合成大片段基因的瓶颈是什么？我们离人工制造一个生物还有多远？
现在最常用的DNA合成方法是固相亚磷酰胺三酯法，从3‘到5'合成， 1、脱保护基 (Deblocking) 用三氯乙酸 (Trichloroacetic Acid，TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT (二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。 2、活化 (Activation) 将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体 (其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。 3、连接 (Coupling) 亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。 4、封闭 (Capping) 缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。 5、氧化 (Oxidation) 缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。 因此每增加一个碱基需要5步反应，即使假设每一步效率是99%，那么总的效率也是0.99^(5*碱基长度)，用科学计算器很容易算出来100bp的最终目标产品的占总量的比例。 因为DNA合成是在固相上进行的，每一个碱基的合成包含了脱保护基(DMT)、碱基的加成、盖帽(Capping)、氧化等步骤。如果说某一个碱基由于种种原因(如瓶中溶液没有了，或管道堵塞)，未加入到正在延伸的Oligo上，那么下一个反应Capping将会把Oligo封死，使整个oligo合成立即中止。在纯化过程中，这种合成不完全的短片段是可以被去除的，因此化学合成的精确性是没有问题的； 但是Hecker,KH使用两条长123和126的化学合成的DNA，用DNA聚合酶进行primer,extension并且酶切连接转化后检查in vivo的复制发现： 好像不知道为什么合成的DNA复制错误率还是挺高的，这篇太老了下不到我就懒得再找全文了…… 现在也全基因合成，乃是把基因组分别设计成很多短片段然后一步步PCR得到的(Hoover, D. M., & Lubkowski, J. 2002)，要合成一个10kb的全基因，想想就真是一件天怒人怨的事情啊……
赞同 和 的回答，人工合成大片段基因第一步就是合成长核苷酸链的问题，因为核苷酸是一个个加上去的，即使每一步得率都很高，但一旦长了就没有办法。现在我们在invitrogen合成引物（单核苷酸链），单条在56个（好像？）核苷酸以下的一个价，56个以上的另一个价，最长不能超过120个（好像？），这似乎就是目前用固相亚磷酰胺三酯法合成引物的极限了。 因为基因组是双链的，我们可以通过合成互补的两条单链退火得到需要的双链，这样得到的不过是一百来个碱基对的DNA双链。而最小的有细胞结构的生物的基因组也有160kb之巨。 为了得到更长的DNA双链，我们可以用分子生物学的工具来做到。比如，在模板存在的情况下，我们可以通过PCR的方法，使用高保真的聚合酶，一次性扩增产生10kb以上的片段；我们还可以通过限制性内切酶和连接酶的工具，将多个DNA片段连结上；我们也能通过使用quikchange诱变的方法对DNA序列进行小范围的修改；我们还能通过BAC、YAC等载体将得到的超长片段在细菌或酵母内保藏、扩增。如果不考虑基因组的装配，以现在的技术，我们是能够获得长达一万kb的DNA双链的，请看这货的工作： 。 基因合成无法做到像3D打印的原因是尺度不同，3D打印是在宏观尺度上材料的构筑，而基因合成是在分子尺度上的化学反应，它们的原材料服从的物理规律不一样。除非咱能得心应手地操作单分子。 如果我们硬要从一堆无机物，de novo做一个生命出来，俺不知道还有多远，不过乐观估计是以十年为单位计算的。这个问题可能是没有意义的，因为以现有的生物资源，我们似乎只用在它们的基础上进行修改、不断地修改，就能够满足人类的需求了。而这样的事情，不是有人在做么？此所谓：转基因。