<h2>Zebrafish에서 hHtrA2의 DNA나 RNA의 발현양상의 비교 분석</h2><p>Zebrafish에서 hHtrA2의 발현양상을 알아보기 위하여 pWT-GFP DNA나 이 plasmid를 linearlize하여 in vitro에서 합성한 WT-GFP mRNA를 각각 embryo에 microinjection하여 단백질 발현의 효율을 조사하였다. WT-GFP DNA나 mRNA 각각을 one cell stage의 embryo에 약 \( 35 \mathrm{~pg} \)을 microinjection하였으며, 수정 후 24 시간째인 prim-5 stage [somite(체절) 발생이 끝나는 단계(총 30개의 somite 발생)]에서 관찰하였다. DNA의 microinjection 후 WT-GFP의 발현양상은 embryo 전체에 dot 형태로 나타나는 것을 확인할 수 있다. York에서 관찰되는 녹색의 형광은 plasmid로부터 발현되는 WT-GFP 단백질이 아니라 york 자체가 형광을 흡수함으로써 나타나는 background이다. WT-HtrA2 mRNA를 embyo에 microinjection 후 WT-HtrA2의 발현양상을 관찰한 결과, DNA를 embryo에 microinjection하였을 때 관찰할 수 있었던 dot 형태의 양상과는 달리 몸 전체에 퍼져 있는 것과 같은 발현양상을 보였다. 특히, 발생과정 중인 zebrafish의 머리 쪽에서 WT-HtrA2가 강하게 발현되며 몸통과 꼬리 쪽으로 갈수록 약하게 발현 되는 것을 관찰할 수 있었다. 이렇게 transient로 zebrafish embryo에서 DNA 또는 RNA로부터 WT-HtrA2 단백질을 발현시켰을 때 모든 세포에서 골고루 발현되지는 않지만 zebrafish의 body 전체에 퍼져 발현되는 양상을 보였다. 또한 DNA와 mRNA 모두 발생과정 중의 zebrafish에서 발현시키게 될 경우 발현에 별 문제점이 없으므로 실험 목적에 따라 DNA나 mRNA를 선택하여 zebrafish embryo에 microinjection하는 실험을 수행할 수 있다.</p><h2>Zebrafish에서의 WT-HtrA2 단백질 발현 시스템 구축</h2><p>앞 실험에서 DNA나 mRNA를 embryo에 microinjection하였을 때 GFP fusion 단백질의 발현을 잘 관찰할 수 있으므 로, in vitro에서 mRNA를 만드는 과정을 거치지 않고 plasmid DNA를 embryo에 직접 microinjection하여 발생과정 중인 zebrafish에서 WT-GFP의 발현양상을 관찰하는 방법을 선택하였다. DNA의 microinjection은 zebrafish embryo의 one cell stage에서만 실시하였다. 두 개의 다른 발생시기인 12 hours post fertilization (hpf) (5~6 somite stage, 5~6개의 somite가 발생하는 단계이며 최초로 눈이 구별되는 단계)와 24 hpf 에서 관찰하였으며, 발생하는 embyro의 측면을 관찰 하였다.</p></p>pWT-GFP, pS306A-GFP, pGFP plasmid 모두 동일한 양의 DNA를 embryo에 microinjection하여 각 단백질들의 발현양상을 관찰하였다. GFP가 zebrafish embryo에서 발현될 경우 zebrafish의 발생에 전혀 영향을 미치지 않는 것을 관찰할 수 있다. Zebrafish에서 WT-GFP가 S306A-GFP보다 다소 적은 양이 발현되기는 하나, 각각의 HtrA2 단백질의 발현을 쉽게 확인할 수 있고 GFP 자체도 zebrafish에 영향을 끼치지 않으므로 생체 내에서 HtrA2의 생리적 기능을 연구하는 데 이 발현 시스템을 이용할 수 있다. 또한 사용한 GFP나 HtrA2 발현 vector 모두 에서 embryo에 DNA를 microinjection한 후 24시간 일 때 보다는 early time인 12 시간대에 WT-GFP fusion 단백질이 더 잘 발현되는 것을 관찰할 수 있다. Zebrafish가 점점 성장해 감에 따라 단백질의 발현이 감소하며 72 시간 경에는 WT-GFP의 발현을 거의 관찰할 수 없었다(data not shown). 따라서 본 연구에서는 zebrafish에서 인간 유전자인 hHtrA2를 정상적으로 발현할 수 있는 시스템을 정립함으로써, 앞으로 zebrafish에서 hHtrA2의 생리적 기능을 연구하는 데 있어 기본적인 자료로 활용 할 수 있을 것이다.</p>
WT-HtrA2의 발현양상을 관찰하기 위해서 WT-HtrA2 mRNA를 embyo에 microinjection 했다고 하는데, 어떻게 나타났어?
몸 전체에 퍼져 있는 것과 같은 발현양상