Medical Youth Original articles

Keywords: Anksioznost, finasterid, neurosteroidi, GABA, pacovi Anxiety, finasteride, neurosteroids, GABA, rats

Tradicionalni neurobiološki koncept etiologije anksioznih poremećaja zasnovan je na monoaminergičkoj hipotezi, prema kojoj je poremećaj prouzrokovan deficitom serotoninergičke, odnosno noradrenergičke transmisije u funkcionalno važnim delovima mozga. Skorašnje studije su ukazale na značaj uloge gama aminobuterne kiseline (GABA) u nastanku ovog poremećaja. Blokadom 5α-reduktaze u mozgu, finasterid (FIN) inhibira sintezu alopregnanolona (ALLO) i tetrahidrodeoksi-kortikosterona (THDOC) na dozno zavisan način i preusmerava progesteron u alternativne metaboličke puteve čime menja GABA-ergičku transmisiju i utiče na emocionalno stanje. Cilj: Cilj ovog rada bio je da ispita uticaj finasterida, kao modulatora GABA-ergičke transmisije, na anksioznost kod pacova. Materijal i metode: Mužjaci pacova Vistar (Wistar) soja podeljeni su u dve grupe. Prva, kontrolna grupa tretirana je 2-hidroksipropil-ß-ciklodekstrinom, a druga grupa je tretirana finasteridom (150 mg/kg). Dnevne doze FIN-a (50 mg/kg) administrirane su intraperitonealno tokom tri uzastopna dana. Anksioznost je procenjivana 24 časa nakon primene poslednje doze FIN-a "uzdignutim plus lavirintom" i testom "svetlo-tama". Rezultati: U testu "uzdignuti plus lavirint" ukupno vreme provedeno u otvorenim kracima lavirinta nije se značajno razlikovalo kod životinja iz grupe tretirane FIN-om u odnosu na životinje iz kontrolne grupe (p > 0,05). Nije uočena ni značajna razlika između dve grupe u broju prelazaka iz jednog kraka u drugi preko centralne platforme (p > 0,05). U testu "svetlosttama" vreme koje su životinje iz FIN grupe provodile u svetlom delu kutije bilo je značajno kraće u odnosu na isti parametar registrovan kod životinja iz kontrolne grupe (p < 0,05). Zaključak: Finasterid ispoljava anksiogeno dejstvo kod pacova koje se prvenstveno ispoljava anksioznošću od svetlog prostora. Finasterid nema značajan uticaj na anksioznost od otvorenog prostora. 

Uvod

Anksiozni poremećaji predstavljaju grupu nepsihotičnih mentalnih poremećaja kod kojih je anksioznost jedini ili vodeći simptom, a koja nije uzrokovana organskim oboljenjima mozga ili drugim psihijatrijskim poremećajima (1). Anksioznost predstavlja formu patološkog straha koju karakteriše osećaj unutrašnje uznemirenosti, uplašenosti i zabrinutosti u odsustvu ili u nesrazmeri sa objektivnom opasnošću. Tri glavne manifestacije anksioznosti su: opšta anksioznost (strepnja, teskoba), fobije i panični poremećaji (1,2). 
Tradicionalni neurobiološki koncept etiologije anksioznih poremećaja zasnovan je na monoaminergičkoj hipotezi, prema kojoj je poremećaj prouzrokovan deficitom serotoninergičke, odnosno noradrenergičke transmisije u funkcionalno važnim delovima mozga (2,3). Skorašnje studije su ukazale na značajne uloge glutamata i gama aminobuterne kiseline (GABA) u nastanku ovog poremećaja (3,4). 
Neurosteroidi su steroidne komponente, sintetisane u mitohondrijama glijalnih ćelija i neurona, koje svoju aktivnost ostvaruju vezivanjem za posebno neurosteroidno mesto na GABA A receptorskom kompleksu. Prvi korak u sintezi neurosteroida predstavlja transport holesterola u mitohondrije astrocita. Holesterol se transportuje u mitohondrije pomoću multiproteinskog kompleksa u čijem sastavu se nalazi i translokatorski protein (TSPO) koji prenosi holesterol sa spoljašnje na unutrašnju mitohondrijsku membranu (5,6). Nakon transporta holesterol se u mitohondrijama pod dejstvom monooksigenaze zavisne od citohroma P450 prevodi u pregnenolon, koji se zatim u glatkom endoplazmatskom retikulumu pod dejstvom enzima 5α-reduktaze i 3α-hidroksisteroid dehidrogenaze konvertuje u neurosteroide alopregnanolon (ALLO) i 3α-5α-tetrahidrodeoksikortikosteron (THDOC) (6,7). Ovi neurosteroidi deluju kao pozitivni alosterni modulatori GABA A receptora. Dosadašnje studije ukazuju na značajnu ulogu neurosteroida u regulaciji unosa hrane, seksualnog ponašanja, agresivnosti, telesne temperature i arterijskog pritiska (8). Pokazano je takođe da ALLO i THDOC ispoljavaju anksiolitičko i antidepresivno dejstvo (9). Finasterid (FIN), inhibitor 5α-reduktaze, primenjuje se u terapiji hiperplazije prostate (10) i androgene alopecije (11). Ovaj inhibitor smanjuje unos etanola kod miševa kod kojih se razvila zavisnost (12), izaziva hiperalgeziju (13), deluje proepileptogeno (14,15) i poboljšava tok hepatične encefalopatije (HE) (16). Blokadom 5α-reduktaze u mozgu FIN inhibira sintezu ALLO i THDOC i preusmerava progesteron u alternativne metaboličke puteve, čime menja GABA-ergičku transmisiju. Na ovaj način FIN modulira emocionalno stanje i potencijalno može da utiče na ponašanje vezano za anksioznost (17). Cilj ovog rada je stoga bio da se ispita uticaj finasterida na anksioznost kod pacova. 

Materijal i metode


Korišćene supstance

Finasterid i 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin su nabavljeni od Sigma Aldrich Co., SAD. 

Eksperimentalne životinje

Eksperimenti su sprovedeni na odraslim mužjacima pacova Vistar (Wistar) soja, mase 170-200 g, koji su nabavljeni iz vivarijuma Vojnomedicinske akademije u Beogradu. Životinje su čuvane pojedinačno, u kavezima od pleksiglasa (55 x 35 x 30 cm) u standardnim laboratorijskim uslovima (temperatura 22 ± 2ºC, relativna vlažnost vazduha 50%, 12/12 h ciklusi svetlost/tama, sa svetlom uključenim u 9 h), pri čemu su im voda i hrana bili dostupni ad libitum. Sve eksperimentalne procedure su bile u skladu sa Direktivom Evropskog parlamenta (2010/63/ EU) i odobrene od strane Etičkog komiteta Univerziteta u Beogradu (dozvola broj 1891/2). 
U cilju ispitivanja uticaja FIN-a na anksioznost, životinje (n = 20) su podeljene na kontrolnu grupu (n = 10), tretiranu 2-hidroksipropil-ß-ciklodekstrinom i grupu tretiranu finasteridom (150 mg/kg, n = 10). Dnevne doze FIN-a (50 mg/kg) administrirane su tokom tri uzastopna dana. Doza FIN-a je određena na osnovu ranije studije koja je pokazala da ova doza snižava nivo ALLO u plazmi i mozgu za 66% i 80% u toku 24 h (18). Finasterid je rastvoren u 20% rastvoru 2-hidroksipropil-ß-ciklodekstrina u 0,9% natrijumhlorida (NaCl). Sve supstance su primenjene intraperitonealno. Anksioznost je procenjivana 24 h nakon primene poslednje doze FIN-a "uzdignutim plus lavirintom" (engl. elevated plus maze) i testom "svetlo-tama" (engl. light-dark test). Oba testa se zasnivaju na konfliktu između urođenog straha glodara prema otvorenom prostoru i težnje životinje da ispita novi prostor u kome se nalazi. 

Uzdignuti plus lavirint

"Uzdignuti plus lavirint" (UPL) je izvođen u lavirintu uzdignutom na stalak visine 50 cm, koji se sastoji od četiri kraka. Dva naspramna kraka (50 x 10 x 40 cm) zatvorena su bočnim zidovima, dok su druga dva (50 x 10 cm) otvorena. U centru se nalazi platforma (10 x 10 cm) na koju se inicijalno postavlja eksperimentalna životinja glavom okrenutom ka zatvorenom kraku. Ponašanje životinja je praćeno u toku 5 minuta i registrovano digitalnom kamerom (Logitech C210, SAD) postavljenom iznad lavirinta. Kao pokazatelji anksioznosti u ovom testu određivani su ukupno vreme koje životinja provodi u otvorenim kracima i broj prelaza iz zatvorenih u otvorene krake. 

Test "svetlo-tama"

Test arenu čine dva odeljka: svetli i tamni. Svetli deo test kutije (27 x 27 x 27 cm, sve bele površine) povezan je sa tamnim delom (27 x 18 x 27 cm, sve crne površine) otvorom dimenzija 8 x 8 cm (Elunit, Beograd, Srbija). Životinja se spušta u centar svetlog dela gde se narednih 5 minuta digitalnom kamerom snima njeno ponašanje. Kao pokazatelj anksioznosti u ovom testu određivano je ukupno vreme koje životinja provodi u svetlom delu test kutije. 

Statistička analiza

Vremena provedena u svetlim kracima lavirinta ("uzdignuti plus lavirint") i u svetlom delu kutije (test "svetlo-tama") prikazana su kao medijana sa 25. i 75. percentilom u zagradi, dok je broj prelaza iz jednog kraka lavirinta u drugi preko centralne platforme prikazan kao srednja vrednost ± standardna devijacija. Kako je Kolmogorov-Smirnovljevim testom procenjeno da vremena provedena u otvorenim kracima lavirinta i svetlom delu kutije ne podležu normalnoj raspodeli, za procenu statističke značajnosti razlika korišćen je neparametarski Man-Vitni (Mann-Whitney) U test. Za procenu statističke značaj-nosti razlika u broju prelazaka životinje iz jednog kraka u drugi korišćen je Studentov t test, s obzirom na normalnost raspodele ovih podataka. Statistička analiza obavljena je kompjuterskim programom SPSS15.0, a razlika je smatrana statistički značajnom ako je p < 0,05. 

Rezultati Uzdignuti plus lavirint

Rezultati dobijeni testom "uzdignuti plus lavirint" prikazani su na Grafikonu 1. Ukupno vreme provedeno u otvorenim kracima lavirinta nije se značajno razlikovalo kod životinja iz FIN grupe [100,0 (89,0 i 113,5)] u odnosu na životinje iz kontrolne grupe [85,5 (63,25 i 114,5)] (p > 0,05). Nije uočena ni značajna razlika u broju prelazaka iz jednog kraka u drugi preko centralne platforme između životinja iz FIN (13,6 ± 3,8; p > 0,05) i kontrolne grupe (14,2 ± 2,9; Grafikon 2). 
Statistička značajnost razlike utvrđena je Man-Vitni U testom (*p < 0,05 u odnosu na kontrolnu grupu). 
Za procenu statističke značajnosti razlika korišćen je Studentov test. Za detaljnije informacije videti Grafikon 1. 
Grafikon 1. Ukupno vreme koje životinja provodi u svetlim kracima lavirinta u testu "uzdignuti plus lavirint" kod životinja iz kontrolne i grupe tretirane finasteridom. Dnevne doze FIN-a (50 mg/kg) administrirane su tokom tri uzastopna dana. Anksioznost je procenjivana 24 h nakon primene poslednje doze FIN-a u lavirintu koji se sastoji od dva otvorena (50 x 10 cm) i dva zatvorena kraka bočnim zidovima (50 x 10 x 40 cm), povezana centralnom platformom (10 x 10 cm). Ukupno trajanje testa je 5 min. Grafikon 2. Broj prelazaka iz jednog kraka u drugi u testu "uzdignuti plus lavirint" kod životinja iz kontrolne i FIN grupe. Grafikon 3. Ukupno vreme koje životinja provodi u svetlom delu kutije u testu svetlost-tama kod životinja iz kontrolne i FIN grupe. Test se izvodi u kutiji koja se sastoji iz svetlog (27 x 27 x 27 cm, sve bele površine) i tamnog odeljka (27 x 18 x 27 cm, sve crne površine), međusobno povezanih otvorom (8 x 8 cm). Ukupno trajanje testa je 5 min. 

Test "svetlo-tama"

Rezultati dobijeni testom "svetlo-tama" prikazani su na Grafikonu 3. Vreme koje su životinje iz FIN grupe provodile u svetlom delu kutije [30,5 (5,5 i 53,0)] bilo je statistički značajno kraće u odnosu na isti parametar registrovan kod životinja iz kontrolne grupe [115,5 (50,0 i 133,25)] (p < 0,05). 
Statistička značajnost razlike utvrđena je Man-Vitni U testom (*p < 0,05 u odnosu na kontrolnu grupu). 

Diskusija

U skladu sa važnom ulogom koju GABA ima u funkcionisanju centralnog nervnog sistema (CNS), sintetisan je veliki broj supstanci koje moduliraju GABA-ergički sistem i na taj način utiču na najrazličitije procese: anksioznost, san, učenje i pamćenje, koordinaciju pokreta, mišićni tonus i epileptogenu aktivnost (19). Do danas je otkriveno čak 14 veznih mesta za različite ligande na GABA A receptorima, uključujući mesta za barbiturate, benzodiazepine, alkohole, neurosteroide, anestetike, blokatore kanala i jona cinka (Zn 2+ ) (19). Aktivacija GABA A receptora koji sadrže α 2 i/ili α 3 podjedinicu prvenstveno doprinosi anksiolitičkom i, u velikoj meri, miorelaksantnom dejstvu (20). 
Rezultati testa "svetlo-tama" u našoj studiji ukazuju da FIN ispoljava anksiogeno dejstvo (grafikon 3), što se najverovatnije može objasniti njegovom modulacijom GA-BA-ergičke transmisije posredstvom neurosteroida. Sve je više dokaza koji govore u prilog činjenici da endogeni neurosteroidi imaju važnu ulogu u patogenezi nekih psihijatrijskih poremećaja, uključujući anksiozne poremećaje i depresiju (21,22). Rezultati više kliničkih studija pokazuju da primena FIN-a u lečenju androgene alopecije uzrokuje pojavu anksiozno/depresivne simptomatologije kod pacijenata, koja je praćena značajnim promenama u koncentraciji neuroaktivnih steroida u likvoru i serumu u odnosu na zdrave kontrole (23,24). Tako je u likvoru ovih pacijenata zapažen pad koncentracije progesterona (PROG), dihidroprogesterona (DHP), tetrahidroprogesterona (THP), dihidrotestosterona (DHT) i ALLO, dok je nivo pregnenolona (PREG), testosterona (T) i 3α-diola bio značajno viši u odnosu na zdravu populaciju. S druge strane, u serumu je uočen porast PREG, T, 3α-diola, 3β-diola i 17β-estradiola i pad koncentracije DHP i THP u odnosu na zdrave kontrole (24). Osim toga, dosadašnje studije ukazuju na to da se koncentracija ALLO i THDOC u serumu i likvoru pacijenata koji boluju od depresije snižava, kao i da nivo ALLO u likvoru negativno korelira sa Hamiltonovom skalom depresije (engl. Hamilton depression rating scale, HAM-D skor), pokazateljem težine depresivne epizode (25). I eksperimentalne studije, slično našoj, ukazuju na anksiogeno dejstvo FIN-a, potencijalno posredovano modulacijom sinteze neurosteroida. Rani postnatalni tretman pacova FIN-om od 6. do 15. dana dovodi do ispoljavanja anksioznog ponašanja kod adultnih životinja (26), dok primena PROG kod ovarijektomisanih ženki pacova ispoljava anksiolitički efekat sličan onom koji se dobija nakon primene benzodiazepina (BDZ) (27). 
Tačan mehanizam anksiogenog dejstva FIN-a nije poznat, ali glavnu ulogu imaju inhibicija sinteze i povećanje razgradnje neurosteroida. Finasterid na dozno zavisan način inhibira sintezu ALLO i THDOC blokiranjem 5α-reduktaze u CNS-u, a preusmerava i progesteron u alternativne metaboličke puteve, kao što je njegova redukcija pod dejstvom 20α-hidroksisteroid dehidrogenaze. Usled ove reakcije nivo 20α-dihidroprogesterona nakon lečenja FIN-om raste, dok se nivoi progesterona i deoksikortikosterona u mozgu ne menjaju (28). Uočeno je da aktivnost 20α-hidroksisteroid dehidrogenaze u humanoj populaciji poseduje aldo-keto reduktaza 1C1, koja takođe inaktivira ALLO, što predstavlja potencijalni dodatni mehanizam anksiogenog dejstva FIN-a (29). Nivo ALLO u mozgu se smanjuje i usled hidroksilacije progesterona pomoću izoformne 2D monooksigenaze zavisne od citohroma P450 (30). Neke studije takođe pokazuju da anksiogeno dejstvo FIN-a može da bude uzrokovano i direktnom modulacijom GABA-ergičke transmisije usled promene kvaternerne strukture GABA A receptora. Rani postnatalni tretman pacova FIN-om uzrokuje povećanje ekspresije α 4 i δ subjedinice GABA A receptora u hipokampusu (26). Zanimljivo je da ovi pacovi u adultnom uzrastu ispoljavaju paradoksalno anksiozno ponašanje nakon primene PROG, što ukazuje na kompleksnost interakcije neurosteroida i GABA A receptora u modulaciji anksioznosti i na potencijalno dvojne efekte FIN-a u zavisnosti od uzrasta u kome se primenjuje. 
Za razliku od testa "svetlo-tama", test "uzdignuti plus lavirint" u našoj studiji nije pokazao anksiogeno dejstvo FIN-a (grafikoni 1 i 2). Iako se oba testa koriste za procenu anksioznosti, u nekim studijama su takođe dali oprečne rezultate (31). Miševi kojima je uklonjen gen za kalcineurin provode kraće vreme u svetlom odeljku kutije u testu "svetlo-tama", ali istovremeno značajno duže vreme provode u otvorenim kracima lavirinta u odnosu na divlji soj životinja (31). Ovo se može objasniti činjenicom da ova dva testa ispituju različite aspekte anksioznosti kod glodara: test "svetlo-tama" ispituje anksioznost od svetlog prostora, a "uzdignuti plus lavirint" anksioznost od otvorenog prostora. Tako naša studija ukazuje da FIN prvenstveno izaziva anksioznost od svetlog, a ne i od otvorenog prostora. Suprotno našoj studiji, neke studije su pokazale da FIN nakon sistemske ili intrahipokampalne admini-stracije izaziva i anksioznost od otvorenog prostora kod pacova (32,33). Ova diskrepanca se najverovatnije može objasniti različitim dozama FIN-a korišćenim u ovim studijama, a dobro je poznato da FIN inhibra sintezu neurosteroida na dozno zavisan način. 
Na osnovu rezultata naše studije može se zaključiti da FIN ispoljava anksiogeno dejstvo kod pacova, koje se prvenstveno ispoljava anksioznošću od svetlog prostora. Finasterid nema značajan uticaj na anksioznost od otvorenog prostora.
Medical Youth Original articles