Kardiovaskularna oboljenja su jedan od glavnih zdravstvenih problema, s obzirom na to da doprinose 50% mortalitetu od ukupnog broja evidentiranog, odnosno oko jedne tre}ine umrlih su u starosnoj grupi izme|u 35 i 65 godina. Koronarna sr~ana oboljenja a u manjoj meri cerebrovaskularna oboljenja su glavni uzro~nici kardiovaskularnog mortaliteta (1)


Ateroskleroza je bolest velikih elasti~nih i velikih mi{i}nih arterija koja se manifestuje mestimi~nim o{te}enjem intime (2), odnosno ona je hroni~no inflamatorno stanje vaskularnog zida, koje prelazi u akutno klini~ko stanje zbog rupture plaka, {to uslovljava nastanak tromboze (3). 
Na pojavu i razvoj ateroskleroze uti~u brojni faktori rizika: `ivotno doba, pol, porodi~na predispozicija, uro|eni poreme}aji metabolizma, hiperlipidemija, ar-terijska hipertenzija, pu{enje, fizi~ka neaktivnost, gojaznost. 
Hiperholesterolemija (ste~ena ili hiperlipoproteinemija tip IIa), pove}anje koncentracije triglicerida i lipoproteina, su najva`niji i najvi{e ispitivani faktori rizika (4). Lipoproteini male gustine (LDL) ulaze u }eliju vezuju}i se za LDL-receptore preko apoproteina B. Ako je koncentracija LDL u plazmi pove}ana, vi{ak LDL koji ostaje u cirkulaciji podle`e oksidaciji koja podsti~e aterogenezu. Drugi va`an lipoprotein u metabolizmu holesterola je lipoprotein velike gustine (HDL). HDL je supstrat lecitin-holesterol-acil-transferaze (LCAT), koja esterifikuje slobodni holesterol i smanjuje njegovu koncentraciju u plazmi (5). 
Va`nu ulogu u usporavanju procesa ateroskleroze ima endogeni antioksidacioni za{titni sistem koji ~ine enzimi: superoksid-dismutaza (SOD), katalaza (CAT), glutationperoksidaza (GSH-Px), glutation-Stransferaza (GST), glutation-reduktaza (GR) i neenzimske komponente: glutation (GSH), vitamin E, vitamin C, ubihinon (Co Q) i druge. U stru~noj terminologiji postoji vi{e naziva za ovaj sistem, ali se termin £antioksidacioni za{titni sistem‹ (AOS) ustalio krajem osamdesetih i po~etkom devedesetih godina dvadesetog veka (6, 7). 

Kratak sadr`aj: U ovom radu je pra}en efekat osmonedeljne modifikovane dijete za pacove na lipidni status, aktivnost glutation-S-transferaze, katalaze, glutationa i koncentracije vitamina E u plazmi mu`jaka Wistar pacova. @ivotinje su `rtvovane bez anestezije, dekapitacijom, 24 h po prestanku dijete. Krv je prikupljana u heparizovane epruvete radi odre|ivanja komponenata lipidnog statusa: triglicerida, HDL i LDL. Za histolo{ku analizu je izolovana abdominalna aorta. Koncentracije vitamina E, triglicerida, ukupnog i LDL holesterola u plazmi i odnos LDL/HDL, su bile zna~ajno pove}ane (p < 0,05) u pore|enju sa kontrolom. Aktivnost glutation-S-transferaze, katalaze i koncentracije glutationa tako|e su pove}ani u odnosu na kontrolne pacove, ali ne pokazuju statisti~ku zna~ajnost (p > 0,05). Dobijeni rezultati pokazuju da prolongirana specifi~na aterogena dijeta kod pacova dovodi do zna~ajnog pove}anja varijabli lipidnog statusa bez sli~nih promena u antioksidativnom statusu u krvi. 
Klju~ne re~i: ateroskleroza, pacovi, lipidni status, antioksidacioni status. 

Adresa autora

Dr Sa{ko Velkovski Institut za fiziologiju Medicinski fakultet Vi{egradska 26/II 11001 Beograd Cilj ovog rada je bio da se, na animalnom modelu eksperimentalne ateroskleroze, utvrdi povezanost pove}ane koncentracije lipida i promena u AOS u krvi. 

Materijal i metode

U ovom radu kori{}eni su odrasli mu`jaci Wistar albino pacova, telesne mase oko 400 g podeljeni u dve grupe po pet `ivotinja: kontrolnu (K) i eksperimentalnu (E). Sve `ivotinje su dr`ane na sobnoj temperaturi 22 " 2 ‰C u kojoj je po{tovan svetlosni re`im dan/no} (12h:12h). @ivotinje su dobijale vodu i peletiranu hranu ad libitum. 

Tretman `ivotinja

Eksperimentalne `ivotinje su podvrgnute modifikovanoj aterogenoj dijeti za pacove u trajanju od osam nedelja (8). Aterogena smesa je sadr`ala: 40% butera, 10% suncokretovog ulja, 5% kristalnog holesterola, 17% saharoze, 20% kazeina, 4% NaCl, 2% holne kiseline, 0,3% tiouracila, 1% holinhlorida, 0,5% MgO i 0,2% inozitola. Svaka eksperimentalna `ivotinja je dobijala po 5 g aterogene smese svakog jutra sondom, intragastri~no, u toku 8 nedelja. Po zavr{etku tretmana, `ivotinje su `rtvovane dekapitacijom, bez anestezije, izme|u 8 i 10 h pre podne. Uzetoj krvi odre|ivani su lipidni i antioksidacioni status. 

Biohemijske analize

Krv je sakupljana u heparinizovane epruvete, centrifugirana 15 minuta s 5 000 rpm da bi se odvojili eritrociti i plazma. Koncentracije komponenata lipidnog statusa (triglicerida, ukupnog holesterola, HDL holesterola i LDL holesterola) odre|ivane su u uzorku heparinizirane plazme, primenom uobi~ajenih enzimskih kolorimetrijskih testova (Zastava Yugomedica, Kragujevac u saradnji sa Lightning Instrumentation, Lausanne, Switzerland). Tako|e je ra~unat odnos koncentracija LDL/HDL. U plazmi su odre|ivane aktivnost glutation-S-transferaze (GST) (9), koncentracija vitamina E (Vit. E) (10) i glutationa (GSH) (11). 
Posle odvajanja plazme eritrociti su ispirani tri puta sa po 2 mL fiziolo{kog rastvora i centrifugirani tri puta po 10 minuta na 5 000 rpm. Opranim eritrocitima je dodavana hladna destilovana voda u odnosu 1:3, a zatim su uzorci ostavljani da liziraju na ledu (0 ‰C) uz povremeno mu}kanje. U hemolizatu je odre-|ivana aktivnost enzima katalaze (12). 

Histolo{ke analize

Za histolo{ku analizu je izolovana abdominalna aorta koja je fiksirana u Buenovom (Bouin) fiksativu. Dehidratacija je obavljena u seriji rastvora alkohola (30%, 50%, 70%, 96% i 100%), prosvetljavanje u ksilolu, a kalupljenje u parafinu. Preseci debljine 5 mm bojeni su hematoksilin eozinom i analizirani na svetlosnom mikroskopu Opton. 

Statisti~ka obrada podataka

Za testiranje zna~ajnosti razlika kori{}en je neparametarski dvosmerni Mann-Whitney U test iz softverskog paketa statisti~kih testova Pharmacologic Calculation System (R. J. Tallarida & R. B. Murray, Springer ' Verlag, New York, 1986). 

Rezultati

Koncentracije triglicerida, ukupnog holesterola i LDL holesterola u plazmi eksperimentalne grupe bile su statisti~ki zna~ajno ve}e u odnosu na kontrolnu grupu (p < 0,05). Koncentracija HDL holesterola u eksperimentalnoj grupi se nije razlikovala u odnosu na kontrolnu grupu (p > 0,05). Odnos LDL/HDL u grupi E bio je statisti~ki zna~ajno ve}i (p < 0,01) u pore|enju sa kontrolom (Tabela I). 
Tabela I Lipidni status mu`jaka pacova posle osmonedeljne dijete TG, mmol/L 0,98 " 0,29 Aktivnost GST i koncentracija GSH u plazmi eksperimentalne grupe bile su ve}e za 12% odnosno 21% u odnosu na kontrolnu grupu, ali ne statisti~ki zna~ajno (p > 0,05) (Tabela II). Koncentracija Vit. E u eksperimentalnoj grupi je bila statisti~ki zna~ajno ve}a (p < 0,01) za 138% u pore|enju sa kontrolom. Aktivnost CAT u eritrocitima pacova eksperimentalne grupe je bila pove}ana za 40% u odnosu na kontrolnu grupu, ali bez statisti~ke zna~ajnosti (p > 0,05) (Tabela II). 
Zid abdominalne aorte kontrolnih `ivotinja je imao tipi~nu gra|u zida arterije elasti~nog tipa: endotel, dobro razvijenu intimu u ~ijem su se subendotelnom matriksu nalazile sporadi~ne glatke mi{i}ne }elije sekretornog tipa, mediju od vi{e slojeva glatkih mi{i}nih }elija kontraktilnog tipa odvojenih fenestriranim elasti~nim laminama, i tanku adventiciju. Kod eksperimentalnih `ivotinja, zid abdominalne aorte je bio zadebljan u celini. Na endotelu su se mogla primetiti mestimi~na o{te}enja. Intima je bila mestimi~no umereno zadebljana sa retkom fokalnom }elijskom akumulacijom. Slojevi medije su bili odvojeni elasti~nim laminama ~ija je struktura mestimi~no bila nejasna, a mestimi~no su se zapa`ale akumulacije lipida. Broj glatkih mi{i}nih }elija sintetskog fenotipa je bio pove-}an. Adventicija je bila umereno zadebljana, bez znakova zapaljenja. 

Diskusija

Rezultati prikazani u ovom radu pokazuju da su koncentracije triglicerida, ukupnog holesterola i LDL holesterola u eksperimentalnoj grupi pove}ani u odnosu na kontrolu. Sli~ne promene su uo~ene i na drugim animalnim modelimaima aterogene dijete (13). Ako se posmatra ukupni lipidni status, odnosno sve njegove komponente zajedno, uo~ava se da izrazito pove}anje koncentracije ukupnog holesterola u toku aterogene dijete nastaje zbog pove}anja koncentracije LDL holesterola. Pove}ana koncentracija LDL pra}ena je njihovom oksidacijom, a za oksidovani LDL (oxLDL) receptori glatkih mi{i}nih }elija i monocita imaju ve}i afinitet i nastaje njihova ekstenzivnija internalizacija (14). U ranijim radovima je pokazano da apsolutni nedostatak ili defekt LDL-receptora (hiperlipoproteinemija tip II), kao i njihov relativni nedostatak (alimentarna hiperlipoproteinemija tip IIa) ima za posledicu pove}anje koncentracije LDL u plazmi i pove-}anje odnosa koncentracija LDL i HDL u plazmi. U kontaktu sa endotelom LDL se oksiduje i acetiluje (15). Kroz o{te}enu endotelnu barijeru LDL lako prodire u intimu gde se fagocituju tkivni makrofagi (16). Utv|eno je da su makrofagi i glatke mi{i}ne }elije ispunjene lipidima penaste }elije (17). Penaste }elije, koje mi nismo zapazili histolo{kom analizom abdominalne aorte pacova, u ateroskleroznom plaku, nastaju i zbog }elijskog preuzimanja ostataka hilomikrona. Arterijska akumulacija ostataka hilomikrona mo`e doprineti destabilizaciji plaka kao posledici }elijske smrti nakon produkcije reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) u makrofagima i glatkim mi{i}nim }elijama (18). U oksidaciji LDL va`nu ulogu ima superoksid anjon radikal (O 2 •' ) u endotelnim }elijama (19). Pove}ano oslo-ba|anje O 2 •' iz zidova arterija u hiperholesterolemiji potvr|uju koncept da je arterijski zid u hiperholesterolemiji i/ili aterosklerozi pod pove}anim oksidacionim stresom (20). Superoksid anjon radikal i azot oksid (NO • ) produkovani u zidovima arterija od strane endotelnih i glatkih mi{i}nih }elija formiraju peroksinitrit (ONOO ' ), a ovaj razlaganjem daje visoko reaktivni hidroksil radikal koji oksiduje LDL. Na taj na~in, oba ova radikala doprinose patogenezi ateroskleroze (21). LDL mogu direktno da stimuli{u proliferaciju glatkih mi{i}nih }elija, pove}anjem aktivnosti protein kinaze C (PKC) (22). 
Sve ve}i broj dokaza potvr|uje da su brojna pa-tofiziolo{ka stanja udru`ena sa pove}anom vaskulnom produkcijom ROS (23). Proaterogenim efektima ROS suprotstavlja se endogeni antioksidacioni za{titni sistem. Jedan od mehanizama za{tite AOS je inhibicija aterogenih efekata LDL delovanjem SOD (24). Adheziju leukocita za endotel u ranoj aterogenezi stim-uli{u oksidovani LDL. Ova stimulacija adhezije leukocita za endotel oksidovanim LDL odvija se preko O 2 •' zavisnog puta i inibira je SOD koja sadr`i bakar i cink (CuZn SOD) (25). Pre`ivljavanje makrofaga i glatkih mi{i}nih }elija obrnuto je srazmerno produkciji ROS, a znatno se produ`ava u prisustvu SOD i CAT (18). Monociti i makrofage sadr`e vi{e GSH posle izlaganja oksidovanim LDL, {to je posledica de novo sinteze stimulisane oksidovanim LDL (26). Ateromatozni plakovi su bogati }elijama koje sadr`e GSH-Px, dok }elije normalnih arterijskih zidova skoro da i ne sadr`e GSH-Px. Aktivnost GSH-Px u }elijama ateromatoznog plaka se pove}ava tek po{to se lipidna peroksidacija dogodila (27). Ravnote`a izme|u oksidacije LDL i po-sledi~nog stvaranja ROS, s jedne i aktivnosti komponenata AOS, s druge strane, odre|uje da li }e se i u kojoj meri odvijati aterogeneza. U ovom eksperimentalnom modelu aktivnost CAT u eritrocitima nije zna~ajno promenjena, {to je u skladu sa nalazima drugih autora (28). Osim toga, aktivnost CAT se ne menja zna~ajno ni u humanim vaskularnim oboljenjima s ateroskleroti~nom osnovom, kao {to je angina pektoris (29). Na{i rezultati pokazuju da aktivnost GST u plazmi nije bila statis-tisti~ki zna~ajno pove}ana, ali treba imati u vidu da je u ranijim radovima pokazano da se GST nalazi prete`no u citosolu a kod pacova u mikrozomima, endo-plazmati~nom retikulumu i spolja{njoj membrani mitohondrija (30). Druga istra`ivanja na ovakvim eksperimentalnim modelima pokazuju da je u plazmi smanjena aktivnost antioksidacionih za{titnih enzima, dok u eritrocitima ostaje normalna aktivnost CAT (31). ^injenica da ni koncentracija GSH u plazmi nije statisti~ki zna~ajno promenjena ukazuje da se, u ovom eksperimentalnom modelu, glutation redoks sistem u celini ne menja. Od posmatranih antioksidacionih varijabli, jedino je koncentracija Vit. E u plazmi bila statisti~ki zna~ajno ve}a u eksperimentalnoj grupi u odnosu na kontrolu. Istra`ivanja humanog antioksidacionog statusa, tako|e daju podatke da je koncentracija Vit. E pove}ana u bolestima koje su posledica hiperlipoproteinemije ili koegzistiraju sa njom (29). Literatura obiluje ~esto vrlo opre~nim podacima o efektima hiperlipidemije, aterogeneze, ateromatoze i ateroskleroze na AOS i njegove pojedine komponente. Te promene se razlikuju ne samo izme|u razli~itih vrsta (32), ve} i izme|u razli~itih tkiva (33). Ve}ina istra`iva~a se sla`u u tome da je interakcija izme|u komponenata AOS veoma slo`ena i razli~ita u zavisnosti od oksidacionog agensa. Dobijeni rezultati pokazuju da produ`ena spe-cifi~na aterogena dijeta kod pacova dovodi do zna~ajnog pove}anja koncentracije ukupnog holesterola i LDL holesterola u krvi, koje korelira s antioksidacionim statusom krvi. Hiperlipidemija i stvaranje lipidnih peroksida i drugih ROS su u me|usobno povezani a samim tim je i uloga AOS u usporavanju aterogeneze zna~ajna. 



  Sa{ko D. Velkovski1, Verica Milo{evi} 2 , Sne`ana Risti} 1 , Sla|an Pavlovi} 2 , Zorica S. Sai~i} 2 , Vesna P. Star~evi} 1 1 Institut za fiziologiju, Medicinski fakultet u Beogradu, Vi{egradska 26/II, 11001 Beograd 2 Institut za biolo{ka istra`ivanja £Sini{a Stankovi}‹, 29. Novembra 142, 11060 Beograd 


	UC 577,1; 61	ISSN 0354-3447
	Jugoslov. Med. Biohem. 21: 31-35, 2002	Originalni nau~ni rad
		Original paper
	EFEKTI ATEROGENE DIJETE NA LIPIDNI STATUS
	I NEKE ANTIOKSIDACIONE VARIJABLE U KRVI PACOVA

Jugoslov. Med. Biohem. 2002.; 21 (1) 

Jugoslov. Med. Biohem. 2002.; 21(1) 

EFFECTS OF PROLONGED ATHEROGENIC DIET ON LIPID STATUS AND SOME ANTIOXIDANT PARAMETERS IN RAT BLOOD

Sa{ko D. Velkovski Summary: In this study we measured the effects of eight-week atherogenic diet on plasma lipid status, glutathione-S-transferase activity, red blood cells-catalase activity, and glutathione and vitamin E plasma level adult male Wistar albino rats. The animals were sacrificed by decapitation 24 h after the end of the diet. Triglycerides, total cholesterol, and LDL cholesterol plasma levels, as well as LDL/HDL ratio, and vitamin E plasma level significantly raised (p<0,05) after the diet in comparison with the controls. HDL cholesterol plasma level, glutathione--S-transferase and red blood cells-catalase activities, and glutathione plasma level remained unchanged (p>0,05). These findings demonstrated that prolonged specific atherogenic diet in rats induced significant raise of the lipid parameters, but did not affect blood antioxidant status. 
Key words: atherosclerosis, rats, lipid status, antioxidant status.
Kardiovaskularna oboljenja su jedan od glavnih zdravstvenih problema, s obzirom na to da doprinose 50% mortalitetu od ukupnog broja evidentiranog, odnosno oko jedne tre}ine umrlih su u starosnoj grupi izme|u 35 i 65 godina. Koronarna sr~ana oboljenja a u manjoj meri cerebrovaskularna oboljenja su glavni uzro~nici kardiovaskularnog mortaliteta (1)