<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물재료 및 성장조건</h2><p>담배 (Nicotiana tabacum cv. Xanthi)를 식물재료로 사용하였다. 담배종자는 \( 70 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 에탄올에서 2분간 표면살균한 다음, \( 2.5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) sodium hypochlorite 용액에서 10분간 살균하고 멸균수로 3회 세척하였다. 살균된 종자는 \( 2 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) sucrose가 포함된 1/2 MS 기본배지 (Murashige and Skoog 1962)에 파종하고, 파종 후 4주 기내배양된 담배식물체의 엽절편체를 실험재료로 사용하였다. 유전자 도입 및 발현이확인된 형질전환체 종자는 1/2 MS 기본배지에 파종하였다. 파종된 종자는 \( 26^{\circ} \mathrm{C} 16 \mathrm{~L} / 8 \mathrm{D} \) 광주기에서 2 주간 배양 후 0, 100, 200, 300, 400 \(\mathrm{mM} \)의 NaCl 및 sorbitol이 각각 포함된 1/2 MS배지에 옮겨 치상하거나 이후의 색소 및 토코페롤 함량 분석실험을 위한 온실재배를 위해 토양으로 이식하였다.</p><h2>유전자</h2><p>들깨로부터 분리한 \( \gamma \)-TMT 유전자 (Kim et al. 2002)를 형질전환 벡터제조를 위해 사용하였다. \( \gamma \)-TMT 유전자는 nopaline synthase terminator (nos-T)와 함께 식물형질전환 벡터인 pBI121의 변형벡터인 pHF 벡터내로 도입하여 CaMV \( 35 \mathrm{S} \) promoter에 의한 \( \gamma \)-TMT 유전자의 발현을 유도하도록 하였다. 구축된 식물발현용 운반체인 pHFT는 freeze-thaw 방법으로 Agrobacterium tumefaciens EHA101에 도입하였다.</p><h2>형질전환</h2><p>벡터 pHFT로 형질전환된 Agrobacterium tumefaciens EHA101을 YEP (hygromycin)액체배지에 접종하여 48시간 동안 진탕 배양하였다. Agrobacterium 배양액에 담배 엽절편체를 20분 간 감염시킨 다음, \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) NAA, \(1 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\) BA, \(20 \mathrm{g} / \mathrm{L} \) sucrose, \( 8 \mathrm{g} / \mathrm{L} \) agar가 첨가된 MS배지에서 2일간 공동배양하였다. 형질전환된 재분화 식물체를 얻기 위하여 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) NAA, \(1 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) BA, \(300 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) carbenicillin, \( 10 \mathrm{mg} \) hygromycin, \( 20 \mathrm{g} / \mathrm{L} \) sucrose, \( 8 \mathrm{g} / \mathrm{L} \) agar가 첨가된 MS배지에서 배양한 다음, 3주마다 계대배양 하였다. 재분화된 신초는 \( 300 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) carbenicillin, \( 10 \mathrm{mg} \) hygromycin, sucrose \( 20 \mathrm{g} / \mathrm{L} \) sucrose, \( 8 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) agar가 첨가된 MS 배지로 옮겨 발근을 유도하였다. 발근된 개체는 순화 후 화분으로 이식하여 온실에서 생육시켰다.</p><h2>형질전환체 검정</h2><p>형질전환체에서 형질전환유전자의 도입을 확인하기 위하여 PCR 방법이 이용되었다. Genomic DNA 추출은 형질전환체의 잎조직 \( 1 \mathrm{g} \) 을 cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)방법으로 추출하였다 (Jones and Walker 1963), PCR 분석을 위한 반응액은 i-star taq PCR pre-mix (Intronbio, 한국)를 사용하였고, CaMV 35S 프로모터와 \( \gamma \)-TMT 유전자 부위의 염기서열을 이용하여 제작한 primer (forward primer 5'-GGAC CTAACAGAACTCGCCGTAAAGAC-3'/ reverse primer 5'-CCACCCGGTGGTGCAGATACCT-3')와 하이그로마이신 저항성 유전자 내의 염기서열을 이용한 primer (forward primer 5'-CCGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTG-3'/ reverse primer 5'-CTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCT-3')를 사용하였다. PCR 반응은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 60^{\circ} \mathrm{C}\) 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 1분으로 30회 반응시킨 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 extension하였다.</p><p>도입된 \( \gamma \)-TMT 유전자의 발현확인은 RT-PCR 방법을 사용하였다. 형질전환체 및 대조구로부터의 total RNA는 액체질소를 이용하여 식물조직을 완전히 분쇄한 후 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 추출하였다. 추출된 total RNA lug은 SuperScript \( { }^{\mathrm{TM}} \) ll Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 \( \gamma \)-TMT의 염기서열 일부를 이용하여 제작한 프라이머 (forward primer 5'-AGGTATCTGCACCACCGGGTGGC-3'/ reverse primer 5'-GATAGGTCOCTGTGGCACCATGTAACGAT-3')를 이용하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 30초, \( 60^{\circ} \mathrm{C}\) 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 1분을 1회 반응주기로 하여 28주기 동안 증폭하였다. 최종 PCR 산물은 \( 1 \% \) agarose gel 상에서 전기영동으로 분리하여 ethidium bromide로 염색하여 확인하였다.</p><h2>토코페롤 합성 유전자의 발현분석을 위한 RT-PCR</h2><p>담배 HPT, TC 유전자의 cDNA 클로닝은 이미 보고된 감자 (Solanum tuberosum) TC 유전자(accession no. AY536918)와 애기장대 (Arabidopsis thaliana) HPT 유전자 (accession no. AF324344)의 염기서열을 이용하였다. 담배에서 클로닝된 유전자의 염기서열 분석을 통해서 TC (forward primer 5'-ATGTACTCTGTAGAGAATCCTGCATTTCCCAAG-3' reverse primer 5 'TCCTGCTGTAGACTTCTGCTTTGAGTTAACGT-3')유전자와 HPT (forward primer 5'-GCAACAGGTGAGCTCCACTGAAAGCTTAG-3'/ reverse primer 5'-TACGTGGAACAGCATTAGGATCCCTCTCA-3') 유전자에 대한 primer를 합성하였다. 합성된 primer를 이용하여 형질전환체 및 대조구에서 추출된 total RNA lug을 모형으로 하여 제조한 cDNA를\( 94^{\circ} \mathrm{C}\) 30초, \( 60^{\circ} \mathrm{C}\) 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 1분을 1회 반응주기로 하여 25주기 동안 증폭하였다. 증폭된 DNA의 정량화를 위한 ternal standard는 actin (forward primer 5'-CTATTCTCCGCTTTGGACTTGGCA-3'/ reverse primer 5'-AGGACCTCAGGACAACGGAAACG-3')유전자를 이용하였다.</p><h2>토코페롤 추출 및 분석</h2><p>토코페롤 추출은 Panfili 등 (2003)의 방법에 따라, 대조체와 형질전환체 식물체의 잎을 막자사발을 이용하여 분쇄 후 건조 중량 \( 0.5 \mathrm{g} \)의 시료에 internal standard (a-tocopherol acetate, \( 50 \mathrm{ppm} \) )와 추출용매 \( 100 \mathrm{ml} \) (Methanol: Ethylacetate: Ether= 1: 1: 1)을 넣어 혼합한 후 1시간동안 초음파 추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman, No.4)로 여과한 후 농축하여 \( 50 \mathrm{ml} \) ethyl acetate로 녹여 삼각 flask에 옮겨 담은 후 \( 1.5 \mathrm{ml} \) Potassium hydroxide 포화용액을 넣어서 16시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 용액은 분액여두에 옮겨서 동량의 증류수로 용매 분획한 상등액 (ethyl acetate)을 모았다. 같은 방법으로 3회 추출한 ethyl acetate용액에 sodium sulfate anhydrous 를 넣어 수분을 제거한 후 여과지로 여과하였으며, 여액은 회전농축기로 농축 후 \( 2 \mathrm{ml}\)MeOH (\(1\%\) BHT; Butylated Hydroxy Toluene)에 완전히 녹여 Polyfluortetraethylene (PTFE) syringe filter로 재 여과한 후 HPLC 분석을 실시하였다. 정량분석에 사용된 HPLC는 Shimadzu (Japan)사 제품으로 두개의 펌프(LC-10ADvp)와 SPD-M10 Avp PDA (photodiode array) detector에 Class-vp software를 사용하였고 파장은 \( 290 \mathrm{nm} \) 에서, 컬럼은 COSMOSIL packed column \( (4.60 \times 150 \mathrm{mm}, 5 \mu \mathrm{m}) \) 이며 injection volume은 \( 40 \mu \mathrm{l} \), 유속은 \( 2 \mathrm{mL} / \mathrm{min} \) 이었다.</p><h2>클로로필과 카르테노이드 정량</h2><p>파종 후 5주 후 대조구와 형질전환체의 완전 전개된 상위 2, 3엽면체를 Lichtenthaler (1987)의 방법에 따라 \( 80 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)acetone을 이용하여 추출한 후 \( 663,647,470 \mathrm{nm} \)에서의 흡광도 값을 측정하여 정량화 하였다.</p>
어떤 벡터 안에서 \( \gamma \)-TMT 유전자 발현을 유도하는가?
pHF 벡터