PRIMENA NOVIH TROMBOCITNIH PARAMETARA (CD61 I RETIKULOVANIH TROMBOCITA) U LABORATORIJSKOM PRAĆENJU TROMBOCITOPENIJA

Slavica KRSMANOVIĆ , Bratislav STANKOVIĆ Visoka zdravstvena škola strukovnih studija u Beogradu, Cara Dušana 254; Zemun; Srbija SAŽETAK UVOD. Retikulovani trombociti su najmlađa forma cirkulišućih trombocita, koji sadrže rezidue informacione ribonukleinske kiseline (iRNK). Broj retikulovanih trombocita odražava stepen trombopoeze, povećavajući se kada se i produkcija trombocita poveća i obrnuto. CD61 je receptor za fibrinogen, fibronektin, protrombin, trombospondin, vitronektin i Von Willebrandov faktor. "Floy" ("Flow")-citometrijsko imunološko određivanje broja trombocita je predloženo od strane Internacionalnog saveta za standardizaciju u hematologiji (International Council for Standardization in Haematology, ICSH) za referentnu metodu brojanja trombocita (2000.). Metoda je razvijena upotrebom monoklonskih antitela prema membranskim antigenima trombocita, a najčešće korišćeno je antitelo je usmereno protiv receptora CD61. 

CILj.

Utvrditi značaj novijih trombocitnih parametara (CD61 i retikulovanih trombocita) i njihovu primenu u rutinskoj laboratorijskoj dijagnostici bolesti trombocita. 

MATERIJAL I METODE.

Ispitivanje je grupa bolesnika sa trombocitopenijom u Kliničkom Centru Srbije. Eksperimentalna grupa 1 obuhvatala je 28 pacijenata (12 muškaraca i 16 žena) sa trombocitopenijom različitog uzroka, koji su bili podeljeni u dve podgrupe: sa hipoplastičnom trombocitopenijom i hiperdestruktivnom trombocitopenijom. 
U eksperimentalnoj grupi 2 obrađeno je 30 pacijenata (18 muškaraca 12 žena), kod kojih je planirana terapija transfuzije trombocita (akutna faza bolesti sa brojem trombocita manjim od 50 x 10 9 /L ). Kontrolnu grupu činila je 20 dobrovoljaca (9 muškaraca i 11 žena), kod kojih su trombocitni parametri (broj i srednja zapremina trombocita-MPV), bili u granici referentnih vrednosti i nisu uzimali nikakvu terapiju. Uzorci krvi uzimani su u alikvotima od 3 mililitra (ml), venepunkcijom u Becton Dickinson vakutejnerima sa K-2 EDTA antikoagulansom. Od hematoloških parametara su određivani: broj trombocita (određivan je optičkom metodom-brojanjem trombocita u komori za brojanje trombocita) i srednji volumen trombocita -MPV, procenat retikulovanih trombocita, -(% rTr), određen metodom "flou"-citometrije ("flow"citometrije). U drugom delu ispitivanja pridodato je i brojanje trombocita korišćenjem monoklonskog antitela usmerenog na receptor CD61 na analizatoru "Cell Dyn SAPPHIRE" (Abbott Diagnostics, USA). REZULTATI. Dobijeni rezultati pokazali su statistički značajnu razliku procenta retikulovanih trombocita između kontrolne grupe i eksperimentalne grupe-1 i eksperimentalne grupe-2 pacijenata sa trombocitopenijom (13,312 % prema 1,776 %). Poređenjem vrednosti retikulovanih trombocita između pacijenata sa hiperdestruktivnom i hipoplastičnom trombocitopenijom dobija se, takođe, statistički značajna razlika (18,780 % prema 6,022 %). Statistički su se značajno razlikovali i broj i srednja zapremina trombocita (MPV). Između vrednosti trombocita određenih PLTo i CD61 metodom ne postoji statistički značajna razlika (p = 0,9431). Vrednosti trombocita određene PLTi metodom su statistički značajno više od vrednost PLTo (p = 0,0071) i od vrednosti CD61 (p = 0,0049). 
ZAKLJUČAK. Diferencijalne dijagnostičke metode su ograničene i biopsija koštane srži (bone marrow needle biopsy) se smatra "zlatnim standardom" dijagnoze trombocitopenije. "Flou"-citometrijska analiza retikulovanih trombocita je zato i našla svoje mesto kao dodatna, neinvazivna dijagnostička metoda, jer su brojne studije poslednjih 20 godina prikazale retikulovane trombocite u perifernoj krvi kao odraz stepena megakariopoeze u kostnoj srži. Zato je i zadatak biohemijskih laboratorija da podstaknu ovakvu vrstu ispitivanja, u cilju dobijanja kompletnijih informacija o dijagnozi, tretmanu i prognozi trombocitopenije. KLJUČE REČIK: trombocoiti; trombocitopoeza; trotrpobocitopenija; retikulovani trombociti; receptor CD61. [3][4][5]. Megakariociti se mogu uspešno kultivisati na agaru [6] i na koagulumu plazme na kome se iz ćelija koštane srži čoveka stvaraju kolonije megakariocita (BFU-Mk) [7,8]. 

I. UVOD

U toku megakariocitopoeze, u stadijumu prethodnih nezerelih ćelija, dolazi do povećanja brija megakariocita i njihove proliferacije i diferencijacije kao odgovor na mitotičke faktore rasta. Trombociti nastaju iz citoplazme megakariocita stvaranjem izduženih tankih nastavaka nazvanih protrombocitima (slika 1), koje se obično nalaze na delu membrane megakariocita u blizini endotelnih ćelija koje oblažu sinusoide koštane sži [4,8]. Slika 1. Proces megakariocitopoeze [4] Trombociti su krvne ćelije koje sa faktorima koagulacije učesvuju u procesu hemostaze, tj. zaustavljanju krvarenja nakon povreda krvnih sudova [1]. Trombociti su male bikonveksne krvne ćelije bez jedra, nastale fragmentacijom prekursornih ćelijkamegakariocita [4,5]. Prečnik trombocita je 2-3 mikrona (μm), sa prosečnim životnim vekom u cirkulaciji 5-9 dana. Prema dosadašnjim istraživanjima pretpostavlja se da se najveći deo TPO stvara u jetri i bubrezima. TPO deluje na ćelije koje poseduju Mpl receptore. U ćelije koje sadrže Mpl receptore. spadaju: megakariociti, trombociti i prethodne nezrele matične CD34+ ćelije. TPO stvara CD41+ megakariocite [4,8]. Najnezrelija morfološki prepoznatljiva prethodna (prekursorna) ćelija trombocitne loze je megakarioblast. Ova ćelija podseća na mijeloblast i prethodnik je promegakariocita i megakariocita. Megakariociti se lako prepoznaju u razmazu koštane srži zbog svoje veličine i lobularnog jedra [4]. 

II. 2. Morfologija trombocita

Od diferencijacije matične ćelije hematopoeze do stvaranja trombocita potrebno je prosečno da protekne 10 dana. Normalan broj trombocita je 250 h 10 9 /L. Srednji promer trombocita je 1-2 mikrometara (m), a srednji ćelijski volumen 5,8 femto litara (fl). Mladi trombociti (retikulovani trombociti) provode oko 36 sati u slezini nakon izlaska iz koštane srži. Od ukupne mase trombocita, oko trećine trombocita nalazi se u slezini. Staza krvi u slezini ne dovodi do oštećenja trombocita. Destrukcija trombocita primarno se dešava u koštanoj srži, jetri i slezini [1,2,4]. 
Ako se sagleda morfologija trombocita, može se zaključiti da su to krvne ćelije diskoidnog oblika, ne sadrže jedro, endoplazmatski retikulum niti Goldžijev (Golgijev) aparat. Periferna zona trombocita obavijena je omotačem trombocita nazvanim glikokaliksom. Ona sadrži plazmatske proteine (fosfolipide, holesterol, glikolipide i 9 glikoproteina od GpI do GpIX) i faktore koagulacije (posebno faktor Ifibrinigen, kao i faktore koagulacije V, VII, XII, XIII, receptore za Von Willebrandov faktor-vWF i fibrinogen), činioce fibrinolize i komponente komplementa. Ispod glikokaliksa nalazi se membrana trombocita koja ima negativan elektronski potencijal i sastavljena je od konglomerata lipidnih i proteinskih molekula, a naziva se sol-gel zonom. Ispod membrane trombocita nalazi se sistem filamenata (koga čine aktin i miozin) i mikrotubula koji čine skelet trombocita. Ovaj skelet omogućava trombocitima kretanje i promenu oblika. Membranski fosfolipid (TF3) važan je u pretvaranju FX u aktivirani FX (Fxa) i pretvaranje protrombina u trombin [1,2,4]. 
U unutrašnjosti trombocita nalazi se u zoni organela alfa-granule (kojih ima najviše) i guste granule (uz ostale aktivne supstance i metabolite, sadrži adenozin-difosfat -ADP i serotonin). Druge važne organele su lizozomi koji sadrže hidrolitičke enzime i peroksizome koji su bogati katalaztom. Morfologija trombocita je prikatzana je na slici 3 [4,[17][18][19]. 
Membranozna zona je sačinjena od membrana nastalih od glatkog endoplazmatskog retikuluma megakariocita, organizovanih u gusti tubularni sistem koji je odgovoran za sintezu i oslobađanje tromboksana A2 [9]. Periferna zona je bogata glikoproteinima potrebnim za trombocitnu adheziju, aktivaciju i agregaciju (gpIb/IX/X; gpVI; gpIIb/IIIa) [17]. Slika 3. Šematski prikaz trombocita i njihovih granula [4]. 

II. 3. Trombocitni antigena i antitela

Na površini trombocita nalaze se i spcifična antigeni HPA 1-8, a svaki se sastoji od a ili b alela. Oni izražavaju antigene sistema AB0 krvnogrupnog sistema i antigene sistema HLA klase I [4]. 
Antigen CD61 je deo glikoprote-inskog kompleksa IIIa/IIb, takođe obeležen i kao integrin β3. To je površinski antigen membrane trombocita (slika 4) [20].. Slika 4. Integrin β3 [20] Antigen CD61 je receptor za fibrinogen, fibronektin, protrombin, trombospondin, vitronektin i vWF, i kao takav jedan je od ključnih činilaca primarne hemostaze [20]. korišćeno je monoklonsko antitelo usmereno protiv antigena CD61 [20,21]. 
Klinički najznačajnije antitelo usmereno na trombocitni antigen PI A1 koji zavisi od polimorfizma jedne aminokiseline IIa glikoproteina. Ređa su aloantitela usmerena na druge krvnogrupne antigene. Antitela na ove aloantigene su glavni uzrok neonatalne aloimune trombocitopenije [4]. 

II. 2. Uloga trombocita u hemostazi

Trombociti imaju fundamentalnu ulogu u održavanju homeostaze Ovo se prvenstveno ostvaruje formiranjem tromba nakon povrede krvnog suda. Nakon adhezije i agregacije trombocita i formiranja trombocitnog tromba koji se učvršćuje fibrinskim vlaknima na mestu povređenog krvnog suda, Nakon toga dolazi do aktiviranja fibrinolize kojom se razlažu nerastvorljivi delovi tromba i time se rekanališe lumen krvnog suda i uspostavlja normalna cirkulacija u povređenom krvnom sudu. Aktiviraju se činici fiziološke fibrinolize koji se nalaze u adventiciji endotela povređenog krvnog suda ne postoji oštećenje endotela, pa normalan endotel inhibira aktivaciju trombocita produkcijom azotoksida (NO), endotelne adenozindifosfataze (ADP-aze), koja razlaže aktivator trombocita adenozindifosfat (ADP) i prostaglandin I 2 (PGI 2 ). Endotelne ćelije zida krvnog produkuju vWF koji predstavlja ligand celularne adhezije kolagena za bazalnu membranu. Pod fiziološkim uslovima kolagen nije eksprimovan (izložen) krvnoj struji. Kada dođe do povrede krvnog suda kolagenu, vWF i tkivnom faktoru omogućen je direktan kontakt sa trombocitima i oni postaju aktivirani. Takođe, trombociti se aktiviraju trombinom ili negativno naelektrisanom površinom (slika 5) [18]. Slika 5. Aktivacija trombocita. GpIb vezuje vWF i indukuje adheziju, dok gpIIIa/IIb vezuje fibrinogen i stimuliše interakciju trombocita [18]. 
Pri povredi krvnog suda dolazi do refleksne vazokonstrikcije uz izlaganje subendotelnog matriksa, a protok krvi se redukuje. Polazna tačka je vezivanje solubilnog proteina, Von Willebrandovog faktora (vWF), za subendotelni matriks, a nakon toga vWF eksprimira vezivna mesta za specifični glikoproteinski receptor na trombocitima, gpIb (primarna hemostaza). 
Vezani trombociti dezintegrišu i započinje kaskadno vezivanje ostalih trombocita: dolazi do izlaganja gpIIIa/IIb, receptora za fibrinogen i vWF, koji se "kao lepak" provlače između trombocita (sekundarna hemostaza) [19]. 

II..3. Bolesti trombocita

Abnormalnosti ili bolesti trombocita se nazivaju trombocitopatije, koje mogu biti kvantitativne (snižen broj trombocita -trombocitopenije ili povišen broj trombocita -trombocitoze) i kvalitativne, kada dolazi do poremećene funkcije trombocita i nazivaju se trombastenijama [4,5,16 [16,19]. U opštoj hirurgiji, kao i na hematološkim odeljenjima, trombocitopenija je jedna od najvećih problema što preoperativne pripreme i postoperativnog toka bolesti, to i same terapije i prognoze hematoloških oboljenja. Definicija trombocitopenije je nizak broj trombocita, tj. niži od 150 x 10 9 /L, mada neki autori tvrde da se trombocitopenijom smatra tek smanjenje broja trombocita ispod 50 h 10 9 /L [4,5,16]. 

III. MATERIJAL I METODOLO-GIJA

Ispitivanje je sprovedeno u grupi bolesnika sa trombocitopenijom u Klinici za digestivnu hirurgiju, Klinici za hematologiju i Interno-opšte-intenzivnog odeljenja Urgentnog centra, Kliničkog Centra Srbije. Eksperimentalna grupa-1 obuhvata 28 pacijenata (12 muškaraca i 16 žena). Starost pacijenata je od 21 do 91 godinu, sa trombocitopenijom različitog uzroka, koji su nakon postavljanja dijagnoze podeljeni u dve grupe, na osnovu patofiziološkog mehanizma smanjenja broja trombocita: hipoplastične trombocitopenije, HPT (broj pacijenata 12 -N=12) i hiperdestruktivne trombocitopenije, HDT (broj pacijenata 16 -N=16). U eksperimentalnoj grupi-2 obrađeno je 30 pacijenata (18 muškaraca 12 žena), starosne dobi od 28 do 76 godina. Kod njih je planirana terapija transfuzije trombocita gde su kriterijumi za prihvatanje ovih pacijenata bili broj trombocita niži od 50 x 10 9 / L i akutna faza bolesti, što je bila klinička procena ordinirajućeg lekara. Kontrolnu grupu činilo je 20 dobrovoljaca (9 muškaraca i 11 žena), starosti od 30 do 74 godine, kod kojih su trombocitni parametri, broj i srednja zapremina trombocita (MPV), bili u granici referentnih vrednosti i nisu uzimali nikakvu terapiju. Uzorci krvi uzimani su u vakutajner epruvetama od 3 ml venepunkcijom u "Becton Dickinson" vakutajnerima sa K-2 EDTA (kao antikoagulansom). Od laboratorijskih analiza kod svih ispitivanih pacijenata rađeni su: broj trombocita (određivan je optičkom metodom brojanja trombocita u komori za brojanje trombocita) i srednji volumen trombocita (MPV), procenat retikulovanih trombocita ( % rTr) određivan je metodom "flou"citometrije, dok je u drugom delu ispitivanja optičkoj i impedansnoj metodi pridodato i brojanje trombocita korišćenjem monoklonskog antitela usmerenog na receptor CD61 na analizatoru (Cell Dyn SAPPHIRE , Abbott Diagnostics), uz korišćenje komercijalnih reagenasa (slika 6) Uzorci krvi su rađeni najkasnije 48 sati od momenta uzorkovanja i za to vreme su čuvani u namenskom frižideru na +4 °C. Slika 6. Analizator (Cell Dyn SAPPHIRE, Abbott Diagnostics) " Floy"-citometrija koju smo koristili u našoj studiji je metoda koja određuje optičke i fluorescentne karakteristike pojedinačnih krvnih ćelija [22,23] . Fluorescencija je fenomen gde je svetlost apsorbovana na jednoj, a zatim emitovana na drugoj, nešto višoj talasnoj dužini. Kod aparata Cell Dyn SAPPHIRE ćelijska fluorescencija je rezultat upotrebe specijalnih boja, koje se vezuju za određenu ćelijsku komponentu i u interreakciji su sa laserom. Ribo-nukleinska kiselina (RNK) u retikulovanim trombocitima vezuje boju, koja biva pobuđena laserom talasne dužine 488 nanometara (nm) i fluorescira u uskoj oblasti sa centrom na 530 nm. Retikulovani trombociti su definisani u ovoj metodi kao frakcija trombocita sa pojačanim intenzitetom bojenja RNK od onog što je predviđeno na osnovu njihove zapremine [22,24]. U imunološkoj metodi određivanja broja trombocita ključnu ulogu igra monoklonsko antitelo usmereno protiv antigena CD61 i ono je obeleženo bojom FITC (fluorescein izotiocijanat). Ova boja se meša sa uzorkom cele krvi u vakutajner epruveti i inkubira u termostatu na 37 °C. Nakon toga se detektuju obeleženi trombociti i specifičnim algoritmima se izražavaju kao broj trombocita [25][26][27] . 

IV. REZULTATI


IV.1.


Laboratorijske vrednosti određivanja retikulovanih trombocita kod bolesnika sa trombocitopenijom

Radi procene kliničkog značaja retikulovanih trombocita upoređene su vrednosti laboratorijskih parametara kod kontrolne grupe i grupe pacijenata sa trombocitopenijama različitih uzroka. Izračunavan je i koeficijent korelacije (p). Dobijene vrednosti prikazane su u Tabeli 1. i na grafikonu 1, 2 i 3. 

IV.2. Laboratorijske vrednosti određivanja broja trombocita primenom tri metode kod bolesnika sa trombocitopenijom

Vršeno je merenje distribucije vrednosti broja trombocita primenom tri metoda: 1. impedance (PLTi); 2. optičke metode (PLTo) i 3. imuno-bojenjem (određivan je broj CD61 receptora). Na osnovu dobijenih rezultata izračunavan je koeficijent korelacije (p) (tabela 5). 
Tabela 5. Distibucija vrednosti trombocita određenih primenom 3 metode (impedanca -PLTi, optička metoda -PLTo i imuno-bojanjem -CD61) Pošto je distribucija vrednosti broja trombocita dobijena primenom ove tri metode približno ista, urađena je Pearsonova korelacija. Uz koeficijent korelacije izdaje se interval pouzdanosti (95% CI) i meren je koeficijent korelacije (p). Ako je p < 0,05 dve grupe podataka su u značajnoj korelaciji. Takođe, kako su u našoj studiji dobijene statistički značajno više vrednosti broja trombocita primenom impedance kao metode određivanja broja trombocita, određivanje retikulovanih trombocita "flou"-citometrijskom metodom (koja je zasnovana na imuno-bojenju i uz upotrebu monoklonskih antitela usmerenih prema antigenu CD61), daju najtačnije rezultate kod trombocitopeničnih pacijenata i poboljšavaju procenu efikasnosti terapije. Ovo ukazuje na potrebe pridržavanja algoritma ispitivanja trombocitopenija (slika7). Slika 7. Alogoritam trombocitopenije (preuzeto sa sajta: http://en.wikipedia.org/wiki/Thrombocytopenia) Ovaj algoritam je opisan na sledeći način: ukoliko impedancijski analizator izbroji manje od 20 x 10 9 /L trombocita, prvi korak u kontrolnom (refleks) testiranju je pregled perifernog krvnog razmaza u cilju isključenja prisustva eritrocitnih fragmenata, šizocita (eritrociti promenjene morfologije i oblika, pri čemu eritrociti gube diskoidni oblik i dobijaju oblik šlema) i džinovskih trombocita. U razmazu periferne krvi vrlo retko mogu da se nađu megakariociti ili delovi megakariocita. U perifernom razmazu krvi se obično nalaze nepravilni delovi jedra megakariocita, opkoljeni malim slojem citoplazme. Delovi megakariocita najčešće se nalaze u razmazima krvi osoba obolelih od hronične mijeloidne leukemije, sepse i nakon akutnih hemoragija [4,20]. Drugi korak u ispitivanju (algoritmu) trombocitopenije je ponovno brojanje trombocita optičkom metodom u komori za brojanje trombocita i treći korak je određivanje procenta retikulovanih trombocita. Kako tehnologija u medicini napreduje, ova optička metoda brojanja trombocita u komori bi mogla biti zamenjena imunobrojanjem (tj. određivanjem procenta retikulovanih trombocita), upotrebom monoklonalnih antitela usmernim prema površinskim antigenima na membrani trombocita CD61, što je početkom dvadeset prvog veka i prihvaćeno kao referentna metoda određivanja broja trombocita [24,30]. Najčešće korišćena monoklonska antitela su usmerena prema glikoproteinskom kompleksu membrane trombocita gpIIIa/IIb, a deo kompleksa gpIIIa/IIb se u CD nomenklaturi obeležava kao receptor CD61 [28]. Dobijeni rezultati u našoj studiji pokazali su statistički značajnu razliku procenta retikulovanih trombocita između kontrolne grupe i eksperimentalne grupe pacijenata sa trombocitopenijom (13, 

VI. ZAKLJUČAK

Trombocitopenija može biti rezultat nedovoljne sinteze trombocita u koštanoj srži, povećane potrošnje na periferiji ili ubrzane razgradnje trombocita u retikuloendotelijalnom sistemu. Diferencijalne dijagnostičke metode su ograničene i biopsija koštane srži (bone marrow needle biopsy) se još uvek smatra "zlatnim standardom" dijagnoze trombocitopenije [30,31]. 
"Flou"-citometrijska analiza retikulovanih trombocita je zato i našla svoje mesto kao dodatna, neinvazivna dijagnostička metoda u ispitivanju trombocitopenija. Brojne studije su u poslednjih dvadesetak godina prikazale retikulovane trombocite u perifernoj krvi kao odraz stepena megakariopoeze u kostnoj srži [22] The experimental group 2 consisted of 30 patients (18 men, 12 women) with acute thrombocytopenia with platelets less than 50 x 10 9 /l, which are divided into two subgroups: with hypoplastic thrombocytopenia (18 patients) and destructive thrombocytopenia with hyperactive platelet lineage (12 patients). The control group consisted of 20 volunteers (9 men and 11 women), in which the platelet parameters (the number and medium platelets volume -MPV) were within the normal limits and therefore they did not take any treatment. The blood samples are collected in aliquots of 3 ml by venipuncture in Becton Dickinson's vacuum tubes with K-2 EDTA anticoagulant. The number of platelets (determined by the optical method-platelet count in the in the platelet counting chamber) and medium platelets' volume -MPV and the percentage of reticular platelets -rP% (is determined by flow-cytometric method) which are examined by hematological parameters. In the second part of the test, platelets' counting using monoclonal antibodies is directed to platelet receptor CD61 analyzer "Cell Dyn Sapphire" (Abbott Diagnostics, USA) is added. RESULTS. There was a statistically significant difference between the percentage of reticular platelets between the control group and the patients with thrombocytopenia (13,31% against 1,78%). There was also a statistically significant difference against between reticular platelets from the patients with destructive thrombocytopenia (18,78%) and hypoplastic thrombocytopenia (6,02%). There was no statistically significant difference (p = 0.9431) between the number and and medium platelet volume (MPV) between levels of platelets and platelet receptor CD61, which is determined by PLTo method. The platelets values are determined by specific PLTi method which is statisticaly higher than the PLTo value (p = 0.0071) and platelet receptor CD61 values (p = 0.0049). CONCLUSION. Differential diagnostic methods are limited and the biopsy of bone marrow is considered as the "gold standard" for diagnosis of thrombocytopenia. "Flow"cytometric analysis of reticulted platelets are additional, non-invasive diagnostic method. The task of biochemical laboratory is to encourage this type of test, in order to obtain more complete information of the diagnosis, treatment and thrombocytopenia' prognosis. KEYWORDS: platelets; thrombocytopoiesis; thrombocytopenia; reticulated platelets; receptor CD61. 

Tabela 1 . 1 .Grafikon 2 .Grafikon 3 .

 1123 Poređenje vrednosti parametara između pacijenata eksperimentalne grupe sa trombocitopenijom i kontrolne grupe [podaci su prikazani kao srednja vrednost -Xsr (Sd) i koeficijent korelacije Vrednosti trombocita kod eksperimentalne grupe pacijenata sa trombocitopenijom i kontrolne grupe (podaci su predstavljeni kao box-plots grafikon koji pokazuju 10, 25, 50, 75 i 90 percentila) Vrednosti srednjeg volumena trombocita (MPV) kod pacijenata eksperimentalne grupe pacijenata sa trombocitopenijom i kontrolne grupe. (podaci su predstavljeni kao box-plots grafikon koji pokazuju 10, 25, 50, 75 i 90 percentila) Vrednosti retikulovanih trombocita kod eksperimentalne grupe pacijenata sa trombocitopenijom i kontrolne grupe (podaci su predstavljeni kao box-plots grafikon koji pokazuju 10, 25, 50, 75 i 90 percentila) Takođe, upoređene su vrednosti hematoloških parametara kod kontrolne grupe i grupa pacijenata sa hipoplastičnom (HPT) i hiperdestruktivnom trombocitope-nijom (HDT). Dobijene vrednosti prikazane su u Tabelama 2, 3 i 4 i na grafiko-nima 4, 5 i 6. 


Grafikon 4 .Grafikon 5 .Grafikon 6 .

 456 Vrednosti trombocita kod pacijenata eksperimrentalne grupe sa hipoplastičnom trombocitopenijom (HPT), pacijenata sa hiperdestruktivnom trombocitopenijom (HDT) i kontrolne grupe. [podaci su predstavljeni kao box-plots grafikon koji pokazuju 10, 25, 50, 75 i 90 percentila] Vrednosti MPV kod pacijenata sa hipoplastičnom trombocitopeni-jom (HPT), pacijenata sa hiperdestruktivnom trombocitopenijom (HDT) i kontrolne grupe. (podaci su predstavljeni kao box-plots grafikon koji pokazuju 10, 25, 50, 75 i 90 percentila) Vrednosti retikulovani trombociti kod pacijenata sa hipoplastičnom trombocitopenijom (HPT), pacijenata sa hiperdestruktivnom trombocitopenijom (HDT) i kontrolne grupe. (podaci su predstavljeni kao box-plots grafikon koji pokazuju 10, 25, 50, 75 i 90 percentila) 


Grafikon 7 .Grafikon 8 .

 78 Korelacija vrednosti trombocita određenih PLTi i PLTo metodom. Koeficijenat korelacije r = 0,5058; 95% CI je 0,1780-0,7325; p = 0,0044 Korelacija vrednosti trombocita određenih PLTi i CD61 metodom. Koeficijenat korelacije r = 0,5597; 95% CI je 0,2497-0,7656; p = 0,0013 Grafikon 9. Korelacija vrednosti trombocita određenih PLTo i CD61 metodom. Koeficijenat korelacije r = 0,9477; 95% CI je 0,8920-0,9751; p = < 0,0001 V. DISKUSIJA 2009. godine predložen je jedan dijagnostički algoritam koji bi mogao da služi kao vodič za interpretaciju rezultata niskih 




  




  




  




  




  




  




  




  


Ime trombocita potiče od grčkih reči: θρόμβος-ugrušak i κύτος-ćelija, što

  
	Slika 2. Aktivirani trombociti (izgled na elektronskom mikkroskopu) [preuzeto sa sajta
		http://www.fi.edu/learn/heart/blood/platelet.html]
	CILJEVI ovog stručnog rada su:
	upoznavanje sa značajem novijih
	trombocitnih parametara (CD61 i
	retikulovanih	trombocita)	u
	svakodnevnoj	kliničkoj	praksi	i
	mogućnostima njihove primene u
	rutinskom laboratorijskom praćenju
	trombocitopenije.			
				ukazuje na njihovu osnovnu funkciju -
				formiranje	krvnog	ugruška	[2].
				Trombociti su kao takvi prisutni jedino
				kod sisara, dok kod ostalih vrsta
				kičmenjaka (npr. ptice, vodozemci itd.)
				oni	cirkulišu	kao	intaktne
				mononuklearne ćelije [9-16].

II. DOSADAŠNJA SAZNANJA P. 1. Proces megakariocitopoeze

  
	Trombopoetin (TPO) je najvažniji faktor
	rasta megakariocitopoeze. Kontrolu
	sinteze TPO kontroliše gen THPO, koji
	je lokalizovan na hromozomu 3.
	Istraživanja	genske	inaktivacije,
	pokazala su TPO i njegov receptor Mpl
	(mijeloproliferativni receptor), primarni
	regulatori megakario-trombocitopoeze.
	Tokom normalne hemostaze broj
	trombocita se održava u uskim
	granicama, pri čemu je nivo cirkulišućeg
	TPO	relativno	nizak.	Tokom
	trombocitopenije (broj trombocita niži
	od 150 h 10		

9/L), zbog pada mase trombocita dolazi do redukcije vezivanja i razgradnje TPO od Mpl pozitivnih trombocita. Zato raste koncentracija slobodnog TPO u serumu. TPO stvaraju četiri organa: jetra, bubreg, koštana srž i slezina. 
Tabela 2 .

 2 Poređenje vrednosti parametara između pacijenata eksperimentalne grupe sa hipoplastičnom trombocitopenijom (HPT) i pacijenata sa hiperdestruktivnom trombocitopenijom (HDT). [podaci su prikazani kao srednja vrednost -Xsr (Sd) i koeficijent korelacije (p)*] 


	Parametar	HPT (N = 12)	HDT (N = 16)	p*
	Trombociti h 10 9 /L	33,67 (27,404)	14,37 (13,952)	0,022
	MPV (fl)	10,55 (2,278)	12,32 (3,884)	0,173
	Retikulovani trombociti, procentual-ni (%) odnos	6,022 (4,2570)	18,780 (7,7586)	< 0,0001
	 p < 0,05 -statistički značajna razlika		
	Tabela 3. Poređenje vrednosti parametara između pacijenata sa hipoplastičnom
	trombocitopenijom (HPT) i kontrolne grupe. [podaci su prikazani kao srednja vrednost -
	Xsr (Sd) i koeficijent korelacije (p)*]		
	Parametar	Kontrola (N = 20)	HPT (N = 12)	p*
	Trombociti, 10 9 /L	232,0 (46,26)	33,67 (27,404)	< 0,0001
	MPV, FL	8,06 (0,860)	10,55 (2,278)	0,0001
	Retikulovani trombociti, (%) odnos	1,776 (0,8414)	6,022 (4,2570)	0,0001
	*p < 0,05 -statistički značajna razlika		
	Tabela 4. Poređenje vrednosti parametara između pacijenata sa hiperdestruktivnom
	trombocitopenijom (HDT) i kontrolne grupe. [podaci su prikazani kao srednja vrednost -
	Xsr (Sd) i koeficijent korelacije (p)*]		
	Parametar	Kontrola (N = 20)	HDT (N = 16)	p*
	Trombociti, 10 9 /L	232,0 (46,26)	14,37 (13,952)	< 0,0001
	MPV, fl	8,06 (0,860)	12,32 (3,884)	< 0,0001
	Retikulovani trombociti, %	1,776 (0,8414)	18,780 (7,7586)	< 0,0001
	* p < 0,05 -statistički značajna razlika		

PARAMETERS OF PLATELETS (CD61 AND RETICULATED PLATELETS) IN LABORATORY MONITORING TROMBOCYTOPENIA Slavica KRSMANOVIC , Bratislav STANKOVIC The High Educational School of Professional Health Studies, 11 080 Zemun; Serbia; 254 Cara Dusana Street SUMMARY INTRODUCTION.

  Reticulated platelets are the youngest form of circulating platelets characterized by a residual amount of iRNA.It has been suggested that the reticulated platelet count, providing an estimate of thrombopoiesis.The platelet receptor CD61 is a receptor for fibrinogen, fibronectin, prothrombin, thrombospondin, vitronectin and von Willebrand factor.Flow-cytometric immunological determination of platelets number is proposed by the International Council for Standardization in Hematology (ICSH) as reference.The method is developed using monoclonal antibodies against platelets membrane antigens.The antibody directed against platelet receptor CD61 is the most used.OBJECTIVE.To determine significance of reticular platelets and platelet receptor CD61 testing in laboratorical diagnosis of platelets diseases.MATERIALS AND METHODS.A group of patients with thrombocytopenia in the Clinical Center of Serbia is examined. The experimental group 1 consisted of 28 patients (12 men and 16 women) with chronic thrombocytopenia, which are divided into two subgroups: with hypoplastic thrombocytopenia (12 patients) and destructive thrombocytopenia with hyperactive platelet lineage (16 patients). 


	APPLICATION OF NEW	U sklopu neinvazivne dijagnostike poremećaja trombocitne loze, sve više
					primenu nalaze i biomarkeri, kao što su:
					TPO (trombopoetin) i anti -trombocitna
					antitela. Navedeni biomarkeri u sklopu
					algoritma dijagnostike trombocitopenije
					mogu dati kompletnu informaciju
		. Zato je i zadatak	kliničaru	o	patofiziološkim
	biohemijskih laboratorija da podstaknu	poremećajima megakariocitopoeze, a
	ovakvu vrstu ispitivanja, u cilju	posebno u postavljanju dijagnoze,
	dobijanja kompletnijih informacija o	tretmanu i prognozi trombocitopenija.
	dijagnozi,	tretmanu	i	prognozi
	trombocitopenija.		
	LITERATURA:		
	1. Laki K . Our ancient heritage in blood
	clotting and some of its		
	consequences. Annals of the New York
	Academy of Sciences; 1972; 202: 297-
	307.