Biochemical Study of Alkaline Phosphatase in Staphylococcus aureus


The present research aimed isolating and purifying Alkaline phosphatase enzyme from crude protein extract (Lysate supernatant) of Staphylococcus aureus by using different biotechnologies. To proceed, the following steps were achieved: 

Firstly, The verification of the existence of enzyme in bacteria, the bacteria were diagnosed by using the API 20 stripe that consists of (20) items. It had been detected that the experimented bacterium was Staphylococcus aureus, the enzyme was isolated from this bacterium to ensure its availability in it within the logarithmic phase and this was done through growing it for 18 hours in a suitable growth medium. It had been detected that the enzyme was intracellular because of the occurrence of enzyme activity in the lysate supernatant without occurring it in the cell free culture supernatant. 
Secondly, Enzyme purification, the enzyme had been purified through three stages: precipitation of protein by ammonium sulphate, dialysis and finally, the protein extract was passed through column chromatography by using Sephadex G-100 gel, the estimated enzyme activity after this step was 16.2 in comparison with its activity before the purification processes (crude protein extract). The approximate molecular weight of alkaline phosphatase was estimated by using gelatinous filtration technique and it was 51.000 Dalton. 
Thirdly, Measuring of the enzyme activity in the experimented animals, the results showed an increase of enzyme activity in the blood serum of mice injected with pathological bacteria in comparison with its activity in the blood serum of healthy mice, i.e. the intact ones. 

Keywords




  




  




  




  


:

  Alkaline phosphatase, Staphylococcus aureus, molecular weight. ‫و‬ ‫ـا‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫بالبالزم‬ ‫ـة‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫المحيط‬ ‫ـحة‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫الفس‬ ‫ـل‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫داخ‬ ‫ـا‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ي‬ ‫البكتير‬ ‫ـي‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ف‬ ‫ـدي‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫القاع‬ ‫ـفاتيز‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫الفوس‬ ‫يم‬ ‫ـز‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫إن‬ ‫ـع‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫يتموض‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫اإلن‬ ‫ـنيع‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫تص‬ ‫ـي‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ف‬ ‫ـفات‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫الفوس‬ ‫ـص‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫نق‬ ‫ـروف‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ظ‬ ‫ـت‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫وتح‬ ‫تمي‬ ‫ـار‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫اللوغ‬ ‫ـو‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫النم‬ ‫ـور‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ط‬ phosphate limitation ( Wang et al., 2005 ‫ـا‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ي‬ ‫بكتر‬ ‫ـايتوبالزم‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫س‬ ‫ـي‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ف‬ ) Staphylococcus aureus ‫ا‬ ‫ـتجلط‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ال‬ ‫ـص‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫لفح‬ ‫ـة‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫لموجب‬ Coagulase ‫ـذلك‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ل‬ ‫ـص‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫الفح‬ ‫ـذا‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫له‬ ‫ـالبة‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫الس‬ ‫ـا‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ي‬ ‫البكتير‬ ‫دون‬ ‫ـاعد‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫يس‬ ‫ـر‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫مباش‬ ‫ـر‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫غي‬ ‫ـكل‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫بش‬ ‫ـا‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ي‬ ‫البكتير‬ ‫ـذه‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ه‬ ‫ـي‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ف‬ ‫يم‬ ‫ـز‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫االن‬ ‫ـود‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫وج‬ ‫ـى‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫عل‬ ‫ـا‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ي‬ ‫البكتير‬ ‫ـد‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫تحدي‬ 


	Du et al., 2001) ‫الباحثين‬ ‫من‬ ‫العديد‬ ‫أشار‬ ‫كما‬ ، ‫نك‬ ‫ز‬ ‫ايونات‬ ‫بعة‬ ‫أر‬ ‫على‬ ‫الفعالة‬ ‫اقعه‬ ‫مو‬ ‫اء‬ ‫الحتو‬ ‫الى‬ ( ‫األساس‬ ‫اد‬ ‫للمو‬ ‫اسعة‬ ‫الو‬ ‫يم‬ ‫اإلنز‬ ‫خصوصية‬ ‫أن‬ Zn +2 ‫اي‬ ‫و‬ ‫وني‬ ‫ﹶ‬ Fernely, 1971 ‫مغنيسيوم‬ Mg +2 ‫عمليات:‬ ‫في‬ ‫ه‬ ‫دور‬ ‫اسة‬ ‫در‬ ‫إلى‬ ‫أدت‬ ) (Coleman et al., 1983) ، ‫ال‬ ‫من‬ ‫كل‬ ‫تحليل‬ ‫االستر‬ ‫أحادية‬ ‫الفوسفاتية‬ ‫مركبات‬ (Bradshaw et al., 1981) ، ‫ل‬ ‫الفوسفاتية‬ ‫النهايات‬ ‫و‬ ‫النووي‬ ‫لحامض‬ DNA Sowadaki et al., 1985) ) ، ‫مستقبالتها‬ ‫الى‬ ‫الفوسفات‬ ‫نقل‬ ‫وفي‬ Trans phosphorylation ، ‫العمل‬ ‫ائق‬ ‫وطر‬ ‫اد‬ ‫المو‬ ‫بكتيريا‬ :Staphylococcus aureus ‫الب‬ ‫ات‬ ‫مختبر‬ ‫من‬ ‫عليها‬ ‫الحصول‬ ‫تم‬ ‫التعليمي‬ ‫السالم‬ ‫مستشفى‬ ‫يولوجي/‬ ‫كتير‬ ، ‫الموصل‬ ‫في‬ ‫و‬ ‫يط‬ ‫شر‬ ‫باستخدام‬ ‫شخصت‬ (API 20) nalytical profile Insera , Biomeriuex France . ‫العالية‬ ‫اكيز‬ ‫التر‬ ‫وجود‬ ‫عند‬ ‫السيما‬ ‫مثل‬ ‫الفوسفاتية‬ ‫المستقبالت‬ ‫من‬ Tris -buffer ‫و‬ Ethanol amine (Trowsdale et al., 1990) ، ‫القاعدي‬ ‫الفوسفاتيز‬ ‫إنزيم‬ ‫وتنقية‬ ‫عزل‬ ‫ظروف‬ ‫تحت‬ ‫تتم‬ ‫التي‬ ‫و‬ ( ‫قاعدية‬ pH 11.0 -7.5 ‫الفوسفات‬ ‫ونقص‬ ) ( (Dhaked et al., 2005 ، ‫بو‬ ‫ـعادلة‬ ‫الم‬ ‫ـب‬ ‫ـ‬ ‫حس‬ ‫اآلتية‬ : (Liang and Blake, 2006) . -‫تحديد‬ ‫للبكتيريا:‬ ‫اللوغارتمي‬ ‫النمو‬ ‫طور‬ ‫ة‬ ‫عكور‬ ‫قياس‬ ‫خالل‬ ‫من‬ ‫الطور‬ ‫هذا‬ ‫تحديد‬ ‫تم‬ ‫الع‬ ‫الق‬ ‫ال‬ ‫المغذي‬ ‫المرق‬ ‫وسط‬ ‫في‬ ‫بكتيري‬ Nutrient broth ‫من‬ ‫ساعتين‬ ‫كل‬ ‫بعد‬
	‫ـــــــــــــــــــــــــــــــ‬ ‫ــــ‬ ‫ة‬ ‫از‬ ‫هز‬ ‫حاضنة‬ ‫في‬ ‫التحضين‬ ‫ــــــــــــــــــــــــــــــــ‬ ‫ـــــــــــــــــــــــ‬ O ‫ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ‬ || ( 180 ‫دقيقة)‬ ‫ة/‬ ‫دور‬ ( ‫نوع‬ ‫من‬ Gallen Hamp, England ‫ـــــــــــــــــ‬ ‫ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ‬ O ‫ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ‬ | | O¯___P___O___R H¯ | ( ‫ة‬ ‫ار‬ ‫حر‬ ‫وبدرجة‬ ) 37 ‫م‬ ) ° ‫ولمدة‬ 24) ) ‫ساعة‬ ، ‫باستخد‬ ‫الضوئي‬ ‫المطياف‬ ‫ام‬ Spectrophotometer (Sartorius BL 210S, Labomed, Inc sepectrosc) ، ‫عند‬ + H __O__H ‫الطول‬ ‫ا‬ ( ‫لموجي‬ 600 ‫نانوميتر‬ ) (Harris et al., 2002) . Alkaline O¯___P___O ¯ + ROH | -‫الجرثومي‬ ‫المعلق‬ ‫تحضير‬ ‫ُعد‬ ‫أ‬ ‫و‬ ‫زجاجي‬ ‫دورق‬ ‫في‬ ‫المغذي‬ ‫المرق‬ ‫سط‬ ‫بحجم‬ ( 1000 ‫سم‬ 3 ‫بالموصدة‬ ‫وعقم‬ ) Autoclave ، ‫الوسط‬ ‫ترك‬ ‫ثم‬ ‫درجة‬ ‫إلى‬ ‫ليبرد‬ Phosphatase O¯ O¯ ‫ة‬ ‫ار‬ ‫حر‬ (50 -45) ‫م‬ ° ‫و‬ ‫الدورق‬ ‫لقح‬ ‫ب‬ ‫يا‬ ‫بكتير‬ Staphylococcus aureus ، ‫و‬ ‫حضن‬ ‫لمدة‬ (18) ‫ة‬ ‫ار‬ ‫حر‬ ‫درجة‬ ‫عند‬ ‫ساعة‬ (37) ‫م‬ ° ‫في‬ Phosphomonoester Regenerated Pi ‫ة‬ ‫از‬ ‫هز‬ ‫حاضنة‬ ( 180 ‫دقيقة)‬ ‫ة/‬ ‫دور‬ . ‫المقدمة‬ ‫بكتيريا‬ Staphylococcus aureus ‫شخص‬ ‫العنقودية‬ ‫ات‬ ‫المكور‬ ‫يا‬ ‫بكتير‬ ‫ة‬ ‫مر‬ ‫ألول‬ Sir-Alaxander Ogston in Aberdeen-Scotland ، ‫عام‬ ‫في‬ 1880 ‫في‬ ( ‫احية‬ ‫الجر‬ ‫اجات‬ ‫الخر‬ ‫قيح‬ Ogston, 1882 ) ‫ـ‬ ‫ي‬ ‫ـنوع‬ ‫ال‬ ‫قع‬ Staphylococccus aureus ‫ـس‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫جن‬ ‫ضمن‬ Staphylococcus ، ‫وعائلة‬ Micrococcaceae ، ‫ام‬ ‫كر‬ ‫لصبغة‬ ‫موجبة‬ ‫يا‬ ‫بكتير‬ ‫وهي‬ ، ‫ال‬ ‫و‬ ‫ية‬ ‫اختيار‬ ‫ائية‬ ‫هو‬ ، ‫متحركة‬ ‫وغير‬ ، ‫ات‬ ‫للسبور‬ ‫مكونة‬ ‫وغير‬ ، ‫الشكل‬ ‫وكروية‬ ‫بين‬ ‫قطرها‬ ‫اوح‬ ‫يتر‬ (1.5-0.5) ‫مايكروميتر‬ ، ‫أو‬ ‫ة‬ ‫قصير‬ ‫ـل‬ ‫سالس‬ ‫أو‬ ‫اج‬ ‫ازو‬ ‫بشكل‬ ‫المجهر‬ ‫تحت‬ ‫تظهر‬ ‫ـي‬ ‫ـاق‬ ‫عن‬ ‫بشكل‬ ‫د‬ ‫النقسامها‬ ‫نتيجة‬ ‫وذلك‬ ‫مستوى‬ ‫من‬ ‫بأكثر‬ ، ‫موجبة‬ ‫ل‬ ‫ـجلط‬ ‫الت‬ ‫فحص‬ Coagulase ( Bhatla and Zahoor, 2007; Cassate et al., 2006 ) . ‫الشعر‬ ‫وعلى‬ ‫لإلنسان‬ ‫التنفسية‬ ‫المجاري‬ ‫و‬ ‫األطعمة‬ ‫و‬ ‫المجاري‬ ‫ومياه‬ ‫الغبار‬ ‫و‬ ‫اء‬ ‫الهو‬ ‫في‬ ‫طبيعية‬ ‫ة‬ ‫بصور‬ ‫يا‬ ‫البكتير‬ ‫اجد‬ ‫تتو‬ ( Malik,1996 ‫كما‬ ) ( ‫الجلد‬ ‫على‬ ‫اجد‬ ‫تتو‬ Noble, 1998 ‫المنخر‬ ‫ـة‬ ‫فتح‬ ‫وفي‬ ) nostril ، ‫يا‬ ‫بكتير‬ ‫تعد‬ Staphylococcus aureus ‫من‬ ( ‫الحيوية‬ ‫للمضادات‬ ‫ة‬ ‫المستمر‬ ‫مقاومتها‬ ‫بسبب‬ ‫ايدة‬ ‫المتز‬ ‫االهمية‬ ‫ذات‬ ‫الممرضات‬ Lowy, 1998 ‫اضا‬ ‫أمر‬ ‫مسببة‬ ) ‫ﹰ‬ ‫اصا‬ ‫تؤدي‬ ‫حيث‬ ‫المناعة‬ ‫نقص‬ ‫من‬ ‫يعانون‬ ‫الذين‬ ‫المرضى‬ ‫تؤ‬ ‫قد‬ ‫حادة‬ ‫اض‬ ‫اعر‬ ‫ظهور‬ ‫الى‬ ‫يا‬ ‫البكتير‬ ‫بهذه‬ ‫بتهم‬ ‫عدت‬ ‫فقد‬ ‫لذلك‬ ‫الموت‬ ( ‫ية‬ ‫انتهاز‬ ‫يا‬ ‫بكتير‬ Foster, 2005 ‫مسببة‬ ) ‫ﹰ‬ ‫إصابات‬ ‫اجات‬ ‫الخر‬ ‫و‬ ‫الثانوية‬ ‫الجلد‬ Abscesses ‫التنفسي‬ ‫الجهاز‬ ، ‫صابات‬ ‫ا‬ ‫و‬ ‫ـولية‬ ‫ـ‬ ‫الب‬ ‫المجاري‬ ، ‫العظم‬ ‫ـهاب‬ ‫الت‬ ‫و‬ Osteomylitis ، ‫القل‬ ‫شغاف‬ ‫ـهاب‬ ‫الت‬ ‫و‬ ‫ب‬ Endocarditis ( Bhatla and Zahoo, 2007 ‫القاعدي‬ ‫الفوسفاتيز‬ ‫إنزيم‬ ‫ب‬ ‫القاعدي‬ ‫الفوسفاتيز‬ ‫يم‬ ‫إلنز‬ ‫يشار‬ ‫الرمز‬ ‫ـ‬ ALP (EC 3.1.3.1) ، (McComb et al., 1979) ، ‫ال‬ ‫و‬ ‫ذي‬ ‫ت‬ ‫أقر‬ ‫ه‬ ‫يمات‬ ‫لإلنز‬ ‫و‬ ‫يس‬ ‫الفوسفات‬ ‫يم‬ ‫إنز‬ ‫مى‬ ‫القاعدي‬ ‫يز‬ ‫ـ‬ ‫ب‬ Orthophosphate monoester-phosphohydrolases ( Trowsdale et al., 1990 ) ، ‫المائي‬ ‫التحلل‬ ‫يمات‬ ‫إنز‬ ‫من‬ ‫وهو‬ hydrolases ( Spiro,1973 ) ، ‫المعدنية‬ ‫يمات‬ ‫اإلنز‬ ‫ومن‬ metalloenzyme ، ( ‫ة‬ ‫كبير‬ Le Du et al., 1985 . ) (Le ‫ـ‬ ‫ك‬ ‫تعتبر‬ ‫ـتي‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ال‬ ‫خلوية‬ Pro-inflammatory ( Picher et al., 2003 ) inflammatory response ‫الداخلية‬ ‫للفوسفات‬ ‫الته‬ ‫إز‬ ‫خالل‬ ‫من‬ Endogenous dephosphorylating ‫إليها‬ ‫الحاجة‬ ‫تكون‬ ‫عندما‬ ‫الحادة‬ ‫االلتهابية‬ ‫االستجابة‬ ‫خالل‬ ‫دور‬ ‫وله‬ Acute ‫الدولية‬ ‫الجمعية‬ 130,000) ( ‫دالتون‬ ) Kim and Wyckoff, 1990 ) ، ‫كما‬ ‫يؤدي‬ ‫يئه‬ ‫جز‬ ‫من‬ ‫للفوسفات‬ ‫الته‬ ‫إز‬ ‫في‬ ‫متمثال‬ ‫دفاعيا‬ ‫ا‬ ‫دور‬ ATP ‫الخارج‬ Alkaline phosphatase ‫يستخدم‬ ‫ولذلك‬ ‫الخبيثة‬ ‫اض‬ ‫األمر‬ ‫تطور‬ ‫لتتبع‬ (Hofmann and Milla´n, 1993) ، ‫و‬ ‫ن‬ ‫وز‬ ‫يم‬ ‫اإلنز‬ ‫يمتلك‬ ‫ا‬ ‫يئي‬ ‫جز‬ ‫ا‬ ‫بين‬ ‫اوح‬ ‫يتر‬ 170,000-.) ‫انية‬ ‫الحيو‬ (Bortolato et al., 1999) ، ‫االلتهابات‬ ‫حالة‬ ‫في‬ ‫الدم‬ ‫مجرى‬ ‫إلى‬ ‫الغشاء‬ ‫من‬ ‫يتحرر‬ ‫الذي‬ Inflammation ‫الخاليا‬ ‫انقسام‬ ‫عادة‬ ‫ا‬ ‫و‬ Remodelling and cell proliferation ( et al., 2001 T Abe ) ، ‫السرطانية‬ ‫الخاليا‬ ‫و‬ ‫الجسم‬ ‫ائل‬ ‫سو‬ ‫في‬ ‫و‬ ‫تجديد‬ ‫وعند‬ ‫اصابات‬ ‫و‬ ( ‫التحفيز‬ ‫في‬ ‫ات‬ ‫بوهيدر‬ ‫الكار‬ ‫وحدات‬ ‫مشاركة‬ ‫على‬ ‫أدلة‬ Berenson et al., 1966 ) ‫تبط‬ ‫وير‬ ‫في‬ ‫البالزمي‬ ‫بالغشاء‬ ‫يم‬ ‫اإلنز‬ ‫الخاليا‬ ‫اغلب‬ ‫الى‬ ‫بهم‬ ‫دي‬ 12 ( Fosset et al., 1974 ‫إلى‬ ) 15 ( % Cathala and Brunel, 1975 ‫للبروتين‬ ‫الكلي‬ ‫الوزن‬ ‫من‬ ‫ات‬ ‫بوهيدر‬ ‫كار‬ ) ، ‫أية‬ ‫توجد‬ ‫ال‬ ‫لكن‬ ‫في‬ ‫وخاصة‬ ‫مختلفة‬ periplasmic space ( Wyckoff, 1987 ) ، ‫ـائن‬ ‫اللب‬ ‫ـي‬ ‫ف‬ ‫ـي‬ ‫البالزم‬ ‫ـاء‬ ‫وبالغش‬ (Trowsdale et al., 1990) -‫القاعدي‬ ‫الفوسفاتيز‬ ‫إنزيم‬ ‫عزل‬ ‫ة‬ ‫الفقر‬ ‫من‬ ‫عليه‬ ‫المستحصل‬ ‫البكتيري‬ ‫العالق‬ ‫ة‬ ‫عكور‬ ‫قيست‬ ‫السابقة‬ ‫الط‬ ‫عند‬ ‫الموجي‬ ‫ول‬ (600) ‫نانوميتر‬ ، ‫و‬ ‫ية‬ ‫البكتير‬ ‫الخاليا‬ ‫رسبت‬ ‫المبرد‬ ‫المركزي‬ ‫الطرد‬ ‫جهاز‬ ‫باستخدام‬ Cooling ultracentrifuge ‫نوع‬ ‫من‬ ( Heraeus chrest Gm bH , Cryofuge 6-4 ) ، ‫ـل‬ ‫النق‬ ‫ـات‬ ‫بميكانيكي‬ ‫ة‬ ‫ـر‬ ‫األخي‬ ‫ـي‬ ‫ف‬ ‫ه‬ ‫دور‬ ‫ـر‬ ‫يفس‬ ‫ـذا‬ ‫وه‬ ‫الخلوي‬ ‫ة‬ ‫ار‬ ‫حر‬ ‫بدرجة‬ (4) ‫م‬ ° ‫لمدة‬ 30 ‫دقيقة‬ ، ‫و‬ ‫المترسبة‬ ‫الخاليا‬ ‫غسلت‬ (3) ‫الدارئ‬ ‫المحلول‬ ‫باستخدام‬ ‫ات‬ ‫مر‬ mM Tris -HCL buffer PH .( Mc Comb et al., 1979) ‫و‬ ‫ـد‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫يب‬ ‫أ‬ 8.0 ) 10 ( ) Kumar et al., 2008 .) ‫و‬ ‫الصوتية‬ ‫فوق‬ ‫الترددات‬ ‫جهاز‬ ‫باستخدام‬ ‫ية‬ ‫البكتير‬ ‫الخاليا‬ ‫ان‬ ‫جدر‬ ‫حطمت‬ Ultrasonic ‫نوع‬ MSE, SEP. No PG 1545) ) ‫يم‬ ‫ـز‬ ‫ـ‬ ( ‫التجلط‬ ‫يم‬ ‫ألنز‬ ‫المنتجة‬ Baird-Parker, 1965 ( ‫ـ‬ ‫ل‬ ‫يضها‬ ‫بتعر‬ ‫وذلك‬ 20,000 ‫ثانية‬ ‫ذبذبة/‬ ) ، ‫لمدة‬ ( 30 ‫العملية‬ ‫وكررت‬ ‫ثانية‬ ) 3) ‫ات‬ ‫مر‬ ( . ‫و‬ ‫ر‬ ‫عن‬ ‫ائق‬ ‫الر‬ ‫فصل‬ ‫ة‬ ‫المتكسر‬ ‫الخاليا‬ ‫اسب‬ ‫المبرد‬ ‫المركزي‬ ‫الطرد‬ ‫جهاز‬ ‫باستخدام‬ ، ‫و‬ ( ‫ة‬ ‫ار‬ ‫حر‬ ‫درجة‬ ‫عند‬ ‫ة‬ ‫المتكسر‬ ‫الخاليا‬ ‫ائق‬ ‫ر‬ ‫حفظ‬ 4 ‫م‬ ) ° (Hostacka et al., .) ‫ويتكون‬ ‫اللبائن‬ ‫في‬ ‫القاعدي‬ ‫الفوسفاتيز‬ ‫يم‬ ‫إنز‬ ‫م‬ ‫سكري‬ ‫بروتين‬ ‫ن‬ glycoprotein (OMoss et al., 1966) ، ‫مابين‬ ‫يحتوي‬ 1993) .

‫القاعدي‬ ‫الفوسفاتيز‬ ‫أنزيم‬ ‫تنقية‬ ‫احل‬ ‫مر‬ - ‫االمونيوم‬ ‫كبريتات‬ ‫باستخدام‬ ‫البروتين‬ ‫ترسيب‬ :

  
							.)	( Kumar et al., 2008	100 mM Tris HCL buffer PH 9.8	‫الدارئ‬ ‫المحلول‬	‫يضم‬	‫حجمي‬ ‫وعاء‬ ‫في‬ ‫غطست‬
	‫ال‬ ‫يفصل‬ ‫الذي‬ ‫ان‬ ‫األوز‬ ‫ذات‬ ‫البروتينية‬ ‫مركبات‬	،	(Husson et al., 1989)	‫الهالمي:‬ ‫الترشيح‬ ‫افيا‬ ‫كروماتوغر‬ ‫الهالم:‬ ‫تحضير‬ ‫نوع‬ ‫من‬ ‫الهالم‬ ‫استخدم‬ Sephadex -G100	--	‫أ‬
											.	)	1999	،	‫(المظفر‬ ‫دالتون‬ )	150000 -4000	( ‫المدى‬ ‫ضمن‬ ‫تقع‬ ‫التي‬ ‫يئية‬ ‫الجز‬
	‫مع‬ ‫العمود‬ ‫ان‬ ‫جدر‬ ‫على‬ ‫بهدوء‬ ‫الهالم‬ ‫بسكب‬ ‫تعبئته‬ ‫تم‬ ‫الذي‬ ‫يم‬ ‫اإلنز‬ ‫لفصل‬ ‫سم‬ )	× 75	‫العمود:‬ ‫تعبئة‬ ( ‫اإلبعاد‬ ‫ذي‬ ‫الفصل‬ ‫عمود‬ ‫استخدم‬ 1.7	-	‫ب‬
	‫و‬ ‫جاهز‬ ‫العمود‬ ‫أصبح‬ ‫وبذلك‬ ‫المقطر‬ ‫بالماء‬ ‫حجمه‬ ‫بقدر‬ ‫تين‬ ‫مر‬ ‫العمود‬ ‫غسل‬ ‫لالستخدام‬ ‫ا‬	‫لفقاعات‬ ،	‫ا‬ ‫تكون‬ ‫عدم‬ ‫اعاة‬ ‫مر‬
											.)	Robyt and White, 1987	(
	‫و‬ ‫يم‬ ‫أنز‬	‫البيض‬ ‫لبومين‬	‫ا‬ ‫و‬	‫البقر‬ ‫مصل‬ ‫لبومين‬	‫ا‬	‫و‬ ‫هي‬	،	‫يئي‬ ‫الجز‬ ‫الوزن‬ ‫معلومة‬	‫القياسية:‬ ‫اد‬ ‫المو‬ ‫إضافة‬ ‫قياسية‬ ‫بروتينات‬ ‫لخمسة‬ ‫االسترداد‬ ‫حجوم‬ ‫تقدير‬ ‫تم‬	-
											.	‫و‬ ‫األنسولين‬	‫يئي‬ ‫الجز‬ ‫الببسين‬
	‫ر‬ ‫تبعه‬ ‫العمود‬ ‫ان‬ ‫جدر‬ ‫على‬ ‫دائري‬ ‫بشكل‬ ‫القياسية‬ ‫اد‬ ‫المو‬ ‫و‬ ‫الغشائي‬ ‫ز‬	‫الف‬ ‫من‬ ‫الناتج‬ ‫لبروتيني‬	‫ا‬	‫المحلول‬ ‫من‬	‫سم‬ 3	‫إضافة‬ ‫حقن‬ ‫تم‬ ‫النموذج:‬ (2.5)	-	‫ج‬
	‫،ثم‬ ‫العمود‬ ‫داخل‬ ‫نموذج‬	‫اال‬ ‫دفع‬ ‫لغرض‬	Elution solution	‫روغان‬ ‫كمحلول‬ ‫استخدامه‬ ‫تم‬ ‫الذي‬	،	‫المقطر‬ ‫الماء‬ ‫من‬	3	‫سم‬	(2.5)	‫إضافة‬
	‫باستخدام‬ ‫نانوميتر‬ )	( 280	‫لموجي‬	‫ا‬	‫اها‬ ‫محتو‬ ‫ومتابعة‬ ‫يدويا‬ ‫البروتينية‬ ‫المادة‬ ‫استرداد‬ ‫البنفسجية‬ ‫فوق‬ ‫األشعة‬ ‫مطياف‬ ‫جهاز‬ UV-Visible spectrophotometer ‫ا‬ ‫الطول‬ ‫عند‬ ‫االمتصاصية‬ ‫اءة‬ ‫قر‬ ‫خالل‬ ‫من‬ ‫لبروتيني‬ ‫شركة‬ ‫من‬ APEL .
	‫لبروتيني‬	‫ا‬	‫المحلول‬ ‫حقن‬ ‫عند‬ ‫المفصولة‬ ‫اء‬ ‫األجز‬ ‫من‬ ‫جزء‬ ‫كل‬ ‫في‬ ‫القاعدي‬ ‫الفوسفاتيز‬ ‫يم‬ ‫أنز‬ ‫فعالية‬ ‫متابعة‬ ‫تمت‬ ‫ذلك‬	‫عن‬ ‫فضال‬
	‫ثم‬	‫يمية.‬ ‫األنز‬ ‫الفعالية‬ ‫ذات‬ ‫البروتينية‬ ‫اء‬ ‫األجز‬ ‫جمع‬ ‫ذلك‬ ‫بعد‬ ‫ليتم‬	،	‫الفصل‬ ‫عملية‬ ‫خالل‬ ‫يم‬ ‫اإلنز‬ ‫متابعة‬ ‫لغرض‬ ‫الفصل‬ ‫عمود‬ ‫في‬ ‫المجهول‬
	‫الوزن‬ ‫تقدير‬ ‫في‬ ‫استخدامها‬ ‫لغرض‬ ‫المعلومة‬ ‫يئية‬ ‫الجز‬ ‫انها‬ ‫أوز‬	‫م‬	‫يت‬ ‫ولوغار‬ ‫القياسية‬ ‫البروتينات‬ ‫سترداد‬	‫ا‬ ‫حجوم‬ ‫بين‬ ‫خطية‬ ‫عالقة‬ ‫رسم‬ ‫تم‬
											.)	Robyt and White, 1987	( ‫القاعدي‬ ‫الفوسفاتيز‬ ‫يم‬ ‫إلنز‬ ‫يبي‬ ‫التقر‬ ‫يئي‬ ‫الجز‬
											‫(	‫التجف‬ ‫تقنية‬	-	‫د‬
	‫يك‬ ‫تحر‬ ‫مع‬ )%	( 75	‫الى‬ ‫كامل‬ ‫وبتشبع‬ ‫ة‬ ‫المتكسر‬ ‫الخاليا‬ ‫ائق‬ ‫ر‬ ‫إلى‬ ‫الصلبة‬ ‫بحالتها‬ ‫االمونيوم‬ ‫يتات‬ ‫كبر‬ ‫إضافة‬ ‫م‬	‫ت‬
	‫دقيقة،‬ )	30	‫لمدة‬ ‫المبرد‬ ‫المركزي‬ ‫الطرد‬ ‫بجهاز‬ ‫يج‬ ‫المز‬ ‫فصل‬ ‫ثم‬ ،	( ‫ة‬ ‫ار‬ ‫حر‬ ‫وبدرجة‬ ‫المغناطيسي‬ ‫بالمحرك‬ ‫يج‬ ‫المز‬ 4 °( ‫م‬ )
	100 mMTris		HCL	buffer	PH	9.8	‫الدارئ‬ ‫المحلول‬ ‫في‬ ‫أذيب‬ ‫و‬ ‫اسب‬ ‫الر‬ ‫على‬ ‫الحصول‬ ‫تم‬ ‫بعدها‬
											Kumar et al., 2008; Robyt and White, 1987 )	(
	‫ثم‬	،	‫بط‬ ‫الر‬ ‫المحكمة‬ ‫السيلوفان‬ ‫أكياس‬ ‫في‬	‫الساب‬ ‫قة‬	‫ة‬ ‫الفقر‬ ‫في‬ ‫المحضر‬ ‫لبروتيني‬	‫ا‬	-‫المحلول‬ ‫وضع‬ ‫خالل‬ ‫من‬ ‫الغشائي‬ ‫الفرز‬ ‫عملية‬ ‫تمت‬ ‫الغشائي‬ ‫الفرز‬ :

التجفيد):‬ ‫التبريد‬ ‫اسطة‬ ‫بو‬ ‫يف‬

  
	0.67		‫يساوي‬ )	Extinction coefficient	( ‫ضوئي‬ ‫امتصاص‬ ‫معامل‬ ‫له‬ ‫الذي‬ ‫للبروتين‬ ‫القياسي‬ ‫المنحني‬ ‫لتحضير‬	‫ا‬	‫قياسي‬	‫ال‬ ‫محلو‬
											‫للبروتين.‬ ‫النموذجي‬ ‫القياسي‬ ‫المنحني‬ )	‫و‬ ( ‫الشكل‬ ‫يوضح‬ 1	)	Holme and Peck, 1988	(
	‫م‬ ) °	-20	( ‫ة‬ ‫ار‬ ‫حر‬	‫بدرجة‬	‫تجميدها‬ ‫بعد‬ ‫التجفيد‬ ‫جهاز‬ ‫باستخدام‬ ‫الهالمي‬ ‫الترشيح‬ ‫تقنية‬	‫تركيز‬ ‫تم‬ ‫مركز.‬ ‫بروتيني‬ ‫محلول‬ ‫على‬ ‫الحصول‬ ‫لغرض‬ ‫من‬ ‫الناتجة‬ ‫البروتينية‬ ‫الحزمة‬
	‫وذلك‬	‫القاعدي:‬ ‫الفوسفاتيز‬ ‫إنزيم‬ ‫فعالية‬ ‫تقدير‬ ‫ف‬ ‫تقدير‬ ‫تم‬ ‫التنقية‬ ‫ات‬ ‫خطو‬ ‫من‬ ‫خطوة‬ ‫كل‬ ‫وبعد‬ ‫الخاليا‬ ‫من‬ ‫الخالي‬ ‫ائق‬ ‫الر‬ ‫و‬ ‫ة‬ ‫المتكسر‬ ‫الخاليا‬ ‫ائق‬ ‫ر‬ ‫من‬ ‫كل‬ ‫في‬ ‫يم‬ ‫االنز‬ ‫عالية‬	-
									.	Biomerieu xsa	‫شركة‬	‫صنعتها‬ ‫التي‬ ‫و‬	)	Phosphatase alkaline -Kite	( ‫ة‬ ‫الجاهز‬ ‫العبوة‬ ‫باستخدام‬
	‫التنقية‬ ‫ات‬ ‫خطو‬ ‫من‬ ‫خطوة‬ ‫كل‬ ‫وبعد‬ ‫الخاليا‬ ‫من‬ ‫الخالي‬ ‫ائق‬ ‫الر‬ ‫و‬ ‫ة‬ ‫المتكسر‬ ‫الخاليا‬ ‫ائق‬ ‫ر‬ ‫ن‬	‫البروتين‬ ‫كمية‬ ‫تقدير‬ ‫م‬ ‫كل‬ ‫في‬ ‫البروتين‬ ‫كمية‬ ‫قدرت‬ :	-
	‫طورها‬ ‫التي‬		)	( Lowry et al., 1951	Folin -Lowry method	‫الوري‬	‫فولن‬ ‫يقة‬ ‫طر‬ ‫باستخدام‬ ،
	‫بوصفه‬	Bovine Serum Albumin (BSA)	‫لبقري‬	‫ا‬	‫المصل‬ ‫لبومين‬	‫ا‬	‫استخدم‬ .)	Schacterle and Pollak, 1973	(	‫الباحثان‬

‫الشكل‬ 1 : ‫للبروتين‬ ‫القياسي‬ ‫المنحني‬ ‫الفوسف‬ ‫إنزيم‬ ‫فعالية‬ ‫تحديد‬ ‫انا‬ ‫الحيو‬ ‫في‬ ‫القاعدي‬ ‫اتيز‬ ‫ت‬ ‫المختبرية‬ - ‫المستخدمة:‬ ‫المختبرية‬ ‫انات‬ ‫الحيو‬ (

  ‫ية‬ ‫السويسر‬ ‫البيض‬ ‫ان‬ ‫الفئر‬ ‫ناث‬ ‫ا‬ ‫و‬ ‫ذكور‬ ‫الحالية‬ ‫اسة‬ ‫الدر‬ ‫في‬ ‫استخدمت‬ 


			.	)	( 2	‫الشكل‬ ‫في‬	‫موضح‬ ‫كما‬	‫يا‬ ‫البكتر‬ ‫تشخيص‬ ‫تم‬ ،	API 20	Staphylococcus aureus ‫يط‬ ‫شر‬ ‫في‬ ‫الموجودة‬ ‫البايوكيميائية‬ ‫ات‬ ‫االختبار‬ :	‫بكتيريا‬ ‫تشخيص‬ ‫اعتمادا‬ ‫على‬
										:2	‫الشكل‬
	‫التي‬ )	Swiss albino mice Mus musculus
									.	‫النماذج‬ ‫بهذه‬ ‫البحث‬	‫الموصل‬ ‫جامعة‬ ‫البيطري/‬ ‫الطب‬ ‫و‬ ‫بية‬ ‫التر‬	‫ا‬	‫كليت‬	‫وزودت‬ ‫ا‬	‫أسبوع‬ )	( ‫بين‬ ‫أعمارها‬ ‫اوحت‬ ‫تر‬ 10-8
	‫درجة‬ )	( ‫ة‬ ‫ار‬ ‫حر‬ ‫بدرجة‬ ‫وحضنت‬ ‫المغذي‬ ‫المرق‬ ‫وسط‬ ‫في‬ 37	Staphylococcus aureus	‫يا‬ ‫بكتير‬	‫البكتيري:‬ ‫المعلق‬ ‫تحضير‬ ‫من‬ ‫البكتيري‬ ‫المعلق‬ ‫حضر‬	-
	‫و‬ ‫غسل‬		،	‫دقيقة‬ )	( ‫لمدة‬ ) 30	5ooo rpm)	‫و‬ ‫بسرعة‬ ‫المركزي‬ ‫الطرد‬ ‫جهاز‬ ‫باستخدام‬ ‫ية‬ ‫البكتير‬ ‫الخاليا‬ ‫رسبت‬	‫ساعة‬ ) ،	( ‫لمدة‬ ‫مئوية‬ 18
	‫فيه‬ ‫ية‬ ‫البكتير‬ ‫الخاليا‬	‫أعداد‬	‫أن‬	‫علما‬	،	‫انات‬ ‫الحيو‬ ‫حقن‬ ‫في‬	‫المستعمل‬	‫المحلول‬ ‫بنفس‬ ‫اسب‬ ‫الر‬ ‫علق‬ ‫ثم‬ ‫الفسلجي‬ ‫الملح‬ ‫بمحلول‬ ‫تين‬ ‫مر‬ ‫اسب‬ ‫الر‬
										.	0.5	‫الند‬ ‫ماكفر‬	‫ألنبوبة‬	‫المساوية‬ ‫و‬	‫سم‬ ‫خلية/‬ ) 3	( ‫كانت‬ 10 8 ×1
	-( ‫ية‬ ‫شعر‬ ‫الدم:‬ ‫عينات‬ ‫سحب‬ ‫خل‬ ‫يدية‬ ‫الور‬ ‫ة‬ ‫الضفير‬ ‫باتجاه‬ ‫العين‬ ‫اوية‬ ‫ز‬ ‫من‬ ‫الدم‬ ‫سحب‬ ‫العين‬ ‫مقلة‬ ‫ف‬ Waynforth, 1980 ) ، ‫و‬ ‫الدم‬ ‫ترك‬ ‫حتى‬ ‫تخثر‬ ‫ه‬ ( ‫مركزي‬ ‫طرد‬ ‫له‬ ‫اجري‬ ‫ثم‬ ‫فة‬ ‫الغر‬ ‫ة‬ ‫ار‬ ‫حر‬ ‫درجة‬ ‫في‬ Ophthalmic venous -plexus 5000 rpm ‫أنبوبة‬ ‫باستخدام‬ ‫لمدة‬ ) ( 30 )
										.	‫السابقة‬	‫ة‬ ‫الفقر‬ ‫في‬ ‫إليها‬ ‫المشار‬ ‫يقة‬ ‫الطر‬ ‫وحسب‬ ‫فيه‬ ‫يم‬ ‫اإلنز‬ ‫فعالية‬ ‫قياس‬ ‫لغرض‬	،	‫دقيقة‬
										‫ج‬	‫ا‬ ‫لنتائ‬

‫تشخيص‬ ‫نظام‬ ‫نتائج‬ API staph ‫القاعـدي‬ ‫الفوسفاتـيز‬ ‫إنزيم‬ : ‫أ‬ - ‫اللوغارت‬ ‫النمو‬ ‫طور‬ ‫تحديد‬ ‫مي:‬

  
	‫باستعمال‬ ‫ساعة‬ ، ‫يبد‬ ‫الطور‬ ‫هذا‬ ‫ان‬ ‫وتبين‬ ‫الضوئي‬ ‫المطياف‬ ‫جهاز‬ ‫أ‬ ‫تقر‬ Spectrophotometer ‫يب‬ ( ‫الساعة‬ ‫من‬ ‫ا‬ 6 ‫الى‬ )	‫النمو‬ ‫طور‬ ‫تحديد‬ ‫تم‬ ‫البكتيري‬ ‫النمو‬ ‫لحساب‬ ، ‫لمدة‬ ‫التحضين‬ ‫من‬ ‫ساعتين‬ ‫كل‬ ‫بعد‬ ‫وذلك‬ ‫يا‬ ‫لبكتر‬ Staphylococcus aureus 24 ،
	‫التجارب‬ ‫في‬ ‫الستخدامها‬ ‫تمي‬ ‫اللوغار‬ ‫النمو‬ ‫طور‬	‫بوصفها‬	‫ساعة‬ )	( ‫بعمر‬ ‫يا‬ ‫البكتير‬ 18	‫انتخب‬ ‫لذلك‬ ‫ت‬	،	)	( 3	‫الشكل‬	‫في‬ ‫كما‬	)	22	( ‫الساعة‬
														‫الالحقة.‬
		‫لبكتيريا‬ ‫اللوغارتمي‬	‫منحني‬		:3	‫الشكل‬			

‫الطور‬ ‫وتحديد‬ ‫النمو‬ Staphylococcus aureus ‫ب‬ - ‫الفوسفاتي‬ ‫انزيم‬ ‫وفعالية‬ ‫موقع‬ ‫تحديد‬ ‫ز‬ ‫القاعدي:‬

  
	‫العمل،‬ ‫ائق‬ ‫وطر‬ ‫اد‬ ‫مو‬ ‫في‬ ‫الموضحة‬ ‫و‬	)	‫يم‬ ‫األنز‬	‫عزل‬	(	‫ة‬ ‫الفقر‬ ‫حسب‬	‫فعاليته‬ ‫قياس‬ ‫بداللة‬ ‫قاعدي‬	‫ال‬ ‫الفوسفاتيز‬ ‫يم‬ ‫انز‬ ‫موقع‬ ‫تحديد‬ ‫تم‬

‫الجدول‬ 1 : ‫بكتيريا‬ ‫من‬ ‫القاعدي‬ ‫الفوسفاتيز‬ ‫انزيم‬ ‫تنقية‬ ‫احل‬ ‫مر‬ Staphylococcus aureus ‫التنقية‬ ‫احل‬ ‫مر‬ ‫الحجم‬ ‫سم‬

  
	‫المئوية‬ ‫النسبة‬ % ‫لالستعادة‬			‫للزيادة‬ ‫المئوية‬ ‫النسبة‬ % ‫النوعية‬ ‫الفعالية‬ ‫في‬		‫الفعالية‬ ‫النوعية**‬ ‫/ملغم‬ ‫وحدة‬	‫الفعالية‬ ‫الكلية‬ ‫االنزيمية‬ ‫وحدة(‬ U )	3
	100.0				1.0			0.05	1.32	20	‫الخام‬ ‫المستخلص‬
	87.9				1.8			0.09	1.16	4	‫كبريتات‬ ‫اسب‬ ‫ر‬ ‫محلول‬ ‫االمونيوم‬
	81.8				3.6			0.18	1.08	7.5	‫الغشائي‬ ‫الفرز‬
								‫الهال‬ ‫الترشيح‬ ‫مي‬
	65.2				16.2			0.81	0.86	89	Sephadex	‫باستخدام‬ G-100
								A	‫القمة‬
	. ‫بروتين‬ ‫ملغم‬ /	) [	Kind and King U/dl	( ‫بالـ‬ ‫مقاسة‬ ‫االنزيم‬ ‫وحدة‬ [ ‫االنزيم‬ ‫وحدات‬ ‫عدد‬ : ‫النوعية‬ ‫الفعالية‬ **
	°.	‫م‬ )	( ‫حرارة‬ ‫وبدرجة‬ ‫دقيقة‬ ) 37	15)	‫في‬ ‫فينول‬ ‫ملغم‬ )	( ‫لتحرير‬ ‫الالزمة‬ ‫االنزيم‬ ‫كمية‬ ‫تمثل‬ : 1	Kind and King
								‫لبكتريا‬	5	‫الشكل‬

‫البروتيني‬ ‫المحلول‬ ‫لروغان‬ ‫الجانبي‬ ‫المظهر‬ : Staphylococcus aureus ‫الترشيح‬ ‫بتقنية‬ ‫الهالمي.‬ ‫الشكل‬ 4 : ‫التنقية‬ ‫مراحل‬ ‫خالل‬ ‫الكلية‬ ‫البروتين‬ ‫كمية‬ ‫ألنزيم‬ ‫لبكتيريا‬ ‫القاعدي‬ ‫الفوسفاتيز‬ Staphylococcus aureus ‫ـيز‬

  ‫لفوسفات‬ ‫يم‬ ‫إنز‬ ‫وتنقية‬ ‫ـزل‬ ‫ـ‬ ‫ع‬ ‫على‬ ‫الحالية‬ ‫اسة‬ ‫الدر‬ ‫قامت‬ ‫هي‬ ‫ام‬ ‫كر‬ ‫لصبغة‬ ‫موجبة‬ ‫كروية‬ ‫مرضية‬ ‫يا‬ ‫بكتر‬ ‫من‬ ‫القاعدي‬ 


	‫البايوكيميائية‬ ‫الفحوصات‬ ‫وعلى‬ ‫ام‬ ‫كر‬ ‫بصبغة‬ ‫صبغها‬ ‫بعد‬ ‫خالياها‬ ‫شكل‬ ‫على‬	‫تشخيص‬ ‫في‬ ‫عتمد‬ ‫ها‬	‫أ‬ ‫ﹸ‬	Staphylococcus aureus
	‫يط‬ ‫شر‬ ‫في‬ ‫الموجودة‬ ‫ﹸ‬ ‫ال‬ ‫بها‬ ‫تمر‬ ‫التي‬ ‫ار‬ ‫األطو‬ ‫أهم‬ ‫من‬ ‫تمي‬ ‫اللوغار‬ ‫النمو‬ ‫طور‬ ‫يعد‬ API 20 ‫الطر‬ ‫من‬ ‫لكونه‬ ‫ائ‬ ‫التشخيص‬ ‫في‬ ‫الدقة‬ ‫و‬ ‫السهولة‬ ‫عن‬ ‫فضال‬ ‫عالميا‬ ‫المستخدم‬ ‫يعة‬ ‫السر‬ ‫التشخيصية‬ ‫ق‬ . ‫نموها‬ ‫ة‬ ‫فتر‬ ‫خالل‬ ‫يا‬ ‫بكتير‬ ، ‫فعالية‬ ‫ذات‬ ‫تكون‬ ‫فيه‬ ‫الخاليا‬ ‫لكون‬ ‫وذلك‬
	‫في‬ ‫الستخدامها‬ ‫مناسبة‬ ‫الطور‬ ‫هذا‬ ‫في‬ ‫يا‬ ‫البكتير‬ ‫تكون‬ ‫لذلك‬ ‫ة‬ ‫متميز‬ ‫وكيميائية‬ ‫فسيولوجية‬ ‫خصائص‬ ‫وذات‬ )	1988	‫يدي‬ ‫(الز‬ ‫عالية‬ ‫ايضية‬ ،
	‫الطور‬ ‫هذا‬ ‫خالل‬ ‫يبدأ‬ ‫القاعدي‬ ‫الفوسفاتيز‬ ‫يم‬ ‫إنز‬ ‫انتاج‬ ‫و‬	‫تكوين‬ ‫ألن‬ ‫و‬	،	)	Prescott et al., 2005	( ‫البايوكيميائية‬ ‫و‬ ‫الفسيولوجية‬ ‫اسات‬ ‫الدر‬
	‫ان‬ ‫كما‬	،	)	Wang et al., 2005	(	‫بالبالزما‬ ‫المحيطة‬ ‫الفسحة‬ ‫إلى‬ ‫البالزمي‬ ‫الغشاء‬	‫خالل‬ ‫من‬	‫ه‬ ‫تصدير‬ ‫يتم‬ ‫ثم‬ ‫ومن‬	،	‫السايتوبالزم‬ ‫في‬
	‫طيه‬ ‫عملية‬ ‫بعد‬ ‫فقط‬ ‫تزداد‬ ‫يم‬ ‫اإلنز‬ ‫فعالية‬ ‫يت‬ ‫ـبر‬ ‫الك‬ ‫ـنائية‬ ‫ث‬ ‫ة‬ ‫ـر‬ ‫ـ‬ ‫ـ‬ ‫اآلص‬ ( ; Sone et al., 1997 Folding Kumar et al., 2008 ‫الف‬ ‫إلى‬ ‫نقله‬ ‫يتم‬ ‫أن‬ ‫بعد‬ ‫إال‬ ‫تحدث‬ ‫ال‬ ‫التي‬ ‫و‬ ‫تعد‬ ‫التي‬ ‫و‬ ) ‫من‬ ‫كل‬ ‫في‬ ‫المهم‬ ‫االيضي‬ ‫الجزء‬ ‫ثم‬ ‫ومن‬ ‫بالبالزما‬ ‫المحيطة‬ ‫سحة‬ ‫السالبة‬ ‫يا‬ ‫البكتير‬ ‫تكوين‬
	Nugent et	(	‫بون‬ ‫الكر‬ ‫و‬ ‫الفوسفات‬ ‫مصادر‬ ‫على‬ ‫للحصول‬ ‫ية‬ ‫الضرور‬ ‫يمات‬ ‫اإلنز‬ ‫معظم‬ ‫على‬ ‫ائها‬ ‫الحتو‬ ‫وذلك‬ ‫ام‬ ‫كر‬ ‫لصبغة‬ ‫الموجبة‬ ‫و‬
	‫ضمن‬ ‫الطور‬ ‫هذا‬ ‫حددت‬ ‫قد‬ ‫سابقة‬ ‫اسات‬ ‫در‬ ‫أن‬ ‫علما‬	،	‫ساعة‬ )	( ‫بين‬ ‫يبا‬ ‫تقر‬ ‫يقع‬ ‫الذي‬ ‫و‬ ‫الطور‬ ‫هذا‬ ‫تحديد‬ ‫تم‬ ‫فقد‬ ‫لذلك‬ 22-6	،	)	al.,1974
	( ‫ة‬ ‫الفتر‬ 16-6 ‫ال‬ ‫هذه‬ ‫نتائج‬ ‫اللقا‬ ‫حجم‬ ‫إلى‬ ‫يرجع‬ ‫قد‬ ‫اسة‬ ‫در‬ ‫يا‬ ‫ـتير‬ ‫بك‬ ‫من‬ ‫ـل‬ ‫ك‬ ‫في‬ ‫ساعة‬ ) ‫ح‬ E. coli ‫تقصير‬ ‫إلى‬ ‫يؤدي‬ ‫جديد‬ ‫غذائي‬ ‫وسط‬ ‫ضافة‬ ‫ا‬ ‫و‬ ‫اللقاح‬ ‫حجم‬ ‫يادة‬ ‫ز‬ ‫أن‬ ‫علما‬ ‫الغذائي‬ ‫الوسط‬ ‫ونوع‬ ‫و‬ Staphylococcus aureus ‫(النعمان‬ ، 1998 ) ، ‫المالحظ‬ ‫النسبي‬ ‫التفاوت‬ ‫إن‬ ‫في‬
	‫منحني‬ ‫ار‬ ‫أطو‬ ‫ة‬ ‫فتر‬ ‫تحديد‬ ‫في‬ ‫مهما‬ ‫ا‬ ‫دور‬	‫م‬ ‫ؤديان‬	‫اوتها‬ ‫ضر‬ ‫ومدى‬ ‫يا‬ ‫البكتير‬ ‫عزل‬ ‫مصدر‬ ‫أن‬ ‫عن‬ ‫فضال‬	،	‫ساعات‬ ‫بضع‬ ‫إلى‬ ‫التطبع‬ ‫ة‬ ‫فتر‬
											.)	( ‫البكتيري‬ ‫النمو‬ Koneman et al., 1997
	،	‫يبا‬ ‫تقر‬ ‫ساعة‬ )	( ‫لمدة‬ ‫وتحضينها‬ 18	‫المناسب‬ ‫الغذائي‬ ‫الوسط‬	‫في‬	‫يا‬ ‫البكتر‬	‫ة‬	‫تنمي‬ ‫تم‬ ‫أن‬ ‫بعد‬	‫القاعدي‬ ‫الفوسفاتيز‬ ‫يم‬ ‫إنز‬ ‫عزل‬ ‫تم‬

(

  ‫الموقع‬ ‫داخلية‬ ‫يمات‬ ‫اإلنز‬ ‫من‬ ‫هو‬ ‫القاعدي‬ ‫الفوسفاتيز‬ ‫يم‬ ‫إنز‬ ‫أن‬ ‫اسة‬ ‫الدر‬ ‫كشفت‬ ‫حيث‬ Csopak et al.,1972 ‫أي‬ ‫وجود‬ ‫عدم‬ ‫بداللة‬ ) ‫ة‬ ‫في‬ ‫يم‬ ‫لإلنز‬ ‫فعالية‬ ( ‫ة‬ ‫ـكسر‬ ‫المت‬ ‫الخاليا‬ ‫ائق‬ ‫ر‬ ‫في‬ ‫نوعية‬ ‫فعالية‬ ‫له‬ ‫سجلت‬ ‫حين‬ ‫في‬ ‫الخاليا‬ ‫من‬ ‫الخالي‬ ‫ائق‬ ‫الر‬ 0.05 ‫الخارجي‬ ‫الغشاء‬ ‫لكون‬ ) ‫يا‬ ‫ـبكتير‬ ‫بال‬ ‫ـيط‬ ‫المح‬ ‫ـط‬ ‫الوس‬ ‫الى‬ ‫يم‬ ‫اإلنز‬ ‫خروج‬ ‫ـع‬ ‫يمن‬ ‫ـاجز‬ ‫كح‬ ‫يعمل‬ ‫ام‬ ‫كر‬ ‫ـبغة‬ ‫ـ‬ ‫لص‬ ‫ـة‬ ‫السالب‬ ‫يا‬ ‫للبكتير‬ ( Manoil et al.,1990 ‫تعمل‬ ‫كما‬ ) ‫يم‬ ‫اإلنز‬ ‫از‬ ‫ـر‬ ‫إف‬ ‫ـع‬ ‫من‬ ‫إلى‬ ‫ام‬ ‫كر‬ ‫لصبغة‬ ‫السالبة‬ ‫و‬ ‫الموجبة‬ ‫يا‬ ‫البكتير‬ ‫من‬ ‫ـل‬ ‫ك‬ ‫في‬ ‫البالزمي‬ ‫الغشاء‬ ‫ضمن‬ ‫الموجودة‬ ‫ة‬ ‫المفسفر‬ ‫الدهون‬ ‫طبقة‬ ‫خارجيا‬ ، ‫ا‬ ‫ية‬ ‫البكتير‬ ‫الخاليا‬ ‫خارج‬ ‫أبدا‬ ‫ازها‬ ‫إفر‬ ‫يتم‬ ‫ال‬ ‫التي‬ ‫البروتينات‬ ‫من‬ ‫وهو‬ ‫بالبالزما‬ ‫المحيطة‬ ‫الفسحة‬ ‫ضمن‬ ‫يقع‬ ‫يم‬ ‫اإلنز‬ ‫ولكون‬ ‫لى‬ ‫الوسط‬ ‫ا‬ ( ‫فيه‬ ‫النامية‬ ‫لزرعي‬ Beacham et al., 1976 ) ، ‫الخاليا‬ ‫ائق‬ ‫ر‬ ‫مستخلص‬ ‫من‬ ‫يم‬ ‫لإلنز‬ ‫الكلية‬ ‫الوحدات‬ ‫على‬ ‫الحصول‬ ‫تم‬ ‫فقد‬ ‫لذلك‬ ‫السليمة‬ ‫و‬ ‫الكاملة‬ ‫الخاليا‬ ‫ائق‬ ‫ر‬ ‫من‬ ‫وليس‬ ‫ة‬ ‫المتكسر‬ Intact cells MacAlister et al., 1972; Nugent et al., 1974) ‫أشار‬ ‫كما‬ ) ‫بين‬ ‫التنافس‬ ‫نوع‬ ‫على‬ ‫اعتمادا‬ ‫و‬ ‫التجمع‬ ‫إلى‬ ‫البروتين‬ ‫يئات‬ ‫جز‬ ‫فتميل‬ ‫الماء‬ ‫يئات‬ ‫جز‬ ‫مع‬ ‫االتحاد‬ ‫و‬ ‫الذوبان‬ ‫على‬ ‫البروتينات‬ ‫و‬ ‫االمونيوم‬ ‫يتات‬ ‫كبر‬ Aggregation 


	Pseudomonas	‫يا‬ ‫لبكتير‬ ‫بالبالزما‬ ‫المحيطة‬ ‫الفسحة‬ ‫في‬	‫أيضا‬ ‫يم‬ ‫اإلنز‬ ‫وجود‬ ‫إلى‬ ) ‫ﹰ‬	‫و‬ ) 1970)	( 1971	Cheng et al.,	‫الباحث‬
	‫فوق‬ ‫الترددات‬ ‫بجهاز‬ ‫ة‬ ‫المتكسر‬ ‫الخاليا‬ ‫ائق‬ ‫ر‬ ‫من‬ ‫الخام‬ ‫لبروتيني‬	‫ا‬	aerogenosa ‫المستخلص‬ ‫على‬ ‫الحصول‬ ‫بعد‬ ‫يم‬ ‫اإلنز‬ ‫تنقية‬ ‫عملية‬ ‫تمت‬ .
											‫االتية:‬ ‫ات‬ ‫الخطو‬ ‫خالل‬ ‫من‬ ‫وذلك‬ ‫الصوتية‬
	‫األولى‬ ( ‫االمونيوم‬ ‫يتات‬ ‫بكبر‬ ‫تشبعها‬ ‫درجة‬ ‫على‬ ‫اعتمادا‬ ‫الخام‬ ‫المستخلص‬ ‫في‬ ‫الموجودة‬ : ‫االمونيوم‬ ‫يتات‬ ‫بكبر‬ ‫البروتين‬ ‫ترسيب‬ ، ‫البروتينات‬ ‫ترسيب‬ ‫خاللها‬ ‫يتم‬ ‫التي‬ ‫للتنقية‬ ‫األولى‬ ‫احل‬ ‫المر‬ ‫من‬ ‫الخطوة‬ ‫هذه‬ ‫تعد‬ Robyt and White,1987 ) ، ‫األمالح‬ ‫من‬ ‫لكونه‬
		،	)	1998	،	‫وآخرون‬ ‫(فؤده‬	‫يمات‬ ‫اإلنز‬	‫ف‬	‫ه‬ ‫تأثير‬ ‫وعدم‬	‫عالية‬ ‫سرعة‬ ،	‫ب‬ ‫الذوبان‬ ‫على‬ ‫بقابليتها‬ ‫تمتاز‬ ‫التي‬

 ;Csopak et al.,1972 ;Woolkalis and Baumann, 1981 ;Brenna et al., 1975Morales et al., 2000 ;Yamashita et al.,
Biochemical Study of Alkaline Phosphatase in Staphylococcus aureus