<h2>세포 독성</h2><p>세포 독성을 알아보기 위해 B16F10 murine melanoma cell과 SK-MEL-5 human melanoma cello 이용하여 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoli um bromide (MTT) assay 를 실시하였다. B16F10 murine melanoma cell 과 SK-MEL-5 human melanoma cell을 96 well plate에 \( 5.0 \times 10^{4} \mathrm{cell} / \mathrm{mL} \) 로 분주한 후 부착 및 안정화를 위하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24 시간 동안 배양하였다. 시료의 농도는 100 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 로부터 희석하였고, 희석된 시료를 배양된 세포에 처리하여 다시 24 시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 후 \( 10 \% \) MTT (Thiazolylblue tetrazolium bromide) solution ( \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) in phosphate-bufferedsaline) \( 100 \mu \mathrm{L} \) 를 가하여 다시 1 시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고, DMSO \( 100 \mu \mathrm{L} \) 를 가하여 생성된 formazan을 용해시킨 후 multiable counter (Victor3 1420, PerkinElmer Inc.)를 이용하여 \( 590 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 대조구와 비교하여 나타내었다.</p><h2>Wound healing assay</h2><p>세포의 운동성 억제효과를 확인하기 위한 in vitro wound healing assay를 실시하였다. B16F10 murine melanoma cell과 SK-MEL-5 human melanoma cell을 6 well plate에 \( 3 \times 10^{5} \) cells/well로 분주한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24 시간 동안 배양하였다. 이후 yellow pipette tip을 이용하여 cell의 표면에 wound를 형성시키고 배양액을 교체하였다. 시료를 3, 10, \(30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 농도로 치리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하면서0, 6, 12 시간 간격으로 healing 정도를 현미경 (ECLIPSE TE2000-U, Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. Wound healing 비율은 wound의 거리를 즉정하여 억제활성의 정도를 대조구와 비교하였다.</p><h2>통계 처리</h2><p>모든 실험은 3회 반복하여 결과값을 평균과 표준편차로 나타내었고(mean \( \pm\) SD), Statistical analysis system (SAS, version 9.4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)에 의하여 유의차를 검정하였다(Duncan's multiple range test, \( p<0.05 \) ).</p><h1>결과 및 고찰</h1><h2>반응표면분석에 의한 효소 전처리 조건 최적화</h2><p>상황버섯 \( \beta \)-glucan 추출조건의 최직화를 위해 반응표면분석을 실시하였으며, 그에 따라 종속변수인 \( \beta \)-glucan 함량을 즉정한 결과는 Table 2와 같다. 추출 조건 별 \( \beta \)-glucan 함량은 \(1.0093- 2.0440 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{~g} \) 의 범위로 나타났으며, \( 0.6 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{~mL} \) 의 효소를 6시간 동안 반응시킸을 때 가장 높은 함량을 보였다.</p><p>각 실험 구간에서 최대 반응값을 가지기 위한 조건으로 viscozyme 농도는 되었으며 \( \left(\mathrm{R}^{2}=0.9245\right) \), 이 조건에서의 \( \beta \)-glucan 함량은 \( 1.9708 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{~g} \) 으로 예측되었다. 이에 따라 최적 추출 조건에서 추출한 시료의 \( \beta \)-glucan 함량은 \( 1.9594 \mathrm{~g} / 100 \) \( \mathrm{g} \) 으로 측정되었으며, 이는 예측된 \( \beta \)-glucan 함량( \( 1.9708 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{~g}) \) 과 \( 99.42 \% \) 유사하였다.</p>
배양액을 제거한 후 무엇을 얼마만큼 가해서 다시 1시간 동안 배양해?
\( 10 \% \) MTT (Thiazolylblue tetrazolium bromide) solution ( \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) in phosphate-bufferedsaline) \( 100 \mu \mathrm{L} \)