<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료</h2><p>본 실험에 사용한 큰금계국(C. lanceolata) 꽃은 2015년 7월에 경희대학교에서 채집하였고, 우석대학교 김대근 교수가 동정하였다. 표본시료(KHU-NPCL-201507)는 경희대학교 천연물화학실에 보관되어 있다.</p><h2>시약 및 기기</h2><p>시약 및 기기는 이전 실험과 동일하게 사용하였다. 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis(2-amidinopropane) dihydro-chloride (AAPH), ascorbic acid는 Sigma-Aldrich사(St, Louis, MO, USA) 로부터 구매하였다.</p><h2>추출 및 분리</h2><p>건조된 상태의 큰금계국 꽃 \( 3 \mathrm{~kg} \)을 \( 80 \% \) MeOH 수용액에 24시간 담가서 실온에서 추출하였다 (\( 67.5 \mathrm{~L} \times 4 \)). 얻어진 여액을 \( {40 }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 감압농축하여 MeOH 추출물 (\( 1.1 \mathrm{~kg} \))을 얻었다. 얻어진 MeOH 추출물은 \( \mathrm{H_{2}O} \) (\( 2 \mathrm{~L} \))와 ethyl acetate (EtOAc, \( 2 \mathrm{~L} \times 4\))로 분배 추출하였고, 다시 \( \mathrm{H_{2}O} \)층을 n-butyl alcohol (n-BuOH, \( 1.8 \mathrm{~L} \times 4 \))로 분배 추출하였다. 각층을 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 감압농축하여 EtOAc 분획(CLFE, \( 194 \mathrm{~g} \)), n-BuOH 분획(CLFB, \( 254 \mathrm{~g} \)) 및 \( \mathrm{H_{2}O} \) 분획(CLFW, \( 248 \mathrm{~g} \))을 얻었다. CLFE 분획( \( 194 \mathrm{g} \))에 대하여 silica gel (\( \mathrm{SiO_{2}} \)) column chromatography (CC) (\( \varphi ~13 \times 17 \mathrm{~cm} \), \( \mathrm{CHCl}_{3}-\mathrm{MeOH}-\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}=32: 3: 1 \rightarrow 12: 3: 1 \rightarrow 9: 3: 1 \rightarrow 6: 4: 1 \), 각각 \( 17.8 \mathrm{~L} \) 사용)를 실시하여 총 \( 13 \)개의 분획물(CLFE-1~CLFE-13)을 얻었다. CLFE-7 분획 (\( 5.1 \mathrm{~g} \))에 대하여 \( \mathrm{SiO_{2}} \) CC ( \( \delta ~4.5 \times 15 \mathrm{~cm}\), \(\mathrm{CHCl}_{3}-\mathrm{MeOH}=20: 1 \), 총 \( 5 \mathrm{~L} \) 사용) 늘 실시하여 총 \( 14 \)개의 분획물(CLFE-7-1~CLFE-7-14)을 얻었다. CLFE-7-9 분획(\( 1.1 \mathrm{g} \))에 대하여 octadecyl silica gel (ODS) CC (\( \varphi 4.5 \times 5 \mathrm{~cm} \), acetone-\( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}=2: 3 \rightarrow 1: 1 \), 총 \( 32.5 \mathrm{~L} \) 사용)를 실시하여 총 11개의 분획물(CLFE-7-9-1~CLFE-7-9-11)을 얻었다. CLFE-7-9-2 분획(\( 44.9 \mathrm{mg} \) )에 대하여 \( \mathrm{SiO_{2}} \) CC ( \( \varphi 2 \times 15 \mathrm{~cm}\), \(\mathrm{CHCl}_{3}-\mathrm{MeOH}-\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}= 50: 3: 1 \), 총 \( 720 \mathrm{~mL} \) 사용)를 실시하여 화합물 2 (CLFE-7-9-2-9, \( 12.1 \mathrm{mg}\), \(\mathrm{Ve} / \mathrm{Vt} \) 0.350-0.445, \( R_{f}=0.50 \) on \( \mathrm{SiO_{2}} \) Thin layered Chromatography (TLC) \( 60 \mathrm{~F}_{254}\), \(\mathrm{CHCl}_{3}-\mathrm{MeOH}-\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}=25: 3: 1 \) )를 분리하였다. CLFE-7-9-10 분획( \( 28.5 \mathrm{mg} \))에 대하여 ODS CC (\( \varphi 1 \times 8 \mathrm{~cm} \), acetone-\( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}=2: 3 \), 총 \( 250 \mathrm{~mL} \) 사용)를 실시하여 화합물 1 (CLFE-7-9-10-7, \( 7.9 \mathrm{mg}, \mathrm{Ve} / \mathrm{Vt} \) 0.624-0.702, \( R_{f}=0.56 \) on RP-18 TLC 60 \( F_{254 \mathrm{S}} \), acetone-\( \mathrm{H_{2}O}=2: 1 \)) 을 분리하였다.</p><p>화합물 1 (Melanoxetin): Yellow amorphous powder (MeOH); Negative fast atom bombardment mass spectroscopy (FAB/ MS) \( m/z \) 301 \( [M-H]^{-} \); Infrared spectroscopy (IR) (\( CaF_2 \) window) 3358, 1617, 1589 \( \mathrm{~cm}^{-1} \); Proton nuclear magnetic resonance ( \( { }^{1}H \)-NMR) (\( 600 \mathrm{MHz}\), pyridine-\( d_{5}\), \(\delta_{H} \)) 7.89 (\( 1 \mathrm{H}\), \(d\), \(J=1.8 \mathrm{~Hz}\), \(\mathrm{H}-2\)), 7.89 (\( 1 \mathrm{H}\), \(d\), \(J=7.2 \mathrm{~Hz}\), \mathrm{H}-5\)), 7.82 (\( 1 \mathrm{H}\), \(dd\), \(J=8.4\), \(1.8 \mathrm{~Hz}\), \(\mathrm{H}-6'\)), 7.27 (\( 1 \mathrm{H}\), \(d\), \(J=8.4 \mathrm{~Hz}\), \(\mathrm{H}-5}\)), 6.36 (\( 1 \mathrm{H}\), \(d\), \(J=7.2 \mathrm{~Hz}\), \(\mathrm{H}-6\)); Carbon nuclear magnetic resonance (\( { }^{13}C \)-NMR) ( \( 150 \mathrm{MHz} \), pyridine-\( d_{5}\),\(\delta_{C} \)) \( 176.6 (\mathrm{C}-4)\), \(167.3 (\mathrm{C}-7)\), \(164.2(\mathrm{C}-9)\), \(152.5(\mathrm{C}-2)\), \(147.2\left(\mathrm{C}-4^{\prime}\right)\), \(145.4\left(\mathrm{C}-3^{\prime}\right)\), \(135.8(\mathrm{C}-3)\), \(133.0(\mathrm{C}-8)\), \(127.5\left(\mathrm{C}-1^{\prime}\right)\), \(121.9\left(\mathrm{C}-6^{\prime}\right)\), \(119.7 (\mathrm{C}-5)\), \(117.8\left(\mathrm{C}-2^{\prime}\right)\), \(116.1\left(\mathrm{C}-5^{\prime}\right)\), \(115.7(\mathrm{C}-10)\), \(112.7(\mathrm{C}-6) \).</p><p>화합물 2 Protocatechuic acid methyl ester): White amorphous powder (MeOH); Negative FAB/MS \( m/z \) 167 \( [M-H]^{-} \) ; IR ( \( CaF_{2} \) window) 3550, 1742, 1612 \( \mathrm{~cm}^{-1} \) ; \({ }^{1} \)H-NMR (\( 600 \mathrm{MHz} \), pyridine-\( d_{5}\), \(\delta_{H} \)) 8.11 (\( 1 \mathrm{H}\), \(d\), \(J=2.4 \mathrm{~Hz}\), \(\mathrm{H}-2 \)), 7.81 (\( 1 \mathrm{H}\), \(\mathrm{dd}\), \(J=8.4\), \(2.4 \mathrm{~Hz}\), \(\mathrm{H}-6 \)), 7.27 (\( 1 \mathrm{H}\), \(\mathrm{d}\), \(J=8.4 \mathrm{~Hz}\), \(\mathrm{H}-5 \)), 3.75 ( \( 3 \mathrm{H}\), \(s\), \(7-\mathrm{OCH}_{3} \)); \( { }^{13}C \)-NMR (\( 150 \mathrm{MHz} \), pyridine-\( d_{5}\), \(\delta_{c} \)) \( 167.2 (\mathrm{C}-7)\), \(152.4 (\mathrm{C}-4)\), \(147.0 (\mathrm{C}-3)\), \(126.9 (\mathrm{C}-1)\), \(122.8 (\mathrm{C}-6)\), \(117.6 (\mathrm{C}-2)\), \(116.1 (\mathrm{C}-5)\), \(51.5 (7-\mathrm{OCH}_{3}) \).</p><h2>라디칼 소거 활성</h2><p>위 연구에 대한 재료 및 방법은 이전 실험과 동일하게 실시하였다.</p>
큰금 계국 꽃을 몇시간 추출했어?
24시간