<h1>재료 및 방법</h1><h2>Chromosomal DNA의 분리</h2><p>iNtRON사의 Genomic DNA Extraction kit (Cat. No 17121)를 사용하여 청국에서 분리한 Bacillus subtilis BB-1(KFCC 11344P)을 OD 1.0이 되게 배양한 후 회수한 균체를 \( 50 \mu \ell \) pre-buffer (added \( 20 \mathrm{mg} / \mathrm{m} \ell \) RNase A)로 현탁 후 lysozyme \( 3 \mu \ell(100 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분동안 반응시켰다.</p><p>반응 후 \( 250 \mu \ell \) G-buffer (added \( 20 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) RNase A, 20 \( \mathrm{mg} / \mathrm{m \ell} \) protease K 를 첨가, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 \( 250 \mu \ell \) binding buffer를 첨가하여 binding 시킨 후 column을 이용하여 DNA를 분리하였다.</p><h2>Polymerase chain reaction (PCR)에 의한 DNA 증폭</h2><p>PCR을 위한 primer들은 Bacillus subtilis로부터 이미 크로닝된 혈전용해효소 유전자들 중 공통된 연결순서 영역으로부터 forward 5'-CGG ATC CGT GAG AGG CAA AAC GGT G-3' 와 reverse 5'-TGA ATT CTT GTG CTG CTG CTT GTC C-3'를 각각 25 \( \mathrm{mer} \)를 합성하였고, 이때 PCR 후 크로닝을 위하여 forward primer에 BamH1 그리고 reverse primer에 EcoR1 restriction site를 각각 삽입하였다. 증폭에 사용된 Perkin Elmer-2400의 조건을 초기 denaturation 단계에서 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \), 30초를 유지하였으며, annealing \( 55^{\circ} \mathrm{C} \), 30초, 그리고 중합반응은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) , 30초에서 30 cycle을 실시한 후 최종 단계인 DNA합성은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분동안 실시하여 증폭하였다.</p><h2>PCR 산물의 크로닝</h2><p>생성된 PCR 산물을 pGEM T-easy(Promega Co., USA) 크로닝 벡터에 크로닝 후 primer 제작시 인위적으로 삽입한 BamH1과 EcoR1으로 절단하여 pBluescript II SK(-)에 sub-cloning하여 DNA 연결순서를 확인하고 혈전용해효소 대량 발현을 위해 DNA 단편의 5'-end 에 NdeI, 3'-end에 BamHI restriction site를 각각 생성시켜 Bacillus와 E. coli의 shuttle vector인 pEB vector (BioLeaders Co., Korea)의 NdeI과 BamHI site에 연결하여 protease 활성이 약한 B. subtilis 168에 형질전환 하였다.</p><h2>Bacillus subtilis 168 의 electro-competent cell 제조</h2><p>B. subtilis 168을 nutrient agar plate에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 12시간 배양한 후 생성된 단일 colony를 선별하고 \( 10 \mathrm{ml} \)의 nutrient broth에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 동안 배양하였다. 이중 \( 5 \mathrm{m} \ell \)를 취하여 \( 500 \mathrm{~m} \ell \)의 액체 배지에 다시 접종한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 진탕 배양(\( 150 \mathrm{rpm} \))하면서 OD가 \(0.5\)가 될 때까지 배양하였다. 이 배양액을 30분 동안 얼음에 정치하였고, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 침전물에 ice washing buffer (\(0.5 \mathrm{M}\) sucrose, \( 0.01 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{MgCl2} \cdot 6 \mathrm{H} 2 \mathrm{O} \), \( 0.01 \mathrm{mM} \) maleic acid, \(\mathrm{ pH} \ 6.5\))을 가하여 수세하였다. 이 과정을 3번 반복하고 마지막 과정에서는 \( 5 \mathrm{ml} \)의 ice washing buffer로 침전물을 녹여 \( 40 \mu \ell \)씩 \( 1.5 \mathrm{ml} \) eppendorf tube에 분주하여 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 사용하였다.</p>
PCR을 실시할때 초기 denaturation 단계의 온도는 몇도로 설정해야하니?
\( 95^{\circ} \mathrm{C} \)