Volumen 65, Broj 12

Keywords: jetra, mikrocirkulacija, ishemija, povreda, reperfuziona, endotel, patologija liver, microcirculation, ischemia, reperfusion injury, endothelium, pathology

Klinički centar, *Hirurška klinika, † Klinika za endokrinologiju, dijabetes i bolesti metabolizma, ‡ Klinika za plastičnu i rekonstruktivnu hirurgiju, Niš 

Značaj u hirurgiji jetre

Ograničavanje perioda ishemije, odnosno vaskularna izolacija jetre, neophodan je postupak prilikom izvođenja većine hirurških procedura na jetri, naročito tokom operativnog lečenja ekstenzivne traume jetre, resekcije velikih (intra)hepatičkih tumorskih lezija i transplantacije jetre. Iako je blagovremena reoksigenacija tkiva ključna za očuvanje funkcijskog kapaciteta jetre i prevenciju postoperativne hepatičke insuficijencije, nakon ponovnog uspostavljanja dotoka krvi u jetru, odnosno reperfuzije, jetra je izložena dodatnom ošećenju koje pogoršava već postojeću ishemijsku leziju 2 . Stoga, I/R oštećenje hepatocita značajno vremenski ograničava bezbednu upotrebu vaskularne izolacije jetre tokom resekcionih zahvata. Stepen oštećenja hepatocita, nastalog usled I/R, zavisi delom od primarne lezije tokom ishemije, delom od sekundarnog oštećenja tokom reperfuzije, ali i od prethodnog strukturno funkcijskog stanja parenhima jetre i opšteg stanja bolesnika. S druge strane, postoje i stavovi da period reperfuzije nema izolovani, autonomni patogenetski značaj, tj. ne dovodi do ćelijskog oštećenja nezavisno od ishemije, već predstavlja samo nastavak prethodno započete inicijalne ishemijske lezije 3 . Pored lokalnog, parenhimskog oštećenja jetre, produžena ishemija i sledstvena reperfuzija jetre tokom resekcionih procedura dovode i do značajne sistemske organske disfunkcije, odnosno lezije udaljenih organa 4 . Sistemski efekti I/R jetre manifestuju se kao sindrom sistemskog inflamacijskog odgovora organizma (SIRS) i sindrom multiple organske disfunkcije (MODS) i, po pravilu, kritični su i, neretko, fatalni. 
Pored ovoga, I/R oštećenje tokom transplantacije jetre jedan je od osnovnih uzroka primarne disfunkcije grafta, jedne od najozbiljnijih komplikacija kao i faktora morbiditeta i mortaliteta nakon ortotopske transplantacije jetre, za koju, sem retransplantacije, ne postoji efikasno lečenje 5,6 . Mehanizam I/R oštećenja u osnovi primarne disfunkcije humanog hepatičkog alografta nije u potpunosti razjašnjen, ali je utvrđeno da važnu ulogu ima aktivacija Kupferovih ćelija i gubitak vitalnosti sinusoidnih endotelnih ćelija nakon čuvanja na hladnom i reperfuzije grafta jetre 7 . 
Incidencija primarne disfunkcije transplantovanog grafta jetre kreće se 2-23% i raste proporcionalno vremenu hladne ishemije grafta jetre (cold ischemia storage time) 5,8 . Smatra se da je I/R oštećenje grafta jetre tokom transplantacije osnovni etiološki faktor rane disfunkcije grafta kod oko 10% bolesnika, kao i da dovodi do povećane incidencije epizoda i akutnog i hroničnog odbacivanja grafta 9 . Pored trajanja hladne ishemije jetre, osetljivost grafta jetre na I/R oštećenje zavisi i od drugih osobina donora (steatozna donorska jetra, ishemija donorske jetre usled hipotenzije, funkcijsko oštećenje donorske jetre izazvano lekovima, druge previđene bolesti donorske jetre itd) i operativnih faktora (neadekvatna Radojković M, et al. Vojnosanit Pregl 2008; 65(12): 913-918. operativna tehnika, redukovani portni i/ili hepatički arterijski dotok (inflow) krvi u jetru nakon završene transplantacije, produženo trajanje hladne i tople ishemije transplantovanog grafta jetre, itd). 
U određenim okolnostima I/R oštećenje jetre ne predstavlja isključivo otežavajuću okolnost za hirurga koji se bavi patologijom jetre. Pokazalo se da je radiofrekventna ablacija malignoma jetre koji nisu pogodni za operaciju mnogo efikasnija kada se sprovodi uz korišćenje Pringleovog manevra 10 . Iako se to pripisuje smanjenom gubitku (odavanju) toplote, izraženi inflamacijski odgovor tokom perioda reperfuzije definitivno doprinosi promociji nekroze tumora. 

Patogenetski značaj mikrocirkulacijskih poremećaja u ishemijsko-reperfuzijskom oštećenju jetre

Važna uloga odložene hepatičke mikrocirkulacijske perfuzijske insuficijencije do koje dolazi tokom ishemije, a naročito reperfuzije dobro je dokumentovana (tabela 1) [11][12][13] . 
Utvrđeno je da je intenzitet mikrocirkulacijskih poremećaja u jetri proporcionalan trajanju perioda ishemije 11,12 . Nastanak mikrocirkulacijskog oštećenja objašnjava se akumulacijom i adhezijom neutrofila i trombocita u hepatičkim sinusoidima, što dovodi do opstrukcije njihovog lumena. Ovaj alternativni mehanizam oštećenja jetre tokom I/R označava se kao fenomen izostanka reperfuzije (fenomen no-reflow). Postoje i dokazi koji ukazuju na to da začepljenje lumena sinusoida nije odgovorno za hepatičku I/R leziju. Utvrđeno je da neutrofili zaustavljeni u hepatičkim sinusoidama ne utiču na prekid sinusoidne perfuzije, tj. da je protok krvi kroz sinusoide ispunjene stagnantnim neutrofilima usporen, ali ne i zaustavljen 14, 15 . Smatra se da je verovatniji uzrok oštećenja hepatičke mikrocirkulacije povećano stvaranje vazokonstriktora i vazodilatatora i potencijalno izmenjena vaskularna osetljivost (sinusoida) jetre usled I/R i/ili inflamacije, što vodi lokalnom mikrocirkulacijskom perfuzijskom disbalansu i ishemijskom oštećenju 16 . U prilog takvom objašnjenju govori i dokazan korisni protektivni efekat različitih vazodilatatornih supstancija (NO, mizoprostol, itd), odnosno štetno delovanje vazokonstriktora (endotelin 1 -ET-1, tromboksan itd) tokom I/R. 

Patofiziologija mikrocirkulacijskih poremećaja

Mikrocirkulacijski poremećaji tokom I/R jetre u najvećoj meri posledica su promena u endotelnim ćelijama koje se manifestuju poremećajima permeabilnosti, ekspresije citokina i adhezivnih molekula i mikrovaskularnog tonusa, pokretanjem inflamacijske i koagulacijske kaskade i konačnom kapilarnom okluzijom (fenomen no-reflow). Akumulacija leukocita dodatno ugrožava integritet endotelne barijere i povećava oksidativni stres, što dovodi do hiperpermeabiliteta i edema tkiva. 
Azot-oksid i endotelin 1. Do disrupcije protoka krvi kroz hepatičke sinusoide dolazi usled kontrakcije zvezdastih (stelatnih) ćelija. S obzirom da ET-1 izaziva kontrakciju stelatnih ćelija zaključeno je da I/R oštećenje nastaje kao rezultat disbalansa između nivoa dva vazoaktivna antagonista: vazokonstriktora ET-1 i vazodilatatora azot-oksida (NO) 17 . Azot-oksid ima značajnu vazodilatatornu ulogu u mikrocirkulaciji i I/R oštećenju organa. Nastaje iz L-arginina delovanjem NO sintaze (NOS) koja u tkivima postoji kao inducibilna NOS (iNOS) i u konstitutivnim formama, kao što su endotelna NOS (eNOS) i neuronska NOS (nNOS) 18 . Azotoksid ima različite funkcije uključujući i inhibiciju adhezije leukocita za endotelne ćelije sinusoida putem supresije adhezivnih molekula, inhibiciju agregacije trombocita, regulaciju mikrocirkulacije (vazodilataciju sinusoida) i inhibiciju kaspazne aktivnosti u prevenciji apoptoze 19,20 . 
U ranoj fazi reperfuzije jetre koncentracija ET-1 raste i u plazmi i u hepatičkom parenhimu, što je povezano sa redukcijom protoka krvi kroz jetru 21,22 . S druge strane, koncentracija NO niska je tokom prvih nekoliko časova reperfuzije, što je rezultat niskih intracelularnih nivoa nikotinamid adenin dinukleotid fosfata (NADPH) i kiseonika nakon perioda ishemije i oslobađanja velike količine arginaze koja razlaže L-arginin (prekursor neophodan za sintezu NO), što dovodi do deplecije L-arginina koja maksimum dostiže oko 30 minuta nakon početka reperfuzije 23,24 . Utvrđeno je da aktivacija NOS (npr. tetrahidrobiopterinom, važnim koenzimom NOS) i povećanje ekspresije iNOS i eNOS dovodi do ublažavanja I/R oštećenja jetre 25,26 . Smatra se da NO produkovan delovanjem eNOS ima hepatoprotektivna svojstva [27][28][29] . Hepatoprotektivno dejstvo aktivacije eNOS u I/R oštećenju nas-Tabela 1 Mikrocirkulacijski poremećaji u tkivu jetre 13 taje posredstvom različitih mehanizama koji uključuju verovatnu vazodilataciju i redukovanu infiltraciju makrofagima 30 . Za razliku od eNOS, uloga iNOS još uvek je kontroverzna. Rezultati nekih studija ukazuju da aktivacija iNOS dovodi do redukcije I/R oštećenja organa 27,31 . Međutim, suprotno ovim rezultatima pokazalo se da NO produkovan posredstvom iNOS ostvaruje štetna dejstva učešćem u oksidativnom stresu, tj. interakcijom sa anjonom superoksida koja vodi produkciji peroksinitrita, snažnog induktora ćelijske smrti 32 . Sam peroksinitrit pokazuje dvojako delovanje, odnosno moguće je da ima i hepatoprotektivno dejstvo putem redukcije leukocitne adhezije i infiltracije 33 . Ispitivanja na eksperimentnim modelima transplantacije jetre pokazala su da aktivacija iNOS u Kupferovim ćelijama i polimorfonuklearima može pokrenuti I/R oštećenje hepatocita 34 . Takođe, u eksperimentnom modelu I/R oštećenja steatozne jetre na pacovima utvrđena je pojačana aktivacija iNOS i ET-1, što ukazuje na njihovu važnu ulogu u regulaciji perfuzije sinusoida 35 . U skladu sa ovim rezultatima, inhibicija iNOS može imati korisne biološke efekte. Upotreba inhibitora iNOS (kao što su FK330 i ONO-1714) dovodi do redukcije aktivacije leukocita, hepatičke apoptoze i ukupnog I/R oštećenja jetre u eksperimentnom modelu transplantacije jetre na pacovima i svinjama 36,37 . 

Arteriole

Teorija mikrocirkulacijske perfuzijske insuficijencije izazvane stvaranjem vazokonstriktora i vazodilatatora i mogućom izmenjenom vaskularnom osetljivošću potvrđena je brojnim eksperimentnim dokazima. Inhibicija sinteze vazodilatatora NO pogoršala je reperfuzijsko oštećenje, što se može sprečiti dodavanjem egzogenog NO i drugih vazodilatatora 38,39 . Takođe, stimulacija produkcije NO L-argininom tokom reperfuzije umanjuje portnu hipertenziju i reperfuzijsko oštećenje 24 . S druge strane, dodavanje monoklonskog anti-ET-1 antitela ili antagonista receptora za ET-1 dovodi do poboljšanja hepatičkog mikrovaskularnog protoka krvi tokom reperfuzije, umanjuje oštećenje tkiva i poboljšava preživljavanje 40,41 . 
Neutrofili i adhezivni molekuli. Utvrđeno je da su neutrofili odgovorni za tzv. kasnu fazu I/R oštećenja šest i više časova od početka reperfuzije (protektivni efekat neutropenije izostaje tokom prvih 5-6 h reperfuzije) 42 . Akumulacija neutrofila u jetri počinje već tokom prvih časova od početka reperfuzije. Intenzitet lokalne infiltracije neutrofilima zavisi od njihove ekstravazacije kroz vaskularni endotel i migracije kroz ekstracelularni matriks. Regrutacija i akumulacija neutrofila u jetri odvija se u dve faze: faza inicijalnog pripajanja i faza raspoređivanja neutrofila na sinusoidnom endotelu. To premeštanje neutrofila na mesta inflamacije regulišu brojni prethodno stvoreni i aktivirani akutni inflamacijski medijatori -hemoatraktanti. Među njima najznačajniji su pojedini faktori sistema komplementa, tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin 1 (IL-1), faktor aktivacije trombocita (platelet activating factor -pAF), regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES) citokin iz porodice interleukina 8 (IL-8), monocyte chemoatractant protein-1 (MCP-1), macrophage inflammatory proteins (MIP-1 alpha, MIP-1 beta, MIP-2), hemokini i dr. Hemokine sekretuju tkivne ćelije, lokalni i akumulirani leukociti i en-dotelne ćelije aktivirane proinflamacijskim citokinima na mestima inflamacije. Jetra pokazuje sposobnost produkcije velike količine ovih hemokina. Svojom koncentracijom na mestu inflamacije sekretovani hemokini stvaraju lokalni gradijent od kojeg zavisi smer migracije neutrofila 43 . Pored ovog uticaja na lokalnu dijapedezu neutrofila, hemokini signalnim mehanizmom aktiviraju i adhezivne molekule od čije aktivnosti zavisi ekstravazacija i lokalna adhezija neutrofila za endotel hepatičnih sinusoida. Pored hemokina, ističe se i važna uloga fosfatidilserina (PS) u procesu dijapedeze i migracije neutrofila. U uslovima anoksije i reoksigenacije dolazi do postavljanja PS na spoljašnju stranu sinusoidnih endotelnih ćelija, što deluje hemoatraktantno na neutrofile i tromobocite, odnosno privlači ih i promoviše njihovo vezivanje za mikrocirkulaciju oštećujući protok krvi 44 . Molekuli kao što je diannexin (homodimer humanog annexina V molekulske mase 73 kD) vezuje PS i smanjuje aktivaciju sinusoidnih endotelnih ćelija 45,46 . On umanjuje lokalnu akumulaciju neutrofila (i trombocita) u jetri, indirektno suprimiše inflamacijski odgovor, redukuje apoptozu i štiti jetru od I/R oštećenja 47 . Pored toga, utvrđeno je i da proteaze matriksa olakšavaju kretanje neutrofila duž mikrocirkulacije. Npr. aktivnost metaloproteinaze matriksa 9 (MMP-9) visoko je povećana nakon I/R 48 . 
Za raspoređivanje neutrofila i njihovu čvrstu adheziju za sinusoidne endotelne ćelije odgovorne su brojne porodice različitih tzv. adhezivnih molekula 49 . Među njima su najznačajnije porodice selektina, integrina i imunoglobulina 49 . Lselektini poseduju receptore na neutrofilima i regulišu raspoređivanje neutrofila na endotelu sinousoida. E-selektini uglavnom su prisutni u sinusoidnim endotelnim ćelijama. Njihovu aktivnost regulišu proinflamacijski citokini TNF-α i IL-1 koji su odgovorni za akumulaciju i početnu slabu adheziju neutrofila za sinusoidne endotelne ćelije na mestima inflamacije. Nakon stvaranja ovih slabih inicijalnih veza, dalja adhezija neutrofila za endotelne ćelije hepatičnih sinusoida odvija se pod regulatornim delovanjem integrina koji u sadejstvu sa intercelularnim adhezivnim molekulom 1 (intercellular adhesion molecule-1 -ICAM-1) i vaskularnim ćelijskim adhezivnim molekulom 1 (vascular cell adhesion molecule-1 -VCAM-1) dovode do stvaranja čvrstih adhezija akumuliranih neutrofila za sinusoidne endotelne ćelije 43 . Pored adhezivnih molekula, u procesu adhezije neutrofila za sinusoidne endotelne ćelije važnu ulogu imaju i mehanički faktori: edem ćelije i lezija hepatičkih sinusoida tokom inflamacijskog odgovora, produkcija vazokonstriktora i smanjena deformabilnost (promenljivost i prilagodljivost oblika) neutrofila izloženih delovanju inflamacijskih medijatora [50][51][52] . 
Nakon završenog procesa adhezije za endotelne ćelije hepatičkih sinusoida sledi transmigracija neutrofila iz sinusoida u hepatički parenhim. Ovaj proces još uvek nije u potpunosti razjašnjen. Utvrđeno je da pravac transmigracije neutrofila određuje gradijent hemokina u parenhimu, a smatra se da i u ovom procesu transmigracije ključnu ulogu imaju adhezivni molekuli: β2-integrini, ICAM-1 i VCAM-1. Proinflamacijski citokini TNF-α, IL-1 i interferon gama (IFN-γ) identifikovani su kao snažni stimulusi transmigracije neutrofila u hepatički parenhim 53,54 jenta određenog parenhimskom koncentracijom hemokina, postoje indicije da transmigracija neutrofila iz hepatičkih sinusoida u parenhim zavisi i od drugih medijatora povezanih sa I/R oštećenjem koji mogu delovati kao hemoatraktanti za neutrofile (npr. neki produkti lipidne peroksidacije, faktori koji se oslobađaju iz parenhimskih ćelija nakon njihove apoptoze, itd.) 55,56 . 
Po završenoj transmigraciji neutrofila sa endotela hepatičkih sinusoida u parenhim jetre, dolazi do adhezije neutrofila za parenhimske ćelije i sledstvenog oštećenja hepatocita. Utvrđeno je da je proces adhezije neutrofila za hepatocite takođe regulisan medijatorskim delovanjem adhezivnih molekula i to β2-integrina (LFA-1 i Mac-1) na neutrofilima i ICAM-1 na hepatocitima 57 . Takođe, vezivanje neutrofila za hepatocite zavisi i od prisustva niskih nivoa IL-8 58 . Dokazano je da u patofiziološkom mehanizmu oštećenja hepatocita slepljenim neutrofilima učestvuju slobodni kiseonični radikali i proteaze, pri čemu dominantnu ulogu imaju proteolitički enzimi 59 . Najznačajnije među njima su kalcijum-zavisne proteaze koje aktiviraju slobodni kiseonični radikali i proinflamacijski citokini 60 . Nakon aktivacije, te proteaze dovode do proteolize citoskeletnih i membranskih proteina i posledičnog gubitka mitohondrijskog membranskog potencijala i povećanja permeabilnosti mitohondrijske membrane što dovodi do ćelijske smrti apoptozom ili nekrozom. Intracelularna aktivnost ovih proteaza značajno je povećana već 30 minuta nakon početka ishemije, a svoj maksimum dostiže 60 minuta od početka reperfuzije 61 . Patogenetska proinflama-cijska uloga slobodnih kiseoničnih radikala u ovom mehanizmu sastoji se u inaktivaciji antiproteaza plazme 59 , aktivaciji transkripcijskih faktora NF-κB i AP-1 koji regulišu transkripciju proinflamacijskih citokina, hemokina i adhezivnih molekula i aktivaciji intracelularne signalne transdukcije koja vodi ka ćelijskoj smrti 62 . Ova signalna transdukcija može se blokirati hormonima kao što su atrijski natriurezni peptid (ANP) i ciklični gvanozin monofosfat (cGMP) koji tako ispoljavaju protektivno delovanje na I/R oštećenje jetre 63 . Pored toga, neutrofili doprinose i razvoju oksidativnog stresa i stvaranju medijatora, kao što su leukotrien B4 i 12hidroksieikozatetraenoična kiselina. 

Zaključak

Ishemijsko/reperfuziono oštećenje jetre odigrava se posredstvom kompleksnih patofizioloških mehanizama koji uključuju oksidativni stres, proinflamacijski odgovor, aktivaciju imunskog sistema, koagulacijskog sistema, sistema komplementa i apoptozu hepatocita, što dovodi do mikrocirkulacijskih poremećaja. Iako autonomni, ti patofiziološki procesi deluju komplementarno i u različitom stepenu doprinose strukturnom i funkcijskom oštećenju hepatocita. Patogenetska dominacija svakog od ovih patofizioloških mehanizama varira i zavisi od dužine ishemije i prethodnog funkcijskog stanja tkiva jetre. Dalje detaljno rasvetljavanje ovih procesa neophodno je za uspešnu prevenciju razvoja I/R oštećenja jetre u različitim kliničkim okolnostima. 

L I T E R A T U R A




  . Pored hemotaksičnog gradi- 


	Radojković M, et al. Vojnosanit Pregl 2008; 65(12): 913-918.
Volumen 65, Broj 12