合成大片段基因的瓶颈是什么？我们离人工制造一个生物还有多远？
谢邀，正如评论所说，每一句问题描述都是一个课题。对于我这种得个目的片段用PCR，合成DNA片段找公司的人来说，我尚未遇到瓶颈哈哈。对于题主的问题也只能翻翻文献给个我认为能解释的答案。 回答这个问题，不明确的地方有：大片段基因有多大，多少bp算大？题主所指的基因概念模糊，是单个基因还是基因组？目前单个基因以及多个基因的合成技术很成熟了，但是大片段的（≥100kbp）DNA合成研究的较少，难度也很大。 目前人工合成基因的方法除了从自然界中获取样品再通过PCR（聚合酶链式反应）扩增外，就是用化学合成的方法合成而不需要模板。化学方法合成主要是固相亚磷酰胺三酯法，原理看下面参考文献，也有其他人提到了，合成的寡核苷酸链越长，得率越来越低，出错率越来越高，因此目前不可能用化学方法愣头愣脑直接合成哇长哇长的DNA片段。 大片段DNA合成的基本策略是： 1、将dNTP(也就是原料)按照要求的DNA序列合成寡核苷酸； 2、将寡核苷酸组成较短的DNA序列（400-600bp）； 3、将短的DNA序列通过融合连接的方法连成长的基因序列（＞1kbp）； 4、通过普通的酶连接法或细胞体内重组合成更长的基因和组成基因组的长片段(≥ 10kb)； 5、在大肠杆菌及酵母中依次组装，最后达到超过1 Mb的基因组； 6、将合成的基因组移植到细胞中去，并使合成的基因组的基因按要求表达。 大片段基因的合成难点在哪？ 大致的理由其他人也说了，DNA长，周期长、易出错。1、合成成本高。合成1Mbp的双链DNA大约需要20w美元。这只是碱基的价钱，还有时间、基因设计分析等等； 2、DNA合成过程易出错，出错概率在1-11个/kbp,那么，每合成一段DNA则需要测序比对，找到突变位点并修复，这个过程复杂又漫长； 我们离人工制造生物还有多远？ 世界上有很多课题组有基因合成和人工生命合成尝试。想要得到像人这样复杂的生命体还要很久，目前都是合成原核生物的基因组。以下是个例子： 2010年《Science》杂志发表的文章“Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome”介绍了 J. Craig Venter课题组人工合成1.08Mbp的基因组导入到 M. capricolum的受体细胞中并创造出新的M. mycoides细胞，可以认为是人工合成的生命结构，该细胞内只含人工合成的DNA序列并且有预期的表型，同时能够连续复制。 下图是该课题组人工合成基因的方法 大致流程是在体外合成110个10kbp的DNA（蓝色片段）并在酵母细胞中装配，这110个DNA片段10个为一组连成11个100kbp的片段（绿色片段），最后将这11个大片段连接成基因组（红色环）。整个基因组包括4个watermarker及若干酶切位点以保证有选择性标记。 其实单纯的合成大片段基因只要有钱有时间有精力，慢慢搞肯定能搞出来，更难的在于基因的排列、非结构基因分析、代谢通路、蛋白组学的研究等等，这些问题没有解决的情况下，人造生物的合成那还差得远。 不知此回答题主满意否 参考：Gibson DG et al. Creation of a bacterial cell controlled by achemically synthesized genome. Science, 2010, 329: 52-56 王冬梅.从碱基到人造生命——基因组的从头合成.生命的化学
关于合成DNA的原理，楼上各位已经介绍很多了。的确，目前在DNA分子的合成层面，最大的技术困难就是如何合成长链的DNA分子。另一个重要的问题是，合成的DNA分子如何进行高效的组装？ 传统的限制性内切酶效率低、限制多；新兴的gibson assembly方法依赖于PCR，但只要是PCR，在基因组水平的DNA组装上，就一定会发生突变；不依赖于PCR的golden gate方法目前是最可靠最高效的方法，新近一系列基因组水平DNA合成的文章大都采用了此方法。然而即便如此，也只是一次组装5~8个长度在1k~2k之间的片段，比起基因组水平动辄以百万碱基作为单位的长度，还是小巫见大巫。 通量低必然导致成本高，也就成了合成大片段DNA的最大门槛。