<h1>결과 및 고찰</h1><h2>균주의 선별</h2><p>부산시 사하구 일대의 가정하수로부터 유용효소를 생산하는 균주를 분리하였으며, 각각의 배지조성에 따른 다양한 균주를 분리하기 위하여 LBM, R2A, 그리고 M9 배지를 사용하였다. LBM 배지에서 생육활성대를 형성하는 다수의 균주를 확보하여 이 중 우수한 균주 4종을 분리하였으며, R2A, 그리고 M9 배지에서는 LBM 배지에 비해 생육활성대를 형성하는 다수의 균주를 확보하지 못하였으며, 1종을 분리하였다 (자료 미제시). 분리된 균주들 중 HC ratio가 높은 균주인 BD5를 lipolytic 기질 분해능이 우수한 균주로서 최종적으로 선정하였으며, LBM 배지에서 최적의 성장을 나타내었다.</p><h2>균주의 동정과 phylogenetic anaylsis</h2><p>선별된 균주 BD5는 그램 염색법에 의하여 그램 음성균으로 확인되었으며, 광학현미경 관찰에 의하여 단간균의 형태가 관찰되었다(Table 1). 16S rDNA 염기서열 분석 결과 BD5는 Acinetobacter baumannii와 \( 99 \% \)의 높은 상동성을 나타내었으며, 형태학적, 생리적인 특징도 Acinetobacter baumannii와 유사하여 분리된 균주를 Acinetobacter 속으로 동정하고 Acinetobacter sp. BD5로 명명하였다. 선별된 균주의 phylogenetic analysis 결과(Fig. 1) Acinetobacter calcoaceticus와 밀접한 관련이 있으며, 본 연구와 같이 Acinetobacter sp. ADP1은 lioplytic 효소를 생산한다는 보고도 있었다. 현재 lipolytic 효소를 생성하는 균주는 Pseudomonas sp., Bacillus sp., Stapylococcus sp.와 Acinetobactersp. 등이 알려져 있으며, Pseudomonas sp.와 Bacillus sp.가 생산 하는 lipolytic 효소가 보고되어 있다.</p><h2>균주의 생육</h2><p>Acinetobacter sp. BD5의 생육도를 측정결과는 Fig. 2와 같 다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양한 경우 6시간만에 대수 증식기에 도달하여 빠른 성장을 보였으나, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)의 경우 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에 비하여 낮은 성장을 보이며 12시간 이후로는 완만하게 감소되는 것으로 나타났다. \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 매우 낮은 성장을 보였다(자료 미제시). 이러한 결과는 대부분의 Acinetobacter종들의 최적온도가 \( 35 \sim 50^{\circ} \mathrm{C} \)로 보고되고 있는 것과 일치하는 특성을 보여 주며, 이와 같은 호열성 균주들은 용매와 세제에 대하여 안정하고, 열에 안정한 효소를 생산할 수 있으므로 생물공학 산업에서 적용가능하다고 보고된 바 있다. 이는 Acinetobacter sp. SY-01이 생산하는 lipolytic 효소와 유사한 양상을 보이며, Acinetobacter sp. BD5는 고온에서 성장하는 호열성균주로서 이 균주가 생산하는 lipolytic 효소는 열에 안정할 것으로 보인다.</p><h2>고체배지에서의 lipolytic 효소 생성 검증</h2><p>LB 배지에 전 배양한 배양액을 \( 1 \% \)의 tributyrin이 첨가된 EL 고체배지에 획선을 그어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양 12시간 때에 투명한 생육활성대(growth-clear zone)를 형성하였다(Fig. 3). Fig. 4 와 같이 olive oil이 첨가된 CE 고체배지에서는 24시간 배양하였을 때 투명한 생육활성대와 노란색으로 색깔 변화를 나타내었으며, 다른 균주에서는 활성을 나타내지 않았다(자료 미제시). CE 고체배지 상의 색깔 변화는 선별된 균주가 생산하는 lipolytic 효소에 의해 olive oil이 분해되어 생성되는 지방산이 \( \mathrm{pH}\)를 감소시켜 나타나는 것으로 이는 선별된 균주가 olive oil을 가수분해하는 것으로 보인다. Tween 20-LB 고체 배지에서 12시간 배양하였을 때 파우더와 같은 생육활성대(powder-like zone)를 형성하였으며, BD3은 EL과 CE 고체배지에서 거의 생육이 이루어지지 않아 이 실험에서 제외하였다(Fig. 5). 이러한 결과는 균주가 생산하는 lipolytic 효소에 의해 tributyrin, olive oil과 Tween 20이 가수분해되어 형성되는 것이다. 이는 상업적인 lipase인 lipolase (novonordisk)가 tributyrin과 oilve oil에서 활성을 보이는 결과와 매우 유사한 것으로 보이며, Tween 20에 대한 분해능은 A. lwoffii 16C-1보다 우수한 것으로 나타났다. Acinetobacter sp. BD5 가 다양한 lipolytic 기질을 분해하는 것으로 보아 이 균주가 lipolytic 효소를 생산하는 것으로 보이며, A. lwoffii 16C-I보다 빠른 시간 내에 lipolytic 기질을 분해하는 것으로 나타나 산업적으로 유용할 것으로 기대된다.</p><h2>액체배지에서의 lipolytic 효소의 활성 평가</h2><p>Acinetobacter sp. BD5가 세포외로 방출하는 lipolytic 효소 활성의 최적 배양조건을 검토하기 위해 배양 시간별 lipolytic 활성을 측정하였다. Fig. 6의 결과와 같이 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 빠른 성장을 보이는 배양 6시간째에 \( 1.167 \) units \( / \mathrm{min} \cdot \mathrm{ml} \)로 가장 높은 lipolytic 효소 활성을 보였으며, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 보다는 활성이 낮았으나 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양 6시간째에 \( 0.572 \) units/ \( \mathrm{min} \cdot \mathrm{ml} \)로 비교적 높은 효소 활성을 나타내었다. 이는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 모두 배양 6 시간때인 대수증식기에 도달할 때까지 lipolytic 효소의 활성이 증가하는 양상을 보였으나, 균주의 성장속도가 감소함에 따라 활성의 비율도 감소하는 것으로 나타났으며, 배양 18시간까지 \( 50 \% \) 이상의 잔존활성을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 A. lwofffi I6C-1의 경우 배양 12시간째에 lipolytic 효소가 \( 40 \% \) 정도의 활성을 나타내는 결과와 달리, Acinetobacter sp. BD 5의 경우 비교적 빠른 시간(배양 6시간 때)에 많은 lipolytic 효소를 생성하는 것으로 보인다. 이 후의 실험을 위한 조효소는 lipolytic 효소활성이 가장 높은 6시간까지 배양한 배양상등액을 사용하였다. 효소활성의 최적온도는 Fig. 7에 나타내고 있다. lipolytic 효소의 활성은 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 0.97 units \( / \mathrm{min} \cdot \mathrm{ml} \) 로 최고로 최적의 활성을 나타내며, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 나타난 효소활성을 기준으로 하였을 때, \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 88 \%\), \(80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 77 \% \) 의 잔존활성을 갖는 것으로 나타났다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서도 \( 50 \% \) 이상의 활성을 보여 비교적 넓은 범위의 온도에서 활성을 나타내었다. Acinetobacter sp. BD5 가 생산하는 lipolytic 효소의 최적 온도는 P. fluorescens보다 높으며, B. thermocatenulatus보다 유사하거나 낮았다. 이는 Acinetobacter sp. BD5가 호열성 균주로 이 균주가 생산하는 lipolytic 효소는 열에 안정할 것이라는 예상을 뒷받침해주며, 산업적으로 유용할 것으로 기대된다. Fig. 8에 각 \( \mathrm{pH}\)에서 보이는 효소의 활성을 나타내었다. 효소 활성의 최적 \( \mathrm{pH}\)는 9.0 이었으며, \( \mathrm{pH}\) 7.0-8.1 범위에서 \( 90 \% \) 이상의 활성이 유지되는 것으로 나타났고, \( \mathrm{pH}\) 5.0-6.0 과 \( \mathrm{pH}\) 9.8-10.6범위에서 \(50\%\) 이상의 활성이 존재하여 넓은 범위의 \( \mathrm{pH}\)에서 lipolytic 효소의 활성이 나타났다. Acinetobacter sp. BD5의 lipolytic 효소 활성의 \( \mathrm{pH}\)는 Bacillus sp. BP-6 LipA가 생산하는 lipolytic 효소의 최적 \( \mathrm{pH}\)와 A. calcoaceticus BD 413의 \( \mathrm{pH}\) 7.8-8.8보다 다소 높은 것이며, Acinetobacter sp. RAG-1과 Acinetobacter sp. SY-01과 유사한 것이었다. 이는 Acinetobacter sp. BD5이 생산하는 lipolytic 효소는 alkaline lipolytic 효소인 것으로 생각되어진다. 본 균주가 생산하는 lipolytic 효소는 비교적 넓은 \( \mathrm{pH}\)범위와 고온에서 활성이 유지되는 것으로 보아 폐유분해, 세제 합성과 유기물질 합성 등에 적용가능하며, 생물공학분야와 산업적으로 잠재적 가치가 있을 것으로 생각된다. 그러므로 이 물질을 생산하는 균주의 기초 자료를 얻기 위해 PCR primer를 설계하여 균주로부터 lipolytic 효소의 유전자를 검출하고, 그 특성을 밝혀야 할 것으로 생각된다.</p>
가정하수로부터 유용효소를 생산하는 무엇을 분리했어?
균주