<h1>고 찰</h1><p>많은 연구자들이 지금까지 수행해 오고 있는 HtrA2에 관한 연구들은 enzyme activity나 이 단백질의 세포사멸 경로에서의 기능, 또는 세포사멸에 관여하는 다른 단백질들과의 상호작용 등에 관한 내용들이 주를 이룬다. 이러한 연구들은 cell 내에서 HtrA2가 관여하는 생체 반응의 mechanism을 규명하는 데 이용되지만, 실제로 whole-organism 내에서 HtrA2의 생리적 기능을 연구하기 위한 시스템이나 적절한 동물모델에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.</p><p>본 연구에서는 hHtrA2의 생리적 기능을 보다 명확히 연구하기 위한 기반 기술을 구축하기 위해, 인간과 유사한 새로운 척추동물 모델인 zebrafish를 선택하여 이 물고기의 발생과정 중 hHtrA2 발현을 관찰할 수 있는 적절한 vector 시스템과 발현 조건을 확립하였다. Expression vector인 pcDNA는 human CMV promoter를 가지고 있어 zebrafish나 mammalian cell에서 특정 유전자를 발현하는 데 이용할 수 있으나, in vitro에서 mRNA를 합성하는 데 사용하기는 적절하지 않아 pCS2+ vector를 사용하였다. 이 vector는 simian CMV promoter를 가지고 있고 SV40 polyA tail 뒤에 multiple restriction enzyme site가 존재하므로 plasmid DNA로 embryo 에 microinjection할 수 있을 뿐만 아니라, 이 plasmid를 linearlize하여 polyA tail을 가지고 있는 mRNA를 in vitro에서 쉽게 제작할 수 있다는 장점도 있다.</p><p>pCS2+ vector 시스템을 이용하여 zebrafish에서 microinjection한 후 WT-GFP의 DNA와 mRNA로부터 단백질의 발현을 비교한 결과 커다란 차이점은 보이지 않았다. DNA 는 mRNA와는 달리 embryo에 microinjection하면 nucleus로 가서 transcription이 일어나고, 합성된 mRNA가 cytoplasm으로 export된 후 protein synthesis machinery를 통해 단백질이 만들어져야 하므로 단백질 발현의 효율이 다소 낮을 수 있고 단백질이 발현하는 데 시간이 걸릴 수 있으나 다루기가 쉽다는 큰 장점이 있다.</p><p>WT-GFP DNA를 발현시켜 다음 실험을 진행하기 위한 일환으로 여러 가지 농도 \( (10, 50, 100 \mathrm{~pg}) \)의 DNA를 embryo에 microinjection하였다. DNA \( 100 \mathrm{~pg} \)을 embryo에 microinjection하였을 때는 발현을 확인하기도 전에 대부분의 microinjection 된 embryo가 사망하여 유전자의 발현을 거의 확인하지 못하였으며, \( 50\sim 100\mathrm{~pg} \)을 microinjection 하였을 때는 발생과정 중 embryo가 사망하는 비율이 매우 높았다. 전체 microinjection한 embryo 중 약 \( 70 \% \) 이상이 사망하여 다 음 실험을 진행하기에는 무리가 있었다. Embryo에 \( 10 \mathrm{~pg} \)의 DNA를 microinjection 하였을 경우 WT-GFP의 발현율이 너무 약하여 WT-GFP 단백질의 발현을 확인하기가 어려웠다. WT-GFP 단백질의 적절한 발현 조건을 잡기위해, \( 10 \mathrm{~pg} \) 과 \( 50 \mathrm{~pg} \) 사이의 농도인 \( 25\sim 35 \mathrm{~pg} \)을 embryo에 injection 하였을 때, WT-GFP 단백질의 발현율도 높으면서 embryo의 사망률 도 낮아 이 농도를 선택하였다(data not shown). 가시적으로 WT-GFP의 발현이 GFP vector alone이나 S306A-GFP보다 발현율이 다소 떨어짐을 볼 수 있다. 이러한 현상은 WT-GFP의 특성 때문이라고 사료되며 WT-GFP가 embryonic development상에서 어떠한 역할을 하는 지는 앞으로 좀더 연구가 진행되어야 할 부분이다.</p><p>이러한 연구결과를 바탕으로 mammalian cell에 transfection하는 expression plasmid를 zebrafish embryo에 microinjection하는 데 이용할 수 있으므로 인간 유전자의 발현과 기능을 mammalian cell과 zebrafish에서 동시에 연구할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 연구에서 정립한 발현 시스템을 이용하면 생체 내에서 hHtrA2의 생리적 기능을 용이하게 연구 할 수 있다.</p>
Expression vector인 pcDNA는 in vitro에서 mRNA를 합성하는 데 사용하기는 적절하지 않기 때문에 사용하는 것은 무엇인가?
pCS2+ vector