Microbial diversity of soil contaminated with high content of heavy metals


Mikrobni diverzitet zemljišta kontaminiranog visokim sadržajem teških metala


IZVOD

Mnogobrojne industrijske aktivnosti, osim koristi za ljudsku populaciju, imale su za posledicu povećanje sadržaja teških metala i promene diverziteta živih organizama u životnoj sredini. Cilj ovog rada bio je ispitivanje uticaja visokih koncentracija teških metala na mikrobni diverzitet zemljišta. Istraživanja su obavljena na području bivše fabrike "Rog" (Ljubljana, Republika Slovenija), gde su uzeta četiri uzorka kontaminiranog zemljišta, dok je kontrolni uzorak predstavljao nekontaminirano zemljište. Ispitivanje mikrobnog diverziteta (brojnost bakterija, gljiva i aktinomiceta) obavljeno je primenom standardnih metoda. Rezultati istraživanja ukazuju da je brojnost mikroorganizama zavisila od lokacije i prusustva/odsustva kontaminacije. U kontrolnoj varijanti brojnost svih ispitivanih grupa mikroorganizama bila je veća u odnosu na ostale uzorke. Brojnost bakterija u kontaminiranim uzorcima iznosila je od 1,21-6,88x10 6 CFU/g, gljiva 1,08-30,30x10 3 CFU/g i aktinomiceta 302,15-381,82x10 3 CFU/g. U kontrolnoj varijanti broj bakterija iznosio je 17,45x10 6 CFU/g, gljiva 54,02x10 3 CFU/g i aktinomiceta 481,91x10 3 CFU/g. Ovi rezultati ukuzuju na značaj ispitivanja mikrobnog diverziteta na kontaminiranim lokacijama i predstavljaju osnovu za potencijalne aplikacije bioremedijacionih tehnologija na području bivše fabrike "Rog". Ključne reči: mikrobni diverzitet, kontaminacija, teški metali, bakterije, gljive, aktinomicete. 

UVOD

Metali su značajna komponenta ekosistema, čije koncentracije uglavnom zavise od geoloških i bioloških procesa [1]. U podgrupi teških metala nalaze se uglavnom elementi neophodni za živa bića (mikroelementi) i elementi sa nepoznatom fiziološkom ulogom [2]. Efekat teških metala na žive organizme zavisi od njihove koncentracije u ćelijama. Neki od njih su u malim koncentracijama značajni za metabolitičke procese u ćelijama, dok su u visokim koncentracijama toksični [3]. Međutim, osim u ćelijama, teški metali izazivaju ozbiljne posledice po životnu sredinu a među njima jedni od najčešćih su olovo i hrom [4]. 
Mnoga istraživanja ukazuju da višegodišnja kontaminacija zemljišta teškim metalima ima negativne efekte na mikrobiološku aktivnost zemljišta a posebno na mikrobnu respiraciju [5][6]. 
*Autor za korespondenciju: Dora Ilić E-mail: ilic.dora@gmail.com Rad primljen: 10. 02. 2016. Rad prihvaćen: 13. 03. 2016. 
Rad je dostupan na sajtu: www.idk.org.rs/casopis Štetno delovanje teških metala na aktivnost mikroorganizama u zemljištu praćeno je i smanjenim intenzitetom transformacije organskih materija, redukcijom zemljišnog disanja i inhibicijom nekih enzima u zemljištu [7]. Promene takođe mogu nastati i u morfološkim osobinama mikroorganizama, kruženju hranljivih materija i pigmentaciji [8]. Hemijske analize ukazuju na stepen kontaminacije nekog lokaliteta teškim metalima, ali ne odslikavaju posledice njihovog prisustva za ključne metabolitičke procese u zemljištu [9]. Biološkim metodama se, sa druge strane, dolazi do podataka o uticaju kontaminacije na organizme u zemljištu, što se manifestuje kroz inhibiciju rasta i njihove aktivnosti u uslovima stresa [10]. 
Cilj ovog rada bio je ispitivanje mikrobnog diverziteta u zemljištu u uslovima višegodišnje kontaminacije teškim metalima. 

MATERIJAL I METODE

Uzorci za ova istraživanja uzeti su u julu 2010. godine sa lokacije Pogona za galvanizaciju fabrike "Rog" (Ljubljana, Republika Slovenija), iz površinskog dela zemljišta (0-15 cm). U ovom Pogonu su sve proizvodne aktivnosti vezane za hromiranje ra-mova bicikala u galvanizacionim kadama obustavljene 1994. godine. Od tada se galvanizaciona tečnost nakupljala u kadama a zatim izlivala iz njih van objekta i tekla ka reci Ljubljanici. Analize uzoraka uzetih oko objekta pokazale su visok sadržaj teških metala [11]. Iz neposredne blizine Pogona uzeta su 4 uzorka, dok je kontrolni uzorak predstavljao nezagađeno zemljište. 
Ispitivanje mikrobnog diverziteta obavljeno je primenom standardne metodologije. U uzorcima je ispitan ukupan broj bakterija na podlozi 0,1xTSA, gljiva na podlozi roze bengal streptomicin agar [12] i aktinomiceta na podlozi skrobno-amonijačni agar [13]. Sve analize obavljene su u tri ponavljanja. Brojnost mikroorganizama je izražena brojem kolonija po gramu vazdušno suvog uzorka (CFU/g). Vlažnost uzoraka određena je nakon sušenja u sušnici na temperaturi od 105ºC u trajanju od 2 časa. 
Dobijeni rezultati su analizirani neparametarskim statističkim Kruskal-Wallis ANOVA testom. 

REZULTATI I DISKUSIJA

Mnoga istraživanja ukazuju da čak i male količine teških metala u životnoj sredini imaju štetan efekat na sve žive organizme, transformaciju organskih materija i kruženje hranljivih elemenata [4]. Međutim, metabolitički procesi kod mikroorganizama su više ili manje osetljivi na prisustvo teških metala, odnosno povećanje njihove koncentracije dovodi do selektivne inhibicije mikrobiološke aktiv-nosti [14]. Zbog toga, mikroorganizmi imaju veoma važnu ulogu u biogeohemijskim ciklusima teških metala u životnoj sredini [2] a istraživanja mikrobnog diverziteta imaju poseban značaj i za potencijalnu primenu remedijacionih tehnika na kontaminiranim lokalitetima [15]. 
Rezultati istraživanja ukazuju da je mikrobni diverzitet ispitivanih lokacija zavisio od lokacije i prisustva/odsustva kontaminacije (grafici 1, 2, 3). 
Ukupan broj bakterija je važan parametar biogenosti zemljišta [16]. U ovim istraživanjima ukupan broj bakterija bio je najveći u kontrolnom uzorku (17,45x10 
6 CFU/g), dok je u kontaminiranim uzorcima broj bakterija znatno manji (grafik 1). Ovi rezultati obrađeni su deskriptivnom statistikom i ukazuju na postojanje statistički značajnih razlika između lokacija (H=12,433(4, N=15), p>0.05). 
Razlike u brojnosti bakterija u ispitivanim uzorcima mogle bi se povezati sa karakteristikama zemljišta. Prethodna istraživanja ukazuju da je, u zavisnosti od mehaničkog sastava zemljišta, ukupan broj bakterija uglavnom bio veći u nekontaminiranom zemljištu u odnosu na kontaminirano [17]. Kontaminacija teškim metalima utiče na smanjenje intenziteta respiracije zemljišta i mikrobne biomase [18]. Osim toga, u prethodnim istraživanjima potvrđena je pozitivna korelacija između kontaminacije teškim metalima i usporavanja procesa transformacije organske materije [19], što svakako dovodi i do redukcije mikrobiološke aktivnosti zemljišta. 

Grafik 1 -Ukupan broj bakterija u ispitivanim uzorcima (x10 6 CFU/g)

Gljive su sistematska grupa mikroorganizama koja, pomoću enzima, aktivno učestvuje u razlaganju organskih jedinjenja i usvajanju hranljivih elemenata, odnosno poboljšavanju ishrane biljaka [20]. Od kontaminiranih lokacija, najveća brojnost gljiva bila je u uzorku 1 (30,3x10 
3 CFU/g). Kruskal-Wallis test pokazuje da postoje statistički značajne razlike između lokacija u ukupnom broju gljiva (H=15,1665(4, N=15), p>0.05). Slično kao i kod ukupnog broja bakterija, najveća brojnost među uzorcima konstatovana je u kontrolnoj varijanti (grafik 2). I drugi autori su utvrdili da je ukupan broj gljiva bio manji u kontaminiranom zemljištu u odnosu na nekontaminirano [17]. Takođe, istraživanja ukazuju i da promena broja plesni u zemljištu zavisi od koncentracije i vrste metala [21]. Brojnost gljiva takođe zavisi i od udaljenosti od izvora kontaminacije i sezone uzorkovanja. U prethodnim istraživanjima utvrđena je negativna korelacija između broja gljiva i udaljenosti od izvora kontaminacije, pri čemu je broj gljiva bio najveći u proleće a najmanji u jesen [22]. Isti autori su takođe utvrdili da je zastupljenost gljiva povezana sa vrstom teških metala u zemljištu. Međutim, drugi autori [23] opisuju rezistenciju nekih filamentoznih gljiva na prisustvo kadmijuma i nikla, što ukazuje na mogućnost njihove primene u bioremedijaciji kontaminiranih lokacija. 

Grafik 2 -Brojnost gljiva u ispitivanim uzorcima

Osim gljiva, važnu ulogu u degradaciji organskih materija imaju i aktinomicete [24], koje nepristupačna jedinjenja transformišu do pristupačnih hranljivih materija [25]. 

Grafik 3 -Brojnost aktinomiceta u ispitivanim uzorcima

Brojnost aktinomiceta je, slično prethodnim rezultatima, najveća u kontrolnoj varijanti (grafik 3), što je potvrđeno i u istraživanjima drugih autora [26]. I kod ove sistematske grupe mikroorganizama prisutne su statistički značajne razlike u brojnosti između ispitivanih lokacija (H=10.83(4, N=15), p>0.05). Kao i kod brojnosti gljiva, u uzorku sa lokacije jedan broj aktinomiceta bio je najveći, što se može povezati sa karakteristikama zemljišta. 
Ukupna smanjenja zastupljenosti mikrobnih populacija u kontaminiranim uzorcima u odnosu na kontrolni iznosila su 60,6-93,0% za bakterije, 43,9-98,0% za gljive i 20,8-37,3% za aktinomicete. U prethodnim istraživanjima konstatovana je redukcija broja aerobnih heterotrofnih bakterija za 47-67% u odnosu na nekontaminirano zemljište [27]. Isti autori ukazuju na manju osetljivost aktinomiceta prema prisustvu teških metala u zemljištu (stepen redukcije 20,2-31,3%), što je u skladu i sa našim istraživanjima. 

ZAKLJUČAK

U ovim istraživanjima ispitan je uticaj višegodišnje kontaminacije teškim metalima na mikrobni diverzitet zemljišta u fabrici "Rog" (Slovenija). Rezultati ukazuju na smanjenje mikrobnog diverziteta u odnosu na kontrolnu lokaciju, a razlike u brojnosti bakterija, gljiva i aktinomiceta su statistički značajne. U narednom periodu ciljevi istraživanja biće usmereni ka detaljnijoj karakterizaciji mikrobnog diverziteta, uključujući i primenu molekularnih metoda za identifikaciju mikrobnih populacija. 

Zahvalnica

Ova istraživanja su finansijski podržana od strane Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije (TR 31080) i projekta EU Komisije AREA, ugovor br. 316004. 



  




  




  


ABSTRACT


MICROBIAL DIVERSITY OF SOIL CONTAMINATED WITH HIGH CONTENT OF HEAVY METALS

Except of benefits for human population, several industrial activities have a negative consequences i.e. increasing of heavy metal content and changes in diversity of living organisms in environment. The aim of this work was to examinated the influence of high content of heavy metals on microbial diversity of soil. Researches was conducted at locations of former factory "Rog" (Ljubljana, Republic of Slovenia), by taking of four samples of contaminated soil, while the control was uncontaminated soil sample. Determination of microbial diversity (abundance of bacteria, fungi and actinomycetes) was performed using the standard methodology. The results of research showed that abundance of microorganisms depends on location and presence/absence of contamination. In control treatment abundance of all examinated groups of microorganisms was higher compared with other samples. The bacterial number in contaminated samples was from 1.21 to 6.88x10 6 CFU/g, the number of fungi was from 1,08 to 30,30x10 3 CFU/g, while actinomycetes number from 302,15 to 381,82x10 3 CFU/g. In control treatment, bacterial number was 17,45x10 6 CFU/g, fungi number 54,02x10 3
Microbial diversity of soil contaminated with high content of heavy metals