<h1>재료 및 방법</h1><p>유도기질인 페놀로부터 유도되는 효소계 (페놀을 catechol로 변환시켜주는 ring activation 효소인 dioxygenase, mono-oxygenase와 catechol에서 벤젠고리를 끊어주는 ring fission 효소인 catechol dioxygenase)중에서 어떤 효소가 TCE 분해와 관련이 있는지 다음과 같이 조사하였다. 즉, \( 5 \mathrm{mM} \) catechol에서 배양된 washed cell을 \( 23 \mu \mathrm{g} \) protein/ \( \mathrm{ml} \)의 농도로 현탁한 무기염 배지 \( 10 \mathrm{ml} \)를 \( 50\)-\(\mathrm{ml} \) serum vial에 첨가한 후, TCE stock solution을 \( 25 \mu \mathrm{M} \) (액상 \( =18.1 \mu \mathrm{M}) \) 첨가하였다. Vial을 teflon-faced butyl rubber로 밀봉하여 \( 200 \mathrm{rpm}\), \(30^{\circ} \mathrm{C}\), 20시간동안 반응시킨 후, 대조구인 페놀에서 배양한 washed cell에 의한 TCE 분해와 비교하였다. Dioxygenase 활성은 Gibson 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 페놀에서 배양한 균체를 원심분리하여 회수한 뒤에 \( 2 \mathrm{mM} \) indole이 첨가된 무기염 배지에 현탁하였다. 현탁액을 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(160 \mathrm{rpm} \)에서 4시간동안 진탕한 후, 반응액과 동일한 부피의 ethyl acetate로 2회 추출하여 indigo 생성량을 \( 660 \mathrm{nm} \)에서 조사하였다. 효소활성은 흡광도가 0.1 증가할 때를 1 unit로 하였다. Phenol-degrading monooxy-genase 활성은 Lee 등의 방법을 변형하여 측정하였다. Sonicator로 균체를 파쇄하여 원심분리 (\(18,000 \mathrm{rpm}\), 50분)한 배양상등액을 조효소액으로 사용하였다. 조효소액 \( 100\mu \ell\) (\(23 \mu \mathrm{g} \mathrm{~protein}/\mathrm{ml}\))와 reaction mixture (\(100 \mu \mathrm{M} \) 페놀, \( 1 \mathrm{mM} \) NADH, \( 100 \mathrm{mM} \) Na-phosphate buffer) \( 1 \mathrm{ml} \)와 혼합한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(180 \mathrm{rpm} \)에서 15분간 진탕하였다. 반응을 중지시키기 위해 \( 2 \mathrm{N}\) \(\mathrm{NH}_{4} \mathrm{OH}\) \(12\mu \ell \)를 첨가하고, \( 2 \% \)-amin-oantipyrene \( 40 \mu l \) 와 \( 2 \% \mathrm{~K}_{3} \mathrm{Fe}(\mathrm{CN})_{6} 40 \mu l \)를 넣은 후, 잘 흔들어 주었다. 그리고 최종 반응액에 증류수 \( 2 \mathrm{ml} \)를 첨가한 후, \( 510 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 미리 작성된 검량선과 비교하여 페놀 분해량을 계산하였고, 효소활성은 \(1 \mu \mathrm{M} / \mathrm{min} \)의 페놀이 분해될 때를 1 unit로 하였다.</p><p>Polymerase chain reaction (PCR)을 이용하여 TCE 분해 효소를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. PCR에 이용된 DNA template는 Bio-Rad사의 instageneTM matrix 시약을 이용하여 분리하였다. LB 한천평판배지에서 생육시킨 균체를 instagene TM matrix시약 \( 100 \mu l \)에 현탁하여 \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 유지한 후, \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 8분간 유지하였다. 반응이 끝난 뒤, 실온에서 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}\), 10분)한 반응액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하면서 DNA template로 사용하였다. 2개의 primer는 Selvaratnam 등이 phenol-monooxygenase 유전자의 염기서열에 기초로 하여 작성한 DMPN1 (5'-ATC ACC GAC TGG GAC AAG TGG GAA GAC C-3')과 DMPN2 (5'-TGG TAT TCC AGC GGT GAA ACG GCG G-3')를 한국생공(주)에서 주문하여 사용하였다. PCR amplification은 \( 0.5 \mu \ell \)의 Takara Taq polymerase \( (5 \mathrm{unit} / \mu \ell)\), \(10 \mu \ell\) \(10 \times \) PCR buffer, \( 8 \mu l \) dNTP mixture, \( 2 \mu \ell \) template DNA \( (450 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \), 각 \( 0.25 \mathrm{mM} \)의 primer를 첨가하고 GeneAmp PCR system (9600, Perkin Elmer)를 사용하여 initial denaturation \( 95^{\circ} \mathrm{C}\), 2분; den-aturation \( 95^{\circ} \mathrm{C}\), 1분; primer annealing \( 50^{\circ} \mathrm{C}\), 30초; primer extension \( 72^{\circ} \mathrm{C}\), 1분의 조건으로 40 cycle을 실행한 후, final extension은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 유지하여 증폭을 종결하였다. PCR 산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel상에서 전기영동을 실시하여 확인하였다. PCR product의 정제는 QIAGEN gel extraction kit를 사용하여 실시하였고, 정제된 PCR product는 ABI 377기종의 auto-sequencer를 사용하여 dye termi-nator sequencing법으로 실시하였다. PCR product의 염기 서열 분석은 Blast search program을 이용, internet상의 database인 gene-bank, EMBL, DDBJ, PDB을 통하여 실시하였다.</p>
현탁액은 어떤 방법으로 조사하였는가?
\( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(160 \mathrm{rpm} \)에서 4시간동안 진탕한 후, 반응액과 동일한 부피의 ethyl acetate로 2회 추출하여 indigo 생성량을 \( 660 \mathrm{nm} \)에서 조사