<h2>SDS-polyacrylamide gel 전기영동 및 Western blot analysis</h2><p>선행 방법에 준하여 정상 및 길경 추출물이 처리된 배지에서 자란 세포들을 lysis buffer로 용해한 후, 고속원심분리로 세포 내 잔사물을 분리시킨 후 동량의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 분리한다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose mem-brane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, \( 10 \% \) skim milk를 함유한 PBS-T \( \left(0.1 \%\right. \) Tween 20 in PBS)에 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 이상 incubation하면서 비특이적인 단백질들에 대한 block-ing을 실시하였다. 그리고 특정 단백질에 대한 항체를 membrane에 적용시켜 항원 항체 반응을 일으킨 후, PBS-T로 씻어내고 특정 항체에 대한 이차 항체 반응을 실시한 후 ECL (Enhanced ChemiLuminoesence) 용액 (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, 이차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다.</p><h2>RT-PCR 법에 의한 전사 수준 조사</h2><p>이상과 같은 동일한 조건에서 준비된 암세포를 대상으로 RNAzol B(TEL-TEST, INC., Texas, USA)을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, Choi의 방법에 준하여 oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 \( 2 \mu \mathrm{g} \) 의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 template로 사용하여 Bax, Bcl-2 및 caspase-3 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다. 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 포함하여 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산물들을 \( 1 \% \) agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, Sigma)를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.</p>
특정 단백질에 대한 항체를 어디에 적용시켰는가?
membrane