<h2>Oil Red O 염색</h2><p>\(3\)T\(3\)-L\(1\) 지방세포를 \( 10 \% \) calf serum과 \( 100 \mathrm{unit} / \mathrm{mL} \)의 penicillinstreptomycin이 함유된 DMEM 배지로 \(2 \sim 3\)일 주기로 신선한 배지를 교체하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% ~\mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다. Confluent 상태가 된 \(2\)일 후 분화유도 배지 (\(10 \% \) FBS, \(100 \mathrm{~unit} / \mathrm{mL} \) penicillin-streptomycin, DMEM, \( 500 ~\mu \mathrm{M}\) IBMX, \(0.25 ~\mu \mathrm{M} \) dexamethasone 및 \( 10 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) insulin)로 교체하였다. 이후 \(2 \)일 동안 \( 10 \%\) FBS와 \( 10 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) insulin이 포함된 DMEM을 사용하여 분화를 종료시킨 후, 시료가 첨가된 분화유도 배지에서 \(3\)T\(3\)-L\(1\) 세포의 지방 축적을 Oil Red O (ORO) 염색법을 통해 분석하였다. 분화가 완료된 세포는 PBS로 세척 후 \( 4 \%\) PFA solution으로 \(30 \)분간 실온에서 고정한 후 증류수로 세척하고 세포 이외의 배경 염색을 방지하기 위해서 \( 60 \% \) isopropanol을 넣고 \(5 \)분간 상온에서 반응하였다. \( 60 \% \) isopropanol을 제거한 후, \( \mathrm{ORO} \)를 이용하여 실온에서 \(15 \)분간 염색하였다. 증류수로 세척 후 \( 100 \% \) isopropanol를 첨가하여 세포내 \( \mathrm{ORO} \)를 녹인 후 \(96\)-well plate에 \( 100 ~\mu \mathrm{L} \)씩 분주하여 \( 517 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 추출물을 처리하지 않은 분화된 지방세포를 대조군으로 하여 지방 축적(\(\% \) of control)을 계산하였다.</p><h2>WST assay</h2><p>\(\mathrm{HaCaT}\) 세포 생존율은 EZ-Cytox Cell Viability assay kit를 이용하여 분석하였다. \( \mathrm{HaCaT} \) 세포를 \(24\)-well plate에 \( 1.0 \times 10^{5} \mathrm{cells}/\mathrm{well}\)의 농도로 접종하여 \(24 \)시간 배양한 뒤, 각 농도별로 희석한 시료가 포함된 FBS 미함유 배지로 교환한 후 \(24 \)시간 배양하였다. 배양 후 EZ-Cytox를 한 well당 \( 50 ~\mu \mathrm{L} \)씩 첨가하고 \(1 \)시간 동안 더 배양한 후에 배양한 배지를 \(96\)-well plate에 옮겨 담고 microplate reader를 사용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포 생존율을 조사하였다.</p><h2>Hyaluronic acid (HA) 생성량 분석</h2><p>HaCaT 세포를 \(24\)-well plate에 \( 1.0 \times 10^{5} \mathrm{cell}/\mathrm{well}\) 밀도로 분주하고, \(24 \)시간 후에 농도별로 희석한 추출물이 포함된 FBS 미함유 배지로 교환한 후 \(24 \)시간 배양하였다. 배양 후 각각의 상층액을 취하여 배지 중 HA의 양을 Human HA ELISA Kit (CUSABIO BIOTECH Co., Ltd.)을 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군은 Retinoic acid를 이용하여 비교 하였다.</p>
\(3\)T\(3\)-L\(1\) 지방세포를 무슨 배지에서 배양하나요?
penicillinstreptomycin이 함유된 DMEM 배지