<h1>재료 및 방법</h1><h2>Cell culture</h2><p>유형 I과 유형 II 고셔병 환자의 fibroblast (Coriell,Camden, NJ, USA, Gaucher type I: GM#10915, Gaucher type II: GM#08760) 세포를 \( 20\% \) Fetal bovine serum (Thermo Scientific, South Logan, UT, USA)와 \( 1 \% \) pen-icillin-streptomycin solution (Thermo Scientific) 및 \( 1 \% \) so-dium pyruvate, \( 100 \mathrm{mM} \) (Thermo Scientific)이 함유된Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Thermo Scientific)를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} 95 \% \) air 및 \( 5 \%\ \mathrm{CO}_{2} \) incubator(Thermo Scientific) 내에서 배양하였다.</p><h2>Chemical treatment</h2><p>Resveratrol (Sigma, Saint Louis, MO, USA)을 dimethly sulfoxide (Sigma, Saint Louis, MO, USA)에 \( 10 \mathrm{mM} \) 되게 용해시킨 뒤, serial dilution을 통해 \( 1 \mathrm{mM} \) 과 \( 0.1 \mathrm{mM} \)로 만든 후에 이를 각각 \( 100 \mathrm{~mm} \) dish에 최종 농도가 \( 10\ \mathrm{uM}, 1\ \mathrm{uM}, 0.1\ \mathrm{uM} \)이 되도록 사용하였으며, 24시간과 48시간의 간격으로 세포를 노출 시킨 후 사용하였다.</p><h2>MTT assay</h2><p>Trypan blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 를 이용해 cell counting 을 수행하여 세포의 생장율을 측정한 뒤, 96-well plate에 \( 1 \times 10^{4} \) 이 되도록 세포를 분주한다. 각 well당 최종 \( 100 \mathrm{ul} \)가 되게 세포 배양액을 첨가하고 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubation에서 24시간 배양시킨 뒤 다양한 농도의 레스베라트롤 용액을 각 well에 첨가한다. 이후 24시간과 48시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 반응시킨다. EZ-cytox MTT assay kit(Daeillab service, Seoul, Korea)을 \( 10 \mu l \) 를 각 well에 분주한 뒤, 2시간 정도 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\ \mathrm{CO} _{2} \) incubation에서 반응시킨 뒤, \(420\sim480 \mathrm{~nm} \) 사이에서 흡광도를 측정한다. 얻어진 결과는 densitometry 분석을 통해 양적 차이를 검증 하였다. 각각 3회의 반복실험을 통해 얻어진 실험결과는 평균 \( \pm \) 표준편차로 표기하였고, 통계적 유의성 검정은 Student's t-test를 통하여 실시 하였으며, p값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의 하다고 판단하였다.</p><h2>RNA isolation 및 quantitative RT-PCR 분석</h2><p>유형 I 과 II 각각의 Gaucher disease fibroblast 세포를 배양한 후 TriZol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 RNA를 분리하였고, 이 중 \( 100 \mathrm{ng} \)의 RNA를 역전사효소로 cDNA 전환하여 quantitative RT-PCR의 주형으로 사용하였다. Quantitative RT-PCR을 위해 Accupower PCR PreMix(BIONEER, Daejeon, Korea)와 p53 primer와 p21 primer를 각각 주형과 함께 혼합하고 PCR 을 통해 mRNA의 양적 변화를 확인하였다. 얻어진 결과는 densitometry 분석을 통해 양적차이를 검증 하였다. 각각 3회의 반복실험을 통해 얻어진 실험 결과는 평균 \( \pm \) 표준편차로 표기하였고, 통계적 유의성 검정은 Student's t-test를 통하여 실시 하였으며, p값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의 하다고 판단하였다. Primer 염기서열은 다음과 같다. p53-forward: TAA CAG TTC CTG CAT GGG CG. p53-reverse: GAC CCT TTT TGG ACT TCA GG. p21-forward : GAT GTC CGT CAG AAC CCA TG. P21-reverse: AGA AGA TCA GCC GGC GTT TG.</p><h2>Western blot 분석</h2><p>유형 I 과 II 고셔병 환자 fibroblast 세포에서 용해액을 추출하기 위해 RIPA buffer를 사용하여 세포를 용해 하였고, 각 단계별로 protease-inhibitor cocktail (Sigma, Saint Louis, MO, USA)을 섞어 세포의 용해액을 추출하였다. 각 시료별로 \( 30 \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 \( 10 \% \) sodium dodecyl sulfate-poly-acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 실시하였고, 전기영동을 통해 poly-vinylidene fluoride (PVDF) membrane (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 단백질을 이동시켜 western blot을 실시하였다.단백질을 보유한 membrane은 \( 5 \% \) skim milk (Bio-Rad,Hercules, CA, USA)를 통해 blocking 시킨 후 p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), PARP (Abcam, Cambridge, MA, USA), 그리고 \( \beta \)-actin (Sigma, Saint Louis, MO, USA) 1차 항체를 처리하였고, anti-rabbit 및 anti-mouse (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 2차 항체를 사용하였으며, Supersignal West Pico Luminal / enhancer solution (Pierce, Rockford, IL, USA)을 통해 단백질 밴드를 확인하였다. 모든 western blot 결과는 3회의 반복실험을 통해 검증 하였고, 얻어진 실험결과는 평균\( \pm \)표준편차로 표기하였다. 또한 통계적 유의성 검정은 Student's t-test를 통하여 실시하였으며, p값이 \( \pm \) 0.05미만일 경우 통계적으로 유의 하다고 판단하였다.</p><h2>위상차현미경을 이용한 세포 증감양상 관찰</h2><p>세포배양용 cell culture dish에 유형 I 과 II 고셔병 환자 fibroblast 세포를 넣고 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubation에서 24시간 배양시킨 뒤, \( 0.1 \mathrm{uM}, 10 \mathrm{uM} \) 농도의 레스베라트롤 용액을 각 plate에 첨가한다. 이후 24시간과 48시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \ \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양한 뒤 Olympus CKX41현미경과 카메라를 이용하여 세포를 촬영하였다.</p>
\( 20\% \) 소태아혈청와 \( 1 \% \) pen-icillin-streptomycin solution 및 \( 1 \% \) so-dium pyruvate, \( 100 \mathrm{mM} \)을 함유하는 것은 뭐야?
Dulbecco's Modified Eagle Medium