<h2>펩타이드의 전처리 및 LC-MS/MS 분석</h2><p>펩타이드의 농도는 Pierce quantitative fluorometric peptide assay를 사용하여 측정했으며, liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) 분석을 위해 펩타이드 샘플은 이전 보고된 대로 HLB OASIS column을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 염 성분을 제거해 주었다. 탈염 과정이 끝나면 건조된 펩타이드를 \( 200 \mu \mathrm{L} \)의 로딩 용액( \( 15 \mathrm{mM} \) ammonium formate, \( 2 \%\) ACN) 으로 재구성해준 뒤, 바닥에 C18 Empore 디스크 멤브레인을 패킹하고 POROS 20 R2 역상 resin을 \( 200 \mu \mathrm{L} \) 의 노란색 tip에 채워 stage-tip을 만들어 주었다. 펩타이드 용액을 stage-tip에 로딩하기 전 tip은 \( 100 \% \) 메탄올, \( 100 \%\) ACN으로 세척하고 로딩 용액으로 conditioning 해주었다. 펩타이드를 로딩하고 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 60, 80 및 \( 100 \% \) ACN을 포함하는 \( \mathrm{pH} 10 \) 완충 용액들을 사용하여 3개의 분획으로 분리하였다. 마지막으로 나눠진 3개의 분획 각각을 진공 원심분리기에서 동결 건조 후 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 얻어진 펩타이드는 \( 2 \% \) ACN 및 \( 0.1 \% \) formic acid (solvent-A)에 다시 용해시켜 UHPLC Dionex UltiMate\({}^Ⓡ\) 3000 장비를 사용하여 역상 크로마토그래피를 진행하였다. 샘플을 수집하기 위해, UHPLC에 Acclaim PepMap 100 트랩 column (\(100 \mu \mathrm{m} \times 2 \mathrm{~cm} \), nanoViper C18, \( 3 \mu \mathrm{m} \), \(100 \mathring{~A} \) )을 장착한 후 \( 98 \%\) 용매 A를 6분 동안 \( 6 \mu \mathrm{L} / \) 분의 유속으로 흘려 보내주었다. 연속적으로 샘플은 Acclaim PepMap 100 모세관 컬럼 (\( 75 \mu \mathrm{m} \times 15 \mathrm{~cm} \), nanoViper C18, \( 3 \mu \mathrm{m} \), \(100 \mathring{~A} \)) )에서 \( 400 \mathrm{~nL} / \mathrm{min} \)의 유속으로 분리 되었다. LC 분석 시 용매의 구배는 90분 동안 용매-B (\(100\%\) ACN)및 \( 0.1 \% \) formic acid)를 \( 2 \% \) 에서 \( 35 \%\), \(10 \) 분 동안 \( 35 \% \) 에서 \( 95 \% \), 이어서 5분 동안 \( 90 \% \) 용매-B에서 실행되었으며, 마지막으로 15분 동안 \( 5 \% \) 로 진행하였다. LC-MS/MS를 전자 분무 이온화 소스와 함께 사중 극자기반 질량 분석기 QExactive \( { }^{\mathrm{TM}} \) Orbitrap 고분해능 질량 분석기에 이전 보고된 것과 동일한 매개변수를 사용하여 Top15 방법으로 연결했다. 그리고 모든 단백질체 질량분석 raw 데이터는 ProteomeXchange consortium을 통해 PRIDE partner repository에 PXD025132로 등록하였다.</p><h2>MaxQuant와 Perseus 소프트웨어를 이용한 데이터 분석</h2><p>LC-MS/MS 분석으로 얻어진 데이터는 MaxQuant 소프트웨어(version 1.6.17.0)를 사용하여 이전에 보고되었던 방식에 따라 분석하였다. 모든 데이터는 Oryza sativa database를 참조하였다. Andromeda에서 첫번째에는 \( 20 \mathrm{ppm} \), 다음에는 \( 4.5 \mathrm{ppm} \)의 기본 전구체 질량 허용오차(default precursor mass tolerances set)를 설정하여 Label-free quantification (LFQ) 데이터를 처리하였다. LFQ 데이터는 \( 0.5 \mathrm{Da} \) 질량의 허용오차(최대 2회 trypsin 절편화를 인식하지 못하는 값)를 기반으로 검색하였다. Raw data를 분석함에 있어서 fixed modification으로서 cysteine 잔기의 carbamidomethylation을 설정하고, variable modification으로서 lysine 잔기의 acetylation 및 methionine 잔기의 oxidation을 설정하였다. 또한 통계적 허용 범위 내의 펩타이드를 식별하기 위해 reverse nonsense version을 기반으로 false discovery rate (FDR)를 \( 1 \% \) 로 설정하였다.</p><p>LFQ 데이터의 multiple sample test (one-way ANOVA, Ben-jamini-Hochberg \(\mathrm{FDR}<0.05 \), fold change \(\mathrm{(FC)} >1.25 \)), hierarchical clustering analysis (HCA), 및 principle component analysis (PCA) 등의 통계 분석은 Perseus 소프트웨어 (ver. 1.6.14.0)를 사용하여 수행하였다. 또한 통계적으로 유의미한 차이를 보이는 단백질들의 기능 및 세포 내 위치 확인을 위하여 각각 AriGO v2.0를 활용한 Gene Ontology (GO) enrichment분석, CELLO2GO를 활용한 세포 내 위치 확인, 및 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KEGG 경로 분석들을 수행하였다.</p>
Pierce quantitative fluorometric peptide assay는 무엇의 농도를 확인하기 위해서 사용했지?
펩타이드의 농도