<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주 및 plasmids</h2><p>본 연구에 사용된 방선균은 대구지역에서 분리된 S. platensis YK-2로 TGase를 생산하며 본 균주의 포자는 접합전달의 수용체로서 사용하였다. E. coli XL-10-Gold는 클로닝을 위한 숙주로 사용하였으며 메틸화가 결손된 E. coli ET12567/pUZ8002를 접합전달의 DNA 공여균주로 사용하였다. phiC31유래의 attachment site (attP)와 integrase (int) 기능을 가진 pSET152 \( (5.7 \mathrm{~kb}) \)를 접합전달의 부위-특이적 재조합(site-specific recombination) 벡터로 사용하였다. 본 벡터가 접합전달을 통해 숙주세포 내로 전달되면 integrase의 도움으로 방선균 chromosome의 attB site로 삽입되어 유전자 재조합 (recombination)이 이어서 일어나기 때문에 본 논문의 결과들은 접합전달효율(transconjugation frequency)로 나타냈다.</p><h2>배지 및 배양조건</h2><p>S. platensis ATCC 49173의 포자생산용 배지는 ISP2 한천배지(yeast extract \( 4 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), malt extract \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), glucose \( 4 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), agar \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{l}, \mathrm{pH} 7.0 \sim 7.4\))를 사용하였으며 접합전달을 위한 배지로는 AS-1 (yeast extract \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{l}, \mathrm{L} \)-alanine \( 0.2 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), L-arginine \( 0.2 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), L-asparagin \( 0.5 \mathrm{~g} / 1 \), soluble starch \( 5 \mathrm{~g} / 1, \mathrm{NaCl} 2.5 \) \( \mathrm{g} / 1, \mathrm{Na}_{2} \mathrm{SO}_{4} 10 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), agar \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{l}, \mathrm{pH} \) 7.5), ISP4 (soluble starch \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{l}, \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 1 \mathrm{~g} / \mathrm{l}, \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 1 \mathrm{~g} / \mathrm{l}, \mathrm{NaCl} 1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \( (\mathrm{NH} 4)_{2} \mathrm{SO}_{4} 2 \mathrm{~g} / 1, \mathrm{CaCO}_{3} 2 \mathrm{~g} / \mathrm{l}, \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.001 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \( \mathrm{MnCl}_{2} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.001 \mathrm{~g} / \mathrm{l}, \mathrm{ZnSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.001 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), agar \( 15 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), pH 7.0 7.4), MS배지(mannitol \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), soya flour \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), agar \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{l}) \) 를 사용하였다. 또 E. coli의 일반배양 및 형질전환을 위해 Luria Bertani (LB)배지를 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 180 \mathrm{rpm} \)으로 진탕배양 하였다.</p><h2>DNA 조작 및 분리</h2><p>대장균에서의 DNA 조작은 Sambrook 등[19]의 방법을 사용하였고 S. platensis 에서의 DNA 조작은 Kieser 등의 방법을 사용하였으며 S. platensis 접합전달체의 total DNA는 Rao 등의 방법으로 회수하였다. Southern blot hybrid-ization을 위해 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche Applied Science, Tokyo, Japan)와 pSET152의 \( 0.5 \mathrm{~kb} \) apramycin-resistant 유전자 단편을 probe로 사용하였다. DNA 염기서열 결정은 pSET152의 attP site에서 \( 100 \mathrm{bp} \) 떨어진 부분의 염기서열을 이용하여 ATTPR primer (5'-CTGGGTGGGTTACACGACGCCCCT-3')를 제작하여 진행하였다.</p><h2>접합전달방법</h2><p>E. coli에서 S. platensis으로 plasmid의 접합전달은 Kieser 등이 확립한 방법에 변형하여 수행하였다. pSET152를 포함하는 공여균주 E. coli ET12567/pUZ8002은 apramycin (50\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \); 이하 Apr), chloramphenicol \( (25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \); 이하 Cm), kanamycin (\( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \); 이하 Km) 이 첨가된 \( \mathrm{LB} \) 배지에 접종한 후, optical density 600에서 0.4가 될 때까지 배양하였다. S.platensis의 생육에 저해가 되는 첨가된 항생제를 제거하기 위해 동량의 LB 배지로 두 번 세척한 후 0.1 배의 LB 배지로 재현탁하여 S. platensis 와의 접합전달을 위한 공여균주로 사용하였다. 열처리하지 않은 \( 1 \times 10^{7} \)의 S. platensis 포자를 \( 2 \times YT \) 배지 \( 0.5 \mathrm{ml} \)로 현탁한 후 준비된 공여균주의 현탁액 \( 0.5 \mathrm{ml} \)\( \left(2.5 \times 10^{7}\right) \)와 잘 혼합한 다음, 원심분리하여 상징액을 제거한 뒤 얻어진 pellet을 \( 10 \mathrm{mM} \)의 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 를 포함한 4 종류(AS-1, ISP2, ISP4, MS)의 고체배지에 도말하고 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 16 \sim 20 \)시간 동안 정치배양하였다. 형질전환체의 선별을 위해 \( 1.5 \mathrm{ml} \)의 살균수에 \( 0.5 \mathrm{mg} \)의 nalidixic acid (이하 Nal)와 \( 1 \mathrm{mg} \)의 Apr을 첨가하여 배지위에 중첩시킨 후, \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 6일간 더 배양하였다. 선발된 접합전달체를 Nal\((25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 및 Apr( \(25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)이 함유된 선택 배지에 계대배양하여 얻어진 균주들의 chromo-some DNA를 추출하고 PCR에 의해 형질전환 유무를 확인하였다. 본 연구를 통해 얻어진 모든 접합전달효율(transcon-jugation frequency)은 접합전달실험에 사용된 포자수 대비 획득된 접합전달체수의 비율로 나타내었다.</p><h2>염기서열의 accession number</h2><p>본 논문에 보고된 S. platensis ATCC 49173의 attB site의 염기서열은 GeneBank에 accession number AB531501로 등록되었다.</p>
DNA 조작 및 분리에서 S. platensis 에서의 DNA 조작은 무슨 방법을 사용하였는가?
Kieser