Keywords: bioetanol, lignocelulozna sirovina, enzimska hidroliza

Bioetanol iz lignoceluloznih sirovina: obnovljivi izvori i enzimska tehnologija za održivu proizvodnju energije

Lignocelulozni otpaci poljoprivredne proizvodnje su široko dostupni kao obnovljivi potencijalni izvori sirovina za proizvodnju tečnih biogoriva. Bioetanol proizveden iz obnovljive lignocelulozne sirovine mogao bi da dovede do smanjenja emisije gasova koji izazivaju efekt staklene bašte, ali i energetske krize izazvane ograničenim rezervama fosilnih goriva. Međutim, složena struktura lignocelulozne sirovine predstavlja izvor mnogobrojnih problema u konverziji do bioetanola. Veliki deo njih se odnosi na enzimsku hidrolizu tokom koje se polimeri sirovine, najčešće celuloza, razlažu do jednostavnih šećera. Obezbeđivanje odgovarajuće interakcije između celuloze i celulaza, kao enzimskog kompleksa koji je razgrađuje, je od ključnog značaja za efikasnost enzimske hidrolize, a samim tim i za održivost i ekonomsku isplativost celokupne proizvodnje bioetanola. Zbog toga se slobodno može reći da razumevanje mehanizama enzimske depolimerizacije lignoceluloznih materijala, zajedno sa proizvodnjom novih i poboljšanih enzima može obezbediti globalnu upotrebu ove vredne obnovljive sirovine za proizvodnju etanola i osigurati održivu i ekološki prihvatljivu proizvodnju energije. 

UVOD

Stalni rast svetske populacije kao i sve veća industrijalizacija, motorizacija i urbanizacija čine da potrebe čovečanstva za energijom konstantno rastu. Globalna potrošnja energije iz svih izvora 2008. godine je bila 514 EJ uz tendenciju porasta do 1000 EJ do 2050. godine, ukoliko se nastavi dosadašnji trend ekonomskog rasta. Danas se više od 80% svetske potrebe za energijom obezbeđuje sagorevanjem fosilnih goriva, od čega se 60% sagori u motorima transportnih vozila [1]. Međutim, vrhunac eksploatisanja nafte će se, prema predviđanjima, najverovatnije desiti do 2030. godine nakon čega će uslediti opadanje [2]. Prema tome, potrebno je obezbediti alternativne izvore koji će nadomestiti buduću razliku između potrebne energije i energije koju će se dobijati iz fosilnih goriva. Osim toga, težnja razvijenih zemalja da smanje zavisnost od fosilnih goriva, koja uvoze, i zemalja u razvoju za dobijanjem jeftine energije razlog su velikih ulaganja u razvoj alternativnih goriva. Ako se ovome doda i rastuća svest o uticaju sagorevanja fosilnih goriva na životnu sredinu i život na planeti uopšte, uvođenje alternativnih, osim finansijske dobrobiti, trebalo bi da ima i višestruku korist. 
Zbog svega ovoga se može reći da bi novi i alternativni izvori energije trebalo da budu obnovljivi, održivi, ekonomski isplativi i ekološki prihvatljivi [1]. Veliki potencijal za ispunjenje ovih uslova ima proizvodnja goriva iz biomase (biogoriva). Posebnu pažnju među biogorivima privlači proizvodnja bioetanola, kao jednog od najznačajnijih biogoriva za transportni sektor. Ovaj rad sagledava mogućnost proizvodnje bioetanola iz lignoceluloznih sirovina, s posebnim naglaskom na potencijal upotrebe lignoceluloznih sirovina, kao i na značaj enzimske tehnologije u celokupnom procesu konverzije lignoceluloze do etanola. 

LIGNOCELULOZNI BIOETANOL

Od ukupne količine energije koja se dobija iz fosilnih goriva, 60% se upotrebi u transportnom sektoru, koji je ujedno odgovoran za više od 70% svetske emisije ugljenik(II)-oksida i 19% svetske emisije ugljenik(IV)-oksida [3], gasova koji najviše doprinose efektu staklene bašte na planeti. Usled toga, obezbeđivanje alternativnog goriva za motorna vozila je jedan od prioriteta istraživanja u oblasti biogoriva. 
Danas se većina bioetanola proizvodi iz šećernih sirovina i tako proizveden bioetanol se naziva onim prve generacije. Ovo, međutim, predstavlja problem s aspekta kompeticije sa izvorima hrane i sada, ali pogotovu u budućnosti. Kao posledica toga, razvoj proizvodnje bioetanola u poslednje vreme biva usmeren ka proizvodnji iz nejestivih, lignoceluloznih sirovina kroz tehnologije druge generacije (biološke i termohemijske). 
Proizvodnja bioetanola iz lignoceluloznih sirovina se odvija kroz četiri osnovna koraka -prethodna obrada (eng. pretreatment) koja ima zadatak da pripremi lignoceluloznu sirovinu za sledeći proces; proces enzimske hidrolize, tokom koje se polimeri lignocelulozne sirovine prevode u fermen-tabilne šećere; potom se šećeri nastali enzimskom hidrolizom lignoceluloznih polisaharida primenom odgovarajućih mikroorganizama metabolišu do etanola, koji se u poslednjem koraku prečišćava i koncentruje destilacijom [4]. 
Bioetanol se može mešati sa naftom uz male modifikacije motora sa unutrašnjim sagorevanjem, ili koristiti kao čisto gorivo. Iako 1 litar etanola sadrži 66% energije u odnosu na 1 litar benzina, on ima potpunije sagorevanje čime se smanjuje emisija ugljenik(II)-oksida, nesagorenih ugljovodonika i karcinogenih supstanci. Pored toga, bioetanol sadrži sumpor samo u tragovima, pa se njegovim sagorevanjem značajno smanjuje emisija sumpor(IV)-oksida, glavne komponente kiselih kiša [3]. Na primer, pri prelasku sa benzina na mešavinu benzina sa etanolom sa udelom od 10% (v/v) (E10), emisija gasova staklene bašte se može smanjiti za 15% [5], a mešavina sa 5% etanola se može koristiti bez modifikacije motora [4]. 
Smatra se da glavne karakteristike lignoceluloznih sirovina predstavljaju ključ za smanjenje troškova, potrošnje energije i zagađenja pri korišćenju bioetanola druge generacije [3]. Osim toga, za razliku od fosilnih goriva, lignocelulozne sirovine su ravnomerno raspoređene širom sveta, a njihova upotreba zavisi samo od lokalne dostupnosti i ekonomije [6,7]. Iz ukupno dostupnih lignoceluloznih sirovina, koje predstavljaju više od polovine ukupno proizvedene biomase u svetu, godišnje se može dobiti 442 milijarde litara bioetanola [5]. Pri korišćenju bioetanola dobijenog iz šećerne repe i šećerne trske može se smanjiti emisija gasova staklene bašte za 40%, odnosno za 90% [4]. U odnosu na fosilna goriva, smanjenje emisije gasova se ostvaruje i kroz životni ciklus bioetanola. Naime, određena količina ugljenik(IV)-oksida, koja se emituje u atmosferu pri sagorevanju, je bila fiksirana u procesu fotosinteze koji se odvijao u biljkama iz koje se gorivo dobilo [8]. 

KARAKTERISTIKE LIGNOCELULOZNE SIROVINE -PREDNOSTI I OGRANIČENJA

Lignocelulozne sirovine obuhvataju šumski i poljoprivredni otpad, kao i različite vrste trava, odnosno nejestive biljke ili njihove delove. Lignocelulozne sirovine su najrasprostranjeniji tip biomase na svetu, sa godišnjom proizvodnjom od 10 10 Mt [9]. Iako lignocelulozne sirovine najčešće predstavljaju otpadni materijal, njihov hemijski sastav i karakteristike pružaju mogućnost za dobijanje vrednih proizvoda, između ostalih i bioetanola. Potencijal lignoceluloznih sirovina za proizvodnju bioetanola leži u visokom sadržaju polisaharida (preko 60%) [10] koje, kao što je ranije pomenuto, nakon depolimerizacije do prostih šećera neki mikroorganizmi mogu izmetabolisati do etanola. U sastavu lignoceluloznih sirovina su dominantne tri gradivne komponente -celuloza, hemiceluloza i lignin, čiji sadržaj veoma zavisi od vrste sirovine (slika 1). U ćelijskim zidovima viših biljaka, lignin formira čvrst matriks sa hemicelulozom, u koji su ugrađena vlakna celuloze. Na ovaj način se ojačava celokupna struktura ćelijskih zidova i dobija kompleks koji je veoma teško razoriti. Zbog toga, sastav lignocelulozne sirovine, od kog potiče potencijal za upotrebu za proizvodnju bioetanola, istovremeno predstavlja i jednu od glavnih prepreka koje treba prevazići u ovom procesu. 
Slika 1 -Prosečan sastav pojedinih vrsta lignoceluloznih sirovina [24] Celuloza je linearni homopolimer biljnog porekla koji se sastoji od velikog broja ostataka β-Dglukoze i predstavlja glavnu sirovinu za konverziju u etanol. Međutim, usled prisustva velikog broja intermolekulskih vodoničnih veza, u određenim delovima se obrazuju strukture kristalne celuloze, koja je nerastvorna u vodi i veoma otporna na dejstvo različitih hemikalija i enzima. Visok stepen polimerizacije, rezistentna kristalna struktura i tesna povezanost celuloze sa matriksom hemiceluloze i lignina su najvažniji faktori koji otežavaju efikasnost i visoku produktivnost enzimske hidrolize celuloze iz lignoceluloznih sirovina [11]. 
Hemiceluloza je heteropolisaharid, koji se sastoji od pentoza, heksoza i šećernih kiselina. Hemiceluloza ima manju molekulsku masu od celuloze, ali i kratke lance u bočnim granama, sastavljenim od različitih šećera, koji se lako hidrolizuju. Hemiceluloza predstavlja vezu između lignina i celuloznih vlakana i tako doprinosi krutosti i otpornosti celokupne celuloza-hemiceluloza-lignin strukture ćelijskog zida [12]. 
Posle celuloze i hemiceluloze, lignin je najrasprostranjeniji polimer u prirodi. To je amorfni heteropolimer koji se sastoji od tri različite fenilpropanske jednice. Glavna uloga lignina je da biljci daje strukturnu potporu i čvrstinu, nepropustljivost i zaštitu od mirkoorganizama i oksidativnog stresa. Budući da su celulozna vlakna ugrađena u matriks hemiceluloze i lignina, on predstavlja fizičku barije-ru za kontakt između celulolitičkih enzima i supstrata [11]. Pored toga, pokazano je da se celulolitički enzimi neproduktivno vezuju za lignin, tj. enzim se vezuje za supstrat koji ne može hidrolizovati [11,13]. Ove dve pojave za posledicu imaju povećano i neefikasno korišćenje enzima, što je, s obzirom na njihovu visoku cenu [14], ekonomski neopravdano. 
Složenost i otpornost ćelijskog zida lignoceluloznih sirovina je uzrok potrebe za prethodnom obradom ovih sirovina, a agresivnost uslova pri kojima se ona radi značajno je određen tipom sirovine. Kompromis između uslova prethodne obrade koji će razoriti ćelijski zid (i tako olakšati enzimsku hidrolizu), a neće dovesti do stvaranja zagađenih otpadnih tokova je veoma značajan za efikasnu enzimsku hidrolizu i održivost celokupnog procesa proizvodnje bioetanola [15][16][17]. 
ENZIMSKA HIDROLIZA LIGNOCELULOZNIH SIROVINA Enzimska hidroliza lignocelulozne sirovine predstavlja ključni korak u celokupnoj proizvodnji bioetanola, s obzirom da se u ovom procesu konvertuju komponente biomase u supstrat za alkoholnu fermentaciju. Naime, enzimskom hidrolizom od složenih polisaharida lignocelulozne sirovine nastaju prosti šećeri koje će proizvodni mikroorganizam metabolisati do etanola. 
Iako je celuloza homopolimer, potreban je kompleks enzima, koji sačinjavaju tri vrste hidrolaza, da bi se razgradila. Endoglukanaze (EG) nasumično hidrolizuju unutrašnje β-1,4-glikozidne veze, egzoglukanaze ili celobihidrolaze (CBH I, CBH II) otcepljuju celobiozne jedinice sa krajeva celuloznog lanca (CHB I sa redukujućeg kraja, CHB II sa neredukujućeg kraja), dok β-glukozidaze hidrolizuju celobiozu do glukoze (slika 2). 

Slika 2 -Šematski prikaz hidrolize celuloze sinergističkim delovanjem celulaza [7]

Delujući sinergistički, ove tri vrste enzima hidrolizuju celulozu do glukoze. Delovanjem endoglukanaza stvaraju se nova mesta za vezivanje egzoglukanaza i otcepljivanje celobioznih jedinica. Zatim β-glikozidaze (BG) hidrolizuje celobiozu do glukoze (slika 2), što je od presudnog značaja, jer je egzoglukanaza enzim podložan inhbiciji proizvodom, celobiozom, zbog čega bi hidroliza celuloze bila značajno usporena [7,18]. Budući da većina mikroorganizama koji se koristi za komercijalnu proizvodnju celulaza ne sadrži β-glikozidazu u dovoljnoj količini, ovaj enzim se često posebno dodaje prilikom razgradnje celuloze [19]. 
Ono što razlikuje celulaze od drugih klasa enzima jeste sposobnost hidrolize nerastvornog supstrata. U cilju obezbeđivanja odgovarajućeg kontakta i orijentacije između katalitičkog mesta i supstrata, celobiohidrolaze i endoglukanaze imaju celuloza-vezujući domen (domen koji nije katalitički već služi za vezivanje za supstrat), što je od presudnog značaja i za samu hidrolizu celuloze (slika 3). Pretpostavlja se da celuloza-vezujući domen, postojanjem hipotetičkog proteina remeti strukturu celuloznih vlakana (strelica na slici 2) i da različiti domeni u enzimima iniciraju hidrolizu celuloze sa različitih mesta [18]. Ove dve karakteristike celulolitičkih enzima su predmet mnogih istraživanja i veoma su značajne za spoznavanje mehanizma njihovog delovanja i unapređenje celolupnog procesa enzimske hidrolize celuloze. 

Slika 3 -Građa i mehanizam delovanja celobiohidrolaza [25]

Razumevanje mehanizma delovanja celulaza dodatno otežavaju faktori koji su vezani za heterogenu hidrolizu, a koji se ne mogu izolovati kako bi se pojedinačno proučili, pa ne čudi što se degradacija lignoceluloze ne pokorava Michaelis-Menten-ovoj kinetici. [18]. I pored brojnih napora, kinetika celulaza ostaje velikim delom nepoznanica, što veoma otežava određivanje optimalnih uslova za njihovo delovanje, ili bar predviđanje ponašanja pod određenim uslovimaa [20]. 
Poznavanje mehanizma depolimerizacije lignocelulozne sirovine je tesno povezano sa uslovima pri kojima se ovaj proces odvija. Izbor vrste enzima i koncentracije, kao i uslova u kojima će se vršiti hidroliza, ključni su za dobijanje dobrog prinosa šećera, a samim tim i bioetanola. Imajući u vidu uzak opseg vrednosti pH i temperature pri kojima enzimi ispoljavaju maksimalnu aktivnost, ovi parametri se pažljivo moraju odabrati i kontrolisati prilikom procesa. Ovo naročito može biti problematično kada se za razgradnju obnovljivih sirovina koriste smeše više enzima, kao što su celulaze, hemicelulaze i pektinaze. 
Kada je reč o dva osnovna parametra svakog enzimskog procesa, koncentraciji enzima i koncentraciji supstrata, njihova optimizacija je pri enzimskoj hidrolizi lignocelulozne sirovine, naročito sa stanovišta buduće industrijalizacije, od presudnog značaja. Niske koncentracije enzima i supstrata daju niske koncentracije dobijenih šećera i znatno produžavaju vreme potrebno za postizanje zadovoljavajućeg stepena hidrolize. S druge strane, visoke koncentracije supstrata omogućavaju obradu veće količine biomase tokom jednog ciklusa, ali mogu dovesti do smanjenja prinosa hidrolize usled problema vezanih za difuzione limitacije izazvane smanjenim sadržajem vode i problemima u postizanju homogenosti smeše enzim-supstrat [21,22]. Visoke koncentracije enzima mogu dovesti do neproduktivne upotrebe enzima, jer povećanje količine enzima nije proporcionalno prinosu šećera koji nastaju kao rezultat delovanja enzima [21]. Dakle, jedan od osnovih izazova enzimske hidrolize celuloze iz lignocelulozne sirovine jeste dostizanje balansa između dovoljno visoke koncentracije supstrata, ali ne previsoke da se ne bi javile difuzione limitacije, i dovoljno visoke koncetracije enzima da bi hidroliza bila brza i efikasna, a da ne dođe do neproduktivne upotrebe enzima. 
Karakteristike lignocelulozne sirovine -vrsta, poreklo i sastav značajno diktiraju pravac istraživanja i razvoja tehnologije njene enzimske hidrolize. Kao što je ranije pomenuto stepen polimerizacije i kristaličnosti celuloze, sadržaj hemiceluloze, kao i sadržaj i distirbucija lignina predstavljaju dodatne informacije koje treba uzeti u obzir pri izboru svih uslova procesa enzimske hidrolize [12,23]. Zbog raznovrsnosti lignoceluloznih sirovina kao supstrata, nemoguće je utvrditi univerzalan metod za proces enzimske hidrolize. Potrebni enzimi i odnosi u kojima se oni mešaju, pronalaženje uslova u kojima će svaki od njih moći da ispolji svoju aktivnost, kao i utvrđivanje optimalnih količina enzima i supstrata se moraju odrediti za svaki lignocelulozni supstrat pojedinačno [8]. 
Tokom poslednje decenije se ulažu značajni napori u smeru poboljšanja postojećih i identifikaciji novih i efikasnijih, kako enzima, tako i mikroorganizama koji ih proizvode [18]. Osim toga, širom sveta se radi na optimizaciji smeša enzima i procesnih parametara za pojedinačne, lokalno dostupne, lignocelulozne sirovine. I pored svih nepoznanica na polju enzimske hidrolize lignoceluloznih sirovina, može se reći da je ona trenutno najperspektivnije rešenje od kojeg se očekuje da, u godinama koje slede, proizvodnju bioetanola učini održivom i ekonomski isplativom. ZAKLJUČAK Sve veća potreba čovečanstva za energijom, ograničene rezerve fosilnih goriva, kao i uticaj njihovog sagorevanja na životnu sredinu su glavna pokretačka sila za razvoj alternativnih goriva. Među gorivima koja se mogu dobiti iz obnovljive biomase, od posebnog značaja je bioetanol kao potencijalno biogorivo za motore sa unutrašnjim sagorevanjem. Razvoj proizvodnje bioetanola se usmerava ka dobijanju iz otpadnih, lignoceluloznih sirovina. Karakteristike lignoceluloznih sirovina koje se odnose na njihov sastav i široku dostupnost su glavni razlozi koji ih čine obećavajućim u pogledu proizvodnje bioetanola. S druge strane, karakteristike lignoceluloznih sirovina istovremeno postavljaju velike izazove pred ključni proces u konverziji do etanolaproces enzimske hidrolize. Dublje poznavanje mehanizma delovanja celulolitičkih enzima je od presudnog značaja za unapređenje enzimske hirolize i, stoga, efikasnost celokupnog procesa proizvodnje bioetanola iz lignoceluloznih sirovina. Dakle, proizvodnjom bioetanola iz obnovljivih lignoceluloznih sirovina uz razvoj tehnologije njihove enzimske hidrolize može se obezbediti održivo, sigurno, ekonomski isplativo i ekološki prihvatljivo gorivo za motorna vozila širom sveta. 

Zahvalnica Autori se zahvaljuju Ministarstvu prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije (projekat TR 31002).

LITERATURA 

Scientific paperReceived for Publication: 12. 06. 2013. Accepted for Publication: 11. 09. 2013. 

ABSTRACT BIOETHANOL FROM LIGNOCELLULOSIC BIOMASS: RENEWABLE SOURCES AND ENZYME TECHNOLOGY FOR SUSTAINABLE ENERGY PRODUCTION

Renewable sources, available globally in the form of residual agricultural biomass, i.e. lignocellulosic feedstock, can be transformed into liquid biofuels. Bioethanol produced from renewable lignocellulosic feedstock has great potential to reduce greenhouse gasses emissions and energy crisis, related to the combustion of fossil fuels. However, the complex structure of lignocellulosic feedstock imposes many problems to its conversion to bioethanol. Many of those problems are addressed to the enzymatic hydrolysis during which biomass polymers, primarily cellulose, are degraded to simple sugars. Achieving proper interaction between cellulose and cellulases, enzyme complex degrading cellulose, is crucial for efficient biomass hydrolysis, and thus viable and cost effective overall bioethanol production. Therefore, understanding of mechanisms of enzymatic depolymerization of lignocellulosic feedstock along with production of new and improved enzymes may provide global usage of this valuable renewable source for bioethanol production and ensure sustainable energy supply which is environmentally beneficial. Key words: bioethanol; lignocellulosic feedstock; enzymatic hydrolysis.