<h1>재료 및 방법</h1><h2>시약 및 실험동물 사육과 식이 투여</h2><p>Berberine chloride (14050), silibinin (S0417) 그리고 simvastatin (PHR1438)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하여 멸균 증류수에 용해하여 사용하였다. 실험동물은 DBL (충북 음성)로부터 생후 4 주령의 C57BL/ 6 생쥐를 구입한 후, 온도 \( 18 \pm 2{ }^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도 \( 50 \pm 10 \% \), 환기회수 \( 10 - 20 \) 회/시간, 조명시간 12 시간(점등 08:00, 소등 20: 00) 으로 설정된 동물실에서 환경적응을 위해 일주일 동안 고형배합사료(RodFeed, DBL)로 적응시킨 다음, 평균 체중 \( 19 \sim 21 \mathrm{~g} \) 의 마우스를 각 군 당 8 마리씩 6 개군으로 나누어 분류하였다. 실험동물의 사육과 사용 등 실험과정은 중원대학교 동물윤리위원회의 규정에 저촉되지 않게 실시하였다(JWCUC-201608-001-02). 정상식이(normal control, NC )군에는 일반식이인 고형배합사료를 공급하였고, 고지방식이 (high fat diet, HFD)군은 \( 60 \mathrm{kcal} \% \) fat (D12492, Reseach diets Inc., New Brunswick, NJ, USA) 고지방식이를 자유급식 방법으로 제공하였다. 6 개군 중에서 5 개군에는 고지방식이를 공급하여 비만을 유도하였으며, 1개군은 일반식이인 고형배합사료를 전체 실험기간 동안 공급하여 NC 군으로 분류하였다. 7 주 동안 고지방식이를 제공한 5 개군 중에서 1 개군은 고지방식이만을 지속적으로 제공하여 HFD 군으로 분류하였고 3개군에는 고지방 식이의 제공과 함께 각각 BBR \(100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{g}\) BW), SBN\((100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{g} \)BW), 그리고BBR-SBN (BBR \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{g} \) BW plus SBN\( 100 \) \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{g}\) BW)을 경구투여하여 BBR군, SBN 군, BBR-SBN군으로 분류하였으며, 남은 1개군은 양성대조(positive control, PC)군으로 분류하여 고지방식이 제공과 함께 고지혈증 환자의 혈중 지질 개선에 이용하는 simvastatin \( (0.67 \mu \mathrm{g} / \mathrm{g}\) BW) 을 투여하였다. 체중과 식이섭취량은 일주일에 한번 일정한 시간에 주기적으로 측정하였고, 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 실험 기간 동안의 체중 증가량을 같은 기간 동안 섭취한 식이섭취량으로 나누어 산출하였다.</p><h2>혈장 지질 분석</h2><p>혈액 내 지질 분석을 위해 8 주 동안의 경구투여를 마친 마우스를 마취시킨 후 경동맥에서 혈액을 채취하여 \( 13,000 \mathrm{rpm} \) 으로 10 분 동안 원심 분리한 후, 혈청을 분리하여 \( -80{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에 냉동 보관하며 분석에 사용하였다. 혈중 중성지방(triglyceride, TG) 함량은 중성지방 측정용 키트(Asan Pharmaceutical Co. Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 효소학적 방법으로 처리한 후 550\( \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 분석하였고, 총 콜레스테롤(total cholesterol, T-CHO) 함량은 총 콜레스테롤 측정용 키트(Asan Pharmaceutical Co. Ltd.)을 이용해 효소학적 방법으로 처리한 후 \( 500 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. High-density lipoprotein (HDL)-cholesterol 함량도 측정 용 키트(Asan Pharmaceutical co. Ltd.)를 이용하여 효소학적 방법으로 처리한 후 \( 500 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.</p><h2>Aspartate transaminase (AST) 및 alanine aminotransferase (ALT) 측정</h2><p>혈액 내 AST와 ALT의 함량은 실험동물을 마취시킨 후 흉부를 열어 심장에서 혈액을 채취하고 이를 \( 13,000 \mathrm{rpm} \) 으로 원심 분리한 후 혈청을 분리하여 분석에 사용하였다. 혈장 AST/ALT 측정용 키트(Asan Pharmaceutical Co. Ltd.)를 사용하여 Reitman-Frankel 법을 이용하여 처리한 후 \( 505 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 함량을 분석하였다.</p><h2>Histological staining</h2><p>간과 부고환의 지방조직을 확인하기 위해 8 주 동안의 경구투여를 마친 실험동물을 마취시킨 후 간 조직과 부고환 지방조직을 적출하여 \( 10 \% \) 중성포르말린에 고정 후 paraffin block을 제작하여 \( 0.4 \mu \mathrm{m} \) 굵기로 삭절한 후 Hematoxylin and eosin (H\(\&\)E) 염색을 통해 지방세포의 크기와 형태를 광학현미경을 이용하여 분석하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>모든 실험결과는 평균(mean) \( \pm\)표준오차(standard error, SE)로 나타냈으며 실험결과 분석은 Graph pad Prism 5.0 프로그램 (Graph Pad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)을 이용하여 진행하였다. 각 그룹 간 비교는 분산분석(one way analysis of variance, ANOVA)에 이어 Tukey's multiple comparison test를 이용하여 대조군과 실험군 사이의 유의성을 \( p<0.05 \) 수준에서 검증하였다.</p>
실험동물은 DBL (충북 음성)로부터 생후 4 주령의 C57BL/ 6 생쥐를 구입한 후, 온도 \( 18 \pm 2{ }^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도 \( 50 \pm 10 \% \), 환기회수 \( 10 - 20 \) 회/시간 그리고 조명시간이 12시간으로 설저오디었는데 점등시간과 소등시간은 언제야?
점등 08:00, 소등 20: 00