<h2>FPLC에 의한 효소의 정제 및 단백질 확인</h2><p>Ammonium sulfate에 의해 농축된 효소액을 멸균 증류수로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 여러번 투석을 행하여 염 등을 제거한 다음 \( 0.15 \mathrm{M} \) \( \mathrm{NaCl} \) 이 포함된 \( 50 \mathrm{mM} \) phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} \ 7.0 \) )로 녹인 후 FPLC system에서 \( 0.15 \mathrm{M} \) \( \mathrm{NaCl} \)이 포함된 동일 buffer로 평형화시킨 superdex 200 HR 10 / 30 (Amersham pharma-cia biotech, UK) column을 통하여 분당 \( 0.5 \mathrm{~m} \ell \) 정도의 유속으로 gel filtration하여 분리 정제하였으며, 정제된 단백질은 Laemmli등의 방법에 따라 각각 \( 0.1 \% \mathrm{SDS} \)가 포함된 \( 12.5 \% \) acryamide농도의 Separating gel과 \( 4 \% \) acrylamide 농도의 stacking gel을 사용하여 SDS-PAGE gel 상에서 정제된 단백질을 최종 확인하였다.</p><h2>항체제조와 western blot</h2><p>순수분리된 혈전용해효소를 수컷의 토끼 피하지방에 한번에 \( 200 \mu \mathrm{g} \)씩 일주일 간격으로 세 번 주사한 후 마지막 주사 후 3일 뒤 부스팅하고 귀의 혈관을 통하여 혈액을 채취하였다. 혈액은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 overnight 시킨 후 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리하여 혈청을 얻어 polyclonal 항체로 사용하였다. Western blot은 Towbin 등의 방법을 이용하여 전기영동이 끝난 단백질을 nitrocellulose membrane (Millpore Co., USA)에 \( 250 \mathrm{~mA} \)로 1시간 30분간 transfer하였다. 그 후 이 막을 \(\mathrm{ pH}\ 7.8\)의 phosphate buffer saline (PBS)에 5분씩 5회 세척한 후 \( 1 \% \) skim milk가 함유된 PBS buffer에 1시간 30분간 blocking하여 불필요한 단백의 부착을 억제시켰다. 그 후 \( 1 \% \) skim milk를 포함하는 PBS buffer에 \(1:5,000\) (\( \mathrm{v}/\mathrm{v} \))의 비율로 primary antibody를 희석한 후 blotting wells에 넣어 rotator 를 이용하여 상온에서 16시간동안 흔들면서 반응하였다. 반응이 끝난 후 PBS buffer를 이용하여 15분씩 3회 세척하여 \( 1 \% \) skim milk가 포함된 PBS buffer에 anti-rabbit IgG (Sigma Co., USA)를 \( 1: 2,000(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 희석하여 4시간동안 상온에서 rotator를 이용하여 흔들면서 반응시켰다. 이를 PBS buffer로 15분간 3회 세척한 뒤 \( 15 \mathrm{mg} \) 4-chloro-1-naphtol, \( 45\mathrm{~ml} \) Tris- \( \mathrm{Cl} \) \(\mathrm{pH}\ 7.4\)), \( 0.5 \mathrm{~m} \ell \) \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)로 구성된 발색용액에 10분 간 반응시킨 후 증류수로서 세척하고 건조하여 생성된 band를 육안으로 관찰하여 사진 촬영하였다.</p><h2>혈전용해효소생산 최적 \(\mathrm{ pH}\) 및 온도</h2><p>혈전용해효소생산의 최적 \(\mathrm{ pH}\)와 온도를 측정하기 위하여 pH는 fibrin plate를 제조함에 있어서 fibrinogen 용액의 \(\mathrm{ pH}\)를 각각 \(5.0\) 부터 \(9.0\)까지 조절한 후 thrombin \(10\mathrm{unit}\)를 가하여 본 혈전용해효소를 적당량 loading한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 6시간반응시켜 용해된 분해면적을 측정하였다. 이때 \(\mathrm{ pH}\) \(4.0\)이하와 \(10.0\)이상에서는 강산과 강염기로 인해 fibrin plate가 만들어지질 않았다. 최적활성 온도는 최적 \(\mathrm{ pH} \7.0\)에서 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)부터 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)로 배지의 온도를 조절 후 6시간 반응시켜 용해된 분해면적을 측정하였다.</p><h2>기질특이성 조사</h2><p>정제된 혈전용해효소의 기질톡이성을 조사하기 위하여 각 종 단백질인 skim milk, casein, gelatin, blood agar를 기질로 한 plate상에서 동량, 동시간 반응하여 기질의 분해양상을 비교하였다.</p><h2>혈전분해 양상 조사</h2><p>제조된 fibrin plate를 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 열처리하여 plas-minogen을 불활성화시킨 fibrin plate (plasminogen-free fi-brin plate)와 열처리 하지 않은 fibrin plate plasmi-nogen-rich fibrin plate)에서 FPLC에 의해 순수분리된 혈전 용해효소를 반응시켜 그 분해 양상을 비교, 검토하여 plami-nogen activator type인지 fibrin을 직접 분해하는 혈전용해 효소인지 검토하였다.</p>
제조된 fibrin plate를 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 열처리하면 무엇이 불활성화되는가?
plas-minogen