Predgovor

Hemijski deo ove doktorske disertacije je urađen na Departmana za hemiju, biohemiju i zaštitu životne sredine, Prirodno-matematičkog fakulteta, Univerziteta u Novom Sadu, pod mentorstvom prof. dr Mirjane Popsavin, redovnog profesora PMF-a u Novom Sadu, a u okviru projekata «Sinteza potencijalnih citotoksčnih agenasa, antihormona, enzimskih inhibitora i stimulatora rasta» i «Sinteza biološki aktivnih molekula i analoga od potencijalnog interesa za biomedicinu i agronomiju», finansiranih od strane Ministarstva prosvete i nauke Republike Srbije. 
Profesorka Mirjana Popsavin je predložila temu, rukovodila radom, snimala i tumačila NMRspektre, često i sama uzimala učešća u eksperimentalnom radu, pomažući mi u komplikovanijim laboratorijskim operacijama, ili pak postavljajući i obrađujući neke moje reakcije, čuvajući me tako od praznog hoda u stalnom nedostatku vremena. Zbog svega napred rečenog kao i zbog ogromne pomoći pružene u toku pisanja rada neizmerno sam joj zahvalna. 

Biološki i biohemijski deo ove doktorske disertacije je urađen u Institutu za onkologiju

Vojvodine, Sremska Kamenica a najveće zasluge za realizaciju ovog dela disertacije ima dr Gordana Bogdanović. 

Ovom prilikom se iskreno zahvaljujem:

dr Gordani Bogdanović (Institut za onkologiju Vojvodine, Sremska Kamenica) čijom predusretljivošću i trudom su urađeni testovi biološke aktivnosti sintetizovanih jedinjenja, kao i na podršci i savetima tokom izrade i pisanja ovog rada, -prof. dr Velimiru Popsavinu (Departman za hemiju, biohemiju i zaštitu životne sredine, PMF, Novi Sad), na nesebičnoj stručnoj pomoći, -dr Svetlani Trivić, red. prof. i dr Kseniji Kuhajdi, red. prof. Prirodno-matematičkog fakulteta, Univerziteta u Novom Sadu na interesovanju za ovaj rad. 
-Dimitru Jakimov, specijalisti medicinske genetike (Institut za onkologiju Vojvodine, Sremska Kamenica) koji mi je uvek spremno i rado pomagao pri eksperimentalnom radu, tako i prilikom tekstualne, grafičke i idejne obrade podataka na računaru, -Lidiji Aleksić, specijalisti medicinske genetike (Institut za onkologiju Vojvodine, Sremska Kamenica) koja mi je pomogla u izvođenju bioloških testova na citometru, -dr Tatjani Srdić Rajić (Institut za onkologiju i radiologju Srbije, Beograd), koja mi je svojim nesebičnim savetima i sugestijama pomogla u tumačenju i kvantifikaciji razultata dobijenih Western blot testom, -mr Milki Jadranin za snimanje masenih spektara visoke rezolucije (IHTM-Centar za hemiju, Beograd), -mr Snežani Trifunović za urađene elementarne mikroanalize (Laboratorija za mikroanalizu, IHTM-Centar za hemiju, Beograd, pod rukovodstvom prof. dr Vlatke Vajs), -dr Branislavu Joviću za snimanje IR-spektara (Departman za hemiju, biohemiju i zaštitu životne sredine, PMF, Novi Sad), -mr Milošu Svirčevu, dipl. hem. Bojani Srećo, ms Jovani Francuz, ms Ivani Kovačević i dr Goranu Benedekoviću, na korisnim savetima i sugestijama, koji su pomogli da se ostvari sinteza novih nukleozida, -gospođi Ružici Marušić (Departman za hemiju, biohemiju i zaštitu životne sredine, PMF, Novi Sad) za pripremu reagenasa i dugogodišnju prijatnu saradnju, -Sabine Alispahić, profesoru književnosti i srpskog jezika, (Institut za onkologiju Vojvodine, Sremska Kamenica) na doprinosu da ovaj rad bude u duhu srpskog jezika, -za svesrdno zalaganje i saradnju laborantu, Ljiljani Savić, -mojim roditeljima i prijateljima za ljubav i razumevanje kao i pomoć koju su mi pružili tokom rada. 
Novi Sad, 2012. godine Mr Vesna Kojić 

UVOD

U drugoj polovini 20 veka farmaceutska industrija je povećala interesovanje za nukleozidnim i nukleotidnim analozima. Obe komponente nukleozida, šećerna ili bazna mogu podleći modifikacijama. 
Sinteza izosternih analoga nukleozida sa hemijski izmenjenim bazama i/ili strukturno modifikovanim šećernim komponentama predstavlja veoma aktuelnu problematiku zbog činjenice da pojedini predstavnici pokazuju interesantnu biološku aktivnost. 
Promene u šećernoj komponenti nukleozida uključuju promene šećernog substituenta ili zamenu kiseonika iz šećernog prstena sa drugim heteroatomom. Aciklični nukleozidi, sa druge strane, se razlikuju od konvencionalnih nukleozida pošto kod njih je šećerni prsten zamenjen sa acikličnim fragmentom. Aciklični nukleozidni analozi imaju veći stepen konformacione pokretljivosti i stoga mogu zauzeti optimalnu geometriju za čvršće vezivanje za aktivno mesto enzima. 
Nukleozidi su klasifikovani u dve velike grupe-N-nukleozidi i C-nukleozidi. 
C-nukleozidi su posebna klasa nukleozida koji, umesto C-N, sadrže C-C vezu između šećernog i heterocikličnog segmenta. Kao posledica toga, C-nukleozidi su stabilni prema dejstvu intracelularnih hidrolitičkih enzima, što predstavlja dodatnu atraktivnu osobinu ovih analoga. 
Postoje četiri pristupa u sintezi C-nukleozida: a) metoda formiranja C-glikozidne veze jonskim ili slobodno-radikalskim mehanizmom ili katalitičkim procesima u prisustvu teških metala, b) višefazna izgradnja heterocikličnog prstena na pogodno funkcionalizovanoj Cglikozidnoj podjedinici, c) hemijska transformacija lako pristupačnog C-nukleozida u manje pristupačni analog d) totalna sinteza iz neugljenohidratnog polaznog materijala. 
Pojedini prirodni, kao i neki sintetički C-nukleozidi, sve više nalaze primenu u hemioterapijikao antitumorski, antivirusni i antibakterijski agensi, a takođe i kao imunomodulatori i regulatori ekspresije gena. 1,2 Tiazofurin (2--D-ribofuranoziltiazol-4-karbiksamid) je sintetički C-nukleozid sa značajnom onkolitičkom aktivnošću, 3 koji je registrovan kao orphan drug za terapiju hronične mijeloidne leukemije (CML) u blastnoj krizi. 
Danas se zna da je biološka aktivnost tiazofurina posledica njegove intracelularne konverzije u aktivni metabolit tiazol-4-karboksamid adenin dinukleotid (TAD) koji inhibira aktivnost inozin 5'-monofosfat dehidrogenaze (IMPDH), ključnog enzima u de novo sintezi guaninskih nukleotida. 4 S obzirom na to da je aktivnost IMPDH povećana kod mnogih tipova malignih tumora, ovaj enzim je značajan cilj u hemioterapiji kancera. Inhibicija aktivnosti IMPDH dovodi do redukcije sinteze 5,6 guanilata, a otuda i do inhibicije sinteze RNK i DNK i proliferacije malignih ćelija. Takođe dolazi i do indukcije diferencijacije, smanjenja onkogene aktivnosti i indukcije apoptoze kod nekih 7,8,9,10 ćelijskih linija i tkiva. 
Znajući da inhibicija 11 aktivnosti IMPDH izaziva, pored antitumorske, antivirusnu, imunosupresivnu, antibakterijsku i antiparazitsku aktivnost, potpuno je razumljivo interesovanje koje tiazofurin pobuđuje već više od dvadeset godina. 
Dobijanje novih tipova C-nukleozida i identifikacija strukturnih karakteristika neophodnih za njihovu biološku aktivnost, mogu biti od značaja za dizajn novih hemioterapeutika, povećane aktivnosti, selektivnosti i stabilnosti. 
[11][12][13][14][15][16] Sintezom specifičnijih i efikasnijih inhibitora IMPDH od tiazofurina mogao bi se učiniti napredak u terapiji malignih bolesti, ali i drugih patoloških stanja u kojima se registruje povišena aktivnost enzima IMPDH. 
Iz tih razloga, istraživanja u okviru ove doktorske disertacije usmerena su na sintezu (E),(S)-2-(3,4-dihidroksi-but-1-enil)tiazol-4-karboksamida i (S)-2-(3,4-dihidroksi-butil)tiazol-4karboksamida, novih acikličnih tiazolnih C-nukleozida sa dvostrukom vezom i 2′,3′-dideoksi funkcijom u acikličnoj šećernoj komponenti. Testiranje novosintetizovanih jedinjenja, kako na njihovu in vitro citotoksičnost prema nekoliko ćelijskih linija humanih leukemija i čvrstih tumora, tako i proveru ćelijskih mehanizama koji su u osnovi uočenih citotoksičnih efekata sintetizovanih analoga u odnosu na tiazofurin kao referentno jedinjenje, takođe predstavlja jedan od važnih zadataka ove doktorske disertacije. Višefazna sinteza pomenutih acikličnih analoga tiazofurina zasnovana je na D-arabinozi kao hiralnom prekursoru. 

OPŠTI DEO


Sinteza i in vitro biološka ispitivanja potencijalnih agonista i derivata tiazofurina

Jedan od važnih zadataka savremene medicinske hemije predstavlja razvoj novih hemioterapeutika, analoga prirodnih i sintetičkih biološki aktivnih molekula sa agonističkim dejstvom. Rukovodeći se ovom strategijom, sintetisan 16,17 je tiazofurin, prvi sintetički Cnukleozid sa značajnom antitumorskom aktivnošću. Istovremeno, strukturne modifikacije tiazofurina, koje bi dovele do potentnijeg, a manje toksičnog terapeutika postaju predmet istraživanja. 
U tom smislu razvijeni su i unapređeni različiti sintetski postupci čiji je pregled dat u poglavljima koja slede. Takođe, ukratko su diskutovani podaci o biološkoj aktivnosti dobijenih jedinjenja. 

Tiazofurin i izosterni analog, selenazofurin -struktura i biološka aktivnost

Tiazofurin (2.1; Shema 2.1.) je tiazolni C-nukleozid koji pokazuje snažnu citotoksičnu aktivnost prema izvesnom broju malignih ćelija. 18 Tiazofurin je u fazi II/III kliničkih ispitivanja, ali je nedavno odobrena njegova upotreba kao "orphan drug" za tretman hronične mijeloidne leukemije. Biološka aktivnost tiazofurina je rezultat njegove sposobnosti da smanji intracelularni depo guaninskih nukleotida inhibicijom inozin monofosfat dehidrogenaze. 15 Aktivni metabolit tiazofurina je tiazol-4-karboksamid-adenine-dinukleotid (TAD, 2.2; Shema 2.1.), analog nikotinamid adenin dinukleotida (NAD + ) -kofaktora IMPDH, koji se usled strukturne sličnosti vezuje za kofaktor-vezujuće mesto na enzimu. 19 Tiazofurin je pokazao uspeh u tretmanu CML-BC (mijeloblastna kriza hronične mijeloidne leukemije). Takođe je aktivan protiv multiplog mijeloma i karcinoma jajnika, što mogu biti korisne indikacije za njegovu kliničku upotrebu u budućnosti. U toku kliničkih ispitivanja uočeni su i mnogi sporedni efekti, uključujući mučninu, povraćanje, povišenje serumskih transaminaza, glavobolju, neutropeniju (smanjenje broja neutrofilnih leukocita), kao i toksičnost prema centralnom nervnom sistemu. Međutim, komplikacije bi mogle biti prevaziđene upotrebom odgovarajućih doza zajedno sa dodatnom terapijom. Uočeno je sinergističko delovanje tiazofurina sa drugim antitumorskim agensima, kao što su taksol (Bristol-Myers Squibb CO), retinska kiselina, gemcitabin (Eli Lilly & Co), metotreksat, genistein i trimidoks (Molecules for Health). Za očekivati je da ovaj sinergizam ima implikacije na klinički tretman humanih solidnih tumora, s posebnim značajem za karcinome dojke, jajnika, pankreasa, pluća i jetre. 18 17 su prvi sintetizovali izosterni analog tiazofurina, selenazofurin (2.23, Shema 2.10.), i njegov 5-fosfat koji su prilikom ispitivanja na životinjama pokazali antitumorsku aktivnost, kao i širok spektar in vitro antivirusnu aktivnost. 21 Tiazofurin (2.1; Shema 2.1.) se u osetljivim ćelijama metabolitički transformiše do analoga NAD + , nakon čega ispoljava citotoksično delovanje. Biohemijska istraživanja su pokazala da ovo jedinjenje u ćeliji fosforiluje neke od ćelijskih kinaza, nakon čega se nastali 5'-fosfat u reakciji katalizovanoj NADpirofosforilazom vezuje sa AMP, gradeći tiazofurin adenin dinukleotid (TAD, tiazol-4karboksamid adenin dinukleotid, 2.2, Shema 2.1. i Shema 2.10.). TAD se vezuje na mesto koje kod aktivnog enzima zauzima NAD + , ali zbog svoje strukture ne može da izvrši funkciju koenzima. Selenazofurin 2-(-D-ribofuranozil)selenazol-4-karboksamid, 2.23, Shema 2.10., kao i tiazofurin, svoju biološku aktivnost ispoljava nakon intracelularne konverzije u odgovarajući dinukleotid (SAD, 2.4, Shema 2.2.). Biohemijska istraživanja 21,23 su pokazala da se biološka aktivnost selenazofurina bazira na istom mehanizmu kao kod tiazofurina, s tim da je selenazofurin od 5 do 10 puta efikasniji inhibitor proliferacije ćelija leukemije P388 i L1210 od samog tiazofurina. 

O


Srivastava i Robins


Programirana ćelijska smrt

Otkriće programirane ćelijske smrti je jedan od ključnih događaja koji su doprineli boljem razumevanju biologije ćelije i značajno je uticao na istraživanja u oblasti biomedicinskih nauka, posebno u domenu eksperimentalne onkologije. Apoptoza je oblik ćelijske smrti i bitno se razlikuje od duže poznate nekroze. Ćelija aktivno učestvuje u autodestrukciji, njeno samouništenje je programirano. 5][26][27][28] Apoptoza predstavlja aktivan i visokouređen proces u kojem ćelija prolazi kroz niz morfoloških promena. Tipični događaji u procesu apoptoze su "penušanje" ćelijske membrane, premeštanje molekula fosfatidil-serina sa unutrašnje na spoljašnju stranu ćelijske membrane, unakrsno povezivanje proteina i smanjenje zapremine ćelija, kondenzacija hromatina, cepanje jedarne DNK prvo u veće segmente, a zatim u nukleozomalne fragmente, i na kraju formiranje velikih citoplazmatičnih vezikula (apoptotskih tela), [29][30][31] koja se otkidaju od ćelijske površine (Slika 2.1.). Nastala apoptotska tela uklanjaju fagociti pri čemu nema pojave inflamatorne reakcije u okolnom tkivu. Poremećaj regulacije ovog složenog procesa vodi ka pojavi različitih oboljenja kao što su maligne, autoimune i degenerativne bolesti. Povećano interesovanje za proučavanje ćelijske smrti pojavilo se, pre svega, zahvaljujući radovima u kojima je pokazano da u određenim situacijama smrt ćelije predstavlja fiziološki proces i da ćelija u njemu aktivno učestvuje. Činjenica da neke ćelije umiru prostorno i vremenski precizno određeno dovela je do uvođenja termina programirana smrt ćelija, a s obzirom na posebne morfološke karakteristike Ker, Vili i Kari su ovakvu smrt ćelija nazvali apoptoza. 4][35][36] Međutim, poslednjih godina sve više se uviđa da pored ova dva suštinski različita tipa ćelijske smrti postoje i drugi načini umiranja ćelija i danas je prihvaćeno da postoje tri osnovna tipa ćelijske smrti: [37][38][39][40] apotoza, autofagna smrt ćelije i nekroza. Dok prva dva tipa predstavljaju regulisan i aktivan način umiranja ćelija, dotle je nekroza najčešće neuređen i pasivan tip ćelijske smrti koji nastaje usled kolapsa ćelijskih homeostatskih mehanizama. Pored toga, postojeća klasifikacija ćelijske smrti, ne može uvek lako da se primeni, jer u mnogim slučajevima postoje preklapanja između tipova ćelijske smrti. Načelno jasne razlike između navedenih tipova ćelijske smrti nisu uvek dovoljno primetne, pa se često zapažaju mešoviti oblici, kao i preklapanje više različitih tipova ćelijske smrti. Pored toga postoje morfološki oblici koji se ne mogu podvesti ni pod jedan od ovih tipova, a koji imaju specifična imena kao što su anoikaza, entoza, partanatos, piroptoza, netoza i kornifikcija. 41,43 Zbog toga je važno dobro poznavati metode za identifikaciju smrti ćelije. 42,43 Dok se za nekrozu i autofagnu smrt ćelija pre svega koriste morfološke, za identifikaciju apoptoze -pored morfološkihkoristi se čitav niz različitih biohemijskih i molekulskih metoda. 
Biohemijske metode imaju značajne prednosti nad morfološkim jer se mogu kvantifikovati. 
Međutim, i ove metode imaju nedostatke, pa se dobijeni rezultati moraju tumačiti pažljivo, pogotovo kada se ispituju pojedinačno. Naime, pojedinačni tip biohemijskog odgovora ne mora uvek biti nesumnjiv pokazatelj određenog modaliteta ćeljske smrti (npr. [46][47] 

Regulacija apoptoze

Veliki broj stimulusa i stanja u organizmu, bilo fizioloških ili patoloških, mogu dovesti do apoptotske ćelijske smrti. Apoptozu može uzrokovati i nedostatak međućelijskih signala. Većini ćelija potrebna je stalna stimulacija ili kontakt s površinom na kojoj rastu, a naročito je važna uloga citokina, faktora rasta i pojedinih hormona. 48 Oštećenja DNK pokreću apoptozu, stoga se faktori koji ova oštećenja prouzrokuju, kao što je jonizujuće zračenje, hemioterapeutici ili lekovi poput analoga nukleozida, ubrajaju u "pokretače apoptoze". 49 Reaktivne kiseonične vrste, koje nastaju kao proizvodi aerobnog metabolizma u humanim ćelijama, mogu aktivirati apoptozu delujući na propustljivost mitohondrijske membrane i na otpuštanje citohroma c (Cyt C). 50,51 Posebno mesto zauzimaju ligandi koji se vezuju za ćelijske površinske receptore ("receptori smrti"). Najpoznatiji ligandi su: Fas ligand (FasL ili CD95 ligand), faktor tumorske nekroze α (TNFα), limfotoksin (TNFβ) i TRAIL (engl. TNF-related apoptosis inducing ligand). 41,52 Proces apoptoze se može pokrenut i raznim signalima od kojih jedni deluju intracelularno, a drugi ekstracelularno, kao što je aktivacija receptora smrti. Oba puta se sprovode aktiviranjem enzima cistein aspartat proteaza, koji su poznati pod nazivom kaspaze. Kaspaze su proteolitički enzimi (citoplazmatične cistein-aspartat specifične endoproteaze) koji podstiču apoptozu. 53,54 U ćelijskoj citoplazmi nalaze se u obliku proenzima, a mogu se aktivirati autokatalitički ili drugom kaspazom. Svoju potpunu proteolitičku aktivnost postižu kao tetrameri koji nastaju nakon dvostrukog cepanja. Stepenasta razgradnja u kojoj jedna kaspaza može aktivirati druge kaspaze, ali i samu sebe, pojačava apoptotski signalni put i dovodi do vrlo brze smrti ćelije. 55 Inhibitori kaspaza zaustavljaju apoptozu. 53,56 Centralnu ulogu u ovom procesu ima kaspaza 3. Tokom apoptoze kaspaza 3 je odgovorna, ili delom ili u potpunosti, za postepenu razgradnju velikog broja ćelijskih proteina, fragmentaciju DNK i kondenzaciju hromatina. 57 Aktivacijom kaspaze dolazi do izvršenja apoptotskog programa. Postoje dva osnovna puta aktivacije kaspaza, spoljašnji i unutrašnji. 

Spoljašnji put apoptoze

Spoljašnji put (Slika 2.2.) uključuje tzv. 9][60] Citoplazmatični delovi ovih receptora nazivaju se domeni smrti DD (engl. Death Domain, DD). Vezivanjem Fas Liganda (FasL) za Fas-receptor dolazi do receptorske trimerizacije, što rezultira unutarćelijskim nakupljanjem DD delova Fas receptora uz pomoć kompleksa proteina poznatih kao DISC (engl. Death-Inducing-Signalling-Complex). Preko adaptorskih molekula FADD (engl. Fas-Associated-Death-Domain-Protein) koji imaju dva domena, signal aktivira prokaspazu 8. 41,61 Domen DD molekula FADD veže se za DD domen Fas receptora, a domen DED (Death-Effector-Domain) molekula FADD za prokaspazu 8 (ili -10). [64][65][66] Takođe, vezivanjem TNF-liganda za TNFR1 receptor pokreće se sličan put, osim što su u ovom slučaju adapterski molekuli TRADD (TNFR-Associated Death Domain), koji imaju sposobnost vezivanja različitih proteina na aktiviranom delu receptora. 33,67 poptozu pokrenutu aktivacijom Fas i TNFR1 receptora inhibira familija proteina FLIP (engl. 
FasL Inhibitor Protein), v-FLIP i c-FLIP, koji se kao homolozi kaspaze 8 vežu za Fas-FADD kompleks, čime inhibiraju aktivaciju prokaspaze 8. [68][69][70][71][72][73][74][75][76][77] Vezivanje liganda za odgovarajuće receptore dovodi do aktivacije "uzvodnih" kaspaza, kao što su kaspaza 8 ili 10, koje proteolizom dovode do aktivacije "efektorskih" kaspaza, kaspaze 3, 6 i 7. 33,78 Jednom aktivirane efektorske kaspaze razgrađuju čitav niz proteina neophodnih za život ćelije i dovode do većine morfoloških promena koje nastaju tokom apoptotskog procesa. 
Efektorske kaspaze razlažu i lamine (proteine koji održvaju integritet nukleusne ovojnice) dovodeći do razgradnje nukleusne ovojnice, zatim PARP (polimeraze poli-ADP riboze), enzima ključnog za reparaciju DNK, kao i proteine citoskeleta. Na taj način, efektorske kaspaze dovode do karakteristčnih morfoloških promena ćelijske smrti. 

Unutrašnji put apoptoze

Drugi, unutrašnji put (Slika 2.3.), uključuje signale koji potiču iz unutrašnjosti ćelije, a koji nastaju usled različitih oštećenja, odnosno stresa u pojedinim organelama, kao što su jedro, endoplazmin retikulum ili Goldžijev aparat. Centralno mesto u ovom putu imaju mitohondrije kod kojih dolazi do tranzitorne promene potencijala membrane, odnosno povećane propustljivosti za male molekule. Jedan od molekula koji napušta mitohondrije je i citohrom c (Cyt C), koji se vezuje za jedan citoplazmatski protein APAF-1 (engl. apoptosis protease activating factor-1) dovodeći do njegove konformacione promene, te omogućavajući aktivaciju kaspaze 9. 33 Ovo ima za posledicu dalje aktiviranje efektorske kaspaze 3, što konačno vodi ćeliju u smrt. 
Pored kaspaza, važnu ulogu u moduliranju apoptotskog procesa imaju proteini iz porodice Bcl-2. 
Ako je uzrok smrti ćelije oštećenje DNK, ključna je uloga proteina p53 koji je u ćelijama prisutan u inaktivnom obliku. Oštećenja DNK podstiču nakupljanje proteina p53 u ćeliji, zbog čega dolazi do zaustavljanja ćelijskog ciklusa u G1 fazi i popravljanja oštećene DNK, ili do pokretanja apoptoze, ako su ta oštećenja nepopravljiva. 79,80 Protein p53 može pokrenuti apoptozu tako da poremeti odnos proapoptotskih i antiapoptotskih mitohondrijskih proteina Bcl-2 porodice ili da indukuje gene koji povećavaju produkciju reaktivnih kiseoničnih vrsta, koji su snažni aktivatori apoptoze. Proteini Bcl-2 porodice dele se na proapoptotske (Bad, Bax, Bak i dr.) i antiapoptotske proteine (Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-w) 81 Proapoptotski proteini prisutni su u citosolu kao senzori ćelijskog oštećenja ili stresa, dok se antiapoptotski proteini nalaze u intermembranskom prostoru mitohondrija. Odnos proapoptotskih i antiapoptotskih faktora određuje osetljivost ćelija na apoptozu. 82 Važno je naglasiti da taj odnos bitno određuje odgovor tumorskih ćelija na zračenje i hemoterapiju. 83 Članovi Bcl-2 familije regulišu broj i tip jonskih kanala u unutrašnjoj membrani mitohondrija, pri čemu Bad i Bax dovode do stvaranja većih jonskih kanala kroz koje izlaze Citohrom C (Cyt C) i drugi proapoptotski molekuli. Otpušteni Cyt C veže se uz medijatorski molekul Apaf-1 koji aktivira kaspazu 9. 84,85 Cyt C, Apaf-1, kaspaza 9 i ATP zajedno učestvuju u indukciji apoptoze. 86 Osim Cyt C, mitohondrije sadrže i druge apoptotske faktore kao što su AIF (engl. Apoptosis-Inducing Factor) i endonukleaza G. AIF iz mitohondrija prelazi u jedro ćelije, nezavisno od kaspaza dovodi do fragmentacije DNK na fragmente veličine od 50-300 kb i time dovodi do kondenzacije hromatina uz jedarnu membranu. 87 Endonukleaza G izlazi iz mitohondrija tokom apoptoze i delimično je odgovorna za internukleozomalno cepanje DNK, koje je takođe nezavisno od kaspaza. 88,89 U ranoj fazi apoptoze spoljašnja membrana mitohondrija postaje propustljiva za proteine, što dovodi do otpuštanja rastvorljivih intermembranskih mitohondrijskih proteina, dok na unutrašnjoj membrani dolazi do slabljenja transmembranskog potencijala što može poslužiti kao pokazatelj ranih apoptotskih promena u in vivo uslovima. 90 Takođe ulogu u modulaciji apoptotskog procesa imaju i inhibitorni proteini apoptoze (IAP), koji sprečavaju apoptozu direktnim blokiranjem kaspaza. 91,92 

Apoptoza u tumorima

Danas se smatra da su poremećaji u apoptotskim putevima značajni u patogenezi mnogih bolesti, od neurodegenerativnih poremećaja do malignih tumora. 93 Jedna od najvažnijih karakteristika malignih ćelija jeste preživljavanje ćelije s oštećenjem DNK i nakupljanje novonastalih genskih mutacija. Zdrave ćelije imaju sposobnost prepoznavanja i brzog popravljanja oštećenih mesta na DNK, a aktivacijom apoptoze sprečavaju deobu ćelije i umnožavanje mutiranih ćerki ćelija. 
Nakupljanje tumorskih ćelija može biti posledica aktivacije onkogena, inaktivacije tumorsupresor gena, mutacije gena koji regulišu apoptozu ili poremećaja u procesu popravljanja DNK. 94 Važna uloga apoptoze u kancerogenezi prvi put je uočena zahvaljujući istraživanjima Bcl-2 (engl. B cell lymphoma) gena, čija mutacija je otkrivena u ćelijama folikularnog limfoma. 
U normalnim ćelijama protein Bcl-2 inhibira apoptozu, a njegovo nakupljanje u citoplazmi tumorskih ćelija sprečava odumiranje malignog klona. 94 Gen p53 prvi je tumor-supresorski gen koji se dovodi u vezu sa apoptozom. 94,95 Mutacija gena p53 prisutna je i u korelaciji sa uznapredovalim stadijumom tumora i lošijom prognozom pacijenata. Gubitak funkcije gena p53 povećava hromozomsku nestabilnost i dovodi do nakupljanja različitih oštećenja u ćeliji, što može dovesti do prelaska u transformisani fenotip. 94,96 Protein p53 podstiče ekspresiju proapoptotskih gena kao što je gen za Bax i time aktivira apoptozu u cilju odstranjivanja tumorskih ćelija. Zračenje i hemioterapija uzrokuju oštećenje DNK što aktivira apoptozu preko proteina p53 u ćelijama tumora, pa su tumori s mutacijom gena p53 rezistentniji na hemioterapiju i zračenje. 55 poslednjih 10 godina otkriveno je da neki hemioterapeutici kao što je doksorubicin, podstiču apoptozu, a da su poremećaji u signalnim putevima apoptoze u tumorskim ćelijama povezani s rezistencijom na lekove. 98 Apoptoza je prisutna u spontanoj regresiji tumora i u tumorima pacijenata koji su lečeni hemoterapijom. 99 kođe, sve više se istražuje put apoptoze nezavisan od kaspaza. 100 Naime, ugrožena ćelija može aktivirati različite puteve apoptotske smrti kako bi osigurala samouništenje. Kaspaza-nezavisna smrt ćelije odvija se znatno sporije od kaspaza-zavisne apoptoze. Kaspaza-zavisna apoptoza je najefikasnija i najbrža, ali ukoliko je zbog mutacija, genetskih manipulacija i inhibicija poremećena, ćelija može pokrenuti apoptotsku smrt nezavisnu od kaspaza. 101 ko, eventualna primena lekova koji bi ometali kasne efektorske mehanzme apoptoze, 102 kao na primer primena inhibitora kaspaza, u mnogim slučajevima ne bi bila uspešna, zbog oslobađanja različitih molekula iz mitohondrija koji mogu dovesti do ćelijske smrti nezavisne od kaspaza. S druge strane, mnogo veću perspektivu bi imali lekovi koji bi modulirali mehanizme pre uključivanja u sam proces. 
Pored krupnih koraka učinjenih na otkriću novih bioloških agenasa, do danas nema odgovora vezanih za nove terapijske procedure u lečenju malignih bolesti: kojim mehanizmom se može postići selektivnost u dejstvu novih antitumorskih agenasa? Poremećaji u signalnim putevima apoptoze u tumorskim ćelijama povezani su sa rezistencijom na lekove. 103 5][106] Međutim, uključujući hemoterapeutike i određene proapoptotske proteine kao što su Bax i Bak, mogu aktivirati apoptozu kaspaza zavisnim i nezavisnim putem. 
To znači da se selektivnost odnosi na blokadu aktivnosti antiapoptotskih članova Bcl-2 familije proteina odnosno na aktivaciji procesa apoptoze samo tumorskih, a ne i normalnih/zdravih ćelija jednog tkiva. 97 

3.

NAŠI RADOVI Mogući mehanizam prevođenja tiazolina 7 u tiazol 8 prikazan je na Shemi 3.5. 
U prvoj fazi ove oksidacije uvodi se brom u položaj C-4 pomoću bromtrihlormetana, a zatim sledi eliminacija bromovodonika dejstvom DBU, koji se pri tom transformiše u odgovarajući hidrobromid stabilizovan rezonancom. Dejstvom metanolnog rastvora amonijaka na jedinjenje 8 (sobna temperatura, 6 dana), ostvarena je amonoliza svih estarskih grupa, pri čemu je dobijen slobodni C-nukleozid 9 u prinosu od 86.69% (Shema 3.3.). 
Na strukturu deblokiranog nukleozida 9 ukazuje odsustvo signala karakterističnih za benzoatnu i etil-estarsku funkciju u njegovim 1 H i 

Analozi koji nisu sintetizovani u okviru ovog rada a detaljno su biološki i biohemijski isptivani

Takođe, predmet ove doktorske disertacije podrazumevao je detaljno ispitivanje bioloških i biohemijskih aspekata antitumorskog desjstva petnaest analoga tiazofurina koji su ranije sintetizovani u našoj laboratoriji. 

Analozi tiazofurna arabino konfiguracije


Ispitivanje antiproliferativne aktivnosti

Uspešan ishod procesa razvoja novih, efikasnijih antitumorskih agenasa podrazumeva pronalaženje takvih molekula koji u niskim koncentracijama izazivaju visok stepen inhibicije rasta neoplastičnih ćelija. Sposobnost nekog jedinjenja da inhibira rast kulture ćelija kvantitativno se izražava u procentima, odnosno kao IC 50 vrednost (koncentracija ispitivane supstance pri kojoj se broj tretiranih ćelija smanjuje za 50% u odnosu na netretiranu kontrolu). Srednja vrednost, standardna devijacija i koeficijent varijacije izračunati su za replikate (najmanje triplikat) uzoraka u svakom eksperimentu. Svaki eksperiment je urađen tri puta. 
Koeficijent varijacije (CV) u eksperimentalnim i kontrolnim kulturama bio je manji od 10%. 
Koncentracija pri kojoj se postiže 50% inhibicije rasta, odnosno citotoksičnosti (IC 50 ), određena je "Median effect" analizom pomoću programa CalcuSyn. 

Uticaj tiazofurina i analoga na rast K562 ćelija

Na osnovu rezultata dobijenih tretiranjem K562 ćelijske linije tiazofurinom i njegovim analozima, 9 i 12, u rasponu koncentracija od 0.01 do 100 µM i u toku 24, 48 i 72 h (Slika 3.1.), može se zaključiti da tiazofurin i oba analoga inhibiraju rast K562 ćelija, a stepen inhibicije zavisi od koncentracije ispitivane supstance i vremena tretmana. Tip odgovora za sva ispitivana jedinjenja je isti u svim ispitivanim vremenima. Utvrđeno je da se nakon 24 h inkubacije najsnažniji antiproliferativni efekat imao analog 12, koji pri koncentraciji od 100 µM smanjuje broj ćelija za 66% u odnosu na kontrolu. Nukleozid 9 i tiazofurin, pri istoj koncentraciji, izazivaju gotovo isti antiproliferativni efekat (59 odnosno Ćelijska linija: K562, vreme inkubacije: 72h 

Uticaj tiazofurina i analoga na rast HL-60 ćelija

Citotoksični profil tiazofurina i analoga (9 i 12) prema HL-60 ćelijskoj liniji prikazan je na Slici Iz priloženih dijagrama se vidi da sve tri supstance inhibiraju rast HL-60 ćelija, a stepen inhibicije zavisi od koncentracije ispitivane supstance i vremena inkubacije. Sva ispitivana jedinjenja pokazuju sličnu aktivnost i isti tip odgovora tokom sva tri ispitivana vremenska intervala. Ćelijska linija: HL60, vreme inkubacije: 72h Ćelijska linija: RAJI, vreme inkubacije: 72h 

Uticaj tiazofurina i analoga na rast Raji ćelija


Uticaj tiazofurina i analoga na rast PC-3 ćelija

Tretiranjem PC-3 ćelijske linije tiazofurinom i analozima 9 i 12 u rasponu koncentracija od 0.01 do 100 µM u toku 24, 48 i 72 časa, zaključuje se da tiazofurin i oba analoga pokazuju dozno ali ne i vremenski zavisnu inhibiciju. Utvrđeno je da nakon sva tri ispitivana vremena inkubacije jedinjenja daju isti tip biološkog odgovora (Slika 3.5.). Tiazofurin, kao i oba analoga, pokazali su veoma nisku, gotovo identičanu citotoksičnost, u sva tri ispitivana vremena inkubacije, za ceo raspon koncentracija (12-46% za TI, 21-42% za 9 i 18-44% za 12) (Slika 3.5.). Ćelijska linija: PC3, vreme inkubacije: 72h Sva ispitivana jedinjenja u svim vremenskim periodima pokazuju skoro identičan tip odgovora. 
Oba analoga su ispoljila nisku citotoksičnost (8-43% za 9, 6-33% za 12). Tiazofurin je pokazao skoro isti antiproliferativni efekat u intervalu koncentracija od 0.01 do 1 µM u sva tri vremenska Ćelijska linija: HT29, vreme inkubacije: 72h 

Uticaj tiazofurina i analoga na rast MCF-7 ćelija

Na Slici 3.7. je prikazan uticaj 9, 12 i tiazofurina u toku 24, 48 i 72 časa inkubacije na MCF-7 ćelijsku liniju. Sva tri ispitivana jedinjenja inhibiraju rast MCF-7 ćelija, a stepen inhibicije zavisi od koncentracije i od vremena tretmana. Ćelijska linija: MCF7, vreme inkubacije: 72h Ćelijska linija: MDA MB 231, vreme inkubacije: 72h Ćelijska linija: HeLa, vreme inkubacije: 72h Sve tri ispitivane supstance su pokazale veoma nisku citotoksičnost u sva tri ispitivana vremena inkubacije (4-46%). Ćelijska linija: Hs294T, vreme inkubacije: 72h Nakon inkubacije u toku 24, 48 i 72 h tiazofurin je pokazao nešto jači antiproliferativni efekat pri svim ispitivanim koncentracijama u odnosu na oba novosintetizovana analoga. Ćelijska linija: MRC5, vreme inkubacije: 72h Pri koncentraciji od 0.01 µM tiazofurin inhibira rast ćelija za 41-48%, dok se pri dejstvu analoga, pri istoj koncentraciji, postiže antiproliferativni efekat od 11-19% za 9, odnosno 21-28% za 12. 
Citotoksičnost tiazofurina pri koncentraciji od 100 µM je znatno veća od antiproliferativnog efekta analoga 9 (za 40%), odnosno 12 (za 30%). 

Poređenje antiproliferativne aktivnosti na osnovu IC 50 vrednosti

Vrednosti IC 50 za svih jedanaest ispitivanih ćelijskih linija nakon inkubacije u toku 24, 48 i 72 h prikazane su u Tabeli 3.1. 1.51 >100 >100 >100 >100 >100 >100 8. 75 5.01 2.51 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 6.53 5. 68 3.21 89.55 59.17 29.87 >100 >100 >100 >100 >100 >100 5. 65 2.12 1.03 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 89.7 50.36 42.35 0.28 1.46 0.01 >100 >100 >100 >100 >100 >100 1.25 0.96 0.08 >100 >100 >100 >100 >100 >100 3.64 2.01 0.06 >100 >100 >100 >100 >100 >100 3.99 3.87 0.64 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 0.11 0.09 0.05 >100 >100 >100 >100 >100 >100 10,2 6. 34 5.26 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 16,43 5. 68 4.08 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 

Korelacioni odnosi (SAR)


Ćelijski ciklus

Početni eksperimenti o biološkoj aktivnosti novosintetizovanih jedinjenja na panelu malignih ćelijskih linija pokazali su da većina jedinjenja ispoljava značajnu antitumorsku aktivnost. S obzirom na to da MTT test daje informacije o preživljavanju i proliferativnoj sposobnosti ćelija, sledeći korak u istraživanjima bio je da se ispita da li u osnovi antitumorske aktivnosti ovih jedinjenja leži njihova antiproliferativna i/ili citotoksična aktivnost, odnosno indukcija ćelijske smrti, U cilju ispitivanja molekulskih mehanizama koji leže u osnovi antitumorskog dejstva ispitivanih jedinjenja, odabrali smo K562 (humana hronična mijelogena leukemija) tumorsku ćelijsku liniju kao model sistem. Dokazano je da tiazofurin indukuje apoptozu u K562 ćelijama, in vitro, 116,117 koja se pokazala kao najosetljivija linija prema isptivanim analozima. U svim daljim eksperimentima K562 ćelije su kontinualno tretirane ispitivanim jedinjenjima tokom 24 i 72 h pri koncentraciji koja odgovara IC 50 vrednosti ispitivanog jedinjenja, nakon 24-i 72-časovnog tretmana. 

Uticaj analoga tiazofurina na distribuciju faza ćelijskog ciklusa

U cilju određivanja antiproliferativnog efekta sintetizovanih analoga tiazofurina, ispitivan je njihov uticaj na faze ćelijskog ciklusa K562 ćelija primenom protočne citometrije. 
Aciklični tiazolni nukleozid 9 i 12 kao i tiazofurin su, nakon 24-časovnog kontinualnog tretmana, smanjili procenat ćelija u G2/M fazi za oko 50% u odnosu na kontrolu. Analozi arabino konfiguracije 13 i 14 smanjili su procenat ćelija u G0/G1 i S fazi u odnosu na tiazofurin i kontrolu, dok je procenat ćelija u G2/M fazi veći od tiazofurina za oko 10-13.3% a od kontrole 

Apoptoza

Prilikom analize ćelijskog ciklusa bojenjem propidijum-jodidom na protočnom citometru, uočen je proapoptotski efekat ispitivanih analoga na tretiranoj ćelijskoj liniji, kroz jasno formiranje subG1 pika koji odgovara nakupljenim hipodiploidnim apoptotskim ćelijama. U daljem istraživanju, ispitivan je tip ćelijske smrti koji je indukovan dejstvom analoga na K562 ćelije. 
Ispitivanje ćelijske smrti praćeno je, uz korišćenje dvostrukog bojenja Annexin V-FITC/propidijum-jodida. Gubitak asimetrije plazma membrane predstavlja prvi korak u pocesu apoptotske ćelijske smrti. U apoptotskim ćelijama, membranski fosfolipid, fosfatidil-serin se premešta sa unutrašnje na spoljašnju stranu plazma membrane, čime se omogućava vezivanje Annexina V (kalcijum zavisnog fosfolipid-vezujućeg proteina), koji ima veliki afinitet za fosfatidil-serin. Za Annexin V može biti vezana fluorescentna boja, kao što je fluorescein izotiocijanat (FITC). Korišćenjem dvostrukog bojenja ćelija sa Annexin V-FITC i propidijumjodidom, moguća je detekcija ćelija u ranoj fazi apoptotske ćelijske smrti u odnosu na testove zasnovane na određivanju nuklearnih promena, kao što je DNK fragmentacija. 
Ispitivali smo kinetiku ćelijske smrti u K562 ćelijama tretiranim analozima tiazofurina, kao i referentnim tiazfurinom. Ćelije su kontinualno tretirane ispitivanim jedinjenjima u toku 24 i 72 h, pri koncentracijama koje odgovaraju njihovim IC 50 vrednostima za 24 odnosno 72 h, nakon čega je određivan procenat apoptotskih i nekrotičnih ćelija na protočnom citometru. 

Apoptoza kao dominantan tip ćelijske smrti

Tretman ćelija tiazofurinom u koncentraciji od 8.7 µM tokom 24 h, ne indukuje apoptozu u K562 ćelijama u poređenju sa netretiranim K562 ćelijama. Ovo je u skladu sa rezultatima De Abreu, 118 koji je ustanovio da tiazofurin pri sličnim koncentracijama ne indukuje apoptozu na Molt-4 ćelijskoj linji tokom prva 24 h. Dužim delovanjem tiazofurina na ćelijske linije dolazi do blagog povećanja pozitivnih Annexin-V ćelija. Ovo ukazuje da tiazofurin, nakon 24 h pri IC 50 koncentraciji, deluje uglavnom kao inhibitor inozinmonofosfat-dehidrogenaza (IMPDH). 
Apoptotski odgovor, predstavljen je kao procenat specifične apoptoze (Slika 3.18) pokazuje 64as vi analozi tiazofurina nakon 24 I 72 h višestruko povećavaju procenat Annexin-V pozitivnih K562 ćelija u odnosu na tiazofurin. Analog 22 je bio najaktivniji u oba ispitivana vremena. 
Procenat specifične apoptoze povećava se sa dužinom tretmana pa je nakon 72 h dva ( 123 Ekspresija Bax proteina je povećana nakon 72 h tretmana sa svim ispitivanim supstancama, kao i sa tiazofurinom, u odnosu na vreme tretmana od 24 h. Ovi rezultati su u u skladu sa povećanjem specifične apoptoze nakon 72 h. 

Uticaj analoga na ekspresiju kaspaze 3

Kaspaze, familija aspartat-specifičnih cisteinskih proteaza, igraju ključnu ulogu u programiranoj apoptotskoj ćelijskoj smrti. 5][126] U nastavku istraživanja ispitivali smo da li tretman K562 ćelija aktivira kaspazu 3, koja je ključna egzekutivna kaspaza u apoptotskoj kaskadi. Međutim, morfologija apoptoze može biti ostvarena ne samo delovanjem kaspaza već i proteazama iz drugih familija. 
Ćelijska smrt izazvana antitumorskim agensom je obično povezana sa povećanjem apoptoze preko kaspaza-zavisnog puta, iako kaspaza-nezavisni put može takođe biti uključen. 104,127 ugim rečima, apoptoza se može izazvati bez aktivacije kaspaza, odnosno aktivacija kaspaza ne mora nužno da izazove ćelijsku smrt. 130 vo ekspresije prekursora i aktivne podjedinice kaspaze 3 u ćelijama izloženim dejstvu tiazofurina i njegovih analoga (aciklični tiazolni nukleozidi, analozi arabino, ksilo i ribo konfiguracije) 9, 12-27, određivali smo u cilju provere da li ova jedinjenja indukuju apoptozu aktiviranjem kaspaze 3. Western blot analiza je pokazala da dolazi do ekspresije proteinskog prekursora kaspaze 3 u K562 ćelijama tretiranim sa svim ispitivanim analozima (9, 12-27), međutim, nivo ekspresije aktivne podjedinice kaspaze 3 je bio drugačiji i zavisi kako od prirode analoga, tako i od isptivanog vremena. Aktivacija kaspaze 3 dovodi do cepanja različitih "nizvodnih" proteina, uključujći poli-(ADPriboza) polimerazu (PARP). 128,129 Enzim PARP uključen je u mehanizam kojim se popravlja oštećena DNK tokom ćelijskog ciklusa isecanjem baza (engl. base excision repair) i stoga je jedan od biohemijskih obeležja apoptoze. 130 Western blot analizom smo pokazali proteolitičko cepanje PARP-a u K562 ćelijama nakon tretmana sa svim ispitivanim analozima 9, 12-27, koje zavisi kako od strukture analoga tako i od vremena delovanja. U poređenju sa drugim analozima, 

Diskusija rezultata bioloških ispitivanja

Potreba za razvojem novih, efikasnijih i manje toksičnih antitumorskih lekova podstakla je istraživanja u pravcu novih farmakološki aktivnih supstanci. Ova potreba je naročito važna za većinu rasprostranjenih karcinoma, kao što su karcinom grlića materice, dojke, pluća i debelog creva. Trenutno, hemoterapija i hormonski preparati nisu potpuno efikasni upavo zbog nespecifičnih mehanizama delovanja. 132 Pored toga, rezistencija mnogih tumora na već postojeće terapije predstavlja i dalje jedan od glavnih problema u terapiji malignih bolesti. Stoga bi strategija u razvoju novih lekova bazirana na prevazilaženju tumorske rezistencije mogla doprineti preživljavanju pacijenata obolelih od karcinoma. 133  Naša dalja istraživanja išla su u pravcu ispitivanja signalnih puteva koje novosintetizovani analozi tiazofurina koriste u ispoljavanju svog antitumorskog dejstva. Pokazano je da je u K562 ćelijama apoptoza praćena aktivacijom "nizvodnog" molekula apoptotskog puta, kaspaze-3. Ova proteaza ima značajnu ulogu u apoptozi [137][138][139][140] kao i ključnu ulogu u morfo-funkcionalnim promenama jedra tokom apoptoze. 140 U našem modelu molekulskog mehnizma delovanja novosintetizovanih analoga tiazofurina dolazi do aktivacije kaspaze-3. Aktivaciji kaspaze-3 prethodi aktivacija proteina p53 -tumor supresorske familije proteina, koji imaju centralnu ulogu u ćelijskom odgovoru na oštećenja DNK. 141 Ovi proteini se nakupljaju u jedru nakon oštećenja DNK i kontrolišu dalju proliferaciju ćelije. 142,143 6][147][148] Dalje je ispitivana količina molekula Bax u tretiranim ćelijama, koji je proapoptotski faktor iz familije Bcl-2 proteina, i predstavlja ciljni gen za protein p53. 149,150 U ćelijama koje su u homeostazi Bax protein postoji kao neaktivni monomer u citosolu ćelija. 2][153] S druge strane, pretpostavka je da aktiviranje MEKK-MKK-JNK (engl. Mitogen-activated protein kinase kinase-Jun N-terminal kinases) proteinskog puta c-Abl proteinskom-kinazom, predstavlja okidač za oslobađanje molekula Cyt C iz mitohondrija, što vodi povećanoj ekspresiji upravo Bax proteina. 54,155 7][158][159][160] Na osnovu naših rezultata, ne može se zaključiti da li translokacija Bax proteina direktno ili indirektno indukuje apoptozu preko mitohondrijalnog puta. 
Apoptoza i nekroza predstavljaju dva tipa ćelijske smrti sa različitim morfološkim i biohemijskim karakteristikama. Mada su nekada smatrane dvoma potpuno različitim vidovima suštinski istog događaja, danas se apoptoza i nekroza posmatraju sa istog stanovišta, tj. kao ekstremi u kontinuitetu jednog događaja. 161,162 0][171][172] Doskora se u poređenju sa nekrozom, apoptoza smatrala superiornim mehanizmom odstranjivanja tumorske mase. Međutim, s obzirom na to da se apoptoza dešava bez narušavanja plazma membrane same ćelije, ona sprečava početak inflamatornog odgovora, što je osnovna razlika u odnosu na put nekroze. Novija istraživanja ukazuju da je izloženost nekrotičnih, mrtvih ćelija makrofagima izazivala pojačanu stimulaciju makrofagne antitumorske aktivnosti, što vodi bržem odstranjivanju tumorskih ćelija iz organizma. 173,174 Spekuliše se da bi ovakav antitumorski efekat nastao usled nespecifične aktivacije imunog sistema makrofagama i nekrotičnim ćelijama, mogao voditi dugotrajnijem i efikasnijem antitumorskom efektu. 169,173,175 ši rezultati ukazuju, po prvi put, da antitumorska aktivnost ispitivanih novosintetizovanih jedinjenja na testiranoj ćelijskoj liniji K562 obuhvata promene u fazama ćelijskog ciklusa, kao i indukciju apoptoze putem različitih mehanizma (kaspaza-zavisni i kapaza-nezavisni put). Medijumi za gajenje kultura sadrže antibiotike: penicilin 100 IJ/mL i streptomicin 100 g/mL (ICN Galenika). Sve ćelijske linije održavaju se u sudovima za kulturu (Costar, 25 cm 2 ) na 37 °C, u atmosferi sa 100% vlage i 5% CO 2 (Heraeus). 

EKSPERIMENTALNI DEO

U eksperimentima su korišćene ćelije u logaritamskoj fazi rasta između trećeg i desetog presađivanja. 
Ćelije koje rastu u jednom sloju (PC-3, HT-29, MCF-7, MDA-MB-231, HeLa, Hs 294T i MRC-5), neophodno je da se presađuju po postizanju konfluencije od 80% do 90%. Dobijanje jednoćelijske suspenzije je vršeno dodavanjem 0,5% rastvora tripsina, nakon čega su ćelije inkubirane 5 minuta na 37 °C. Enzimska reakcija je zaustavljena dodavanjem odgovarajućeg medijuma, pri čemu komponente seruma vrše inaktivaciju tripsina. Ćelijska suspenzija je zatim centrifugirana 10 minuta na 1 500 o/min, a ćelijski talog resuspendovan u svežem medijumu. 
Nakon toga su određivani broj ćelija i njihova vijabilnost. 
Ćelije koje rastu u suspenziji (K562, HL-60, Jurkat i Raji), presađuju se po postizanju konfluencije od 80% do 90%. Ćelijska suspenzija je centrifugirana 10 minuta na 1 500 o/min, a ćelijski talog resuspendovan u svežem medijumu. Nakon toga su određivani broj ćelija i njihova vijabilnost DET testom. 

Određivanje broja ćelija i vijabilnosti

U eksperimentima su korišćene samo žive (vijabilne) ćelije. Broj ćelija i njihova vijabilnost određeni su testom odbacivanja boje sa 0,1% tripan plavim 85 . Tripan plavo je boja koja ulazi u ćeliju ukoliko joj je narušen integritet ćelijske membrane. Pri tome se mrtve ćelije boje u plavo, pa ih je na ovaj način moguće razlikovati od živih ćelija. 
Ćelijska suspenzija (50 μL) je razblažena sa 200 μL 0.5 % rastvora tripan plavog i ćelije su odmah brojane u hemocitometru na invertnom mikroskopu. Broj ćelija u 1 mL suspenzije izračunat je prema sledećoj formuli, uzimajući u obzir dimenzije komore i razblaženje: N = N 0 x 10 4 x 5 N = ukupan broj živih ćelija u 1 mL suspenzije; N 0 = broj živih ćelija izbrojan po kvadratu komore hemocitometra; 5 = faktor razblaženja; 10 4 = korekcioni faktor (dubina komore i zapremina u mL). 
Vijabilnost ćelija je izračunata prema sledećoj formuli: 

Analiza podataka

Dobijeni rezultati su statistički obrađeni pomoću programa Statistica for Windows Release 5. 0. Srednja vrednost, standardna devijacija i koeficijent varijacije izračunati su za replikate (najmanje triplikat) uzoraka u svakom eksperimentu. Svaki eksperiment je urađen tri puta. 
Koeficijent varijacije (CV) u eksperimentalnim i kontrolnim kulturama bio je manji od 10%. 
Citotoksičnost je izražena procentom. Koncentracija kojom se postiže 50% inhibicije rasta odnosno citotoksičnosti (IC 50 ), određena je "Median effect" analizom pomoću programa Calcu Syn. 

Annexin-V-FLUOS

Za ranu fazu apoptoze karakteristične su promene na ćelijskoj površini, tj. promene na nivou membrane. Jedna od membranskih promena je translokacija fosfatidil-serina (PS) sa unutrašnje na spoljašnju površinu plazma membrane. Annexin V je 35-36 KD Ca 2+ zavisan fosfolipid vezujuči protein sa visokim afinitetom vezivanja za PS. Na ovoj osobini Annexina V je zasnovan test senzitivnosti za izlaganje PS na spoljašnju stranu ćelijske membrane i detekciju apoptotskih ćelija u ćelijskoj populaciji, ali ne i u tkivima. S obzirom da se i kod nekrotičnih ćelija PS izlazi na spoljašnju stranu membrane, istovremeno bojenje ćelija Annexinom V konjugovanim sa fluorescein isotiocijanatom (FITC) i propidijum-jodidom omogućava razlikovanje apoptotskih od nekrotičnih ćelija. 
Princip testa: Analiza PS na spoljašnjoj površini membrane apoptotičnih ćelija je rađena koriščenjem FITC Annexin-V kita za detekciju apoptoze (BD Pharmingen TM , BD Biosciences). 

Potrebni reagensi:

1. Inkubacioni pufer (Annexin V vezujući): 10 mM Hepes/NaOH, pH 7.4; 140 mM NaCl; 2.5 mM CaCl 2 2. Propidijum-jodid. Koristimo 5 l po testu. FITC Annexin-V. Koristimo 5 l po testu. 

Procedura bojenja:

1. Ćelije (1 x 10 6 ) isprati dva puta sa 1 ml PBS i centrifugirati na 200 x g; 5'. 

Western blot

Western blot je analitička tehnika koja se koristi za detekciju specifičnih proteina u datom uzorku homogenata ili ekstrakta tkiva. Koristi gel elektroforezu za razdvajanje nativnih (prema 3-D strukturi) ili denaturisanih (prema dužini polipeptidnog lanca) proteina. Proteini se zatim prenose na membranu (obično je u pitanju nitroceluloza ili PVDF) gde se detektuju korišćenjem specifičnih antitela. HT 29 (ATCC HTB38), ćelijska linija humanog adenokarcinoma kolona, uspostavljena iz primarnog tumora. Ćelije morfološki liče na epitelne ćelije. Kariotip ove linije je 2n = 46. Rastu zalepljene za podlogu kao jednoredni sloj ćelija ("monolayer"). MCF 7 (ATCC HTB22), ćelijska linija humanog adenokarcinoma dojke. MCF7 je uspostavljena iz pleuralnog izliva i ispoljava neke karakteristike diferenciranog epitela dojke, uključujući i sintezu estradiola. Ćelije eksprimiraju estrogene i progesteronske receptore. MCF-7 ćelije imaju "wild" tip p53 i eksprimiraju P-glikoprotein (Pgp) (35). Morfološki liče na epitelne ćelije. Kariotip ove linije je 2n = 46, a kultura je heteroploidna (hipertriploidna do hipotetraploidna). Rastu zalepljene za podlogu kao jednoredni sloj ćelija ("monolayer"). 

MDA-MB-231 (ATCC HTB26

), ćelijska linija humanog adenokarcinoma dojke, uspostavljena je iz pleuralnog izliva. Morfološki liče na epitelne ćelije. Kariotip ove linije je 2n = 46. Rastu zalepljene za podlogu kao jednoredni sloj ćelija ("monolayer"). 
HeLa (ATCC CCL2), ćelijska linija karcinoma grlića materice. Morfološki liče na epitelne ćelije. Kariotip ove linije je 2n = 46. Rastu zalepljene za podlogu kao jednoredni sloj ćelija ("monolayer"). 
Hs 294T (ATCC HTB140), ćelijska linija melanoma. Rastu zalepljene za podlogu kao jednoredni sloj ćelija ("monolayer"). 
MRC 5 (ATCC CCL 171), zdrava ćelijska linija fibroblasti pluća. MRC-5 je normalna diploidna ćelijska linija sa 46, XY kariotipom. Rastu zalepljene za podlogu kao jednoredni sloj ćelija ("monolayer"). Na osnovu uspostavljanja korelacionih odnosa (SAR) između strukture i antiproliferativne aktivnosti analoga tiazofurina, utvrđeno je da ispitivani analozi, zavisno od konfiguracije, prouzrokuju različite promene antiproliferativne aktivnosti u odnosu na tiazofurin. 

-24h

Takođe je utvrđeno da ispitivani analozi tiazofurina dovode do promena u distribuciji ćelija po fazama ćelijskog ciklusa. Promene u fazama ćelijskog ciklusa K562 ćelija zavise od tipa jedinjenja, i od vremena tretmana. 
Ispitujući koji tip ćelijske smrti leži u osnovi citotoksičnog dejstva testiranih jedinjenja, utvrđeno je da svi analozi povećavaju kako procenat specifične apoptoze tako i procenat specifične nekroze s dužinom tretmana. Pokazali smo da sintetizovani analozi tiazofurina indukuju vremenski zavisnu apoptozu u tretiranoj ćelijskoj liniji. Može se spekulisati da je apoptotska aktivnost sintetizovanih jedinjenja zapravo posledica strukturnih promena, i da su ovakve promene u hemijskoj strukturi osnova pokazane antitumorske aktivnosti. 
Ispitujući signalne puteve pokazano je da je u K562 ćelijama apoptoza praćena aktivacijom "nizvodnog" molekula apoptotskog puta, kaspaze-3. Na osnovu dobijenih rezultata, ne može se sa sigurnošću zaključiti da li translokacija Bax proteina direktno ili indirektno indukuje apoptozu preko mitohondrijalnog puta. Međutim, na osnovu dobijenih rezultata se može zaključiti da antitumorska aktivnost ispitivanih sintetizovanih jedinjenja na testiranoj ćelijskoj liniji K562 obuhvata i promene u fazama ćelijskog ciklusa, kao i indukciju apoptoze pomoću dva različita mehanizma (kaspaza-zavisnim i kapaza-nezavisnim putem). 

Slika 2 . 1 .

 21 Uklanjanje apoptotske ćelije fagocitozom32 


Slika 2 . 3 . 33 Slika 2 . 4 .

 233324 Unutrašnji put apoptoze Regulacija apoptoze 


92

 92 


8 BrShema 3 . 5 .

 835 Mogući mehanizam prevodjenja tiazolina 7 u tiazol 8 


2 13, 2 -Shema 3 2 14, 2 -( 2 - 110 Shema 3 2 15, 2 -Shema 3 2 16 2 -( 3 - 111 Shema 3 2 17, 2 -( 3 - 111 Shema 3 2 18, 2 -Shema 3 20 ,Shema 3 3 21, 2 - 110 Shema 3 2 22, 2 - 113 Shema 3 2 23, 2 -( 2 - 114 Shema 3 2 24, 2 - 114 Shema 3 2 25, 2 -( 2 - 113 Shema 3 2 27, 2 -

 2232221103223223111322311132232033211032211332221143221143222113322 (2-Acetamido-2-deoksi-β-D-arabonofuranozil)tiazol-4-karboksamid109 Azido-2-deoksi-β-D-arabonofuranozil)tiazol-4-karboksamid (2-Amino-2-deoksi-β-D-arabonofuranozil)tiazol-4-karboksamid110 Deoksi-3-fluoro-β-D-ksilofuranozil)tiazol-4-karboksamid Acetamido-3-deoksi-β-D-ksilofuranozil)tiazol-4-karboksamid (3-Amino-3-deoksi-β-D-ksilofuranozil)tiazol-4-karboksamid112 2-([(S)-1,2-O-(Etiliden-egzo-1-C-il)]-β-D-ksilofuranoza)tiazol-4-karboksamid 110 ([(R)-1,2-O-(Etiliden-endo-1-C-il)]-β-D-ksilofuranoza)tiazol-4-karboksamid (2-Benzamido-2-deoksi-β-D-ribofuranozil)tiazol-4-karboksamid Acetamido-2-deoksi-β-D-ribofuranozil)tiazol-4-karboksamid [2-deoksi-2-(3-metoksibenzamido)-β-D-ribofuranozil]tiazol-4-karboksamid Azido-2-deoksi-β-D-ribofuranozil)tiazol-4-karboksamid (2-Amino-2-deoksi-β-D-ribofuranozil)tiazol-4-karboksamid Shema 3.21. Jedinjenja 26 i 27 su dobijena primenom reakcione sekvence koja je prikazana na Shemi 3.22. : (a) BzCl, Py, CH 


Shema 3 .

 3 Imajući u vidu postavljeni cilj ove doktorske disertacije, u finalnoj etapi naših radova ispitivan je uticaj novosintetizovanih C-nukleozida na rast sledećih humanih ćelijskih linija: hronična mijeloidna leukemija (K562), promijelocitna leukemija (HL-60), leukemija T-limfocita (Jurkat), Burkittov limfom (Raji), adenokarcinom prostate (PC-3), karcinom kolona (HT-29), adenokarcinom dojke (MCF-7) pozitivan na estrogenske receptore (ER+), adenokarcinom dojke (MDA-MB-231) negativan na estrogenske receptore (ER-), karcinom grlića materice (HeLa), melanom (Hs 294T) i normalni fibroblasti pluća (MRC-5). Tiazofurin je primenjen kao referentno jedinjenje. Ćelijske linije su izložene delovanju tiazofurina, 9 i 12-27 tokom 24, 48 i 72 h u rasponu koncentracija od 0.01 do 100 µM. Efekat pomenutih jedinjenja na rast ćelija izmeren je tetrazolijum kolorimetrijskim testom (MTT test) 115 neposredno po završetku inkubacije. Princip metode se zasniva na redukciji tetrazolijumove soli 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolijum bromid, (MTT) u plavo obojeni proizvod (formazan; Shema 3.23.), u prisustvu mitohondrijalnog enzima sukcinat dehidrogenaze. Količina nagrađenog formazana direktno je proporcionalna broju vijabilnih ćelija, a apsorbanca se određuje na spektrofotometru (mikročitaču), na dve talasne dužine: test talasnoj dužini od 540 nm i referentnoj talasnoj dužini od 690 nm.  23.: Metabolička transformacija MTT u formazan  Za detalje videti eksperimentalni deo. Dobijeni rezultati su statistički obrađeni pomoću programa Statistica for Windows, Release 5.0. 


Slika 3 . 1 .

 31 Uticaj tiazofurina i analoga 9 i 12 na proliferaciju K562 ćelija nakon inkubacije u toku: (a) 24 h, (b) 48 h, (c) 72 h. 


3. 2 . 3 . 2 .

 232 Slika Uticaj tiazofurina i analoga 9 i 12 na proliferaciju HL-60 ćelija nakon inkubacije u toku: (a) 24 h, (b) 48 h, (c) 72 h. 


Slika 3 . 5 .

 35 Uticaj tiazofurina i analoga 9 i 12 na proliferaciju PC-3 ćelija nakon inkubacije u toku: (a) 24 h, (b) 48 h, (c) 72 h. 


Slika 3 . 7 .

 37 Uticaj tiazofurina i analoga 9 i 12 na proliferaciju MCF-7 ćelija nakon inkubacije u toku: (a) 24 h, (b) 48 h, (c) 72 h.Nakon 24 i 48 h inkubacije tiazofurin je pokazao niži antiproliferativni efekat pri koncentracijama od 0.01 do 10 µM u odnosu na novosintetizovane analoge. Takođe je utvrđeno da oba analoga, 9 i 12, pri svim ispitivanim koncentracijama (33-69% za 9 i 33-70% za 12), pokazuju skoro identičan antiproliferativni efekat. Pri koncentraciji od 1 µM i većim detektovan je slabiji antiproliferativni efekat tiazofurina od oba analoga. 


Slika 3 . 13 . 57 Slika 3 . 14 .

 31357314 Korelacije između strukture i antiproliferativne aktivnosti tiazofurina i analoga ksilo konfiguracije (16, 17, 18, 19, 20 i 21) Korelacije između strukture i antiproliferativne aktivnosti tiazofurina i analoga ribo konfiguracije (22, 23, 24, 25, 26 i 27) 




  Nakon 24 h (Slike 3.20.a, 3.21.a, 3.22.a), svi analozi (osim 14, 18, 26 i 27), kao i tiazofurin povećavaju ekspresiju kaspaze 3, što jasno ukazuje na uključenost kaspaze 3 u apoptotske procese u tretiranoj ćeliji. Manji efekat na ćelijski sadržaj kaspaze 3 je uočen nakon 72-časovnog tretmana ćelija sa ispitivanim supstancama (osim 14, 18 i 27) (Slike 3.20.b, 3.21.b, 3.22.b). 


analozi 18 (Slika 3 .Slika 3 .Slika 3 .Slika 3 .Slika 3 .

 1833333 ksilo konfiguracije) (24h, 72h), i 27 (ribo konfiguracije) (72 h) indukuju najslabije cepanje PARP (Slike 3.20.a, 3.21.a, 3.22.a, 3.20.b, 3.21.b, 3.22.b). 20a, c: Rezultati Western blot analize za jedinjenja iz grupe acikličnih tiazolnih nukleozida (9, 12); arabino konfiguracije (13, 14, 15), 24 h. 20b, d: Rezultati Western blot analize za jedinjenja iz grupe acikličnih tiazolnih nukleozida (9, 12); arabino konfiguracije (13, 14, 15), 72 h. 21a, c: Rezultati Western blot analize za jedinjenja iz grupe analoga tiazofurina ksilo konfiguracije (jedinjenja 16-21), 24 h. 21b, d: Rezultati Western blot analize za jedinjenja iz grupe analoga tiazofurina ksilo konfiguracije (jedinjenja 16-21), 72 h. 22a, c: Rezultati Western blot analize za jedinjenja iz grupe analoga tiazofurina ribo konfiguracije (jedinjenja 22-27), 24 h. 


Slika 3 .

 3 22b,d: Rezultati Western blot analize za jedinjenja iz grupe analoga tiazofurina ribo konfiguracije (jedinjenja 22-27), 72 h. Slike 3.21-3.22 Nakon 24 h i 72 h tretmana K562 ćelija analozima tiazofurina i tiazofurinom, primenjenim u IC 50 koncentraciji, ćelijski lizati su podvrgnuti imunoblotu. Membrane su inkubirane sa anti-Bax, Bcl2, Kaspasa 3, PARP i anti-β-aktin antitelima. Nivo β-actin proteina je korišćen kao kontrola uspešnosti Western blot-a. Na slikama 3.20-3.22c,d prikazan je rezultat kvantifikacije traka dobijenih Western blotom, koje odgovaraju Bax, Bcl2, Kaspaza 3 i PARP proteinima. Kvantifikacija traka dobijenih u Western blotu je odrađena denzitometrijskom analizom, koristeći ImageJ softver. Relativne količine Bax, Bcl2, Caspase 3 i PARP proteina u lizatima K562 ćelija prikazane su u arbitrarnim jedinicama. 


2 .

 2 Preneti 100 l resuspendovanih ćelija (1 x 10 5 ) u epruvetu od 5 ml. 3. Dodati 5 l Annexin V FITC i 5 l PI 4. Pažljivo vorteksovati ćelije i inkubirati 15' na sobnoj temperature u mraku dodato je 5 L Annexin V-FITC i 5 L propidijum-jodida. Ćelije su blago promućkane i inkubirane sa datim fluorescentnim bojama 15 minuta na 25 C, u mraku. Nakon toga, 400 L pufera za vezivanje je dodato u svaku epruvetu i analizirano na BD FACS Calibur protočnom citometru primenom Cell Quest kompjuterskog programa. Procenat specifične apoptoze je određivan prema formuli: % specifične apoptoze = 100 x [ekspermentalna apoptoza (%)-spontana apoptoza (%)]/[100%spontana apoptoza (%)] Procenat specifične nekroze je određivan prema formuli: % specifične nekroze = 100 x [ekspermentalna nekroza (%)-spontana nekroza (%)]/[100%spontana nekroza (%)] 




  176 


4. 2 . 6 . 1 .

 261 Pripremanje ćelijskog lizata za Western blot analizuMaterijal i aparati:1. Ploče 6 well (NUNC); 2. Centrifuga. Supstance i rastvori:1. Hranljivi medijum za ćelijske kulture; 2. Destilovana voda.Proteinski uzorci ćelija (K562) su pripremjeni za Western blot analizu pri čemu su ćelije bile tretirane ispitivanim supstancama (IC 50 koncencentracija) tokom 24 h i 72 h. Nakon isteka inkubacije, ćelije centrifugirati, resuspendovati u destilovanoj vodi, prebrojati i ostaviti 2 h na sobnoj temperaturi. Nakon centrifugiranja na 1300 o/min, 10 minuta, određena je koncentracija proteina metodom po Bradfordu.Osnovni podaci o ćelijskim linijama67. (http//www.atcc.org.; b) http//www.camr.org.uk/ecacc.htm) K562 (ATCC CCL 243), ćelijska linija uspostavljena je iz pleuralnog izliva bolesnice sa hroničnom mijeloidnom leukemijom u terminalnoj blastnoj krizi. Populacija se sastoji od visoko nediferentovanih ćelija granulocitne loze. Ćelije imaju morfološke osobine limfoblasta, a kariotip je 2n = 46. Novije studije su pokazale da su K562 blasti multipotentne, hematopoetske maligne ćelije koje spontano diferentuju u prepoznatljive progenitore eritrocitne, granulocitne i monocitne serije. Diferencijacija u pravcu granulocitne serije može se indukovati i pomoću DMSO. Koriste se kao osetljive ciljne ćelije u testu NK citotoksičnosti. Rastu kao suspenzija pojedinačnih ćelija. HL-60 (ATCC CCL 240), ćelijska linija uspostavljena iz periferne krvi bolesnice sa akutnom promijelocitnom leukemijom. Ćelije imaju morfološke osobine mijeloblasta i pokazuju fagocitnu aktivnost. Rastu kao suspenzija pojedinačnih ćelija. JURKAT (ATCC CRL 1435), ćelijska linija uspostavljena je iz periferne krvi 14-godišnjeg dečaka sa leukemijom T ćelija. Ćelije imaju morfološke osobine limfoblasta. Ovo su pseudodiploidne ćelije, a kariotip ove linije je 2n = 46. Rastu kao suspenzija pojedinačnih ćelija. RAJI (ATCC CCL 86), ćelijska linija uspostavljena iz leve maksile 11-godišnjeg dečaka obolelog od Burkit-ovog limfoma. Ćelije imaju morfološke osobine limfoblasta, a kariotip je 2n = 46. Rastu kao suspenzija pojedinačnih ćelija. PC 3 (ATCC CRL 1435), ćelijska linija dobijena iz kosti, 62 godišnjeg pacijenta sa metastatskim adenokarcinomom prostate. Morfološki imaju osobine epitelijalnih ćelija. Rastu zalepljene za podlogu kao jednoredni sloj ćelija ("monolayer"). 




  (dd, 1H, J 5a,5b = 11.3 Hz, J 4,5a = 6.3 Hz, H-5a ) 3.74 (ddd, 1H, J 4,5a = 6.3 Hz, J 4,5b = 2.9 Hz, J 3,4 = 8.5 Hz, H-4) 3.84 (dd, 1H, J 4,5b = 2.7 Hz, J 5a,5b = 11.3, H-5b) 3.93 (dd, 1H, J 2,3 = 1.8 Hz, J 1,2 = 8.3 Hz, H-2) 4.02 (dd, 1H, J 2,3 = 1.8 Hz, J 3,4 = 8.3 Hz, H-3) 4.09 (d, 1H, J 1,2 = 8.3 Hz, H-1) (dd, 1H, J 5a,5b = 12.4 Hz, J 4,5a = 5.1 Hz, H-5a ) 4.93(dd, 1H, J 5a,5b = 12.4 Hz, J 4,5b = 3.1 Hz, H-5b) 5.78 (d, 1H, J 2,3 = 2.4 Hz, H-2) 6.00 (ddd, 1H, J 4,5a = 5.1 Hz, J 4,5b = 3.1 Hz, J 3,4 = 8.0 Hz, H-4) 6.27 (dd, 1H, J 2,3 = 2.4 Hz, J 3,4 = 7.9 Hz, H-3) 7.33-8.15 (m, 20H, Ar-H) 9.72 (s, 1H, CHO) 




  Asignacija [, ppm]:1.33 (t, 3H, J CH2CH3 = 7.2 Hz, CH 3 iz CO 2 CH 2 CH 3 ) 4.33 (q, 2H, CH 2 iz CO 2 CH 2 CH 3 ) 3.73 (dd, 1H, J 3',4'a = 6.6 Hz, J 4'a,4'b =12.0 Hz, H-4'a) 3.68 (dd, 1H, J 3',4'b =3.7 Hz, J 4'a,4'b =12.0 Hz, H-4'b) 6.20 (m, 1H, H-3') 6.99 (dd, 1H, J 2',3' = 6.4 Hz, J 1',2' = 16.0 Hz, H-2') 7.17 (d, 1H, J 1',2' = 16.2 Hz, H-1') 7.40-8.16 (m, 10H, Ar-H) 8.33 (s, 1H, H-5) Asignacija [, ppm]: 3.62 (dd, 1H, J 3',4'a = 6.3 Hz, J 4'a,4'b =11.2 Hz, H-4'a) 3.68 (dd, 1H, J 3',4'b =5.2 Hz, J 4'a,4'b =11.2 Hz, H-4'b) 4.39 (m, 1H, H-3') 6.80 (dd, 1H, J 2',3' = 4.9 Hz, J 1',2' = 16.2 Hz, H-2') 6.96 (d, 1H, J 1',2' = 16.2 Hz, H-1') 8.14 (s, 1H, H-5)62.9 MHz 13 C NMR-Spektar jedinjenja 9 (CD 3 OD)Asignacija [, ppm]: 1.38 (t, 3H, J CH2,CH3 =7.2 Hz, CH 2 CH 3 ) 2.41 (m, 2H, CH 2 -2') 3.25 (m, 2H, CH 2 -1') 4.40 (q, 2H, J CH2,CH3 =7.2 Hz, CH 2 CH 3 ) 4.51 (dd, 1H, J 3',4'a = 6.0 Hz, J 4'a,4'b =12.0 Hz, H-4'a) 4.61 (dd, 1H, J 3',4'b =3.7 Hz, J 4'a,4'b =12.0 Hz, H-4'b) 5.589 (m, 1H, H-3') 7.35-8.08 (m, 10H, Ar-H) 8.03 (s, 1H, H-5) i 2.03 (2m, 2H, 2H-2') 3.17 (m, 2H, 2H-1') 3.50 (d, 2H, J 3',4' = 5.5 Hz, 2H-4') 3.68 (m, 1H, J 3',4' =5.5 Hz, H-3') 8.07 (s, 1H, H-5) 62.9 MHz 13 C NMR-Spektar jedinjenja 12 (CD 3 OD) (C=O iz CONH 2 ) 




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  




  


Slika 2.2. Spoljašnji put apptoze 33

  

3.1. Strategija sinteze

  
	Poslednjih nekoliko decenija C-nukleozidi su intenzivno proučavani radi dobijanja selektivnih
	hemioterapeutika. Najvažniji sintetički C-nukleozidi su tiazofurin (2.1) i njegov izosterni analog
	selenazofurin (2.2; Shema 2.2.). Pri tome je utvrđeno da oba pomenuta C-nukleozida inhibiraju
	inozinmonofosfat-dehidrogenazu, jer nakon fosforilovanja 5'-hidroksilne grupe formiraju NAD
	slične derivate kao što su tiazofurin-, odnosno selenazofurin-adenin-dinukleotidi (TAD odnosno
	SAD; Shema 2.2.). S druge strane, interesantne biološke osobine acikličnih nukleozida podstakle
	su istraživanja u pravcu sinteze velikog broja analoga poznatih nukleozida sa izmenjenom
	šećernom komponentom.
	Kao što je u uvodnom delu navedeno, osnovni zadatak naših radova obuhvata sintezu novog C-
	nukleozida sa tiazolnom heterocikličnom bazom i acikličnim butendiolnim fragmentom. Iz tih
	razloga najpre je planirana trofazna hemijska transformacija D-arabinoze, u pogodno
	funkcionalizovani aciklični derivat sa reaktivnom aldehidnom funkcijom. Planirani proces
	dobijanja acikličnog C-nukleozida predstavlja višefaznu izgradnju heterocikličnog aglikona na
	odabranim acikličnim šećernim derivatima sa reaktivnim supstituentom na C-1. Oksiminovanje
	aldehida vodi ka formiranju izomernih E i Z-oksima koji dehidratacijom daju nitrilni derivat iz
	kojeg je formiranje 1,3-tiazolnog sistema ostvareno preko tiazolinskih izomera.

3.2. Rezultati i diskusija 3.2.1. Sinteza (E),(S)-2-(3,4-dihidroksi-but-1-enil)tiazol-4-karboksamida i (S)- 2-(3,4-dihidroksi-butil)tiazol-4-karboksamida

  
	odgovarajućih NMR spektara. 13 C NMR spektar jedinjenja 3 potvrđuje da molekul sadrži četiri
	benzoatne grupe (165.23, 165.32, 165.43 i 166.12 ppm, 4C=O), kao i po dve CH 3 i CH 2 grupe iz Sintetizovano jedinjenje 6 okarakterisano je IR i NMR spektrima, kao i odgovarajućim TOF M-
	etilditioacetalnene funkcije [14.11, 14.25 (2CH 3 ) i 25.19, 25.31 ppm (2 CH 2 )]. spektrom. U NMR spektrima jedinjenja 6 nema signala karakterističnih za vodonikove i
	U cilju dobijanja acikličnog nitrila 6 planirano je uklanjanje tioacetalne funkcije jedinjenja 3, ugljenikove atome dietilditioacetalne funkcije, dok potvrda prisustva nitrilne funkcije dolazi iz
	praćeno sukcesivnim transformacijama aldehida 4, preko oksima 5, u ključni intermedijer 6 13 C NMR spektra koji pokazuje karakterističan signal na 114.22 ppm.
	(Shema 3.2.). Uklanjanje dietilditioacetalne grupe jedinjenja 3 ostvareno je dejstvom smese HgO Konačno, signal koji se u TOF M-spektru visoke rezolucije javlja na m/e 564.16435 (M+H) +
	i HgCl 2 u acetonu i vodi na sobnoj temperaturi u toku 3.5 sata. Nakon obrade reakcione smese i ukazuje na korektnu bruto formulu (izračunato za C 33 H 26 NO 8 : 564.16529), kao i visok stepen
	kristalizacije dobija se visokokristalni aldehid 4 u prinosu od 60.73%. Protonski NMR spektar čistoće novosintetizovanog molekula 6.
	jedinjenja 4 potvrđuje prisustvo aldehidne grupe signalom na 9.72 ppm kao i četiri benzoatne Naredna etapa naših istraživanja usmerena je na uvođenje heterocikličnog aglikona u molekul 6
	grupe signalima u intervalu od 7.33-8.15 ppm. koji poseduje odgovarajuću C 5 acikličnu strukturu. Planirano je da tiazolni prsten u nitril 6
	uvedemo primenom dve sukcesivne reakcije ciklokondenzacijom sa hidrohloridom etilestra L-
	HO cisteina i oksidacijom sa BrCCl 3 u prisustvu DBU. Ova ideja zasniva se na radu Liang et al, 108 C O H HO CH(SEt) 2 BzO CH(SEt) 2 koji su uspešno ostvarili sintezu 3'-amino analoga tiazofurina iz D-glukoze.
	OH Reakcijom jedinjenja 6 sa hidrohloridom etilestra L-cisteina u prisustvu trietilamina (apsolutni OH OBz a b
	OH MeOH; sobna temperatura; 2 časa) dobija se smesa diastereoizomernih tiazolina 7 (smesa je OH OBz
	CH 2 OH zbog novouvedenog C-4 hiralnog centra; Shema 3.3.). CH 2 OH		CH 2 OBz
	D-Arabinoza, 1	2		3
	Reagensi i uslovi: (a) EtSH, HCl, 0ºC, 40.31%; (b) BzCl, Py, st, 48 h, 95.74%.
	O	Shema 3.1.	O		O
	CN	OEt	OEt	NH 2
	Reakcija aldehida 4 sa hidroksilamin-hidrohloridom u prisustvu natrijum-acetata, izvedena je u OBz etanolu, na sobnoj temperaturi u toku 2 časa. Pri tome je dobijena smesa E i Z-oksima 5, koji su BzO N S N S N S OBz a b c
	nakon hromatografskog prečišćavanja dobijeni u prinosu od 35.91%. Dehidratacija smese oksima ostvarena je sa metansulfonil-hloridom u apsolutnom piridinu (-15C, 0.5h; st, 2h). Na CH 2 OBz OBz BzO OBz BzO OH HO
	taj način je dobijen željeni nitril 6 u prinosu od 81.76% (Shema 3.2.). 6 7 8	9
		O	N	OH
	CH(SEt)			
	2				CN
	C		C	
		H	H	
	BzO			
	BzO	BzO		BzO
	OBz			
	OBz Kao polazno jedinjenje za naša istraživanja poslužio nam je dietilditioacetal D-arabinoze (2, OBz OBz OBz a b c
		OBz	OBz	OBz
	CH Shema 3.1.) koji je dobijen iz D-arabinoze po literaturnom postupku. 107 Acetalizacija D-2 OBz CH 2 OBz CH 2 OBz CH 2 OBz
	arabinoze izvedena je dejstvom etantiola u koncentrovanoj hlorovodoničnoj kiselini, prvo na 3 4 5 6
	0ºC, a zatim na sobnoj temperaturi, pri čemu je dobijen proizvod 2 u prinosu od 40.31%. Reagensi i uslovi: (a) HgCl 2 , HgO, Me 2 CO, H 2 O, st, 3.5 h, 60.73%; (b) NH 2 OH×HCl, NaOAc, EtOH, st, 2
	Primenom standardih reakcionih uslova benzoilovanja (BzCl/Py, sobna temperatura), tioacetal 2 h, 35.91%; (c) MsCl, Py, -15ºC, 0.5 h, zatim st, 2 h, 81.76%.
	je preveden u tetrabenzoatni derivat 3 (Shema 3.1.), čija je struktura potvrđena na osnovu Shema 3.2.

1 2 3 4 5 2' 3' 4' 1'

  Nastali imino intermedijer 7a podleže sukcesivnoj nukleofilnoj adiciji amino grupe na imino funkciju uz nastajanje tiazolidina 7b, koji lako gubi NH 3 dajući očekivane tiazoline 7. 


	uključuje nukleofilnu adiciju tiolne grupe L-cistenskog estra na nitrilnu funkciju molekula 6.
				HSCH 2 CHCO 2 Et									O
				NH 2									OEt
					CH 2 CH	CO 2 Et						
	BzOH 2 C BzO	BzO	C	N	R C NH S NH 2	R	N NH 2 S	H	CO 2 Et	-NH 3	S	N
	BzO									BzO		OBz
		6			7a			7b				7
					BzO						
					BzOH 2 C			R		
				Shema 3.4. Mogući mehanizam prevodjenja nitrila 6 u tiazolin 7	
	Tokom ove reakcije odigrava se i uvođenje dvostruke veze u aciklični fragment molekule nakon
	eliminacije dve benzoatne grupe.								
	Oksidacijom tiazolina 7 sa BrCCl 3 u apsolutnom metilenhloridu, na 4C u toku 17 časova, nastao
	je (E),(S)-Etil-2-(3,4-dibenzoiloksi-but-1-enil)tiazol-4-karboksilat (8) u prinosu od 46.86% u
	odnosu na 6 (računato na dve sintetičke faze). Struktura i čistoća novosintetizovanog C-
	nukleozida 8 potvrdjena je IR-, NMR-i M-spektrima. 13 C NMR Spektar jedinjenja 8 pokazuju
	signale C-atoma tiazolnog prstena:  C 127.04 (C-5), 147.63 (C-4 ) i 161.03 (C-2). Dokaz
	prisustva egzociklične dvostruke veze proizvoda 8 dobijen je takođe analizom njegovog 13 C
	Reagensi i uslovi: (a) Hidrohlorid etilestra L-cisteina, Et 3 N, MeOH, st, 2h; (b) DBU, BrCCl 3 , CH 2 Cl 2, 0C  NMR spektra, pri čemu signali locirani na 125.96 ppm (C-1′), odnosno na 131.47 ppm (C-2′)
	4C, 16h, 46.86% iz 6; (c) NH 3 , MeOH, st, 8 dana, 86.69% . jasno ukazuju na prisustvo olefinske dvogube veze u položaju C 1′ -C		
					Shema 3.3.						
	Struktura novosintetizovanog jedinjenja 7 potvrđena je NMR spektrima dobijenih snimanjem
	sirove reakcione smese. U 13 C NMR spektru sirovog proizvoda 7 odsutan je signal
	karakterističan za nitrilnu funkciju, ali se na 34.51 ppm i 78.33 ppm javljaju signali (CH 2 -5 i C-4
	respektivno), koji dokazuju prisustvo tiazolinskog aglikona u molekulu 7. Mogući mehanizam
	ove transformacije prikazan je na Shemi 3.4. Prva faza ove ciklokondenzacije verovatno

2′ . U protonskom NMR spektru jedinjenja 8 protonu sa C-2′ odgovara dubletdubleta na 6.76 ppm, sa vicinalnim kuplovanjima od 5.3 i 16 Hz. činjenica da je ovaj signal pomeren u oblast visokih vrednosti frekvencija, kao i velika vrednost njegovog kuplovanja sa H-1′, definitivno potvrđuje E konfiguraciju dvostruke veze. Konačno, signal koji se u TOF M-spektru visoke rezolucije javlja na m/e 452.11623 (M+H) + ukazuje na korektnu bruto formulu (izračunato za C 24 H 22 NO 6 S: 452.11606), kao i visok stepen čistoće novosintetizovanog molekula 8. 


  13i13C NMR spektri jedinjenja 10 ne sadrže signale koji bi ukazivali na prisustvo olefinske grupe, dok karakteristični signali u13C NMR spektru u oblasti niskih vrednosti frekvencija (29.45 i 31.03 ppm, CH 2 -1′ i CH 2 -2′) dokazuje prisustvo dve metilenske grupe. 


		O					O		O
		OEt					OEt		OEt
	S	N	a			S	N	+	S	N
	BzO	OBz	BzO	OBz	
	8					10			11
						b		
						O		
							NH 2	
					S	N		
					2'	1'		
			HO	4'	3'	OH		
					12			

13C NMR spektrima.Oba NMR spektra pokazuju signale locirane u oblasti visokih vrednosti frekvencija [ H6.80 (H-2′) i 6.96 (H-1′);  C 124.26 (C-1′) i 139.53 (C-2′)] koji ukazuju na prisustvo olefinske veze u položaju C 1′ -C 2′ .Signal na 8.14 ppm (s, 1H, H-5) u 1 H NMR spektru potvrđuje prisustvo tiazolnog prstena, dok amidnoj funkciji odgovara signal na 168.30ppm (CONH 2 ) u 13 C NMR spektru.Konačno, signal koji se u TOF M-spektru visoke rezolucije javlja na m/e 237.03173 [M+Na] + ukazuje na korektnu bruto formulu (izračunato za C 8 H 10 N 2 NaO 3 S: 237.03043), kao i visok stepen čistoće novosintetizovanog molekula 9. Naredna etapa istraživanja posvećena je reduktivnoj transformaciji dvostruke veze jedinjenja 8 (Shema 3.6.),uciljudobijanja zasićenog analoga jedinjenja 9. Katalitičkim hidrogenovanjem olefina 8 u etanolu uz 10% Pd/C kao katalizator, pri normalnom pritisku vodonika, na sobnoj temperaturi u toku 72 časa dobija se zasićeni aciklični nukleozid 10 u prinosu od 54.20%.Iz reakcioni smese izolovan je i butil analog 11 (30.75%),nastaokaorezultat eliminacije ili hidrogenolize estarskih grupa (Shema 3.6.).Strukture novosintetizovanih jedinjenja 10 i 11 potvrđene su NMR spektrima: 1 Prisustvo tiazolnog prstena u strukturi proizvoda 10 potvrđeno je signalom koji se u njegovom protonskom NMR spektru javlja na 8.03 ppm, a potiče od rezonance vinilnog protona u tiazolnom prstenu.Ostali spektroskopski podaci takođe su u potpunoj saglasnosti sa strukturom 10.NMR spektroskopijom dokazano je prisustvo butil grupe kao i etil estarske grupe u jedinjenju 11:  H 0.95 (t, 3H, (CH 2 ) 3 CH 3 ), 0.34-1.53(grupasignala,2H, CH 2 ), 1.79 (m, 2H, CH 2 ), 3.07 (t, 2H, CH 2 ); 1.40 (t, OCH 2 CH 3 ), 4.43 (q, 2H, COCH 2 CH 3, ),  C 172.49 (COOC 2 H 5 ).Dejstvom metanolnog rastvora amonijaka na jedinjenje 10 (sobna temperatura, 16 dana), ostvarena je amonoliza svih estarskih grupa, pri čemu je dobijen slobodni C-nukleozid 12 u prinosu od 71.0% (Shema 3.6.).Na strukturu deblokiranog nukleozida 12 ukazuje odsustvo signala karakterističnih za benzoatnu i etil-estarsku funkciju u njegovim 1 H i 13 C NMR spektrima.Oba NMR spektra pokazuju signale locirane u oblasti niskih vrednosti frekvencija [ H 1.86 i 2.03 (H-2′) i 3.17 (H-1′);  C 30.26 i 34.32 (C-2' i C-1')] koji ukazuju na prisustvo tiazolnog prstena i karboksamidne funkcije na njemu u položaju C-4.Signal na 8.07 ppm (s, 1H, H-5) u 1 H NMR spektru potvrđuje prisustvo tiazolnog prstena, dok amidnoj funkciji odgovara signal na 173.10 ppm (CONH 2 ) u 13 C NMR spektru.Konačno, signal koji se u TOF M-spektru visoke rezolucije javlja na m/e 217.06344 [M+H] + ukazuje na korektnu bruto formulu (izračunato za C 8 H 13 N 2 NaO 3 S: 217.06414), kao i visok stepen čistoće novosintetizovanog molekula 12.Reagensi i uslovi: (a) H 2 , Pd/C, EtOH, 72 h, 54.20% za 10 i 30.75 za 11 (b) NH 3 , MeOH, st, 16 dana, 71.0% Shema 3.6. 
Uticaj tiazofurina i analoga na rast Jurkat ćelija

  Na osnovu prikazanih rezultata dobijenih tretiranjem Jurkat ćelijske linije tiazofurinom i analozima 9 i 12, u intervalu koncentracija od 0.01 do 100 µM tokom 24, 48 i 72 časa, vidi se da tiazofurin i oba analoga inhibiraju rast Jurkat ćelija, a stepen inhibicije zavisi od koncentracije Pri najvećoj koncentraciji 12 je pokazao aktivnost sličnu tiazofurinu, dok je aktivnost 9 bila manja za ceo raspon koncentracija u sva tri vremena inkubacije. Sa porastom koncentracije, citotoksičnost tiazofurina i 12 je gotovo ista u toku 48 i 72 h, pa je pri koncentraciji od 100 µM kod oba jedinjenja oko 70%, dok je analog 9 bio aktivan tek nakon 72 h, tako da je za 100 µM dostigao aktivnost od 60%. 


	analoga 9 i tiazofurina pri istoj koncentraciji, postiže slabiji antiproliferativni efekat (12,
	koncentraciji od 0.1 µM smanjuje broj ćelija za 20% odnosno 19% u odnosu na kontrolu, dok se odnosno 39%).
	dejstvom tiazofurina, pri istoj koncentraciji, postiže antiproliferativni efekat od samo 10%. Pri
	najvećoj koncentraciji referentno jedinjenje je pokazalo nešto veći antiproliferativan efekat
	(66%) od 9 (60%) a neznatno veći od 12 (65%). ispitivane supstance i dužine tretmana. Analog 9 pokazuje veoma nisku citotoksičnost prilikom
	Nakon inkubacije u toku 48 i 72 h analozi 9 i 12 pokazali su sličan antiproliferativni efekat pri inkubacije u toku 24 i 48 h (Slika 3.3.). Inkubacija: 24h svim ispitivanim koncentracijama. Pri koncentraciji od 100 µM i za isti vremenski period Koncentracija [µM] Jedinjenje 0.01 0.1 1 10 100 TI 9.21 9 11.56 20.02 40.10 50.93 61.77 analog 12 (72% i 90%) je bio efikasniji od 9 (65% i 78%). Tiazofurin i oba analoga pri najnižoj 100 10.12 48.66 58.13 65.11 tiazofurin je pokazao sličan ili slabiji antiproliferativni efekat (68% za 48 h i 71% za 72 h), a Ćelijska linija: Jurkat, vreme inkubacije: 24h
	12 koncentraciji inhibiraju rast HL-60 ćelija u intervalu 9-25%. 80 [%] Inkubacija: 24h 12.34 19.62 34.01 52.03 65.60
	Citotoksičnost	20 40 60						Jedinjenje TI 9	Koncentracija [µM] 0.1 1 10 39.19 41.78 59.69 61.95 67.75 0.01 100 11.99 25.45 25.67 31.61 34.02
								12	48.09 50.66 56.86 57.69 62.60
		0	0.01	0.1	1	10	100	Inkubacija: 48h
			TI	9	12		Koncentracija [µM]	Jedinjenje	0.01	0.1 Koncentracija [µM] 1 10	100
		100		Ćelijska linija: Jurkat, vreme inkubacije: 48h	TI	14.25 46.13 65.18 59.25 68.41
								9	15.94 22.84 42.87 58.73 64.99
	[%]	80						12 Inkubacija: 48h 8.91	20.84 40.39 59.73 71.61
	Citotoksičnost	20 40 60						Jedinjenje TI 9	Koncentracija [µM] 0.1 1 10 41.67 43.13 63.20 64.93 69.48 0.01 100 15.36 27.54 28.45 36.87 38.97
								12	45.98 57.20 62.01 66.73 68.98
		0	0.01	0.1	1	10	100	Inkubacija: 72h
			TI	9	12		Koncentracija [µM]	Jedinjenje	0.01	0.1 Koncentracija [µM] 1 10	100
		100		Ćelijska linija: Jurkat, vreme inkubacije: 72h	TI	23.35 47.31 55.38 65.25 71.41
								9	25.87 38.13 43.72 59.93 78.03
	[%]	80						12 Inkubacija: 72h 12.00 26.13 54.62 60.93 89.99
	Citotoksičnost	20 40 60	TI	9	12			Jedinjenje TI 9	Koncentracija [µM] 0.1 1 10 46.18 47.82 65.93 72.80 74.47 0.01 100 37.70 49.39 53.90 54.18 60.32
								12	49.28 59.99 65.21 68.73 72.14
		0						
			0.01	0.1	1	10	100	
			TI	9	12		Koncentracija [µM]	

Slika 3.3.Uticaj tiazofurina i analoga 9 i 12 na proliferaciju Jurkat ćelija nakon inkubacije u toku: (a) 24 h, (b) 48 h, (c) 72 h.Nakon 24 h inkubacije najsnažniji antiproliferativni efekat imao je analog 12, koji već pri koncentraciji od 0.01 µM smanjuje broj ćelija na 48% u odnosu na kontrolu, dok se dejstvom 


  Na osnovu prikazanih rezultata dobijenih tretiranjem Raji ćelijske linije tiazofurinom i analozima, 9 i 12, u opsegu koncentracija od 0.01 do 100 µM tokom 24, 48 i 72 h, može se zaključiti da sve tri supstance inhibiraju rast Raji ćelija, a stepen inhibicije zavisi od koncentracije ispitivane supstance i dužine tretmana (Slika 3.4.). 



Slika 3.4. Uticaj tiazofurina i analoga 9 i 12 na proliferaciju Raji ćelija nakon inkubacije u toku: (a) 24 h, (b) 48 h, (c) 72 h. 
Uticaj tiazofurina i analoga na rast HT-29 ćelija

  Na Slici 3.6. prikazan je uticaj 9, 12 i tiazofurina na HT-29 ćelije nakon inkubacije u toku 24, 48 i 72 h. Sva tri ispitivana jedinjenja inhibiraju proliferaciju HT-29 ćelija, a stepen inhibicije zavisi od koncentracije, ali ne i od dužine tretmana. Oba analoga 9 i 12 su ispoljila veoma nisku citotoksičnost (10-44%) u sva tri ispitivana vremena inkubacije. 


			Inkubacija: 24h
			Jedinjenje	0.01	Koncentracija [µM] 0.1 1 10	100
			TI	12.65 21.19 28.12 38.34 43.91
			9	21.63 25.07 29.32 34.99 38.65
			12	18.36 28.97 30.68 35.65 41.12
			Inkubacija: 48h
			Jedinjenje	0.01	Koncentracija [µM] 0.1 1 10	100
			TI	13.36 22.58 30.02 39.65 44.25
			9	25.87 22.14 30.04 39.87 48.08
			12	20.64 34.36 34.64 36.64 43.64
			Inkubacija: 72h
			Jedinjenje	0.01	Koncentracija [µM] 0.1 1 10	100
			TI	14.02 25.23 33.03 40.36 46.35
			9	27.87 25.41 33.24 35.48 42.09
			12	25.36 35.93 36.67 39.65 44.02
	TI	9	12	
	Slika 3.6. Uticaj tiazofurina i analoga 9 i 12 na proliferaciju HT-29 ćelija nakon inkubacije u toku: (a) 24 h,
	(b) 48 h, (c) 72 h.			

Uticaj tiazofurina i analoga na rast MDA-MB-231 ćelija

  Tretiranjem MDA-MB-231 ćelijske linije tiazofurinom i analozima 9 i 12, u rasponu koncentracija od 0.01 do 100 µM tokom 24, 48 i 72 časa, može se zaključiti da sve tri supstance inhibiraju rast MDA-MB-231 ćelija, a stepen inhibicije zavisi od koncentracije i od vremena tretmana. 


			Inkubacija: 24h
			Jedinjenje	0.01	Koncentracija [µM] 0.1 1 10	100
			TI	4.11	22.63 48.04 53.64 62.45
			9	33.98 53.72 62.01 66.73 68.98
			12	31.25 45.20 61.51 62.73 65.98
			Inkubacija: 48h
			Jedinjenje	0.01	Koncentracija [µM] 0.1 1 10	100
			TI	26.19 27.17 49.52 54.58 65.70
			9	48.69 50.66 56.86 57.69 58.26
			12	34.56 55.31 62.45 63.24 66.31
			Inkubacija: 72h
			Jedinjenje	0.01	Koncentracija [µM] 0.1 1 10	100
			TI	32.25 35.74 49.70 56.41 64.38
			9	38.28 47.99 52.21 58.73 60.14
			12	39.32 57.02 65.21 66.34 69.95
	TI	9	12	
	Slika 3.8. Uticaj tiazofurina i analoga 9 i 12 na proliferaciju MDA-MB-231 ćelija nakon inkubacije u toku:
	(a) 24 h, (b) 48 h, (c) 72 h.		

Oba analoga pokazala su veoma nisku, gotovo identičnu citotoksičnost, u sva tri ispitivana vremena inkubacije, za ceo raspon koncentracija (16-48% za 9 i 6-44% za 12). Tiazofurin je pokazao znatno veći antiproliferativni efekat (32-58% za 24 h, 33-60% za 48 h i 35-62% za 72 h) od 9 i od 12 pri svim koncentracijama (Slika 3.8.). 
Uticaj tiazofurina i analoga na rast HeLa ćelija

  Na Slici 3.9. prikazani su rezultati dobijeni tretiranjem HeLa ćelijske linije tiazofurinom i analozima 9 i 12 pri koncentracijama od 0.01 do 100 µM tokom 24, 48 i 72 h. 


			Inkubacija: 24h
			Jedinjenje	0.01	Koncentracija [µM] 0.1 1	100
			TI	31.70 35.42 41.15 55.40 58.51
			9	15.67 24.33 30.45 38.79 41.65
			12	5.36	21.56 23.89 34.00 36.68
			Inkubacija: 48h
			Jedinjenje	0.01	Koncentracija [µM] 0.1 1	100
			TI	33.56 37.68 45.78 58.12 59.99
			9	21.74 30.54 36.45 40.12 46.58
			12	11.36 24.85 33.92 35.78 40.26
			Inkubacija: 72h
			Jedinjenje	0.01	Koncentracija [µM] 0.1 1	100
			TI	35.48 39.45 48.34 60.05 62.38
			9	20.14 22.54 30.54 40.02 48.52
			12	16.31 28.64 35.22 37.36 44.46
	TI	9	12	
	Slika 3.9. Uticaj tiazofurina i analoga 9 i 12 na proliferaciju HeLa ćelija nakon inkubacije u toku: (a) 24 h,
	(b) 48 h, (c) 72 h.			
	Iz navedenog proizilazi da tiazofurin i oba novosintetizovana analoga inhibiraju rast HeLa ćelija
	a stepen inhibicije zavisi od koncentracije i od vremena tretmana. Tip odgovora tokom svih
	ispitivanih vremena je sličan.	

Tiazofurin je pokazao gotovo isti antiproliferativni efekat pri svim ispitivanim koncentracijama (21-53% za 24 h, 22-59% za 48 h i 36-73% za 72 h) u poređenju sa 9 i 12. 
Uticaj tiazofurina i analoga na rast Hs294T ćelija

  Na Slici 3.10. prikazani su rezultati dobijeni tretiranjem Hs294T ćelijske linije tiazofurinom i novosintetisanim analozima 9 i 12 u intervalu koncentracija od 0.01 do 100 µM tokom 24, 48 i 72 h. 


			Inkubacija: 24h
			Jedinjenje	0.01	Koncentracija [µM] 0.1 1 10	100
			TI	21.18 27.08 34.17 53.07 52.63
			9	24.89 32.85 44.97 49.14 60.01
			12	23.65 32.35 40.62 52.34 58.88
			Inkubacija: 48h
			Jedinjenje	0.01	Koncentracija [µM] 0.1 1 10	100
			TI	22.09 33.09 45.28 55.34 58.71
			9	18.94 29.05 40.91 55.17 63.09
			12	24.94 36.05 42.91 50.97 61.49
			Inkubacija: 72h
			Jedinjenje	0.01	Koncentracija [µM] 0.1 1 10	100
			TI	36.21 33.03 50.98 57.18 73.11
			9	25.21 38.89 46.87 59.32 69.84
			12	26.61 39.89 51.87 60.32 63.64
	TI	9	12	
	Slika 3.10. Uticaj tiazofurina i analoga 9 i 12 na proliferaciju Hs294T ćelija nakon inkubacije u toku: (a) 24
	h, (b) 48 h, (c) 72 h.			

Uticaj tiazofurina i analoga na rast MRC-5 ćelija

  Na Slici 3.1.. prikazani su rezultati koji su dobijeni tretiranjem normalne MRC-5 ćelijske linije tiazofurinom i novosintetizovanim analozima 9 i 12, pri koncentracijama od 0.01 do 100 µM tokom 24, 48 i 72 h. Sve tri supstance inhibiraju rast MRC-5 ćelija a stepen inhibicije zavisi kako od koncentracije, tako i od dužine tretmana. 


			Inkubacija: 24h		
			Jedinjenje	0.01	Koncentracija [µM] 0.1 1 10	100
			TI	9.78	17.70 22.13 36.69 44.61
			9	4.05	2.36	6.69	9.87	14.36
			12	14.29 22.36 26.69 29.87 21.32
			Inkubacija: 48h		
			Jedinjenje	0.01	Koncentracija [µM] 0.1 1 10	100
			TI	10.03 19.34 23.33 38.63 45.67
			9	11.15 13.75 17.16 19.88 22.99
			12	21.22 23.65 28.64 30.02 28.34
			Inkubacija: 72h		
			Jedinjenje	0.01	Koncentracija [µM] 0.1 1 10	100
			TI	11.24 20.02 24.65 39.98 46.35
			9	20.79 23.20 27.78 38.94 43.51
			12	22.87 24.65 30.14 33.65 34.55
	TI	9	12			
	Slika 3.11. Uticaj tiazofurina i analoga 9 i 12 na proliferaciju MRC-5 ćelija nakon inkubacije u toku: (a) 24
	h, (b) 48 h, (c) 72 h.					

22, 23, 24, 26 i 27, dok analog 25 nije

  Raji ćelijskoj liniji, dok analog 16 pokazuje snažnu citotoksičnu aktivnost prema HL-60, Jurkat, Raji, PC-3 i HT-29 malignim ćelijama.Na osnovu IC 50 vrednosti određenih za K562 ćelijsku liniju, može se zaključiti da analozi 17, 18, 19, 20 i 21 snažno inhibiraju rast u sva tri ispitivana vremena inkubacije.Pri tome je molekul 18 odgovarajućim IC 50 vrednostima od 1.12, 0.98 i 0.79 µM.Nešto slabiju ali snažniju citotoksičnost u poređenju s tiazofurinom, ispoljila su jedinjenja 20 i 21.Isto tako, tiazofurin je ispoljio snažnu, vremenski zavisnu citotoksičnost prema HeLa ćelijama, dok su dva novosintetizovana analoga 16 i 17 bila potpuno neaktivna prema ovoj ćelijskoj liniji. delovao na ovu ćelijsku liniju. Najjača citotoksičnost je registrovana kod analoga 22, pri čemu se pokazalo da je ovaj molekul 3 000 puta aktivniji od tiazofurina (posle 24 h), od 26 oko 928 puta (posle 72 h), dok mu je aktivnost bila veća oko 630 puta od analoga 27 Prema MCF-7 ćelijskoj liniji samo je analog 25 pokazao značajnu antiproliferativnu aktivnost u sva tri vremena inkubacije, koja je bila 200, 300 i 450 puta veća od aktivnosti tiazofurina (nakon 24, 48 i 72 h inkubacije), dok analozi 26 i 27 nisu inhibirali rast ni u jednom od ispitivanih 


	h. Nakon 72 h inkubacije oba novosintetizovana jedinjenja su bila oko 2 puta aktivnija od
	Uopšteno, na osnovu rezultata iz Tabele 3.1. proizilazi da novosintetisani analog 9 ispoljava referentnog jedinjenja.
	snažnu antiproliferativnu aktivnost prema K562, HL-60, Jukat, Raji, PC-3, MCF-7 i HeLa Jedina ćelijska linija prema kojoj su i tiazofurin i oba novosintetizovana analoga bili potpuno
	ćelijskim linijama, dok analog 12 pokazuje snažnu citotoksičnu aktivnost prema K562, HL-60, neakativni jeste melanom Hs 294T. vremenskih perioda.
	Jukat, Raji i MCF-7 malignim ćelijama. Konačno, iz Tabele 3.1. se vidi da tiazofurin pokazuje snažnu citotoksičnost prema zdravim oko 102 puta aktivniji od tiazofurina nakon 24 h inkubacije, dok je antiproliferativna aktivnost Analozi 18, 19, 20 i 21 su inhibirali rast ove ćelijske linije snažnije od referentnog molekula od 2 Nijedan analog ribo konfiguracije nije inhibirao rast MDA-MB-231 ćelija ni u jednom od
	Na osnovu IC 50 vrednosti određenih za K562 ćelijsku liniju, može se zaključiti da oba analoga, 9 ćelijama MRC-5 dok su analozi potpuno neaktivni prema ovoj ćelijskoj liniji. analoga 17, 19, 20 i 21 veća od tiazofurina 2-100 puta, zavisno od vremena inkubacije. do 382 puta, zavisno od perioda inkubacije. ispitivanih vremenskih perioda. S druge strane, tiazofurin je ispoljio snažnu, vremenski zavisnu
	i 12, snažno inhibiraju rast u sva tri ispitivana vremena inkubacije. Pri tome su oba analoga oko 2 Takođe, iz Tabele 3.1. se vidi da analozi arabino kofiguracije (13, 14 i 15) prema K562 ćelijskoj Prema HL-60 ćelijskoj liniji analozi 17 i 18 su ispoljili značajniju antiproliferativnu aktivnost tek Jedina ćelijska linija prema kojoj su i tiazofurin i novosintetisani analozi bili potpuno neakativni antiproliferativnu aktivnost prema ovoj ćelijskoj liniji.
	puta aktivnija od tiazofurina nakon 72 h inkubacije, dok je antiproliferativna aktivnost analoga liniji ispoljavaju slabiju ili istu citotoksičnost u odnosu na tiazofurin. Samo je analog 13 nakon nakon inkubacije od 72 h. Najjača citotoksičnost je registrovana kod analoga 16, pri čemu se je melanom Hs 294T. Isto tako, tiazofurin je ispoljio snažnu, vremenski zavisnu citotoksičnost prema HeLa ćelijama,
	nakon 24 i 48 h gotovo ista kao kod tiazofurina. 72 h ispoljio 189 puta veću aktivnost od referentnog jedinjenja. pokazalo da je ovaj molekul 20, odnosno 3 puta aktivniji od tiazofurina nakon 48, odnosno 72 h. Konačno, iz Tabele 3.1. se vidi da novosintetizovani analozi pokazuju neaktivnost ili nisku dok su novosintetizovani analozi 22, 23, 24 i 26 bili potpuno neaktivni prema ovoj ćelijskoj
	Prema HL-60 ćelijskoj liniji oba analoga su ispoljila značajniju antiproliferativnu aktivnost koja Snažnu, vremenski zavisnu antitumorsku aktivnost, identičnu tiazofurinu, ispoljilo je samo Rezultati dobijeni nakon tretiranja Jurkat ćelija, ukazuju da su svi analozi ksilo konfiguracije citotoksičnost (samo molekul 17) prema zdravim ćelijama MRC-5, za razliku od referentnog liniji. Analog 27 je 8 do 27 puta aktivniji kako od analoga 25, tako i od referentnog jedinjenja
	je gotovo identična aktivnosti tiazofurina (9.32-0.19%). Na osnovu rezultata dobijenih nakon jedinjenje 15 prema HL-60 ćelijskoj liniji . pokazali snažnu antiproliferativnu aktivnost nakon 24, 48 i 72 h, dok su jedinjenja 16, 17 i 18 jedinjenja. nakon sva tri vremena inkubacije. Najjača antiproliferativna aktivnost oba analoga registrovana
	pokazala značajniju aktivnost od tiazofurina pri sva tri ispitivana vremena inkubacije. je nakon 72 h.
	Tiazofurin i novosintetizovani analozi (osim analoga 27) bili su potpuno neaktivani prema Hs
	294T ćelijskoj liniji.
	Aktivnost 12 nakon 24, 48 i 72 h bila je oko 23, 50 odnosno 44.5 puta veća u odnosu na druge strane, tiazofurin je ispoljilo snažnu, vremenski zavisnu antipriloferativnu aktivnost prema
	tiazofurin. svim ćelijskim linijama. (posle 24 h).
	Oba analoga 9 i 12 su bila potpuno neaktivna prema MDA-MB-231 ćelijskoj liniji, za razliku od Melanom Hs 294T je jedina ćelijska linija prema kojoj su i tiazofurin i oba novosintetizovana 19, 20 i 21 su bili potpuno neaktivnim prema HT-29 ćelijama. Prilično neočekivano, pokazalo se da analog 22 snažno inhibira rast PC-3 ćelija nakon sva tri
	tiazofurina koji je pokazao jaku citotoksičnost nakon sva tri vremena inkubacije (24, 48 i 72 h) analoga bili potpuno neakativni. Prema MCF-7 ćelijama, analozi 17, 20 i 21 su pokazali snažnu aktivnost samo nakon 72 h perioda inkubacije, dok su tiazofurin i ostali ispitivani analozi bili neaktivani prema ovoj
	sa odgovarajućim IC 50 vrednostima od 1.12, 0.98 i 0.79 µM. Takođe, iz Tabele 3.1. se vidi da tiazofurin i analog 13 pokazuju snažnu citotoksičnost prema inkubacije, dok jedinjenja 16, 18, i 19 nisu inhibirala rast ni u jednom od ispitivanih vremenskih ćelijskoj liniji. Najjača antiproliferativna aktivnost analoga 22 registrovana je nakon 72 h.
	Isto tako, tiazofurin i oba novosintetizovana analoga su ispoljila snažnu, vremenski zavisnu zdravim ćelijama MRC-5 dok su analozi 14 i 15 potpuno neaktivni. perioda. S druge strane, tiazofurin je ispoljio snažnu, vremenski zavisnu antipriloferativnu
	citotoksičnost prema HeLa ćelijama. Nakon 24 h registrovana je slabija aktivnost analoga prema aktivnost prema ovoj ćelijskoj liniji.
	1.75 ovoj ćelijskoj liniji nakon, dok su oba analoga pokazala sličnu aktivnost kao tiazofurin nakon 48 0.67 0.15 55.8 34.7 22.6 >100 >100 >100

tretiranja Jurkat ćelija, proizilazi da je analog 12 pokazao snažnu antiproliferativnu aktivnost nakon 24, 48 i 72 h, dok je jedinjenje 9 bilo aktivno samo pri najdužem ispitivanom vremenu inkubacije.Najsnažnija citotoksičnost jedinjenja 12 registrovana je nakon 72 h, pri čemu se pokazalo da je ovaj analog oko 2 puta aktivniji od tiazofurina, dok je nakon 24, odnosno 48 h inkubacije njegova aktivnost bila oko 7, odnosno 36 puta veća u odnosu na referentno jedinjenje.Prema Raji ćelijskoj liniji oba analoga (9 i 12) su ispoljila jaču antiproloferativnu aktivnost od tiazofurina samo nakon 24 h, pri čemu su oba analoga bila oko 2 puta aktivnija.Dok je u ostalim vremenskim periodima antiproliferativna aktivnost analoga bila slabija (48 h) ili slična tiazofurinu (72 h).Oba analoga nisu inhibirala rast PC-3 i HT-29 ćelijskih linija ni u jednom od ispitivanih vremenskih perioda.S druge strane, tiazofurin je ispoljio snažnu, vremenski zavisnu antipriloferativnu aktivnost prema HT-29 ćelijskoj liniji.Prema MCF-7 ćelijama, najpotentnija citotoksičnost registrovana je kod analoga 9 nakon 72 h inkubacije, pri čemu se pokazalo da je ovaj analog oko 100 puta aktivniji od tiazofurina.Analog 15 je bio aktivan i prema Jurkat ćelijskoj liniji pri čemu je pokazao sličnu aktivnost kao tiazofurin, dok analozi 13 i 14 nisu inhibirali rast pomenutih ćelija ni u jednom od ispitivanih vremenskih perioda.Sva tri ispitivana analoga su ispoljila značajnu, vremenski zavisnu citotoksičnost prema Raji ćelijama.Citotoksična aktivnost analoga 13 je bila 27, 5, odnosno 2 puta veća od aktivnosti tiazofurina zavisno od vremena inkubacije(24, 48odnosno 72 h), dok je analog 15 bio oko 5 puta aktivniji nakon 72 h. Prilično neočekivano, pokazalo se da dva analoga arabino kofiguracije (13 i 15) snažno inhibiraju rast PC-3 ćelija nakon sva tri perioda inkubacije, dok su tiazofurin i analog 14 bili potpuno neaktivni prema ovoj ćelijskoj liniji. Analog 13 je 1.4 do 2 puta aktivniji od analoga 15 nakon sva tri vremena inkubacije. Najjača antiproliferativna aktivnost oba analoga registrovana je nakon 72 h. Prema HT-29, MCF-7, MDA-MB-231 i HeLa ćelijskim linijama nijedno jedinjenje iz ove grupe nije pokazalo izrazitu aktivnost, osim jedinjenja 14 za HT-29 i 15 za HeLa ćelijske linije. S Na osnovu rezultata iz Tabele 3.1 vidi se da su novosintetizovani analozi 17, 18, 19, 20 i 21 (analozi ksilo konfiguracije) ispoljili snažnu antiproliferativnu aktivnost prema K562, HL-60, Jurkat i Najsnažnija citotoksičnost jedinjenja 18 registrovana je nakon 72 h, pri čemu se pokazalo da je ovaj analog oko 11 puta aktivniji od tiazofurina, dok je nakon 24, odnosno 48 h inkubacije njegova aktivnost bila oko 2.3 i 25.5 puta veća u odnosu na referentno jedinjenje. Prema Raji ćelijskoj liniji svi analozi (16, 17, 13, 18, 20 i 21) su ispoljili jaču ili sličnu antiproloferativnu aktivnost od tiazofurina u svim vremenskim periodima. Najpotentnija citotoksičnost registrovana je kod analoga 17 nakon 72 h inkubacije, pri čemu se pokazalo da je ovaj analog oko 1 354 puta aktivniji od tiazofurina. Aktivnost molekula 17 nakon 24 i 48 h bila je oko 8 932, odnosno 4 049 puta veća u odnosu na tiazofurin. Prilično neočekivano, pokazalo se da analozi 17, 20 i 21 snažno inhibiraju rast PC-3 ćelija, dok su tiazofurin i analozi 18 i 19 bili potpuno neaktivni prema ovoj ćelijskoj liniji. Najjača antiproliferativna aktivnost analoga registrovana je nakon 72 h. Prema HT-29 ćelijskoj liniji samo su jedinjenja 16, 17 i 18 pokazala jaku citotoksičnost nakon inkubacije u toku 24, 48 i 72 h. IC 50 vrednosti analoga 16 i 17, registrovane nakon sva tri vremena inkubacije, bile su skoro identične odgovarajućim vrednostima tiazofurina, dok je jedinjenje 18 bilo oko 50 puta aktivnije, u svim ispitivanim vremenima,. Nasuprot tome, analozi Analozi 16, 17, 18 i 19 su bili potpuno neaktivni prema MDA-MB-231 ćelijskoj liniji, za razliku od tiazofurina koji je pokazao jaku citotoksičnost nakon sva tri vremena inkubacije (24, 48 i 72 h) sa Od novosintetisanih analoga ribo konfiguracije, samo analozi 22 i 27 su pokazala jaku citotoksičnost prema K562 ćelijskoj liniji, nakon inkubacije u toku 24, 48 i 72 h. IC 50 vrednosti analoga 22 i 27, registrovane nakon najdužeg vremena inkubacije, bile su skoro 100 i 4 puta manje od odgovarajućih vrednosti za tiazofurin, dok je analog 22 pokazao snažniju citotoksičnost, tako da je nakon 24 tj. 72 h oko 75 tj. oko 100 puta bio aktivniji od tiazofurina. Nasuprot tome, analozi 23, 24 i 26 su se pokazali potpuno neaktivnim prema K562 ćelijama. Značajniju citotoksičnost prema HL-60 ćelijama pokazala su samo analozi ribo konfiguracije 24, 26 i 27, pri čemu je analog 26 bio 9.5 puta aktivniji od tiazofurina i to samo nakon 72 h. Ostali analozi nisu bili aktivni prema ovoj ćelijskoj liniji. Analog 22 je pokazao jaku citotoksičnost, sličnu tiazofurinu u svim vremenskim intervalima prema Jurkat ćelijama. Ostali analozi su bili neaktivni. Raji ćelijska linija je bila osetljiva na delovanje pet analoga ribo knfiguracije Jedino je analog 22 pokazao značajnu citotoksičnost prema HT-29 ćelijskim linijama. Aktivnost 22 nakon 72 h bila je oko 13 puta veća u odnosu na tiazofurin. Ostali analozi nisu bili aktivni prema ovoj ćelijskoj liniji. Takođe, iz Tabele 3.1. se vidi da tiazofurin i analog 22 pokazuju snažnu citotoksičnost prema zdravim ćelijama MRC-5, dok su analozi 23, 24, 25, 26 i 27 bili neaktivni prema ovoj ćelijskoj liniji. 


  časovnog tretmana, dok je nakon 72 h taj procenat sličan kontroli i 2.4 puta je veći od vrednosti dobijenih sa tiazofurinom. Značajniju apoptozu K562 ćelija (subG1) izaziva samo jedinjenje 17 nakon 24 h i tiazofurin nakon 72 h (Slika 3.16). Formiranje subG1 pika potiče od populacije ćelija sa fragmentisanim molekulima DNK. Ovakav hipodiploidan DNK sadržaj osnovna je 


				ANALOZI TIAZOFURINA KSILO KONFIGURACIJE		
					ACIKLIČNI TIAZOLNI NUKLEOZIDI			
	karakteristika ćelija koje su ušle u apoptozu, te se populacija ovih ćelija jasno izdvaja u vidu N S O NH 2 N S O O HO S O O HO S HO S O O O NH 2 OH OH F OH AcHN H 2 N N N N NH 2 NH 2 NH 2
	subG1 pika, na jednoparametarskom histogramu ćelijskog ciklusa. 16 17			18
	K562 ćelije tretirane analozima ribo konfiguracije 22, 23, 24 i 25 u toku 24 h imaju povećan OH HO OH HO
	procenat ćelija u G0/G1 fazi, a manji u S (osim 22) i G2/M fazi u poređenju sa kontrolom. 9 12 O HO S NH 2 O O HO HO
	Međitim, analozi 26 i 27 neznatno (~1.1-4.1%), smanjuju procenat ćelija u G0/G1 fazi u poređenju i sa tiazofurinom i sa kontrolom, ne menjaju značajno procenat ćelija u S fazi, dok značajnije povećanje procenta ćelija u G2/M fazi izaziva analog 27. Izlaganje K562 ćelija analozima ribo konfiguracije tokom 72 h povećava procenat ćelija u G0/G1 fazi u odnosu na ANALOZI TIAZOFURINA ARABINO KONFIGURACIJE O HO NHAc HO N 3 HO NH 2 O H 2 N HO NH 2 NH 2 NH 2 N S O O HO N S O O HO N S O HO OH N O O HO N S O O O O CH 3 HO H 3 C NH 2 N S 19 20 21
		13				14					15
	60						60					
	50	24h					50	72h				
	40						40					
	30						30					
	20						20					
	10						10					
	0						0					
		sub G1	G0/G1	S faza	G2/M		sub G1	G0/G1	S faza	G2/M
	24h		sub G1	Kon G0/G1	TI S faza	9 G2/M	12 72h	13	sub G1	14	G0/G1	15 S faza	G2/M
		Kon	1.05	36.28	48.38	14.29		Kon	3.04		45.02	35.73	15.31
	3.4-6.5%. Nakon izlaganja K562 ćelija ovim jedinjenjima tokom 72 h,utvrđeno je da sva ispitivana jedinjenja (9, 12, 13, 14 i 15) i tiazofurin povećavaju procenat apoptotskih ćelija (sub G1 pik) uz smanjen procenat ćelija u G0/G1 u odnosu na kontrolu, dok je procenat ćelija u S fazi neznatno veći i od tiazofurina i od kontrole. Procenat ćelija u G2/M fazi za sva ispitivana 24h sub G1 G0/G1 S faza G2/M 72h sub G1 G0/G1 S faza TI 2.22 37.08 53.16 7.55 TI 24.99 35.66 33.62 5.74 G2/M Kon 1.05 36.28 48.38 14.29 Kon 3.04 45.02 35.73 16 2.17 40.77 45.86 11.36 16 2.02 44.12 41.04 13.60 15.31 TI 2.22 37.08 53.16 7.55 TI 24.99 35.66 33.62 17 9.86 36.33 49.51 4.48 17 1.92 43.62 41.90 13.32 5.74 9 2.67 39.04 50.60 7.74 9 7.81 40.31 38.91 18 3.88 55.66 35.76 4.72 18 12.88 40.77 33.25 13.88 13.70 12 2.70 39.28 51.13 7.24 12 7.77 38.30 39.15 19 2.41 38.36 51.28 8.50 19 13.72 42.24 33.24 11.70 15.47 13 2.11 33.68 47.01 17.70 13 13.49 39.24 36.48 20 2.23 35.76 53.08 9.81 20 14.52 44.11 32.04 9.35 11.77 14 2.33 29.89 47.71 20.87 14 13.62 37.73 35.23 13.63 21 2.71 37.32 51.76 9.19 21 13.54 46.22 30.36 9.99
	15 jedinjenja, osim tiazofurina, sličan je kontroli. (Slika 3.15) 2.59 36.68 52.44 9.11 15 Slika 3.16. Uticaj tiazofurina i analoga na ćelijski ciklus K562 ćelija primenom protočne citometrije; analozi 17.17 38.15 34.39 10.85
	Među analozima ksilo konfiguracije, nakon 24-časovnog tretmana K562 ćelija samo je jedinjenje Slika 3.15. Uticaj tiazofurina i analoga na ćelijski ciklus K562 ćelija primenom protočne citometrije; aciklični tiazofurina ksilo konfiguracije (jedinjenja 16-21)
	18 značajnije uticalo na ćelijski ciklus: procenat ćelija u G0/G1 fazi povećan je za ~1.5 puta a u tiazolni nukleozidi (9, 12); analozi tiazofurina arabino konfiguracije (13, 14, 15)
	S fazi je smanjen za ~ 1.5-1.3 puta u poređenju sa tiazofurinom i kontrolom. Sličan odgovor

dobijen je i nakon 72-časovnog tretmana. Sva jedinjenja ksilo konfiguracije smanjuju procenat ćelija u G2/M fazi, a posebno nizak procenat daju 17 i 18 u poređenju sa tiazofurinom nakon 24-tiazofurin dok je gotovo isti u odnosu na kontrolu. Procenat ćelija u S fazi je sličan vrednostima dobijenim za tiazofurin a neznatno je niži (~1%) od kontrole. Procenat ćelija u G2/M fazi je podjednak za sva ispitivana jedinjenja, sličan je vrednostima dobijenim nakon 24-časovnog tretmana, ali je ~2 puta veći u poređenju sa tiazofurinom. Procenat apoptotskih ćelija (sub-G1 pik) manji je u prva 24 h u odnosu na 72 h za sva ispitivana jednjenja, dok tiazofurin izaziva značajnu apoptozu samo posle 72 h (24.99%). (Slika 3.17) Na osnovu dobijenih rezultata možemo zaključiti da analozi tiazofurina dovode do promena u distribuciji ćelija po fazama ćelijskog ciklusa. Promene u fazama ćelijskog ciklusa K562 ćelija zavise od tipa jedinjenja, kao i od vremena izloženosti ćelija jedinjenjima, odnosno dužini tretmana. 
Ispitivanje uticaja novosintetisanih analoga tiazofurna na ćelijske signalne molekule koji su uključeni u apoptotsku kaskadu

  perioda (29.00% za 24 h I 50.41% za 72 h). Jedino je analog 17 izazvao veći procenat specifične apoptoze nakon 24 h, dok je posle 72 h procenat specifične apoptoze bio 2,7 puta manji. Jedinjenja 14, 26, 27 pokazuju najveće smanjenje ekspresije Bcl-2 proteina u oba ispitivana vremena. Razni hemoterapeutici indukuju apoptozu koja se ispoljava značajnom ekspresijom Bax proteina. Međutim, u našim eksperimentima analozi tiazofurina 9, 12-27 nisu bitno uticali na ekspresiju Bax proteina nakon 24 h. Takođe je potvrđeno da apoptoza u raznim humanim solidnim tumorima može biti izazvana i u odsustvu bilo kakvih promena u nivou Bax proteina. 


	3.5.3. U cilju definisanja antitumorske aktivnosti sintetizovanih analoga na molekulskom nivou, a radi
	Procenat specifične nekroze raste s produženjem vremena inkubacije (Slika 3.19). Procenat otkrivanja molekulskih signalnih puteva preko kojih se ispoljava, ispitivan je njihov uticaj na
	specifične nekroze nakon 72 h za analoge 19, 21 i 23 je između 20% i 25%, dok je za ostale ekspresiju proteina koji se nalaze uzvodno i nizvodno u signalnoj kaskadi ćelijske proliferacije,
	analoge bio nešto niži (6-18%). diferencijacije i apoptoze. Efekat ispitivanih jedinjenja na promenu nivoa pro-apoptotskih i anti-
	apoptotskih proteina u tretiranim ćelijama, utvrđivan je semi-kvantitativnom Western blot
	60 metodom. 24h	72h			
	50 Da bismo objasnili mehanizme apoptoze indukovane analozima tiazofurina 9, 12-27 koji su
	40 dobijeni u našim laboratorijama, ispitivali smo kako ova jedinjenja menjaju ekspresiju Bcl-2,
	Bax, kaspaze 3 i Poli (ADP-riboze) polimeraze (PARP) koji su uključeni u kritične faze
	30 apoptotskog puta. Članovi Bcl-2 familije proteina ključni su regulatori apoptoze. Apoptoza
	20 zavisi od balansa između pro-i antiapoptotskih proteina Bcl-2 familije. Antiapoptotski član Bcl-
	2 ima ključnu ulogu u apoptozi, jer sprečavajući indukciju apoptoze izaziva rezistenciju
	10 tumorskih ćelija na lek. 119-122		
	0				
	-10				
	TI	9 12	13 14 15	16 17 18 19 20 21	22 23 24 25 26 27
	30 Radi utvrđivanja uticaja novosintetizovanih analoga tiazofurina i tiazofurina na ekspresiju 24h 72h
	25 proteina Bcl-2 i Bax u tretiranoj K562 ćelijskoj liniji, supstance su primenjene u odgovarajućoj
	20 IC 50 koncentraciji, a ćelije su inkubirane u toku 24 h, odnosno 72 h.	
	Western blot analiza ispitivanih analoga 9 i 12-27 (Slika 3.20.a-3.22.a i 3.20.b-3.22.b.) pokazuje
	15 da nakon 24-časovnog tretmana neki analozi (12, 14, 20, 21, 26 i 27) smanjuju ekspresiju Bcl-2
	10 u odnosu na kontrolu (netretirane ćelije) i tiazofurin, dok analozi 9, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23,
	24 i 25 neznatno povećavaju ukupnu količinu Bcl-2 proteina u odnosu na kontrolu, a znatno više
	5 u odnosu na tiazofurin. Nakon 72 h ispitivani analozi 14 i 27 smanjuju ekspresiju
	0 antiapoptotskog Bcl-2 proteina u odnosu na kontrolu i tiazofurin, dok analozi 13, 18, 25 i 26
	-5 neznatno povećavaju ukupnu količinu Bcl-2 proteina u odnosu na kontrolu. U odnosu na
	TI	9 12	13 14 15	16 17 18 19 20 21	22 23 24 25 26 27

13, 19, 20, 21, 22 I 27), tri (9, 12, 25n, 16, 23, 24, I 26), četiri (25) ili pet (18) puta veći u poređenju sa vrednostima dobijenim za 24 h. Jedinjenje 22 izaziva najveću specifičnu apoptozu u oba ispitivana vremenska Slika 3.18. Procenat specifične apoptoze Slika 3.19. Procenat specifične nekroze 3.5.3.1. Uticaj analoga na rane događaje u apoptozi Bax, proapoptotski protein Bcl-2 porodice, prolazi konformacione promene kao odgovor na apoptotski stimulans, i na taj način se suprotstavlja aktivnosti Bcl-2, stimulišući oslobađanje citohroma c (CytC) i drugih apoptogenih proteina u citoplazmu, nastavljajući proces apoptoze. tiazofurin, ekspresija Bcl-2 je približno ista, osim za analoge 13, 14, 17, 18, 22, 25, 26 i 27 gde je niža. 


  164 potvrđuju i naši rezultati.Naime, pokazali smo da analozi 19, 21 i 23 imaju ovakvu dvostruku funkciju u izazivanju kako apoptoze, tako i nekroze u tretiranim ćelijama.Mada su apoptotski putevi oduvek bili željeni cilj prilikom sinteze, karakterizacije i razvoja novih onko terapeutika, u novije vreme se sve više izučava selektivna prednost nekroze u sprečavanju progresije tumora.Poznato je da se tumorske ćelije karakterišu nakupljanjem velike količine genomskih mutacija,164a posledica toga su česte strukturno funkcionalne promene u proteinima koji su ili integralni deo mitohondrijalnog apoptotskog puta ili tumor-supresori koji utiču na uzvodne apoptotske događaje.Ovakve genomske promene često finalno vode rezistenciji ćelija na ustanovljene antitumorske lekove, koji deluju putem apoptotskih mehanizama.U ovim slučajevima nekroza može biti alternativni mehanizam zaustavljanja proliferacije tumorskih ćelija.Neki autori čak spekulišu da bi supstance koje izazivaju nekrozu mogle imati širi spektar pozitivnih hemioterapeutskih aktivnosti s obzirom na to da ne zavise od aktivnosti gena koji kontrolišu apoptotski odgovor.165- 168 



4.1. Hemijski deo

  13m vrednostima uz tetrametilsilan kao interni standard.Protonski NMR Spektri su asignirani metodom homo-dekuplovanja, odnosno 2D COSY tehnikom.13C NMR Spektri su asignirani metodom selektivnog dekuplovanja. CI Maseni Spektri snimljeni su na Finningan-MAT 8230 spektrometru uz izobutan kao reagens gas. Tok reakcija je praćen tankoslojnom hromatografijom na aluminijumskim folijama Kieselgel 60 F 254 (Merck). Hromatogrami su izazivani sa 50%-nom H 2 SO 4 uz naknadno zagrevanje na 120ºC. Fleš hromatografija je urađena na kolonama Kieselgel 60 (0.040-0.063, E. Merck). Ekstrakti su sušeni anhidrovanim Na 2 SO 4 . 


	Opšte metode -Tačke topljenja su određene na aparatu Büchi 510 i nisu korigovane. Vrednosti
	optičke rotacije su izmerene na automatskim polarimetrima P 3002 (Krüss) i Polamat A (Zeiss,
	Jena) na sobnoj temperaturi. IR Spektri su snimljeni na spektrofotometrima Specord 75 IR
	(Zeiss, Jena) i Nexus 670 (ThermoNicolet, detektor DTGS), a položaj traka je dat u cm -1 . NMR
	Spektri su smimljeni na instrumentu Bruker AC 250 E, a hemijska pomeranja (-skala) su
	izražena u Organski rastvarači su uparavani na rotacionom vakuum uparivaču pri temperaturama vodenog
	kupatila do 40ºC.

4. 
1.1. Dietilditioacetal D-arabinoze (2)

  TOF M-Spektar: m/e 452.11606 (M+H) + . Izračunato za C 24 H 22 NO 6 S: 452.11623. eluiranje sa silikagela EtOAc/i-PrOH 1:1) pri čemu se dobija čist proizvod 12 (0.012 g; 71%) u obliku belih kristala, [] D -46.25 (c 0.192; CH 3 OH), R f =0.37 (CHCl 3 /MeOH 5:1). TOF M-Spektar: m/e 217.06344 (M+H) + . Izračunato za C 8 H 13 N 2 O 3 S: 217.06414. Ćelije su gajene u različitim medijumima u zavisnosti od linije kojoj pripadaju. U Tabeli 4.1. su prikazane korišćene ćelijske linije i odgovarajući medijumi za gajenje. 


	pri čemu se dobija čist proizvod 8 (0.0788 g; 46.86% u odnosu na jedinjenje 6) u obliku
	bezbojnog ulja, [] D -21.87 (c 0.798; CHCl 3 ), R f =0.38 (toluen/EtOAc 9:1).
	IR (film): ν max 1722 (C=O, estar).		
	4.2. Biomedicinski deo		
	4.1.8. (E),(S)-2-(3,4-dihidroksi-but-1-enil)tiazol-4-karboksamida (9) 4.2.1. Održavanje ćelijskih kultura
	Rastvor jedinjenja 8 (0.0681 g; 0.1508 mmol) u zasićenom metanolnom rastvoru amonijaka (5
	mL) ostavi se na sobnoj temperaturi u toku 6 dana, a zatim upari. Ostatak nakon uparavanja
	rastvarača se prečisti preparativnom tankoslojnom hromatografijom (EtOAc/i-PrOH 8:2; Tabela 4.1. Uslovi održavanja i presađivanja ćelijskih linija
	eluiranje sa silikagela EtOAc/i-PrOH 1:1) pri čemu se dobija čist proizvod 9 (0.0280 g; 86.69%) Naziv linije Održavanje Presađivanje
	u obliku žutog ulja, [] D -3.82 (c 1.02; CH 3 OH), R f =0.40 (EtOAc/i-PrOH 8:2).. ATCC CCL 243
	K562 TOF M-Spektar: m/e 237.03173 (M+Na) + . Izračunato za C 8 H 10 N 2 NaO 3 S: 237.03043. Humana hronična mijelogena leukemija
	ATCC CCL 240		
	HL-60 Humana promijelocitna leukemija ATCC CCL 1435 Jurkat	RPMI 1640 + 2 mM glutamina + 10% FTS	2 puta nedeljno; 5-10 x10 4 /ml
	Humana leukemija-T ćelija		
	ATCC CCL 86 Jedinjenje 8 (0.1349 g; 0.298 mmol) se rastvori u 96% etanolu (7 mL) i hidrogenuje u prisustvu Raji
	10% Pd/C (0.020 g) pri normalnom pritisku vodonika, na sobnoj temperaturi, u toku 24 h. Pošto Humani Burkittov limfom
	ATCC CRL 1438 reakcija nije ni krenula (snimljena je TLC) nastavljena je uz dodatak sveže količine katalizatora PC-3 (0.045 g) u toku dodatnih 48 časova. Suspenzija se procedi kroz celit, talog ispere sa EtOH i Humani adenokarcinom prostate
	upari. Ostatak nakon uparavanja rastvarača se prečisti preparativnom tankoslojnom ATCC HTB 38
	Rastvoru D-arabinoze (10 g; 66.75 mmol) u koncentrovanoj HCl (8.5 mL) doda se etilmerkaptan HT-29 hromatografijom (toluen/EtOAc 9:1; eluiranje sa silikagela CH 2 Cl 2 /EtOAc 1:1) pri čemu se Humani karcinom
	(10 mL). Ovako pripremljena reakciona smeša meša se na ledenom kupatilu, sve dok se ne pojave kristali. Posle toga, reakciona smeša se ostavi u kupatilu sa ledom i soli u toku narednih kolona dobija čist proizvod 10 (0.0734 g; 54.20%) u obliku bezbojnog ulja, [] D -24.15 (c 0.39; ATCC HTB 22 CHCl 3 ), R f =0.29 (toluen/EtOAc 9:1) i jedinjenje 11 (0.0196 g; 30.75%) takođe u obliku MCF-7
	pola časa. Kristali se odvoje filtracijom, isperu ledenom vodom i brzo se prekristališu iz toplog rastvora NaHCO 3 . Izdvojeni kristali se filtruju, isperu s ledenom vodom, apsolutnim alkoholom i 2 puta nedeljno; Humani karcinom dojke ER+ bezbojnog ulja R f =0.40 (toluen/EtOAc 9:1). DMEM + 2 mM 2-5 x10 4 /mL ATCC HTB 26 TOF M-Spektar za jedinjenje 10: m/e 454.13198 (M+H) + . Izračunato za C 24 H 24 NO 6 S: glutamina + 10% FTS 0.05% tripsin u 0.1% MDA-MB-231
	454.13188. Humani karcinom dojke ER-etrom, pri čemu se dobija čist proizvod 2 (6.1 g; 40.31%) u vidu belih kristala, tt 126ºC (lit 32 EDTA-PBS ATCC CCL 2
	126ºC). HeLa		
	NAPOMENA: Ogled se izvodi u digestoru sa dobrom ventilacijom, a zaostali etilmerkaptan (u Humani karcinom grlića materice 4.1.10. (S)-2-(3,4-dihidroksi-butil)tiazol-4-karboksamid (12) ATCC HTB 140
	Hs 294T filtratu) se uništava viškom hlornog kreča. Humani melanom		
	ATCC CCL 171		
	MRC-5		
	Humani fibroblasti pluća		

4.1.9.(S)-Etil-2-(3,4-dibenzoiloksi-butil)tiazol-4-karboksilat (10) i etil-2-(butil)tiazol-4-karboksilat (11)Rastvor jedinjenja 10 (0.0354 g; 0.0784 mmol) u zasićenom metanolnom rastvoru amonijaka (5 mL) ostavi se na sobnoj temperaturi u toku 16 dana, a zatim upari. Ostatak nakon uparavanja rastvarača se prečisti preparativnom tankoslojnom hromatografijom (CHCl 3 /MeOH 5:1; 
2D COSY 1 H NMR-Spektar jedinjenja 4 (CDCl 3 )

  , 128.37, 128.43, 128.51, 128.58, 128.68, 128.81, 128.85, 129.26, 129.49,129.71, 129.83, 129.99, 133.26, 133.61, 133.81, 133.96 (Ar-C) 165.09, 165.39 i 165.96 (4C=O iz 4Bz) 194.31 (C=O ) J 5a,5b = 12.3 Hz, J 4, 5a = 5.0 Hz, H-5a ) 4.97 (dd, 1H, J 5a,5b = 12.5 Hz, J 4, 5b = 3.5 Hz, H-5b ) 6.03 (m, 1H, H-4) 6.14 (d, 1H, J 2,3 = 4.2 Hz, H-2) 6.28 (dd, 1H, J 2,3 = 4.3 Hz, J 3,4 =7.2 Hz, H-3) 7.40-8.20 (m, 20H, Ar-H) 


		C	O H
	BzO		OBz 1	CN
			OBz BzO	2
		CH 2 OBz O 3 C H 4	OBz OBz
	Asignacija [, ppm]: 62.47 (C-5) 69.03 (C-3) 69.34 (C-4) 76.45 (C-2) Asignacija [, ppm]: 124.49BzO 4.65 (dd, 1H,	OBz OBz 5 CH 2 OBz CH 2 OBz

, 12, 14-16, 18-21, 23-27, prema

  115u je ostvarena sinteza novih acikličnih tiazolnih C-nukleozida sa dvostrukom vezom i 2',3'dideoksi funkcijom u acikličnoj šećernoj komponenti, koja je zasnovana na D-arabinozi kao hiralnom prekursoru.Višefazna sinteza acikličnih analoga tiazofurina 9 i 12, polazi od dietilditioacetal D-arabinoze 2 (Shema 3.1.),izkojegjedaljimhemijskimpromenama prisutnih supstituenata dobijena tetra-Obenzoil-aldehido-D-arabinoza (4), koja zbog slobodne aldehidne grupe pogoduje za finalno uvođenje heterocikličnog prstena (Shema 3.2.).Konverzija aldehida 4 u odgovarajući oksimino derivat 5 ostvarena je reakcijom jedinjenja 4 sa hidroksilamin-hidrohloridom i natrijum-acetatom u etanolu na sobnoj temperaturi.Pri tome je dobijena smesa E i Z-oksima 5, koji su nakon hromatografskog prečišćavanja izolovani u prinosu od 35.91%.Dehidratacija smese oksima ostvarena je sa metansulfonil-hloridom u apsolutnom piridinu (-15C, 0.5 h; zatim st, 2 h).Na taj način je dobijen odgovarajući aldono-nitril 6 u prinosu od 81.76% (Shema 3.2.).etapa rada, koja obuhvata reakcije za izgradnju tiazolnog prstena, ostvarena je primenom metodologije koju su razradili Liang et al.Tokom ove reakcije odigrava se i uvođenje dvostruke veze u aciklični fragment molekule nakon eliminacije dve benzoatne grupe.Oksidacijom tiazolina 7 sa BrCCl 3 u apsolutnom metilenhloridu, na 4C u toku 17 časova, nastao je (E),(S)-Etil-2-(3,4-dibenzoiloksi-but-1-enil)tiazol-4-karboksilat (8) u prinosu od 46.86% u odnosu na 6 (računato na dve sintetičke faze).Dejstvom metanolnog rastvora amonijaka na jedinjenje 8 (sobna temperatura, 6 dana), ostvarena je amonoliza svih estarskih grupa, pri čemu je dobijen slobodni C-nukleozid 9 u prinosu od 86.69% (Shema 3.3.).Katalitičkim hidrogenovanjem jedinjenja 8 (H 2 , Pd/C, st) ostvarena je redukcija dvostruke veze u acikličnom delu molekule, pri čemu je dobijen tiazolni derivat 10 u prinosu od 54.20% (Shema3.6.).Dejstvom metanolnog rastvora amonijaka na jedinjenje 10 (sobna temperatura,16 dana), ostvarena je amonoliza svih estarskih grupa, pri čemu je dobijen slobodni C-nukleozid 12 u prinosu od 71.0% (Shema 3.6.).U drugom delu rada ispitivana je antiproliferativna aktivnost novosintetizovanih nukleozida 9 i 12, kao i petnaest analoga tiazofurina 13-27, pomoću MTT testa,115prema ćelijskim linijama odabranih humanih leukemija (K562, HL-60, Jurkat), Burkitovog limfoma (Raji), solidnih humanih tumora (HT-29, MCF-7, MDA-MB-231 i HeLa), odnosno prema ćelijama normalnih humanih fibroblasta pluća (MRC-5). Tiazofurin je korišćen kao referentno jedinjenje, a citotoksičnost je izražena kao IC 50 vrednost (Tabela 3.1.). Uopšteno, na osnovu dobijenih rezultata proizilazi da novosintetizovani analog 9 ispoljava snažnu antiproliferativnu aktivnost prema K562, HL60, MCF-7 i HeLa ćelijskim linijama, dok analog 12 pokazuje snažnu citotoksičnu aktivnost prema K562, Jurkat, MCF-7 i HeLa malignim ćelijama. Kao najosetljivija ćelijska linija, na osnovu IC 50 vrednosti, prema svim ispitivanim analozima se pokazala K562. Analozi ksilo konfiguracije (18, 19, 20 i 21) su značajno inhibirali rast HeLa ćelija tokom sva tri ispitivana vremena. Takođe, iz Tabele 3.1. se vidi da novosintetizovani analozi pokazuju nižu citotoksičnost prema zdravim ćelijama MRC-5 u odnosu na referentno jedinjenje. Najslabiju aktivnost (preko 100 puta) ispoljio je analog 17 u sva tri ispitivana vremena, dok je molekul 13 pokazao 8-12 puta slabiju citotoksičnost od tiazofurina, tokom sva tri ispitivana vremena. Jedino ja analog 22 bio aktivniji od referentnog molekula tokom sva tri ispitivana vremena. Iako ovaj rezultat ukazuje na potencijalnu selektivnost analoga, 9 


	21 -72h		6.	ZAKLJUČAK	
		Apoptoza Apoptoza			Ćelijski ciklus Ćelijski ciklus
	Quad* % Gated Quad* % Gated	Opis Opis		Marker Marker	% Gated % Gated	Faza Faza
	UL UL	6.87 25.12	Nekroza Nekroza		M1 M1	38.03 46.12	G0/G1 G0/G1
	UR UR	6.68 12.31	Kasna apoptoza Kasna apoptoza	M2 M2	51.08 30.36	S S
	LL LL	76.88 49.96	Žive ćelije Žive ćelije	M3 M3	8.50 9.99	G2/M G2/M
	LR LR	9.58 12.62	Rana apoptoza Rana apoptoza	M4 M4	2.41 13.54	sub G1 sub G1
	20 -24h 22 -72h Naredna					
		Apoptoza Apoptoza			Ćelijski ciklus Ćelijski ciklus
	Quad* % Gated Quad* % Gated	Opis Opis		Marker Marker	% Gated % Gated	Faza Faza
	UL UL	12.45 7.35	Nekroza Nekroza		M1 M1	35.68 44.11	G0/G1 G0/G1
	UR UR	5.28 80.99	Kasna apoptoza Kasna apoptoza	M2 M2	53.08 34.12	S S
	LL LL	74.43 3.74	Žive ćelije Žive ćelije	M3 M3	9.01 10.50	G2/M G2/M
	LR LR	7.85 7.935	Rana apoptoza Rana apoptoza	M4 M4	2.23 11.29	sub G1 sub G1

1088Reakcijom jedinjenja 6 sa hidrohloridom etilestra L-cisteina u prisustvu trietilamina (apsolutni MeOH; sobna temperatura; 2 časa) dobija se smesa C-4 epimernih tiazolina 7 (Shema 3.3.). malignim ćelijama, radi utvrđivanja njihovog potencijala kao selektivnog antitumorskog agensa neophodna su dodatna ispitivanja na većem broju zdravih ćelija. 
Pri koncentraciji od 0.01 µM tiazofurin inhibira rast ćelija za 22%, dok se pri dejstvu analoga, 

27.67 29.64 33.58 35.47 45.31 

H NMR-Spektar 

MHz jedinjenja 3 (CDCl 3 )BzO 

H NMR-Spektar 

MHz jedinjenja 4 (CDCl 3 ) 

H NMR-Spektar 

MHz jedinjenja 6 (CDCl 3 ) 

V(%) = (N 0 /N 0 +M 0 ) x 100 gde je M 0 = broj mrtvih ćelija izbrojan po kvadratu komore hemocitometra. 
Vijabilnost ćelija korišćenih u eksperimentu je bila veća od 90%. 

Kolorimetrijski MTT test

Ćelije su sakupljene u logaritamskoj fazi rasta, istaložene centrifugiranjem (10 min / 200 x g) i izbrojane u 0,1% tripan plavom. Vijabilne ćelije su posejane u kvadriplikatu u mikrotitar ploče sa 96 otvora, tako da je u 90 l medijuma bilo 10 4 (K562, HL-60, Jurkat i Raji) ili 5 x 10 3 (PC-3, HT-29, MCF-7, MDA-MB-231, HeLa, Hs 294T i MRC-5) ćelija. Ploče sa zasejanim ćelijama ostavljene su u termostat na 37 o C, sa 5% CO 2 naredna 24 časa. Po isteku inkubacije u sve otvore osim kontrolnih (ćelije u medijumu), dodato je po 10 L ispitivane supstance odgovarajuće koncentracije i inkubacija je nastavljena pod istim uslovima u toku 24, 48 ili 72 h. Rastvor MTT, pripremljen neposredno pre dodavanja, dodat je u sve otvore na ploči u zapremini od 10 l /otvoru i inkubacija je nastavljena naredna 3 h (u termostatu na 37 °C, sa 5% CO 2 ). Po isteku 3 h u svaki otvor je dodato po 100 l 0.04 mol/l HCl u izopropanolu. Apsorbancija je očitavana odmah po isteku inkubacije na čitaču za mikrotitar ploče (Multiscan, MCC/340) na test talasnoj dužini od 540 nm i referentnoj talasnoj dužini od 690 nm. Otvori na ploči koji su sadržavali samo medijum i MTT, ali ne i ćelije, služili su kao slepa proba ("blank"). 
Citotoksičnost je izražena procentom prema formuli: CI = (1-A s /A k ) 100, pri čemu je A k apsorbancija kontrolnih uzoraka, a A s apsorbancija uzoraka sa ispitivanom supstancijom. 

Kontrola kvaliteta pri izvođenju testa:

Vijabilnost posađenih ćelija je bila veća od 90%, određena testom sa tripan plavim (DET); ćelije su korišćene u logaritamskoj fazi rasta i u koncentraciji koja je obezbeđivala logaritamski rast ćelija tokom trajanja testa (za adherentne ćelije je bilo 5 x 10 3 /otvoru, a za K562 10 4 /otvoru); Koeficijent varijacije (CV) u eksperimentalnim i kontrolnim kulturama bio je manji od 15%, a za većinu naših eksperimenata je bio manji od 10%. Apsorbancija (A) kontrole (ćelije u medijumu) bila je najmanje tri puta veća od srednje vrednosti A za slepu probu (medijum). 
Asignacija [, ppm]: 4.30 (d, 1H, J 2,3 = 7.0 Hz, H-1) 4.61 (dd, 1H, J 5a,5b = 12.2 Hz, J 4,5a = 6.6 Hz, H-5a ) 4.88(dd, 1H, J 5a,5b = 12.2 Hz, J 4,5b = 3.3 Hz, H-5b) 5.92 (m, 2H, H-2 i H-4) 6.45 (dd, 1H, J 4,5a = 5.1 Hz, J 4,5b = 3.1 Hz, J 3,4 = 8.0 Hz, H-3) 6.27 (dd, 1H, J = 3.7 Hz, J = 6.0 Hz, H-3) 7.38-8.18 (m, 20H, Ar-H) 

MHz 13 C NMR-Spektar jedinjenja 3 (CDCl 3 )