Immune mechanisms of induction and expression of contact hypersensitivity reaction in rats

Keywords: Contact hypersensitivity reaction, DNCB, Sensitization phase, Elicitation phase, DA and AO rats, Draining lymph nodes, Ear skin organ culture. Research area: Biology Major: Immunobiology

Allergic contact dermatitis (ACD) is a common skin inflammatory disease in humans, affecting 15-20% of the general population. Large number of chemical agents that induce ACD (called haptens), together with lack of adequate conventional immunosuppressive therapy, make this disease a major challenge for public health and modern immunology. Pathophysiology of ACD is studied on animal models referred as contact hypersensitivity. Although the reaction of contact hypersensitivity (CHS) has been much studied, mostly in mice, the knowledge of its mechanisms is still far from complete. In addition, there is paucity of data about CHS in other experimental animals, beside mice, which might increase our understanding of the immunobiology of contact allergy. In light of this, in the present study the characteristics of CHS were analyzed in rats, using two strains, Dark Agouti (DA) i Albino Oxford (AO), which have been shown to differ in reactivity to certain inflammatory stimuli. CHS to hapten dinitrochlorobenzene (DNCB) was induced by applying two different hapten concentrations in sensitization and elicitation phases (sensitization/elicitation regime 0.4%/0.13% and 4%/1.3% DNCB). Mechanisms of CHS were studied in induction (sensitization) and expression (elicitation) phases, by evaluating dynamics in activity changes of draining lymph node (dLN) cells in sensitization phase and by evaluating production of inflammatory/anti-inflammatory mediators in conditioned medium of ear skin organ culture and activity changes of dLN cells in elicitation phase (24 hours after elicitation). The results showed increased in vivo (ear thickness) and ex vivo (patohistology analysis of ear skin) parameters of CHS reaction, in both rat strains following the treatment with high DNCB dose, but the reaction was more intensive in DA compared to AO rats. In sensitization phase it was showed: increased dLN cell number in both strains (higher in DA rats), changes in ratio of CD4 + and CD8 + subsets (increased ratio of CD4 + /CD8 + cells in DA rats, because of increased relative number of CD4 + and decreased relative number of CD8 + cells and decreased CD4 + /CD8 + ratio in AO rats, because of decreased relative number of CD4 + cells and increased CD8 + cells relative number), increased ex vivo proliferation of dLN cells and increased spontaneous and specific (induced by in vitro cell stimulation with hapten) production of inflammatory cytokines IFN-γ and IL-17 and Th2/anti-inflammatory cytokine IL-10 (more pronounced in DA rats). Similarly to DA rats, no changes in production and expression of Th2/anti-inflammatory cytokine IL-4 were noted in AO rats in sensitization phase. Increased ear thickness in elicitation phase was accompanied by increased production of TNF-α, NO, MPO, IFN-γ and IL-17 in conditioned medium of ear skin organ culture. Strain-dependent differences in CHS expression were related to differences in intensity (higher NO, MPO, IFN-γ, IL-17 in DA strain) and type of immune response (increased production of IL-4 only in AO rats). In addition, in this phase of the reaction it was showed the increase in dLN activity in DNCB-treated DA rats (increased spontaneous and specific proliferation, concomitantly with increased expression of growth factor IL-2 receptor α chain, as well as production of effector cytokines IFN-γ and IL-17, and gene expression of p35, p40 and T-bet, which are indicators of differentiation of Th1/type1 cells), compared to controls. The absence of changes in the activity of effector mechanisms in dLN of AO strain is accompanied by increased production of IL-4 and increased numbers of CD4 + CD25 + Foxp3 + cells, that phenotypically correspond to regulatory T cells (Treg). CHS to DNCB in rats (similarly to mouse model) is characterized by activation of Th1/type1 and Th17/type17 immune response, and differences in response intensity (in induction and expression phase) and response type (in expression phase) could be underlying mechanism of strain-dependent difference. Comparative analysis of CHS in more reactive (DA) and less reactive (AO) strains, can contribute to the further knowledge of the immunological mechanisms underlying the development and expression, as well as regulation of this reaction. Such findings might be useful in exploring the potential of therapeutic modalities to reduce skin damage caused by contact allergy, as well as in the elucidation of immunomodulatory potential of different chemicals, particularly those that gain access to the host system via skin. 

MENTORI:


Mojim dragim mami, tati, bratu Zoranu i suprugu Andriji

Eksperimentalni deo doktorske disertacije urađen je na Institutu za Biološka istraživanja "Siniša Stanković", Univerziteta u Beogradu, pod rukovodstvom Prof. Dr Milene Kataranovski. Dr Mileni Kataranovski dugujem ogromnu zahvalnost na stručnoj pomoći, velikoj podršci, poverenju, ali i konstruktivnim kritikama, koje mi je ukazivala u toku mog rada. Eksperimentalni i teorijski deo doktorske disertacije rezultat su ideje, znanja i iskustva koje mi je nesebično prenela prof. Kataranovski. Posebnu zahvalnost joj dugujem za korisne savete i podsticaj u toku pisanja disertacije. 
Zahvaljujem se Dr Ivani Mirkov, koja mi je od samog početka pružala veliku pomoć u sticanju iskustva u istraživačkom radu, i koja je često rame uz rame sa mnom odgovarala izazovima eksperimentalnog dela ove teze. Posebno joj se zahvaljujem na stručnoj pomoći, korisnim sugestijama i strpljenju koje mi je pružila u toku izrade disertacije. 
Dr Ljiljani Medenici i Dr Dragani Vučević zahvaljujem se na uloženom vremenu, stručnim savetima i sugestijama. 
Dr Draganu Kataranovski zahvaljujem se na stručnoj pomoći i podršci u toku mog istraživačkog rada. 
Jeleni Đokić i Marini Ninkov se zahvaljujem na nesebičnoj pomoći u eksperimentalnom radu i izradi disertacije, ali najviše im se zahvaljujem što svojom vedrinom, razumevanjem i iskrenošću, svakodnevnicu čine lepšom i lakšom. Takođe, zahvaljujem se Sandri Belij-Rammerstorfer i Tamari Saksidi na prijateljstvu, kao i na stručnim savetima i sugestijama kada god je to bilo potrebno. Njihova podrška u profesionalnim, ali i privatnim, usponima i padovima mi mnogo znači. 
Veliku zahvalnost dugujem Dr Đorđu Miljković, koji je omogućio analizu na protočnom citofluorimetru, ali koji mi je i svojim stručnim i nesebičnim savetima pomogao mnogo puta; Mr Lidiji Zolotarevski, na patohistološkoj analizi tkiva uha; Dr Sasi Vasilijić, na tehničkoj pomoći pri testu proliferativne aktivnosti; Sandri Belij-Rammerstorfer za pomoć u pojedinim fazama eksperimentalnog rada; Veljku Blagojević za pomoć pri tehničkoj izradi disertacije, i svim ostalim kolegama koje su učestvovale u ekperimentalnom delu disertacije. Zahvaljujem se i suprugu Andriji na uloženom vremenu, velikom trudu i strpljenju u toku tehničke obrade disertacije. 

Najveću zahvalnost i poštovanje dugujem svojoj porodici i bliskim prijateljima, za pruženu nesebičnu ljubav, podršku i razumevanje. Bez njih bi sve bilo mnogo teže.

Imunski mehanizmi indukcije i ekspresije reakcije kontaktne preosetljivosti kod pacova SAŽETAK Alergijski kontaktni dermatitis (AKD) je česta zapaljenska bolest kože kod ljudi, koja pogađa 15-20% svetske populacije. Velika zastupljenost hemijskih agenasa (haptena) koji izazivaju AKD, uz odsustvo adekvatne konvencionalne imunosupresivne terapije, čine ovu bolest velikim izazovom za javno zdravlje, i savremenu imunologiju. Razvoj životinjskog modela AKD, reakcije kontaktne preosetljivosti, omogućio je napredak u razumevanju njene patogeneze. Iako je reakcija kontaktne preosetljivosti (KP) dosta ispitivana, pretežno na mišjem modelu, mehanizmi u osnovi razvoja bolesti nisu dovoljno poznati. Takođe, mali je broj podataka o reakciji KP kod drugih eksperimentalnih životinja, osim miševa, koji bi mogli da unaprede znanje o imunobiologiji kontaktnih alergija. U svetlu toga, u ovom radu su ispitane karakteristike reakcije KP kod pacova, korišćenjem dva soja pacova, Dark Agouti (DA) i Albino Oxford (AO), za koje je pokazano da se razlikuju u reaktivnosti na pojedine zapaljenske stimuluse. Indukcija (senzibilizacija) i izazivanje (elicitacija) reakcije KP vršene su sa haptenom dinitrohlorobenzenom (DNCB), koji je primenjen u dve različite koncentracije (režim senzibilizacije/elicitacije 0.4%/0.13% i 4%/1.3% DNCB). 
Mehanizmi KP kod pacova ispitani su u fazi senzibilizacije i elicitacije reakcije, praćenjem dinamike promena aktivnosti ćelija drenirajućih limfnih čvorova (dLČ) u fazi senzibilizacije, i ispitivanjem produkcije inflamatornih/ anti-inflamatornih medijatora u kondicioniranom medijumu organokulture uha, i promena aktivnosti ćelija dLČ u fazi elicitacije reakcije (24 časa nakon elicitacije). Rezultati su pokazali povećanje in vivo (otok uha) i ex vivo (patohistološka analiza isečaka kože uha) parametara reakcije KP kod oba soja pacova nakon tretmana sa višom dozom haptena, ali je reakcija bila intenzivnija kod DA u odnosu AO soj. Nakon senzibilizacije dolazi do: povećanja broja ćelija u dLČ kod oba soja (izraženije kod DA jedinki), promene zastupljenosti CD4 + i CD8 + ćelija i njihovog odnosa (povećanja odnosa CD4 + /CD8 + ćelija kod DA soja, zbog povećanja zastupljenosti CD4 + ćelija a pada zastupljenosti CD8 + ćelija, i smanjenja odnosa CD4 + /CD8 + kod AO soja, zbog pada zastupljenosti CD4 + ćelija a povećanja CD8 + ćelija), povećanja ex vivo proliferacije izolovanih ćelija i povećanja spontane i specifične (nakon in vitro stimulacije ćelija sa haptenom) produkcije inflamatornih citokina IFN-γ i IL-17, i Th2/anti-inflamatornog citokina IL-10 (izraženije kod DA soja). U ovoj fazi reakcije kod oba soja nije zapažena promena u produkciji i ekspresiji Th2/anti-inflamatornog citokina IL-4. U fazi ekspresije (elicitacije) reakcije pokazano je da je povećanje otoka uha praćeno povećanjem produkcije TNF-α, NO, MPO, IFN-γ i IL-17 u kondicioniranom medijumu organokulture eksplanata kože uha, kao i da su razlike u ekspresiji reakcije između dva soja praćene razlikama u intenzitetu promena (veća koncentracija NO, MPO, IFN-γ, IL-17 kod DA soja) i tipu imunskog odgovora (povećana produkcija IL-4 samo kod AO soja). U ovoj fazi reakcije pokazano je povećanje aktivnosti ćelija dLČ (spontane i specifične proliferacije, uz povećanje ekspresije inducibilnog α lanca receptora za faktor rasta IL-2, kao i produkcije efektorskih citokina IFN-γ i IL-17, i ekspresije gena za p35, p40 i T-bet, koji su pokazatelji diferencijacije Th1/tip1 ćelija) kod DA soja nakon tretmana sa DNCB-om, u odnosu na kontrole. Odsustvo promena u aktivnosti efektorskih mehanizama u dLČ kod jedinki AO soja je praćeno povećanom produkcijom IL-4, i povećanim brojem CD4 + CD25 + Foxp3 + ćelija, koje fenotipski odgovaraju regulatornim T ćelijama (Treg). 
Reakcija KP na DNCB kod pacova (slično mišjem modelu) karakteriše se aktivacijom Th1/tip1 i Th17/tip imunskog odgovora, a razlike u intenzitetu odgovora (u fazi senzibilizacije i elicitacije) ili tipu odgovora (u fazi elicitacije), mogu biti u osnovi zabeleženih međusojnih razlika u intenzitetu ekspresije reakcije. Komparativno ispitivanje kontaktne preosetljivosti kod reaktivnijeg DA soja i manje reaktivnog AO soja, može doprineti saznanjima o imunskim mehanizmima koji su u osnovi razvoja i ekspresije, kao i regulacije ove reakcije. Ovakva saznanja mogu dati dobru osnovu za razvoj novih terapeutskih modaliteta u lečenju alergijskog kontaktnog dermatitisa, ali i osnovu za ispitivanje imunotoksičnog potencijala hemijskih agenasa, posebno onih koji dospevaju u organizam preko kože. Priprema ćelija drenirajućih limfnih čvorova 3.5.2. Testovi proliferacije ćelija drenirajućeg limfnog čvora 3.5.3. Određivanje metaboličke vijabilnosti ćelija drenirajućeg limfnog čvora pomoću MTT testa 3.5.4. Analiza zastupljenosti ćelijskih populacija na protočnom citofluorimetru 3.5.5. Produkcija citokina od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora 3.5.6. Reakcija lančanog umnožavanja u realnom vremenu 3.6. Ispitivanje produkcije medijatora inflamacije u kondicioniranom medijumu organokulture uha 3. 6 

UVOD

U svakodnevnom životu organizam je u kontaktu sa raznim stranim prirodnim i sintetičkim hemijskim agensima, koji se nazivaju ksenobiotici. Udisanje, oralno unošenje ili kontakt kože sa ovim agensima najčešće je bez posledica, međutim pojedine hemikalije mogu imati imunotoksičan efekat, tj. mogu dovesti do prekomerne ili neadekvatne aktivacije, ili supresije funkcije imunskog sistema. Kontaktni dermatitis (KD) je jedna od najzastupljenijih manifestacija imunotoksičnosti ksenobiotika kod ljudi. To je česta zapaljenska bolest kože, koja se javlja na mestu kontakta kože sa neproteinskim hemikalijama (Nosbaum i drugi, 2009). KD se može klasifikovati na iritantni (IKD) i alergijski kontaktni dermatitis (AKD) koji se, iako imaju sličnu kliničku i histološku manifestiju, mogu razlikovati na osnovu prisustva (AKD) ili odsustva (IKD) antigen-specifičnih T ćelija u kožnim ekcematoznim lezijama (Nosbaum i drugi, 2009). IKD je nespecifična zapaljenska dermatoza, koju izazivaju hemijski agensi toksični za ćelije kože, kao što su kiseline, bazni agensi i lekovi, sposobni da aktiviraju mehanizme (nespecifičnog) urođenog imunskog sistema. AKD je sa druge strane reakcija preosetljivosti tipa IV (kasni tip preosetljivosti), koja je posredovana T ćelijama i zavisi od njihove aktivnosti. Do sada je identifikovano više hiljada različitih supstanci, prisutnih u prirodi, koje mogu da izazovu AKD. Neke od njih su metali (nikl, hrom, kobalt, zlato, platina, berilijum), topikalni antibiotici (npr neomicin), konzervansi (formaldehid, paraben), jedinjenja koja se koriste u proizvodnji lateks rukavica, jedinjenja iz biljaka (hrizantema, tulipani, otrovni bršljen) (Chipinda i drugi, 2011; Saint-Mezard i drugi, 2004a). 

Alergijski kontaktni dermatitis

Za razvoj AKD neophodne su dve faze: senzibilizacija (aferentna faza ili faza indukcije) i elicitacija (eferentna faza ili faza ekspresije). Do indukcijе bolesti dolazi nakon kontakta kože sa količinom alergena dovoljnom da izazove senzibilizaciju. Ako se koža senzibilisane osobe ponovo izloži delovanju istog alergena dolazi do razvoja zapaljenske reakcije koju karakterišu eritem (crvenilo) i edem (otok), praćeni pojavom papula, vezikula, kraste i svraba, na mestu kontakta kože sa kontaktnim alergenom (Kimber i drugi, 2002; Petkovic, 2011) (Slika 1.). 

Slika 1. Klinički aspekt alergijskog kontaktnog dermatitisa

Ovo kompleksno oboljenje kože predstavlja veliki izazov za javno zdravlje i imunologе. Procenjeno je da 15-20% svetske populacije pati od kontaktnih alergija, sa prevalencom koja raste širom sveta. Procenjuje se da u Evropi 20% populacije pati od kontaktnih alergija na najmanje jedan alergen, sa niklom, parfemima i konzervansima kao najčešćim uzročnicima. Bolest se javlja dva puta češće kod žena nego kod muškaraca, i češće se javlja u ranijem životnom dobu, sa prevalencom od 15% kod dece starosti između 12-16 godina (Peiser i drugi, 2013). Faktori rizika kod kontaktnih alergija su: inherentni senzibilišući potencijal haptena, visoka koncentracija haptena tj. doza po jedinici površine, visoka frekvenca izloženosti, okluzija, dug period izloženosti haptenu, promenjena funkcija kožne barijere (Peiser i drugi, 2013). Iako pojedina istraživanja ukazuju na značaj genetike u razvoju AKD, ne postoji jasan stav o ulozi ovih endogenih faktora individualne osetljivosti kod AKD (Schnuch i Carlsen, 2011). 
Jedina dostupna etiološka terapija AKD podrazumeva izbegavanje kontaktnog alergena. 
Kod akutnog AKD koriste se topikalni steroidi, koji se po oporavku kože zamenjuju melemima i hladnim kremama. Kod težeg oblika bolesti kratkotrajno se primenjuju sistemski kortikosteroidi. Konvencionalna imunosupresivna terapija nije adekvatna u lečenju AKD, i perspektivu čine nove klase imunosupresora koji ciljano deluju na uzročnike bolesti, i uključuju inhibitore adhezivnih molekula, kontrolisanu aplikaciju regulatornih citokina, neutralizaciju proinflamatornih citokina (Saint-Mezard i drugi, 2004a). Iako je AKD dosta ispitivana, nisu poznati svi mehanizmi u osnovi razvoja bolesti, pa su u tom smislu gledano, neophodna što detaljnija ispitivanja patogeneze ove bolesti koja bi pomogla razvoj novih terapija. 

Hapteni

Alergeni koji izazivaju AKD su hemikalije različitog porekla i prirode čija je molekulska masa najčešće manja od 500 daltona (hapteni), ali sa zajedničkom karakteristikom: samostalno nisu imunogeni, već nakon vezivanja za proteine formiraju antigenske determinante koje aktiviraju imunski sistem. Hapten se, nakon prolaska u epiderm i derm, vezuje za vanćelijske i ćelijske proteine. Delove ovog kompleksa preuzimaju dendritične ćelije, i nakon obrade, eksprimiraju ih na svojoj površini vezane sa molekulima glavnog kompleksa tkivne podudarnosti (eng. MHC, Major Histocompatibility Complex). Ovako eksprimiran, hapten može da aktivira T-ćelijski imunski odgovor (Benezra, 1990). 
Više od 80 godina je poznato da je reaktivnost haptena sa proteinima značajna za njhovu sposobnost da izazovu alergijsku senzibilizaciju. Hapteni su najčešće elektrofilne hemikalije koje mogu da reaguju sa nukleofilnim centrom proteina formirajući kovalentne veze. Izuzetak su soli metala, koji sa proteinima grade koordinatne veze. Veza sa velikom energijom, kao što je kovalentna, omogućava hapten-protein kompleksu da preživi unutarćelijsku obradu proteina do peptida, nakon čega će biti prezentovan vezan za MHC molekule (Chipinda i drugi, 2011). Neke od elektrofilnih hemikalija su aldehidi, ketoni, amidi, halogene supstance, metalni katjoni. 
Pojedini hapteni nisu normalno elektrofilni (prohapteni), ali se oksidacijom ili metaboličkom transformacijom, zahvaljujući aktivnosti keratinocita i/ili dendritičnih ćelija, prevode u hemikalije sposobne da reaguju sa proteinom (Divković i drugi, 2005). 
Faktori koji mogu uticati na senzibilišuću aktivnost haptena su i lipofilnost, trodimenzionalna struktura, i afinitet vezivanja za proteine. 
Iako su proteini za koje se vezuju hapteni većinom nepoznati, postignut je napredak u njihovoj identifikaciji. Pokazano je da modifikacija proteina od strane haptena nije neselektivna, tj. ograničena grupa proteina, i njihovih aminokiselinskih ostataka, mogu biti potencijalne mete, kao što je npr. keratin 5 u koži ljudi (Martin, 2012). 

Istorijski aspekt kontaktne preosetljivosti

Kontaktni dermatitis je kao pojava verovatno prepoznat još u starom veku, sudeći po zapisima iz tog perida, kada je primećeno da pojedine osobe nakon sečenja drveta bora trpe jak svrab. U sedamnaestom, osamnaestom i devetnaestom veku javljaju se i prvi pokušaji izazivanja reakcije kontaktnog dermatitisa nakon nanošenja hemikalija na zdravu kožu kod ljudi. U devetnaestom veku je prvi put detaljno opisan test ispitivanja kontaktnog dermatitisa, stvaranjem lezija na koži kod ljudi nakon kontakta sa indijskim orahom (Lachapelle, 2009). Josef Jadassohn, dermatolog koji je 1895. opisao kontaktnu alergiju na živu, primetivši da se kod pojedinih osoba razvija ekcematozna reakcija na koži nakon ponovljenog kontakta sa hemikalijom, a koja nije posledica iritantnog efekta hemikalije (Jadassohn, 1985), danas se smatra 'ocem' kontaktnog dermatitisa i kožnog testa sa krpicama (eng. 'patch' test). U dvadesetom veku raste svest o značaju identifikacije hemikalija koje mogu biti uzročnici kontaktnog dermatitisa, što rezultira razvojem brojnih kožnih testova sa tom svrhom. Prvobitna istraživanja kontaktnog dermatitisa vršena su na ljudima, međutim kako ispitivanje potencijala slabih senzibilišućih agenasa zahteva veliki broj ispitanika, a kontakt ispitanika sa hemikalijom može izazvati trajan zdravstveni problem, javlja se potreba za uvođenjem životinjskih modela bolesti. Do 1930. razvijen je model kontaktne preosetljivosti kod zamorčića, koji se zasniva na prvom kontaktu kože sa haptenom usled njegovog intrakutanog ili epikutanog nanošenja (senzibilizacija), i drugog kontakta (elicitacije reakcije) usled nanošenja hemikalije od petog do devetog dana nakon senzibilizacije na bilo koju površinu kože, osim na prvobitno tretirano mesto, nakon čega dolazi do ekspresije reakcije, sa pikom 24-48h nakon elicitacije (Landsteiner i Jacobs, 1935;Schild, 1962). 
Istorijski, zamorčići su prvi prihvaćeni kao vrsta od izbora za ispitivanje senzibilišuće aktivnosti hemikalije na koži. Najviše korišćeni i najbolje okarakterisani testovi na zamorčićima su zatvoreni 'patch' test (Buehler, 1965) (Kimber i Dearman, 1994), za koje je pokazano da su podjednako efikasni kao testovi na zamorčićima. Ovi testovi se zasnivaju na sposobnosti hemikalije da izazove otok uha (MEST), ili proliferaciju ćelija limfnog čvora koji drenira regiju na koju je nanesena hemikalija (LLNA). LLNA se izdvojio kao danas najčešće korišćeni životinjski test sistem za procenu potencijala hemijskog agensa da izazove senzibilizaciju, sa visokim stepenom reproducibilnosti u inter-i intra-laboratorijskim testiranjima (Fowler i Fisher, 2008). Sa razvojem životinjskog modela AKD, reakcije kontaktne preosetljivosti (KP), napreduju i istraživanja imunobioloških procesa koji su u osnovi indukcije, ekspresije i regulacije reakcije. Ovakva istraživanja značajna su za razvoj pouzdanijih testova i u proceni rizika u odnosu na izloženost hemijskim agensima, ali i za razvoj novih dijagnostičkih metoda i terapeutskih modaliteta u lečenju AKD. Iako su ova istraživanja rađena i na krupnijim životinjama kao što su psi, majmuni, ovce, uzimajući u obzir etnički i tehnički aspekt, danas u istraživanjima dominiraju glodarski modeli, u prvom redu miševi (Zollner i drugi, 2005). Pokazano je da u KP kod miševa i pacova preovladava infiltrat limfocita i monocita u zahvaćenoj koži, kao i kod ljudi (Haley, 2003), kao i da njihov odgovor na eksperimentalnu terapiju u velikoj meri reflektuje terapijski učinak kod ljudi (Zollner i drugi, 2005). 
Protokoli za izazivanje eksperimentalne KP kod miševa se danas razlikuju u režimima indukcije i elicitacije reakcije. Senzibilizacija se izaziva jednostrukim ( Arts i drugi, 1996). Ekspresija reakcije prati se najčešće 24 časa nakon elicitacije, kada se zapaža njen maksimum. Najčešće korišćeni hapteni u izazivanju KP su nitrohalogeni derivati benzena kao što su dinitrohlorobenzen (DNCB), dinitrofluorobenzen (DNFB), trinitrofluorobenzen (TNCB), kao i oksazolon (OXAZ) i pikrinska kiselina. Ovi jaki hapteni nazivaju se i eksperimentalnim, jer se ne nalaze u prirodi. 

Alergijski kontaktni dermatitis: mehanizmi indukcije i ekspresije reakcije

Reakcija KP, kao životinjski model AKD, dala je veliki doprinos razumumevanju efektorskih i regulatornih mehanizama ove bolesti. Kao i AKD, KP je reakcija posredovana T ćelijama specifičnim za hapten, i za njenu optimalnu ekspresiju su neophodne dve vremenski i prostorno odvojene faze: faza senzibilizacije i elicitacije. 
Faza senzibilizacije započinje nakon prvog kontakta kože sa eksperimentalnim haptenom, i završava se aktivacijom T ćelija specifičnih za hapten u drenirajućim limfnim čvorovima (dLČ) regije na koju je nanesen hapten. Nakon aktivacije, specifične T ćelije napuštaju limfne čvorove, ulaze u krvotok i započinju recirkulaciju između limfoidnih organa i kože. Ova faza traje 10-15 dana kod ljudi i 5-7 dana kod miševa, i karakteriše je odsustvo kliničke manifestacije bolesti (Vocanson i drugi, 2009). U nekim slučajevima može se javiti primarni alergijski kontaktni dermatitis, zapaljenska reakcija u koži specifična za hapten, 5-15 dana nakon prvog kontakta sa haptenom (Vocanson i drugi, 2009). Ponovni kontakt senzibilisanih životinja sa haptenom vodi razvoju zapaljenske reakcije sa karakterističnim znacima kliničke manifestacije bolesti AKD. 
Maksimum reakcije javlja se nakon 24-48 časova kod miševa i 72 časa kod čoveka. 
Zapaljenska reakcija se održava nekoliko dana nakon čega opada usled delovanja regulatornih mehanizama (Vocanson i drugi, 2009) (Slika 2.). Slika 2. Šema reakcije kontaktne preosetljivosti. Faza senzibilizacije započinje topikalnom aplikacijom haptena na površinu kože životinja. Prisustvo haptena u koži dovodi do produkcije proinflamatornih citokina (TNF-, IL-1) i hemokina (1), što izaziva aktivaciju i migraciju epidermnih i dermnih dendritičnih ćelija, koje prezentuju hapten, preko aferentne limfe do drenirajućih limfnih čvorova (2). U drenirajućim limfnim čvorovima, prezentovanje haptena dovodi do proliferacije, aktivacije i diferencijacije T ćelija specifičnih za hapten (3). Produkcija citokina u drenirajućim limfnim čvorovima u toku faze senzibilizacije stimuliše i kontroliše efikasnu aktivaciju i proliferaciju (IL-1, IL-2, IL-6), kao i diferencijaciju (IFN-, IL-17, IL-4) T ćelija. Na kraju ove faze, senzibilisane specifične T ćelije napuštaju limfni čvor, i aferentnom limfom ulaze u krv, gde započinju recirkulaciju (4). U fazi elicitacije reakcije, nakon ponovne aplikacije istog haptena na najčešće površinu uha, hapten preuzimaju ćelije u koži (Langerhansove ćelije, keratinociti, endotelne ćelije) i prezentuju ga hapten-specifičnim T ćelijama iz krvi. Ovo izaziva produkciju inflamatornih citokina i hemokina na mestu elicitacije, dovodeći do infiltracije neutrofila u kožu. Dinamična interakcija ćelija adaptivne i urođene imunosti, koje ispoljavaju svoje efektorske aktivnosti, dovodi do razvoja karakterističnih kožnih lezija (5). 

Faza senzibilizacije

Sposobnost haptena da izazove senzibilizaciju zavisi od njegove proinflamatorne aktivnosti, tj. sposobnosti aktivacije ćelija urođene imunosti, kao i od antigenske aktivnosti koju stiče nakon vezivanja za proteine u koži (Vocanson i drugi, 2009). (Martin i drugi, 2002). Njihova istraživanja su ukazala na postojanje dva moguća mehanizma senzibilizacije od strane kontaktnih alergena: mehanizam koji zavisi od IL-12, kod koga je aktivacija samo TLR2 ili TLR4 dovoljna da izazove KP; i mehanizam koji je nezavisan od IL-12, za koji je potrebno prisustvo TLR4, često dovoljno ako je samo na dendritičnim ćelijama. Takođe, oni su ukazali na to da su, u slučaju reakcije KP na TNCB, ligandi za TLR2 i TLR4 endogene prirode, a ne komponente komensalne flore kože (Martin i drugi, 2002). Jedan od predloženih endogenih aktivatora TLR2/TLR4 u KP je degradovana hijaluronska kiselina. Pokazano je da kontaktni alergeni, kao što je TNCB, mogu da dovedu do produkcije reaktivnih vrsta kiseonika (eng. ROS, Reactive Oxygen Species) in vitro, od strane ćelijskih linija mišjih keratinocita i fibroblasta, i in vivo, nakon nanošenja haptena na uho miša (Esser i drugi, 2012). Pretpostavlja se da produkcija ROS, izazvana prisustvom haptena, dovodi do oksidativne degradacije hijaluronske kiseline (Martin i drugi, 2011). Osim ovih mehanizama, nedavna istraživanja su sugerisala da se nikl može direktno vezati za TLR4 kod ljudi, izazivajući proinflamatornu reakciju neophodnu za razvoj AKD (Schmidt i drugi, 2010). Obezbeđivanjem signala opasnosti (tretman sa dodecil sulfatom) koji dovodi do aktivacije inflamazoma, omogućava se senzibilizacija sa inače tolerogenim DNTB-om, dok ukidanje signala opasnosti, tj. mogućnost aktivacije inflamazoma, vodi razvoju tolerancije na inače jak senzibilišući DNFB ( Watanabe i drugi, 2008). Ovaj model je u saglasnosti sa zapažanjima da ljudi koji nisu skloni alergijama, nakon izlaganja niklu, slabom haptenu koji inače ne aktivira inflamazom (Watanabe i drugi 2008), razvijaju nikl-specične CD25 + Treg ćelije sa supresorskom aktivnošću, za razliku od osoba koje boluju od AKD, kod kojih je supresorska aktivnost ovih ćelija ograničena ili odsutna (Cavani i drugi, 2003). 

Receptori

Topikalno nanošenje haptena TNCB-a i OXAZ-a kod miševa, dovodi do oslobađanja veće količine vanćelijskog adenozin trifosfata (ATP) u koži, koji deluje kao DAMP (vezujući se za purinergički receptor P2X7), što dalje dovodi do aktivacije inflamazoma i produkcije IL-1β, koji su neophodni za indukciju KP (Weber i drugi, 2010). 

Ćelijski odgovor na haptene u koži

Nakon nanošenja, hapteni intereaguju sa ćelijama kože, dovodeći do produkcije brojnih citokina (IL-1α, IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IFN-indukovan protein 10/IP-10, makrofagni inflamatorni protein 2/MIP-2) neophodnih za indukiju reakcije KP (Enk i Katz, 1992). 
Kožu grade dva sloja, epiderm i derm, međusobno povezana bazalnom laminom. 
Pored najbrojnijih keratinocita (>90%) u epidermu se nalaze melanociti, Merkelove ćelije, Langerhansove ćelije i epidermni T limfociti (Mestas i Hughes, 2004; Nestle i drugi, 2009). Derm je anatomski komplikovaniji, sa većom ćelijskom raznovrsnošću. U njemu se nalaze najbrojniji fibroblasti, zatim dendritične ćelije, CD4 + T ćelije, γδ ćelije, T ćelije prirodne ubice (eng. NKT, Natural Killer T cell), mast ćelije, makrofagi (Nestle i drugi, 2009). 

Keratinociti

Keratinociti, kao najbrojnije ćelije epiderma, čine fizičku barijeru prodiranju hemikalija kroz kožu. Pokazano je da poremećaj ove barijere povećava osetljivost na senzibilizaciju sa niklom kod ljudi (Novak i drugi, 2008) i OXAZ-om kod miševa (Scharschmidt i drugi, 2009). Međutim, keratinociti se ne smeju posmatrati samo kao deo pasivne barijere, već i kao ćelije sa bitnom imunološkom funkcijom, od važnosti za tkivnu homeostazu ali i u različitim patološkim stanjima. Pokazano je da keratinociti eksprimiraju većinu TLR, i da odgovaraju na prisustvo pojedinih haptena (DNFB, nikl) aktivacijom TLR4, što može dovesti do aktivacije inflamazoma i produkcije IL-1β i IL-18 (Kaplan i drugi, 2012). Pored IL-1β i IL-18, keratinociti produkuju i mnoge druge proinflamatorne citokine i hemokine ( Corsini i Galli, 2000). Jedan od citokina koji je bitan za senzibilizaciju a koga produkuju keratinociti u odgovoru na hapten je faktor nekroze tumora-α (eng. TNF-α-Tumor necrosis factor-α). Nakon nanošenja kontaktnog alergena na kožu miševa (OXAZ, FITC) i ljudi (difenilciklopropenon) pokazano je da TNF-α, zajedno sa IL-1β i IL-18, podstiče migraciju i sazrevanje Langerhansovih ćelija iz kože u dLČ (Cumberbatch i Kimber, 1995; Griffiths i drugi, 2001). Pored proinflamatorne aktivnosti, keratinociti mogu da utiču i na prirodu adaptivnog imunskog odgovora. Pokazano je da ćelijske linije keratinocita čoveka nakon tretmana sa haptenima, ali ne i iritantima, eksprimiraju p40 subjedinicu IL-12 koji vodi polarizaciji Th1 imunskog odgovora (Banarjee i drugi, 2004), kao i da nakon tretmana sa niklom produkuju IL-23 bitan za proliferaciju Th17 ćelija (Larsen i drugi, 2009). Što se tiče održavanja tkivne homeostaze i kontrole imunskog odgovora, pokazano je da ove ćelije u odgovoru na inflamaciju eksprimiraju RANKL (eng. Receptor Activator of NF-kB Ligand), koji povećava broj Treg ćelija (Loser i drugi, 2006), što može dovesti do supresije reakcije KP kod miševa (Ghoreishi i drugi, 2009) odnosno AKD kod ljudi (Hanneman i drugi, 2006). Pored toga, keratinociti produkuju katelicidine, peptide sa antibiotskim dejstvom, koji inhibiraju produkciju citokina indukovanu hijaluronskom kiselinom, ali produkuju i imunosupresivne citokine, kao što su IL-10 i transformišući faktor rasta (eng. TGF-Transforming Growth Factor)-β (Ferguson i drugi, 1994). 

Dendritične ćelije

Ključan događaj u inicijaciji AKD je aktivacija CD4 + i CD8 + T ćelija specifičnih za hapten u dLČ, njihova proliferacija i diferencijacija u efektorske T ćelije (Nestle i drugi, 2009). Iako hapteni mogu stići do dLČ limfnim tokom, aktivacija imunskog odgovora u dLČ zahteva njihov transport i prezentaciju posredstvom migratornih dendritičnih ćelija (Itano i drugi, 2003). 
Dendritične ćelije (DĆ) se u odnosu na lokalizaciju u koži dele na epidermne i dermne DĆ. U epidermu se nalaze langerin + DĆ (Langerhansove ćelije), koje se kod miševa razlikuju od dermnih langerin + DĆ po ekspresiji EPCAM (eng. Epithelial Cell Adhesion Molecule). Pod uticajem proinflamatornih medijatora produkovanih u koži nakon kontakta sa haptenom, ali i nakon direktnog prepoznavanja haptena (Kaplan i drugi, 2012), Langerhansove DĆ (LĆ) preuzimaju hapten vezan za tkivne proteine, obrađuju ovaj kompleks i prikazuju ga na svojoj površini vezanog za MHC molekule klase I (MHC I) i klase II (MHC II), što dovodi do njihove aktivacije ( Watanabe i drugi, 2002). Aktivisane LĆ povećavaju ekspresiju kostimulatornih molekula, kao što su CD54, CD80, i CD86, i produkciju proinflamatornih citokina (IL-1, TNF-( Aiba i Tagami, 1999). Nakon aktivacije, sledi migracija ovih ćelija iz kože u dLČ, i njihovo sazrevanje. Za ove procese su neophodni IL-1β i TNF-α, produkovani od strane keratinocita i samih LĆ ( Watanabe i drugi, 2002). Ovi citokini dovode do promene u ekspresiji adhezivnih molekula, pre svega do gubitka ekspresije molekula CD324 (Ekadherin), što omogućava migraciju LĆ iz epiderma. Generalno, IL-1β produkovan od strane LĆ autokrino aktivira LĆ preko IL-1 receptora, i stimuliše keratinocite da produkuju TNF-α koji parakrino utiče na LĆ i doprinosi njihovoj migraciji (Cumberbatch i drugi, 1999). Uporedo sa ovom aktivnošću povećana je i produkcija enzima koji razgrađuju bazalnu membranu, kao što su matriksne metaloproteinaze, od strane aktivisanih LĆ (Kobayashi, 1997). 
Iako davno identifikovane kao antigen-prezentujuće ćelije (APĆ) u koži, in vivo uloga LĆ je ostala kontroverzna (Nestle i drugi, 2009). One su dugo smatrane ćelijama odgovornim za indukciju imunskog odgovora na antigene, kao što su hapteni (Ptak i drugi, 1980; Vocanson i drugi, 2009), međutim danas preovladava mišljenje da ove ćelije imaju pre tolerogenu nego senzibilišuću aktivnost. Na mišjem modelu bolesti pokazano je da odsustvo Langerhansovih ćelija, izazvano topikalnom primenom kortikosteroida, uklanjanje slojeva epiderma pomoću lepljivih traka ('stripovanje') (Grabbe i drugi, 1995), ili uvođenjem receptora za toksin difterije (DTR) u gen za humani langerin (Kaplan i drugi, 2005; Bobr i drugi, 2010), povećava intenzitet reakcije KP. Pretpostavlja se da Langerhansove ćelije, nakon migriranja u dLČ 3-4 dana nakon nanošenja haptena, intereaguju sa CD4 + T ćelijama, što dovodi do povećane produkcije IL-10, citokina koji inhibira CD4 + i CD8 + T ćelije specifične za hapten (Igyarto i drugi, 2009). Eksperimenti u kojima su Langerhansove ćelije uklonjene u različitim fazama reakcije KP, pokazali su da ove ćelije imaju supresivnu ulogu prvenstveno u toku senzibilizacije, a ne i elicitacije reakcije ( Kaplan i drugi, 2005). Dobijeni su i suprotni rezultati, koji su pokazali da kod miševa sa odsustvom Langerhansovih ćelija, izazvanim preko sistema DTR/DT, reakcija KP je ili nepromenjena ili smanjena (Bennett i drugi, 2005). Neusaglašeni rezultati verovatno su posledica korišćenja različitih genetski modifikovanih sojeva miševa, različitih haptena i procedura u izazivanju KP, kao i činjenice da langerin poseduju i druge ćelije pored Langerhansovih (Vocanson i drugi, 2009). 
Novija istraživanja na miševima identifikovala su dermne DĆ kao prve ćelije koje migriraju u dLČ nakon nanošenja haptena, gde izazivaju T-ćelijsku proliferaciju bitnu za indukciju KP (Fukunaga i drugi, 2008). Kod ljudi se u dermu nalazi nekoliko populacija DĆ, koje se od mišjih razlikuju po ekspresiji površinskih markera, kao i po poreklu (Burke i Anandasabapathy, 2011). DĆ derma kod ljudi karakteriše konstitutivna ekspresija receptora DC-SIGN (CD209) (Toebak i drugi, 2009), lektina tipa C bitnog u aktivaciji i migraciji DĆ, kao i u aktivaciji T ćelija (Soilleux i drugi, 2002), a kod miševa ekspresija CD11c molekula i odsustvo makrofagnog markera kao što je F4/80 (Valladeau i Sealand, 2005). I kod ljudi i kod miševa u dermu su prisutne langerin + DĆ, koje se razlikuju od epidermnih Langerhansovih ćelija (Valladeau i Sealand, 2005). 
Pokazano je da se KP može izazvati nakon adoptivnog transfera dermnih DĆ izolovanih iz miševa senzibilisanih sa FITC-om, ali ne i Langerhansovih ćelija (Kumamoto i drugi, 2009). Sugerisano je da su upravo langerin + dermne DĆ bitne za indukciju KP kod miševa (Bursh i drugi, 2007). Nasuprot tome, kod miševa sa delimičnim ili potpunim odsustvom ekspresije gena za transkripcioni faktor Batf, značajan za razvoj DĆ, a koji pokazuju konstitutivno odsustvo CD103 + langerin + dermnih DĆ, reakcija KP se razvija neometano, ukazujući da ove ćelije nisu neophodne za razvoj KP (Edelson i drugi, 2010). Velike razlike u podacima koje se dovode u vezu sa različitim eksperimentalnim uslovima, ukazuju na neophodnost razvoja novih modela koji će sa većom preciznošću utvrditi ulogu epidermnih i dermnih DĆ u razvoju KP. 

Mast ćelije

Ćelije veoma bitne za razvoj urođene i adaptivne imunosti u raznim organima su mast ćelije. One su najbrojnije na mestima kontakta organizma sa spoljašnjom sredinom, kao što su derm kože i mukoza gastrointestinalnog i respiratornog trakta, gde su lokalizovane oko krvnih i limfnih sudova, i nervnih završetaka. One su važne za gotovo svaki aspekt imunskog odgovora u zdravom ili bolesnom tkivu, uključujući inicijaciju, modulaciju i regulaciju ( Matsue i drugi, 2009). Mast ćelije iskazuju visoko afinitetni receptor za imunoglobulin (Ig) E (FcεRI), i nakon aktivacije preko ovog receptora, one odgovaraju produkcijom raznih imunološki aktivnih supstanci, kao što su histamin, proteaze, proteoglikani i TNF-α, koji dovode do reakcije rane preosetljivosti ( Kaplan i drugi, 2009). Ove ćelije mogu da se aktiviraju i putem nezavisnim od IgE, pomoću produkata komplementne kaskade i citokina ( Navi i drugi, 2007). Same mast ćelije produkuju mnoge proinflamatorne medijatore kao što su citokini IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-13, TNF-α i hemokini CC-hemokinski ligand 2 (CCL2), CCL3, CCL4 ( Kaplan i drugi, 2009). 
Mast ćelije imaju različit efekat na funkciju DĆ. Kod ljudi ove ćelije mogu da podstaknu sazrevanje DĆ in vitro (Kitawaki i drugi, 2006), kod miševa in vivo podstiču migraciju DĆ zahvaljujući oslobađanju histamina (Jawdat i drugi, 2004) ili TNF-α (Suto i drugi, 2006), ili inhibiraju migraciju Langerhansovih ćelija kod miševa produkcijom prostaglandina D 2 (PGD 2 ) ( Angeli i drugi, 2001). Ove ćelije mogu da utiču na migraciju leukocita na mesto zapaljenske reakcije, kao i na Th1/Th2 polarizaciju (Navi i drugi, 2007). 
Iako je poznato da mast ćelije učestvuju u reakciji KP, njihova uloga je kontroverzna. Korišćenjem BALB/c i C3H/HeN miševa, pokazano je da su mast ćelije bitne za indukciju KP na DNFB: nakon aktivacije mast ćelija u koži, usled nanošenja haptena, one migriraju u dLČ gde putem produkcije CCL4 (MIP-1β), podstiču infiltraciju T ćelija u čvorove (Wang i drugi, 1998). Ispitivanja na miševima sa mutacijom u c-kit proto-onkogenu (Kit W/W-v soj) koji kodira receptor sa tirozin-kinazom aktivnošću (eksprimiranom u intersticijalnim ćelijama Cajala, u ćelijama hematopoeze, melanocitima i mastocitima), a kod kojih su mast ćelije kongenitalno (urođeno) odsutne, pokazala su da ova mutacija smanjuje ili ne utiče na intenzitet reakcije KP (Galli i Hammel, 1984). Sa druge strane, korišćenjem Kit W/W-v miševa sugerisana je i imunosupresivna uloga mast ćelija, u kasnoj fazi reakcije KP na alergene iz urušiola, biljnog soka otrovnog bršljena, posredstvom produkcije IL-10 ( Grimbaldeston i drugi, 2007). Kontradiktorni rezultati dobijeni korišćenjem Kit W/W-v miševa mogu biti posledica urođenog odsustva i drugih ćelijskih tipova usled mutacije u c-kit genu, ali i postojanja kompenzatornih mehanizama koji bi mogli da modulišu funkciju imunskog sistema. Pa tako, korišćenjem miševa kod kojih su mast ćelije kondicionalno i specifično uklonjene (Mas-TRECK miševi), pokazan je značaj ovih ćelija u indukciji reakcije, usled njihove interakcije sa DĆ, tj. stimulacije migracije i sazrevanja DĆ (Otsuka i drugi, 2011). 
Retki su radovi koji ispituju ulogu mast ćelija u alergijskom kontaktnom dermatitisu kod ljudi. Dvorak i saradnici su pokazali da kod ljudi, nanošenje DNCB-a i urušiola rezultira izraženim promenama u dermalnoj mikrovaskulaturi i mast ćelijama (Dvorak i drugi, 1976). 

T ćelije u koži

Normalna, zdrava koža, sadrži više od dvostrukog broja T ćelija prisutnih u krvi (Nestle i drugi, 2009). U normalnom epidermu nalazi se heterogena populacija T ćelija, od kojih su najzastupljenije memorijske CD8 + ćelije sa αβ T ćelijskim receptorom (eng. TCR, T Cell Receptor). U dermu je prisutan podjednak broj CD4 + i CD8 + T ćelija, koje su većinom memorijske ćelije koje eksprimiraju CLA (eng. Cutaneous Lymphocyteassociated Antigen) ( Nestle i drugi, 2009). Nedavna istraživanja su sugerisala da glavnu ulogu u imunskoj homeostazi i patološkim procesima kože imaju upravo rezidentne T ćelije, a ne migratorne T ćelije. Rezidentne memorijske T ćelije predstavljaju prvu liniju odbrane nakon ponovnog kontakta kože sa antigenom i otuda se smatraju bitnim efektorskim ćelijama u tkivnoj patologiji (Nestle i drugi, 2009). U koži se nalaze i takozvane nekonvencionalne T ćelije urođene imunosti, od kojih su najbrojnije γδ T ćelije i NKT ćelije. 

γδ T ćelije

Kod ljudi γδ T ćelije čine samo mali deo dermnih i epidermnih T ćelija, dok kod miševa γδ (Vγ5 + ) dendritične epidermne T ćelije (eng. DETC, Dendritic Epidermal T Cells) čine više od 90% epidermnih T ćelija (Nestle i drugi, 2009). Smatra se da DETC lokalno suprimiraju zapaljensku reakciju na alergene i patogene u kojoj učestvuju konvencionalne αβ T ćelije (Girardi i drugi, 2006). 
Istraživanja na miševima sa odsustvom γδ T ćelija sugerisala su regulatornu ulogu ovih ćelija u senzibilizaciji reakcije KP na DNFB i OXAZ, putem direktne inhibicije hapten-specifičnih CD8 + αβ T ćelija ( Guan i drugi, 2002). Međutim, pokazano je da delecija gena za δ lanac TCR (δ -/-miševi), koja je u osnovi odsustva γδ T ćelija, ima različit efekat kod pojedinih sojeva miševa. Kod C57BL/6 miševa, ova mutacija ne utiče na intenzitet reakcije KP, za razliku od mutacije toga gena na FVB ili NOD genetičkoj pozadini, koja vodi razvoju spontanog dermatitisa i intenzivnijoj reakciji KP. Adoptivnim transferom sugerisano je da su DETC neophodne i dovoljne za supresiju spontanog dermatitisa kod FVB δ -/-miševa ( Girardi i drugi, 2002). Mehanizam kojim bi DETC suprimirale KP još uvek nije potpuno razjašnjen. O γδ T ćelijama u koži ljudi se manje zna, ali se smatra da bi mogle biti funkcionalno ekvivalentne invarijantnim epidermnim γδ T ćelijama kod glodara (Kaplan i drugi, 2012). Aktivisane B1-ćelije migriraju u slezinu gde produkuju hapten-specifična IgM antitela, koja su neophodna za fazu elicitacije (Campos i drugi, 2006a(Campos i drugi, , 2006b)). Nedavno je pokazano da davanje α-galaktozilceramida (α-GalCer), potentnog aktivatora NKT ćelija, u toku senzibilizacije miševa sa DNFB-om, povećava intenzitet i dužinu trajanja reakcije KP nakon elicitacije (Gorbachev i Fairchild, 2006). Naime NKT ćelije stimulišu migraciju dendritičnih ćelija kože u dLČ, što rezultira povećanom aktivacijom CD8 + T ćelija specifičnih za hapten (Gorbachev i Fairchild, 2006). Pretpostavlja se da je interakcija DĆ i iNKT ćelija uključena u sazrevanje (i migraciju) DĆ kože, u fazi senzibilizacije i elicitacije, i da ova interakcija dovodi do produkcije citokina od strane iNKT ćelija bitnih za aktivaciju drugih ćelija uključenih u razvoj reakcije (Nieuwenhuis i drugi, 2005). Grupa istaživača je pokazala da su NKT ćelije česte u T ćelijskom infiltratu u koži u fazi elicitacije AKD kod ljudi, gde produkuju IL-4 i IFN-γ (Gober i Gaspari, 2008). 

Adaptivna imunost u fazi senzibilizacije: aktivacija hapten-specifičnog imunskog odgovora

AKD zavisi od aktivacije T ćelija specifičnih za hapten u toku faze senzibilizacije. Adoptivni transfer T ćelija iz senzibilisanih u naivne miševe omogućava prenos senzibilizacije, dok uklanjanje T ćelija kod senzibilisanih miševa inhibira reakciju KP (Vocanson i drugi, 2009). T-ćelijska aktivacija zavisi od kombinacije tri različita signala. Prvi signal podrazumeva interakciju TCR sa kompleksom haptena i MHC molekula na površini DĆ, drugi signal obezbeđuju kostimulatorni molekuli, a treći produkovani citokini (Vocanson i drugi, 2009). Odsustvo poslednja dva signala dovodi do apoptoze T ćelija ili anergije, uprkos prisustvu antigena. 
U reakciji KP, nakon migracije DĆ u dLČ, kompleks haptena i peptida vezan za MHC molekule klase I i II na površini DĆ prepoznaju hapten-specifične CD8 + i CD4 + T ćelije, redom. In vitro istraživanja sa trinitrofenolom (TNP) kao haptenom, pokazala su da i CD8 + (Martin i drugi, 1992) i CD4 + (Kohler i drugi, 1997) T ćelije svojim TCR prepoznaju haptenski epitop, nezavisno od amino-kiselinske sekvence bočnog lanca proteina za koji je hapten vezan, i nezavisno od MHC haplotipa. 
Za efikasnu aktivaciju T ćelija neophodna je interakcija kostimulatornih molekula na površini DĆ, članova B7 familije CD80 (B7-1) i CD86 (B7-2), kao i CD40, sa odgovorajućim molekulima na površini T ćelija. DĆ nakon sazrevanja eksprimiraju CD80 i CD86, koji mogu da se vežu za CD28 molekul eksprimiran konstitutivno na T ćelijama, a koji je neophodan za razvoj KP kod miševa ( Kondo i drugi, 1996). Kod miševa je pokazano da je ekspresija B7-2 na Langerhansovim ćelijama bitna za aktivaciju efektorskih T ćelija u fazi senzibilizacije, dok je B7-1 odgovoran za ograničenje razvoja CD4 + Th2 regulatorne komponente, čime se omogućava efikasan imunski odgovor nakon elicitacije (Xu i drugi, 1997a). Iako je prvobitno pokazano da aktivacija specifičnih CD8 + T ćelija u fazi senzibilizacije ne zavisi od CD40-CD40L interakcije (Gorbachev i drugi, 2001a), kasnije istraživanje je sugerisalo da angažovanje CD40 molekula na površini Langerhansovih ćelija u ovoj fazi stimuliše aktivaciju efektorskih T ćelija ( Gorbachev i Fairchild, 2004). Interakcija T ćelija sa DĆ može imati za posledicu i inhibitorni efekat sa ciljem ograničavanja preterane T ćelijske aktivacije, sa CTLA-4/CD80 ili CTLA-4/CD86 interakcijom kao glavnim inhibitornim putevima (Vocanson i drugi, 2009). Pokazano je da je aktivacija CTLA-4 na T ćelijama bitna za toleranciju izazvanu UV-zračanjem kod senzibilisanih miševa (Schwarz i drugi, 2000). Značaj CTLA-4 aktivacije u regulaciji alergijskog kontaktnog dermatitisa pokazan je i kod ljudi (Levings i drugi, 2002). 

Faza elicitacije

Ponovni kontakt kože sa haptenom kod senzibilisanih životinja aktivira ćelije urođene imunosti kože, usled proinflamatorne aktivnosti samog haptena, što dovodi do aktivacije i migracije senzibilisanih hapten-specifičnih T ćelija u derm i epiderm tretirane kože. Zapaljenska reakcija nastala usled ispoljavanja efektorskih aktivnosti ćelija urođene imunosti i T ćelija specifičnih za hapten dovodi do razvoja karakterističnih kožnih lezija. 

Dinamična interakcija ćelija urođene i adaptivne imunosti u fazi elicitacije

Ekspresija i intenzitet reakcije KP zavise od događaja u fazi senzibilizacije, sa aktivacijom B ćelijske imunosti kao važnim faktorom. Nakon elicitacije miševa, haptenspecifična IgM antitela, produkovana od strane B1 ćelija u fazi senzibilizacije, stvaraju kompleks sa haptenom, koji aktivira komplement klasičnim putem i vodi lokalnom nastanku C5a (Szczepanik i drugi, 2003). Vezivanjem za svoj receptor na površini mast ćelija i trombocita, C5a stimuliše ove ćelije da oslobađaju vazoaktivni serotonin i TNFα, što dovodi do povećanja lokalne mikrovaskularne propustljivosti i aktivacije endotelnih ćelija (Szczepanik i drugi, 2003). Povećana ekspresija adhezivnih molekula E-i P-selektina i njihovih liganada VCAM-1 (eng. Vascular Cell Adhesion Molecule 1) i ICAM-1 (eng. Intercellular Adhesion Molecule 1) na površini endotelnih ćelija, stimuliše migraciju senzibilisanih CD8 + T ćelija specifičnih za hapten na mesto elicitacije reakcije. Endotelne ćelije preuzimaju hapten nakon elicitacije i prezentuju ga pristiglim senzibilisanim CD8 + T ćelijama iz krvi, što dovodi do njihove aktivacije i produkcije IFN-γ i IL-17 (Kish i drugi, 2011). Ovi citokini dalje stimulišu endotelne ćelije da produkuju hemokine CXCL1 i CXCL2, koji su odgovorni za infiltraciju neutrofila u kožu. Pretpostavlja se da CD8 + T ćelije ne migriraju u tkivo bez prethodne infiltracije neutrofila, kao i da je produkcija T-ćelijskih hemoaktraktanata i metaloproteinaza od strane neutrofila neophodna za kasniju infiltraciju efektorskih T ćelija u kožu (Kish i drugi, 2009). U vezi sa tim, pokazano je da intenzitet migracije neutrofila na mesto elicitacije reakcije kontroliše infiltraciju T ćelija specifičnih za hapten ( Engeman i drugi, 2004). Rezultati koji pokazuju da uklanjanje neutrofila odgovarajućim antitelima inhibira KP, potvrđuju značaj ovih ćelija za ekspresiju reakcije KP (Dilulio i drugi, 1999). Infiltracija neutrofila na mesto elicitacije pod kontrolom je dva medijatora, TNF-α i MIP-2, za koje je pokazano da ih produkuju mast ćelije (Biedermann i drugi, 2000). 

Produkcija medijatora inflamacije u koži nakon elicitacije

Kompleksna produkcija citokina i hemokina nakon prvog talasa migracije T ćelija na mesto elicitacije odgovorna je za drugi talas infiltracije ćelija u kožu, koji uključuje neutrofilne leukocite, T ćelije i inflamatorne monocite (Vocanson i drugi, 2009). In situ imunohistohemijska analiza isečaka obolele kože pacijenata sa AKD, pokazala je povećanu zastupljenost ćelija koje produkuju IL-2, IL-4, IFN-γ, IL-6, IL-10, IL-1α, IL-1β i TNF-α (Hoefakker i drugi, 1992; Ulfgren i drugi, 2000). U koži miša nakon elicitacije zabeleženo je povećanje ekspresije gena za IL-β, IL-10, IL-6 i GM-CSF (eng. Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor) ( Kondo i drugi, 1994). 
TNF-α je značajan za ekpresiju KP na šta ukazuju podaci o smanjenju otoka uha nakon elicitacije reakcije kod miševa čija je koža tretirana sa anti-TNF-α antitelima neposredno pre elicitacije (Piguet i drugi, 1991). Pored toga, histološka analiza isečaka kože uha nakon elicitacije miševa sa delimičnim ili potpunim odsustvom ekspresije gena za TNF-α (TNF-α -/-) pokazala je smanjenu vaskularnu propustljivosti i smanjen broj inflamatornih ćelija u dermu (neutrofila, mononukleara i eozinofila), u odnosu na miševe kod kojih je ovaj gen eksprimiran (wild type) (Shibata i drugi, 2005). In situ hibridizacija pokazala je da su izvor ovog citokina pretežno bazalni keratinociti, ali da ga produkuju i ćelije dermalnog infiltrata (Piguet et al., 1991). 
Inhibicija KP kod miševa sa delimičnim ili potpunim odsustvom ekspresije gena za IL-1 (IL-1α/β -/-) u fazi elicitacije se prevazilazi dodavanjem TNF-α. Pretpostavlja se da IL-1 podstiče ekspresiju TNF-α u fazi elicitacije, koji dalje, posredstvom IP-10, podstiče migraciju inflamatornih ćelija u kožu. Takođe, TNF-α podstiče ekspresiju iRNK za IL-1α i IL-1β, što sugeriše da ovi citokini amplifikuju međusobnu ekspresiju (Nakae i drugi, 2003). 
Iako je produkcija IL-2 povećana u uhu nakon elicitacije miševa, nezavisno od korišćenog haptena (Ulrich i drugi, 2001), kao i u koži pacijenata nakon izlaganja kontaktnom alergenu ( Ulfgren i drugi, 2000), eksperimentalna istraživanja ukazuju na to da ovaj citokin nije neophodan za ekspresiju reakcije KP. Naime, korišćenje miševa sa potpunim ili delimičnim odsustvom ekspresije gena za IL-2 (IL-2 -/-) ( Hope i drugi, 2000), ili tretman miševa sa anti-IL-2R antitelima pre elicitacije (Piguet i drugi, 1991), nisu uticali na intenzitet reakcije KP. Hope i drugi su pokazali da, iako IL-6 doprinosi proliferaciji T ćelija nakon senzibilizacije miševa, uloga ovog citokina nije kritična za indukciju efektorskih ćelija, već za razvoj zapaljenske reakcije na mestu elicitacije reakcije, verovatno podsticanjem infiltracije leukocita (Hope i drugi, 2000). Povećanje produkcije IL-6, zajedno sa povećanjem nivoa akutno-faznih proteina, zabeleženo je i u plazmi životinja nakon elicitacije. Korelacija koncentracije cirkulišućeg IL-6 sa otokom uha, ukazuje na značaj ovog citokina u ekspresiji reakcije (Kimber i drugi, 1990), moguće efektom na oslobađanje granulocita iz koštane srži ili marginalnog pula u cirkulaciju ( Ulrich i drugi, 1989). 
Azot monoksid (NO) je biološki medijator koji je u malim koncentracijama važan za procese kao što su vazodilatacija i neurotransmisija, dok u većim koncentracijama ima značajnu ulogu u odbrani organizma od različitih parazita i tumorskih ćelija (Ross i drugi, 1998). Fiziološka uloga NO značajna je u održavanju homeostaze u koži, ali ovaj medijator može doprineti i razvoju kožnih bolesti (Weller, 2003). Ross i drugi su pokazali da elicitacija miševa povećava ekspresiju gena za iNOS (eng. inducible Nitric Oxide Synthase), jednog od tri izoenzima neophodnih za produkciju NO, u keratinocitima i Langerhansovim ćelijama, sugerišući ulogu ovog medijatora u ekspresiji reakcije KP (Ross i drugi, 1998). iNOS reaktivnost zabeležena je i u oboleloj koži pacijenata sa AKD (Ford i drugi, 1997). 
Migracija leukocita je obeležje imunskog odgovora, a hemokini su faktori važni u njenoj regulaciji, kako u fiziološkim tako i u patološkim stanjima. Analiza isečaka kože (hibridizacijom in situ) senzibilisanih osoba nakon nanošenja alergena pokazala je kompleksnu ekspresiju različitih citokina sa hemoatraktantnim svojstvima, koji vremenski i prostorno kontrolišu migraciju leukocita na mesto elicitacije (Goebeler i drugi, 2001) (nazivi hemokina koji učestvuju u ekspresiji kontaktne preosetljivosti i njihovi receptori predstavljeni su u Tabeli 1). Najranije produkovani hemokin je CCL2, prisutan u bazalnom epidermu već šestog časa nakon kontakta kože sa haptenom, kao posledica proinflamatornog efekta samog haptena. Početna infiltracija limfocita u derm kože stimulisana je produkcijom hemokina CCL5, CCL2, CCL17, CCL18 i/ili CCL22 u dermu. Dalje (nakon 48h), povećana ekspresija CXCL9 i CXCL10 u epidermu obezbeđuje hemoatraktantni signal za T limfocite koji eksprimiraju receptor CXCR3 (Goebeler i drugi, 2001), i koji čine 70% T limfocita koji su migrirali u obolelu kožu kod pacijenata sa AKD (Sebastiani i drugi, 2002). Komparativna analiza zastupljenosti hemokinskih receptora na površini CD4 + i CD8 + T ćelija specifičnih za nikl, pokazala je povećanu ekspresiju CXCR3 na CD8 + i CCR4 na CD4 + T ćelijama, ukazujući da obrazac migracije ove dve populacije ćelija može biti pod kontrolom produkovanih hemokina (Sebastiani i drugi, 2002). U KP kod miševa takođe je pokazano učešće 

Reakcija kontaktne preosetljivosti

Životinje su senzibilisane tako što im je na dorzalnu površinu prethodno ošišane kože nanošen DNCB rastvoren u aceton/maslinovo ulje (rastvarač), tokom dva uzastopna dana. 

Histologija

Isečci kože uha uzeti 24 časa nakon elicitacije fiksirani su u 4% formalinu (pH 6.9), nakon čega su sukcesivno sprovođeni kroz seriju etanola rastuće koncentracije (70%, 86%, 96% i 100%), ksilol i zatim su kalupljeni u parafin. Pravljeni su preseci tkiva debljine 5 μm i bojeni hematoksilinom i eozinom. Histološki preparati su zatim analizirani pomoću digitalnog svetlosnog mikroskopa (Coolscope, Nikon Co, Japan). 
Kvantitativna analiza vršena je brojanjem mononuklearnih ćelija na najmanje 30 vidnih polja uvećanja 100x koja su zahvatala čitavu površinu preseka, i pod imerzionim uljem, nakon čega je računata srednja vrednost broja ćelija na polje (po uzorku). Kvantitativna analiza broja mast ćelija vršena je na isečcima bojenim sa Gimsom (Giemsa). 

Ispitivanje karakteristika imunskog odgovora u

drenirajućim limfnim čvorovima Foxp3 + pozitivnih ćelija u ukupnoj populaciji ćelija dLČ, na uzorcima pojedinačnih životinja. 
U svim analizama, nivo autofluorescence određivan je na kontrolnim uzorcima kojima nisu dodata antitela, i ona je bila manja od 0.5 % pozitivnih ćelija. 

Produkcija citokina od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora

Za određivanje produkcije citokina od strane ćelija drenirajućih limfnih čvorova, zasejavano je 5x10 Rezultati su prikazani kao relativne vrednosti preračunati u odnosu na kontrolnu grupu. 

Mehanizmi indukcije reakcije


Produkcija i ekspresija IL-17 od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora tokom faze senzibilizacije

Spontana produkcija IL-17 povećana je prvog dana samo kod jedinki AO soja senzibilisanih samo sa višom dozom DNCB-a, i trećeg dana kod jedinki oba soja senzibilisanih i sa 0.4% i sa 4% DNCB-om, u odnosu na nesenzibilisane jedinke (Slika 6A). 
In vitro stimulacija ćelija SdLČ sa DNBS-om dovela je do dozno-zavisnog povećanja specifične produkcije kod jedinki DA soja trećeg i petog dana, dok kod AO pacova nije zapažena promena produkcije IL-17 u odgovoru na in vitro antigensku stimulaciju (Slika 6B). 
Ekspresija gena za IL-17 je veća kod senzibilisanih u odnosu na nesenzibilisane životinje kod oba soja (Slika 6C). Ex vivo proliferativni odgovor ćelija EdLČ pokazao je dozno-zavisno povećanje kod jedinki DA soja, dok je kod jedinki AO soja nepromenjen, u odnosu na kontrolne jedinke (Slika 13B). 

Mehanizmi ekspresije reakcije KP kod pacova

Kod jedinki DA soja zabeleženo je dozno-zavisno povećanje proliferativnog odgovora nakon stimulacije ćelija sa egzogenim IL-2, dok ćelije AO soja nisu odgovorile promenom proliferativne aktivnosti nakon stimulacije sa IL-2 (Slika 13C). 
Analizom membranske ekspresije α lanca receptora za IL-2 utvrđeno je povećanje procentualne zastupljenosti CD25 + ćelija (kao i njihovog ukupnog broja) u 
EdLČ jedinki DA soja tretiranih sa DNCB-om, mada je pri nižoj dozi samo numeričko povećanje (p=0.08). Takođe, kod jedinki ovog soja utvrđeno je povećanje srednjeg intenziteta fluorescence (SIF) nakon primene svake od doza DNCB-a, u odnosu na kontrolne životinje. Kod AO soja procentualna zastupljenost CD25 + ćelija je nepromenjena kod jedinki tretiranih DNCB-om u odnosu na kontrolne jedinke, dok je nakon preračunavanja ukupnog broja utvrđeno statistički značajno, i numeričko povećanje (p=0.1) kod jedinki tretiranih nižom (tretman 0.4%/0.13) i višom (4%/1.3%) dozom, redom. SIF je povećan kod jedinki ovog soja tretiranih samo sa višom dozom DNCB-a. Ispitivani parametri u svim eksperimentalnim grupama niži su kod AO u odnosu na DA soj (Tabela 4). 
Specifičnost proliferacije ćelija EdLČ ispitana je pomoću in vitro stimulacije ovih ćelija sa DNBS-om. Samo ćelije EdLČ jedinki DA soja kod kojih je reakcija KPizazvana nanošenjem više doze DNCB-a (tretman 4%/1.3%), odgovorile su na egzogeno dodati hapten povećanjem proliferativne aktivnosti (Slika 13D). 

Metabolička vijabilnost ćelija drenirajućeg limfnog čvora u fazi elicitacije

Jedan od uzroka nepromenjene proliferacije i odsustva responsivnosti na stimulaciju sa IL-2 i haptenom kod jedinki AO soja, može biti povećano umiranje ćelija u kulturi. Iz tog razloga, ispitana je metabolička vijabilnost ćelija, merena pomoću kolorimetrijskog MTT testa (Oez i drugi, 1990). MTT indeks, predstavljen kao odnos redukcije MTT u kulturi ćelija gajenih 24 časa (24h), i sveže izolovanih ćelija (0h), a koji ilustruje stepen preživljavanja ćelija, povećan je kod jedinki DA soja nakon primene samo niže doze DNCB-a (0.4%/0.13%) i kod jedinki AO soja nakon primene samo više doze (tretman 4%/1.3%), u odnosu na kontrolne jedinke (tretman 0%/0%). 
MTT indeks se nije promenio kod jedinki DA pacova nakon primene više doze DNCBa, u odnosu na kontrole, verovatno kao posledica povećane MTT redukcije i 0h (p=0.03) i 24h (numeričko povećanje p=0.1) (Slika 14). 

Zastupljenost CD4 + i CD8 + ćelija u drenirajućem limfnom čvoru u fazi elicitacije

Kod jedinki oba soja zabeleženo je smanjenje procentualne zastupljenosti CD4 + ćelija nakon primene svake od doza DNCB-a (mada je kod jedinki AO soja pri primeni više doze samo numeričko sniženje, p=0.1), i povećanje procentualne zastupljenosti CD8 + ćelija, nakon primene svake od doza kod DA soja (Tabela 5A) i samo više doze kod AO soja (Tabela 5B). Ove promene dovele su do smanjenja odnosa CD4 + /CD8 + ćelija, nakon primene svake od doza, kod oba soja. Preračunavanjem ukupnog broja CD4 + i CD8 + ćelija utvrđen je nepromenjen broj CD4 + ćelija, i povećan broj CD8 + ćelija nakon primene svake od doza kod jedinki DA soja, dok je kod AO soja povećanje ukupnog broja i CD4 + i CD8 + ćelija utvrđeno nakon primene samo više DNCB doze (ali značajno niži broj CD8 + ćelija u odnosu na jedinke DA soja). Nakon in vitro stimulacije ćelija sa DNBS-om došlo je do porasta specifične produkcije ovog citokina samo kod jedinki DA soja, nakon primene svake od doza DNCB-a (tretman 0.4%/0.13% i 4%/1.3%), u odnosu na kontrole (tretman 0%/0%) (Slika 16B). 
Ekspresija gena za IFN-γ povećana je kod jedinki DA soja nakon primene svake od doza DNCB-a, dok je kod jedinki AO soja zabeleženo povećanje ekspresije gena samo pri višoj DNCB dozi (Slika 16C), u odnosu na kontrole, ali značajno niže u odnosu na DA soj. vrednost ekspresije gena iz dva eksperimenta ± SD. Statistički značajne razlike * p<0.05 u odnosu na 0%/0% DNCB odgovarajućeg soja. 

Produkcija i ekspresija IL-17

Spontana produkcija IL-17 povećana je kod jedinki DA soja nakon primene svake od doza DNCB-a (tretmani 0.4%/0.13% i 4%/1.3%), dok kod senzibilisanih jedinki AO soja elicitacija reakcije nije promenila spontanu produkciju IL-17 od strane ćelija EdLČ, u odnosu na kontrole (tretman 0%/0%) (Slika 17A). Nakon in vitro stimulacije ćelija EdLČ sa DNBS-om, zabeleženo je dozno-zavisno povećanje produkcije IL-17 samo kod jedinki DA soja (Slika 18B). 
Ekspresija gena za ovaj citokin nije promenjena kod jedinki DA soja, dok je kod jedinki AO soja zabeležena tendencija (p=0.07) povećanja ekspresije gena za IL-17 nakon primene samo više doze DNCB-a, u odnosu na kontrolne jedinke (Slika 18C). Utvrđeno je povećanje produkcije IL-4 samo kod jedinki AO soja nakon primene niže (numeričko povećanje, p=0.1) i više doze DNCB-a (tretman 0.4%/0.13% i 4%/1.3% redom), u odnosu na kontrole (0%/0%) (Slika 19A). 
Ekspresija gena za IL-4 povećana je samo kod jedinki AO soja nakon senzibilizacije i elicitacije samo sa višom dozom DNCB-a, u odnosu na kontrole (Slika 19B). CD4 + CD25 + Foxp3 + ćelija u EdLČ nakon nanošenja DNCB-a, u odnosu na kontrolne jedinke. Kod AO soja procentualna zastupljenost CD4 + CD25 + Foxp3 + povećana je nakon primene i niže i više doze DNCB-a (statistički značajno povećanje pri nižoj dozi i tendencija povećanja pri višoj dozi, p=0.086), dok je povećanje ukupnog broja CD4 + CD25 + Foxp3 + ćelija zabeleženo nakon primene samo više DNCB doze, u odnosu na kontrole (Tabela 6). 
Ekspresija gena za TGF-β, anti-inflamatorni citokin značajan za imunosupresivnu aktivnost CD4 + CD25 + Foxp3 + T ćelija (Josefowicz i drugi, 2012), nije promenjena nakon elicitacije reakcije KP kod senzibilisanih jedinki DA soja (0.9±0.7 i 1.2±0.8 za tretman 0.4%/0.13% i 4%/1.3% redom), kao ni AO soja (0.7±0. 4 Naime, ova grupa autora pokazala je da CD4 + CD25 + T ćelije izolovane iz krvi zdravih osoba suprimiraju in vitro aktivnost T ćelija specifičnih za nikl, za razliku od istih ćelija izolovanih iz krvi pacijenata alergičnih na nikl, kod kojih je supresorska aktivnost smanjena ili odsutna (Cavani i drugi, 2003). In vivo tretman miševa sa anti-CD25 + antitelima, u vreme senzibilizacije, vodi povećanoj aktivaciji efektorskih CD8 + T ćelija, Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti sledeće: 
1. Epikutano nanošenje DNCB-a kod pacova DA i AO soja dovodi do razvoja zapaljenske reakcije specifične za hapten, sa povećanjem in vivo/ex vivo (otok uha/histopatološke promene u uhu) parametara reakcije kontaktne preosetljivosti kod oba soja, ali koje su izraženije kod DA u odnosu na AO soj. 
Faza senzibilizacije reakcije kontaktne preosetljivosti: 
2. U drenirajućem limfnom čvoru senzibilisanih jedinki dolazi do: 
povećanja celularnosti i proliferativne aktivnosti ćelija kod oba soja, ali izraženije kod DA u poređenju sa AO sojem; -promene zastupljenosti CD4 + i CD8 + ćelija, sa različitim obrascem promena između dva soja: povećanje odnosa CD4 + /CD8 + ćelija kod DA soja i sniženja ovog odnosa kod AO Takođe, s obzirom da je pacov vrsta koja se najčešće koristi u imunotoksičnim i imunofarmakološkim istraživanjima, rezultati ove disertacije omogućavaju primenu KP na ovoj vrsti za ispitivanje imunomodulatornog potencijala hemijskih agenasa, posebno onih koji dospevaju u organizam preko kože. 

Literatura




  Ivana Mirkov naučni saradnik Instituta za biološka istraživanja "Siniša Stanković" Univerziteta u Beogradu Dr Milena Kataranovski redovni profesor Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu i naučni savetnik Instituta za biološka istraživanja "Siniša Stanković" Univerziteta u Beogradu ČLANOVI KOMISIJE: Dr Ivana Mirkov naučni saradnik Instituta za biološka istraživanja "Siniša Stanković" Univerziteta u Beogradu Dr Milena Kataranovski redovni profesor Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu i naučni savetnik Instituta za biološka istraživanja "Siniša Stanković" Univerziteta u Beogradu Dr Ljiljana Medenica redovni profesor Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu Dr Dragana Vučević redovni profesor Medicinskog fakulteta Vojnomedicinske akademije Univerziteta odbrane u Beogradu 


Ključne reči:

  Reakcija kontaktne preosetljivosti; DNCB; Faza senzibilizacije; Faza elicitacije reakcije; DA i AO pacovi; Drenirajući limfni čvorovi; Organokultura eksplantata kože uha. Naučna oblast: Biologija Uža naučna oblast: Imunobiologija UDK broj: [599.323.45 : 57.082][616.6-002 : 57.083.32] (043.3) 3.3. Reakcija kontaktne preosetljivosti 3.4. Histologija 3.5. Ispitivanje karakteristika imunskog odgovora u drenirajućim limfnim čvorovima 3.5.1. 




  Hope i drugi, 1994; Dearman i drugi, 2005; Igyarto i drugi, 2009) ili ponovljenim (Nagai i drugi, 2000; Kish i drugi, 2009; Kish i drugi, 2011) nanošenjem haptena na dorzalnu ili ventralnu površinu kože, dok se elicitacija izaziva nanošenjem istog haptena na površinu uha, tri dana nakon senzibilizacije (Weigmann i drugi, 1997; Gautam i drugi, 1992), ako je višekratna aplikacija haptena u elicitaciji, ili pet dana (Hope i drugi, 2000; Salerno i drugi, 1995; Traidl i drugi, 1999), ili kasnije (Scott i drugi, 2002; Hartmann i drugi, 2006), ako je jednokratna aplikacija haptena. Na pacovskom modelu bolesti, reakcija se indukuje nanošenjem haptena na dorzalnu površinu kože dva (Skoglund i Scheynius, 1990) ili tri dana (Arts i drugi, 1996) zaredom, dok se elicitacija reakcije vrši nanošenjem haptena na uho najčešće petog dana nakon senzibilizacije (Skoglund i Scheynius, 1990; 


1. 4 . 1 . 1 .

 411 Mehanizmi urođene imunosti u fazi senzibilizacije Klinička zapažanja da iritantni efekat haptena (tj. sposobnost agensa da izazove vidljivu zapaljensku reakciju u koži nakon prvog nanošenja) korelira sa njegovim potencijalom senzibilizacije, ukazala su na značaj aktivacije urođene imunosti od strane haptena za izazivanje AKD (Kaplan i drugi, 2012). U prilog ovoj tvrdnji idu podaci McLelland i Shuster, koji su pokazali da primena iritanasa na mestu aplikacije niklsulfata kod senzibilisane osobe izaziva intenzivniju reakciju (McLelland i Shuster, 1990). Urođena imunost predstavlja prvu liniju odbrane organizma tako što detektuje prisustvo i prirodu ne samo infekcije, već bilo kojeg fizički ili hemijski izazvanog oštećenja ćelija ili tkiva, i kontroliše razvoj adaptivnog imunskog odgovora. Ćelije urođene imunosti prepoznaju konzervisane molekulske obrasce zajedničke za različite klase mikroba (eng. PAMP, Pathogen-Associated Molecular Patterns), a koje se ne eksprimiraju na ćelijama domaćina. PAMP obuhvataju nukleinske kiseline, proteine, šećere, i lipide, karakteristične za mikrobe. Ćelije imunskog sistema prepoznaju ove molekulske obrasce preko nekoliko tipova ćelijskih receptora, različito lokalizovanih u ili na ćeliji, nazvanih receptori za molekulske obrasce (eng. PRR, Pattern Recognition Receptors) (Zhang i Mosser, 2008). Iako su PRR prvobitno identifikovani kao receptori za molekulske obrasce mikroorganizama, veliki broj istraživanja je pokazao da kod određenih patoloških stanja i endogeni molekuli mogu biti ligandi za ove receptore, obaveštavajući imunski sistem o prisustvu tkivnog oštećenja, a sa ciljem aktivacije mehanizama kojima se to oštećenje može popraviti. Ovi endogeni molekuli, poreklom od oštećenih ili umirućih ćelija, označeni su kao molekulski obrasci oštećenja (eng. DAMP, Damage-Associated Molecular Patterns) (Gallucci i Matzinger, 2001). Primeri molekula koji mogu delovati kao DAMP su: proteini toplotnog šoka (eng. HSP, Heat Shock Proteins), HMGB1 (eng. High Mobility Group protein Box1), RNK (ribonukleinska kiselina), DNK (dezoksiribonukleinska kiselina), hijaluronan, i heparan sulfat (Kaplan i drugi, 2012). Nedavna istraživanja pokazala su da PRR mogu biti aktivirani od strane kontaktnih alergena, što, kod osoba sklonih alergijama, vodi ekspresiji imunskog odgovora tj. AKD (Kaplan i drugi, 2012). Receptori slični Toll proteinu (eng. TLR, Toll-Like Receptor), članovi familije interleukin (IL)-1 receptora, su najbolje okarakterisani PRR. Do sada je identifikovano 13 TLR kod miševa i 11 kod ljudi, koji mogu prepoznati različite PAMP i DAMP ligande (Tsan i Gao, 2004; Zhang i Mosser, 2008). Nakon vezivanja odgovarajućeg liganda, pojedinačni TLR intereaguju sa različitom kombinacijom adaptorskih proteina, aktivirajući transkripcione faktore kao što su NF-kB (eng. Nuclear Factor-kappaB), MAP (eng. Mittogen Activated Protein) kinaze, IRF3 (eng. Interferon Regulatory Factor 3), što započinje specifičan imunski odgovor (Akira i drugi, 2006). Istraživanja koja su pokazala da kontaktni alergeni aktiviraju NF-kB i MAP kinaze (Takanami-Ohnishi i drugi, 2002; Aiba i drugi, 2003) navela su na ispitivanje uloge TLR u indukciji reakcije KP. Martin i drugi su prvi sugerisali značajnu ulogu TLR2 i TLR4 u reakciji KP kod miševa na TNCB, OXAZ, i fluorescein isotiocijanat (FITC) 




  slični NOD-u (eng. NLR, NOD-Like Receptor) su najveća familija unutarćelijskih receptora, koji prepoznaju PAMP i DAMP još uvek nedovoljno objašnjenim mehanizmom. Aktivacija ovih receptora, kao što je NLRP3, dovodi do formiranja kompleksa velike molekulske mase, nazvanog inflamazom (Martinon i drugi, 2009). Inflamazom čine oligomeri receptora i adaptorski molekul ASC (eng. Apoptosis-associated Speck-like protein containing CARD) za koji se vezuje prokaspaza-1. Vezivanje prokaspaze-1 za kompleks inflamazoma dovodi do njene aktivacije. Glavna funkcija kaspaze-1 je u aktivaciji neaktivnih formi citokina IL-1β i IL-18, čije oslobađanje doprinosi razvoju inflamacije (Martinon i drugi, 2009). Značaj inflamazoma u odgovoru na hapten pokazan je na miševima sa potpunim ili delimičnim odsustvom ekspresije gena za ASC i NLRP3 (Asc -/-i Nlrp3 -/-miševi), kod kojih je ekspresija reakcije KP na TNCB i DNFB smanjena. Pretpostavlja se da aktivacija inflamazoma obezbeđuje proinflamatorni signal bitan za senzibilizaciju T ćelija (Watanabe i drugi, 2007). Predloženi model delovanja inflamazoma u aktivaciji T ćelija podrazumeva aktivaciju ovog kompleksa od strane haptena, kao što je DNFB, što dovodi do produkcije IL-1β. Ovaj citokin dalje podstiče ekspresiju IL-6 i IL-12 u dLČ, stvarajući sredinu koja favorizuje Th1/tip1 imunski odgovor i inhibira aktivnost regulatornih T ćelija (Treg). Ova istraživanja pokazala su da je za indukciju senzibilizacije, pored antigenog svojstva haptena, neophodan i tzv. signal opasnosti (koji obezbeđuju molekuli patogena, ili molekuli oslobođeni iz tkiva oštećenog usled infekcije ili sterilne inflamacije), koji aktivira inflamazom uz posledičnu produkciju IL-1β. Za razliku od DNFB-a koji obezbeđuje i jedan i drugi signal i s toga može da dovede do indukcije reakcije KP, dinitrotiocijanobenzen (DNTB) koji normalo obezbeđuje samo antigenost (nedostaje signal opasnosti koji bi aktivirao inflamazom i IL-1β) indukuje tolerancu pre nego senzibilizaciju (Watanabe i drugi, 2008). 


1 . 4 . 1 . 3 . 1 .

 14131 Interakcija TCR sa kompleksom hapten/peptid i MHC molekul, i obezbeđivanje kostimulatornog signala, započinje aktivacionu kaskadu koja dovodi do proliferacije i diferencijacije T ćelija specifičnih za hapten(Rustemeyer i drugi, 2012). Kao što je već pomenuto, produkcija citokina, od kojih mnoge produkuju DĆ, takođe je neophodna za T-ćelijsku aktivaciju, proliferaciju i diferencijaciju (Vocanson i drugi, 2009). Ubrzo nakon nanošenja haptena u fazi senzibilizacije KP, ćelije dLČ započinju proliferaciju (Saint-Mezard i drugi, 2004a), zavisnu od produkcije IL-1, IL-2 i IL-6 (Hope i drugi, 2000;Nakae i drugi, 2001), mada pojedini istraživači dovode u pitanje povezanost produkcije IL-6 i limfoproliferativne aktivnosti u dLČ nakon senziblizacije pojedinih sojeva miševa(Lappin i drugi, 1998). Klinička i eksperimentalna istraživanja sugerisala su značaj i CD4 + i CD8 + T ćelija za razvoj AKD (Kalish i Johanson, 1990; Kalish i drugi, 1994;Gocinski i Tigelaar, 1990). Tip citokina koji se produkuje u toku interakcije T ćelije i DĆ određuje diferencijaciju aktivisanih CD8 + i CD4 + T ćelija. IL-12, IL-4 ili kombinacija IL-6/IL-21/IL-23 sa ili bez TGF-β, podstiču diferencijaciju naivnih T ćelija u Th1/tip1 ćelije (koje produkuju IFN-γ, IL-2 i TNF-α), Th2/tip2 ćelije (produkuju IL-4, IL-10, IL-13 i IL-5) ili Th17/tip17 ćelije (produkuju IL-17A, IL-17F, IL-21 i IL-22), redom (Vocanson i drugi, 2009). Istraživanja na miševima pokazala su da je polarizacija T ćelija tipa 1 neophodna za optimalan razvoj AKD (Vocanson i drugi, 2009). Xu i drugi su pokazali da nakon senzibilizacije miševa sa DNFB-om i OXAZ-om, u dLČ dolazi do polarizacije dve funkcionalno različite populacije T ćelija: efektorskih CD8 + T ćelija (Tc1) koje produkuju IFN-γ, i CD4 + T ćelija (Th2) sa negativnom regulatornom ulogom, koje produkuju IL-4/IL-10 (Xu i drugi, 1996). Ova grupa je sugerisala da je diferencijacija CD4 + T ćelija ka Th2 profilu verovatno posledica odsustva ili niske produkcije IL-12 u toku senzibilizacije specifičnih T ćelija, s obzirom da razvoj Th1 ćelija uglavnom zavisi od prisustva ovog citokina. Aktivacija protektivnog Th2 imunskog odgovora u fazi senzibilizacije ima za ulogu ograničenje imunske aktivnosti koja može dovesti do imunopatologije. U vezi sa tim, pokazano je da tretman životinja sa anti-IL-4-antitelima u toku senzibilizacije intenzivira ekspresiju KP (Xu i drugi, 1996; Gorbachev i drugi, 2001b). Nasuprot ovim istraživanjima, postoje podaci i o značaju IL-4 za indukciju i razvoj KP kod miševa (Yokozeki i drugi, 2000), kao i podaci da uloga IL-4 u indukciji KP zavisi od genetičke pozadine korišćenih miševa (Nagai i drugi, 2000). Nedavno, produkcija IL-17 u fazi senzibilizacije je zabeležena kod miševa (He i drugi, 2006) i ljudi (Larsen i drugi, 2008), i sugerisan je značaj Th17 ćelija za razvoj efektorskih T ćelija u ovoj fazi KP (He i drugi, 2009). Nastanak efektorskih i memorijskih T ćelija Nakon aktivacije T ćelija specifičnih za hapten u fazi senzibilizacije, one napuštaju dLČ usled promene u ekspresiji hemokinskih receptora, i ulaze u cirkulaciju (Vocanson i drugi, 2009). Specifične T ćelije kod kojih se smanjuje ekspresija CCR7, gube sposobnost recirkulacije i migracije u LČ. CCR7 -T ćelije čine efektorske i efektorske memorijske T ćelije (ćelije periferne memorije) koje migriraju u periferna tkiva, pre svega kožu. Ove ćelije eksprimiraju CCR4 i/ili CCR10, α4β1 integrin i CLA, koji su neophodni za njihovu migraciju u kožu (Vocanson i drugi, 2009). CCR7 + specifične T ćelije čine drugu populaciju memorijskih ćelija, takozvane centralne memorijske ćelije, i one zadržavaju sposobnost recirkulacije između krvi i LČ, ali ne migriraju u periferna tkiva. Efektorske i efektorske memorijske T ćelije obezbeđuju brz i efikasan imunski odgovor nakon ponovnog kontaka kože sa haptenom, dok centralne memorijske ćelije imaju ulogu u očuvanju relativno visoke zastupljenosti T ćelija specifičnih za hapten (Sallusto i drugi, 1999; Vocanson i drugi, 2009). 


10 (

 10 hemokina CXCL10 (Nakae i drugi, 2003; Gautam i drugi, 1994) i CCL2 (Gautam i drugi, 1994) u ekspresiji reakcije, posredstvom stimulacije migracije T ćelija specifičnih za hapten u kožu. Za migraciju neutrofila u obolelu kožu su odgovorni hemokini CXCL1 i CXCL8 kod ljudi (Sebastiani i drugi, 2002; Dilulio i drugi, 1999), tj. CXCL2 (funkcionalni analog humanog IL-8) kod miševa (Biedermann i drugi, 2000). U rezoluciji kontaktne preosetljivosti hemokini CCL1 i CCL20 mogu imati značajnu ulogu, putem stimulacije migracije CCR8 + regulatornih T ćelija koje produkuju IL-Tr ćelije) i CCR8 + CD4 + regulatornih T ćelija, redom, u kožu (Sebastiani i drugi, 2002; Varona i drugi, 2001). 




  Real-time PCR (Higuchi i drugi, 1993) služi za detekciju produkata PCR amplifikacije u toku eksponencijalne faze, u kojoj se, u toku svakog ciklusa, količina DNK duplo uvećava. U eksponencijalnoj fazi postoji kvantitativni odnos između početne količine uzorka i količine PCR produkta koji nastaje u određenom ciklusu. Detekcija je vršena pomoću fluorescentne probe SYBRGreen koja se nespecifično vezuje za lanac DNK. Amplifikacija 4 μl 10 puta razblažene cDNK, u 20 μl reakcione smeše za PCR, rađena je u Real-Time PCR aparatu (Applied Biosystems, Foster City, CA) upotrebom SYBRGreen PCR master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Reakcija se sastojala iz sledećih ciklusa: aktivacije dUTP (10 minuta na 50 o C), inicijalne denaturacije cDNK (10 minuta na 95 o C), nakon čega je sledilo 40 ciklusa amplifikacije cDNK. Svaki ciklus sastojao se iz denaturacije (15 s na 95 o C), i vezivanja prajmera za lanac cDNK (aniling) i sinteze novog lanca cDNK (ekstenzija/elongacija) (1 min na 60 o C). Određivan je nivo ekspresije gena za IL-17, IFN-, IL-4, IL-10, p35, p40, T-bet, TGF-β. Parovi prajmera korišćeni u reakciji su prikazani u Tabeli 1. Ekspresija gena izračunavana je prema formuli 2 -(ΔCt) , gde je ΔCt razlika između broja ciklusa na komese pojavljuje fluorescentni signal za ispitivani gen i broja ciklusa za gen za β-actin (tzv. house-keeping gen) prema kome se normalizuje ekspresija ispitivanog gena. 


Tabela 1 .

 1 Sekvence korišćenih oligonukleotida (prajmera) 


Slika 2 .

 2 Patohistološke promene na presecima kože uha u fazi elicitacije reakcije kontaktne preosetljivosti. Kontrolne životinje DA (A) i AO (B) soja, kojima je nanošen rastvarač. Tretman 0.4%/0.13% kod DA (C) i AO soja (D): kongestija krvnih sudova. Tretman 4%/1.3% kao DA soja (E): ulceracija, izrazit edem derma, gust infiltrat u dermu; kod AO soja (F): edem derma, gust mononuklearni infiltrat u dermu (hematoksilin i eozin, uvećanje 10x). 


Slika 5 .

 5 Produkcija IFN-γ i ekspresija gena za ovaj citokin od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora u toku faze senzibilizacije. Spontana produkcija IFN-γ (A) i specifična produkcija (nakon in vitro stimulacije na DNBS-om, 10μg/ml kulture) (B) od strane ćelija SdLČ kod jedinki DA i AO soja. Količina iRNK za IFN-γ određena RT-PCR metodom u ćelijama SdLČ petog dana senzibilizacije (C). Rezultati su prikazani kao srednja vrednost produkcije iz najmanje tri nezavisna eksperimenta ± SD, tj. kao arbitrarne vrednosti ekspresije gena iz dva eksperimenta ± SD. Statistički značajne razlike: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 u odnosu na kontrolne jedinke i # p<0.05 u odnosu na 0.4% DNCB, odgovarajućeg soja; s p<0.05 u odnosu na jedinke DA soja. 


4 . 2 . 3 . 3 .

 4233 limfnog čvora u toku faze senzibilizacije. Spontana produkcija IL-17 (A) i specifična produkcija (B) od strane ćelija SdLČ kod jedinki DA i AO soja. Količina iRNK za IL-17 određena RT-PCR metodom u ćelijama SdLČ petog dana senzibilizacije (C). Rezultati su prikazani kao srednja vrednost produkcije iz najmanje tri nezavisna eksperimenta ± SD, tj. kao arbitrarne vrednosti ekspresije gena iz dva eksperimenta ± SD. Statistički značajne razlike: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 u odnosu na kontrolne jedinke i # p<0.05 u odnosu na 0.4% DNCB, odgovarajućeg soja. Produkcija i ekspresija IL-4 od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora tokom faze senzibilizacije S obzirom da su spontana i DNBS-stimulisana produkcija IL-4 bile ispod nivoa detekcije, produkcija ovog citokina ispitana je nakon stimulacije ćelija sa ConA (1 μg/ml kulture). Rezultati su pokazali nepromenjenu produkciju IL-4 kod senzibilisanih u odnosu na nesenzibilisane jedinke oba soja, i u svim ispitivanim terminima (Slika 7A), kao i nepromenjenu ekspresiju gena za ovaj citokin petog dana senzibilizacije (Slika 7B). 


Slika 7 . 4 . 2 . 3 . 4 .

 74234 Produkcija IL-4 i ekspresija gena za ovaj citokin od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora u toku faze senzibilizacije. Produkcija IL-4 nakon in vitro stimulacije ćelija SdLČ sa ConA (1 μg/ml kulture) (A) kod jedinki DA i AO soja. Količina iRNK za IL-4 određena RT-PCR metodom u ćelijama SdLČ petog dana senzibilizacije (B). Rezultati su prikazani kao srednja vrednost produkcije iz najmanje tri nezavisna eksperimenta ± SD, tj. kao arbitrarne vrednosti ekspresije gena iz dva eksperimenta ± SD. Produkcija i ekspresija IL-10 od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora tokom faze senzibilizacije Porast spontane produkcije IL-10 zabeležen je kod senzibilisanih jedinki DA soja samo prvog dana senzibilizacije, nakon primene niže doze (numerički porast, p=0.08) i više doze DNCB-a. Kod AO soja porast je zabeležen samo na nižoj dozi, trećeg dana nakon poslednje DNCB aplikacije (Slika 8A). Nakon in vitro stimulacije ćelija sa DNBS-om utvrđena je značajno veća produkcija IL-10 kod jedinki DA soja prvog dana nakon senzibilizacije samo sa visokom dozom, i trećeg dana nakon senzibilizacije i sa nižom dozom (numeričko povećanje, p=0.088) i sa višom dozom, u odnosu na kontrole. Kod jedinki AO soja nije zapažena promena u specifičnoj produkciji ovog citokina (Slika 7B). Ekspresija gena za IL-10 nepromenjena je kod jedinki DA soja, dok je kod jedinki AO soja zabeležen porast ekspresije gena za IL-10 nakon nanošenja samo niže DNCB doze, u odnosu na nesenzibilisane jedinke (Slika 8C). 


Slika 9 . 1 . 4 . 3 . 3 . Aktivnost ćelija drenirajućeg limfnog čvora nakon elicitacije reakcije kod senzibilisanih pacova 4 . 3 . 3 . 1 .

 914334331 Promene u gustini mononuklearnog infiltrata u koži uha 24 časa nakon elicitacije reakcije kontaktne preosetljivosti. Kvantitativna analiza obuhvatala je brojanje mononuklearnih ćelija na najmanje 30 polja uvećanja 100x koja su zahvatala čitavu površinu histoloških preseka tretiranog uha, bojenih hematoksilinom i eozinom. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost broja ćelija na polje, iz dva nezavisna eksperimenta ± SD. Statistički značajne razlike: ** p<0.01 u odnosu na kontrolne jedinke odgovarajućeg soja; s p<0.05 u odnosu na jedinke DA soja. Ispitivanje markera inflamacije (TNF-α, IL-1β, NO i unutarćelijski MPO) u kondicioniranom medijumu organokulture uha Povećana produkcija TNF-α, u odnosu na kontrolne jedinke, zabeležena je nakon primene samo više doze DNCB-a kod oba soja. Značajno viša produkcija TNF-α (p<0.05) je izmerena kod AO u odnosu na DA soj, u svim eksperimentalnim grupama (Slika 10A). Produkcija IL-1β nije se promenila nakon primene svake od doza elicitacije kod senzibilisanih životinja u odnosu na kontrolne životinje, kod oba soja (Slika 10B). Povećanje produkcije NO zapaženo je kod DA soja samo pri višoj dozi DNCBa, dok je kod AO soja produkcija NO nepromenjena, u odnosu na kontrolne jedinke (Slika 10C). Aktivnost enzima mijeloperoksidaze (MPO) ispitana je u ćelijama koje su migrirale iz kože u medijum u toku 48-časovne organokulture eksplanata kože uha, i indirektan je pokazatelj migracije granulocita u uho, ali i njihove aktivacije, nakon elicitacije reakcije. Značajno povećanje MPO aktivnosti zabeleženo je kod jedinki DA i AO soja tretiranih samo višom dozom DNCB-a, u odnosu na životinje tretirane rastvaračem, pri čemu je značajno veća aktivnost zapažena kod DA u odnosu na AO soj (Slika 10D).Slika 10. Koncentracija medijatora inflamacije (TNF-α, IL-1β, NO, MPO) u kondicioniranom medijumu organokulture uha. Koncentracija TNF-α (A), IL-1β (B) i NO (C) određivana je u medijumu u kome su kultivisani eksplanti tretirane kože uzete 24 časa nakon elicitacije reakcije kontaktne preosetljivosti. Aktivnost MPO (D) određivana je unutar ćelija koje su migrirale iz kože u medijum u toku 48-časovne organokulture eksplanata tretirane kože. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost produkcije tj. aktivnosti enzima na 10 6 ćelija, iz najmanje dva nezavisna eksperimenta ± SD. Statistički značajne razlike: * p<0.05, ** p<0.01 u odnosu na 0%/0% odgovarajućeg soja; s p<0.05, ss p<0.01 u odnosu na jedinke DA soja. Promena broja ćelija i njihove proliferativne aktivnosti u drenirajućem limfnom čvoru u fazi senzibilizacije Broj ćelija u EdLČ je povećan nakon elicitacije reakcije KP kod jedinki DA soja tretiranih sa obe doze DNCB-a (tretman 0.4%/0.13% ili 4%/1.3%) u odnosu na kontrole (tretman 0%/0%), dok je kod jedinki AO soja zabeleženo numeričko povećanje(p=0.076) broja ćelija nakon primene samo više doze DNCB-a u odnosu na kontrole, ali značajno niže nego kod jedinki DA soja (p=0.02) (Slika 13A). 


Slika 13 .

 13 Broj ćelija drenirajućeg limfnog čvora i njihova proliferativna aktivnost nakon elicitacije reakcije kontaktne preosetljivosti. Drenirajući limfni čvorovi uha (aurikularni) (EdLČ) uzeti su 24 časa nakon elicitacije reakcije, nakon čega je određena njihova celularnost (A). Ex vivo proliferativna aktivnost ćelija EdLČ (B), proliferativna aktivnost nakon in vitro stimulacije ćelija sa IL-2 (50 jedinica/ml kulture) (C) i proliferativna aktivnost nakon in vitro stimulacije ćelija sa DNBS-om (10 μg/ml kulture) (D). Rezultati su prikazani kao srednja vrednost iz najmanje tri nezavisna eksperimenta ± SD. Statistički značajne razlike: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 u odnosu na 0%/0% i # p<0.05, ### p<0.001 u odnosu na 0.4%/0.13% DNCB, odgovarajućeg soja; s p<0.05 u odnosu na jedinke DA soja. Tabela 4. Ekspresija CD25 molekula na površini ćelija drenirajučeg limfnog čvora u 


Slika 14 . 4 . 3 . 3 . 3 .Slika 15 .

 14433315 Metabolička vijabilnost ćelija drenirajućeg limfnog čvora u fazi elicitacije reakcije kontaktne preosetljivosti. Statistički značajne razlike * p<0.05 u odnosu na 0%/0% odgovarajućeg soja. Produkcija IL-6 od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora u fazi elicitacije U mišjem modelu KP sugerisana je uloga IL-6 u proliferaciji ćelija dLČ nakon kontakta kože sa haptenom (Hope i drugi, 1994). S obzirom na različitu proliferativnu aktivnost ćelija EdLČ jedinki DA i AO soja nakon elicitacije reakcije, ispitali smo produkciju ovog citokina. Dozno-zavisno povećanje produkcije IL-6 zabeleženo je samo kod jedinki DA soja, dok je kod AO soja produkcija ovog citokina nepromenjena nakon primene DNCB-a, u odnosu na kontrole (Slika 15). Kod oko 50% jedinki oba soja zapažen je odgovor ćelija EdLČ na in vitro stimulaciju haptenom povećanjem produkcije IL-6 (osim kod AO jedinki nakon tretmana nižom dozom DNCB-a koje nisu odgovorile), ali bez značajne razlike između eksperimentalnih grupa usled velikih variranja (50±25, 56±43 i 26±9 za 0/0%, 0.4/0.13% i 4/1.3% redom, kod DA soja, i 63±67, 0±0 i 127±60 za 0/0%, 0.4/0.13% i 4/1.3% redom, kod AO soja, izraženo u pg/ml). Spontana produkcija IL-6 od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora 24 časa nakon elicitacije reakcije kontaktne preosetljivosti. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost produkcije iz najmanje tri nezavisna eksperimenta ± SD. Statistički značajne razlike: ** p<0.01, u odnosu na 0%/0% i ## p<0.01 u odnosu na 0.4%/0.13% DNCB, odgovarajućeg soja. 


4. 3 . 3 . 5 . Citokinski odgovor ćelija drenirajućeg limfnog čvora u fazi elicitacije reakcije kontaktne preosetljivosti 4 . 3 . 3 . 5 . 1 .

 33543351 Produkcija i ekspresija IFN-γS obzirom da se KP na DNCB kod miša kvalifikuje najčešće kao Th1/tip1 reakcija, ispitana je produkcija i ekspresija IFN-γ, glavnog citokina ovog tipa imunskog odgovora(Slika 16). Spontana produkcija IFN-γ pokazuje dozno-zavisno povećanje kod jedinki DA soja, dok je kod jedinki AO soja nepromenjena u odnosu na kontrole (Slika 16A). 


Slika 16 .

 16 Produkcija IFN-γ i ekspresija gena za ovaj citokin od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora 24 časa nakon elicitacije reakcije kontaktne preosetljivosti. Spontana produkcija IFN-γ (A) i specifična produkcija (nakon in vitro stimulacije sa DNBS-om, 10μg/ml kulture) (B) od strane ćelija EdLČ kod jedinki DA i AO soja. Količina iRNK za IFN-γ određena RT-PCR metodom u ćelijama EdLČ (C). Rezultati su prikazani kao srednja vrednost produkcije iz najmanje tri nezavisna eksperimenta ± SD, tj. kao arbitrarne vrednosti ekspresije gena iz dva eksperimenta ± SD. Statistički značajne razlike: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 u odnosu na 0%/0% i # p<0.05 u odnosu na 0.4%/0.13% DNCB, odgovarajućeg soja; s p<0.05 u odnosu na jedinke DA soja. 


Slika 18 . 4 . 3 . 3 . 5 . 4 . 4 S

 18433544 Produkcija IL-17 i ekspresija gena za ovaj citokin od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora 24 časa nakon elicitacije reakcije kontaktne preosetljivosti. Spontana produkcija IL-17 (A) i specifična produkcija (B) od strane ćelija EdLČ kod jedinki DA i AO soja. Količina iRNK za IL-17 određena RT-PCR metodom u ćelijama EdLČ (C). Rezultati suprikazani kao srednja vrednost produkcije iz najmanje tri nezavisna eksperimenta ± SD, tj.kao arbitrarne vrednosti ekspresije gena iz dva eksperimenta ± SD. Statistički značajne razlike * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 u odnosu na 0%/0% i # p<0.05 u odnosu na 0.4%/0.13% DNCB, odgovarajućeg soja. Produkcija i ekspresija ILobzirom da su spontana i DNBS-stimulisana produkcija IL-4 bile ispod nivoa detekcije, produkcija ovog citokina ispitana je nakon stimulacije ćelija sa ConA. 


Slika 19 . 4 . 3 . 3 . 6 .

 194336 Produkcija IL-4 i ekspresija gena za ovaj citokin od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora 24 časa nakon elicitacije reakcije kontaktne preosetljivosti. Produkcija IL-4 nakon in vitro stimulacije ćelija EdLČ sa ConA (1 μg/ml kulture) (A) kod jedinki DA i AO soja. Količina iRNK za IL-4 određena RT-PCR metodom u ćelijama EdLČ (B). Rezultati su prikazani kao srednja vrednost produkcije iz najmanje tri nezavisna eksperimenta ± SD, tj. kao srednja arbitrarna vrednost ekspresije gena iz dva eksperimenta ± SD. Statistički značajne razlike * p<0.05, ** p<0.01 u odnosu na 0%/0% DNCB odgovarajućeg soja. Zastupljenost CD4 + CD25 + Foxp3 + ćelija u drenirajućem limfnom čvoru u fazi elicitacije Kod miševa je pokazano da CD4 + CD25 + Foxp3 + ćelije, prirodne regulatorne T ćelije (Treg), kontrolišu intenzitet reakcije KP nakon elicitacije senzibilisanih jedinki (Dubois i drugi, 2003). Kako ne postoje podaci o ulozi ovih ćelija u reakciji KP kod pacova, a s obzirom na zabeležene razlike u intenzitetu reakcije KP između jedinki DA i AO soja, ispitana je zastupljenost ćelija ovih fenotipskih karakteristika u EdLČ ova dva soja. Kod jedinki DA soja zabeležen je nepromenjen broj (procentualni i ukupni) 




  Numeričko povećanje broja ćelija u dLČ kod jedinki AO soja tretiranih višom dozom DNCB-a, uz odsustvo promena u proliferaciji ovih ćelija, može biti posledica povećane migracije ćelija u dLČ kod ovog soja. Odsustvo proliferativne aktivnosti u dLČ nakon elicitacije reakcije kod AO soja, nije prevaziđeno ni nakon in vitro stimulacije ćelija sa rekombinantnim IL-2, uprkos povećanju gustine ekspresije IL-2Rα nakon elicitacije sa višom dozom DNCB-a, što sugeriše anergiju ćelija u čvorovima ovog soja. Treg ćelije, koje eksprimiraju IL-2Rα, i koje su bitne u regulaciji reakcije KP (Ring i drugi, 2006), mogu biti odgovorne za odsustvo proliferativne aktivnosti u dLČ kod AO soja, s obzirom da ove ćelije imaju sposobnost inhibicije aktivacije/proliferacije drugih T ćelija(Thornton i Shevach, 2000). U vezi sa tim, broj ćelija sa fenotipskim karakteristikama Treg (CD4 + CD25 + Foxp3 + ćelije) povećan je u dLČ nakon elicitacije reakcije kod senzibilisanih jedinki AO soja (Tabela 5.).Niži odnos CD4 + /CD8 + ćelija u dLČ nakon elicitacije posledica je povećanja relativnog (i ukupnog broja) CD8 + ćelija, uz istovremeni pad relativne zastupljenosti CD4 + ćelija, kod oba soja pacova. Iako je relativan broj CD4 + ćelija smanjen kod jedinki oba soja, zbog povećanja celularnosti dLČ, ukupan broj ovih ćelija je nepromenjen kod DA soja a čak je povećan kod jedinki AO soja. U dLČ miševa u fazi elicitacije pokazano je da su aktivisane CD8 + T ćelije brojnije od aktivisanih CD4 + T ćelija, ali i da obe populacije ćelija proliferišu u dLČ nakon elicitacije(Larsen i drugi, 2007). Povećanje broja CD8 + ćelija u dLČ, može se dovesti u vezu sa nalazima kod miševa i ljudi, koji su pokazala da su CD8 + T ćelije, koje produkuju IFN-γ i IL-17, glavne efektorske ćelije u toku faze elicitacije KP (Xu i drugi, 1997b; Cavani i drugi, 1998;Xu i drugi, 2006). Povećanje ukupnog broja CD4 + i CD8 + ćelija u dLČ jedinki AO soja, uprkos odsustvu proliferativne aktivnosti, sugeriše migraciju ovih ćelija u dLČ nakon elicitacije reakcije. Povećanje produkcije i ekspresije IFN-γ, uz povećanu ekspresiju gena za IL-12 i T-bet, u dLČ nakon elicitacije senzibilisanih jedinki DA soja, ukazuje na aktivaciju Th1/tip1 imunskog odgovora u ovoj fazi reakcije KP na DNCB kod pacova. Naime, u ovom radu je pokazano dozno-zavisno povećanje spontane produkcije IFN-γ, uz povećanje specifične produkcije (nakon in vitro aplikacije haptena) i ex vivo ekspresije gena za IFN-γ u dLČ 24 časa nakon elicitacije reakcije kod senzibilisanih DA pacova. Sa druge strane, zapažena je nepromenjena produkcija IFN-γ kod AO soja, ali uz povećanje ekspresije gena za ovaj citokin nakon elicitacije sa samo višom dozom DNCB-a. S obzirom da IFN-γ mogu da produkuju i CD4 + Th1 i CD8 + Tc1 ćelije, koje se smatraju efektorskim ćelijama u KP (Ishiyaki i drugi, 2007), dalje je ispitana ekspresija gena za IL-12 i T-bet, koji imaju značajnu ulogu u diferencijaciji i aktivaciji Th1/tip1 ćelija (Glimcher i drugi, 2004; Szabo u drugi, 2000). Povećana ekspresija gena uključenih u IFN-γ signalni put, kao što su CCR-5, CXCL-10, Irf1, STAT-5B i STAT-1, zapažena je u dLČ 24 časa nakon elicitacije KP sa DNFB-om kod pacova Crl:CD (SD) soja (Hartmann i sar., 2006), međutim nema podataka o aktivaciji IL-12 i T-bet-a u dLČ u eferentnoj fazi reakcije KP. Povećan nivo iRNK za p35 subjedinicu IL-12 zabeležen je kod jedinki DA soja tretiranih samo sa višom dozom DNCB-a, dok je nivo iRNK za p40, kao i za T-bet, povećan nakon primene svake od doza haptena, kod ovog soja. Riemann i drugi su pokazali da za razliku od p35 čija ekspresija je konstitutivna, ekspresija p40 raste u dLČ nakon kontakta kože sa haptenom (Riemann i drugi, 1996). Povećana ekspresija gena za T-bet i IL-12, u dLČ jedinki samo DA soja, i posledično povećana produkcija IFN-γ, mogu biti u osnovi intenzivne ekspresije reakcije KP zabeležene kod ovog soja. Naime, transgeni miševi sa povećanom ekspresijom gena za T-bet, spontano razvijaju kožne lezije slične promenama karakterističnim za KP, a nakon elicitacije sa DNFB-om, razvijaju intenzivniji otok uha, u odnosu na ″wild type″ jedinke (Ishizaki i drugi, 2007). Kod ovih životinja produkcija IFN-γ povećana je u Th1 i Tc1 ćelijama specifičnim za hapten (Ishizaki i drugi, 2007). Takođe, neutralizacija IL-12 pre elicitacije senzibilisanih miševa smanjuje otok uha, sugerišući značaj ovog citokina u eferentnoj fazi reakcije KP (Riemann i sar., 1996). Povećana ekspresija gena za IFN-γ u dLČ kod jedinki AO soja, nakon elicitacije sa višom dozom DNCB-a, uz nepromenjenu ekspresiju gena za IL-12 i T-bet, sugeriše angažovanje nekih drugih transkripcionih faktora, neophodnih u indukciji ekspresije IFN-γ. U svetlu toga, treba spomenuti da su nedavna istraživanja pokazala da Runx3, transkripcioni faktor značajan za razvoj T ćelija, može direkto indukovati ekspresiju gena za IFN-γ, nezavisno od IL-12 i T-beta-a (Yagi i drugi, 2010). Nepromenjena produkcija IFN-γ, uprkos povećanoj ekspresiji gena za ovaj citokin, kod AO soja, može biti posledica prisustva inhibitornih faktora u toku 72-časovne kulture ćelija, kao što je npr. IL-4, čija produkcija je povećana od strane ćelija dLČ ovog soja. Povećana spontana produkcija IL-17 uz dozno-zavisno povećanje specifične produkcije ovog citokina (nakon in vitro stimulacije ćelija sa haptenom) zabeležena je od strane ćelija dLČ nakon elicitacije senzibilisanih jedinki DA soja, i sugeriše na diferencijaciju/aktivaciju Th17/tip17 ćelija u dLČ u ovoj fazi reakcije. U perifernoj krvi pacijenata obolelih od AKD na nikl prisutne su memorijske Th17 ćelije, koje produkuju IL-17 nakon in vitro stimulacije sa DĆ koje eksprimiraju nikl (Larsen i drugi, 2009). T ćelije koje produkuju IL-17 prisutne su i u koži pacijenata obolelih od AKD, kao i koži miševa na mestu elicitacije KP (Peiser i drugi, 2013), međutim nema podataka o aktivaciji ovih ćelija u dLČ nakon elicitacije reakcije KP kod miševa. Povećanje produkcije IL-17 u dLČ u fazi elicitacije, zavisno od doze DNCB-a primenjene u fazi senzibilizacije (Popov i drugi, 2012), zajedno sa dozno-zavisnim povećanjem produkcije ovog citokina u dLČ u fazi senzibilizacije kod DA pacova, može biti jedan od mehanizama u osnovi efekta doze senzibilizacije na intenzitet ekspresije reakcije KP, ukazujući na značaj ovog citokina u ekspresiji KP na DNCB kod pacova. Povećana produkcija IL-17 uz nepromenjeni nivo iRNK za ovaj citokin kod DA pacova može biti posledica uticaja različitih stimulusa prisutnih u 72-časovnoj kulturi ćelija. Pored TGF-β (čija ekspresija je nepromenjena u dLČ kod jedinki oba soja), faktor bitan za razvoj Th17 ćelija je IL-6 (McGeachy i Cua, 2008), čija produkcija je povećana od strane ćelija dLČ DA pacova nakon elicitacije KP. Sa druge strane, nepromenjena produkcija IL-17 u dLČ jedinki AO soja nakon elicitacije, u odnosu na kontrole, može biti posledica nepromenjene produkcije IL-6 kod ovog soja i samim tim odsustva diferencijacije Th17 ćelija. Generalno, odsustvo specifične produkcije IL-17 u dLČ, zajedno sa odsustvom promena u produkciji ovog citokina u koži uha AO soja, u ekspresiji reakcije KP, može se dovesti u vezu sa odsustvom specifične produkcije ovog citokina i od strane ćelija dLČ u fazi senzibilizacije, što zajedno sugeriše neadekvatnu aktivaciju Th17/ tip17 imunskog odgovora u reakciji KP na DNCB kod ovog soja. Povećana produkcija IL-4 i ex vivo ekspresija gena za ovaj citokin kod jedinki AO soja može biti u osnovi niže ekspresije IFN-γ, p35, p40 i T-bet-a u dLČ, ili obrnuto, uzimajući u obzir recipročnu regulaciju glavnih citokina Th1 i Th2 ćelija (Bushel i Wood, 1999). U tom smislu gledano, odsustvo produkcije i ekpresije IL-4 kod DA soja može biti posledica inhibicije diferencijacije Th2 ćelija, usled povećane produkcije i ekspresije IFN-γ i ekspresije IL-12 (Wurtz i drugi, 2004) u dLČ nakon elicitacije reakcije kod senzibilisanih jedinki ovog soja. Spontana produkcija i produkcija IL-10 in vitro stimulisana haptenom u dLČ nepromenjena je nakon elicitacije reakcije kod oba soja, što je u skladu sa rezultatima dobijenim na miševima, koji pokazuju odsustvo produkcije IL-10 i ekspresije iRNK za ovaj citokin u dLČ 24 časa nakon elicitacije senzibilisanih jedinki sa DNCB-om (Ulrich i drugi, 2001). Međutim, ne treba zanemariti ulogu IL-10 u fazi elicitacije reakcije, s obzirom da je pokazana povećana produkcija ovog citokina u dLČ 48 i 72 časa nakon elicitacije reakcije (Ulrich i drugi, 2001), što se može povezati sa regulatornom ulogom IL-10 u kasnijoj fazi reakcije. Niži nivo iRNK za IL-10 u dLČ kod jedinki AO soja tretiranih sa višom dozom DNCB-a, u poređenju sa kontrolama, može biti posledica povećane ekspresije gena za IL-4 (Yao i drugi, 2005), koja je zabeležena u dLČ ovih životinja. Zastupljenost CD4 + CD25 + Foxp3 + (Treg) ćelija, bitnih u kontroli imunskog odgovora na patogene, aloantigene i alergene (Sakaguchi i drugi, 2006), povećana je u dLČ jedinki AO soja nakon elicitacije svakom od doza DNCB-a. Kod ljudi je pokazano da su CD25 + Treg ćelije odgovorne za održavanje imunske tolerance kod zdravih osoba koje nisu sklone razvoju alergijskog kontanktnog dermatitisa (Cavani i drugi, 2003). 


i

  intenzivnijoj reakciji KP(Vocanson i drugi, 2009). Kod miševa senzibilisanih sa DNFB-om, pokazano je da Treg ćelije migriraju iz kože u dLČ nakon elicitacije (Tomura i drugi, 2010), gde mogu da inhibiraju proliferaciju efektorskih T ćelija specifičnih za hapten, kao i njihovu produkciju IFN-γ (Tomura i drugi, 2010;Gorbachev i Fairchild, 2004). Takođe, pokazano je da IL-4 može izazvati razvoj humanih CD4 + CD25 + Treg ćelija od naivnih CD4 + T ćelija iz periferne krvi(Skapenko i drugi, 2005). Ove Treg ćelije imaju sposobnost inhibicije proliferacije CD25 -T ćelija nezavisno od produkcije regulatornih citokina (IL-10 i TGF-β), i njihova regulatorna aktivnost nije pod uticajem IL-2(Skapenko i drugi, 2005). U svetlu ovih podataka, odsustvo proliferativne aktivnosti ćelija dLČ nakon elicitacije senzibilisanih jedinki AO soja, koja se ne prevazilazi dodavanjem IL-2, i nepromenjena produkcija efektorskih citokina (IFN-γ i IL-17), može biti posledica delovanja Treg ćelija, kao i povećane produkcije IL-4 kod ovog soja. Regulacija aktivnosti/proliferacije efektorskih T ćelija od strane Treg zavisi od njihove ekspresije površinskih molekula (i samim tim kontakta sa efektorskim ćelijama) i produkcije anti-inflamatornih citokina (IL-10 i TGF-β)(Josefowicz i drugi, 2012). Citoliza efektorskih T ćelija, putem produkcije granzima, takođe može biti mehanizam regulacije imunskog odgovora od strane Treg ćelija(Josefowicz i drugi, 2012). Nepromenjena produkcija IL-10 i ekspresija gena za TGF-β, uz povećanje broja CD4 + CD25 + Foxp3 + ćelija u dLČ kod AO soja, sugeriše pre supresiju zavisnu od ćelijskog kontakta, uz moguću citotoksičnu aktivnost ovih ćelija. U prilog ovoj pretpostavci govore naši preliminarni podaci koji su pokazali povećanu (p<0.001) ex vivo apoptozu ćelija dLČ (određivanu citofluorimetrijskom metodom sa propidijum jodidom) kod jedinki AO soja tretiranih višom dozom DNCB-a (23.5%±1.4%), u odnosu na kontrolne jedinke (16.1%±0.6%), kod kojih je povećan i relativan i ukupan broj CD4 + CD25 + Foxp3 + ćelija,. Kod DA jedinki nije zabeležena promena u ex vivo apoptozi ćelija dLČ nakon primene više doze DNCB-a (13.6%±4.3%), u odnosu na kontrole (15.5%±4.3%). Povećana apoptoza ćelija dLČ kod AO soja može biti u osnovi generalno niže rensponsivnosti ćelija dLČ nakon elicitacije reakcije kod ovog soja.Pored CD4 + CD25 + T ćelija, pokazano je da CD8 + Tc2 ćelije mogu imati regulatornu ulogu u reakciji KP, tj. da mogu posredovati tolerancu izazvanu niskom dozom haptena(Steinbrink i drugi, 1996; Seidel-Guyenot i drugi, 2006). Supresorske CD8 + T ćelije ne proliferišu u odgovoru na antigen, imaju sposobnost supresije proliferativne aktivnosti CD4 + T ćelija, ne produkuju IFN-γ i IL-10, ali produkuju IL-4 koji je neophodan za njihovu supresorsku aktivnost (Salgame i drugi, 1991). Povećan broj CD8 + ćelija u dLČ jedinki AO soja, uz nepromenjenu proliferaciju (ex vivo, i in vitro stimulisanu haptenom i IL-2) i produkciju efektorskih citokina, ali povećanu produkciju IL-4 nakon elicitacije reakcije, sugeriše da bi ove ćelije mogle imati pre regulatornu nego efektorsku aktivnost kod ovog soja.Gledano u celini, senzibilizacija pacova sa DNCB-om dovela je do aktivacije Th1/tip1 i Th17/tip17 imunskog odgovora u dLČ, mada je intenzitet odgovora veći kod DA u poređenju sa AO sojem. Zabeležene međusojne razlike u ovoj fazi reakcije se delom mogu objasniti manjim brojem CD25 + ćelija, i manjoj gustini ekspresije ovog molekula, kod AO soja. U fazi elicitacije, povećana ekspresija reakcije praćena je povećanom produkcijom medijatora inflamacije (TNF-α, NO, MPO, IFN-γ i IL-17) na mestu elicitacije reakcije i posledično migracijom ćelija, kao i aktivacijom Th1/tip1 i Th17/tip17 imunskog odgovora u dLČ, kod DA soja. Odsustvo efektorske aktivnosti u dLČ u ovoj fazi reakcije kod AO soja, praćeno je povećanom produkcijom i ekspresijom IL-4 i povećanom zastupljenošću CD4 + CD25 + Foxp3 + ćelija, i ukazuje na supresiju kao mogući uzrok nižeg intenziteta ekspresije reakcije KP kod ovog soja. 


3 .

 3 produkcije i ekspresije IFN-γ i IL-17 kod oba soja; -povećanja specifične produkcije (nakon in vitro stimulacije ćelija sa haptenom) IFN-γ, IL-17 i IL-10 kod DA soja, i povećanja specifične produkcije samo IFN-γ kod AO soja, značajno niže u odnosu na DA soj; -nepromenjene produkcije IL-4 kod oba soja.Efektorska faza reakcije kontaktne preosetljivosti: Nakon elicitacije reakcije zabeleženo je prisustvo proinflamatornog odgovora u tretiranoj koži, kao i produkcija efektorskih citokina IFN-γ i IL-17, značajnih za ekspresiju reakcije, izraženije kod jedinki DA soja u odnosu na AO soj, ali i povećanje produkcije citokina IL-4 samo kod jedinki AO soja. 4. U drenirajućem limfnom čvoru nakon elicitacije reakcije kod senzibilisanih jedinki dolazi do: -povećanja celularnosti i proliferativne aktivnosti ćelija samo kod DA soja; -smanjenja odnosa CD4 + /CD8 + ćelija kod oba soja; -povećanja spontane i specifične produkcije, kao i ekspresije, IFN-γ i IL-17 samo kod DA soja, a povećanja produkcije i ekspresije IL-4 samo kod AO soja, uz nepromenjenu produkciju i ekspresiju IL-10 kod oba soja; -povećanja zastupljenosti CD4 + DC25 + Foxp3 + ćelija samo kod AO soja. Gledano u celosti, karakteristike reakcije kontaktne preosetljivosti kod pacova u saglasnosti su sa dosadašnjim saznanjima o ovoj reakciji koja su dobijena na mišjem modelu bolesti, i u istraživanjima kod čoveka. Na osnovu produkcije citokina karakterističnih za subpopulacije T ćelija, može se zaključiti da fazu senzibilizacije reakcije kontaktne preosetljivosti kod pacova karakteriše aktivacija Th1/tip1 i Th17/tip17 ćelija u drenirajućem limfnom čvoru, koja je intenzivnija kod jedinki DA u odnosu na AO soj. U fazi elicitacije reakcije u drenirajućem limfnom čvoru dolazi do aktivacije Th1/tip1 i Th17/tip17 ćelija samo kod jedinki DA soja, a povećane produkcije Th2/anti-inflamatornog citokina IL-4, uz povećanje broja CD4 + CD25 + Foxp3 + ćelija, samo kod AO soja. Razlike u intenzitetu odgovora u fazi senzibilizacije i tipu odgovora u fazi elicitacije, uz razlike u produkciji medijatora inflamacije na mestu elicitacije reakcije i posledično migraciji ćelija, mogu biti u osnovi različite reaktivnosti jedinki DA i AO soja na primenu kontaktnog alergena. Ovi rezultati s toga ukazuju na genetičku varijabilnosti kao značajan endogeni faktor u reakciji KP. U svetlu toga, komparativno ispitivanje kontaktne preosetljivosti kod reaktivnijeg DA soja i manje reaktivnog AO soja, može dalje osvetliti imunske mehanizme koji su u osnovi razvoja i ekspresije, kao i regulacije ove reakcije. Ovakva saznanja mogu dati dobru osnovu za razvoj novih terapeutskih modaliteta u lečenju alergijskog kontaktnog dermatitisa. 




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  .1. Organokultura eksplanata kože 3.6.2. Određivanje aktivnosti mijeloperoksidaze (MPO test) unutar ćelija iz organokulture eksplanata kože uha 3.6.3. Određivanje nivoa nitrita Griessovom metodom 3.7. Imunoenzimski test na čvrstoj fazi (eng. ELISA, Enzyme-Linked Immuno Sorbent Aktivnost ćelija drenirajućeg limfnog čvora nakon elicitacije senzibilisanih pacova 4.3.3.1. Promena broja ćelija i njihove proliferativne aktivnosti u drenirajućem limfnom čvoru u fazi senzibilizacije 4.3.3.2. Metabolička vijabilnost ćelija drenirajućeg limfnog čvora u fazi elicitacije 4.3.3.3. Produkcija IL-6 od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora u fazi elicitacije 4.3.3.4. Zastupljenost CD4 + i CD8 + ćelija u drenirajućem limfnom čvoru u fazi elicitacije 4.3.3.5. Citokinski odgovor ćelija drenirajućeg limfnog čvora u fazi elicitacije 4. 


	4.3. Mehanizmi ekspresije reakcije KP kod pacova
	4.3.1. Infiltracija ćelija u uho nakon elicitacije reakcije KP
	4.3.2. Produkcija (pro)inflamatornih medijatora u kondicioniranom medijumu
	organokulture uha
	4.3.2.1. Ispitivanje markera inflamacije (TNF-α, IL-1β, NO i unutarćelijski MPO) u
	kondicioniranom medijumu organokulture uha
	4.3.2.2. Produkcija IFN-γ i IL-17 u kondicioniranom medijumu organokulture uha
	4.3.2.3. Produkcija Th2/antiinflamatornih citokina u kondicioniranom medijumu
	organokulture uha
	Assay) 3.8. Statistika 4. Rezultati 4.3.3. 4
	4.1. Promene u uhu 24 časa nakon elicitacije reakcije kontaktne preosetljivosti kod 4.3.3.5.5. Produkcija i ekspresija IL-10
	senzibilisanih pacova 4.3.3.6. Zastupljenost CD4 + CD25 + Foxp3 + ćelija u drenirajućem limfnom čvoru u fazi
	4.1.1. Otok uha kao in vivo mera ekspresije reakcije KP elicitacije
	4.1.2. Histološke promene u uhu nakon elicitacije senzibilisanih životinja 5. Diskusija
	4.2. Mehanizmi indukcije reakcije KP kod pacova 6. Zaključci
	4.2.1. Doprinos faze senzibilizacije povećanju otoka uha nakon elicitacije 7. Literatura
	4.2.2. Osnovni parametri aktivnosti ćelija drenirajućeg limfnog čvora u fazi senzibilizacije
	pacova
	4.2.2.1. Promena broja ćelija i njihove proliferativne aktivnosti u drenirajućem limfnom
	čvoru u fazi senzibilizacije
	4.2.2.2. Zastupljenost CD4 + i CD8 + ćelija u drenirajućem limfnom čvoru trećeg i petog
	dana senzibilizacije
	4.2.3. Citokinski odgovor ćelija drenirajućeg limfnog čvora u fazi senzibilizacije kod
	pacova
	4.2.3.1. Produkcija i ekspresija IFN-γ od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora tokom
	faze senzibilizacije
	4.2.3.2. Produkcija i ekspresija IL-17 od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora tokom
	faze senzibilizacije
	4.2.3.3. Produkcija i ekspresija IL-4 od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora tokom
	faze senzibilizacije
	4.2.3.4. Produkcija i ekspresija IL-10 od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora tokom
	faze senzibilizacije

3.3.5.1. Produkcija i ekspresija IFN-γ 4.3.3.5.2. Ekspresija gena za p35, p40 i T-bet 4.3.3.5.3. Produkcija i ekspresija IL-17 4.3.3.5.4. Produkcija i ekspresija IL- 


  i test maksimizacije (Magnusson i Kligman, 1969), koji se zasnivaju na sposobnosti hemikalije da izazove kožni eritem i edem. Više od dvadeset godina zamorčići su korišćeni kao najbolji model za ispitivanje senzibilišućeg potencijala hemikalija, sve do razvoja testova na mišjem modelu-test otoka uha (eng. MEST, Mouse Ear Swelling Test) (Gad, 1994) i test lokalnog limfnog čvora (eng. LLNA, Local Lymph Node Assay) 



1.4.1.2.4.2. Invarijantne NKT ćelije

  
	Invarijantne (nepromenljive) NKT (iNKT) ćelije čine populaciju T ćelija koje
	iskazuju αβ TCR ograničenog repertoara (invarijantni), a prepoznaju lipidne antigene
	prezentovane u kompleksu sa CD1d molekulom, koji je sličan MHC molekulu klase I
	(Balato i drugi, 2009).
	Na mišjem modelu KP ispitivano je učešće NKT ćelija u ovoj reakciji, najviše u
	fazi senzibilizacije (Askenaze i drugi, 2001; Campos i drugi, 2003; Nieuwenhuis i
	drugi, 2005). Sugerisano je da aplikacija haptena izaziva lokalno oslobađanje endogenih
	glikolipida, nekoliko minuta nakon senzibilizacije (Askenaze i drugi, 2001). Ovi
	glikolipidi vezuju se za CD1d molekul na površini APĆ, što vodi aktivaciji iNKT ćelija,
	koje u jetri produkcijom IL-4 podstiču aktivaciju B1-ćelija (B ćelije urođene imunosti).

Tabela 1. Nazivi hemokina i odgovarajućih receptora uključenih u ekspresiju kontaktne preosetljivosti

  Berg i drugi, 1995), što je u saglasnosti sa kasnijim rezultatima koji su pokazali odsustvo efekta IL-4 u reakciji KP na OXAZ(Traidl i drugi, 1999). 


	Strukturni 1996). Pojedini autori, međutim, ukazuju na mogućnost da i Th1 i Th2 ćelije, i njihovi Drugi naziv Čovek Miš 1.4.3.1. Regulatorni putevi u koži Receptor naziv CCL17 TARC (eng. Thymus-and activation-regulated chemokine) + + CCR4 ključni citokini, mogu doprinositi progresiji reakcije KP. Efikasna zaštita kože zavisi od interakcije keratinocita sa ostalim rezidentnim
	CCL18 Pokazano je da intravenski tretman miševa sa IL-4 ne utiče na KP kada se PARC (eng. Pulmonary and activation-+ Jedan od faktora koji može uticati na ravnotežu između Th1 i Th2 imunskog ćelijama kože i ćelijama koje migriraju u kožu. Ova interakcija je posredovana PITPNM3 regulated chemokine) CCL20 MIP-3α + + CCR6 primenjuje u vreme senzibilizacije miševa sa TNCB-om, ali da značajno redukuje odgovora u KP je priroda haptena. Pokazano je da je imunski odgovor na haptene kao citokinima, održava homeostazu, a njen poremećaj može dovesti do inflamacije
	CCL22 ekspresiju reakcije kada se primeni u vreme elicitacije životinja, sugerišući da IL-4 utiče MDC (eng. Macrophage-Derived + + CCR4 što su DNCB, TNCB i DNFB pretežno Th1, dok je odgovor na FITC pretežno Th2 tipa (Bernard i drugi, 2012). Cytokine) na eferentnu, ali ne na aferentnu fazu reakcije (Gautam i drugi, 1992). Slično ovim rezultatima, Asada i drugi su pokazali da se IL-4 produkuje u koži nakon elicitacije miševa sa TNCB-om, i da ima regulatornu ulogu, jer tretman životinja sa anti-IL-4 antitelima jedan čas pre elicitacije značajno povećava otok uha, i ekspresiju IFN-γ, IL-2, (Tang i drugi, 1996; Dearman i Kimber, 2000). Soj miševa takođe može uticati na Pokazano je da keratinociti konstitutivno eksprimiraju imunosupresivni citokin razvoj dominanitnog tipa CD4 + (Th) ili CD8 + (Tc) ćelija (Honda i drugi, 2013). IL-10, što može biti važno za kontrolu lokalnog imunskog odgovora, kao i da Istraživanja su pokazala da ponovljeno nanošenje TNCB može pomeriti odnos sa Th1 produkcija ovog citokina od strane keratinocita raste već 4 časa nakon nanošenja ka Th2 tipu imunskog odgovora (Kitagaki i drugi, 1997). haptena (Ferguson i drugi, 1994; Enk i drugi, 1992). Ferguson i drugi su pokazali da je
	Strukturni naziv	Drugi naziv	Čovek Miš	Receptor
	CXCL1 CXCL2 toku evolucije, nekoliko regulatornih mehanizama se razvilo sa ciljem sprečavanja Gro-α (eng. Growth-Related Oncogene-α) + CXCR1, + CXCR2 MIP-2 (eng. Macrophage Inflammatory Protein-2) + objašnjenje kontradiktornih rezultata o značaju IL-4 u KP ili AKD je dvostruka uloga CXCR2 CXCL8 IL-8 + CXCR1, CXCR2 preteranog oštećenja kože usled prisustva trajnog antigenskog signala, kao i ograničenja IL-4, regulatorna ili efektorska, u zavisnosti od količine produkovanog citokina. Nije 1.4.2.3.2. Uloga Th2 imunskog odgovora isključen ni različit doprinos IL-4 u aferentnoj i eferentnoj fazi reakcije KP. Drugi Th2 hiperplazije limfnih čvorova. Podaci koji ukazuju na to da hapten može ostati u koži
	CXCL9 Priroda, odnosno tip, imunskog odgovora u reakciji KP nije jasno definisana. Mig (eng. Monokine-induced by + + CXCR3 mesecima, pa i godinama, sugeriše neophodnost angažovanja ovih regulatornih citokin, IL-10, smatra se prirodnim regulatorom ekspresije KP, s obzirom da interferon-γ) CXCL10 IP-10 (eng. Interferon induced Protein-10) + + CXCR3 CCL1 I-309 + + Kao što je već pomenuto, u humanom AKD i na mišjem modelu bolesti pokazano je da mehanizama koji će sprečiti preterano tkivno oštećenje u AKD (Vocanson i drugi, neutralizacija ovog citokina produžava trajanje reakcije KP, dok tretman sa CCR8 CCL2 MCP-1 (eng. Monocyte Chemotactic Protein-1) + + CCL5 RANTES (eng. Regulation and Activated Normal T cell-expressed and -secreted) + CCR5 idrugi, + CCR1, CCR3, drugi, 1994). Takođe, kod miševa sa potpunim ili delimičnim odsustvom ekspresije 2009), dok je na mišjem modelu sugerisana regulatorna uloga Th2/Tc2 ćelija (Xu CCR2 su Tc1/Th1 ćelije glavne efektorske ćelije (Cavani i drugi, 2001; Vocanson i drugi, rekombinatnim IL-10 (rIL-10) pre elicitacije sprečava ekspresiju reakcije (Ferguson i 2009).

1.4.2.3.Efektorski mehanizmi u elicitaciji reakcije KP kod pacova1.4.2.3.1.Uloga Th1/tip1 i Th17/tip17 ćelija Iako su prvobitna istraživanja kod ljudi sugerisala da je alergijski kontaktni dermatitis posredovan CD4 + T ćelijama(Vocanson i drugi, 2009), na mišjem modelu bolesti je pokazano da su zapravo CD8 + T ćelije specifične za hapten, koje produkuju IFN-γ, glavne efektorske ćelije(Vocanson i drugi, 2009).Kasnija istraživanja kontaktne preosetljivosti na nikl kod ljudi potvrdila su značaj CD8 + efektorskih T ćelija(Cavani i drugi, 2001).Detekcija IL-17 u kožnim lezijama pacijenata sa AKD, kao i izolacija CD4 + T ćelija specifičnih za nikl koje produkuju IL-17 iz periferne krvi i kožnih lezija pacijenata ukazala su na značaj ovog citokina u ekspresiji bolesti(Cavani i drugi, 2000).Sugerisano je da IL-17, zajedno sa IFN-γ i IL-4, stimuliše aktivaciju keratinocita nakon elicitacije, i samim tim ekspresiju adhezivnih molekula i produkciju citokina i hemokina od strane ovih ćelija(Albanesi i drugi, 2000).Kod miševa je pokazano da su CD8 + T ćelije koje produkuju IL-17 (tip 17 ćelije), zajedno za citotoksičnim CD8 + T ćelijama (Tc1) koje produkuju IFN-γ, glavne efektorske T ćelije u elicitaciji KP (He i drugi, 2006), kao i da oba citokina doprinose elicitaciji reakcije različitim, još uvek nedovoljno objašnjenim, mehanizmima(He i drugi, 2009).Sugerisano je da IL-17 doprinosi ekspresiji reakcije stimulisanjem migracije leukocita na mesto elicitacije, dok IFN-γ stimuliše produkciju reaktivnih vrsta kiseonika(He i drugi, 2009).Sa druge strane, na miševima sa potpunim ili delimičnim odsustvom ekspresije gena za receptor za IFNγ(IFN-γR -/-) pokazano je da ovaj citokin nije neophodan za ekspresiju KP(Saulnier i drugi, 1995).Nezavisno od uloge IL-17 i IFN-γ u elicitaciji reakcije KP, pokazano je da je citotoksičnost CD8 + T ćelija zapravo ključna za patogenezu KP, sa keratinocitima kao glavnim metama citotoksične aktivnosti T ćelija(Traidl i drugi, 2000), putem koji uključuje interakciju površinog receptora ćelijske smrti Fas i njegovog liganda FasL, kao i angažovanjem molekula perforina.Pokazano je da kod miševa sa homozigotnim mutacijama koje uslovljavaju odsustvo oba citotoksična puta tj.kod kojih izostaje razvoj citotoksičnih T ćelija (P 0/0 gld miševi), ekspresija KP je inhibirana uprkos prisustvu CD8 + T ćelija koje produkuju IFN-γ, na mestu elicitacije reakcije (Kehren i drugi, 1999).Nije poznato da li tip 1 i tip 17 T ćelije iskazuju citotoksičnu aktivnost u različitom stepenu.Iako su CD8 + T ćelije identifikovane kao glavne efektorske ćelije, pokazano je učešće i drugih ćelija u efektorskoj fazi odgovora.Premda se smatra da CD4 + T ćelije imaju prvenstveno regulatornu ulogu, pokazano je da hapten-specifične CD4 + T ćelije mogu da doprinesu inflamaciji, zajedno sa specifičnim CD8 + T ćelijama.U in vitro uslovima, zapaženo je da klon Th1 ćelija izolovan iz kože i krvi pacijenata obolelih od AKD na nikl, ima sposobnost ubijanja humanih keratinocita, ali samo nakon ekspresije MHC II molekula od strane keratinocita, a pod uticajem IFN-γ(Traidl i drugi, 2000).Dakle, za razliku od CD8 + T ćelija koje imaju direktan citotoksičan efekat na keratinocite i doprinose početnoj apoptozi keratinocita, CD4 + T ćelije u saradnji sa CD8 + T ćelijama doprinose tkivnom oštećenju u kasnijoj fazi elicitacije(Traidl i drugi, 2000). Kod miševa, pokazano je da u odsustvu CD8 + T ćelija, CD4 + T ćelije mogu imati efektorsku ulogu u KP na DNFB (Gocinski i Tigelaar, 1990), a zapažena je i niža produkcija IFN-γ od strane CD8 + T ćelija, u odnosu na CD4 + T ćelije, u KP na DNCB (Moussavi i drugi, 1998). p40 subjedinice IL-12 i IL-1β u tretiranom uhu (Asada i drugi, 1997). Nasuprot ovim rezultatima, kod BALB/C miševa sa potpunim ili delimičnim odsustvom ekspresije gena za IL-4 (IL-4 -/-), kod kojih je intenzitet i dužina trajanja KP smanjena, sugerisan je proinflamatorni karakter ovog citokina, značajan za ekspresiju reakcije KP na DNCB, ali ne i OXAZ (Traidl i drugi, 1999). Kod C57BL/6 miševa sa potpunim ili delimičnim odsustvom ekspresije gena za IL-4, takođe je pokazan proinflamatorni karakter ovog citokina, značajan za kasniju fazu elicitacije KP na DNFB (Weigmann i drugi, 1997). STAT-6 (eng. Signal Transducer and Activator of Transcription 6), transkripcioni faktor važan za diferencijaciju Th2 ćelija, ključan je u indukciji reakcije KP na TNCB, DNFB i OXAZ, zahvaljujući stimulaciji sinteze IgE (za koji je IL-4 faktor preuključivanja) i infiltraciji eozinofila i neutrofila na mesto elicitacije reakcije (Yokozeki i drugi, 2000). Kod osoba sa AKD na nikl, koje nemaju atopijsku konstituciju, zapaženo je da CD8 + i CD4 + T ćelije specifične za nikl, izolovane iz periferne krvi ili kožnih lezija tih osoba, produkuju IL-4 (samostalno ili u kombinaciji sa IFN-γ) (Werfel i drugi, 1997). Moguće gena za IL-4 (IL-4 -/-) i IL-10 (IL-10 -/-), pokazano je da IL-10, ali ne i IL-4, suprimira KP na OXAZ (1.4.2.3.3. Druge ćelije uključene u efektorsku fazu reakcije γδ T ćelije mogu da pomažu αβ T ćelijama kao što je pokazano u elicitaciji KP na parafenilendiamin (Yokozeki i drugi, 2001). Takođe, pokazano je da je u odsustvu T i B ćelija kod miševa (Rag -/-miševi), memorija NK ćelija specifična za hapten dovoljna za razvoj KP na DNFB, OXAZ i pikril hlorid (O'Leary i drugi, 2006). 1.4.3. Regulacija reakcije KP Imunski sistem kože, organa koji je često izložen patogenima i agensima iz spoljašnje sredine, mora biti strogo kontrolisan sa ciljem ograničenja inflamacije izazvane bezopasnim antigenima, a uz održavanje sposobnosti eliminacije patogena. U produkcija IL-10, pretežno od strane keratinocita, povećana u koži nakon elicitacije miševa, i da tretman životinja sa rIL-10 pre elicitacije inhibira reakciju KP, ukazujući na značaj ovog citokina u regulaciji KP. Pokazano je da inhibitorni efekat UV zračenja na kožu može biti posredovan povećanom produkcijom IL-10 od strane keratinocita (Rivas i Ulrich, 1992). Imunosupresivan efekat IL-10 ogleda se u inhibiciji produkcije proinflamatornih citokina (IFN-γ, IL-6, IL-1, TNF-α), modulaciji sazrevanja DĆ, i inhibiciji aktivnosti efektorskih T ćelija (O'Gara i Vieira, 2004). Sugerisano je i da IL-10 prevodi Langerhansove ćelije iz imunogenog u tolerogeno stanje tako što suprimira ekspresiju B7 (Ding i drugi, 1992; Enk i drugi, 1993b), izazivajući na taj način anergiju T ćelija u dLČ. Pored keratinocita, mast ćelije takođe mogu biti značajan izvor IL-10 u fazi elicitacije kod miševa, i njegova produkcija može suprimirati zapaljensku reakciju u KP regulisanjem broja leukocita u tretiranoj koži (Grimbaldeston i drugi, 2007). 1. 
4.3.2. Toleranca i regulatorne T ćelije u reakciji KP

  da je produkcija imunosupresivnih citokina, pre svega IL-10, a ne međućelijska interakcija, odgovorna za ovu supresivnu aktivnost Treg (Ring i drugi, 2006). Iako je jasno pokazana uloga ovih ćelija u kontroli imunskog odgovora na mnoge antigene, Treg su ćelije koje još uvek iza sebe ostavljaju više pitanja nego odgovora 


	Visoke koncentracije IFN-γ, oslobođene u toku inflamacije, mogu povećati
	ekspresiju MHC II molekula na površini keratinocita, stimulišući njihovu antigen-
	prezentujuću funkciju CD4 + T ćelijama (Albanesi i drugi, 1998). Kako keratinociti
	minimalno eksprimiraju kostimulatorne molekule CD80 i CD86, prezentacija haptena
	CD4 + T ćelijama u koži izaziva anergiju (stanje funkcionalne inaktivacije) ili apoptozu (Shevach, 2002; Vocanson i drugi, 2009).
	T ćelija, čime se intenzitet i dužina trajanja reakcije KP ograničava (Gober i Gaspari, Druga populacija Treg ćelija, uključena u kontrolu imunskog odgovora kod ljudi 2008). i glodara, su regulatorne ćelije tipa 1 (Tr1) koje se karakterišu po specifičnom
	Regulacija citokinskom profilu, tj. po produkciji visoke koncentracije IL-10. Za razliku od AKD je aktivni imunološki fenomen, posredovan
	supresorskim/regulatornim T ćelijama, na šta ukazuju podaci da se u eksperimentalnom prirodnih CD4 + CD25
	U prisustvu hapten specifičnog signala (kompleksa hapten i MHC molekul) i
	odgovarajućeg kostimulatornog signala (CD80/CD86) iskazanog na površini APĆ,
	naivne T ćelije se aktiviraju i razvijaju u efektorske T ćelije što rezultira međućelijska interakcija posredstvom CTLA-4 inhibitornog receptora koji ima visok senzibilizacijom. Odsustvo kostimulatornog signala, međutim, vodi razvoju imunološke afinitet vezivanja za CD80/CD86, i inhibira produkciju IL-2 bitnu za proliferaciju tolerance. U zavisnosti od gustine antigen/MHC kompleksa na površini APĆ, mogu se efektorskih T ćelija (Gober i Gaspari, 2008). Treg ćelije mogu eksprimirati CLA nakon izazvati najmanje tri nivoa T ćelijske tolerance: aktivna supresija, anergija ili delecija (Rustemeyer i drugi, 2012). interakcije sa DĆ u dLČ, što im omogućava migraciju u kožu (Colantonio i drugi,

(Gober i Gaspari, 2008)a može izazvati adoptivnim transferom limfoidnih ćelija, iz tolerantne u ″naivnu″ (nesenzibilisanu) životinju(Vocanson i drugi, 2009;Rustemeyer i drugi, 2012).Pretpostavlja se da razvoj bolesti zapravo zavisi od ravnoteže između efektorskih i regulatornih mehanizama.Regulacija AKD može biti podeljena na centralnu fazu, koja kontroliše proliferaciju i diferenciju efektorskih T ćelija u dLČ, i perifernu fazu, koja ograničava inflamatorni proces u koži(Gorbachev, 2001).Regulatorne CD4 + T ćelije (Treg) koje konstitutivno i u velikoj gustini eksprimiraju α lanac IL-2 receptora (CD25), CTLA-4 i transkripcioni faktor Foxp3 (eng.Forkhead box p3), smatraju se prvom linijom kontrole imunskog odgovora u AKD(Vocanson i drugi, 2009).Njihovo in vivo uklanjanje nakon tretmana miševa sa odgovarajućim antitelima u vreme senzibilizacije, vodi povećanoj proliferaciji CD8 + T ćelija i intenzivnijoj inflamatornoj reakciji u koži nakon elicitacije reakcije KP(Dubois i drugi, 2003).Kod ljudi, CD4 + CD25 + T ćelije izolovane iz periferne krvi pacijenata alergičnih na nikl pokazuju ograničenu sposobnost da suprimiraju aktivnost CD4 + i CD8 + T ćelija specefičnih za nikl, za razliku od Treg ćelija izolovanih iz zdravih osoba.Ovi rezultati su sugerisali da se AKD može razviti kao posledica poremećene funkcije Treg ćelija(Cavani i drugi, 2003).Jedan od predloženih mehanizama delovanja Treg je 2002).U vezi sa tim, Ring i drugi su ukazali na to da Treg suprimiraju reakciju KP blokiranjem migracije efektorskih T ćelija u tretiranu kožu miša.Međutim ova grupa autora je sugerisala + Treg, koje potiču iz timusa, ove ćelije mogu nastati in vivo i in vitro nakon antigenske stimulacije u tolerogenim uslovima, tj.u prisustvu IL-10 (Roncarolo i drugi, 2006).U AKD na nikl kod ljudi, Tr1 ćelije specifične za nikl su izolovane iz periferne krvi i kožnih lezija alergičnih osoba, ali u većem broju iz periferne krvi zdravih osoba(Cavani i drugi, 2000).In vitro, ove ćelije inhibiraju specifičan Th1 i Tc1 imunski odgovor blokiranjem antigen-prezentujuće funkcije DĆ i monocita, putem zavisnim od IL-10, i pretpostavka je da na ovaj način ograničavaju preterano tkivno oštećenje kod alergičnih osoba, tj.razvoj bolesti kod osoba koje nisu sklone alergijama(Cavani drugi, 2000).Sugerisano je da Treg ćelije zapravo stimulišu IL-10 produkciju od strane Tr1, i na taj način zajedno funkcionišu sa ciljem ograničenja i suprimiranja imunskog odgovora na haptene(Gober i Gaspari, 2008).Ponavljano nanošenje suboptimalne doze jakih haptena, kao što su DNFB i OXAZ, izaziva tolerancu koja onemogućava senzibilizaciju efektorskih ćelija i razvoj KP, čak ni nakon primene optimalne doze haptena.Ovaj fenomen označen je kao toleranca niske doze (eng.LZT, Low Zone Tolerance), i ona je posredovana CD8 + T ćelijama koje produkuju IL-4/IL-10 (Maurer i drugi, 2003).LZT se smatra najzastupljenijim mehanizmom tolerance na haptene kod ljudi (Vocanson i drugi, 2009).1.5. 
Pacov kao eksperimentalni model za ispitivanje reakcije KP Iako

  dosta ispitivana, postoje mnoge kontroverze vezane za reakciju KP.AO, BN, Lew) i outbrednih (Wistar, SD) sojeva pacova koji razvijaju različit profil imunskog odgovora (Th1/Th2) na iste stimuluse, sugerisan je značaj genetičke pozadine u ispitivanjima reakcije KP.Komparativno ispitivanje KP kod Lew pacova, koji preferencijalno razvijaju Th1 imunski odgovor, i Brown Norway (BN) pacova, sklonih Th2-imunskom odgovoru, pokazalo je intenzivniji otok uha nakon elicitacije Lew pacova, sugerišući značajnu ulogu Th1 ćelija u razvoju eksperimentalne kontaktne alergije kod pacova(Peszkowski i drugi, 1994).Sojne razlike u senzibilizaciji na DNCB pokazane su i kod Wistar (Wi) i BN pacova, s obzirom da senzibilisani BN pacovi pokazuju manje izražene mikroskopske i makroskopske promene u uhu nakon elicitacije, u odnosu na Wi pacove (Kuper i drugi, 2008).Supresivni efekat cirkulišućeg za ispitivanje faze senzibilizacije(Arts i drugi, 1996).Osim težine dLČ i broja proliferišućih ćelija nakon senzibilizacije pacova sa kontaktnim alergenima(Arts i drugi, 1996), ostali parametri aktivnosti, kao što su citokinski profil ili T-ćelijski sastav dLČ, koji mogu dati jasniju sliku o mehanizmima ove faze reakcije, nisu dovoljno ispitani kod pacova. 


	Reakcija KP dala je uvid u osnovne mehanizme AKD, korišćenjem najčešće 2. Ciljevi rada mišjeg modela bolesti. Iako dosta ispitivana, brojni kontradiktorni rezultati vezani za
	pojedine aspekte reakcije KP nameću neophodnost boljeg poznavanja patogeneze
	Korišćenje različitih eksperimentalnih procedura, kao i sojeva životinja, pre svega bolesti, sa ciljem razvoja novih terapeutskih modaliteta. Korišćenje drugih
	miševa, mogu biti u osnovi oprečnih rezultata dobijenih za pojedine aspekte ove 1.5.1. Dosadašnja istraživanja reakcije KP na pacovu eksperimentalnih životinja, osim miševa, može unaprediti znanje o imunobiologiji
	reakcije. Takođe, zbog ekonomskog i tehničkog aspekta (jednostavnost korišćenja, kontaktnih alergija. Pacov je jedna od najčešćih eksperimentalnih vrsta u svim Mali je broj podataka o mehanizmima reakcije KP kod pacova, pretežno sa dostupnost velikog broja reagenasa, razvoj velikog broja genetski modifikovanih oblastima biomedicinskih istraživanja, čije korišćenje je omogućilo značajan napredak u akcentom na eferentnoj fazi reakcije. Prop i drugi su prvi optimizovali uslove za sojeva) reakcija KP je najviše ispitivana na miševima. Ispitivanje mehanizama ove bazičnim i primenjenim saznanjima. Iako je pre više od dvadeset godina ova vrsta senzibilizaciju i elicitaciju KP kod pacova, korišćenjem TNCB-a i DNFB-a (Prop i reakcije i na drugim eksperimentalnim životinjama može dati jasniju sliku predložena kao dobar eksperimentalni model za ispitivanje kontaktnih alergija drugi, 1986). Ova grupa istraživača je pokazala da intravensko ubrizgavanje haptena patofiziologije bolesti, što može biti bitno u translacionim studijama. U vezi sa tim, kod Dark Agouti (DA) pacova izaziva specifičnu supresiju reakcije, posredovanu (Scheynius i drugi, 1988), mehanizmi reakcije KP kod pacova ostali su nedovoljno
	karakteristične za Th1-i Th2-ćelije, sa pikom Th1 odgovora 24 časa, i Th2 odgovora 8 časova nakon elicitacije (Hartmann i drugi, 2006). Komparativno ispitivanje reakcije supresorskim OX8 + (CD8 Scheynius, 1990). Dozno-zavisno povećanje produkcije TNF-α i NO u kondicioniranom KP kod sojeva koji se razlikuju u Th1/Th2 ravnoteži u imunskim reakcijama, mogu biti
	ispitivanje imunomodulatornog efekta fotohemoterapije (Van Iperen i Beijersbergen, medijumu organokulture uha kod DA i Albino Oxford (AO) pacova nakon elicitacije sa značajni za ispitivanje prirode imunskog odgovora u reakciji KP, kao jedne od aktuelnih pokazano da u drugim zapaljenskim reakcijama razvijaju kvalitativno i/ili kvantitativno
	1993; 1997). TCDD (2,3,7,8-Tetrahlorodibenzo-p-dioxin), morfin, hormon stresa, samo DNCB-om, ukazalo je na značaj ovih medijatora u ekspresiji reakcije KP kod pacova kontroverzi, ali i za ispitivanje mehanizama koji su u osnovi veće ili manje osetljivosti različit tip imunskog odgovora (Th1 ili Th2) na isti stimulus. U okviru ciljeva ovog rada
	su neki od agenasa čiji efekat na ćelijsku imunost je ispitivan na modelu KP kod pacova (Kataranovski i drugi, 2002a; 2002b). Sniženje NO produkcije u kondicioniranom pojedinih sojeva na razvoj KP. ispitaće se doprinos Th1 i Th2 citokina u fazi senzibilizacije i elicitacije, kao jednoj od
	(Walker i drugi, 2004; Nelson i drugi, 1999; Dhabar i McEwen, 1999). Generalno, medijumu, zabeleženo je u prisustvu aminoguanidina (Kataranovski i drugi, 2002a), LLNA kod miševa je prihvaćen kao najprecizniji i najčešće korišćeni test za postojećih kontroverzi ove reakcije, kao i učešće citokina IL-17 u reakciji KP kod ove
	pacov je najčešće korišćena vrsta u imunotoksikološkim istraživanjima, pre svega zbog inhibitora NO sa specifičnošću za iNOS kod pacova (Nakane i drugi, 1995). U vezi sa ispitivanje senzibilišućeg potencijala različitih hemikalija. Komparativno ispitivanje vrste. Za senzibilizaciju i elicitaciju životinja koristile bi se dve doze haptena, s obzirom

(Duprat, 1989), 1985) dvadeset godina predloženi kao dobar eksperimentalni model za ispitivanje kontaktnih alergija(Scheynius i drugi, 1988), posebno sistemskih manifestacija reakcije, pre svega na perifernu krv i udaljene organe imunskog sistema(Koller i Exon, 1985).Uprkos tome, od tada manji broj podataka je dobijen na pacovskom modelu bolesti, ostavljajući ga u senci mišjeg modela.Reakcija KP se koristi i kao model za ispitivanje imunosupresivnog i antiinflamatornog karaktera potencijalnih terapeutskih agenasa, kao i za ispitivanje imunotoksičnosti različitih hemikalija(Duprat, 1989).Kao reakcija koja započinje, i ispoljava se u koži, KP je dobar model za ispitivanje imunomodulatornog efekta ksenobiotika koji deluju preko kože, uključujući i fizičke faktore, kao što su zračenje i termičke povrede (Simon i drugi, 1994;Cetinkale i drugi, 1999).Pored mišjeg modela, pacovski model KP koristi se u ove svrhe.Kako je pacov najčešće korišćena vrsta za ispitivanje imunskih funkcija nakon izazivanja termalnih povreda, pacovski model KP se pokazao korisnim za ispitivanje efekta agenasa koji se koriste u tretmanu kod ovih povreda(Cetinkale i drugi, 1999).Pokazano je da je pacovski model KP pogodan za svoje veličine i mogućnosti korišćenja različitih organa za analizu, što pacovsku KP čini dobrim modelom za ispitivanje lokalnog i sistemskog imunomodulatornog efekta raličitih fizičkih i hemijskih agenasa, ali i terapeutskih modaliteta u lečenju AKD.U svetlu toga, neophodna je bolja karakterizacija reakcije KP kod pacova.+ ) T ćelijama, koja deluje na nivou faze indukcije, ali ne i ekspresije reakcije(Prop i drugi, 1986). Kasnije, druga grupa istraživača po prvi put je sugerisala delovanje odvojenog supresorskog mehanizma na nivou eferentne faze reakcije na TNCB kod DA pacova, posredovanog CD8 + T ćelijama i makrofagima iz slezine i peritonealne šupljine (Nanishi i Battisto, 1990). Rani radovi na DA pacovima pokazali su stimulatorni uticaj IFN-γ na ekspresiju MHC II molekula na površini keratinocita, i povećanje ćelijskog infiltrata u dermu (Scheynius i drugi, 1986), stanje karakteristično za kasnu fazu AKD kod ljudi (Scheynius i Tjernlund, 1984). Nasuprot ovim rezultatima, uloga IFN-γ u ekspresiji reakcije KP pacova se pokazala kontraverznom, s obzirom da je neutralizacija ovog citokina dovela do smanjenja ekspresije MHC II molekula na keratinocitima, uz povećanje ekspresije reakcije na DNFB kod Lewis (Lew) pacova (Skoglund i drugi, 1988). Takođe, tretman Lew pacova sa rekombinantnim IFN-γ pre i u toku elicitacije potvrdio je regulatornu ulogu ovog citokina u ekspresiji reakcije, verovatno u kontekstu samoregulacije (Skoglund i tim, povećanje ekspresije mRNK za iNOS zabeleženo je u koži uha Crl: CD (SD) pacova nakon elicitacije sa DNFB-om (Hartmann i drugi, 2006). Korišćenjem inbrednih (DA, IL-10 na ekspresiju KP kod pacova pokazan je nakon unošenja ekspresionog vektora za humani IL-10 u keratinocite dorzalne kože senzibilisanih pacova, koji razvijaju slabiji otok uha nakon elicitacije (Meng i drugi, 1998). Iako su istraživanja ekspresije reakcije KP na pacovima pretežno vršena na nivou promena u uhu, pojedinačni radovi ispitivali su ovu fazu reakcije na nivou dLČ. Nakon elicitacije BN pacova sa DNCB-om zabeleženo je povećanje produkcije IFN-γ i IL-12 u dLČ, uz nižu produkciju IL-10 i odsustvo produkcije ostalih Th2 citokina (IL-4 i IL-13), sugerišući efektorsku ulogu Th1 ćelija (Dearman i drugi, 2002). Hartmann i drugi, koji su ispitali profil genske ekspresije u koži i dLČ kod pacova nakon elicitacije sa DNFB-om, potvrdili su aktivaciju IFN-γ-puta u dLČ i koži. Međutim, ovi autori su sugerisali da KP kod pacova nije čisto Th1 polarizovana, već uključuje i Th2 i citotoksične ćelije, kao i mast ćelije i B ćelije. Naime, oni su pokazali različitu dinamiku ekspresije gena za citokine LLNA na dva alergena, DNCB i TMA (trimetil amin), kod miševa i pacova, pokazala su da je pacov takođe dobra test životinja za LLNA, sugerišući da je ova vrsta dobar eksperimentalni model istraženi. Karakterizacija reakcije KP kod pacova može doprineti boljem razumevanju patofiziologije bolesti, i, s obzirom da je pacov najčešće korišćena vrsta u toksikološkim i farmakološkim studijama, može biti značajna za ispitivanje imunomodulatornog efekta fizičkih i hemijskih agenasa, kao i efikasnosti agenasa u terapiji AKD. Ciljevi ovog rada su (1) ispitivanje mehanizama indukcije reakcije KP kod pacova, kroz analizu dinamike promena aktivnosti ćelija dLČ (aksilarni i skapularni LČ) u toku faze senzibilizacije, kao i (2) ispitivanje efektorskih mehanizama reakcije, pomoću analize produkcije inflamatornih medijatora u kondicioniranom medijumu organokulture uha, i pomoću analize promena aktivnosti ćelija dLČ (aurikularni LČ), nakon elicitacije senzibilisanih životinja. Iako su prethodna istraživanja reakcije KP sugerisala da odabir genetičke podloge, tj. soja miša (Fachet i Ando, 1977) ili pacova (Kuper i drugi, 2008; Arts i drugi, 1996; Peszkowski i drugi., 1994), može uticati na pojedine aspekte reakcije, ćelijski i molekulski mehanizmi u osnovi ovih razlika nisu dovoljno ispitani. U svetlu toga, u radu će se koristiti dva soja pacova, Dark Agouti i Albino Oxford, za koje je da je u studijama AKD kod ljudi pokazano da intenzitet reakcije zavisi od doze haptena (Friedman i drugi, 1983; Friedman, 2007). 
. Indukcija i elicitacija reakcije kontaktne preosetljivosti

  
	senzibilizacije/elicitacije 0%/0.13% i 0%/1.3%). Za ispitivanje efekta doze
	senzibilizacije na intenzitet reakcije KP, životinje su senzibilisane sa 0.4% ili 4%
	DNCB, nakon čega je reakcija izazvana sa 0.13% DNCB (režim
	senzibilizacije/elicitacije 0.4%/0.13% i 4%/0.13%). Intenzitet reakcije KP je ispitivan
	24 časa nakon elicitacije, merenjem promene debljine desnog uha, kao in vivo mere
	ekspresije reakcije KP. Debljina uha je merena mikrometrom (šublerom) neposredno
	pre elicitacije reakcije i 24 časa nakon elicitacije (najmanje šest merenja za svako uho),
	100 μl 0.4% ili 4% (w/v) DNCB-a pažljivo je razmazivano na površinu
	kože (otprilike 16 cm 2 ) nastavkom pipete. Pet dana nakon druge aplikacije haptena
	reakcija kontaktne preosetljivosti (KP) je izazivana ponovnim nanošenjem 50 μl tri puta
	manje koncentracije DNCB-a (0.13% ili 1.3%) na dorzalnu i ventralnu površinu desnog
	uha (elicitacija) (režimi senzibilizacije/elicitacije 0.4%/0.13% i 4%/1.3%). Kontrolnim
	(nesenzibilisanim) životinjama je nanošen samo rastvarač u fazi senzibilizacije i
	elicitacije (DNCB doza senzibilizacije/elicitacije 0%/0%) (Slika 1.). Jednoj grupi
	nesenzibilisanih životinja je nanošen DNCB (0.13% ili 1.3%) u fazi elicitacije (režim

i promena u debljini uha je definisana kao razlika debljine posle i debljine pre elicitacije.Površina isečenog uha (mm 2 ) određivana je pomoću programa ImageJ, nakon čega su izračunavane vrednosti mase uha po jedinici površine.Nakon tretmana, životinje su držane u zasebnim kavezima.Slika 1 
Određivanje metaboličke vijabilnosti ćelija drenirajućeg limfnog čvora pomoću MTT testa

  Za određivanje proliferativnog odgovora nakon in vitro stimulacije sa rIL-2 (50 ij/ml), 100 μl suspenzije (0.6x10 6 ćelija/ bunariću) sa 20 μl medijuma ili 20 μl rIL-2 postavljano je u duplikatu, i kultivacija je vršena 24 časa. Nakon 16 časova kulture dodat je [ 3 H]-timidin. Proliferativni odgovor ćelija na in vitro stimulaciju sa IL-2 Sveže izolovanim ćelijama i ćelijama koje su gajene u kulturi 24 h dodavan je MTT u koncentraciji od 500 μg/ml kulture i inkubacija je nastavljana još tri sata. Nastali formazan ekstrahovan je preko noći pomoću zakišeljenog natrijum dodecil sulfata (eng. SDS, Sodium Dodecyl Sulfate) (10% SDS / 0,01N HCl). Absorbanca je merena pomoću ELISA čitača (GRD, Rim, Italija) na talasnoj dužini od 540 nm, a korekcija je rađena natalasnoj dužini od 670 nm. MTT indeks je izražen kao odnos između MTT redukcijezabeležene od strane ćelija koje su gajene 24 h i MTT redukcije zabeležene od strane sveže izolovanih ćelija. 


	unutarćelijsko bojenje dodavanjem Foxp3 antitela konjugovanih sa PE-Cy5, 30 minuta
	na sobnoj temperaturi. Procenat Foxp3 pozitivnih ćelija analiziran je unutar
	CD4 + CD25 + populacije ćelija, nakon čega je preračunavana zastupljenost CD4 + CD25 +
	jeizražen kao razlika između proliferacije zabeležene kod IL-2-stimulisanih i
	nestimulisanih ćelija.
	Za određivanje proliferativnog odgovora nakon in vitro stimulacije ćelija sa
	3.5.1. Priprema ćelija drenirajućih limfnih čvorova haptenom, 200 μl ćelijske suspenzije (1.2x10 6 ćelija/ bunariću) sa 40 μl medijuma ili 40
	U fazi senzibilizacije, prvog, trećeg i petog dana nakon druge aplikacije DNCB-μl DNBS-a (10 μg/ml kulture), koji je analog DNCB-u rastvorljiv u vodi, postavljano je 3.5.4. Analiza zastupljenosti ćelijskih populacija na protočnom citofluorimetru
	a ili rastvarača izolovani su čvorovi koji dreniraju dorzalnu površinu kože (aksilarni i u triplikatu i kultivisano tokom 96 časova. Poslednjih 16-18 časova kulture dodat je U drenirajućim limfnim čvorovima izolovanim trećeg i petog dana
	U svim ispitivanim testovima ćelije su kultivisane u inkubatoru za gajenje ćelija (Flow Laboratories CO 2 incubator 1500, ICN Flow, SAD), pod standardnim uslovima (vlažna atmosfera, temperatura 37 0 C, koncentracija CO 2 5%). senzibilizacije, i 24 časa nakon elicitacije, ispitivana je zastupljenost CD4 + i CD8α + [ Metabolička vijabilnost ćelija drenirajućeg limfnog čvora u fazi elicitacije određivana je pomoću kvantitativnog kolorimetrijskog testa koji se zasniva na metaboličkoj redukciji tetrazolijumove soli MTT, od strane enzima endoplazmatskog retikuluma i mitohondrija, do krajnjeg obojenog produkta formazana (Oez i drugi,1990). MTT redukcije nema u odsustvu ćelija, a povećava se sa povećanom ćelija. Zastupljenost CD25 Zastupljenost CD4 + CD25 + Foxp3 + ćelija određivana je u drenirajućim limfnim
	3.5.2. Testovi proliferacije ćelija drenirajućeg limfnog čvora aktivnošću i proliferacijom ćelija (Mossman, 1983). čvorovima izolovanim 24 časa nakon elicitacije. Suspenzija (1x10 6 ćelija) je inkubirana
	Za određivanje ex vivo (0h) proliferativne aktivnosti, 200 μl pripremljene MTT test je sprovođen zasejavanjem ćelija drenirajućeg limfnog čvora (0,1 x sa direktno obeleženim antitelima za CD4 (FITC) i CD25 (PE) 45 minuta na +4 0 C.
	suspenzije ćelija (1.2x10 6 ćelija/ bunariću) postavljano je u duplikatu u ploče sa 96 10 6 u 100μl) u bunariće ploče za mikrokulturu sa 96 mesta sa ravnim dnom, u triplikatu. Posle dva ispiranja u PBS/0.1% natrijum azid, izvršena je permeabilizacija ćelijske
	mesta (Spektar, Čačak, Srbija). [ 3 H]-timidin (0.5μCi/bunariću) je dodavan na početku membrane, inkubacijom ćelija sa 1 ml komercijalnog rastvora za fiksaciju i
	permeabilizaciju (eBioscience Inc, San Diego, Ca, SAD) na +4 0 C, 60 minuta. Nakon
	permeabilizacije ćelije su ispirane u permeabilizacionom puferu, i izvršeno je

skapularni), dok su 24 časa nakon elicitacije reakcije izolovani čvorovi koji dreniraju uho na koje je nanesen hapten (aurikularni čvorovi).S obzirom na malu veličinu, aurikularni limfni čvorovi su vizuelizovani ubrizgavanjem boje Patent plavo V (Sigma-Aldrich Inc, St. Luis, MO, SAD) u bazu uha.Suspenzija ćelija drenirajućih limfnih čvorova (dLČ) pripremana je pod aseptičnim uslovima mehaničkim istiskivanjem ćelija kroz najlon mrežice sa dijametrom pora 20 μm (Cell strainer, BD Falcon, BD Bioscience, Bedford, SAD).Nakon ispiranja, ćelije su resuspendovane u medijumu.Ukupan broj ćelija i vijabilnost su određivani brojanjem ćelija razblaženih u 0.1% Tripan plavo, pomoću Neubauer hemocitometra.Vijabilnost je određivana pomoću formule broj živih/broj mrtvih x 100%, i uvek je prelazila 95 %.Koncentracija ćelija je podešavana na 6x10 6 /ml.kulture, nakon čega su ploče inkubirane u trajanju od 16 do 18 časova.3H]-timidin.Proliferativni odgovor ćelija na in vitro hapten je izražen kao razlika između proliferacije zabeležene kod hapten-stimulisanih i nestimulisanih ćelija.Skidanje kultura vršeno je pomoću automatskog skidača kultura (Titertec CellHarvester, ICN Flow, SAD).Proliferativna aktivnost određivana je na osnovu ugradnje radioaktivno obeleženog timidina u ćelijsku DNK, mereno β-scintilacionim brojačem (LKB-1219, Rackbeta, Finska).Proliferacija je izražena kao broj otkucaja na minut (b.o.m.) duplikata kultura.3.5.3.+ ćelija ispitivana je u drenirajućim limfnim čvorovima izolovanim prvog dana senzibilizacije, i 24 časa nakon elicitacije. Membranska ekspresija CD4, CD8α, i CD25 molekula određivana je nakon inkubacije ćelija sa direktno obeleženim antitelima-CD4 antitelom obeleženim sa FITC-om i CD8α i CD25 antitelima obeleženim sa PE-om. 1x10 6 ćelija inkubirano je sa antitelima u finalnoj zapremini od 100 μl, 45 minuta na +4 0 C. Nakon toga ćelije su ispirane dva puta u PBS/0.1% natrijum azid, i zatim fiksirane dodavanjem 400 μl 1% paraformaldehida. Svi koraci su rađeni na +4 0 C. Analiza je vršena na FACScalibur protočnom citofluorimetru (BD Biosciences, Heidelberg, Germany), i analizirano je minimum 10000 događaja po uzorku. Rezultati su izraženi kao srednji procenat zastupljenosti pozitivnih ćelija u ćelijskoj populaciji uzoraka pojedinačnih životinja, dok je za CD25 molekul određivana i gustina ekspresije merenjem srednjeg intenziteta fluorescence. Ukupni broj pozitivnih ćelija je izračunavan množenjem procenta pozitivnih ćelija sa ukupnim brojem ćelija, za svaku pojedinačnu životinju. 
2 Određivanje aktivnosti mijeloperoksidaze (MPO test) unutar ćelija iz organokulture eksplanata kože uha

  
	ispunjene sa 1.2 ml medijuma. Kultivacija je vršena pod standardnim uslovima (vlažnaatmosfera na 37 0 C i 5% CO 2 ) tokom 48 časova, i nakon centrifugiranja 10 10 minuta na sobnoj temperaturi. Apsorbanca je merena pomoću ELISA čitača, na DNCB je jedan od najčešće korišćenih haptena u ispitivanju reakcije kontaktne 4. Rezultati talasnoj dužini 570 nm, a korekcija je vršena na 650 nm. Kvantifikacija nitrita preosetljivosti (KP). Najčešće korišćena doza DNCB-a za senzibilizaciju miševa
	minuta na 1400 obrtaja/minut sakupljen je supernatant (kondicionirani medijum u jeodređivana pomoću standardne krive konstruisane korišćenjem poznatih koncentracija (Dearman i drugi, 2002; Plitnick i drugi, 2002; Dearman i dugi, 2005) i pacova (Kuper i
	kojem su gajeni uzorci kože uha). U sakupljenom kondicioniranom medijumu natrijum-nitrita (NaNO 2 ). drugi, 2008) je 1%, mada se koriste i niže doze, počevši od 0.5% (Kuper i drugi, 2008;
	određivana je koncentracija nitrita, pomoću Griessove reakcije, i citokina, pomoću Cumberbatch i drugi, 1993; Urlich i drugi, 2001), kao i više doze ovog haptena kao što
	ELISA. su 2.5% (Jőrundsson i drugi, 1999; Xu i drugi, 1997) ili 5% (Traidl i drugi, 1999). U 3.7. Imunoenzimski test na čvrstoj fazi (eng. ELISA, Enzyme-
	ovom radu korišćene su dve DNCB doze senzibilizacije, 0.4% i 4%, s obzirom da su Linked Immuno Sorbent Assay) Produkcija citokina u kondicioniranom medijumu kulture ćelija dLČ i organokulture isečaka kože uha, određivana je korišćenjem komercijalno dostupnih ELISA setova, prema uputstvu proizvođača. Absorbanca je merena na ELISA čitaču (GRD, Rim, Italija) na talasnoj dužini od 450 nm (referentna vrednost 570 nm). korišćenjem poznatih koncentracija odgovarajućih rekombinatnih citokina, i izražavana je u pg/ml. 3.8. Statistika Program za obradu podataka je Statsoft STATISTIKA v7.0.61.0. (StatSoft Inc., Tulsa, naša preliminarna ispitivanja pokazala da elicitacija reakcije KP kod pacova senzibilisanih sa dozama 0.4% ili 4% dovodi do najizraženije razlike u intenzitetu reakcije: za razliku od doze 0.4% koja dovodi do reakcije slabog intenziteta, viša doza (4%) dovodi do značajno većeg intenziteta reakcije praćenog izraženim mikroskopskim promenama u tretiranom uhu. 3.6.3.6.3. Određivanje nivoa nitrita Griessovom metodom Koncentracija citokina je preračunavana na osnovu standardne krive konstruisane Životinje su senzibilisane nanošenjem DNCB-a u koncentraciji 0.4% ili 4%
	Griessova reakcija prvi put je opisana 1879. godine (Griess, 1879), i od tada je OK). Statistički značajnim smatrane su p vrednosti manje od 0,05.
	najčešće korišćena metoda za određivanje nivoa nitrita (NO 2 -), kao mere oslobađanja
	3.6.1. Organokultura eksplanata kože uha azot-oksida, u različitim biološkim tečnostima. Griessov reagens čine sulfonilamid (SA)
	Nakon uzorkovanja, cele uši na koje je nanesen rastvarač ili DNCB su ispirane i N-(1-Naftil etilendiamin) (NAD) u odnosu 1:1. U ovoj metodi, nitriti u prisustvu SA, u
	prvo u fiziološkom rastvoru a zatim u medijumu sa gentamicinom. Nakon ispiranja, uslovima kisele sredine, formiraju prelaznu diazonijum so, koja zatim reaguje sa NAD i
	formira stabilno azo jedinjenje ljubičaste boje (Sun i drugi, 2003). 50 μl supernatanta
	organokulture uzoraka kože uha je pomešano sa 50 μl Griessovog reagensa, i inkubirano

pincetom je lagano odvojena ventralna od dorzalne površine uha, i tako dobijene polovine ušiju su postavljane u ploče sa 24 mesta (Sarstedt, Nümbrecht, Germany) Nakon centrifugiranja i sakupljanja supernatanta u kome su odgajani uzorci kože uha (eksplanti), ćelije spuštene na dno ploče su prikupljane laganim resuspendovanjem u svežem medijumu.Ukupan broj ćelija i vijabilnost su određivani brojanjem ćelija razblaženih u Tripan plavo (0.1%), pomoću Neubauer hemocitometra.Aktivnost mijeloperoksidaze u ćelijama određivana je na osnovu oksidacije supstrata O-dianizidin dihidrohlorida u prisustvu H 2 O 2 (Bozeman i drugi, 1990).Test je vršen dodavanjem 33 μl lizata (4 x 10 5 ) ćelija u 966 μl rastvora supstrata.Apsorbanca je očitavana nakon 10 minuta na talasnoj dužini od 450 nm.Aktivnost mijeloperoksidaze u ćelijama preračunavana je pomoću standardne krive konstruisane sa standardom mijeloperoksidaze (Sigma-Aldrich Inc, St. Luis, MO, SAD), a rezultat izražavan kao jedinice MPO na 10 6 ćelija.Svaka serija eksperimenata rađena je najmanje dva puta, a rezultati dobijeni iz svih eksperimenata izraženi su kao srednja vrednost sa standardnom devijacijom.Za statističku analizu korišćen je neparametarski Mann-Whitney U test, a za ispitivanje korelacija između parametara imunskog odgovora korišćena je linearna regresija.(w/v),rastvorenog u smeši acetona i maslinovog ulja (rastvarač) na prethodno ošišanu površinu leđa, dva dana zaredom.Pet dana nakon druge aplikacije DNCB-a reakcija je izazvana nanošenjem tri puta manje koncentracije haptena (0.13% ili 1.3%) na površinu uha (elicitacija reakcije).Kontrolne životinje tretirane su samo rastvaračem i u fazi senzibilizacije i elicitacije.Eksperimentalne grupe prikazane su u Tabeli 1.Tabela 1. 
Doze DNCB-a korišćene u fazi senzibilizacije i elicitacije reakcije kontaktne preosetljivosti

  
	4.1.		
	Doza DNCB-a korišćena za	Doza DNCB-a korišćena za	Tretman (Doza
	senzibilizaciju	elicitaciju	senzibilizacije/doza elicitacije)
	0%	0%	0% / 0%
	0%	0.13%	0% / 0.13%
	0%	1.3%	0% / 1.3%
	0.4%	0.13%	0.4% / 0.13%
	4%	0.13%	4% / 0.13%
	4%	1.3%	4% / 1.3%

Promene u uhu 24 časa nakon elicitacije reakcije kontaktne preosetljivosti kod senzibilisanih pacova 4.1.1. Otok uha kao in vivo mera ekspresije reakcije KP

  
	Nakon elicitacije reakcije KP zabeleženo je povećanje otoka uha, izraženo kao
	promena u debljini uha, kod jedinki oba soja tretiranih samo sa višom dozom haptena
	(tretman 4%/1.3%), u odnosu na kontrolne životinje (tretman 0%/0%). Zabeleženo

povećanje otoka uha je značajno niže kod AO u odnosu na DA jedinke (Slika 1A).Merenje promene mase uha po jedinici njegove površine potvrdilo je povećanje otoka uha nakon primene samo više doze kod oba soja, značajno niže kod AO u odnosu na DA soj (Slika 1B). Slika 1 
. Otok uha kao in vivo mera ekspresije reakcije kontaktne preosetljivosti kod pacova

  
	4.1.2. Histološke promene u uhu nakon elicitacije senzibilisanih životinja
	Na histološkim presecima uha nakon elicitacije reakcije kod senzibilisanih
	pacova oba soja primetna je inflamacija, sa karakterističnim edemom i infiltracijom
	leukocita (Slika 2C, D, E, F), dok su nalazi kod kontrola bez promena (Slika 2A, B).
	Kod pojedinih jedinki DA soja nakon primene niže doze DNCB-a (tretman
	0.4%/0.13%) (Slika 2C) uočeni su edem derma, uz prisustvo povećanog broja limfocita
	i fibroblasta u dermu, kao i kongestija kapilara. Kod jedne životinje uočena je
	superficijalna mikropustula sa neutrofilnom spongiozom, kao i spongioza i egzocitoza
	limfocita u epiderm. Kod dve od devet životinja nisu zapažene promene. Nakon
	primene više doze DNCB-a kod ovog soja (tretman 4%/1.3%) (Slika 2E), kod svih
	životinjama je nanošen rastvarač i u fazi senzibilizacije i elicitacije (režim doza
	senzibilizacije/doza elicitacije 0%/0%). Otok uha predstavljen je kao razlika u debljini uha
	izmerena 24 časa nakon elicitacije reakcije i neposredno pre elicitacije (A), i kao promena mase
	uha po jedinici njegove površine (B). Rezultati su prikazani kao srednja vrednost otoka uha iz
	najmanje tri nezavisna eksperimenta ± SD. Statistički značajne razlike: ** p<0.01, *** p<0.001 u
	odnosu na kontrolne jedinke odgovarajućeg soja; s p<0.05, ss p<0.01 u odnosu na jedinke DA
	soja.

. Pet dana nakon senzibilizacije životinja sa dozama DNCB-a 0.4% ili 4% reakcija kontaktne preosetljivosti je izazvana nanošenjem tri puta manje koncentracije haptena na površinu uha (režim doza senzibilizacije/doza elicitacije 0.4%/0.13% i 4%/1.3%). Kontrolnim analiziranih jedinki izražen je inflamatorni proces, sa karakterističnim edemom, praćen gustim infiltratom limfocita u dermu, kao i povećanim brojem neutrofila, pretežno u lumenu kapilara. Kod pojedninih jedinki primećena je ulceracija i vezikulopustula, uz izraženu spongiozu i egzocitozu limfocita u epiderm. Najčešći nalaz kod jedinki AO soja tretiranih nižom dozom DNCB-a (Slika 2D) je kongestija kapilara u dermu i subepidermalno, uz ređu homogenizaciju kolagenih vlakana derma, kao i lako povećanje broja fibroblasta u dermu. Nakon primene više DNCB doze kod AO soja (Slika 2F), zapažen je povećan infiltrat limfocita u dermu kod većine ispitivanih jedinki, uz izraženu spongiozu i egzocitozu limfocita u epiderm kod pojedinih jedinki. Kod ove doze zapažena je izražena promena na kapilarima (kongestija, dilatacija ili komprimovanje), kao i lako povećanje broja fibroblasta i mastocita u dermu. 
KP kod pacova 4.2.1. Doprinos faze senzibilizacije povećanju otoka uha nakon elicitacije reakcije KP

  
	Reakcija KP započinje fazom senzibilizacije, u toku koje dolazi do aktivacije T
	ćelijskog imunskog odgovora u limfnim čvorovima, a koja je neophodna za ekspresiju
	reakcije (Rennert i drugi, 2001).
	U cilju ispitivanja doprinosa faze senzibilizacije promenama otoka uha nakon
	elicitacije reakcije, kao i primarnog iritantnog efekta haptena, nesenzibilisanim
	životinjama je na površinu uha nanet DNCB koncentracije 0.13% ili 1.3% (Slika 3).
	Nakon primene niže doze DNCB-a (tretman 0%/0.13%) nisu zapažene promene otoka
	uha ni kod DA (Slika 3A) ni kod AO (Slika 3B) soja, u odnosu na nesenzibilisane
	jedinke (tretman 0%/0%), što ukazuje na slab iritantan efekat ove doze haptena.
	Efekat doze senzibilizacije na intenzitet reakcije KP ispitan je nakon primene
	niske, slabo iritantne doze DNCB-a (0.13%) na uho DA jedinki prethodno
	senzibilisanih sa dve različite doze DNCB-a (0.4% ili 4%). Elicitacija reakcije kod
	životinja senzibilisanih nižom dozom (tretman 0.4%/0.13%) nije statistički značajno
	promenila otok uha u odnosu na nesenzibilisane kontrole (tretman 0%/0.13%), za
	razliku od elicitacije reakcije kod životinja senzibilisanih sa višom dozom (tretman
	4%/0.13%) kod kojih je značajno povećan otok uha (Slika 3C). Histološka analiza
	preseka uha pokazala je obilniji infiltrat mononuklearnih ćelija u dermu životinja
	senzibilisanih sa višom (Slika 3E), u odnosu na životinje senzibilisane sa nižom dozom
	DNCB-a (Slika 3D).

Primena više DNCB doze (tretman 0%/1.3%) dovela je do povećanja otoka uha kod jedinki oba soja (mada samo tendencija povećanja kod DA soja, p=0.066), u odnosu na odgovarajuće nesenzibilisane jedinke. Nakon primene više doze, kod oba soja, otok uha je manji kod nesenzibilisanih jedinki u odnosu na jedinke koje su prethodno senzibilisane (tretman 4%/1.3%). Slika 3 
. Doprinos faze senzibilizacije povećanju otoka uha nakon elicitacije reakcije.

  
	4%/0.13% ili
	4%0.13%). Otok uha (C) i patohistološke promene na presecima kože uha nakon tretmana
	0.4%/0.13% (D) i 4%/0.13% (E) (hematoksilin i eozin, uvećanje 10x). Rezultati su prikazani
	kao srednja vrednost otoka uha iz najmanje dva nezavisna eksperimenta ± SD. Statistički
	značajne razlike:

Nesenzibilisanim životinjama je na površinu uha nanet DNCB u koncentraciji 0.13% (tretman 0%/0.13%)ili 1.3% (tretman 0%/1.3%),ili sam rastvarač (tretman 0%/0%).Promene u otoku uha merene su kod jedinki DA soja (A) i jedinki AO soja (B).Efekat doze senzibilizacije ispitan je nakon primene niske doze haptena (0.13%) na uho nesenzibilisanih jedinki DA soja (tretman 0%/0.13%)ili prethodno senzibilisanih sa dve različite doze DNCB-a (tretman 0.* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 u odnosu na kontrolne jedinke odgovarajućeg soja; ••p<0.01,•••p<0.001u odnosu na 0%/1.3%odgovarajućeg soja.4.2. 
2. Osnovni parametri aktivnosti ćelija drenirajućeg limfnog čvora u fazi senzibilizacije kod pacova

  
	U fazi senzibilizacije ispitivana je aktivnost ćelija limfnih čvorova (aksilarnih i
	skapularnih) koji dreniraju dorzalnu površinu kože na koju je nanošen DNCB (SdLČ),
	uključujući celularnost, proliferativnu aktivnost, odnos osnovnih subpopulacija T ćelija,
	produkciju i ekspresiju citokina (IFN-γ, IL-17, IL-4, IL-10).
	4.2.2.1.

Promena broja ćelija i njihove proliferativne aktivnosti u drenirajućem limfnom čvoru u fazi senzibilizacije

  Trećeg dana je kod DA soja zabeleženo dozno-zavisno povećanje proliferacije, dok je kod AO soja zabeleženo povećanje proliferacije nakon primene svake od doza DNCB-a, u odnosu na kontrole, i numeričko povećanje (p=0.08) pri višoj u odnosu na nižu dozu. Proliferativni odgovor ćelija SdLČ na in vitro stimulaciju sa IL-2 (50 jedinica/ml kulture) (C). Rezultati su prikazani kao srednja vrednost iz najmanje tri nezavisna eksperimenta ± SD. Statistički značajne razlike: * p<0.05, ** p<0.01, 


	4.2.2.2						
	Petog dana se kod DA soja održava dozno-zavisno povećanje proliferativne aktivnosti,
	*** p<0.001 u odnosu na kontrolne jedinke i # p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001 u odnosu na 0.4% dok se kod AO soja povećana proliferativna aktivnost zadržava nakon primene samo više doze DNCB-a. Intenzitet proliferacije je niži (p<0.05) petog dana nakon primene DNCB, odgovarajućeg soja; s p<0.05, ss p<0.01, sss p<0.001 u odnosu na jedinke DA soja.
	svake od doza DNCB-a, u odnosu na prvi i treći dan, kod oba soja. Iako povećana,
	proliferativna aktivnost je generalno niža kod AO u odnosu na DA jedinke. Tabela 2. Ekspresija CD25 molekula na površini ćelija drenirajućeg limfnog čvora prvog
	Kako proliferativna aktivnost T ćelija zavisi od prisustva i produkcije IL-2, kao i dana senzibilizacije
	od ekspresije receptora za ovaj citokin, ispitana je sposobnost ćelija SdLČ da odgovore
	Doza na stimulaciju sa egzogeno dodatim IL-2 (Slika 4C), kao i membranska ekspresija DA AO CD25 + celije CD25 + celije DNCB-a inducibilnog α-lanca receptora za IL-2 (CD25 molekul) (Tabela 2.). Kod jedinki DA (%) % x10 6 SIF % x106 SIF
	0/0	4.0±.0.5	76.2±22.2	2.6±0.2	2.2±0.3	36.1±4.6	2.3±0.4
	0.4/0.13	4.6±0.5	68.2±30.3	2.8±0.03	3.1±0.1	47.7±15.5	2.3±0.1
	4/1.3	4.7±0.4 * 262.7±51.0 * 3.2±0.2 *	3.2±0.6 *s 60.9±10.8 *s	2.8±0.5
	SIF-Srednji Intenzitet Fluorescence				
	Statistički značajne razlike: * p<0.05 u odnosu na kontrolne jedinke odgovarajućeg soja; s p<0.05
	u odnosu na jedinke DA soja.					
	Kod jedinki AO soja celularnost je povećana samo trećeg dana senzibilizacije,
	numerički (p=0.078) pri nižoj dozi i značajno pri višoj dozi. Iako povećana nakon
	primene više doze, celularnost je u tom vremenskom terminu niža u odnosu na DA (p<0.05) u odnosu na prvi i peti dan. Iako povećana, responsivnost pri višoj dozi kod
	jedinke. jedinki AO soja niža je u odnosu na jedinke DA soja, u svim ispitivanim terminima, kao
	Ex vivo proliferativna aktivnost ćelija SdLČ povećana je kod senzibilisanih i pri nižoj dozi trećeg dana.
	pacova u svim ispitivanim terminima, u odnosu na nesenzibilisane životinje, sa sličnom Ekspresija CD25 molekula na površini ćelija SdLČ ispitana je
	dinamikom promena kod jedinki dva soja (Slika 4B). Prvog dana zabeleženo je citofluorimetrijskom metodom, prvog dana nakon senzibilizacije, kada je zabeleženo
	povećanje ex vivo proliferativne aktivnosti kod senzibilisanih jedinki oba soja, u odnosu najranije povećanje proliferativne aktivnosti ćelija SdLČ, kod jedinki oba soja (Tabela
	na nesenzibilisane jedinke, i to dozno-zavisno povećanje kod AO soja, dok je kod DA 2). Povećanje relativnog i ukupnog broja CD25 + ćelija zapaženo je kod jedinki oba soja

Nanošenje DNCB-a dovelo je do povećanja celularnosti SdLČ kod pacova, sa različitom dinamikom ovih promena kod jedinki DA i AO soja(Slika 4A).Povećanje celularnosti limfnih čvorova kod DA jedinki primećeno je već prvog dana nakon senzibilizacije samo sa višom dozom DNCB-a, u odnosu na kontrole, uz dalje povećanje trećeg dana i petog dana nakon primene svake od doza DNCB-a, kada su zabeležene i veće vrednosti u poređenju sa prvim danom (p<0.05,kodobe doze).Trećeg dana senzibilizacije, kod ovog soja, zabeleženo je dozno-zavisno povećanje celularnosti, dok je petog dana zapažena tendencija povećanja (p=0.06)celularnosti na višoj, u odnosu na nižu dozu, ali i generalno niža celularnost u odnosu na treći dan (tendencija pada, p=0.07, pri nižoj dozi tj.značajno, p<0.01, opadanje pri višoj dozi).soja zapažena tendencija povećanja (p=0.06)pri višoj u odnosu na nižu dozu DNCB-a.soja povećanje proliferacije u odgovoru na egzogeno dodati IL-2 zapaženo je već prvog dana senzibilizacije samo sa višom dozom DNCB-a, u odnosu na kontrolne jedinke, dok je trećeg i petog dana senzibilizacije zabeleženo dozno-zavisno povećanje proliferativne aktivnosti.Kod ovog soja, rensponsivnost ćelija SdLČ na IL-2 stimulaciju zabeležena nakon primene niže doze DNCB-a je petog dana najniža (p<0.05u odnosu na treći i prvi dan), dok je rensponsivnost nakon primene više doze intenzivnija trećeg (tendencija povećanja p=0.067), i petog (p<0.05)dana u odnosu na prvi dan, mada je petog dana zabeležena tendencija pada (p=0.078)intenziteta u odnosu na treći dan.Kod jedinki AO soja je zabeleženo značajno povećanje proliferativnog odgovora ćelija SdLČ na stimulaciju sa IL-2 nakon senzibilizacije sa svakom od ispitivanih doza DNCB-a, u svim ispitivanim terminima, ali je najniži nivo proliferacije primećen trećeg dana nakon primene samo više doze DNCB-a, uz povećanje gustine ekspresije ovog molekula (srednji intenzitet fluorescence) pri ovoj dozi samo kod jedinki DA soja.(SdLČ). Promena broja ćelija SdLČ kod jedinki DA i AO soja (A). Promena ex vivo proliferativne aktivnosti ćelija SdLČ (B). 
. Zastupljenost CD4 + i CD8 + ćelija u drenirajućem limfnom čvoru trećeg i petog dana senzibilizacije

  
	Ispitivanje procentualne zastupljenosti CD4 + i CD8 + ćelija, glavnih
	subpopulacija T ćelija, u SdLČ pokazalo je različitu dinamiku promena trećeg i petog
	dana kod jedinki DA soja, kao i različit obrazac promena kod jedinki DA u odnosu na
	AO soj (Tabela 3.). Naime, kod jedinki DA soja (Tabela 3A), trećeg dana nisu
	zabeležene promene u zastupljenosti ove dve ćelijske subpopulacije kod senzibilisanih u
	odnosu na nesenzibilisane jedinke, dok je petog dana zabeleženo povećanje
	zastupljenosti CD4 + ćelija nakon primene samo više doze DNCB-a, i smanjenje
	zastupljenosti CD8 + ćelija nakon primene niže doze, mada je zapažen i numerički pad
	(p=0.1) zastupljenosti CD8 + ćelija nakon primene više doze, u odnosu na
	nesenzibilisane jedinke. Ovakve promene su petog dana dovele do povećanja odnosa
	ove dve ćelijske subpopulacije (CD4 + /CD8 DNCB-a. Kod ovog soja, preračunavanje ukupnog broja pokazalo je nepromenjen broj
	CD4 + ćelija u oba termina, ali značajno povećanje CD8 + ćelija trećeg dana tj. numeričko
	povećanje (p=0.09) petog dana nakon senzibilizacije samo sa višom dozom, u odnosu
	na nesenzibilisane jedinke. Iako je ukupan broj CD8 + ćelija povećan, niži je u odnosu na
	jedinke DA soja.

+ ), mada samo numeričkog (p=0.1) nakon primene niže doze. S obzirom na povećan broj ukupnih ćelija SdLČ nakon tretmana sa DNCB-om kod jedinki ovog soja, kada se preračuna ukupan broj CD4 + i CD8 + ćelija zapaža se dozno-zavisno povećanje i trećeg i petog dana senzibilizacije. Kod jedinki AO soja (Tabela 3B) senzibilisanih sa 0.4% ili 4% DNCB-om procentualna zastupljenost CD4 + ćelija se smanjuje u odnosu na nesenzibilisane jedinke i trećeg i petog dana senzibilizacije, i niža je u odnosu na DA jedinke. Procentualna zastupljenost CD8 + ćelija nakon primene svake od ispitivanih doza DNCB-a je povećana samo petog dana, mada je zabeleženo numeričko povećanje (p=0.1) i trećeg dana pri primeni više doze. Ove promene dovele su do smanjenja odnosa ove dve ćelijske subpopulacije trećeg dana nakon primene samo više doze, i petog dana nakon primene obe od doza Tabela 3. 
Zastupljenost CD4 + i CD8 + ćelija u drenirajućem limfnom čvoru u toku faze senzibilizacije A

  
	1997) funkciji IL-4, koji je glavni citokin ovih ćelija. Ne postoje podaci o Th1 i Th2
	imunskom odgovoru u fazi senzibilizacije, kao ni o ulozi Th17 ćelija u reakciji KP, kod
	pacova.								
	U svetlu toga, ispitana je dinamika produkcije IFN-γ i IL-17, glavnih citokina
	Th1 i Th17 imunskog odgovora za koje je pokazano da su bitni za indukciju reakcije KP
	Dani nakon senzibilizacije kod miševa (He i drugi, 2009), kao i Th2/anti-inflamatornih citokina IL-4 i IL-10, od DA Doza DNCB-a (%) CD4 + CD8 + CD4 + /CD8 + % x10 6 % x10 6 0 56.9±3.3 12.8±4.8 20.5±1.0 4.6±1.7 2.8±0.3 strane ćelija SdLČ kod pacova. Ekspresija gena za ispitivane citokine određena je petog
	treći dana senzibilizacije, kada se najčešće vrši ispitivanje ove faze reakcije KP kod životinja 0.4 56.1±0.01 40.5±12.3 *** 18.9±3.2 13.6±4.2 *** 3.0±0.5
	4 (Xu i drugi, 1997; He i drugi, 2009), tj. kada se smatra da je aktivacija efektorskih i 53.2±2.0 55.5±18.9 ***# 19.2±1.0 20.0±6.8 ***# 2.8±0.04
	0 memorijskih ćelija specifičnih za hapten kompletna (Vocanson i drugi, 2009). 60.4±1.1 12.7±7.1 25.2±1.8 5.3±2.9 2.4±0.2
	peti	0.4	58.3±3.3	35.0±17.2 *** 22.6±1.8 * 13.6±6.7 **	2.6±0.1
			4	62.2±0.9 * 50.3±16.6 ***# 23.6±0.6	19.1±6.3 ***# 2.6±0.0 *
	B	4.2.3.1							
	Dani nakon senzibilizacije	Doza DNCB-a (%)	%	CD4 +	x10 6	AO %	CD8 +	x10 6	CD4 + /CD8 +
			0	54.5±4.4	14.5±2.1	19.4±2.5	5.2±0.8	2.8±0.1
	treći	0,4	48.1±1.8 *	13.1±3.4	19.3±3.5	5.3±1.4	2.5±0.4
			4	46.4±4.3 *	19.6±7.7	22.2±1.7	9.4±3.7 *sss 2.1±0.0 *
			0	60.2±1.1	12.8±6.7	26.9±0.4	5.7±3.0	2.2±0.1
	peti	0,4	58.0±0.8 *	10.6±4.1	30.8±3.6 *s 5.6±2.2	1.9±0.2 *
			4	54.2±2.1 *#s 17.4±6.1	30.6±1.5 * 9.8±3.4	1.8±0.2 *s
	Statistički značajne razlike: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 u odnosu na kontrolne jedinke i
	# p<0.05 u odnosu na 0.4% DNCB, odgovarajućeg soja; s p<0.05, sss p<0.001 u odnosu na jedinke
	DA soja.							
		4.2.3. Citokinski odgovor ćelija drenirajućeg limfnog čvora u fazi
					senzibilizacije			
	U AKD kod ljudi, i na mišjem modelu bolesti, pokazano je da je aktivacija
	efektorskih Th1/tip1 i Th17/tip17 ćelija mehanizam u osnovi tkivnog oštećenja
	(Albanesi i drugi, 2000; Xu i drugi, 1996). Uloga Th2/tip2 ćelija je međutim

kontroverzna, jer postoje podaci o regulatornoj (Xu i drugi, 1996; Gautman i drugi, 1992; Asada i drugi, 1997), ali i efektorskoj (Traidl i drugi, 1999; Weigmann i drugi, 
. Produkcija i ekspresija IFN-γ od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora tokom faze senzibilizacije

  
	U cilju analize specifičnosti produkcije citokina, ispitan je odgovor ćelija SdLČ
	na in vitro stimulaciju sa dinitrobenzen sulfonskom kiselinom (DNBS), vodosolubilnim
	analogom DNCB-a. Porast specifične produkcije IFN-γ zabeležen je prvog dana kod
	jedinki DA soja senzibilisanih samo sa višom dozom DNCB-a, i trećeg i petog dana kod
	jedinki oba soja nakon primene svake od doza, ali je responsivnost na DNBS generalno
	niža kod senzibilisanih jedinki AO u odnosu na senzibilisane jedinke DA soja (Slika
	5B).
	Određivanje količine iRNK za IFN-γ petog dana senzibilizacije je pokazalo

Spontana produkcija IFN-γ povećana je prvog dana senzibilizacije kod jedinki DA soja nakon primene svake od doza DNCB-a, dok je kod AO soja u ovom terminu zabeležena tendencija povećanja (p=0.06) spontane produkcije nakon primene samo više doze, u odnosu na nesenzibilisane jedinke. Trećeg dana spontana produkcija ovog citokina povećana je kod jedinki oba soja nakon senzibilizacije sa svakom od doza, dok petog dana produkcija opada na nivo zabeležen kao kod kontrola, osim nakon primene niže doze kod jedinki AO soja, kada se povećanje u odnosu na nesenzibilisane jedinke održava značajno višim (Slika 5A). dozno-zavisno povećanje relativne ekspresije gena za ovaj citokin kod DA jedinki, dok je kod AO soja ekspresija nepromenjena u odnosu na nesenzibilisane jedinke (Slika 5C). 
Tabela 5. Zastupljenost CD4+ i CD8+ ćelija u drenirajućem limfnom čvoru u fazi elicitacije reakcije kontaktne preosetljivosti.

  
	A							
						DA	
	Doza DNCB-a (%)	%	CD4 +	x10 6	%	CD8 +	x10 6	CD4 + /CD8 +
	0/0	49.7±4.6	3.5±2.4	21.1±3.5		1.8±1.3	2.2±0.3
	0.4/0.13	45.2±2.7 *	5.6±2.5	26.9±2.4 *	3.4±1.6 *	1.7±0.1 *
	4/1.3	44.9±4.5 *	4.8±2.5	23.9±3.2 *	3.4±1.5 *	1.8±0.2 *
	B							
	Doza DNCB-a (%)	%	CD4 +	x10 6	AO %	CD8 +	x10 6	CD4 + /CD8 +
	0/0	47.7±3.1	1.9±1.0	22.2±4.7 0.8±0.5	2.1±0.4
	0.4/0.13	41.8±5.4 *	1.2±1.0	23.5±3.0 0.7±0.8	1.8±0.3 *
	4/1.3	44.6±3.1	3.0±1.1 *	26.6±4.6 * 2.1±0.9 *s	1.7±0.3 *
	Statistički značajne razlike: * p<0.05, ** p<0.01 u odnosu na 0%/0% odgovarajućeg soja; s p<0.05
	u odnosu na DA soj.							

Zastupljensot CD4 + CD25 + Foxp3 + ćelija u drenirajućem limfnom čvoru u fazi elicitacije reakcije kontaktne preosetljivosti

  radu su ispitani mehanizmi reakcije KP na DNCB, koji je jedan od najčešće korišćenih haptena, kod pacova.Karakteristike lokalnog imunskog odgovora na DNCB ispitane su u fazi senzibilizacije i elicitacije, korišćenjem dva soja pacova, DA i AO, za izvor ovog citokina u KP na DNFB i DNCB kod miševa.Pored T ćelija izvor IFN-γ u dLČ u fazi senzibilizacije mogu biti i NK ćelije.Povećanje spontane produkcije IL-17 trećeg dana i ex vivo ekspresije ovog citokina petog dana senzibilizacije kod oba soja pacova, dalje sugeriše proinflamatorni karakter KP na DNCB kod pacova, i po prvi put ukazuje na učešće IL-17 u indukciji reakcije KP i kod ove vrste.Produkcija IL-17 u dLČ u fazi senzibilizacije pokazana je i u mišjem modelu KP na DNFB, od strane i CD4 + i CD8 + T ćelija (He i drugi, 2009).Ispitivanjem KP kod miševa sa potpunim ili delimičnim odsustvom ekspresije gena za IL-17, sugerisana je uloga ovog citokina u aktivaciji pre svega CD4 + T ćelija specifičnih za hapten u fazi senzibilizacije, a koje su značajne za ekspresiju reakcije KP (Nakae i drugi, 2002). U skladu sa tim, dozno-zavisno povećanje produkcije IL-17 nakon in vitro stimulacije ćelija sa DNBS-om, kod jedinki DA soja, može biti u osnovi zabeleženog uticaja doze senzibilizacije na ekspresiju reakcije KP kod ovog soja. Sa druge strane, Osim merenja otoka uha i histološke analize, kao osnovnih in vivo i ex vivo parametara ekspresije reakcije KP, u ovom radu ispitani su i drugi pokazatelji ekspresije reakcije, uključujući odabrane in vitro parametre urođene i adaptivne imunosti. soja, uz korelaciju između citokinske produkcije i otoka uha, ukazuje na značaj IFN-γ u elicitaciji KP kod pacova. kod AO pacova. Sa druge strane, nepromenjena produkcija IL-4 kod DA soja praćena je intenzivnim otokom uha i povećanom produkcijom IFN-γ i IL-17 od strane ćelija kože uha. Gautam i drugi su, korišćenjem C3H/HeN miševa, pokazali da 


	najveći broj podataka o mehanizmima kontaktnog dermatitisa, dok većina parametara AO soj, što je u skladu sa radovima koji su pokazali da se ova dva soja razlikuju u senzibilizacije kod DA i AO pacova, prvog, trećeg i petog dana nakon nanošenja broj antigena na svojoj površini, izazivaju dozno-zavisno povećanje proliferativne pacova (Miljković i drugi, 2006). U ovom radu je pokazano da ćelije dLČ jedinki AO IL-17 zabeležene od strane ćelija dLČ ova dva soja (diskutovano u daljem tekstu), i pacovima, i rezultati na miševima (Gautam i drugi, 1992; Salerno i drugi, 1995) ukazuju u svim eksperimentalnim grupama (i kontrolnim i tretiranim DNCB-om) može biti povećana proliferacija ovih ćelija, povećana migracija ćelija u dLČ i/ili smanjena
	aferentne i eferentne faze ove reakcije kod pacova nisu dovoljno ispitani. osetljivosti na razvoj i drugih zapaljenskih bolesti (Mostarica-Stojkovic i drugi, 1982; haptena, pokazalo je dozno-zavisno povećanje osnovnih parametara aktivnosti ćelija aktivnosti ćelija LČ in vitro (Macatonia i drugi, 1986). Takođe, ova grupa autora je soja pokazuju i smanjen kapacitet da odgovore na stimulaciju sa egzogeno dodatim IL-posledično različitog intenziteta ekspresije reakcije nakon elicitacije. da ovaj citokin ne utiče na senzibilizaciju T ćelija u dLČ. posledica anatomskih razlika (kao što su debljina kože, veličina uha) između dva soja. emigracija ćelija iz dLČ. Dozno-zavisno povećanje ex vivo proliferativne aktivnosti
	Kako je otok jedno od obeležja AKD, promena debljine uha u reakciji KP Dimitrijevic i drugi, 2001; Lalic i drugi, 1983; Pravica i drugi, 1993). Odsustvo dLČ (broj ćelija i proliferacija) kod oba soja (ali značajno više vrednosti kod pokazala da broj i funkcionalna aktivnost DĆ u dLČ dostižu svoj maksimum drugog 2, što može biti posledica manje zastupljenosti CD25 + ćelija, i manje gustine ekspresije Produkcija citokina u toku kontaktne alergije se sve češće razmatra u cilju Produkcija IL-10 povećana je kod senzibilisanih jedinki DA soja prvog dana Elicitacija reakcije KP kod oba soja pacova nije dovela do promene u produkciji Novija istraživanja su pokazala da infiltrirajuće T ćelije u koži u toku akutne ćelija dLČ nakon elicitacije reakcije kod jedinki DA soja, u saglasnosti je sa
	i 1.1±0.4 za tretman 0.4%/0.13% i 4%/1.3% redom) u odnosu na odgovarajuće kontrole (1.0±0.3 kod DA i 1.0±0.4 kod AO). Doza DNCB-a (%) DA AO CD4 + CD25 + Foxp3 + celije CD4 + CD25 + Foxp3 + celije % x10 3 % x10 3 0/0 2.0±0.8 409.3±117.5 0.7±0.1 153.6±41.4 0.4/0.13 1.8±1.3 390.0±179.6 1.3±0.9 * 239.2±195.7 4/1.3 1.4±0.5 553.6±323.9 1.4±1.0 autoimunskih/zapaljenskih bolesti kao što su eksperimentalni alergijski encefalomijelitis (Mostarica Stojkovic i drugi, 1982; Dimitrijevic i drugi, 2000), eksperimentalni autoimunski uveitis (Lalic i drugi, 1983), diabetes indukovan višestrukim malim dozama streptozotocina (Pravica i drugi, 1993), artritis (Dimitrijevic i drugi, 2001), ali i u imunskom odgovoru na infekciju parazitima kao što je Trichinella spiralis (Vasilev i drugi, 2009). U fazi senzibilizacije, ispitana je dinamika promena u aktivnosti ćelija prvog, trećeg i petog dana nakon nanošenja haptena. U fazi elicitacije, ispitane su osnovne karakteristike otoka uha, kao in vivo mere ekspresije KP (promena debljine uha, histološke promene i infiltracija mononuklearnih ćelija i mast ćelija), produkcija medijatora inflamacije u kondicioniranom medijumu organokulture uha, kao i aktivnost ćelija limfnih čvorova koji dreniraju region uha (aurikularni čvorovi), 24 časa nakon ponovnog nanošenja haptena u ovoj fazi reakcije. Pored osnovnih karakteristika imunskog odgovora u drenirajućim limfnim čvorovima (dLČ) (celularnost i zastupljenost osnovnih subpopulacija T ćelija, i proliferativna aktivnost ćelija), ispitana je produkcija citokina i ekspresija gena za IFN-γ, IL-17 i IL-4 kao glavnih citokina Th1/tip1, Th17/tip17 i Th2/tip2 ćelija, redom, kao i anti-inflamatornog citokina IL-10. Iako vrsta koja se već dugo koristi u toksikološkim ispitivanjima, zbog svoje veličine i mogućnosti upotrebe različitih organa za analizu, tek upotreba pacova kao životinjskog modela u imunotoksikološkim ispitivanjima unapredila je znanje o imunskom sistemu kod ove vrste. Danas je pacov vrsta od izbora u nekliničkim imunotoksikološkim ispitivanjima (Descotes 2004). Jedan od testova imunološke funkcije u imunotoksikološkim ispitivanjima kod pacova je reakcija KP, kojom se ispituje funkcionalnost ćelijske imunosti. Reakcija KP kod pacova korišćena je za ispitivanje efekta morfina (Nelson i drugi, 1999) i cis-urokanične kiseline na in vivo ćelijsku imunost, kao i efekta fotoforeze na ćelijski posredovanu imunost u koži (Van predstavlja in vivo test ekspresije ove reakcije. Ekspresija reakcije KP je praćena 24 časa nakon elicitacije, s obzirom da je kod miševa pokazano da se u ovom terminu postiže maksimum reakcije preosetljivosti (praćeno pomoću otoka uha i histopatološke analize tkiva uha) (Cho i Hough, 1986). Povećanje otoka uha kod DA i AO jedinki, zabeleženo 24 časa nakon primene samo više doze haptena, praćeno je ex vivo pokazateljima zapaljenske reakcije: patohistološkim promenama na preseku uha i povećanjem gustine mononuklearnog infiltrata u dermu. Edem epiderma (spongioza), kod jedinki DA i AO soja nakon primene više doze DNCB-a, slični su promenama zabeleženim u koži pacijenata obolelih od AKD (Streit, 2001). Takođe, kod miševa je pokazano da su edem epiderma, povećanje broja slojeva epidermnih ćelija i egzocitoza limfocita u epiderm histološke promene specifične za reakciju KP (Cho i Hough, 1986). Jedna od najranije prepoznatih karakteristika AKD je povećanje gustine dermalnog infiltrata ćelija u koži nakon nanošenja haptena (Roupe i Ridell, 1979), koga čine T ćelije, makrofagi, Langerhansove ćelije i neutrofili (Avnstrop i drugi, 1987). U vezi sa tim, prisustvo neutrofila u dermu i nivo aktivnosti MPO (hem enzima, prisutnog u primarnim granulama neutrofila, odgovornog za antimikrobno dejstvo aktivisanih neutrofila) u ćelijama koje su migrirale iz kože u toku 48-časovne organokulture, najizraženiji su kod DA pacova tretiranih višom dozom DNCB-a (tretman 4%/1.3%), kod kojih je zabeležen najveći otok uha zajedno sa najvećom gustinom mononukelarnog infiltrata (u odnosu na jedinke DA soja tretirane nižom dozom DNCB-a, ali i u odnosu na jedinke AO soja tretirane višom dozom DNCB-a). Ovi rezultati su u skladu sa podacima dobijenim na miševima, koji su pokazali da je rano nakon elicitacije neophodna infiltracija neutrofila u kožu, koja direktno utiče na infiltraciju efektorskih T ćelija, i intenzitet reakcije KP (Engeman i drugi, 2004). Takođe, histološka slika AKD kod ljudi može pokazati egzocitozu neutrofila sa formiranjem pustula, zajedno sa neutrofilnom spongiozom (Weedon, 2002), ukazujući na značaj neutrofila u ekspresiji statistički značajnog povećanja otoka uha kod životinja tretiranih nižom DNCB dozom (tretman 0.4%/0.13%), kod oba soja, praćeno je manje izraženim histološki evidentnim promenama u uhu životinja tretiranih ovom dozom DNCB-a, kao i nepromenjenom gustinom mononuklearnog infiltrata u odnosu na kontrole (tretman 0%/0%). U osnovi ovih rezultata može biti slabiji iritantni efekat niže doze DNCB-a (0.13%) primenjene u elicitaciji. Nakon topikalnog nanošenja, hapten obezbeđuje signal specifičan za antigen ali i nespecifičan proinflamatorni signal, oba neophodna za optimalnu elicitaciju iritanasa na mestu nanošenja nikl-sulfata kod senzibilisane osobe, povećava intenzitet zapaljenske reakcije u AKD, kao i da suboptimalna doza haptena, nedovoljna da izazove odgovor samostalno, izaziva reakciju nakon istovremenog nanošenja iritanta (McLelland i drugi, 1990). Slični rezultati dobijeni su i kod miševa, kod kojih je sugerisano da zapravo nespecifičan proinflamatorni kapacitet haptena određuje doznu-zavisnost u elicitaciji reakcije KP kod senzibilisanih životinja (Grabbe i drugi, 1996). Reakcija KP započinje sa fazom senzibilizacije i zavisi od nje, što pokazuje odsustvo ili blago povećanje otoka uha nakon nanošenja haptena kod nesenzibilisanih pacova oba soja, značajno niže u odnosu na životinje koje su prethodno senzibilisane. Uticaj doze senzibilizacije na ekspresiju reakcije KP pokazan je kod DA pacova kod kojih se nakon primene slabo iritantne doze elicitacije (0.13%), intenzitet reakcije povećao sa povećanjem doze senzibilizacije. Ovi rezultati su u skladu sa istraživanjima dozno-zavisnog odgovora kod ljudi (Friedmann, 2007) i miševa (Scott i drugi, 2002), u kojima je pokazano da nakon elicitacije reakcije konstantnom dozom DNCB-a, otok kože raste sa povećanjem doze senzibilizacije. Iako su ovi rezultati jasno pokazali doprinos doze senzibilizacije intenzitetu reakcije KP, mehanizmi dozno-zavisnog odgovora u fazi senzibilizacije, i u reakciji KP uopšte, nisu dovoljno ispitani. Razvoj testa lokalnog limfnog čvora (LLNA, eng. Local Lymph Node Assay) kod pacova ukazao je na ovu vrstu kao dobar eksperimentalni model za ispitivanje faze senzibilisanih DA jedinki). Slično ovim rezultatima, pomoću LLNA kod miševa (van Och i drugi, 2000; Scot i drugi, 2002) i pacova (Arts i drugi, 1996), pokazano je da broj ćelija dLČ i njihova ex vivo proliferativna aktivnost, koji su imunološki pokazatelji senzibilišućeg potencijala haptena, rastu sa porastom doze DNCB-a primenjene u senzibilizaciji. Iako je zapaženo dozno-zavisno povećanje broja ćelija u dLČ trećeg dana senzibilizacije kod jedinki oba soja, dinamika promena celularnosti se razlikuje između DA i AO pacova (kod DA soja celularnost raste već prvog dana senzibilizacije kojih je celularnost u ovim terminima nepromenjena, u odnosu na kontrole). Do povećanja broja ćelija u dLČ može doći usled povećane proliferacije T ćelija i/ili migracije ćelija u čvor. U vezi sa tim, senzibilizacija pacova oba soja dovela je do dozno-zavisnog povećanja ex vivo proliferativne aktivnosti ćelija dLČ, sa sličnom dinamikom promena kod dva soja pacova. Visoka korelacija utvrđena između proliferacije i broja ćelija dLČ prvog (R=0.80, p=0.01, Y=9.898+0.0092*X) i trećeg dana (R=0.81, p=0.0025, Y=16.686+0.00024*X) senzibilizacije samo kod jedinki DA soja, ukazuje na doprinos proliferativne aktivnosti povećanju celularnosti dLČ u toku faze senzibilizacije kod ovog soja, ali posredno ukazuje i na doprinos migracije ćelija, posebno kod jedinki AO soja. Ćelije koje mogu migrirati u dLČ u toku senzibilizacije su dendritične ćelije, mast ćelije i makrofagi iz kože (Macatonia i drugi, 1986; Wang i drugi, 1998; Kripke i drugi, 1990). Za dozno-zavisno povećanje proliferativne aktivnosti ćelija dLČ kod jedinki oba soja mogu biti odgovorne DĆ, s obzirom da su naši preliminarni podaci pokazali povećanje broja ćelija dendritične morfologije, zavisno od primenjene doze DNCB-a, u sveže izolovanim ćelijama dLČ prvog dana nakon senzibilizacije jedinki oba soja (0.05±0.03, 0.10±0.05 i 0.31±0.9 za doze 0%, 0.4% i 4% kod DA soja, i 0.05±0.01, 0.17±0.04 i 0.30±0.10 za doze 0%, 0.4% i 4% kod AO soja, izraženo u 10 6 ćelija). U vezi sa tim, pokazano je da 24 časa nakon senzibilizacije CBA miševa sa FITC-om, broj DĆ i njihova funkcionalna aktivnost u dana senzibilizacije, nakon čega opadaju, tako da smanjen broj i funkcionalna aktivnost DĆ može biti u osnovi niže proliferativne aktivnosti ćelija dLČ petog dana senzibilizacije, u odnosu na prvi i treći dan, zabeležene kod oba soja. Pored DĆ, pokazano je da i makrofagi mogu stimulisati proliferaciju T ćelija dLČ nakon senzibilizacije miševa (Hope i drugi, 1994). Odsustvo promene broja ćelija dLČ uprkos značajnom povećanju proliferativne aktivnosti, kod jedinki AO soja, može biti posledica povećane apoptoze ovih ćelija, ili možda njihove emigracije iz čvorova. ćelija dLČ na in vitro stimulaciju sa IL-2, s obzirom da je proliferacija T ćelija povezana i zavisi od produkcije IL-2 i njegove interakcije sa IL-2 receptorom (Smith, 1988). Naši rezultati su pokazali da je egzogeno dodati IL-2 povećao proliferaciju ćelija dLČ senzibilisanih jedinki oba soja već prvog dana, kada je zabeleženo i povećanje broja ćelija koje eksprimiraju inducibilni α lanac receptora za IL-2 (CD25 + ćelije) na svojoj membrani, kao i povećanje gustine ekspresije IL-2Rα molekula, ali značajno niže kod jedinki AO u odnosu na DA soj. Dozno-zavisno povećanje proliferativnog odgovora stimulisanog sa IL-2 trećeg i petog dana senzibilizacije kod jedinki DA soja, i trećeg dana kod AO soja (mada značajno niže u odnosu na DA soj), u skladu je sa rezultatima Kimbera i drugih, koji su pokazali na miševima da proliferativni odgovor ćelija dLČ nakon in vitro stimulacije sa IL-2, tri dana nakon senzibilizacije, raste sa porastom primenjene doze DNCB-a, ali ne i iritanta, omogućavajući prepoznavanje antigenskih epitopa odgovornih za senzibilišući potencijal hemikalija (Kimber i Weisenberger, 1989). S obzirom da egzogeno dodati IL-2 može da stimuliše proliferaciju efektorskih T ćelija (Montes i drugi, 2005), moguće objašnjenje dozno-zavisnog odgovora je da senzibilizacija višom dozom haptena obezbeđuje veći pul aktivisanih T ćelija iz koga se nakon elicitacije može regrutovati veći broj hapten-specifičnih T ćelija, uslovljavajući intenzivniju ekspresiju reakcije KP. Iako povećani kod oba soja, broj i proliferativna aktivnost ćelija dLČ nakon ovog molekula, sugerišući njihovu nižu funkcionalnu aktivnost. Rana istraživanja vršena na DA i AO pacovima pokazala su da se limfociti ova dva soja razlikuju i u sposobnosti produkcije IL-2 nakon stimulacije sa ConA: AO su slabiji producenti IL-2 za razliku od DA pacova koji produkuju više IL-2 (Mostarica-Stojkovic i drugi, 1988; Vukmanovic i drugi, 1989). Ovakvi rezultati daju mesta za pretpostavku da ćelije AO soja imaju smanjenu sposobnost da diferentuju u efektorske CD4 + i CD8 + T ćelije. Naime, pokazano je da specifične CD8 + T ćelije u odsustvu optimalne stimulacije sa IL-imunski odgovor u toku sekundarne aktivacije (Boyman i Sprent, 2012). Analiza zastupljenosti CD4 + i CD8 + ćelija, dve glavne subpopulacije T ćelija, u dLČ trećeg i petog dana senzibilizacije, pokazala je različit obrazac promena kod jedinki DA i AO soja. Naime, kod jedinki DA soja promene u odnosu ove dve ćelijske subpopulacije javljaju se petog dana senzibilizacije, i to u smeru povećanja zastupljenosti CD4 + ćelija, i opadanja zastupljenosti CD8 + ćelija, u odnosu na kontrole. Dominacija CD4 + T ćelija u dLČ petog dana senzibilizacije pokazana je i kod miševa tretiranih sa DNFB-om, kod kojih je zabeleženo da u ovom terminu, dva puta više CD4 + ćelija proliferiše u odnosu na CD8 + ćelije (Larsen i drugi, 2007). Međutim, iako je relativan broj smanjen, ukupan broj CD8 + ćelija, kao i CD4 + , pokazuje dozno-zavisno povećanje, i trećeg i petog dana senzibilizacije DA jedinki, sugerišući značaj obe ćelijske populacije u fazi senzibilizacije KP kod ovog soja. Sa druge strane, smanjenje odnosa CD4 + /CD8 + ćelija kod jedinki AO soja, već trećeg dana senzibilizacije, posledica je smanjenja relativnog broja CD4 + ćelija i povećanja CD8 + ćelija. Snižena zastupljenost CD4 + ćelija u dLČ kod AO soja može biti posledica emigracije ovih ćelija iz čvora ili njihove povećane apoptoze. Naime, pokazano je da citotoksične CD8 + T ćelije specifične za hapten TNP (trinitrofenil) mogu suprimirati aktivaciju CD4 + efektorskih T ćelija in vitro, izazivanjem njihove apoptoze (Martin i drugi, 2004). Kako CD4 + i CD8 + T ćelije doprinose citokinskom miljeu u dLČ u fazi senzibilizacije procene senzibilišućeg potencijala hemikalija, kao dopuna klasičnom LLNA (Dearman i drugi, 2003), ali i mehanizama koji indukuju i regulišu reakciju KP. U ovom radu je prvi put pokazano da u dLČ u fazi senzibilizacije kod pacova dominira citokinski odgovor tipa 1, nezavisno od korišćenog soja. Takođe, po prvi put je pokazano učešće IL-17 u ovoj fazi reakcije kod pacova. Rezultati su u skladu sa nalazima kod miševa, koji su pokazali da senzibilizacija sa kontaktnim alergenima kao što je DNCB, izaziva selektivno citokinski odgovor tipa 1 u dLČ, koji je bitan za razvoj efektorskih ćelija i DNCB može da stimuliše i ekspresiju citokina karakterističnih za tip 2 ćelije (Ulrich i drugi, 2001). Rezultati koji pokazuju povećanje spontane produkcije IFN-γ prvog i trećeg dana senzibilizacije, i specifične produkcije (nakon in vitro stimulacije ćelija sa haptenom) trećeg i petog dana, kod oba soja pacova, uz povećanje ekspresije gena za ovaj citokin petog dana kod senzibilisanih DA jedinki, u skladu su sa podacima dobijenim na mišjem modelu KP na nitrohalobenzene kao što je DNCB, a koji su pokazali značaj produkcije IFN-γ u reakciji kontaktne preosetljivosti na ovu klasu haptena (Urlich i drugi, 2001; He i drugi, 2006). Naime, povećanje produkcije IFN-γ u dLČ 24 časa nakon senzibilizacije sa DNCB-om pokazano je i kod BALB/c miševa, nakon in vitro stimulacije ćelija sa poliklonskim T ćelijskim mitogenom (Ulrich i drugi, 2001), kao i da rana produkcija ovog citokina u čvorovima može biti značajna za polarizaciju imunskog odgovora u pravcu tipa 1. Kod jedinki DA soja i CD4 + i CD8 + ćelije, čiji ukupan broj raste u dLČ nakon senzibilizacije, mogu biti odgovorne za produkciju ovog citokina. Sa druge strane, kod AO soja povećanje ukupnog broja samo CD8 + ćelija nakon senzibilizacije sugeriše ovu subpopulaciju T ćelija kao glavni izvor IFN-γ. Kod miševa je pokazano da za povećanje produkcije IFN-γ u dLČ trećeg (Moussavi i drugi, 1998; Xu i drugi, 1996) i petog dana (Gorbachev i Fairchild, 2004) senzibilizacije sa halogenim haptenima mogu biti odgovorne i CD4 + i CD8 + T ćelije. Nepromenjena produkcija IL-4 (nakon in vitro stimulacije ćelija sa ConA) u svim ispitivanim terminima nakon senzibilizacije jedinki DA i AO soja, u odnosu na kontrole, ukazuje na to da DNCB u fazi senzibilizacije ne dovodi do stimulacije Th2/tip2 imunskog odgovora u dLČ. Ovo je u skladu sa rezultatima koji su pokazali da ćelije dLČ miševa i pacova, nakon in vitro restimulacije sa poliklonskim mitogenom, ne produkuju IL-4 prvog, trećeg i petog dana nakon senzibilizacije sa DNCB-om (Urlich i drugi, 2001), kao ni u kasnijem terminu kod miševa (Dearman i drugi, 2002). Iako je pokazano da je u fazi senzibilizacije produkcija IL-4 u jetri, od strane iNKT ćelija, značajna za aktivaciju B1 ćelija i produkciju hapten-specifičnih IgM antitela neophodnih za fazu elicitacije (Campos i drugi, 2006a; 2006b), naši rezultati na (spontana i specifična produkcija) i trećeg dana (specifična produkcija) senzibilizacije, u odnosu na kontrole, mada su kod oba soja trećeg i petog dana senzibilizacije i spontana i specifična produkcija ovog citokina povećane nakon nanošenja i DNCB-a ali i samog rastvarača. IL-10 je anti-inflamatorni citokin koji ima ulogu u sprečavanju razvoja zapaljenskih i autoimunskih procesa (Hawrylowicz i O'Gara, 2005; O'Gara i drugi, 2008). Iako prvobitno identifikovan kao citokin koga produkuju Th2 ćelije (Fiorentino i drugi, 1989), kasnija istraživanja su povezala ovaj citokin sa funkcijom regulatornih T mnoge druge ćelije adaptivne imunosti (Th1, Th17, CD8 senzibilisanih jedinki DA soja, kod kojih je generalno imunski odgovor u dLČ intenzivniji (u pogledu i proliferacije ćelija i produkcije IFN-γ i IL-17), ukazuje na ovaj citokin kao deo mehanizma kojim se kontroliše povećana T ćelijska aktivnost u dLČ izazvana haptenom. U prilog ovoj pretpostavci govori odsustvo povećane produkcije IL-10 petog dana, kada aktivnost u dLČ opada. U skladu sa ovakvim razmatranjima, kod miševa je zabeležena ekspresija i IFN-γ i IL-10 u dLČ tri dana nakon senzibilizacije sa DNFB-om (Fujisawa i drugi, 1996), i više diferenciran (tip 1) citokinski profil u kasnijim terminima (Dearman i drugi, 2003). Produkcija IL-10 i IFN-γ u dLČ DA soja (koji nakon elicitacije razvija intenzivnu reakciju KP), sugeriše da anti-inflamatorni citokin IL-10 ne utiče na efektorsku funkciju T ćelija, što je pokazano i kod miševa inficiranih sa Toxoplasma gondii (Jankovic i drugi, 2007), ukazujući i na druge efekte IL-10 osim regulatornih i inhibitornih. U tom smislu, pokazano je da IL-10 in vitro, u prisustvu IL-2, može da stimuliše aktivnost CD8 + T ćelija (Groux i drugi, 1998; Santin i Medijatori inflamacije (NO, MPO i citokini TNF-α, IL-1β, IFN-γ, IL-17, IL-10, IL-4) koje oslobađaju ćelije kože nakon kontakta sa haptenom u fazi elicitacije (Hoefakker i drugi, 1992; Nakae i drugi, 2002; Kataranovski et al., 2002a, 2002b; Ferguson i drugi, 1994; Werfel i drugi, 1997) ispitani su u medijumu u kome su kultivisani eksplanti kože tretiranog uha. Kultura eksplanata kože je pogodan model za ispitivanje inflamacije u koži, i dejstva različitih fizičkih i hemijskih agenasa na kožu (Kataranovski i Karadaglić, 1999), pogotovo uzimajući u obzir da u ovom modelu odnosi između eksplanata humane kože se pokazalo korisno i u ispitivanju efekta topikalnog nanošenja kontaktnih alergena na kožu (Varani i drugi, 2007). i drugi, 1991). Kod miševa sa potpunim ili delimičnim odsustvom ekspresije gena za TNF- ili solubilni p75, TNF- receptor, intenzitet reakcije KP je snižen usled inhibicije migracije LĆ iz kože u dLČ, kao i smanjene produkcije faktora rasta za endotelne ćelije (VEGF, engl. Vascular Endothelial Growth Factor) u koži i posledično smanjene dilatacije i propustljivosti krvih sudova i infiltracije inflamatornih ćelija na mesto elicitacije (Shibata i drugi, 2005, Wang i drugi, 1997). Pored keratinocita i LĆ, i mast ćelije mogu doprineti produkciji TNF-α u koži uha nakon elicitacije (Nakae i IL-1β, 24 časa nakon nanošenja svake od doza DNCB-a. Ispitivanjem dinamike promena genskog profila u koži pacova nakon elicitacije, pokazano je prisustvo rane zapaljenske reakcije (uključujući ekspresiju gena za IL-1) osam časova nakon elicitacije, koja opada nakon 24 časa (Hartmann i drugi, 2006). Slično ovim rezultatima, sugerisano je da je aktivacija inflamazoma, i posledično produkcija IL-1β, bitna za ranu fazu KP (5 časova nakon elicitacije) ali ne i kasnu fazu (24 časa nakon elicitacije) elicitacije reakcije KP kod miševa (Watanabe i drugi, 2007). Povećan nivo aktivnosti enzima MPO od strane ćelija kože jedinki oba soja pacova nakon primene više doze DNCB-a, u odnosu na kontrole, u skladu je sa podacima dobijenim na miševima, koji su ukazali na značaj ovog enzima, primarno produkovanog od strane makrofaga i granulocita, za razvoj zapaljenske reakcije u koži u reakciji KP (He i drugi, 2009). Niži nivo aktivnosti MPO kod AO u odnosu na DA soj verovatno je posledica niže infiltracije leukocita koji su izvor ovog enzima, u kožu jedinki AO soja. Komparativno ispitivanje KP kod Lew i BN pacova, koji su skloni Th1 tj. Th2 imunskom odgovoru, redom, pokazalo je da Lew pacovi razvijaju intenzivniji otok uha, u odnosu na BN pacove, što je sugerisalo značaj Th1 ćelija u ekspresiji reakcije KP faze AKD kod ljudi produkuju IL-17, koji zajedno sa IFN-γ doprinosi zapaljenskoj reakciji i tkivnom oštećenju (Pennino i drugi, 2010). Povećana nivo IL-17 u kondicioniranom medijumu oragnokulture uha kod jedinki DA soja tretiranih višom dozom DNCB-a u elicitaciji reakcije, koja korelira sa povećanjem otoka uha, kao i povećana produkcija ovog citokina u dLČ kod DA soja, po prvi put pokazuje značaj IL-17 u ekspresiji reakcije KP i kod pacova. Kod miševa sa potpunim ili delimičnim odsustvom ekspresije gena za receptor za IL-17 i IFN-γ pokazano je da su oba citokina, Aplikacija DNCB-a u elicitaciji reakcije KP dovela je do značajnog povećanja produkcije IL-4 od strane ćelija kože uha, kao i ćelija drenirajućih limfnih čvorova, samo kod jedinki AO soja. Značajno povećanje produkcije IL-4 sa tendencijom povećanja produkcije IFN-γ u kondicioniranom medijumu organokulture uha, koje je zabeleženo kod AO soja nakon elicitacije sa višom dozom DNCB-a u skladu je sa podacima koji su pokazali istovremenu produkciju ova dva citokina u koži pojedinih pacijenata sa AKD (Probst i drugi, 1995; Rowe i drugi, 1998), kao i u koži miševa nakon elicitacije KP (Asada i drugi, 1997). Kod miševa tretiranih sa TNCB-om pokazano je da ekspresija IL-4 u koži uha nakon elicitacije ima ulogu u regulaciji lokalne produkcije proinflamatornih citokina, s obzirom da primena anti-IL-4 antitela kod ovih miševa dovodi do povećanja otoka uha, koji je praćen povećanom ekspresijom IFN-γ, IL-2, p40 IL-12 i IL-1β (Asada i drugi, 1997). U vezi sa tim, povećana intravenska primena IL-4 u vreme ili posle elicitacije životinja sa TNCB-om, značajno redukuje ekspresiju KP, tj da primena anti-IL-4 antitela povećava intenzitet reakcije, takođe sugerišući anti-inflamatorni efekat ovog citokina u eferentnoj fazi reakcije (Gautam i drugi, 1992). Regulatorna uloga IL-4 u elicitaciji KP kod miševa pokazana je i od strane drugih istraživača (Biedermann i drugi, 2001). Pored inhibitornog efekta IL-4 na aktivnost Th1/Tc1 ćelija (Asada i drugi, 1997), ovaj citokin može da smanji produkciju hemoatraktanta i ekspresiju adhezivnih molekula na površini inflamatornih elicitacije (Gautam i drugi, 1992). Izvor IL-4 u koži mogu biti Th2 ćelije (Mosmann i drugi, 1986), ali i mast ćelije (Bradding i drugi, 1992). Suprotni rezultati drugih autora, Nepromenjena produkcija anti-inflamatornog citokina IL-10 24 časa nakon elicitacije reakcije kod jedinki oba soja, u skladu je sa istraživanjima Fergusona i drugih, koji su pokazali da produkcija IL-10 u koži raste 10-14 časova nakon elicitacije miševa sa TNCB-om, nakon čega opada dostižući kontrolnu vrednost 24 časa (Ferguson i drugi, 1994; Barreiro i drugi, 2004). Ova grupa je sugerisala da je IL-10 prirodni regulator reakcije KP u koži (Ferguson i drugi, 1994). Mehanizmi eferentne faze reakcije KP uglavnom se ispituju na osnovu promena zabeleženih u koži nakon elicitacije reakcije kod senzibilisanih životinja. Međutim, ispitivanje akumulacije, proliferacije i aktivacije ćelija u dLČ nakon elicitacije reakcije, takođe može biti značajno za razumevanje patogeneze KP, kao i za ispitivanje istraživanjima koja su pokazala povećanje ekspresije pojedinih gena bitnih za aktivaciju/ proliferaciju T ćelija, u dLČ 24 časa nakon elicitacije reakcije kod senzibilisanih pacova Crl:CD (SD) soja (Hartmann i drugi, 2006). Istraživanja na miševima su pokazala da 24 časa nakon elicitacije senzibilisanih jedinki, u dLČ dolazi do povećane akumulacije i proliferacije CD4 + i CD8 + T ćelija, ali i B ćelija i NK ćelija (Larsen i drugi, 2007). Pored spontane proliferacije, kod jedinki DA soja zabeleženo je i dozno-zavisno povećanje proliferativnog odgovora na in vitro stimulaciju sa IL-2, što uz 353.5±227.5 koje je prethodno pokazano da se razlikuju u osetljivosti/otpornosti na razvoj pojedinih limfnih čvorova koji dreniraju dorzalnu regiju kože (skapularni i aksilarni čvorovi), kao i edem derma, vazodilatacija u dermu, i egzocitoza limfocita u epidermu, zabeleženi reakcije KP (McFadden i Basketter, 2000). McLelland i drugi su pokazali da primena (pri višoj dozi), i održava se visokom i petog dana, za razliku od jedinki AO soja kod Pored spontane proliferacije, ispitana je i dinamika proliferativnog odgovora 2 u toku primarnog imunskog odgovora, slabije proliferišu, i ne obezbeđuju adekvatan ekspresiju reakcije (Kimber i drugi, 2002), mada su pojedina istraživanja pokazala da ćelija (Treg) (Moore i drugi, 2001). Pored Th2 i Treg, danas se zna da IL-10 produkuju ćelijskih elemenata epiderma i derma nisu poremećeni. Korišćenje organokulture IFN-γ i IL-17, neophodni za optimalnu reakciju, ali da joj doprinose različitim mononukleara i endotelnih ćelija, i na taj način inhibira migraciju leukocita na mesto povećanje broja CD25
	Iperen i drugi, 1993). Reakcija KP je najviše ispitivana na mišjem modelu, dajući reakcije kontaktne preosetljivosti. Generalno, sve ispitivane karakteristike otoka uha senzibilizacije (Arts i drugi, 1996). Ispitivanje dinamike promena u dLČ u toku faze dLČ značajno rastu sa porastom primenjene doze FITC-a (iako se broj ukupnih ćelija u senzibilizacije niži su kod jedinki AO soja u odnosu na DA soj, što je zabeleženo i u (Dearman i drugi, 1996), bitnom za razvoj efektorskih T ćelija, različit odnos ove dve drugi, 2000). drugi, 2003). Generalno viša produkcija TNF-α izmerena kod AO u odnosu na DA soj, potencijala hemikalije kao kontaktnog alergena (Larsen i drugi, 2007). Za povećanje
	zabeležene nakon primene više doze DNCB-a izraženije su kod DA soja u odnosu na dLČ ne menja). Ove DĆ, koje sa porastom doze primenjenog haptena prezentuju rastući drugim eksperimentalnim modelima zapaljenskih bolesti ispitivanim kod ova dva soja ćelijske subpopulacije kod DA i AO soja može biti u osnovi različite produkcije IFN-γ i celularnosti dLČ koje je zabeleženo samo kod jedinki DA soja, može biti odgovorna

Tabela 6. *Statistički značajne razlike * p<0.05 u odnosu na 0%/0% DNCB odgovarajućeg soja.5.DiskusijaU Doprinos određene populacije, međutim, može varirati, jer postoje podaci koji pokazuju da su CD8 + (Xu i drugi, 1996; He i drugi, 2009) ili CD4 + (Moussavi i drugi, 1998) T ćelije glavni odsustvo specifične produkcije IL-17 citokina kod AO soja može se dovesti u vezu sa nižom zastupljenošću CD4 + ćelija. Odsustvo i niža specifična produkcija IL-17 i IFN-γ, redom, u dLČ kod AO soja, može biti u osnovi slabijeg intenziteta ekspresije reakcije KP kod ovog soja, u poređenju sa DA sojem, s obzirom da su hapten-senzibilisane T ćelije koje produkuju IFN-γ i IL-17 neophodne za optimalnu ekspresiju reakcije nakon elicitacije (He i drugi, 2009). + T ćelije i B ćelije), kao i ćelije urođene imunosti, uključujući DĆ, makrofage, mast ćelije, NK ćelije, eozinofile i neutrofile (Saraiva i O'Gara, 2010). Produkcija ovog citokina od strane Th1 i Th17 ćelija smatra se delom negativne povratne sprege koja deluje na antigen-prezentujuće ćelije (APĆ), sa ciljem ograničavanja preterane aktivacije efektorskih T ćelija i razvoja imunopatološkog procesa (Saraiva i O'Gara, 2010). Povećana produkcija IL-10 kod Statistički značajno povećanje koncentracije TNF-α u medijumu organokulture eksplanata kože tretirane samo višom dozom DNCB-a, kod oba soja pacova, je u skladu sa ranijim istraživanjima vršenim na AO pacovima koja su pokazala da in vitro produkcija TNF-α korelira sa in vivo i ex vivo parametrima ekspresije reakcije KP kod ove vrste (Kataranovski i drugi, 2002b). TNF-α je citokin značajan za migraciju leukocita na mesto zapaljenske reakcije (Petri i drugi, 2008). In situ imunohistohemijska analiza biopsije kože pacijenata obolelih od AKD, pokazala je povećanje broja ćelija koje produkuju TNF-α, pored IFN-, IL-1 i IL-2, u kožnim lezijama (Hoefakker i drugi, 1992). Značaj ovog citokina u elicitaciji KP pokazan je i na mišjem modelu bolesti, s obzirom da lokalna primena anti-TNF- antitela suprimira reakciju KP (Piguet Povećanje nivoa NO u kondicioniranom medijumu organokulture kože uha zabeležena je kod jedinki DA soja nakon elicitacije samo sa višom dozom DNCB-a, kod kojih je zabeležen najveći intenzitet ekspresije reakcije. U koži uha Crl: CD (SD) pacova, nakon elicitacije reakcije, pokazana je povećana ekspresija gena za iNOS (Hartmann i drugi, 2006), enzima odgovornog za produkciju NO u KP (Kataranovski i drugi, 2002a; Ross i drugi, 1998), dok su nalazi kod miševa pokazali da je NO, poreklom od keratinocita i Langerhansovih ćelija, jedan od značajnih medijatora otoka uha u elicitaciji reakcije KP (Ross i drugi, 1998). Na mišjem modelu KP sugerisano je da NO, produkovan od strane ćelija kože nakon aplikacije haptena, može da dovede do povećane vazodilatacije i posledično infiltracije leukocita na mesto inflamacije. (Peszkowski i drugi, 1994). U našem radu, povećanje produkcije IFN-γ od strane ćelija kože uha tretirane višom dozom DNCB-a kod oba soja pacova, ali značajno više kod osetljivijeg DA mehanizmima: IL-17 signal je neophodan za infiltraciju leukocita na mesto elicitacije, dok je IFN-γ bitniji za stimulaciju produkcije reaktivnih vrsta kiseonika u zapaljenskom tkivu (He i drugi, 2009). U vezi sa poslednjom tvrdnjom, pokazana je korelacija između produkcije IFN-γ i NO u kondicioniranom medijumu organokulture kože uha jedinki DA soja. Niža produkcija IFN-γ i odsustvo produkcije IL-17 od strane ćelija kože uha kod jedinki AO soja, mogu biti posledica niže, i odsustva antigen-specifične produkcije IFN-γ i IL-17, redom, petog dana senzibilizacije, kada je i vršena elicitacija životinja. produkcija IL-4 samo kod AO soja kod koga je zabeležen niži otok uha i niža produkcija efektorskih molekula IFN-γ i IL-17, sugeriše regulatornu ulogu IL-4 u fazi elicitacije KP u odnosu na naše, koji su pokazali da IL-4 ima proinflamatorni efekat značajan za ekspresiju KP uglavnom su dobijeni korišćenjem miševa sa odsustvom ekspresije gena za IL-4 (Weigmann i drugi, 1997; Traidl i drugi, 1999). Naime, niži otok uha kod ovih miševa može biti posledica povećane aktivacije kompenzatornih imunosupresivnih mehanizama, ali i nedostatka ovog citokina i u fazi senzibilizacije u kojoj je, kao što je već pomenuto, IL-4 neophodan za produkciju hapten-specifičnih IgM antitela, koji su bitni za fazu elicitacije (Campos i drugi, 2006a; 2006b). + ćelija i gustine ekspresije IL-2Rα, sugeriše značaj ovog citokina u elicitaciji KP kod DA pacova, ali ukazuje i na povećanu funkcionalnu aktivnost ćelija dLČ, u zavisnosti od primenjene doze haptena. U prilog tome, pokazano je povećanje proliferacije ćelija dLČ nakon in vitro stimulacije ćelija sa haptenom, samo kod jedinki DA soja tretiranih višom dozom DNCB-a. Povećanju proliferacije ćelija dLČ nakon in vitro stimulacije sa haptenom, može doprineti aktivacija naivnih T ćelija ali i memorijskih T ćelija, čije prisustvo je pokazano u dLČ 24 časa nakon elicitacije miševa (Larsen i sar., 2007). Pored IL-2, kod miševa je sugerisana uloga i IL-6 u proliferaciji ćelija dLČ nakon senzibilizacije, ali i značaj ovog citokina za ekspresiju reakcije KP (Hope i drugi, 1994). Iako je produkcija IL-6 zabeležena u koži nakon elicitacije reakcije (Hoefakker i drugi, 1992; Ulfgren i drugi, 2000), nema podataka o produkciji i značaju ovog citokina u dLČ u fazi elicitacije reakcije KP. U ovom radu pokazano je dozno-zavisno povećanje produkcije IL-6 u dLČ samo kod DA soja, kod koga je zabeleženo i dozno-zavisno povećanje proliferativne aktivnosti, što može sugerisati doprinos ovog citokina proliferaciji ćelija dLČ u fazi elicitacije KP kod pacova. 
Slika 8. Produkcija IL-10 i ekspresija gena za ovaj citokin od strane ćelija drenirajućeg limfnog čvora u toku faze senzibilizacije. Spontana produkcija IL-10 (A) i specifična produkcija (B) od strane ćelija SdLČ kod jedinki DA i AO soja. Količina iRNK za IL-10 određena RT-PCR metodom u ćelijama SdLČ petog dana senzibilizacije (C). Rezultati su prikazani kao srednja vrednost produkcije iz najmanje tri nezavisna eksperimenta ± SD, tj. kao arbitrarne vrednosti ekspresije gena iz dva eksperimenta ± SD. Statistički značajne razlike * p<0.05 u odnosu na kontrolne jedinke odgovarajućeg soja.
Immune mechanisms of induction and expression of contact hypersensitivity reaction in rats