<h1>결 과</h1><h2>Miraculin 단백질의 특성 및 구조분석</h2><p>서아프리카 원산으로 Richadella dulcifica의 붉은 열매인 miracle fruit에서 분리된 miraculin 유전자는 \( 660 \mathrm{bp} \) 의 염기로 이루어져, 29개의 아미노산 N-말단 신호 서열을 포함하는 220개의 아미노산으로 \( 24.6 \mathrm{kDa} \)의 분자량을 갖는다(Fig. 1). Miraculin 단백질 생산 및 활용을 위하여 Allermatch (http://www.allermatch.org/) 및 NCBI blast에서 serine protease inhibitor 7 등 총 8종의 독성 및 알러지 관련 단백질과 유사성을 조사한 결과, 모든 단백질에서 \( 35.0 \sim 39.3 \% \)의 범위로 나타났다(Table 1). 그러므로 miraculin 단백질은 인체 또는 동물에 유해한 독성 및 알러지에 영향이 거의 없는 것으로 판단된다. 따라서 본 실험에 사용한 miraculin 단백질을 식물 세포에 발현하여 세포내 축적하면, 매우 유용할 것으로 평가된다.</p><h2>형질전환 세포 육성 및 cell line 선발</h2><p>Miraculin 유전자를 벼 게놈에 도입하기 위해 식물형질전환용 Ti-plasmid pCAMBIA2300 벡터에 SWPA2 프로모터에 하에 발현하도록 유전자를 클로닝하고, 선발 마커로 bar 유전자가 삽입된 식물발 현 벡터를 구축하여 A. tumefaciens EHA105에 형질전환시켜 벼 캘러스에 도입하였다. 감염된 callus는 cell line 구축을 위해 N6 고체배지에서 증식시켰으며 2주마다 계대배양을 하여 빠르게 분화하는 5개의 cell line을 선발하였다(Fig. 2). 유전자 도입 여부를 확인하기 위하여 선발된 cell line으로부터 각각 DNA를 추출한 후 SWPA2 프로모터 영역과 miraculin 유전자 영역의 프라이머를 작성하여 PCR 분석을 수행하였다. 그 결과 WT과 달리 선발된 callus로부터 \( 661 \mathrm{bp} \)에서 밴드가 검출되어 miraculin 유전자가 식물세포에 안정적으로 도입되었음을 확인하였다(Fig. 3A).</p><h2>선발된 셀라인의 현탁배양 및 세포 증식</h2><p>Miraculin 유전자의 도입 여부가 확인되어 선발된 cell line들을 대량 증식하기위해 현탁배양을 실시하였다(Fig. 4A). 선발한 5개 cell line은 \( 60 \sim 85 \mathrm{rpm} \)으로 현탁 배양하고, 4일마다 계대배양을 하였으며, 세포 생장률을 조사하였다. 그 결과, 배양 후 12일째 HK-2 계통의 생장율이 대조구에 비해 6.3배로 가장 많이 증가하였으며, HK-3과 HK-4는 각각 5.5배와 5배의 증가율을 보였다(Fig. 4B).</p><h2>선발된 현탁배양 cell line으로부터 miraculin 발현분석</h2><p>선발한 형질전환 셀라인들에서 miraculin 유전자의 발현여부를 확인하기 위해 각각의 셀라인으로부터 total RNA를 추출한 후 RT-PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, 선발한 5개 셀라인에서 유전자가 발현한 예상 사이즈의 밴드가 검출되었으나, 대조구에서는 검출되지 않았다(Fig. 3B). 따라서 도입한 miraculin 유전자가 벼 게놈에 잘 integration되어 mRNA로 안정적으로 전사되었음을 시사한다. RT-PCR 결과에서 HK-2가 가장 높은 발현양을 보였으며, 다음으로 HK-3,HK-4 순으로 발현의 차이를 보였다(Fig. 3B). 또한 선발한 5개 셀라인에서 단백질 축적 여부를 검토하기 위하여 SDS-PAGE 및 Western blot 분석을 수행한 결과, 선발한 5개 셀라인에서 \( 28.4 \mathrm{kDa} \)의 밴드가 검출되었다(Fig. 5). 따라서 형질전환 벼 현탁배양 셀라인에서 miraculin 단백질이 안정적으로 발현하고 있음을 보여주었다.</p><h2>E. coli 재조합 단백질 생산 및 정량화</h2><p>E. coli에 miraculin 유전자를 발현시켜 단백질 생산 여부 및 정량화를 Ming과 Hellekant (1994)에 의해 보고한 방법으로 실시한 결과 miraculin의 분자량인 \( 24.6 \mathrm{kDa} \)에 FLAG-tag 분자량을 포함한 \( 28.4 \mathrm{kDa} \)에서 농도별로 단백질이 검출되었다(Fig. 6B). 검출된 면적의 intensity를 측정하여 단백질 정량을 위한 표준곡선으로 나타낸 결과, \( y=7630.4 x+148034 \)의 방정식을 얻었다(Fig. 6C).</p><p>표준곡선을 기반으로, 형질전환 식물 세포로부터 추출한 total 단백질에서 얻을 수 있는 재조합 miraculin의 양을 정량화 하였다. 식물형질전환 세포로부터 추출한 동일한 양의 총 단백질 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{lane}\)을 \( 12 \% \) SDS polyacrylamide gels에서 분리하고(Laemmli 1970), Western blot을 실시하여 검출된 밴드의 intensity를 측정하였으며, 이를 구축한 표준곡선에 대입하였다. 그 결과, HK-2 계통에서 현탁배양세포의 정제된 miraculin 단백질은 \( 0.087 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) (TSP 대비 \( 2.0 \% \) )로 가장 높게 나타났으며, 다음으로 HK-3, HK-4, HK-5 및 HK-1계통 순으로 \( 0.080 \sim 0.033 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 범위를 보였다(Table 3). 이런 결과는 박 등(2020)이 당근세포에 발현시킨 결과 보다도 3배 정도 높게 나타났다. 따라서 현탁배양세포를 이용하기 위해서는 당근보다는 벼 유래 현탁배양세포가 용이하다고 생각한다. 본 연구에서 miraculin 단백질 생산이 가장 높았던 HK-2 계통은 탱크배양 등을 통해 scale up 하면 miraculin 단백질생산이 가능할 것으로 사료된다.</p>
Richadella dulcifica의 붉은 열매의 이름은 뭘까?
miracle fruit