<h1>재료 및 방법</h1><h2>배지 및 시약</h2><p>Toluene stress에 대한 내성 test, 균주의 보존과 세포계수는 Brain Heart Infusion broth (BHI ; Difco Lab., Detroit USA)배지를 사용하였다.</p><h2>공시균주 및 배양조건</h2><p>본 실험에서는 그람 양성세균으로 유기용매에 내성을 가지는 Micrococcus sp. BCNU 121 균주를 공시하였다. 균주를 BHI broth 배지에서 24-48시간 배양하여 활성화시킨 후 종균으로 사용하였으며, 전배양액 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 신선한 BHI broth 배지에 접종 후 \( 32^{\circ} \mathrm{C}\), \(180\mathrm{rpm} \) 으로 진탕 배양하였다. 회수된 전배양균주를 세정후 신선한 BHI broth 배지에 접종후 중간 증식기 \( \left(\mathrm{OD}_{660 \mathrm{~nm}}=0.6\right) \) 까지 배양하여, 다양한 농도의 용매와 온도 조건하에서 적응 처리한 후 \( 6,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리하였다. 그리고 원심분리 회수된 균주를 세정후 각종 농도의 용매와 온도 조건에서 생존을 확인하여 준치사 농도, 온도 그리고 치사조건을 확인하였다.</p><h2>Stress tolerance</h2><p>균주를 신선한 LB배지에 접종후 중간 증식기 \( \left\langle\mathrm{OD}_{660}\right. \) \( \mathrm{nm}=0.6 \) )까지 배양하였다. 전배양액의 균주를 다양한 농도의 용매와 온도 조건하에서 적응 처리한 후 \( 6,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 대조구(non-treated cell)와 처리구(treated cell)를 배지에 흡광도 \( 660 \mathrm{~nm} \) 에서 1.0 이 되게 재현탁하였고, 각각의 배양액을 \( 10 \mathrm{ml} \) 씩 test tube에 분주하여 toluene 준치사 농도 \( 3 \% \) 와 준치사 온도 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 처리한 후 0분, 30분에서 샘플을 취하여 \( 0.9 \% \) sodium chloride에 연속 희석한 다음 BHI 한천 배지에 도말하였다. 이를 \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 배양한 후 형성된 colony를 계수하여 stress 내성 정도를 비교하였다.</p><h2>생존율과 내성 assay</h2><p>대조구와 처리구에서 각각 colony를 계수하여 생존율을 측정하였다. 생존율은 0 분에서 colony forming unit (CFU)와 stress 처리 후 주어진 시간에서 CFU의 비율로 나타내었다. Toluene 준치사 농도와 준치사 온도에 대한 내성 효과를 tolerance factor로 표현하였으며, 대조구 세포의 퍼센트 생존율과 처리구 세포의 퍼센트 생존율에 대한 비율로 나타내었다. 모든 실험은 duplicate plating으로 3회 반복 실험하였다.</p>
균주를 배양한 신선한 BHI broth 배지에 전배양액을 몇 \(\mathrm{ml} \) 접종해야 하는가?
\( 1 \mathrm{ml} \)