<h1>재료 및 방법</h1><p>본 실험에 사용된 재료인 땅강아지는 2005년 9월경 무주군 설천면에서 채집하였다. 채집된 개체 중 1개체는 건조시켜 본 연구실에서 확인용으로 stock하고 있다. 채집된 시료는 실험직전까지 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관을 하였으며, \( 50 \mathrm{ml} \) tube에 각 \( 1 \mathrm{~g} \)을 보존하였다. 추출용매로 DW, DMSO, 에탄올, 메탄올을 사용하였다. 추출 용매의 양은 \( 0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{ml} \)의 비율로 추출하였으며, 용매에 따라 추출 조건을 달리하여, DW의 경우는 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안의 열수 추출 과정을 거쳤으며, DMSO, 에탄올, 메탄올의 경우에는 24시간 동안 실온에서 혼탕과정을 거쳐 추출하였다. 실험에 사용된 시약으로는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma, St. Rouis, MO, USA), ferric tripyridyl triazine (Fe(III)-TPTZ, Sigma, St. Rouis, MO, USAa) 등이 사용되었다. 또한 흡광도의 측정은 multi-label counter인 VICTOR 3 (Wallac, Turku, Finland)를 사용하였다.</p><h2>DPPH radical 소거활성</h2><p>DPPH radical 소거 활성능 측정은 이전에 보고된 방법을 변형하여 실험에 사용하였다. 각 추출물의 시료를 \( 10 \mu l \)와 \( 0.2 \mathrm{mM} \mathrm{DPPH} \) 를 \( 190 \mu l \)를 첨가하여 실온에서 30분간 반응한 다음 \( 517 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. DPPH radical 소거활성 비율(\(\%\) inhibition)은 다음과 같이 계산을 하였다.</p><p>Radical inhibition \( (\%)=\frac{A b: \text { control }-A b: \text { sample }}{A b: \text { control }} \times 100 \)</p><p>Ab: control (무처리군), Ab: sample (처리군) Ab; absorbance at \( 517 \mathrm{~nm} \)</p><h2>FRAP 활성 측정</h2><p>실험을 위한 반응액으로는 acetate buffer \( (\mathrm{pH} 3.6,300 \) \( \mathrm{mM}): 10 \mathrm{mM} \)의 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ): \( 20 \mathrm{mM} \)의 \( \mathrm{FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)를 10:1:1의 비율로 섞어 실험 직전에 만들어 사용을 하였다. 반응액 \( (190 \mu \mathrm{l}) \)과 추출물 \( (10 \mu \mathrm{l}) \)을 혼합한 후 150 초 간격으로 약 30 분간 \( 590 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 환원력은 FRAP value \( \left(\mathrm{Fe}_{2} \mathrm{SO}_{4}\right. \) conc. \( ) \) 에 대한 활성정도를 15분 후의 값을 기준으로 구했으며, 이후 시간에 따른 상대 비교를 하였다.</p><h2>Hydroxy radical scavenging assay</h2><p>Hydroxyl radical 소거 활성은 2-deoxyribose 산화 방법을 이용하였다. \( \mathrm{Fe}^{\mathbb{I}} \) 와 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 가 반응하는 Fenton 반응에 의해 생성되어진 hydroxyl radical이 2-deoxyrebose를 산화시켜 malondialdehyde (MDA)로 분해시키며 이 MDA를 \( 530\mathrm{~nm} \) 에서 측정한다. \( \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \quad(50 \mathrm{mM}, 10 \mu \mathrm{l})\), EDTA(ethylenediaminetctraacetic acid, \( 50 \mathrm{mM}, 10 \mu \mathrm{l} \) ), 2-deoxyrebose \( (50 \mathrm{mM}, 20 \mu \mathrm{l}) \), 땅강아지 추출물 \( (10 \mu \mathrm{l}) \)를 넣은 다음 phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.4,100 \mathrm{mM}, 120 \mu \mathrm{l}) \) 와 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}(50 \mathrm{mM} \), \( 20 \mu \mathrm{l}) \)를 넣은 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 시간 동안 반응을 하였다. Trichloroacetic acid (TCA, 2.8\%, \( 100 \mu \mathrm{l} \) )와 2-thiobarbituric acid (TBA, \( 2 \%, 100 \mu l) \)를 반응물에 첨가하였다. 밀봉 후 dry oven을 이용하여 \( 85^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20분간 반응시킨 다음 얼음을 이용하여 냉각 후 spectrophotometer (Perkin Elmer, Turku)를 이용하여 \( 530 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. Hydroxy radical소거 활성(\(\%\))은 아래의 식으로부터 계산하였다.</p><p>Hydroxy radical\[(\%)=\frac{A b: \text { control }-A b: \text { sample }}{\text { Ab: control }} \times 100\]</p><p>\( \mathrm{Ab}: \) control (무처리군), Ab: sample (처리군) Ab; absorbance at \( 530 \mathrm{~nm} \)</p><h2>Cox-2 promoter luciferase assay</h2><p>Promoter assay는 단백질의 발현이라는 초기 단계의 gene을 이용하여 gene의 발현 패턴을 알아보는 실험이다.</p><p>Human genomic DNA에서 cyclooxygenase-2 (Cox-2) 유전자의 promoter 부분(-1432~ +52)을 pcDNA3.1 (Invitrogen) vector에 cloning 하였다. Luciferase 활성 유전자를 Cox-2 promoter gene의 뒷부분에 다시 cloning 한 후 U18 glioma cell line에 lipofectamine을 이용하여 24시간 동안 tans- fection한 후 G418을 이용하여 selection 과정을 거쳤다. 확립된 Cox-2 promoter/luciferase 발현 세포주에 activator인 PMA \( (100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \)를 처리하여 Cox-2 promoter의 활성을 높임과 동시에 추출물을 \( 10 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 처리 하였다. 활성 측정 시스템은 Promega의 luciferase 측정 kit을 사용 하였으며, VICTOR 3 (Perkin Elmer, Turku)롤 이용하여 활성을 확인하였다.</p><h2>통계 분석</h2><p>각 결과의 분석은 Student's t-tests로 비교하였다.</p>
FRAP value \( \left(\mathrm{Fe}_{2} \mathrm{SO}_{4}\right. \) conc. \( ) \) 에 대한 활성정도를 15분 후의 값을 기준으로 무엇을 구했어?
환원력