimira ENT1 (zeleno), (Slika 10A-F, strelice). Imunoblot analiza ekspresije ENT1. A:Reprezentativni snimak imunoblota za ENT1 i β-aktin. U bunariće je nalivano 30 μg proteina. Antitelo na ENT1 na imunoblotu daje jednu specifičnu traku na 62 kDa. B: Kvantitativna analiza ekspresije ENT1 u fiziološkoj kontroli (FK), kao i dva (L2) i sedam (L7) dana nakon povrede. Vrednosti optičkih gustina traka na imunoblotu korigovane su prema odgovarajućim optičkim gustinama za β-aktin u istom bunariću, a potom normalizovane u odnosu na šam kontrolu (arbitrarno predstavljena kao 1.0). Rezultati prikazani stubićima su predstavljeni kao srednje vrednosti ± SEM iz 5 nezavisnih eksperimenta. Nivo statističke značajnosti između grupa **P < 0.01. Dvojno imunofluorescentno obeležavanje na ENT1 i GFAP urađeno je sa ciljem da se potvrdi prisustvo ENT1 na astrocitima u povređenom korteksu, a rezultati ove analize predstavljeni su panelom na Slici 11. Dvojno imunohistohemijsko obeležavanje ENT1 (zeleno) i markera neurona NeuN (crveno) nakon povrede. Jedra su obeležena DAPI bojom (plavo). Na kontrolnim presecima tela neurona i nastavci su intezivno obeleženi na ENT1 (strelice). D-F: Veće uveličanje ukazuje na distribuciju ENT1 na membrani i u citoplazmi neurona (strelice). G-I: Dva dana nakon povrede intezitet fluorescencije za ENT1 na neuronima se značajno smanjuje (strelice). J-L: Sedam dana nakon povrede u blizini lezije uočavaju se ENT1-pozitivne ćelije koje po morfologiji odgovaraju astrocitima (deblje strelice). Strelice ukazuju na retke ENT1 imunopozitivne neurone. Dužine skala:A-C, 25 μm; G-L, 5 μm. Na kontrolnim presecima (Slika 11A-D) nije uočeno prisustvo ENT1 (zeleno) na GFAP (crveno) pozitivnim astrocitima. Dva dana nakon povrede u neposrednoj blizini mesta lezije, primećeni su retki ENT1 imunopozitivni astrociti (Slika 11E-H). Znatno veći broj ENT1 imunoreaktivnih astrocita uočen je sa razvojem astroglioze, sedmog dana nakon povrede, (Slika 11I-L, strelice). 


Slika 11 .

 11 Dvojno imunohistohemijsko obeležavanje ENT1 (zeleno) i markera astrocita GFAP (crveno) nakon povrede. Jedra su obeležena DAPI bojom (plavo).A-D: Na kontrolnim presecima nisu uočeni ENT1 + astrociti. E-H: Dva dana nakon povrede smanjuje se intezitet imunofluorescence za ENT1. Retki ENT1 + /GFAP + reaktivni astrociti uočeni su u blizini mesta lezije. I-L: Sedam dana nakon povrede uočava se veći broj ENT1 + /GFAP + astrocita u blizini lezije (strelice). Dužine skala: A-C, E-G i I-K, 25 μm; D, H i L, 5 μm. 


Slika 12 .

 12 Dvojno imunohistohemijsko obeležavanje ENT1 (crveno) i e-5NT (zeleno) nakon povrede. Jedra su obeležena DAPI bojom (plavo). A-D: Ekspresija ENT1 i e-5NT kontrolnim presecima (strelice). E-H: Dva dana nakon povrede intezitet fluorescence za ENT1 i e-5NT (strelice) se smanjuje, dok se nešto izraženiji intezitet fluorescence za e-5NT uočavana ćelijama čija morfologija podseća na astrocite . I-L: Sedam dana nakon povrede uočavaju se brojne ENT1+/e-5NT+ ćelije u blizini lezije (strelice), čija opšta morfologija ukazuje da se radi o astrocitima. Dužine skale: A-C, E-G i I-K -25 μm; D, H i L -5 μm. 


Slika 14 .Slika 15 .

 1415 Imunoblot analiza ekspresije ENT2. A: Reprezentativni snimak imunoblota za ENT2 i β-aktin. U bunariće je naneto 30 μg proteina. Antitelo na ENT2 na imunoblotu daje jednu specifičnu traku na 50 kDa. B: Imunoblot analiza ekspresije ENT2 u fiziološkoj kontroli (FK), dva (L2) i sedam (L7) dana nakon povrede. Vrednosti relativnih optičkih gustina traka na imunoblotu korigovane su prema odgovarajućim optičkim gustinama za β-aktin, a potom normalizovane u odnosu na fiziološku kontrolu (arbitrarno predstavljena kao 1.0). Rezultati prikazani stubićima predstavljaju srednje vrednosti ± SEM iz 5 nezavisnih eksperimenta. Nivo statističke značajnosti između grupa **P < 0.01. L, strelice). Međutim, u istoj vremenskoj tački, jasno se vide ENT2 imunopozitivne ćelije koje morfološki odgovaraju astrocitima (Slika 15J-L, deblje strelice). Dvojno imunohistohemijsko obeležavanje ENT2 (zeleno) i NeuN (crveno) nakon povrede. Jedra su obeležena DAPI bojom (plavo). A-C: Neuronska ćelijska tela i nastavci su intezivno obeležena na ENT2 (strelice) na kontrolnim presecima. D-F: Veće uveličanje ukazuje na distribuciju ENT2 i na membrani i u citoplazmi neurona (strelice). G-I: Dva dana nakon povrede intezitet fluorescentnog signala za ENT2 na neuronima se smanjuje (strelice). J-L: Sedam dana nakon povrede u blizini lezije uočavaju se ENT2 pozitivne ćelije čija morfologija odgovara reaktivnim astrocitima (gornje strelice). Donje strelice ukazuju na retke ENT2 imunopozitivne neurone. Dužine skala: A-C i G-L, 25 μm; D-F, 5 μm. 


Slika 17 .

 17 Dva dana nakon povrede uočavaju se ENT2 pozitivni astrociti u blizini lezije (strelice) dok se ukupan intezitet fluorescence za ENT2, verovatno na neuronima, značajno smanjuje. I-L: Sedam dana nakon povrede uočavaju se brojni ENT2 + reaktivni astrociti (strelice). Dužina skala: A-C, E-G i I-K, 25 μm; D, H i L, 5 μm. Dvojno imunohistohemijsko obeležavanje ENT2 (crveno) i e-5NT (zeleno) nakon povrede. Jedra su obeležena DAPI bojom (plavo). A-D: Preklapanje ENT2 i e-5NT ekspresije na ćelijama na kontrolnim presecima (strelice). E-H: Dva dana nakon povrede ćelije u blizini lezije, čija morfologija ukazuje na reaktivne astrocite, eksprimiraju ENT2 i e-5NT (strelice), dok ukupan intezitet fluorescence za ENT2 i e-5NT, smanjuje. I-L: Sedam dana nakon povrede uočavaju se brojni ENT2/e-5NT pozitivni astrociti u blizini lezije (strelice). Dužine skala: A-C, E-G i I-K, 25 μm; D, H i L, 5 μm. 


Slika 20 .

 20 Uticaj tretmana na vijabilnost ćelija. Uticaj različitih koncentracija Ado (A), ATP (B), DPM (C) i DPCPX (D) na vijabilnost ćelija određen je MTT testom. Efekti primenjenih tretmana prikazani su kao procenat od kontrole (100%), koja je definisana kao kolorimetrijsko očitavanje u kulturi netretiranih astrocita. Rezultati prikazani tačkama su srednje vrednosti ± SEM iz 3 nezavisna eksperimenta. 


Slika 29 .Slika 31 .

 2931 Analiza genske ekspresije za ENT1 24 h nakon ATP tretmana .Ekspresija iRNK za ENT1 je određena qRT-PCR analizom. Nivoi transkripata svake grupe su prikazani relativno u odnosu na nivo transkripta za ciklofilin-A,. Rezultati prikazani stubićima su srednje vrednosti ± SEM iz tri nezavisna eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: ** P < 0.01.Preciznija analiza promena ekspresije ENT1 na proteinskom nivou urađena je FACS analizom (Slika 31). U obe analizirane vremenske tačke nakon skarifikacije Slika 30. Dvojno imunocitohemijsko obeležavanje ENT1 (zeleno) i vimentina (crveno) 24 h nakon skarifikacije. Jedra su obeležena DAPI bojom (plavo). A-C: Intenzivno obeležava astrocite u kontrolnim kulturama. D-F: Veće uveličanje ukazuje na membransku distribuciju ENT1 na ćelijskim telima astrocitima. G-I: Nakon skarifikacije, ENT1 je prisutan na vimentin-pozitivnim astrocitima blizu mesta povrede. J-L: Na većem uveličanju se uočavaju ENT1 pozitivni astrocitni nastavci. Dužine skala: 30 μm i 10 μm. i DPCPX tretmana, nije bilo značajnih razlika u ekspresiji ENT1 u odnosu na kontrolu. DPM je doveo do smanjenja ekspresije ENT1 za 40%, 4h nakon tretmana (12.37 ± 0.57, P< 0.05) u odnosu na kontrolu (21.62 ± 1.08). Posle 24 h, vrednost ekspresije ENT1 pod svim tretmanina odgovara kontrolnom nivou. Efekat povrede astrocita skarifikacijom ili tretmanima DPM i DPCPX na membransku ekspresiju ENT1. A: Relativne srednje vrednosti inteziteta fluorescence poreklom od ENT1 izražene su u odnosu na kontrolu, 4 i 24 h nakon povrede ili tretmana. B, C: Preklopljeni reprezentativni histogrami inteziteta fluorescence u funkciji broja ENT1 pozitivnih ćelija. Neobeležene ćelije su prikazane sivim histogramom, i predstavljaju negativnu kontrolu. Nivo statističke značajnosti između grupa: *P < 0.05. 


Slika 32 .Slika 33 .

 3233 Analiza genske ekspresije za ENT2 u različitim vremenima nakon skarifikacije . Ekspresija iRNK za ENT2 je određena qRT-PCR analizom. Nivoi transkripata svake grupe su prikazani relativno u odnosu na nivo transkripta za ciklofilin-A. Rezultati prikazani stubićima su srednje vrednosti ± SEM iz tri nezavisna eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: **P < 0.01; # P < 0.001. µM), (Slika 34). Kao kontrola svake grupe uzete su netretirane ćelije iste vremenske tačke. Rezultati su pokazali da tretman ATP-om značajno povećava ekspresiju ENT2 za 100% (0.29 ± 0.03, P < 0.01) u poređenju sa kontrolom (0.15 ± 0.01). Analiza genske ekspresije za ENT2 4 i 24 h nakon Ado, DPM ili DPCPX tretmana .Ekspresija iRNK za ENT2 je određena qRT-PCR analizom. Nivoi transkripata svake grupe su prikazani relativno u odnosu na nivo transkripta za ciklofilin-A,. Rezultati prikazani stubićima su srednje vrednosti ± SEM iz tri nezavisna eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: *P < 0.05; ** P < 0.01.Na Slici 35 prikazano je dvojno imunofluorescentno bojenje na ENT2 (zeleno) i vimentin (crveno) i kontrastno bojenje jedara primenom fluorescentne DAPI boje (plavo) kod kontrolnih kultura i kultura izloženih skarifikaciji. 


Slika 37 .

 37 Analiza genske ekspresije za e-5NT u različitim vremenima nakon skarifikacije .Ekspresija iRNK za e-5NT je određena qRT-PCR analizom. Nivoi transkripata svake grupe su prikazani relativno u odnosu na nivo transkripta za ciklofilin-A, a potom normalizovane u odnosu na odgovarajuću vrednost kontrole. Rezultati prikazani stubićima su srednje vrednosti ± SEM iz tri nezavisna eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: **P < 0.01; # P < 0.001.Na Slici 40 prikazano je dvojno imunofluorescentno bojenje na e-5NT (zeleno) i vimentin (crveno) i kontrastno bojenje jedara primenom fluorescentne DAPI boje (plavo) kod kontrolnih i ćelija izloženih skarifikaciji. 


Slika 41 .

 41 Efekat povrede astrocita skarifikacijom ili tretmanima DPM i DPCPX na membransku ekspresiju e-5NT. A: Relativne srednje vrednosti inteziteta fluorescence poreklom od e-5NT izražene su u odnosu na kontrolu, 4 i 24 h nakon povrede ili tretmana. B, C:Preklopljeni reprezentativni histogrami inteziteta fluorescence u funkciji broja e-5NT-obeleženih ćelija. Neobeležene ćelije su prikazane sivim histogramom, i predstavljaju negativnu kontrolu. Nivo statističke značajnosti između grupa: *P < 0.05; # P < 0.001. receptora, smanjivši je za oko 25% (1.36 ± 0.002, P < 0.05) u odnosu na kontrolnu kulturu (1.83 ± 0.14). 




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  


III Materijal i metode 1. Eksperimentalne životnje

  
		koncentracije adenozina i njegovih metabolita merene su nakon
		farmakoloske blokade ovih transportera.
	 Kako bismo uporedili odgovor astrocita na mehaničku i hipoksičnu
		povredu, poseban cilj bio je ispitivanje aktivnosti komponenti
		adenozinskog sistema u uslovima hemijski izazvane hipoksije u kulturi
		astrocita.
	U in vivo eksperimentima su korišćeni su mužjaci pacova Wistar soja,
	Rezultati ovog istraživanja u velikoj meri doprinose boljem razumevanju starosti 12 nedelja i prosečne težine 200 -250 g. Tokom eksperimenta životinje su
	na to da u literaturi ne postoje podaci o šablonu ekspresije ENT1 statusa pojedinih komponenti adenozinskog sistema nakon povrede nervnog bile smeštene u kavezima (3 -5 po kavezu, odnosno po 2 u post-operativnom
	i ENT2 na nivou iRNK i proteina, kao ni podaci o ćelijskoj distribuciji ovih tkiva. Pored toga, izneseni rezultati bi mogli biti od značaja i sugerisati mesta periodu), pri standardnim uslovima u prostoriji (temperatura: 23 ± 2 °C; relativna
	transportera u korteksu pacova nakon povrede, prvi cilj bilo je farmakoloških manipulacija u budućim terapijskim pristupima lečenja traumatske vlažnost vazduha: 60 -70 %), sa slobodnim pristupom vodi i briketiranoj hrani, i
	rasvetljavanje ovih pitanja. Dalje, zbog svoje uloge u regulisanju povrede mozga. svetlosnom režimu 12 časova dan/12 časova noć.
	koncentracija vanćelijskih nukleotida i adenozina u ciljeve smo uvrstili i Za in vitro eksperimente tj. za pripremu primarnih glijskih kultura korišćeni
	ispitivanje promena ekspresije enzima ektonukleotidaza. su pacovi istog soja starosti do 3 dana.
	 Poznato je da astrociti u velikoj meri doprinose regulaciji vanćelijskih Životinje su uzgajane u odgajalištu Instituta za Biološka istraživanja "Siniša
	koncentracija adenozina kako u fiziološkim tako i u patološkim stanjima, Stanković" u Beogradu. Svi eksperimenti su bili odobreni od strane Etičkog
	iako su mehanizmi i dalje nepotpuno razjašnjeni. Stoga je sledeći cilj bio komiteta Instituta za Biološka istraživanja "Siniša Stanković" (rešenje broj 2-
	34/11).	ispitivanje ekspresije ENT1 i ENT2 na nivou RNK i proteina u primarnoj
		kulturi kortikalnih astrocita i in vitro modelu povrede. Kako bi se dobila
		kompletnija slika o ulozi astrocita u regulaciji vanćelijskih koncentracija
		nukleotida, ispitane su i promene u ekspresiji e-5NT, enzima odgovornog
		za hidrolizu AMP do adenozina.
	 Kako bi se opisala uloga astrocita u kontroli nivoa adenozina i
		adenozinskih metabolita u vanćelijskom prostoru, praćene su promene
		njihovih koncentracija u ćelijskom medijumu, u različitim vremenima
		nakon povrede ili tretmana. U cilju davanja odgovora na pitanje da li i na
		koji način ENT1 i ENT2 doprinose tim procesima u astrocitima,

2. Reagensi 2.1. Rastvori i medijumi Tabela 1. Reagensi Naziv Proizvođač

  
	EDTA	Etilendiaminotetra-sirćetna kiselina-dinatrijumova
		so, dihidrat, (Kemika, Hrvatska)	
	Fluorescentna boja za	DAPI (4, 6-diamidino-2-fenilindol, Invitrogen,
	jedra	USA)		
	HEPES	2-Hidroksietil	piperazin-N'-2-etan	sulfonska
		kiselina, (SERVA Electrophoresis, Nemačka)
	NaOH	Natrijum hidroksid, (Merck, Nemačka)
	BCA kit za određivanje	Micro BCA	Protein Assay	Kit (Pierce
	koncentracije proteina	Biotechnology, SAD)	
	Saharoza	(Sigma, Nemačka)	
	Tris	Tris (hidroksimetil) amino-metan ( SERVA
		Electrophoresis, Nemačka)	
	LDH kit	Promega, Nemačka	
	MTT kit	Sigma, Nemačka		
	BSA	eng. Bovine Serum Albumin, Goveđi serum
		albumin, (Sigma, Nemačka)	

Tabela 2. Rastvori za nesterilni rad Naziv Sastav i proizvodjač

  
	TBS-T pufer		1 g citratne kiseline 88.6 ml ddH2O Tris pufer sa dodatkom deterdženta -0.5% Tween,
	Gel za razdvajanje	6.1 g tri-natrijum citrata SDS denaturišući poliakrilamidni gelovi pH 7.4,
	proteina		do 500 ml mqH2O Gel za razdvajanje: 7.5% akrilamid/bisakrilamid (eng. Tris buffered saline-tween, TBS-T)
	2-metil butan Mowiol		(Sigma, Nemačka) (29:1, Sigma); 9,6 g Mowiol-a (Calbiochem, EMD Millipore,
			0,375 M Tris pH 8,8; SAD)
	4 % PFA, pH 7,4		40 g paraformaldehid (Sigma, Nemačka) 0,1% SDS 24 ml glicerola (Lach Ner, Češka)
	Sirćetna kiselina		500 ml dH2O Gel za koncentrisanje: 5% akrilamid/bisakrilamid min. 99,5 %, (Kemika, Hrvatska)
	TCA		1M NaOH (29:1, Sigma); eng. trichloroacetic acid, trihlor-sirćetna kiselina,
			500 ml 0,2 M PB 0,125 M Tris pH 6,8; (Kemika, Hrvatska)
	Etanol Tripan plavo 0.4 %	100 %, 96 %, 70 %, (Moss Hemos, Srbija) 0,1% SDS eng. Trypan Blue solution, 0.4%, tečan, sterilan,
	Triton-X100 rastvor		0.3% rastvor Polimerizacija: 50 μl 10% amonijum persulfata pogodan za ćelijsku kulturu (Sigma, Nemačka)
	Zoletil FACS pufer		Tiletamine-zolazepam, (ICN) i 5 μl TEMED-a (Serva) na 10 ml rastvora anestetik, (Virbac, 1% FCS
	Pufer za elektroforezu	Francuska) 192 mM glicin; 0.2%BSA
	Fiziološki rastvor proteina		0,9 % NaCl, (Hemofarm, Srbija) 25 mM Tris pH 8,3; 2mM EDTA
	RIPA pufer		50 mM Tris-Cl pH 7.5 0,1% SDS u PBS-u
	Pufer pFACS pufer za	transfer	150 mM NaCl 20% methanol; FACS pufer za permeabilizaciju, sa dodatkom
	proteina		1% NP-40 192 mM glicin; 0.2% Tween
	0,01 M PBS Adenozin, ≥99.0%	Rastvor Na-fosfatnog pufera: 0.1% SDS 25 mM Tris pH 8,3 Sigma, Nemačka
	Ponceau S boja Inozin, ≥99.0%		50 ml 0,2 M PB 10 mM EDTA Radni rastvor: Sigma, Nemačka
	Hipoksantin, ≥99.0%	8,7 g NaCl (Merck, Nemačka) 10 mM EGTA 1% Ponceau S boje; Sigma, Nemačka
	Ksantin, ≥99.5%		do 1000 ml mqH2O 0.5% Triton X-100 5% glacijalna sirćetna kiselina; Sigma, Nemačka
	0,2 M PB (eng. Phosphate H2O2 FACS fiksativ	0,2 M Fosfatni pufer: 33 % (Centrohem, Beograd) destilovana voda. FACS pufer
	buffer) Rastvor luminola Coomassie Brilliant Blue	0,2 M NaH2PO4 (Merck, Nemačka) Za 100ml radnog rastvora: 0,25% Coomassie Brilliant Blue R250; 4% paraform
	boja		0,2 M Na2HPO4 (Merck, Nemačka) 1 ml 0.1g luminola (Sigma, Nemačka) 10% glacijalna sirćetna kiselina; u odnosu 1:1
			mqH2O 0.44 ml p-kumarinske kiseline u DMSO (Sigma, 45% metanol;
			pH 7,4 Nemačka) destilovana voda.
	Citratni pufer		1M Citratni pufer, pH 6 10 ml 1M TRIS-HCl, pH 8.5

Tabela 3. Sterilni rastvori za izolaciju RNK i analizu genske ekspresije Naziv Sastav i proizvađač

  
	DEPC Brevikan	koza	dietil-pirokarbonat, potentni inhibitor RNKaze, 25✕ dNTP Mix 10 ml DMEM; 0,024 g HEPES; 0,002 g EDTA; 0,020 pacov, miš, Santa Cruz in vitro 1:400
	poliklonsko Neurokan miš	(Sigma, Nemačka) MultiScribe™ Reverzna Transkriptaza čovek, pas Biotechnology g tripsina pacov, miš, Santa Cruz in vitro 1:400
	DEPC tretirana voda SYBR Green Sterilna voda monoklonsko	dodati 1ml 0,1% dietil-pirokarbonata u 1000 ml eng. PCR Master Mix gene expression assay (Applied (PAA Laboratories, Austrija) čovek, pas Biotechnology
	strep/pen HIF1-alfa	monoklonsko miš	dH2O, promešati, autoklavirati Biosystems, UK) svinja, krava, smeša antibiotika streptomicina i penicilina, 100X, miš, pacov, Abcam FACS 1:200
	Rastvori za izolaciju Ultra čista destilovana	TRIzol® (Invitrogen, SAD) ; upH2O, eng. UltraPure TM DNase /RNase Free (PAA Laboratories, Austrija) čovek
	RNK voda bez DNaze i RNaze Tripsin GFAP zec poliklonsko	PeqGold, (Peqlab, Biotechnologie, Nemačka); Distilled Water (Invitrogen TM /GIBCO, USA) miš, pacov, Dako in vivo 1:700 tip XI, iz goveđeg pankreasa (Sigma, Nemačka) mačka, pas, in vitro 1:500
	hloroform, (Zorka, Srbija); Rastvor EDTA (za FACS) 10mM EDTA u PBS-u, zagrejati na 37ºC Radni rastvor tripsina 0.25% tripsin, 0.02% EDTA u PBS-u ovca, krava, FACS 1:400
	izopropanol (J.T. Baker, SAD); 70 % etanol napravljen u DEPC dejonizovanoj vodi svinja, krava, Tabela 4. Medijumi i reagensi za kulturu monoklonsko rastvor PLL-a čovek 10 ml 0.1% Poli-L-lizina (Sigma, Nemačka) u GFAP miš miš, pacov, Abcam in vivo 1:400
	Gel za razdvajanje RNK (1% agaroza) Naziv 10X PBS, sterilni monoklonsko Vimentin miš	Agaroza (Bioline, Velika Britanija) u TBE puferu Sastav i proizvođač čovek, pas Dulbecco-ov bez Ca 2+ i Mg 2+ , (PAA Laboratories, čovek 90 ml sterilne, dejonizovane vode pacov, miš, Dako in vitro 1:200
	TBE pufer (1x) Iba1 koza Etidijum-bromid (0.5 µg/ml) 1X PBS, sterilni 2.2. Antitela poliklonsko DMEM DNaza I bez RNaze FCS NeuN miš Tabela 5. Primarna antitela Specifično za poreklo monoklonsko ENT1 zec poliklonsko ENT1 zec poliklonsko monoklonsko beta-Aktin miš	Austrija) pacov, morsko Tris-Borat-EDTA pufer (1 L 5x štoka) Abcam 54 g Tris-a 27.5 g borne kiseline 20 ml 0.5 M EDTA sterlina, dejonizovana voda do 1 L pH 8 Rastvor etidijum-bromida (10 mg/ml, Bio-Rad, in vitro 1:700 SAD) prase, svinja, 900 ml streilne vode čovek 100 ml 10X PBS sterilnog bez Ca 2+ i Mg 2+ Dulbecco's Modified Eagle's Medium, (Gibco, InvitrogenCo, SAD) (Sigma, Nemačka) eng. Fetal Calf serum, Fetalni teleći serum, (PAA FACS 1:200 Laboratories, Austrija), pacov, miš, Millipore in vivo 1:500 reaktivnost na Proizvođač čovek, ptica, Razblaženje gušter vrste pacov dobijeno od pacov, miš, čovek ProteinTech in vitro1:200 čovek in vivo 1:500 ovca, krava, Lauri Alanko mačka, pas, in vivo 1:500 miš, pacov, Invitrogen WB 1:7000
	Komplet za DNazni tretman kDMEM (medijum za poliklonsko ENT2 zec	inaktiviran od 44°C -53°C u periodu od 10 min WB 1:1000 (Fermentas, Litvanija) 10x reakcioni pufer pufer sa MgCl2 Lauri Alanko DMEM pacov dobijeno od in vivo 1:500
	primarnu ENT2 glijsku kulturu) miš mešovitu monoklonsko	10 % FCS pacov, DNaza I/bez RNaze miš, Santa 25 mM EDTA čovek Biotechnology Cruz 1 % streptomicin/penicilin	in vivo 1:300 in vitro 1:200 FACS 1:200
	Komplet cDNK bkDMEM (medijum za za sintezu primarnu mešovitu e-5NT koza poliklonsko	DMEM bez fenol crvenog (bezbojni) High Capacity cDNA reverse Transcription Kit, WB 1:600 (Applied Biosystems, SAD): pacov, miš, Santa Cruz in vivo 1:200 10 % FCS čovek, pas Biotechnology in vitro 1:200
	glijsku kulturu) Rastvor za disocijaciju monoklonsko Fosfakan miš	1 % streptomicin/penicilin 10✕ RT pufer 10✕ RT nasumični prajmeri svinja, krava, za 6 životinja: miš, pacov, Chemicon	FACS 1:200 in vitro 1:400
			čovek

Tabela 6. Sekundarna antitela specifičnost za vrstu Konjugovano sa Poreklo Proizvođač razblaženje

  
	anti-zečje	Alexa Fluor 555	magarac	Invitrogen	1:250
	anti-mišje	Alexa Fluor 488	magarac	Invitrogen	1:250
	anti-mišje	Alexa Fluor 555	koza	Invitrogen	1:250
	TSA TM	eng. -Tyramide signal amplification KIT (Invitrogen, USA),
	Komplet	tiramid signalni amplifikujući komplet, sadrži:	
		Alexa Fluor 488 tiramid (komponenta A),		
		Dimetilsulfoksid (DMSO; komponenta B)		
		anti-zečje HRP konjugovano sekundarno antitelo IgG iz koze
		(komponenta C)				
		Blokirajući reagens (komponenta D)		
		Pufer za amplifikaciju (komponenta E;	sadrži	0.02%
		timerosal)				
	anti-zečje	HRP (peroksidaza	magarac	Santa	Cruz	1:5000
		rena)		Biotechnology	
	anti-mišje	HRP (peroksidaza	magarac	Santa	Cruz	1:5000
		rena)		Biotechnology	
	anti-kozje	Alexa Fluor 488	magarac	Invitrogen	1:250
	anti-zečje	Alexa Fluor 488	magarac	Invitrogen	1:250

Vodonik-peroksid (30% H2O2; komponenta F), stabilan rastvor 2.3. 
Prajmeri Tabela 7. Prajmeri za transktipte

  
		r ACC TTC CAG AAG GAC CCT GT		
	Ciklofilin-	f GGCAAATGCTGGACCAAACAC	194	60°C
	A	r AGAGTTGTCCACAGTCGGAGATG		
	GFAP	f CTCCTATGCCTCCTCCGAGACGAT	170	60°C
		r GCTCGCTGGCCCGAGTCTCTT		
	Brevikan	f CCTCAGGAAGCTGTGGAGAG	152	59°C
		r CTTGCCCCATCTGGAGTAGA		
	Fosfakan	f TTGACAAGTGATGAAGAGAGTGG	207	60°C
		r AATCAGCACATCTCGTTCTATCC		
	Neurokan	f TTTCAGTCCACAGCGATCAG	171	60°C
		r AGGAGAGGGATACAGCAGCA		
	A1	f GGCGATCTTCAGCTCCTTCCCGTA	207	60°C
	receptor	r GTA CTT CTG GGG GTC ACC GGA		
	Geni	Sekvence prajmera 5'→3'	Dužina	Temperatura
			(bp)	vezivanja, At
	ENT1	f CACTTCCTTCGCTGTTAGGG	144	60°C
		r TGTCCCCCTACCACTCTGAC		
	ENT2	f CCCTCATGACCTTCTTCCTG	166	60°C
		r CCAAGAGACCCGGTATAGCA		
	β-actin	f AGATTACTGCCCTGGCTCCT	120	59°C
		r ACATCTGCTGGAAGGTGGAC		
	e-5NT	f CAA ATC TGC CTC TGG AAA GC	119	59°C



  Kako bi se ispitala ekspresija membranskih proteina u astrocitima, rađeno je dvojno obeležavanje sa markerom astrocita GFAP-om. S obzirom na to da se GFAP nalazi unutar ćelije, svi prethodni koraci su rađeni isto ali sa pFACS puferom (sadrži deterdžent koji permebilizuje membranu). 


	 Antitela koja se nisu vezala za odgovarajući antigen uklonjena su dužim su prikazane u ovoj doktorskoj tezi slikane su približno u istim regionima korteksa  Ćelijama zasejanim na pločama sa 96 bunarića je u medijum dodat 10% 13. Protočna citofluorimetrija grupa je uzimano 50 µl ćelijske suspenzije, koja je prebačena i raspoređena
	ispiranjem u 0,01 M PBS-u, nakon čega su preseci inkubirani 2 h na sobnoj svih grupa životinja. Za lokalizaciju pojedinih regiona mozga korišćen je atlas i MTT (5 mg/ml) i potom su inkubirane 3 h na 37°C. u zasebne FACS tube.
	temperaturi sa odgovarajućim sekundarnim antitelom (Tabela 6). nomenklatura Paxinosa i Watsona [207].  Nakon isteka ovog perioda, u svaki bunarić nalivano je 50 µl DMSO kako bi Protočna citofluorimetrija (eng., fluorescence-activated cell sorting, FACS) je  Nakon ispiranja 2 x u pFACS puferu uz centrifugiranje (700 × g, 3 min)
	 Nakon ispiranja 0,01 M PBS-u, pločice su potapane u rasvor DAPI se rastvorio nastali formazan. metoda koja pruža brzu i kvantitativnu analizu pojedinačnih ćelija u tečnom Tabela 8. ćelije se fiksiraju u FACS fiksativu tokom 30 minuta na ledu (zaštićene od
	4, preko noći. Fiksativ je potom zamenjen saharozom u 0.2 M fosfatnom puferu, pH 7.4, u rastućim fluorescentne boje koja obeležava jedra ćelija vezivajući se specifično za dvolančanu DNK i emitujući plavu svetlost.  Očitavanje je apsorbance je vršeno na 540 nm. medijumu. Merenje emisije fluorescentnog signala poreklom od obeleženih ćelija Kontrolna grupa Opis svetla). 11. Imunocitohemijsko obeležavanje ćelija se vrši skeniranjem po njihovom prolasku pored izvora ekscitacije. FACS je široko Neobeležene ćelije Negativna kontrola, prema kojoj se vrše  Nakon koraka ispiranja, ćelije se resuspenduju u FACS puferu (300 µl) i
	koncentracijama (10%, 20%, 30%), radi dehidratacije i krioprotekcije. Zamrzavanje  Nakon ispiranja 5 x 3 minuta, pločice su pokrivane Moviolom i do analize Princip imunocitohemijske analize je sličan postupku imunohistohemijskog LDH test je takođe kolorimetrijski esej. Oštećene ćelije gube integritet korišćena metoda u karakterizaciji individualnih ćelija mereći intezitet fluorescence podešavanja na FACS aparatu, kako bi se uzela u ovako post-fiksirane mogu da se čuvaju u frižideru (začtićene od svetla)
	je izvedeno u 2-metil butanu, mozgovi zavijeni u parafilm i čuvani u zamrzivaču na mikroskopu čuvane na 4°C. obeležavanja tkiva, tako da će ovde biti date ključne razlike. membrane i pritom u okolni medijum oslobađaju dehidrogenazu mlečne kiseline koji produkuju fluorescentno obeležena antitela vezana za protein od interesa. obzir autofluorescenca ćelija. Ove ćelije su prošle najmanje 2 dana.
	na -80ºC do upotrebe. Koronalni preseci mozgova debljine 25 µm su pravljeni na istu proceduru kao i ostale, samo bez primarnog i
		sekundarnog antitela.
	Ćelije + primarna At	Kontrola sa samo primarnim antitelima kako bi se
		potvrdilo da ista ne odaju nikakav detektabilni
		signal.
	Ćelije + sekundarna At	Kontrola sa samo sekundarnim antitelima kako bi
		se potvrdila specifičnost njihovog vezivanja.
	Preseci su analizirani na Zeiss Axiovert invertovanom fluorescentnom
	mikroskopu, i fotografisani odgovarajućim digitalnim kamerama sa uvećanjima Preživljavanje ćelija nakon tretmana je određivano pomoću MTT i/ili LDH
	 Demaskiranje antigena se vršilo zagrevanjem pločica sa presecima u 0.1 M objektiva EC Plan-Neofluar 10x, Plan-Apochromat 20x, EC Plan-Neofluar 40x, EC testa.
	citratnom puferu pH 6 u mikrotalasnoj pećnici tokom 10 minuta na 350 Plan-Neofluar 63x i 100x Plan-Apochromat. Fluorescentne mikrografije slikane su MTT test je kolorimetrijski test, baziran na redukciji žutog MTT-ja (3-(4,5-
	Watt, pre postupka imunohistohemijskog bojenja. AxioCam monohromatskom kamerom te su različitim kanalima naknadno dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromid) do ljubičastog formazana u  Po isteku 30 minuta, dodaje se 50 µl rastvora za prekidanje reakcije i Po isteku ovog vremena, ispiranje se vrši 2 puta u FACS puferu uz  Materijal raspoređen FACS tubama se centrifugira 3 min na 700 × g, nakon  Nakon postupka demaskiranja antigena, preseci su inkubirani sa 1 % BSA pridružene odgovarajuće boje. Vreme ekspozicije za pojedinačne kanale mitohondrijama živih ćelija. Mitohondrijska dehidrogenaza vijabilnih ćelija iseca očitavanje apsorbance se vrši na 490 nm. centrifugiranje (700 × g, 3 min), nakon čega se ćelije inkubiraju sa čega se pažljivo odlije supernatant. tokom 1 h, čime su blokirana mesta nespecifičnog vezivanja antitela. određivano je na početku svakog mikroskopiranja i u toku rada nije značajno tetrazolijumski prsten, dajući ljubičaste MTT formazanske kristale koji su odgovarajućim sekundarnim antitelom (200 µl/tubi, razblaženja su data u  Resuspendovanje ćelija se vrši u 350 µl FACS pufera. U ovom koraku se  Potom su preseci inkubirani preko noći sa primarnim antitelima (Tabela 5), Sva merenja su izvršena u mikroskopu pridruženom softverskom paketu vijabilnosti tretiranih ćelija izražena u procentima u odnosu na kontrolu koju su verodostojnije, one su predstavljale smešu svih grupa, to jest -od svih u vlažnoj komori na 4 °C. menjano. nerastvorljivi u vodi. Test je izveden iz tri nezavisna eksperimenta u triplikatu, a razdvajaju kontrolne grupe (Tabela 8). Kako bi kontrole bile što Tabeli 6) na ledu, tokom 30 minuta nakon čega je usledio korak ispiranja.
	AxioVision, dok su same mikrografije (u rezoluciji 300 piksela/inču) obrađene u činile netretirane ćelije (100%).
	programu Adobe Photoshop CS6. Radi lakšeg praćenja rezultata, mikrografije koje

kriostatu, na temperaturi od -23 ºC.Preseci su montirani na prethodno pripremljena želatinizirana predmetna stakla, i potom ostavljeni nekoliko sati da se osuše na sobnoj temperaturi.Do upotrebe su čuvani na -20 ºC.Za vizualizaciju reakcije antigen-antitelo, na kojoj se zasniva imunohistohemijsko obeležavanje, korišćeno je dvojno fluorescentno bojenje, gde je primarno antitelo neobeleženo, a sekundarno je nosilac fluorescentne boje, koja daje bojenu reakciju nakon ekscitacije odgovarajućom talasnom dužinom.Metod je podrazumevao sledeće korake:  Nakon temperiranja na sobnoj temperaturi, pločice sa kriopresecima su isprane u 0,01 M PBS-u.Uslučajukadajesignalporeklomod sekundarnog antitela bio slab, primenjen je komercijalni Tiramid kit za ampifikaciju signala (Tabela 2), umesto fluorescentno obeleženog sekundarnog antitela, a prema instrukcijama proizvođača.Velika pažnja je posvećena odabiru primarnih i sekundarnih antitela i proverene su njihove kombinacije u smislu ukrštenih i nespecifičnih reakcija.Kontrola bojenja je rađena po iznad opisanom postupku, u odsustvu primarnog antitela.Po završetku tretmana, ćelije su prvo fiksirane 20 min u 4 % PFA na 4 °C, a potom isprane dva puta u sterilnom PBS-u na sobnoj temperaturi.Potom su ćelije permeabilisane u 0,25 % Triton X -100, 10 min, pa isprane u PBS-u.Blokiranje je vršeno inkubacijom u 5 % BSA, tokom 45 min.Kako bi se odredio odnos astrocita i mikroglije u ćelijskoj kulturi, brojanje ćelija je rađeno u sedam kvadrata (0.38 mm 2 ) po uzorku iz tri nezavisna eksperimenta.12.Testovi vijabilnosti (LDH).LDH dalje katalizuje reakciju konverzije mlečne kiseline u pirogrožđanu, uz nastanak NADH.U prisustvu diaforaze i resazurina, NADH oksiduje formirajući crveni formazan.Test je izveden u triplikatu, a vijabilnosti tretiranih ćelija izražena u procentima u odnosu na kontrolu koju su činile lizirane ćelije (100%).45minutaprepočetkaeseja,u dva bunarića sa ćelijama dodato je 10 µl na 100µl medijuma komercijalnog rastvora za liziranje (10 x).Medijum ovako liziranih ćelija je dalje služio kao 100% kontrola.Nakontretmana,astrocitimagajenimna pločama sa 6 bunarića je uziman medijum, centrifugiran na 250 ×g tokom 4 minuta.50µlsupernatantaje pipetirano u ploču sa 96 bunarića, čemu je dodato 50 µl rekonstituisanog supstratnog miksa.Ploča se poklopi, zaštiti od svetla i inkubira tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi.U ovom radu je korišćen protokol indirektne FACS metode koji podrazumeva 2 koraka: inkubaciju ćelija sa primarnim i potom sa odgovarajućim sekundarnim antitelima.Takođe, korišćen je i protokol koji omogućava obeležavanje markera iskazanih samo na površini ćelije.Ovakav protokol omogućio je da se izbegne detekcija proteina od interesa u unutrašnjosti ćelije i da se kvantifikuje fluorescentni signal isključivo poreklom od membranskih proteina.Protokol je podrazumevao sledeće korake:  Po završetku tretmana, ćelije (8 x 10 5 po bunariću) su skidane sa podloge korišćenjem zagrejanog rastvora EDTA (1 ml po bunariću tokom 10 minuta), nakon čega su pipetom prebačene u 12 mm x 75 mm falkon tube (BD Biosciences) i dodato im je još 1 ml hladnog FACS pufera (tripsin se izbegava u ovom protokolu, jer postoji mogućnost da iseče membranske proteine od interesa).Nakon centrifugiranja 3 min na 700 × g, uzorci su inkubirani sa primarnim antitelom (200 µl/tubi, razblaženja su data u Tabeli 5), i inkubirana 45 minuta na ledu.S obzirom da je HIF1α unutarćelijski lokalizovan protein, za ove eksperimente je pre inkubacije sa antitelom, rađena pre-fiksacija FACS fiksativom i permeabilizacija sa pFACS puferom.Snimanje ćelija i kvantifikacija signala rađeni su na FACS Calibur aparatu i pridruženom softveru (BD Biosciences). Broj analiziranih ćelija po eksperimentu je iznosio 50 000 (broj događaja), dok je statistička obrada rezultata urađena iz tri nezavisna eksperimenta. 
Aktivnost komponenti adenozinskog signalnog sistema nakon skarifikacije astrocita u kulturi Budući

  
	4.5. Zastupljenost transkripata ispitivanih komponenti adenozinskog signalnog signalnog sistema i promene vanćelijskog metabolizma adenozina u medijumima
	sistema u korteksu mozga pacova ćelijskih kultura.
	Shodno dobijenim vrednostima ekspresije komponenti adenozinskog
	Dva dana nakon povrede, uočeno je značajno smanjenje ekspresije iRNK za signalnog sistema izraženim relativno u odnosu na β-aktin, najzastupljeniji od 4.2.1. Vijabilnost ćelija u kulturi
	NTPD2 (0.40 ± 0.16, P < 0.01, Slika 18B) u odnosu na odgovarajuću šam kontrolu ovde ispitivanih je transkript za A1 receptor. Najzastupljenije ektonukleotidaze u
	(0.98 ± 0.05). Nasuprot tome, sedam dana nakon povrede uočeno je povećanje korteksu mozga pacova su NTPD1 i NTPD2, dok su ostale ispitivane Vijabilnost ćelija u kulturi nakon 24 h tretmana rastućim koncentracijama
	ekspresije iRNK za NTPD1 (2.31 ± 0.93, P < 0.01, Slika 18A) i NTPD2 (1.55 ± 0.16, P < ektonukleotidaze eksprimirane u daleko manjoj meri. Dalje, analizom nivoa Ado, ATP, DPCPX i DPM, određena je MTT testom (Slika 20).
	0.05, Slika 18B) za oko 3, odnosno 2 puta u odnosu na odgovarajuće šam kontrole ekspresije transkripata utvrđeno je da je ENT2 oko 3 puta zastupljeniji od Uticaj Ado ispitan je u opsegu koncentracija 10-1000 µmol/l. U navedenom
	kontrolu (0.95 ± 0.15). Ekspresija iRNK za NTPD3 ostala je nepromenjena u transkipta za ENT1. opsegu Ado ispoljava mali, ali statistički značajan uticaj na preživljavanje ćelija u
	ispitivanim vremenima nakon povrede (Slika 18C). Poređenje zastupljenosti transkripata ispitivanih komponenti adenozinskog kulturi, koji se kreće od 12 ± 3% ćelijske smrtnosti pri koncentraciji od 50 µmol/l (P
	signalnog sistema u intaktnom korteksu mozga pacova može se predstaviti < 0.05) do 23 ± 5% pri koncentraciji od 1000 µmol/l (P < 0.05) u odnosu na
	sledećim redosledom: kontrolne kulture (Slika 20A).
	A1 receptor > NTPD2 ≈ NTPD1 > NPP2 ≈ e-5NT ≥ ENT2 > NTPD3 ≥ ENT1 >
	NPP1 >>NPP3
	Ekspresija iRNK za e-5NT prikazana je na Slici 18F. Drugog dana nakon povrede zastupljenost iRNK za e-5NT bila je na nivou šam kontrole, dok je sedmog dana povećana oko 2 puta (1.22 ± 0.41, P < 0.05, Slika 18F) u odnosu na šam kontrolu (0.58 ± 0.51). Uticaj DPCPX, antagoniste A1 receptora, na preživljavanje ćelija u kulturi ispitan je u opsegu koncentracija 0.1 do 50 µmol/l. DPCPX izaziva značajan stepen ćelijske smrti pri koncentracijama od 25 µmol/l (52 ± 1%, P < 0.001) i 50 µmola (61 ± 2%, P Citotoksični potencijal u kulturi ćelija nakon skarifikacije glijskog jednosloja, odnosno nakon tretmana prethodno odabranim koncentracijama Ado (50 µM), ATP (100 µM), DPM (5 µM) i DPCPX (1 µM), ispitivan je primenom LDH testa 4 i 24 sata nakon odgovarajućeg tretmana (Slika 21). 4.2. Jedan deo eksperimenata izveden je sa ciljem da se okarakteriše model u pogledu < 0.001) (Slika 20D). U kulturi ćelija 4 h nakon skarifikacije primećeno je neznatno povećanje
	ekspresije odabranih hondroitin-sulfat proteoglikana (engl. chondroitin sulfate ćelijske smrtnosti (27 ± 2%) u odnosu na kontrolu (22 ± 3%). U istoj vremenskoj
	proteoglycans -CSPG) i markera GFAP-a, na genskom i proteinskom nivou. Dalje je tački, od svih ispitivanih tretmana samo je ATP značajno smanjio vijabilnost ćelija
	analiziran odgovor astrocita pod uticajem različitih tretmana. Praćene su promene (29 ± 2.1%, P< 0.05), (Slika 21A).
	u genskoj i proteinskoj ekspresiji nekoliko odabranih komponenti adenozinskog

Na slici 18D-E prikazana je ekspresija transkripata za NPP1 i NPP2. Samo se sedam dana nakon povrede uočava statistički značajno smanjenje ekspresije, NPP1 transkripta (0.005 ± 0.002, P < 0.05, Slika 18D) u odnosu na vrednost šam kontrole (0.013 ± 0.003, P < 0.05, Slika 3D), dok se ekspresija NPP2 ne menja nakon povrede (Slika 18E). Ekspresija gena za NPP3 bila je je ispod granice detekcije (rezultati nisu prikazani). da je u modelu povrede mozga pacova uočena značajna promena aktivnosti i ekspresije komponenti adenozinskog signalnog sistema na astrocitima, u drugom delu teze ispitali smo odgovor astrocita na povredu. Opredelili smo se za model povrede skarifikacijom ćelijskog jednosloja (engl. scratch wound, SW). Uticaj ATP na vijabilnost ćelija u kulturi ispitana je u opsegu koncentracija od 0.1 -20 mmol/l. ATP izaziva značajan porast ćelijske smrti u svim primenjenim dozama, izazivajući čak 81 ± 2% ćelijske smrtnosti pri najvećoj testiranoj dozi od 20 mmol/l (P < 0.001 ). Uticaj DPM na vijabilnost ćelija u kulturi ispitana je u opsegu koncentracija 1-100 µmol/l (Slika 20C). Značajno povećanje smrtnosti ćelija uočeno je pri koncentraciji od 20 µmol/l (43 ± 1%, P< 0.001) i 100 µmol/l (61 ± 3%, P< 0.001). 
4.2.4. Analiza ekspresije ENT2 u različitim vremenima nakon povrede skarifikacijom ili tretmana

  
	Prikazani su rezultati genske ekspresije za ENT2 u različitim vremenima
	nakon skarifikacije i tretmana sa Ado, ATP, DPM i DPCPX. Promena ekspresije
	iRNK za ENT2 praćena je 0.5, 1, 4, 8, 24 i 48 sati nakon skarifikacije, qRT-PCR (Slika
	32).
	Do 8 h nakon skarifikacije nije bilo značajnih promena u ekspresiji ENT2,
	kada je primećen pad nivoa transkripta za 25% (0.23 ± 0.002, P < 0.05) u odnosu na
	kontrolu (0.30 ± 0.001). U kasnijim vremenima ovaj trend se menja, i ekspresija
	ENT2 se povećava za 100% 24 h (0.32 ± 0.03, P < 0.001) i za 200% 48 h (0.24 ± 0.012,
	P < 0.001) nakon povrede, u odnosu na odgovarajuće kontrole (0.15 ± 0.011 i 0.08 ±
	0.01).
	Rezultati su pokazali da Ado i DPM tretmani značajno povećavaju
	ekspresiju iRNK za ENT2 4 h nakon aplikacije, dok DPCPX tretman ne utiče na
	promenu ENT2 u ovoj vremenskoj tački. Tretman Ado povećava ekspresiju ENT2
	za 110% (0.38 ± 0.09, P < 0.05), a DPM za 85% (0.34 ± 0.02, P < 0.01) u odnosu na
	kontrolu (0.18 ± 0.02).
	Nakon 24 h, samo je Ado tretman imao uticaja na promenu ekspresije iRNK

Nadalje je urađena analiza genske ekspresije ENT2 4 i 24 h nakon tretmana Ado (50 µM), DPM (5 µM) i DPCPX (1 µM), (Slika 33). Kao kontrola svake grupe uzete su netretirane ćelije iste vremenske tačke. za ENT1, povećavajući je za oko 90% (0.28 ± 0.02, P < 0.01) u poređenju sa odgovarajućom kontrolom (0.15 ± 0.01). 
4.2.5. Analiza ekspresije e-5NT u različitim vremenima nakon povrede skarifikacije ili tretmana

  
	Prikazani su rezultati genske ekspresije za e-5NT u različitim vremenima
	nakon skarifikacije i tretmana sa Ado, ATP, DPM i DPCPX. Dvadeset i četiri sata
	pre skarifikacije odnosno početka tretmana, ćelijama je ukidan FCS.
	Ekspresija iRNK za e-5NT nakon skarifikacije utvrđena je qRT-PCR
	analizom, 0.5, 1, 4, 8, 24 i 48 sati nakon povrede (Slika 37). Kao kontrola svake
	grupe uzete su intaktne ćelije iste vremenske tačke.
	Već 0.5 h nakon skarifikacije primećen je pad u ekspresiji e-5NT za 25% (1.75
	± 0.09, P< 0.01) u odnosu na kontrolu (2.28 ± 0.12). Pad u nivou e-5NT transkripta
	se održao i 1h posle povrede za 20% (1.67 ± 0.04, P< 0.01) u odnosu na
	odgovarajuću kontrolu (2.05 ± 0.15). U kasnijim vremenima ovaj trend se menja, i
	ekspresija e-5NT se povećava za 160% 24 h (2.61 ± 0.30, P< 0.001) i za 200% 48 h
	(0.83 ± 0.15, P< 0.01) nakon povrede, u odnosu na odgovarajuće kontrole (0.98 ± 0.1
	i 0.28 ± 0.09).
	U daljem toku rađena je analiza genske ekspresije za e-5NT 4 i 24 h nakon
	tretmana Ado (50 µM), DPM (5 µM) i DPCPX (1 µM), (Slika 38).Kao kontrola svake
	grupe uzete su netretirane ćelije iste vremenske tačke.
	Rezultati su pokazali da, 4 h nakon aplikacije, tretman Ado povećava
	ekspresiju e-5NT za 30% (3.19 ± 0.64, P< 0.05), DPCPX smanjuje za 30% (1.73 ± 0.11,
	P< 0.01) u odnosu na kontrolu (2.42 ± 0.21), dok DPM tretman ne utiče na
	ekspresiju e-5NT.
	Svi tretmani su povećali ekspresiju e-5NT nakon 24 h. Ado tretman je povećao nivo

transkripta za 130% (2.39 ± 0.09, P< 0.001), DPM za 30% (1.48 ± 0.11, P< 0.05), kao i 
Analiza genske ekspresije za A1 receptor 24 sata nakon skarifikacije i Ado, DPM ili DPCPX tretmana

  
	Na Slici 41 je prikazana kvantitativna analiza ekspresija e-5NT na
	proteinskom nivou.
	Membranska ekspresija e-5NTu kontroli 4 h nakon početka eksperimenta je
	bila izrazito niska u svim eksperimentima. Pored toga, u istoj vremenskoj tački
	nakon skarifikacije ekspresija e-5NT je ostala nepromenjena u poređenju sa
	kontrolama. Povreda je dovela do smanjenja membranske ekspresije e-5NT 24 h
	kasnije (21.84 ± 0.76, P< 0.05) u odnosu na kontrolu (28.9 ± 1.07).
	DPM i DPCPX tretmani su doveli do značajnog povećanja u ekspresiji e-
	5NT (za 100 i 70%, redom) nakon 4 h (17.79 ± 1.30, 14.34 ± 1.13, P< 0.001) u odnosu
	na kontrolu (8.3 ± 1.10). Posle 24 h nakon oba tretmana, vrednost ekspresije e-5NT
	se smanjila za 20% ( 22.09 ± 3.47 u tretmanu DPM, odnosno 22.06 ± 1.85 u tretmanu
	DPCPX, P< 0.05 ) u poređenju sa kontrolom (28.9 ± 1.07).
	4.2.6. Prikazani su rezultati genske ekspresije za A1 receptor 24 h nakon
	skarifikacije i tretmana Ado (50 µM), DPM (5 µM), DPCPX (1 µM) i ATP (100 µM),

** P < 0.01.(Slika42). Rezultati su pokazali da se ekspresija A1 receptora ne menja značajno 24 sata posle povrede. Samo je tretman ATP-om uticao na promenu ekspresije A1 
8. UPLC analiza promena koncentracija adenozina i njegovih metabolita u ćelijskom medijumu nakon skarifikacije

  
	Adeninski nukleozidi/metaboliti	Koncentracija (μM)
	Adenozin	0.21 ± 0.01
	Vanćelijski metabolizam adenozina nakon SW povrede u kulturi astrocita, Inozin 0.16 ± 0.03
	ispitali smo metodom tečne hromatografije ultravisokih performansi (UPLC). Hipoksantin 2.23 ± 0.03
	Koncentracije Ado, Ino, HX i X detektovane su u ćelijskom medijumu 4, 8 ili 24 sata Ksantin 0.32 ± 0.03
	nakon skarifikacije ili 4 i 24 sata nakon tretmana DPM (5 µM) i DPCPX (1 µM).
	Rezultati su izraženi grafički, kao srednje vrednosti koncentracija dobijenih iz 3
	nezavisna eksperimenta sa 3 uzorka po grupi.	
	Na Slici 44, prikazani su reprezentativni hromatogrami dva standarda
	različitih koncentracija (S1 i S2) i kontrolnog uzorka (K 4h).
	4.2	
	ćelijskom medijumu kontrolnih uzoraka, 4 h nakon početka eksperimenta (zamene
	medijuma).	
	nakon skarifikacije ili korišćenih tretmana, rađena je FACS analiza GFAP
	pozitivnih astrocita. Kvantitativna analiza ekspresije HIF-1α prikazana je na Slici
	43. Ni skarifikacija ni tretman DPCPX nisu nije uticala na ekspresiju HIF-1α .

Međutim DPM tretman je povećao eskpresiju HIF-1α (36.52 ± 1.22, P< 0.01) u poređenju sa kontrolom (17.62 ± 2.23).Slika 42.Analiza genske ekspresije za A1 receptor 24 h nakon SW i Ado, DPM, DPCPX ili ATP tretmana .Ekspresija iRNK za A1 receptor je određena qRT-PCR analizom.Nivoi transkripata svake grupe su prikazani relativno u odnosu na nivo transkripta za ciklofilin-A, a potom normalizovane u odnosu na odgovarajuću vrednost kontrole.Rezultati prikazani stubićima su predstavljeni kao srednje vrednosti ± SEM iz tri nezavisna eksperimenta sa 3 uzorka po grupi.Nivo statističke značajnosti između grupa: *P < 0.05.4.2.U našim eksperimentalnim uslovima najkraće retenciono vreme imao je hipoksantin (1 min), zatim ksantin (1.3 min), inozin (1.4 min), i adenozin (2.1 min). Slika 44. Reprezentativni hromatogrami, dobijeni UPLC metodom uz upotrebu TUV detektora na talasnoj dužini 254 nm. Skraćenice: adenozin (Ado), inozin (Ino), ksantin (X), hipoksantin (HX), retenciono vreme (tr), apsorbanca na 254 nm (A254). Koncentracije standarda u medijumu: S1 -2 µM, S2 -0.5 µM. 
.8.1. Promene koncentracija adenozina u ćelijskom medijumu nakon skarifikacije ili tretmana

  
	Tabela 10. Koncentracije adeninskih nukleozida i njihovih
	metabolita u ćelijskom medijumu kontrolnih grupa, dobijene
	UPLC metodom. Hromatogrami su dobijeni merenjem apsorbancije
	na 254 nm tokom hromatografskog razdvajanja 4 μl
	deproteinizovanog uzorka. Koncentracije su odredjene iz jednačina
	standardnih krivih koje	su konstruisane	na osnovu
	vrednosti površina signala sa hromatograma komercijalnih
	standarda ispitivanih molekula. Rezultati u tabeli predstavljaju
	srednje vrednosti koncentracija (µM) iz 3 nezavisna
	eksperimenta,sa po 3 ili 4 kontrolna uzorka određenih u duplikatu.
	Slika 45 predstavlja prikaz promene koncentracije adenozina u ćelijskom
	medijumu 4, 8 i 24 sata nakon skarifikacije. Koncentracija adenozina se blago ali
	statistički značajno povećava 4 h nakon povrede (0.305 ± 0.015, P< 0.01) u odnosu
	na odgovarajuću kontrolu (0.21 ± 0.01), dok 8 h kasnije nisu uočene statistički
	značajne promene u koncentraciji. Dvostruko smanjenje koncentracije adenozina u
	ćelijskom medijumu posle SW povrede je primećeno 24 h kasnije (0.16 ± 0.02,
	P< 0.001) u odnosu na kontrolu (0.38 ± 0.03).	

Ektonukleotidaze u povredi mozga 4.1. Ekspresija e-5NT nakon povrede mozga in vivo i skarifikacije astrocita in vitro

  
	ukazuju da se oba transkripta, ENT1 i ENT2, eksprimiraju u kortikalnim astrocitima pacova, kako u in vivo [260], tako i u in vitro sistemima [66, 81, 245, 262]. Ova studija je, prema našem saznanju, prva koja je pokazala razlike u ekspresiji ENT1 i ENT2 nakon TPM. Naime, ekspresija oba ispitivana transportna proteina smanjuje se u datim vremenskim tačkama nakon ubodne lezije. Rezultati prisustvo oba transportera na astrocitima, ENT2 je zastupljeniji od dva testirana transportera, bar kada je reč o nivou iRNK. Nakon skarifikacije astrocitnog sloja, ekspresija transportera, kako na nivou iRNK, tako i na nivou proteina nije se bitno menjala tokom prva 24 sata. Opet saglasno našim rezultatima dobijenim in vivo, u kulturi astrocita dolazi do ushodne regulacije oba transportera u kasnijim receptora ili je povećanje transkripcije ENT vezano za Ado receptore, jer su oba tretmana uticala na povećanje transkripata za ENT1 i ENT2. Iako ne možemo da donesemo zaključke o funkciji na osnovu studije ekspresije in vivo i in vitro, prodiskutovaćemo moguće uloge astrocita u kruženju adenozina nakon TPM uzimajući u obzir naše i rezultate drugih grupa. ENT1/2 na reaktivnim astrocitima nakon povrede in vivo takođe idu u prilog ovoj hipotezi. Ipak, bilo bi neophodno ispitati aktivnost transportera direktnim testom, kako bi se potvrdila hipotetička uloga astrocitnih ENT nakon povrede. Kako bi smo utvrdili da li transport Ado preko ENT1/2 ima uticaja na njihovu ekspresiju, ispitali smo ekspresiju na nivou iRNK i proteina 4 i 24 h nakon reč o regulaciji aktivnosti ENT. Studija na hromafinskim ćelijama pokazala je da vezivanje NBTI uzrokuje brzu internalizaciju čak 60% transporternih molekula [268]. Druge studije na retikulocitima sisara pokazale su postojanje citosolnog depoa nukleozidnih transportera [269, 270]. Sem toga, pokazano je da inflamatorni citokini utiču na smanjenje ekspresije 4. e-5NT, lociran na ćelijskoj membrani, poslednji je u nizu ekto-enzima koji
	genske ekspresije delimično se poklapaju sa rezultatima proteinske ekspresije. vremenima nakon povrede, 24 i 48h nakon skarifikacije. Budući da ICC analiza nije Znajući da patološki stimulusi mogu da dovedu do povećanja koncentracije tretmana DPM. Sličan obrazac ekspresije onom nakon tretmana Ado za ENT1 i nekoliko transportera među kojima je i ENT1 [271, 272], ali nisu ispitivani razgrađuju ATP, katalizujući konverziju AMP do Ado. Brzina reakcije e-5NT
	Naime, dva dana nakon povrede zabeležen je značajan pad u zastupljenosti pokazala jasne promene u ekspresiji ovih transportera, urađena je FACS analiza vanćelijskog Ado do 100 puta, važno je otkriti tip ćelija koje su zaslužne za ovo. ENT2 je dobijen 4h nakon primene DPM -ENT1 se smanjio a ENT2 povećao, što je konkretni signalni putevi. manja je od brzine reakcije ostalih ektinukleotidaza, pa ovaj enzim određuje
	transkripta za ENT1 i ENT2, dok se sedam dana nakon povrede nivo transkripta za koja je pokazala da se ekspresija ENT1 i ENT2 nije menjala na proteinskom nivou. Odgovor na ovo pitanje je razmatran kroz različite eksperimentalne pristupe potvrđeno i na nivou proteina FACS analizom. S obzirom na to da je UPLC analiza S obzirom na to da je aktivnost transkripcionog faktora HIF-1α usko vezana ukupnu brzinu prevođenja ATP u adenozin. S obzirom na to da aktivnošću e-5NT
	ENT1 značajno povećava, dok nivo ENT2 transkripta odgovora kontroli. Za ovo S obzirom na to da analiza ekspresije ENT nije praćena u kasnijoj vremenskoj tački tokom protekle decenije, i smatra se da su za povećanje Ado najzaslužniji astrociti pokazala da u istoj vremenskoj tački nakon tretmana DPM nema promena u za hipoksične uslove, u nekoliko studija je ispitivano njegovo dejstvo na
	postoji nekoliko mogućih objašnjenja, kao što su post-transkripciona regulacioni (48h), ostaje mogućnost da i na nivou proteina dolazi do kasnije ushodne regulacije produkcijom Ado od ATP posredstvom e-5NT [53, 81, 105, 240, 245]. Jedno vreme vanćelijskim koncentracijama Ado, ova promena se ne može pripisati Ado. transkripciju ENT. Revijski članak autora Vangeison i Rempe [273] sažima mali
	procesi koji obuhvataju stabilnost proteina, zatim iRNK stabilnost ili početak ENT. vladalo je mišljenje da se Ado akumuliran tokom hipoksije otpušta u vanćelijsku Međutim, mogle bi se pripisati Ino koji nakon tretmana DPM raste a ranije je broj broj objavljenih istraživanja o uticaju HIF-1α na ekspresiju komponenti
	translacije [263]. Bez obzira na poreklo adenozina, neminovno je da sa narušavanjem sredinu posredstvom ENT, međutim, ovaj koncept je doveden u pitanje nakon pokazano da Ino može delovati na adenozinske receptore [94, 108, 109]. adenozinskog sistema. HIF-1α učestvuje u regulaciji različitih proteina, uključujući
	Osim kvantitativnih promena ekspresije ENT, još jedan zanimljiv aspekt homeostaze, njegova vanćelijska koncentracija višestruko raste. Zbog toga smo rezultata Frenguelli-eve grupe [238] koja je pokazala da se nivo vanćelijskog Ado Dvadesetčetiri sata kasnije DPM nije imao nikakvog uticaja na ekspresiju ENT1/2 i negativnu regulaciju ekspresije ENT1 u ćelijama endotela [274]. Sem toga, HIF-
	naših rezultata odnosi se na promenu ćelijske distribucije ENT, posebno ENT2 hteli da ispitamo kakav uticaj ostvaruje sam Ado na ekspresiju ENT u kulturi povećava tokom hipoksije nakon blokiranja transportne aktivnosti ENT. niti na iRNK niti na proteinskom nivou. 1α-zavisna represija ENT2 je potvrđena u mukozi creva, što bi moglo da vodi
	nakon povrede. Imunohistohemijska analiza je pokazala da ubodna lezija vodi ka astrocita. U kulturi astrocita tretiranih Ado do smanjenja ekspresije ENT1 i Ipak, putevi kojima se Ado uklanja iz vanćelijskog prostora nisu dovoljno Budući da su prethodno navedeni rezultati ukazali na mogućnost regulacije povećanju vanćelijskog Ado i smanjenju hipoksijom izazvane inflamacije [275].
	značajnom gubitku imunoreaktivnosti oba transportera u neuronima periledirane povećanja ekspresije ENT2 je došlo već 4 sata nakon tretmana, dok su nakon 24 proučeni. Rezultati skorašnjih studija aktivnosti adenozin kinaze (AK) u epilepsiji ekspresije ENT preko adenozinskih receptora, ispitana je ekspresija ENT nakon Rezultati FACS analize za HIF-1α prikazani u ovoj studiji su pokazali da se
	kore, u obe vremenske tačke. Ovo je u skladu sa rezultatima dobijenim imunoblot sata oba transportera bila ushodno regulisana na nivou iRNK. Imajući u vidu sugerišu da se astrociti ponašaju kao "odvod" adenozina u procesu astroglioze. tretmana DPCPX, koji blokira najzastupljeniji adenozinski receptor -A1 receptor. ekspresija ovog transkripcionog faktora ne menja 4 sata nakon skarifikacije ili
	analizom proteinske ekspresije. Ipak, ushodna regulacija oba transportera je rezultate in vivo studije, može se zaključiti da dolazi do povećanja ekspresije ENT AK hipoteza epiletogeneze predlaže da se vanćelijski nivo Ado povećava nakon Ovaj tretman doveo je do značajnog smanjenja ekspresija iRNK za ENT1 i DPCPX tretmana. Međutim, DPM tretman značajno povećava ekspresiju HIF-1α.
	zabeležena kod reaktivnih astrocita koji okružuju mesto povrede. Ovo je daleko na astrocitima nakon povrede. Tretiranje astrocita sa ATP takođe utiče na ma kog tipa povrede mozga, što dovodi do astroglioze, što za uzvrat ima povećanja ekspresija ENT2 na nivou proteina. Uzevši u obzir prethodno pomenuto povećanje Ino detektovano UPLC analizom u
	. U izraženije u slučaju ENT2, gde se ekspresija na astrocitima dodatno pojačava ekspresiju ENT i to tako što dovodi do povećanja ekspresije oba transprotera na prekomernu ekspresiju astrocitne AK i pojačane aktivnosti ovog enzima, čime se Tretmani Ado, DPM i DPCPX najverovatnije utiču na signalizaciju ćelijskom medijumu nakon istog tretmana, moglo bi se zaključiti da upravo Ino
	našim uslovima, analiza genske ekspresije ukazala je da je ENT2 zastupljeniji od sedmog dana nakon povrede. Zanimljivo je da je sličan obrazac ekspresije pokazan nivou njihovih iRNK. Ovakav nalaz saglasan je rezultatima kinetičke analize smanjuje unutarćelijska koncentracija Ado. Ovo za posledicu ima unos Ado iz posredovanu adenozinskim receptorima, na šta ukazuje činjenica da izazivaju učestvuje u regulaciji HIF-1α. Ovaj nalaz je u skladu sa prethodno objavljenim
	ENT1, na nivou zastupljenosti njihovih iRNK, što je potvrđeno i IHC analizom, a i za e-5NT [171], što dodatno upućuje na zaključak da su astrociti suštinski vezivanja [ 3 H]NBTI za membranu hromafinskih ćelija nakon ATP tretmana. vanćelijske sredine, najverovatnije putem ENT, i srazmerno smanjenje nivoa Ado u slične promene u ekspresiji ENT1 i ENT2. Takođe, rezultati ukazuju i na moguće rezultatima na PC12 ćelijama, gde je pokazano da tretman Ino nakon hipoksije
	saglasno je i sa rezultatima iz literature [260, 261] [105]. uključeni u regulaciju metabolizma Ado nakon povrede mozga. Pokazano je da je tretman ATP značajno povećao broj NBTI vezujućih mesta, ne vanćelijskom prostoru [195, 205, 265, 266]. Stoga bi u budućnosti bilo interesantno odvojene puteve koji regulišu ekspresiju ENT1 i ENT2. značajno povećava sadržaj HIF-1α na nivou proteina [276].
	Kada je reč o prisustvu i ekspresiji ENT na kortikalnim astrocitima u Treba konačno, napomenuti da je ovom studijom praćen i mogući efekat menjajući konstantu disocijacije Kd [264]. S obzirom na to da su slični rezultati istražiti ekspresiju AK u modelima povrede mozga i skarifikacije astrocita, i ispitati Naše razumevanje mehanizama koji regulišu ekspresiju ENT relativno je
	fiziološkim uslovima, naša IHC analiza preseka intaktnog mozga ukazuju na anestetika primenjenog tokom hirurške intervencije, koji međutim, bar kada je reč dobijeni i sa ATP analogom, diadenozin tetrafosfatom, koji ne podleže hidrolizi u kojoj meri aktivnost ENT utiče na funkciju ovog enzima. oskudno u poređenju sa znanjem koje posedujemo o njihovoj strukturi i kinetici
	sporadično prisustvo i oskudnu ekspresiju kako ENT1, tako i ENT2 na astrocitima o promeni ekspresije ENT, nije ostvarivao efekat. ektonukleotidazama, autori su zaključili da ATP preko svojih receptora, deluje Takođe, naši UPLC rezultati su u skladu sa adenozin kinaznom hipotezom transporta [267]. Dosadašnji podaci ukazuju na to da je ekspresija nukleozidnih
	kore prednjeg mozga. Slični literaturni podaci o ekspresiji ENT na astrocitima Kada je reč o ekspresiji ENT na izolovanim astrocitima u kulturi, naši modulatorno na ENT. Ipak ostaje otvoreno pitanje da li ATP deluje preko svojih s obzirom na pad Ado 24h nakon povrede koji se podudara sa povećanom transportera tkivno i ćelijski specifična, te da zavisi i od fiziološkog stanja
	rezultati odgovaraju rezultatima in vivo studije. Iako je FACS analiza potvrdila ekspresijom ENT1/2 na nivou iRNK. Pored toga, izraženo povećanje ekspresije organizma. Nishodna regulacija i recikliranje su najbolje opisani fenomeni kada je



  2. U modelu skarifikacije astrocitnog jednosloja uočeno je da mehanička povreda dovodi do: a. Povećanja ekspresije ENT1 i ENT2, 24 sata nakon skarifikacije. b. Bifazne promene ekspresije e-5NT, u vidu smanjenja ekspresije neposredno nakon povrede i znatne ushodne regulacije 24 časa nakon skarifikacije. c. Nepromenjene ekspresije A1 receptora. 3. Tretmani Ado, ATP, DPM ili DPCPX astrocitnog jednosloja uticali su na ekspresiju ispitivanih komponenti adenozinskog sistema na sledeći način: a. Ado, DPM i DPCPX, nakon četiri sata smanjuju ekspresiju iRNK za ENT1, dok je samo je tretman DPM imao isti efekat i na nivou ENT1 proteina. Tretman Ado i ATP nakon 24 sata značajno povećavaju ekspresiju ENT1. b. Četiri sata nakon tretmana Ado i DPM, ekspresija iRNK za ENT2 se značajno povećala, dok su četvoročasovni tretmani DPM i DPCPX uticali na povećanje ekspresije ENT2 na nivou proteina. Ado i ATP ushodno regulišu ENT2 transkript 24 sata nakon tretmana. c. Tretmani Ado i DPCPX su povećali količinu transkripta za e-5NT u obe ispitivane vremenske tačke, dok je tretman DPM imao isti efekat samo 4 sata nakon povrede. Suprotni efekti se uočavaju na nivou proteina: povećanje ekspresije pod četvoročasovnim tretmanom DPM i DPCPX, i smanjenje 24 sata kasnije. d. Četiri sata nakon blokiranja ENT1/2, povećava se ekspresija transkripcionog faktora HIF-1α. e. iRNK za A1 receptor se smanjuje pod dejstvom ATP tretmana. 4. Skarifikacija ili tretmani su na sledeći način uticali na koncentracije Ado, Ino, HX i X u ćelijskom medijumu: a. Skarifikacija astrocitnog jednosloja povećava koncentracije Ado u ćelijskom medijumu 4 sata nakon povrede, dok se smanjenje detektuje se 24 sata kasnije. Samo je blokiranje A1 receptora uticalo na smanjenje Ado nakon 24 sata. Takođe, blokiranje ENT1/2 u kombinaciji sa skarifikacijom je uticalo na smanjenje koncentracije Ado nakon 4 h. b. U svim ispitivanim vremenima, skarifikacija uz blokiranje A1 receptora dovodi do smanjenja koncentracija Ino. Blokiranje transporta putem ENT1/2 povećava, a u kombinaciji sa skarifikacijom smanjuje vanćelijske koncentracije Ino nakon 4 sata. c. Zabeležen je pad u koncentraciji HX 8 sati nakon skarifikacije. DPM je takođe smanjio koncentracije HX nakon 24h, kao i nakon 4 sata u kombinaciji sa skarifikacijom. d. Koncentracije X su se smanjila 8 i 24 sata nakon skarifikacije. Blokiranje ENT1/2 i A1 receptora je imalo sličan učinak nakon 4 sata, dok ostali tretmani nisu uticali na koncentracije X. 5. Hemijski izazvana hipoksija nakon četvoročasovnog CoCl2 tretmana astrocita dovodi do: a. Povećanja nivoa proteina za ENT2, e-5NT i HIF-1α. b. Povećanja koncentracija Ado i X u ćelijskom medijumu, dok su koncentracije Ino i HX ostale nepromenjene. Na osnovu izloženih rezultata i izvedenih zaključaka može se izvesti generalni zaključak: Traumatska povreda mozga uzrokuje promene u ekspresiji i ćelijskoj distribuciji ENT, promene u ekspresiji ispitivanih ektonukleotidaza i A1 receptora. Veliki broj ovih događaja se dešava u astrocitima, čineći ih važnim u orkestraciji komponenti adenozinskog sistema nakon povrede i samim tim ćelijama koje u velikoj meri određuju dostupnost adenozina. Astrociti regulišu koncentracije adenozina dvojako, što verovatno zavisi od toka reaktivne astroglioze i samim tim promena u ekspresiji komponenti adenozinskog sistema, kao što su ENT i ektonukleotidaze. Neposredno nakon povrede koncentracije adenozina se povećavaju, verovatno kao posledica neposredne mehaničke ozlede ćelija i aktivnosti ektonukleotidaza. U kasnijim vremenima reaktivni astrociti pre služe kao odvod adenozina, najverovatnije putem ENT, smanjujući njegovu dostupnost u vanćelijskom miljeu i negativno utičići na oporavak. Ana Parabucki je rođena 13.02.1984. godine u Podgorici, Crna Gora, gde je završila osnovnu i tri razreda srednje škole. Maturirala je u Las Vegasu, Amerika. Biološki fakultet Univerziteta u Beogradu je upisala 2002. godine, a završila 2008. godine na studijskoj grupi Biologija sa opštim uspehom 9,26 u toku studija i ocenom 10 na diplomskom ispitu. Doktorske studije upisala je 2008. godine na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu, u okviru modula Biologija, i uže naučne oblasti Neuronauke. Od 2008-2011 godine je bila stipendista Ministarstva nauke i tehnološkog razvoja, a od 2011-2013 zaposlena na Odeljenju za Neurobiologiju, u Laboratoriji za neurohemiju Instituta za biološka istraživanja "Siniša Stanković". Od jula 2013., nalazi se na postdoktorskoj poziciji u laboratoriji dr Romana Shustermana, na Univerzitetu u Haifi, Izrael. 


	BIOGRAFIJA AUTORA
	Imajući u vidu neuroprotektivne uloge adenozina u patološkim uslovima, kao i
	činjenicu da od aktivnosti svih ovih komponenti zavisi njegova dostupnost u
	vanćelijskom prostoru, jasno je da ovi rezultati mogu pružiti korisne informacije o
	potencijalnim farmaceutskim metama budućih tretmana traumatske povrede
	mozga.



  Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценцеКреативнезаједнице(CreativeCommons)закојусамсеодлучио/ла.Ауторство -некомерцијално.Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце.Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребудела.3.Ауторствонекомерцијално -без прераде.Дозвољавате умножавање, дистрибуцијуијавносаопштавањедела,безпромена,преобликовањаилиупотребе делаусвомделу,акосенаведеимеауторананачинодређенодстранеаутораили даваоцалиценце.Овалиценцанедозвољавакомерцијалнуупотребудела.Уодносу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћењадела.4.Ауторствонекомерцијално -делити под истим условима.Дозвољавате умножавање,дистрибуцијуијавносаопштавањедела,ипрераде,акосенаведеиме аутора на начин одређен од странеаутора или даваоцалиценцеи ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом.Ова лиценца не дозвољава комерцијалнуупотребуделаипрерада.5. Ауторство -без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, акосенаведеимеауторананачинодређенодстранеаутораилидаваоцалиценце. 


	Прилог 2. Прилог 3. 1. Ауторство-Дозвољаватеумножавање,дистрибуцијуијавносаопштавањедела,и
	прераде,акосенаведеимеауторананачинодређенодстранеаутораилидаваоца
	Изјава о коришћењу лиценце,чакиукомерцијалнесврхе.Овојенајслободнијаодсвихлиценци.
	-a број уписа да је докторска дисертација под насловом АнаПарабуцки Б1205/2008 Изјављујем Активносткомпонентиаденозинскогсигналногсистемаастроцита умоделу можданеповредеin vivo иin vitro  резултатсопственогистраживачкограда,  дапредложенадисертацијауцелининиуделовиманијебилапредложеназа добијањебилокоједипломепремастудијскимпрограмимадругих високошколскихустанова,  дасурезултатикоректнонаведении  данисамкршио/лаауторскаправаикористиоинтелектуалнусвојинудругих лица. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Имеипрезимеаутора АнаПарабуцки Бројуписа Б1205/2008 Студијскипрограм биологија Насловрада Активносткомпонентиаденозинскогсигналногсистемаастроцита у моделуможданеповредеin vivo иin vitro Ментор дрИванаБјелобаба ипроф НадеждаНедељковић______________ Потписани____________АнаПарабуцки__________________________________ изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској Овлашћујем Универзитетску библиотеку "Светозар Марковић" да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: Активносткомпонентиаденозинскогсигналногсистемаастроцита умоделумождане повредеin vivo иin vitro којајемојеауторскодело. Дисертацијусасвимприлозимапредао/ласамуелектронскомформатупогодномза трајноархивирање. 1.Ауторство 2.Ауторство-некомерцијално 3.Ауторство-некомерцијално-безпрераде 2. Овалиценцадозвољавакомерцијалнуупотребудела.
	верзијикојусампредао/лазаобјављивањенапорталуДигиталног репозиторијума 4. Ауторство-некомерцијално-делитиподистимусловима 6. Ауторство-делитиподистимусловима.Дозвољаватеумножавање,дистрибуцију Универзитета у Београду. ијавносаопштавањедела,ипрераде,акосенаведеимеауторананачинодређен Потпис докторанда 5.Ауторство-безпрераде одстранеаутораилидаваоцалиценцеиакосепрерададистрибуираподистомили Дозвољавамдасеобјавемоји личниподацивезанизадобијањеакадемскогзвања докторанаука,каоштосуимеипрезиме,годинаиместорођењаидатумодбране рада. сличномлиценцом.Овалиценцадозвољавакомерцијалнуупотребуделаипрерада. 6.Ауторство-делитиподистимусловима Сличнајесофтверскимлиценцама,односнолиценцамаотвореногкода.
	(Молимодазаокружитесамоједнуодшестпонуђенихлиценци,кратакопислиценци
	Овиличниподацимогусеобјавитинамрежнимстраницамадигиталнебиблиотеке,у датјенаполеђинилиста).
	УБеограду,_________________ електронскомкаталогуиупубликацијамаУниверзитетауБеограду. _________________________
		Потпис докторанда
		Потпис докторанда
	УБеограду,________________________________________________
	УБеограду,_____________________	________________________

skarifikacije (Slika 26E-H, M-P). U isto vreme, nisu primećene razlike u intezitetu imunofluorescence za brevikan (Slika 26U-X). 


Dva dana nakon povrede uočava se značajno smanjenje ENT1 imunoreaktivnosti i ovaj transporter se moze uočiti na neuronima tek sporadično (Slika 10G-I, strelice). Sedam dana nakon povrede, pored retkih ENT1imunopozitivnih neurona, uočavaju se ćelije koje ispoljavaju ENT1 i morfološki odgovaraju astrocitima. 
Promene u koncentraciji adenozina u ćelijskom medijumu praćene su i 4 i 24 sata nakon DPM ili DPCPX tretmana (Slika 46). Značajna promena koncentracije adenozina u vidu dvostrukog smanjenja (0.21 ± 0.05, P< 0.01) je zabeležena samo 24 h nakon DPCPX tretmana u poređenju sa odgovarajućom kontrolom (0.38 ± 0.03). 

Slika 45. Promene koncentracije Ado u ćelijskom medijumu u različitim vremenskim intervalima nakon skarifikacije astrocita.

Beli stubići predstvaljaju srednje vrednosti koncentracije Ado u kontrolnim grupama, a sivi stubići predstavljaju srednje vrednosti Ado grupa koje su izložene skarifikaciji. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti koncentracija ± SEM (µM) iz 3 nezavisna UPLC eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: **P < 0.01; # P < 0.001. 

Uticaj hemijski izazvane hipoksije kobalt-hloridom (CoCl2) na aktivnosti komponenti adenozinskog signalnog sistema

Kako bi se uporedili efekti mehaničke i hipoksične povrede astrocita in vitro u smislu aktivnosti komponenti adenozinskog signalnog sistema, osmišljena je Slika 54. Uticaj DPM na vanćelijske koncentracije Ado i njegovih metabolita, 24h nakon skarifikacije. Srednje vrednosti koncentracija Ado, Ino, Hx i X, su prikazane belim stubićima u kontrolnim grupama (K), svetlosivim u grupama podvrgnutim skarifikaciji (SW), tamnosivim u DPM tretiranim grupama (K+DPM), a crni stubići prikazuju srednje vrednosti grupa nakon skarifikacije i DPM tretmana (SW+DPM). Poređenje grupa je vršeno u odnosu na kontrolu. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti ± SEM (µM) iz 2 nezavisna UPLC eksperimenta sa 3 uzorka po grupi. Nivo statističke značajnosti između grupa: *P < 0.05; **P < 0.01.