<h1>혈액 채취 및 분석 방법</h1><h2>혈액 채취</h2><p>실험쥐들의 혈액 채취는 8주간의 운동수행을 끝낸 뒤 24시간 뒤 최소 10시간 이상의 공복을 유지한 상태에서 혈액을 채취하였다. 그 절차는 먼저 급속적으로 호흡기 마취가 가능한 Chloroform으로 호흡기를 통한 마취를 시킨 후 개복을 하지 않은 상태에서 실험쥐를 앙와위 자세로 고정시킨 뒤 일반 \( 10 \mathrm{ml} \) ( \( 21 \mathrm{~gage} \) ) 주사기로 심장의 좌심실에 첨자 하여 약 \( 5 \mathrm{ml} \) 이상의 혈액을 채취하여 이용하였다. 채취된 혈액은 즉시 혈청 튜브에 넣어 \( 3000 \mathrm{~rpm} \) 에서 3분간 원심 분리하여 혈청을 분리하여 \(-\)70이하에서 냉동 분석 전 까지 보관하였다.</p><h2>혈당 분석</h2><p>체중은 모든 군에서 실험 시작과 함께 측정한 후 정기적으로 매주 1회씩 소형 동물용 체중계(TANITA co., Japan)를 이용하여 측정하였으며, 헐당은 당뇨 유발 후 측정한 후 정기적으로 매주 1회씩 혈액을 꼬리정맥에서 채혈하여 혈당측정기인 SUPER GLUCOCARD (ARKAY, Inc., Japan)를 이용하여 측정하였다.</p><h2>혈중 인슐린 분석</h2><p>흰쥐의 심장에서 채혈한 혈액샘플은 coating된 인슐린 항체관(insulin-specific antibody tube) 속에 넣은 다음 원심분리기(microfuge)로 20분 동안 혈청을 분리한다. 그리고 나서 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 혈청(serum)과 I-insulin을 얻고 초저온 냉동 보관 한 다음 녹십자 검사실에서 위에 떠있는 맑은 액체를 제거하고 tube 안의 방사능(radioactivity)을 Coat-A-count Insulin (DPC, USA) 키트를 사용하여 혈청 안의 insulin 농도를 쟀다. 검사 방법은 제조사의 지침에 따랐으며 Gamma counter (Hewlett Packard, USA)로 측정하였다.</p><h2>조직 절취 및 분석 방법</h2><h3>조직절취 및 GRP-78과 GLUT4 발현 분석</h3><p>8주간 운동 후 Pentobarbital \( (50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg}) \) 을 복강 내에 주입시켜 오른 쪽 하퇴에서 가자미근을 분리한다. 가자미근 조직 \( (0.5 \mathrm{~g}) \) 을 샘플 부피의 5배 정도의 lysing buffer ( \(0.1 \mathrm{M} \mathrm{~K} \) phosphate ; \( 0.5 \mathrm{M} \) EDTA, \( \mathrm{pH~} 7.2 \) )와 함께 얼음에 넣고 균질화(homogenizer) 시킨 후 \( 15,000 \mathrm{~rpm} \) 으로 20분간, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리 시켜 상층을 분리해 낸다. 총 단백질량은 BSA (bovine serum albumin, \( 570 \mathrm{~nm} \) )을 이용하여 정량화 하였다. \( 10 \% \) seperating gel (\( 30 \% \) acryiamide: bisacryl amide, \( 1.5 \mathrm{M} \) tris \( \mathrm{pH~} 8.8 \), \( 10 \% \) SDS, TEMED, \( 10 \% \) ammonium persulfate)과 \( 5 \% \) stacking gel ( \( 30 \% \) acrylamide : bisacryl amide, \( 1 \mathrm{M} \) tris \( \mathrm{pH~} 6.8 \), \( 10 \% \) SDS, TEMED, \( 10 \% \) ammonium persulfate)을 만들어 사용 하였다. 원심분리 \( (15,000 \mathrm{~rpm} \), 20분)한 상층액과 SDS loading buffer ( \( 60 \mathrm{~mM} \) tris \( \mathrm{pH~} 6.8 \), \( 25 \% \) glycerol, \( 2 \% \) SDS, \( 14 \mathrm{~mM} \) 2 - mercaptoethanol, \( 0.1 \% \) Bromophenol Blue)를 잘 혼합한 후 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 끓여 단백질을 변성시킨 후 식혀서 다시 \( 15,000 \mathrm{~rpm} \) 으로 20분간, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심 분리 한다. 스탠다드 마커 (SDS - PAGE Molecular Weight Standards, Bio - Rad)와 함께 각 샘플을 Mini - Protein Ⅱ dual - slap appratus (Bio - Rad)에 준비된 stacking gel well에 같은 total protein content \( (200 \mu \mathrm{g}) \) 가 되도록 분주하고, 80볼트에서 2시간 정도 샘플이 바닥에 닿을 때까지 전기영동 하였다.</p><p>Transfer buffer (\( 190 \mathrm{~mM} \) glycine, \( 50 \mathrm{~mM} \) Tris base, \( 0.05 \% \) SDS, \( 20 \% \) methanol)에 적신 PVDF membrane, What mann \( 3 \mathrm{~M} \) paper, 전기영동한 젤, ECL membrane을 차례대로 겹쳐 Mini trans - blot module (Bio - Rad)에 장치한 후 40볼트로 2시간 전사한다. Membrane으로 증착이 끝나면 rocker platform 위에서 1시간 동안 membrane을 \( 2 \% \) skim milk 용액으로 blocking 시킨다. 1차 항체(GLUT - 4 rabbit antibody와 GRP-78 rabbit antibody)를 blocking 용액(\(2 \% \) skim milk)으로 \( 1 : 500 \) 으로 희석시켜 1시간 30분 동안 흔들어주고 난 다음 TNT 용액으로 10분씩 3차례 헹구어 준다. 그 후 항체(Goat anti - rabbit antibody)를 blocking용액( \( 2 \% \) skim milk)으로 \( 1 : 1,000 \) 으로 희석시켜 1시간 동안 흔들어주고 난 다음 TNT 용액으로 10분씩 3차례 헹구어 준다. 마지막 단계로 alkaline phosphate buffer (\( 5 \mathrm{~M~} \mathrm{NaCl}, 2 \mathrm{~M~} \mathrm{MgCl}_{2}, 2 \mathrm{~M~} \) Tris - base \( \mathrm{pH~} 9.5 \))에 BCIP/NBT(\( 1 \mathrm{~tablet} / 10 \mathrm{~ml} \), Sigma, B - 5655)를 넣어 녹인 용액에 membrane을 넣고 30분간 발색시킨다. 얻어진 membrane을 densitymeter (Sharp jx - 330)를 이용하여 스캔 한 후 이미지 분석 프로그램(Image Master ver. 3.0, Biotech pharmacia)을 통해 GRP-78과 GLUT-4 단백질량을 산출하였다.</p><h2>자료 처리</h2><p>측정된 결과들은 SAS GLM program을 이용하여 각 항목에 대한 평균(mean) 및 표준편차(standard deviation ; S. D.)를 산출하였다. GLUT-4 단백질과 GRP-78 단백질에 대한 집단 간 차이는 일원 분산분석(one-way analysis of variance; one-way ANOVA)을 실시하였다. 사후검증은 Duncan's posthoc test를 실시하였으며, 유의수준은 \( \mathrm{p}<.05 \) 로 설정하였다.</p>
실험쥐에서 채취한 혈액의 양은 얼마인가?
약 \( 5 \mathrm{ml} \) 이상