The role of human papillomavirus typization and cytology in early detection of relapse of cervical intraepithelial neoplasia

Keywords: papiloma virus, citodijagnostika, grlić materice, neoplazme, osetljivost i specifičnost papillomavirus infections, cytodiagnosis, uterine cervical neoplasms, sensitivity and specificity

Uvod/Cilj. Bolesnice sa nekim od vidova lečenja intraepitelne neoplazije grlića materice imaju i do pet puta veći rizik od ostale populacije žena od recidiva bolesti. Cilj rada bio je da se ispita uloga tipizacije humanog papiloma virusa (HPV) i citologije u detekciji recidiva. Metode. Prospektivno kliničko istraživanje obuhvatilo je 35 bolesnica sa recidivom i 30 bez recidiva nakon lečenja cervikalne intraepitelne neoplazije. Kod svih ispitanica urađena je HPV tipizacija korišćenjem polymerase chair reation (PCR) metode i citološki test (konvencionalni Pap razmaz), a potom je izvršeno ocenjivanje primenjenih testova određivanjem njihove senzitivnosti, specifičnosti i pozitivne i negativne prediktivne vrednosti. Rezultati. Recidivi intraepitelnih neoplazija težeg gradusa javljaju se statistički značajno češće kod bolesnica koje i posle lečenja ostaju pozitivne na HPV. Bolesnice koje i posle lečenja intraepitelnih neoplazija ostaju pozitivne na HPV tipa 18 ili zajedno na HPV tipa 16 i 18, imaju češće recidive težeg gradusa, nego one koje su pozitivne samo na HPV tipa 16. Tipizacija HPV ima veću prediktivnu vrednost za dijagnostiku rezidualne bolesti kod starijih bolesnica. Senzitivnost HPV tipizacije za dijagnostiku recidiva intraepitelne neoplazije svih stadijuma je 68,57%, a za teže graduse, HSIL i MIK, 90,47%, specifičnost je 93,33%, pozitivna prediktivna vrednost 90,47%, a negativna prediktivna vrednost 93,53%. Senzitivnost citologije za dijagnostiku recidiva težeg gradusa je 80,95%. Korišćenjem HPV tipizacije zajedno sa citologijom ostvaruje se najveća senzitivnost od 95,23%. Zaključak. I HPV tipizacija i Pap test pružaju zadovoljavajuću senzitivnost i visoku specifičnost u otkrivanju recidiva cervikalnih intraepitelnih neoplazija posebno onih višeg gradusa. Najveća sensitivnost postiže se korišćenjem oba testa. 

Uvod

Procenat mladih žena koje se leče konizacijom ili nekom drugom operativnom tehnikom zbog premalignih i malignih bolesti grlića materice, u stalnom je porastu. Zbog činjenice da se radi o mladim bolesnicama koje se podvrgavaju raznim vidovima lečenja, važno je pronaći najadekvatniji i najsigurniji pristup njihovom daljem praćenju i lečenju. Najvažnija je rana detekcija eventualnih recidiva kao i detektovanje rizične grupe bolesnica za njihovu pojavu. Ovo je pogotovo važno zbog činjenice da se radi o bolesnicama koje još nisu završile svoju reproduktivnu funkciju i kojima bi svaka nova hiruška reintervencija smanjila mogućnost za obavljanje ove funkcije. 
Metode koje koristimo u daljem praćenju bolesnica koje su lečene zbog intraepitelnih neoplazija grlića materice identične su onima koje se koriste pri njihovoj detekciji pre lečenja. Eksfolijativna citologija, kolposkopija, tipizacija humanog papiloma virusa (HPV tipizacija), biopsija, kiretaža cervikalnog kanala, jesu suverene dijagnostičke procedure koje se koriste za otkrivanje mogućih recidiva bolesti. Ono što iz ove cele grupe izdvaja HPV tipizaciju jeste činjenica da rezultat ove analize ne samo da pomaže u detekciji recidiva, već može da predstavlja i važan prognostički parametar koji ukazuje na povećan rizik od razvoja recidiva. Na taj način, zahvaljujući nalazu HPV tipzacije, može da se izdvoji posebna grupa bolesnica koju treba intenzivnije sagledati i pratiti nezavisno od klasičnog protokola o praćenju [1][2][3] . 
Sve bolesnice koje su imale neki od vidova lečenja intraepitelne neoplazije grlića materice i do dvadeset pet godina nakon lečenja imaju pet puta veći rizik od recidiva bolesti u odnosu na ostalu populaciju žena. Ovaj rizik daleko je veći kod bolesnica koje i posle lečenja ostanu pozitivne na HPV 1 . 
Procenat recidiva intraepitelnih neoplazija nakon lečenja kreće se od 8 do 19,3% 2 . Podaci iz literature o negativizaciji i eradikaciji HPV infekcije nakon lečenja, kao i podaci o procentu recidiva, razlikuju se, ali se često navodi da prosečno 39,2% bolesnica postaje negativno nakon operacije, a da su tipovi virusa koji u najmanjem procentu bivaju eradicirani lečenjem 16,18 i 33 3 . 
Costa i sar. 4 iznose sličan procenat negativizacije (29,8%) na prvoj kontroli posle operacije, sa mesečnom stopom negativnih nalaza od 5,27%, tako da se na kraju taj procenat kreće do 63,5%. 
Falliani i sar. 5 u jednom od radova novijeg datuma iznose podatak da je nakon 24 meseca praćenja bolesnica lečenih konizacijom laserom zbog cervikalnih intraepitelnih neoplazija (CIN) težeg gradusa (CIN II -III), procenat recidiva bio 15,4%. Negativizacija bolesnica na virus posle lečenja bila je 78,8%. Jedino su negativizacija na virus i zahvaćenost ivica konusa bili nezavisni i značajni prognostički faktori za pojavu recidiva. Ovi podaci, ujedno, pokazuju da u proseku svaka peta bolesnica lečena od CIN II-III (HSIL) promena ostaje pozitivna na HPV i posle operacije. 
Cilj ovog rada bio je da se utvrdi pouzdanost HPV tipizacije, kao i citologije za detekciju recidiva intraepitelnih neoplazija grlića materice. 

Metode

U Klinici za ginekologiju i akušerstvo u Nišu, u periodu od marta 2006. do marta 2009. godine sprovedena je prospektivna klinička studija. Eksperimentalnu grupu činilo je prvih 35 bolesnica koje su se javile nakon lečenja nekog od stadijuma intraepitelne neoplazije grlića materice zbog recidiva. Kontrolna grupa obuhvatala je prvih 30 bolesnica kod kojih je od lečenja prošlo više od godinu dana i koje nisu imale dijagnostikovan recidiv bolesti. 
Sve bolesnice (njih 65) imale su urađen citološki i nalaz HPV tipizacije. Bolesnice eksperimentalne grupe imale su urađen i patohistološki nalaz dobijen biopsijom ili eventualnom hiruškom reintervencijom. Citološki rezultati dobijeni su primenom konvencionalne citologije. Brisevi su uzimani štapićem sa vatom i špatulom i bojeni diferencijalnom metodom bojenja prema Papanikolau. Očitavanje nalaza vršeno je na mikroskopu marke Olimpus. Klasifikacija nalaza rađena je uporedno sa Papanikolau i Bethezda klasifikacijom. 
Brisevi za HPV tipizaciju uzimani su sterilnim hermetički zatvorenim epruvetama u kojima je štapić pri kraju bio obmotan vatom. Uzorak je uziman iz egzo-i endocerviksa i uz propratnu dokumentaciju odmah prosleđivan u laboratoriju za molekularnu biologiju i citogenetiku Kliničkog centra u Nišu. Uzorci su zamrzavani i skladišteni, a potom su, najdalje u roku od dva meseca, transportovani na ledu u laboratoriju za molekularnu genetiku Stomatološkog fakulteta u Beogradu na dalju analizu. U ovoj instituciji rađena je dalja izolacija i identifikacija malignih tipova HPV korišćenjem PCR metode. 
Štapići sa uzorkom lomljeni su, stavljani u mikrotube i prelivani sa 400 µl sterilne, destilovane vode. Njihovim kuvanjem tokom 15 min postignuta je izolacija virusne DNK. Ostatak štapića je bio uklonjen, a u vodenom rastvoru ostala je DNK virusa. Centrifugiranjem tuba 3 min na 10 000 obrtaja/min, nečistoće sa brisa su se istaložile, a DNK je ostao u supernatantu. Urađeno je međusobno upoređivanje svih dobijenih dijagnostičkih nalaza, a rezultati su dovedeni u vezu sa mogućim poznatim faktorima rizika dobijenim anamnestičkim podacima. Svi rezultati statistički su obrađeni i tabelarno prikazani. Distribucija nalaza HPV tipizacije ispitanica eksperimentalne (sa recidivom) i kontrolne grupe (bez recidiva) prikazana je u tabeli 2. Procenat HPV pozitivnih nalaza bio je statistički značajno veći kod ispitanica sa recidivom bolesti. Samo 6,66% ispitanica kontrolne grupe bile su HPV pozitivne. U tabeli 3 prikazana je distibucija pozitivnih nalaza HPV tipizacije kod bolesnica sa recidivom niskog (LSIL) i visokog gradusa (HSIL). Procenat HPV pozitivnih nalaza bio je statistički značajno veći u grupi sa recidivom visokog gradusa (90,47% HSIL : 35,71% LSIL). 

Rezultati

Procenat HPV pozitivnih nalaza bio je, takođe, statistički značajno češće i kod bolesnica sa recidivom CIN istog gradusa nego kod ispitanica kontrolne grupe (5 od 14; 35,71% : 2 od 30; 6,67%). 
U tabeli 4 prikazana je distibucija stadijuma recidiva CIN u odnosu na tip HPV. Tabela pokazuje da ispitanice sa recidivom visokog gradusa (CIN II -III i MIK) u odnosu na one sa niskim (CIN I) gradusom imaju statistički značajno veću zastupljenost HPV tipa 18 ili udruženog HPV tipa 16 i 18. Značajnu razliku u zastupljenosti HPV tipa u okviru grupe sa visokim gradusom recidiva, nismo uspeli da dokažemo. 
Distribucija HPV nalaza u grupi bolesnica sa recidivom u odnosu na godine života prikazana je u tabali 5. Najveći procenat pozitivnih nalaza HPV testa bio je u grupi starijih ispitanica (83,33%), dok je kod mlađih ispitanica procenat pozitivnih nalaza bio skoro duplo manji (44,41%). Takođe, HPV test bio je pouzdaniji za otkrivanje recidiva kod starijih bolesnica. Starije bolesnice pozitivne na HPV bile su pod većim rizikom od pojave recidiva CIN, zbog čega ih treba intenzivnije pratiti i ispitati. 
Iz podataka datih u tabeli 2, korišćenjem poznatih formula za ispitivanje pouzdanosti dijagnostičkih testova, izračunati su senzitivnost i specifičnost HPV tipizacije u dijagnostici recidiva CIN. Tako, senzitivnost HPV tipizacije za detekciju svih stadijuma recidiva (CIN I, CIN II, CIN III i MIC) iznosi 68,57%. Specifičnost HPV tipizacije je visoka (93,33%). Pozitivna prediktivna vrednost ovog testa iznosi 92,30%, a negativna prediktivna vrednost 71,79% . U tabeli 6 posebno su prikazani parametri prednosti HPV tipizacije za recidive visokog gradusa (CIN II, III i MIK), koji su značajniji, jer zahtevaju hirušku reintervenciju. Izračunata senzitivnost HPV tipizacije za otkrivanje recidiva višeg gradusa je veća i iznosi 90,47%, specifičnost je 93,33%, pozitivna prediktivna vrednost 90,47%, a negativna prediktivna vrednost 93,53%. 
Distribucija citoloških nalaza kod bolesnica sa i bez recidiva bolesti prikazana je u tabeli 7 . Senzitivnost citologije za detekciju recidiva, slična je senzitivnosti HPV tipizacije i iznosi 68,57%. Specifičnost citologije je veća od HPV tipizacije i iznosi 96,66%. 
Distribucija citoloških nalaza u odnosu na stadijum recidiva (tabela 7), pokazuje veću senzitivnost citologije za detekciju recidiva višeg gradusa (CIN II -III i MIK) -80,95%, nego za niže graduse (CIN I) -50%. Korišćenjem HPV tipizacije uporedo sa citologijom povećava se senzitivnost za detekciju recidiva na 95,23%. 

Diskusija

Procentualna zastupljenost bolesnica sa recidivom CIN koje su imale pozitivan nalaz HPV tipizacije prikazana je u tabeli 2. Iz tabele se vidi da je 68,57% bolesnica sa recidivom bilo HPV pozitivno, što se pokazalo statistički značajno. Kod 31,42% bolesnica nalaz HPV tipizacije bio je lažno negativan. Bolesnice kontrolne grupe (bez recidiva) imale su 6,66% lažno pozitivan nalaz HPV tipizacije. Procenat HPV pozitivnih recidiva, iznet u radu holandskih autora, sličan je i iznosi 62,5%, dok je procenat lažno pozitivnih nalaza bio veći (55%) 6 . 
Veći procenat HPV pozitivnih nalaza kod bolesnica sa recidivom CIN, nego kod bolesnica kontrolne grupe, nalaze i Bodner i sar. 7 . Tri meseca nakon konizacije kod 73% njiho-vih bolesnica došlo je do negativizacije na HPV. U kontrolnoj grupi bilo je samo 4% detektovanih recidiva. U eksperimentalnoj grupi (27% bolesnica) sa perzistentnom HPV infekcijom otkriven je recidiv CIN kod 50% slučajeva. Bolesnice eksperimentalne grupe sa perzistentnom HPV infekcijom u većem procentu bile su starije od bolesnica kontrolne grupe. U odnosu na podatak o težini intraeptilne neoplazije zbog koje je rađena konizacija, bolesnice eksperimentalne grupe bile su češće operisane zbog težeg stadijuma. Otkrivenih recidiva kod pozitivnih ivica konizata bilo je 83%. Ako je uz podatak o pozitivnim ivicama, HPV tipizacija bila pozitivna, onda je kod 100% bolesnica otkriven recidiv. Na taj način, pokazano je da HPV tipizacija snižava za 17% nepotrebno urađene hiruške reintervencije 7 . 
Distribucija HPV pozitivnih bolesnica u odnosu na stadijum recidiva intraepitelne neoplazije u našoj studiji pokazuje da je statistički značajno veći procenat bolesnica sa intraepitelnim neoplazijama težeg gradusa, nego onih sa blažim (CIN I), bio pozitivan na HPV (90,47% : 35,71%). Sa druge strane, pokazano je da je veći procenat ovih blažih lezija bio pozitivan sa HPV nego kod bolesnica kontrolne grupe (35,71% : 6,5%). Na osnovu ovih podataka vidi se da je pozitivnost na onkogene HPV tipa 16 i 18 u visokom procentu povezana sa pojavom recidiva. 
Zbirne vrednosti HPV tipizacije u našoj studiji, za sve stadijume recidiva, niže su zato što je rađena PCR metoda na dva najonkogenija tipa HPV 16 i 18, koja su u malom procentu prisutna kod blagih (CIN I) intraepitelnih lezija. Na taj način, ova grupa recidiva najnižeg stadijuma snizila je ukupnu pouzdanost HPV tipizacije (senzitivnost 68,57%, specifičnost 93,33%). Patogeneza i evolucija ovih blagih promena (CIN I) pokazuje u najvećem procentu spontanu regresiju i ne zahteva nikakvu dodatnu hirušku reintervenciju. Smatra U podacima iz literature pouzdanost HPV tipizacije najčešće se određuje upoređivanjem sa validnošću citologije. Značaj citologije u postoperativnom praćenju bolesnica posle urađene konizacije mnogi autori opisuju i podržavaju kao jednu od najkorisnijih dijagnostičkih metoda u detekciji rezidualne bolesti. Tako, Buxton i Luesley 8 navode da bolesnice koje su imale postoperativno normalan citološki Pap nalaz nisu imale rezidualnu bolest, dok je kod 57% sa abnormalnim Pap razmazom otkrivena rezidualna bolest. U radovima novijeg datuma, sa druge strane, više se naglašavana uloga HPV tipizacije nego citologije. Zaključak je da HPV tipizacija kod operisanih bolesnica ima statistički značajno veću senzitivnost nego citologiju, a statistički zanemarljivo nižu specifičnost za detekciju recidiva. Takođe, u istim radovima na osnovu dobijenih podataka ističe se značaj tipizacije za trijažu bolesnica sa graničnim citološkim nalazom nakon operacije -ASCUS nalazom 9 . 
Komparativni prikaz pouzdanosti tipizacije humanog papiloma virusa i eksfolijativne citologije u dijagnostici recidiva radili su Alonso i sar. 10 . Podaci koje su dobili pokazali su da HPV tipizacija ima veću senzitivnost nego citologija (97,2% : 83,3%), a manju specifičnost (81,4% : 92,2%). Kombinacijom i citologije i HPV tipizacije u detekciji recidiva senzitivnost se povećeva na 100%, negativna prediktivna vrednost je, takođe, 100%, dok specifičnost ostaje nešto niža, prihvatljivih 76,6%. 
Upoređivanje senzitivnosti HPV tipizacije i citologije u utvrđivanju recidiva CIN uradili su Lee i sar. 11 koristeći hybrid capture II test (HC II) dokazali su skoro identičnu vrednost senzitivnosti tipizacije HPV i citologije. Senzitivnost tipizacije iznosila je 89,9%, a citologije 86,2%. U odnosu na stadijum intraepitelne neoplazije senzitivnost HPV tipizacije iznosila je 88,1%, za najblaže stadijume (CIN I) do 92,5% za intraepitelne neoplazije težeg (CIN III) stadijuma. U istom radu prilikom određivanja vrste (genotipa) virusa i njihove udruženosti sa neoplazijama višeg gradusa, sem visokog procenta HPV 16 i 18 utvrdili su i veliki procenat virusa tipa 52 i 58. Iz tih razloga, ovi autori naglašavaju da bi se i ove vrste virusa možda mogle uključiti u HPV vakcinaciju 11 . 
Grupa autora iz Italije, Venturoli i sar. 12 , takođe su upoređivali pouzdanost citologije i HPV tipizacije za detek-ciju CIN. Za razliku od podataka u prethodnom radu, njihovi podaci za senzitivnost HPV tipizacije još su bolji nego za citologiju i iznose 91,7%, dok je specifičnost 95,4%. Veća senzitivnost verovatno je posledica toga što su ovi autori za detekciju virusa koristili PCR -ELISA test, a ne hybrid capture II test, što je naročito bitno za diferencijaciju LSIL i HSIL promena. Statističkom analizom svih dobijenih parametara ipak je ustanovljena direktna korelacija HPV DNA pozitivnosti sa težinom dijagnoze, dobijenom citološkim nalazom (p < 0,005). 
Senzitivnost i specifičnost HPV tipizacije u detekciji intraepitelnih neoplazija težeg gradusa pokazali su i drugi autori 13 . Tako npr. od 60,4% HPV pozitivnih bolesnika CIN II -III nađen je kod 18%. Izračunata vrednost senzitivnosti bila je 89,5% (41 bolesnica od 57 HPV pozitivnih na biopsiji imala je nalaz intraepitelnih neoplazija težeg gradusa). Specifičnost HPV tipizacije prema podacima iz ovog rada imala je vrednost od 45,8%, što je najmanji procenat od svih prethodno objavljenih radova. Negativna prediktivna vrednost bila je visoka i iznosila je 95,3%. Na kraju ovog istraživanja zaključeno je da postoji 7,2 puta veći rizik od dobijanja nalaza CIN II -III kod bolesnika sa pozitivnim vrednostima HPV tipizacije 13 . 
Ukupna pouzdanost citologije za detekciju recidiva svih stadijuma, koja je dobijena u našem iztraživanju, prikazana je u tabeli 7. Senzitivnost citologije za sve stadijume recidiva je niska i iznosi 68,57%, dok je specifičnost visoka (96,66%). Pozitivna prediktivna vrednost je 96%, a negativna 72,5%. Senzitivnosti citologije je niža vrednosti zato što citologija ima visok procenat lažno negativnih nalaza kod bolesnika sa blažim stadijumom (CIN I) recidiva. Korišćenjem HPV tipizacije uporedo sa citologijom smanjuje se broj lažno negativnih nalaza za 4, odnosno za 11,42%, što povećava senzitivnost na 80%. 
U tabeli 7 date su izračunate vrednosti pouzdanosti citologije za detekciju svih stadijuma recidiva pojedinačno. Podaci za teže stadijume recidiva slični su onima koje su dobili Alonso i sar. 10 . Senzitivnost citologije je 80,95% (50% za CIN I), a upotrebom HPV tipizacije senzitivnost se povećava na 95,23%, što su najveće vrednosti za senzitivnost (veće i od onih dobijenih kolposkopijom). 
Pozitivnu prediktivnu vrednost za detekciju recidiva CIN različitih stadijuma upotrebom HPV tipizacije i citologije, ispitivali su Almog i sar. 14 . Ukupan procenat patoloških citoloških nalaza tri meseca posle konizacije bio je 22,4%. Procenat LSIL razmaza bio je kod 55%, a HSIL razmaza 45%. Biopsijom grlića materice rezidualna bolest nađena kod 19,1%, tj, kod 85% bolesnica sa patološkim citološkim nalazom. Recidiv LSIL je nađen je kod 52,94%, a HSIL kod 47%. Pozitivna prediktivna vrednost citologije za detekciju LSIL recidiva niža je od HPV tipizacije i iznosi 54,5%, dok je HPV vrednost kod ovih bolesnika bila u 100 niskih i graničnih vrednosti pozitivnosti. Kod HSIL recidiva citologija ima pozitivnu prediktivnu vrednost 89%, dok HPV tipizacija pokazuje 100% prisutnost visokih vrednosti prisustva virusa. Na osnovu ovih podataka autori su došli do zakjučka da HPV tipizacija ima bolju prediktivnu vrednost za LSIL recidive od citologije. Ovakvi podaci slažu se sa rezultatima naše studije Strana 319 Živadinović R, et al. Vojnosanit Pregl 2011; 68(4): 314-320. 
u kojoj je zahvaljujući HPV tipizaciji snižen procenat lažno negativnih citoloških nalaza za 11,42% 14 . 
Prevalenciju HPV pozitivnosti kod bolesnika sa citološki normalnim nalazom ispitivali su Gupta i sar. 15 . Procenat HPV pozitivnih nalaza sa normalnim Pap nalazom u ovom radu iznosio je 16,6%. Kod 67% bolesnica urađen je tip virusa 16 i 18. Pozitivnost HPV i u ovoj grupi bolesnika bila je veća kod starijih bolesnica, kod većeg pariteta i lošijeg socioekonomskog statusa 15 . 
U radu Vergutsa i sar. 16 dobijene su veće vrednosti za senzitivnost HPV tipizacije. Ovi autori u prospektivnoj studiji upoređivali su ulogu HPV tipizacije, statusa ivica i citologije u praćenju bolesnica operisanih konizacijom nožem zbog promena CIN II -III. Bolesnice su praćene na šest meseci tokom dve godine. Ukupan procenat recidiva bio je 8%. Bolesnice sa recidivom bile su statistički značajno starije od bolesnica kontrolne grupe (51,5 : 39,8 godina). Senzitivnost HPV tipizacije bila je najveća u prognozi rezidualne bolesti i iznosila je 100%. Senzitivnost citologije bila je 66,7%, dok je senzitivnost pozitivnih ivica konusa bila 33,33%. Specifičnost citologije bila je najveća (90,9%), specifičnost ivica konizata bila je nešto niža (81,8%), dok je HPV tipizacija imala najnižu vrednost specifičnosti (77,3%). Kontrolna grupa imala je pozitivan nalaz HPV tipizacije kod 22,7% i Pap patološki nalaz kod 9%. Niže vrednosti specifičnosti HPV tipizacije povećavale su se udruženom primenom ovog testa sa citologijom. Tako, ako je patološki nalaz testa HPV tipizacije povezan sa patološkim citološkim nalazom, recidiv intraepitelne neoplazije otkriva se kod više od 50%, dok je učestalost recidiva samo 15%, ako je citološki nalaz normalan, a nalaz HPV tipizacije patološki 16 . 
Predmet ispitivanja u mnogim radovima, sem pozitivnosti na HPV virus, bila je i distribucija perzistencije pojedinih tipova HPV. Nagaia i sar. 17 u grupi perzsitentnih HPV infekcija sa recidivom našli su HPV tipa 16 kod 50%, 18 kod 26, 8%, dok su ostali tipovi bili zastupljeni kod 32,1% bolesnica. 
Podaci o zastupljenosti pojedinih tipova virusa u rekurentnoj bolesti dobijeni u radu Terra i sar. 18 slični su prethodnim. Najzastupljeniji tip virusa bio je tip 16, ali je procenat pojave ovog tipa još veći nego prema rezultatima prethodnih autora i iznosio je 69,7%, tipa 18 bio je 33,3% dok je udruženost oba tipa virusa bila pristuna kod 15,1% bolesnica. Konkomitantna infekcija HPV tipa 16 bila je prisutna kod 15,1%, dok je udruženost infekcije ovih tipova sa HPV tipa 18 bila 33,3%. Isti autori korišćenjem metilacio-specifične PCR reakcije analizirali su promoter hipermetilaciju 8 gena (p16, RARbeta,GSTP1, MGMT, p14, TIMP3, E-cad i DAPk). Recidiv se javio samo u slučaju hipermetilacije kod tri i više od pomenutih osam gena. Na taj način aberantnost promotera metilacije može biti još jedan koristan biomarker recidivantnih intraepitelnih neoplazija 18 . 
Podaci o distribuciji pojedinih tipova HPV u odnosu na stadijum recidiva CIN dobijeni u našem istraživanju kazuju da je najveći procenat ispitanica bio pozitivan na HPV tipa 16 (80%). Ovakvi podaci su očekivani s obzirom na to da se radilo o recidivima skvamoznih neoplazija. Bolesnice koje su bile pozitivne na HPV tipa 18 (njih 5,7%) ili koje su bile po-zitivne na oba virusa HPV 16 i 18 (njih 14,28%), imale su statistički značajno teži gradus recidiva. U odnosu na podatke iz prethodnog rada procenat HPV 18 je manji, dok je procenat konkomitantne HPV 16 i 18 infekcije skoro identičan (15,1%). Što se tiče povezanosti težeg stadijuma recidiva i udružene infekcije sa HPV 16 i 18, naši gore izneti podaci razlikuju se od podataka Venturolija i sar. 19 . Ovi autori nalaze značajnu povezanost stadijuma recidiva i udružene HPV infekcije. 
Oni su ispitivali, takođe, pozitivnost određenih tipova HPV kod bolesnica sa recidivom. Upoređivan je preoperativni i postoperativni HPV status dve godine nakon operacije. Nađeno je da je kod bolesnica sa recidivom bolesti bila veća zastupljenost HPV 16 i 18 (82,4%), nego virusa iz grupe dva (HPV 31, 33, 35, 45, 52 i 58) (66,7%), dok je zastupljenost treće grupe (HPV 39, 51, 56, 59, 68, 26, 53, 66, 73 i 82) bila još manja (14,3%) 19 . 
Slične podatke o zastupljenosti pojedinih tipova HPV kod recidiva dobili su i Sigurdsson i sar. 20 . Ova grupa autora posebno je ispitivala zastupljenost pojedinih tipova virusa za različite stadijume recidiva bolesti. Ukupno 95% recidiva CIN III i 92% karcinoma bilo je pozitivno na virus. Kod promena CIN II i III najčešće je bio zastupljan HPV tipa 16, zatim 33, 31, 52, 35, 18, 58, 56, 39, 45. Kod karcinoma bio je zastupljen, takođe, najviše tip 16, dok je zastupljenost ostalih tipova bila drugačija i iznosila je redom: 18, 33, 45, 31, 39, 52, 35, 51, 56. Iz ovoga sledi da distribucija HPV tipova kod bolesnica sa recidivom zavisi od gradusa bolesti. Sem ovog faktora, u toku ispitivanja ustanovljena je povezanost tipova HPV infekcije i recidiva sa starosnim dobom bolesnica i histološkim tipom tumora (tip 18 bio je češći kod adenokarcinoma). Udruženost više vrsta HPV tipova kod iste bolesnice nije se pokazala značajnom za češću pojavu recidiva ili pojavu težih stadijuma recidiva. Na osnovu ovakve distribucije tipova virusa u raznim stadijumima bolesti i njihove zastupljenosti u postojećim HPV vakcinama isti autori zaključuju da vakcine štite u 60% slučajeva od karcinoma, a u 40% slučajeva od intraepitelnih neoplazija grlića materice 20 . 
Rezultati našeg istraživanja, za distibuciju HPV pozitivnih i negativnih nalaza, u odnosu na starost ispitanica eksperimentalne grupe pokazuju da su starije bolesnice sa recidivom bile HPV pozitivne u statistički značajno većem procentu. Takođe, zaključili smo da je nalaz HPV tipizacije kod starijih bolesnica značajniji faktor u predviđanju recidiva bolesti. Ovakvi podaci ističu značaj perzistencije HPV pozitivnosti za razvoj recidiva, što znači da starije bolesnice koje nisu uspele da svojim imunitetom negativiziraju HPV i imaju rizik od recidiva. 
I na kraju, bolesnice koje i posle godinu dana od operacije ostanu pozitivne na onkogene tipove HPV 16 i 18, imaju veći rizik od pojave recidiva koji je po nekim autorima i 18 puta veći od onog u grupi negativnih na ove tipove virusa 21 . 
Kasnijom analizom patološkog nalaza bolesnica sa recidivom bolesti kod kojih je urađena reintrevencija, utvrđeno je najveće slaganje u stadijumu za recidive visokog (CIN III) gradusa (84,61%), dok su recidivi manjeg gradusa (CIN II -Živadinović R, et al. Vojnosanit Pregl 2011; 68(4): 314-320. I) pri reintervenciji bili zastupljeni kod 50%, bolesnica, što sugeriše da bi, poštujući specifičnosti svakog slučaja recidiva ponaosob, možda za ove stadijume trebalo zauzeti ekspektativniji stav. 

Zaključak

Recidivi intraepitelnih neoplazija težeg gradusa javljaju se statistički značajno češće kod bolesnica koje i posle lečenja ostaju pozitivne na HPV. 
Bolesnice koje i posle lečenja intraepitelnih neoplazija ostaju pozitivne na HPV tipa 18 ili, zajedno, na HPV tip 16 i 18, imaju češće recidive težeg gradusa nego one koje su pozitivne samo na HPV tipa 16. 
Tipizacija HPV ima veću prediktivnu vrednost za dijagnostiku rezidualne bolesti kod starijih bolesnica. 
Senzitivnost HPV tipizacije za dijagnostiku recidiva intraepitelne neoplazije svih stadijuma je 68,57% a za teže graduse (HSIL i MIK) 90,47%; specifičnost iznosi 93,33%, pozitivna prediktivna vrednost 90,47%, a negativna prediktivna vrednost 93,53%. 
Senzitivnost citologije za dijagnostiku recidiva težeg gradusa je 80,95%. Korišćenjem HPV tipizacije zajedno sa citologijom ostvaruje se najveća senzitivnost od 95,23%. 

L I T E R A T U R A




  Strana 315 Živadinović R, et al. Vojnosanit Pregl 2011; 68(4): 314-320. 


Tabela 1 Distribucija patohistoloških nalaza (PH) recidiva kod bolesnica eksperimentalne grupe

  
	U tabela 1 prikazana je distribucija patoloških nalaza
	recidiva nakon lečenja intraepitelnih neoplazija grlića mate-
	rice. Procentualno, broj recidiva CIN I i CIN III bio je sličan
	(40% : 37,14%), dok je statistički bio najmanji broj recidiva
	CIN II stadijuma.			
	PH nalaz	n	Bolesnice	%
	CIN I	14	0040,00,00
	CIN II	05	14,28	
	CIN III	13		37,14
	MIK	03		08,57
	Ukupno	35	100,0000

CIN -cervical intraepithelial neoplasia; MIK -mikroinvazivni karcinom

  
	Živadinović R, et al. Vojnosanit Pregl 2011; 68(4): 314-320.

Tabela 2 Distribucija nalaza HPV tipizacije kod ispitanica eksperimntalne i kontrolne grupe u odnosu na prisustvo ili odsustvo recidiva bolesti

  
	HPV nalaz	sa recidivom	Bolesnice bez recidiva	Ukupno
		n	%		n	%	n	%
	Pozitivan	24	68,58	2	6,67	26	40
	Negativan	11	31,42	28	93,33	39	60
	Ukupno	35	100,00	30	100,00	65	100,00

HPV - 
humani papiloma virus Tabela 3 Distribucija nalaza HPV tipizacije kod ispitanica eksperimentalne grupe sa HSIL (CIN II +CIN III) i MIK nalazom recidiva bolesti u odnosu na LSIL (CIN I) recidiv

  
	HP nalaz	HPV pozitivne n %	HPV negativne n %	n	Ukupno %
	LSIL	5	35,71	9	64,28	14	100
	HSIL i MIK	19	90,47	2	9,52	21	100
	Ukupno	24	68,57	11	31,42	35	100

LSIL -low grade squamous intraepithelial lesion; HSIL -high grade squamous intraepithelial lesion; MIK -mikroinvazivni karcinom; HPV -humani papiloma virus; CIN -cervical intraepithelial neoplasia Tabela 4 Distribucija nalaza recidiva u odnosu na otkriveni tip humanog papiloma virusa

  
	Tip virusa	CIN I n	%	n	CIN II	%	n	CIN III	%	n	MIK	%	n	Ukupno	%
	HPV 16	14	50	4	14,28	9		32,14	1		3,57	28	100
	HPV 18	0		0			1		50	1		50	2		100
	HPV 16+18	0		1		20	3		60	1		20	5		100
	Ukupno	14	40	5	14,28	13	37,14	3		8,57	35	100
	HPV -														

humani papiloma virus ; CIN -cervical intraepithelial neoplasia; MIK -mikroinvazivni karcinom Tabela 5 Distribucija HPV nalaza u odnosu na starosti ispitanica eksperimentalne grupe

  
	Starost bolesnica	HPV pozitivan	HPV negativan		Ukupno
	(godine)	n	%	n	%	n	%
	20-29	4	44,44	5	55,55	9	100
	30-39	9	64,28	5	35,71	14	100
	40-49	10	83,33	2	16,66	12	100
	Ukupno	23	65,71	12	34,28	35	100

HPV -humani papiloma virus Strana 317Živadinović R, et al. Vojnosanit Pregl 2011; 68(4): 314-320. 
Tabela 6 Pouzdanost HPV tipizacije za dijagnostikovanje težih HSIL i MIK stadijuma recidiva bolesti

  
	HPV test	n	HSIL i MIK %	Bez recidiva n %	n	Ukupno	%
	Patološki nalaz		19	90,47	2	9,52	21	100
	Normalan nalaz		2	6,66	28	93,33	30	100
	Ukupno		21	40	30	60	51	100
	HPV -humani						

papiloma virus; HSIL -high grade squamous intraepithelial lesion; MIK -mikroinvazivni karcinom Tabela 7 Distribucija citoloških nalaza kod ispitanica bez i sa recidivom bolesti u zavisnosti od stadijuma recidiva

  
	Bolesnice		patološki	Nalaz Pap testa	normalan	Ukupno
		n		%	n		%	n	%
	Sa recidivom	24		96	11	27,5	35	53,84
	Bez recidivom	1		4	29	72,5	30	46,16
	Ukupno sa recidivom	25		100	40	100	65	100
	LSIL	7		50	7		50	14	100
	HSIL i MIK	17	80,95	4		19,05	21	100
	Ukupno	24	68,58	11	31,42	35	100

Pap -Papanikolau; LSIL -low grade squamous intraepithelial lesions; HSIL -high grade squamous intraepithelial lesion; MIK -mikroinvazivni karcinom

  
	se da ove promene imaju i drugačiju etiopatogenezu i da ne
	predstavljaju stadijum nastanka promena ka težem gradusu
	(CIN II, III) i karcinomu. Iz tih razloga, posebno smo izraču-
	nali pouzdanost otkrivanja onkogenih virusa za teže stadiju-
	me recidiva koji zahtevaju reintervenciju. Dobijeni rezultati
	pokazuju visoku senzitivnost HPV tipizacije za otkrivanje
	težih recidiva koja iznosi 90,47%, specifičnost je 93,33%,
	pozitivna prediktivna vrednost (pozitivan nalaz kod recidiva)
	90,47%, a negativna prediktivna vrednost (negativan nalaz
	kod bolesnica bez recidiva) 93,53%. U ovom istraživanju
	dobili smo više vrednosti za specifičnost od onih koje nala-
	zimo u literaturi, takođe zato što smo koristili PCR i dokazi-
	vali isljučivo visoko onkogene tipove HPV koji su u znatno
	manjem procentu prisutni kod zdravih ispitanica. Na taj na-
	čin, dobili smo manji procenat lažno pozitivnih nalaza i veću
	specifičnost HPV testa.

Živadinović R, et al. Vojnosanit Pregl 2011; 68(4): 314-320.
The role of human papillomavirus typization and cytology in early detection of relapse of cervical intraepithelial neoplasia