<h1>재료 및 방법</h1><h2>미생물 및 plasmids</h2><p>본 연구에 사용한 대장균은 Escheridria coli DH5 a \( \mathrm{coli} \mathrm{DH} a \) [supE44 Dlacul169 ( \( \varphi \) 80tacZ \( \triangle M 15 \) ) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96thi-1 reiA1]로서 plasmid DNA의 분리를 위한 숙주로 사용하였다. Micrococcus luters IAM 1056은 재조합 효모가 분비하는 defensin의 항균활성을 측정하기 위한 시험균으로 한국생명공학연구원 유전자은행[Korean Collection for Type Cultures, KCTCl]에서 분양받아 사용하였다. S. cerevisiac 2805[a, ara3-52 pep4:HIS3 Aprb1 Shis3 can1]를 한국생명공학연구원 이상기박사 연구팀에서 제공받아서 defensin 발현, 분비형 숙주로 사용하였다. 또한 효모 MF \( a 1 \)의 prosequence를 분리하기 위해 S. cerevisiae의 MF \( a 1 \) 유전자를 함유하고 있는 폴라스미드[plasmid] \( \mathrm{YEp} 70 \alpha \mathrm{T} \)를 동일 연구팀에서 제공받아 사용하였다. Defensin 분비를 위한 저조하 풀라스미드 제작은 위해 S. diastaticus glucoamlase 유전자[STA1]의 promoter와 분비신호서열을 함유하고 있는 플라스미드 pYEG27을 사용하였다.</p><h2>배지 및 배양조건</h2><p>대장균은 LB 배지[\( 1 \% \) Bacto-tryptone, \( 0.5 \% \) Bacto-yeast extract, \( 1 \% \mathrm{NaCl} \) 에서 배양하였으며 플라스미드를 함유한 대장균은 항생제 ampicilin릅 \( 75 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \ell \) 의 농도로 침가하였다. 효모형질전환체의 1차 선별을 위한 최소배지로 YNBD 한천배지 \( [0.67 \% \) Bacto-yeast ritrogen base without amino acids, \( 20 \% \) dextrose, \( 0.002 \% \) L-His, \( 2.0 \% \) agar]를 사용하였다. M. inieus는 NB 배지[1.25\% Bacto-heart infusion, \( 0.5 \% \) Bacto-nutrient broth, \( 0.25 \% \) yeast extract]에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15시간 배양한 후 항균활성의 측정에 사용하였다.</p><h2>Defensin 유전자의 합성 및 재구성</h2><p>Mature defensin 유전자를 새 부위로 나누어 합성하였다. 이때 합성 항균팹티드 유전자의 \( 5^{\prime} \)과 \( 3^{\prime} \) 말단에는 제한 효소인식부위 Xbal과 Sall이 각각 함유되게 합성하였다. Defensin의 아미노말단 앞에는 분비단백질이 골지체를 통가할 때 Kex2 endopeptidase에 의해 잘라지는 부위이고 MF \( a 1 \) prosequence의 C-말단인 아미노산 Lys-Arg을 첨가함으로써 defensin 본래의 아미노 말단이 생기도록 하였다. 합성한 defensin 유전자 oligomer 6 개중 중간 부위에 해당되는 oligomer \( (+) /(-) \) 가닥 [F2, R2]을 동시에 인산화시키고 모든 oligomer를 같은 농도[\( 200 \mathrm{nM} \) ]로 섞은 후 annealing하고 이중 \( 1_{\mu \mu \ell} \)를 취하여 20ul에서 5시간 ligation한 후 다시 \( 5^{\prime} \) 말단을 인산화시켰다.</p><h2>효모 형질전환</h2><p>Defensin 유전자를 함유한 재조합 플라스미드를 숙주인 효모에 도입하기 위해 Dohmen 등의 방법으로 효모의 형질전환을 수행하였다.</p><h2>Defensin을 분비하는 효모의 선별</h2><p>일차 선별한 효모 형질전환체를 \( 0.1 \mathrm{M} \) phosphate 완충 용액 \( \mid \mathrm{pH} 7.01\) 을 함유하고 uracilo 없는 YNBD 한천배지에 tooth-picking하고 하룻밤 배양한 후 시험균인 Micrococcus luteus IAM1056 빼양역[\( 1 \% \)]을 함유한 top agar[\( 1.25 \% \) Bacto-heart infusion,\( 0.5 \% \) Bacto-nutrient broth, \( 0.25 \% \) Bacto-yeast extract, \( 0.8 \% \) agar] \( 10 \mathrm{m \ell} \) 을 붓고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 배양한 후 시험균의 생육이 저해되어 균채주위에 생기는 투명환의 생성여부를 조사하여 활성형의 defensin이 분비되는 형질전환체를 선별하였다.</p><h2>Defensin의 항균범위조사</h2><p>황산암모늄으로 농축한 배양 삼등액을 사용하여 M. Lutetis IAM1056 이외 임의의 10종 세균에 대한 항균활성을 조사하였다. 각각의 시험균 벼양액 \( 1 \% \)를 함유한 \( 0.8 \% \) top agar로 overlay된 NB plate에 구멍을 만든 후 배양농축액 \( 50 \mu \) 를 loading하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15시간 배양하였다. 구멍 주위에 생긴 투명환의 지름을 측정하여 항균활성을 조사하였다.</p>
Micrococcus luters IAM 1056은 재조합 효모가 분비하는 무엇을 측정하기 위한 시험균이지?
defensin의 항균활성