Preparare il Vetrino Esaminare i Risultati Eseguire la Colorazione Gram
Indossa i guanti e lega i capelli lunghi per evitare di contaminare il campione di batteri in esame. Disinfetta la superficie di lavoro sotto una cappa aspirante o in un’altra zona ben ventilata. Controlla che il microscopio e il becco di Bunsen siano perfettamente funzionanti prima di procedere. Se è sporco, lavalo con acqua e sapone per eliminare il grasso e il sudiciume. Disinfettalo poi con l’etanolo, un detergente per vetri o con qualunque altro metodo consigliato dalle procedure del laboratorio dove lavori. Puoi usare la tecnica della colorazione Gram per identificare i batteri presenti su un campione medico oppure la coltura di un piatto di Petri. Affinché una colorazione Gram sia utile, devi aggiungere un sottile strato di campione sul colorante. È meglio lavorare su un campione non più vecchio di 24 ore perché, trascorso questo tempo, ci sono maggiori possibilità che le membrane cellulari dei batteri siano danneggiate e quindi la colorazione è meno efficace e precisa.  Se usi un campione di tessuto, versane 1-2 gocce su un vetrino. Spargilo uniformemente sul vetrino per formare una pellicola sottile. Puoi farlo premendo un altro vetrino sopra il primo che contiene il campione. Lascialo asciugare all'aria. Se i batteri provengono da una coltura nel piatto di Petri, sterilizza un bastoncino per inoculazione sulla fiamma di un becco di Bunsen fino a farlo diventare incandescente. Aspetta che raffreddi e utilizzalo per far cadere una goccia di acqua sterilizzata sul vetrino; sterilizza e raffredda ancora una volta il bastoncino prima di trasferire un sottile campione di batteri nell’acqua. Mescolali con delicatezza. I batteri presenti in colture (il “brodo” batterico) andrebbero miscelati in una centrifuga e poi aggiunti al vetrino tramite il bastoncino senza aggiungere acqua. Se il campione è stato raccolto con un tampone, fai rotolare la punta del cotton fioc lungo la superficie del vetrino. Il calore permette al campione di aderire al vetrino così che non si perda durante i risciacqui della colorazione. Fai scorrere rapidamente il vetrino due o tre volte sopra la fiamma di un becco di Bunsen oppure usa uno scaldino elettrico apposito. Cerca però di non surriscaldare lo striscio per evitare che venga distorto. Se usi il becco di Bunsen, regola la fiamma in modo che sia un piccolo cono blu, non lungo e arancione. In alternativa, usa il metanolo aggiungendone 1-2 gocce sullo striscio asciutto. Elimina il metanolo in eccesso e lascia che il vetrino si asciughi all’aria. Questo metodo minimizza i danni alle cellule ospiti lasciando uno sfondo più netto. Si tratta di un piccolo piatto poco profondo in plastica, vetro o metallo con una griglia o rete metallica sulla parte superiore. Appoggia il vetrino sopra questa rete in modo che i liquidi utilizzati possano colare nel piatto sottostante. Se non possiedi un vassoio di colorazione, usa in alternativa un vassoio per cubetti di ghiaccio. Inserisci il vetrino sotto l’obiettivo e controlla i batteri. Questi possono variare molto per dimensione, quindi l’ingrandimento totale necessario varia da 400x a 1000x.  Se utilizzi un ingrandimento molto alto, è meglio usare una lente obiettivo in bagno d’olio per ottenere immagini più chiare. Metti una goccia di olio (per microscopio) sul vetrino evitando di muoverlo per non formare delle bolle. Muovi la torretta del microscopio per selezionare l’obiettivo a immersione mettendolo poi a contatto con l’olio. Il bagno d’olio va usato solo con le lenti specifiche e non con i normali obiettivi "a secco". Esamina il vetrino con il microscopio ottico; i batteri positivi saranno viola a causa del cristalvioletto intrappolato nelle loro membrane cellulari spesse. I gram-negativi saranno rosa o rossi, perché il violetto di genziana è stato “lavato via” dalle loro pareti cellulari sottili e il colorante di sfondo è penetrato.  Se lo striscio è troppo spesso potresti avere dei risultati falsi positivi. Colora un nuovo campione se tutti i batteri risultano gram-positivi, per essere certo che non ci siano errori. Se il flusso di decolorante si è prolungato troppo, allora potresti avere falsi negativi. Colora un nuovo campione se tutti i batteri sono gram-negativi, per essere certo dei risultati. Se non sei certo di quale batterio si tratti, puoi controllare una raccolta di immagini, catalogate per forma e colorazione Gram. Puoi trovare molti data-base online. Per rendere l’identificazione più semplice, i batteri più comuni o quelli di maggiore rilevanza medica sono catalogati per colorazione Gram e forma. I batteri, oltre che per la colorazione, sono anche raggruppati in base alla forma che appare al microscopio. I più comuni sono i “cocchi” (sferici) o i bastoncelli (cilindrici). Ecco alcuni esempi di batteri gram-positivi (colorati di viola) catalogati per forma:   I cocchi gram-positivi sono generalmente Stafilococchi (che significa cocchi in gruppi) o Streptococchi (che significa cocchi in catene).  I bastoncelli gram-positivi includono Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, e Listeria. Gli Actinomyces spesso hanno dei filamenti o diramazioni. Questi sono colorati di rosa e per lo più vengono classificati in tre gruppi. I cocchi dalla forma sferica, i bastoncelli allungati e sottili e infine i coccoidi che sono una via di mezzo.   I cocchi gram-negativi sono più comunemente Neisseria.  I bastoncelli gram-negativi includono E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas e molto altro. Il Vibrio cholerae può assumere la forma di normale bastoncello oppure di bastoncello ricurvo.  I bastoncelli gram-negativi coccoidi (o coccobacilli) includono Bordetella, Brucella, Haemophilus, Pasteurella. Alcuni batteri sono difficili da valutare con precisione, a causa delle loro pareti cellulari fragili o impermeabili. Possono mostrare una colorazione mista viola e rosa oppure colorazioni diverse per batteri dello stesso tipo presenti nello stesso striscio. Tutti i campioni più vecchi di 24 ore presentano questo problema, ma ci sono ceppi di batteri difficili da individuare in ogni fase. In tal caso sono necessari dei test specifici per ridurre il campo delle possibilità e giungere alla loro identificazione, come ad esempio la colorazione di Ziehl-Neelsen, l’osservazione in coltura, i test genetici e il TSI agar.   Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium e  Propionibacterium sono tutti considerati dei batteri gram-positivi, anche se a volte non appaiono colorati in maniera inequivocabile. I batteri piccoli e sottili come Treponema, Chlamydia e Rickettsia sono difficili da colorare con la tecnica di Gram. Le procedure per eliminare il materiale cambiano da laboratorio a laboratorio in base al tipo stesso di materiale. Solitamente i liquidi presenti nel vassoio di colorazione vengono eliminati come rifiuti pericolosi dopo essere stati sigillati in apposite bottiglie. I vetrini vengono sterilizzati in una soluzione al 10% di candeggina e poi eliminati come strumenti taglienti. Usa una pipetta per bagnare lo striscio con diverse gocce di questo colorante (a volte chiamato violetto di genziana). Attendi 30-60 secondi. Il cristalvioletto si dissocia in una soluzione acquosa (CV+) e in ioni cloruro (Cl-). Gli ioni penetrano attraverso la membrana sia delle cellule gram-positive che gram-negative. Gli ioni CV+ interagiscono con i componenti con carica negativa delle pareti cellulari batteriche colorandole di viola. Molti laboratori usano il violetto di genziana della "Hucker" che è arricchito con ossalato di diammonio per prevenire la precipitazione. Inclina il vetrino e usa una bottiglia a spruzzo per lavarlo con un flusso leggero di acqua distillata o di rubinetto. L’acqua dovrebbe scorrere sullo striscio senza che il flusso lo colpisca direttamente. Non esagerare con questa operazione perché potresti rimuovere la colorazione dalle cellule batteriche gram-positive. Anche in questo caso, usa una pipetta e ricopri lo striscio con lo iodio. Aspetta 60 secondi e poi risciacqua con il medesimo metodo sopra descritto. Lo iodio, sotto forma di ioni negativi, interagisce con i cationi CV+ per formare dei complessi più grandi di cristalvioletto e iodio (CV-I) fra gli strati interni ed esterni delle cellule. Questa fase consente al colore viola di fissarsi sulle cellule dove è stato assorbito. Lo iodio è corrosivo, evita di inalarlo, ingerirlo e di entrarne in contatto con la pelle nuda. Per questa fase si usa, solitamente, una miscela in parti uguali di acetone ed etanolo. Il tempo di posa del decolorante deve essere monitorato con grande attenzione. Afferra il vetrino e inclinalo, aggiungi la miscela decolorante fino a quando non noti più il colore viola nel flusso di risciacquo. In genere sono necessari 10 secondi di flusso con il decolorante (o anche meno, se la concentrazione di acetone nella miscela è alta). Non appena tutto il violetto di genziana è stato rimosso sia dalle cellule gram-positive che negative, fermati o dovrai ripetere tutto da capo. Risciacqua immediatamente l’eccesso di miscela decolorante con il metodo descritto in precedenza.  Per decolorare lo striscio puoi utilizzare anche acetone puro (concentrazione maggiore del 95%). La decolorazione è tanto più veloce quanto maggiore è il contenuto di acetone nella miscela di decolorazione; proprio per questo devi essere ancora più preciso nel calcolo delle tempistiche. Se hai difficoltà a monitorare la decolorazione, aggiungi la miscela goccia a goccia. La colorazione di sfondo, per lo più safranina o fucsina, viene utilizzata per aumentare il contrasto fra i batteri gram-positivi e quelli gram-negativi colorando quest’ultimi (che sono stati decolorati dall’acetone) di rosa o di rosso. Lascia il secondo colorante in posa per almeno 45 secondi e poi sciacqualo. La fucsina colora i batteri gram-negativi in modo più intenso, come il haemophilus e la legionella. Questi due tipi di batteri sono ottimi come esercizio per i principianti. Puoi aspettare che si secchi all’aria oppure utilizzare della carta assorbente appositamente studiata a questo scopo. La colorazione Gram è ora completa.
Preparati per il lavoro di laboratorio. Sterilizza il vetrino. Metti un semplice campione sul vetrino. Scalda il campione per fissare lo striscio. Appoggia il vetrino sul vassoio di colorazione. Prepara il microscopio ottico. Riconosci i batteri gram-positivi e quelli gram-negativi. Controlla le immagini di riferimento. Riconosci i batteri gram-positivi in base alla forma. Identifica i batteri gram-negativi. Valuta i risultati misti. Smaltisci il materiale. Lava il vetrino con il cristalvioletto. Risciacqua il cristalvioletto con delicatezza. Risciacqua il campione con iodio e poi con acqua. A questo punto decolora il campione e procedi a un rapido risciacquo. Bagna lo striscio con la colorazione di sfondo e poi risciacqualo. Asciuga il vetrino.
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Preparing a Gram Stain Examining the Result Performing the Gram Stain