<h1>결과 및 고찰</h1><h2>S. cerevisiae에서 GAL10 promoter를 이용한 bovine pancreatic 유래 DNase Ⅰ의 과발현과 분비</h2><p>효모 형질전환체 선별을 위해 구축된 재조합 plasmid는 \( \mathrm{MF} \alpha \) 신호서열을 이용하며 uracil 영양요구성 변이주인 S. cerevisiae 2805 에 형질전환하였다. 그 후 SD 배지로 형질전환체를 1차 선별한 다음 \( 10 \mathrm{~mL} \) test tube 상에 배양하였다. 배양 상등액을 기질 calf thymus DNA와 반응하여 흡광도 변화를 확인하였고 10개의 배양액 중 가장 높은 활성 \( (5.47 \)unit \( / \mathrm{ml} \) )을 보이는 재조합 균주를 선별하였다</p><p>\( 10 \mathrm{~mL} \) test tube 배양을 통해 선별된 pGAL-MF \( \alpha \)-DNaseI의 S. cerevisiae 형질전환체를 baffled-flask 배양을 통해 균체증식, DNase I 활성과 분비 및 plasmid 안정성 등을 정밀 분석하였다. 재조합 효모를 SD배지에서 진탕 배양하면서 12시간 간격으로 균체의 농도와 DNase I의 활성을 확인하였다. DNase I의 활성은 dextrose 소모 후 galactose를 이용하는 12시간 이후부터 발현되어 48시간까지 계속 증가하는 양상을 보였다. Extracellular와 intracellular로 분획 후 효소역가를 측정한 결과 배양 48시간에서 \( \mathrm{OD}_{600}=30.3 \) 의 균체 농도에 도달하였으며 배양 상등액에서 \( 37.7 \mathrm{unit} / \mathrm{mL} \) 의 활성을 보임을 확인하였고, intracellular activity는 \( 0.01 \mathrm{unit}/ \mathrm{mL} \) 로 거의 활성이 없었음을 확인하였다.</p><h2>P. pastoris에서 AOX1 promoter를 이용한 bovine pan-creatic 유래 DNase Ⅰ의 과발현과 분비</h2><p>Bp-DNase I 유전자를 발현하기 위해 AOX1 promoter 하류에 \( \mathrm{MF} \alpha \) 의 분비 신호 서열 \( (\mathrm{MF} \alpha \mathrm{~ss} ; 89 \) 개 아미노산 잔기로 구성; MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGGALEGDFDVVVLPFSNSFNNGLLFINTTIASIAAKQQGVSLQLRQAQA)과 자체 signal이 제외된 bovine pancreatic 유래의 DNase I 유전자(bp-DNase I)를 cloning 하여 pPEXI\((8.8 \mathrm{~kb}) \) 을 구축하였다. MF \( \alpha \) 분비 신호와 DNase I 유전자 연결 부위의 서열은 5'-CTCGAGAAAAGATTGAAAATAGCTGCTTTCAATATTAG-3'로서 XhoI으로 절단하여 연결함으로써 LQKR LKIA의 아미노산 서열을 가지게 되어 번역 후 분비과정 중 KEX2 protease에 의해 절단된다.</p><p>효모 형질전환체 선별을 위해 구축된 재조합 plasmid는 \( \mathrm{MF} \alpha \) 신호서열을 이용하며 histidine 영양요구성 변이주인 P. pastoris \( \mathrm{GS} 115 \) 에 형질전환 후 \( \mathrm{MD} \) 배지로 형질전환체를 1차 선별한 다음 \( 10 \mathrm{~mL} \) test tube 상에 배양하였다. 배양 상등액을 기질 calf thymus DNA와 반응하여 흡광도 변화를 확인하였고 10개의 배양액 중 가장 높은 활성 (\(20.6 \mathrm{unit} / \mathrm{mL} \))을 보이는 재조합 균주를 선별하였다.</p><p>\( 10 \mathrm{~mL} \) test tube 배양을 통해 선별된 pPEXI의 Pichia 형질전환체를 baffled-flask 배양을 통해 균체증식, DNase I 활성과 분비 및 plasmid 안정성 등을 정밀 분석하였다. 재조합 균주 P. pastoris GS 115/pPEXI 을 초기 \( \mathrm{pH} 6.0\), \(30^{\circ} \mathrm{C} \), BMMY 배지에서 48시간 동안 flask 배양한 다음 extracellular, intra-cellular로 분획 후 assay를 수행한 결과, 배양 48시간에서 \( \mathrm{OD}_{600}=35.7 \) 의 균체 농도에 도달하였으며 배양 상등액에서 \( 45.5 \mathrm{unit} / \mathrm{mL} \) 의 활성을 보임을 확인하였다. 또한 intracellular activity는 \( 0.1 \mathrm{unit} / \mathrm{mL} \) 로 거의 활성이 없었음을 확인하였고, bp-DNase I은 대부분이 세포 밖으로 분비되는 것을 확인하였다. 본 연구에서 \( \mathrm{MF} \alpha \) 분비 signal을 사용하여 DNase Ⅰ을 세포 밖으로 거의 \( 100 \% \) 분비시켰다. MF \( \alpha \) 분비 signal을 사용한 외래 단백질 사례를 보면 mouse GM-CSF와 human lysozyme은 세포 밖으로 \( 100 \% \) 분비되는 사례가 있다. 또한 48시간 때의 plasmid 안정성을 확인한 결과 \( 99 \% \) 이상의 안정성을 보였다.</p>
MFα 신호서열을 이용하며 uracil 영양요구성 변이주인 S. cerevisiae 2805 에 형질전환한 물질은 무엇인가요?
재조합 plasmid