<h2>Western blot assay</h2><p>염증반응에 직접적으로 관여하는 대표적인 단백질인 COX-2와 iNOS(Inducible nitric oxide synthase)의 발현에 미치는 발효 울금 배양액 및 원료의 효능을 평가하기 위해서 western blot assay를 실시하였다. Raw 264.7 세포주는 6-well에 \( 5 \times 10^{5} \mathrm{cell} / \mathrm{mL} \)로 분주한 뒤 하루 동안 배양했고, 염증반응을 유도하기 위해 \( 2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 LPS(lipopolysaccharide, Sigma)를 처리하여 세포를 활성화시켰다. 배양액을 이용해서 제조한 1, 2차 분석시료는 \( 20 \mu \mathrm{L} \)씩 처리하였고, 발효 및 비발효 울금 원료는 각각 62.5, 125, 250 \(\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 농도로 DMSO에 현탁하여 처리하였다. 18시간 배양 후 세포를 회수하여 lysis buffer \( (50 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \(\mathrm{pH} 7.6 \), \(150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(0.1 \mathrm{mM} \) EDTA)로 세포를 파쇄하였고 세포 파쇄액은 \( 8 \% \) SDS-PAGE를 통해 전기영동한 후 PVDF membrane에 transfer하고 COX-2(Cell Signaling Technology), iNOS(Cell Signaling Technology) antibody로 immunoblotting하여 각각의 발현양을 비교 분석했다.</p><h2>Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) assay</h2><p>울금 발효물의 소염활성 정도를 측정하기 위해 역전사 중합반응을 실시하였다. 세포의 준비 및 활성화는 western blot assay에서와 동일하게 준비하였다. 양성 대조군으로는 \( 8 \mathrm{uM} \) dexamethasone(Sigma)을 사용하였고 비발효 울금 시료와 함께 효능을 평가하였다. LPS로 활성화된 raw 264.7 세포주에 주정침전법을 이용해서 제조한 울금 2차 분석시료 \( (20 \mu \mathrm{L} / \)well)를 처리한 뒤 18시간 동안 배양하고 세포를 회수하였다. 그 후 TRIsure reagent(Bioline)로 각 세포의 total RNA를 회수한 뒤 oligo-dT primer(Promega)와 MMLV reverse transcriptase(Super-Bio)를 이용해서 역전사 반응을 진행하였다. PCR분석에 사용한 각 cytokine의 primer는 다음과 같다. GAPDH(F: 5'-CAT-GAC-CAC-AGT-CCA-TGC-CAT-CAC-3', R: 5'-TGA-GGT-CCA-CCA-CCC-TGT-TGC-TGT-3'), TNF- \( \alpha \) (F: 5'-GGC-AGG-TCT-ACT-TTG-GAG-TCA-TTG-3', R: 5'-ACA-TTC-GAG-GCT-CCA-GTC-AAT-TCG-G'3'), IL-6(F: 5'-AAT-GAT-GGA-TGC-TAC-CAA-AC-3', R: 5'-TAG-CCA-CTC-CTT-CTG-TGA-CT-3'). PCR반응은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 pre-denaturation 후 GAPDH와 TNF-\(\alpha \)는 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초 반응을 진행시켰고 IL-6는 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 61^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초 반응시켜 총 25회 증폭시킨 다음 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분 동안 마지막 extension을 실시하였다. PCR 결과는 GelRed가 포함된 \( 1.5 \% \) agarose gel에 전기영동한 뒤 확인하였다.</p>
무엇의 효능을 평가하고자 하는가?
COX-2와 iNOS(Inducible nitric oxide synthase)의 발현에 미치는 발효 울금 배양액 및 원료의 효능