<h2>Cell culture 및 transfection</H2><p>HEK293 cello \( 10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) fetal bovine serum, \( 50 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) penicillin과 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) streptomycin이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle minimum essential medium (DMEM) (Invitrogen)에서 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 상태로 37 \( \mathrm{C} \)에서 배양하였다.</p><p>LipofectAMINE reagent (Invitrogen)를 이용하여 pWT-GFP, pS306A-GFP, pCS2+EGFP (pGFP라 명명) plasmid 각각을 HEK293 cell에 transfection하였다. HEK293 cell에 pRFP-NLS와 pWT-GFP나 pS306A-GFP를 co-transfection한 후 발현 양상을 immunofluorescent staining assay와 immunoblot assay 방법으로 관찰하였다.</p><h2>Immunoblot assay</h2><p>HEK293 cell에 DNA를 transfection하여 24 시간 경과한 후 cell을 harvest하여 배지를 제거하고 RIPA buffer ( \( 20 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \( \mathrm{pH} 7.5\), \( 150 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaCl} \), \( 0.1 \% \) SDS, \( 1 \% \) Triton X-100, \( 1 \% \) sodium deoxycholate)로 30 분간 얼음에서 반응 시켜 cell을 용해시키고 ( \( 14,400\mathrm{xg} \)에서 30 분간 원심분리 하여 cell 찌꺼기를 제거하였다. Protein Assay Solution (Bio-Rad)을 이용하여 각각의 단백질 농도를 측정한 후, \( 20 \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 \( 15 \% \) SDS-PAGE로 분리한 후 nitrocellulose membrane에 옮겨 immunoblotting을 실시하였다. hHtrA2 antibody를 반응시킨 다음 secondary antibody로 antigen-antibody complex와 반응시킨 후 ECL (Amersham Pharmacia Biotech.) 방법으로 밴드를 확인하였다.</p><h2>In vitro transcription에 의한 mRNA 제조</h2><p>pWT-GFP plasmid를 Nsi I 으로 linearization한 후 mMESSAGE mMACHINE high yield capped RNA transcription kit (Ambion)를 이용하여 in vitro에서 mRNA를 합성하였다. 이 plasmid에 SP6 promotor가 존재하므로 SP6 polymerase \( 200\mathrm{unit} \), capping과 RNA 합성에 이용되는 NTP mixture를 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 반응 시켜 cap 구조를 가지고 있는 mRNA를 합성하였다. 합성한 mRNA \( (100 \mathrm{ng} / \mu \mathrm{l} \) 농도)를 각 embryo 당 \( 400\sim 600 \mathrm{~pl} \)를 microinjection하여 각 embryo에 약 \( 40 \sim 60 \mathrm{~pg} \)의 mRNA를 injection하였다.</p><h2>Microinjection</h2><p>Microinjection용 plasmid는 HiYield Plasmd Mini kit (Real Biotech Corp. RBC)을 이용하여 정제하였고, 이 정제된 DNA를 zebrafish embryo에 microinjection하였다. Needle (World Precision Instrument Inc.)을 \( 8 \sim 10 \mu \mathrm{m} \)로 제작하고 제작한 needle에 DNA 또는 RNA 용액을 넣은 후 injector (World Precision Instrument Inc.)를 이용하여 embryo에 DNA 또는 RNA를 microinjection 하였다. DNA 또는 RNA를 주입할 때는 1 세포기의 embryo를 이용하여 microinjection을 수행하였으며, sample이 embryo에 잘 injection 되었는 지를 확인하기 위해 DNA나 RNA를 포함하는 용액과 붉은 색을 띠는 phenol red (Sigma) 용액을 1:1 비율로 섞어서 사용하였다. Embryo 당 \( 250 \mathrm{~ng}/ \mu\mathrm{l}\)의 농도로 녹인 DNA 용액을 \( 140 \sim 240 \mathrm{~pl} \)씩 microinjection 하였으며, 이때 embryo에 주입하는 DNA의 양은 embryo당 약 \( 35 \sim 60 \mathrm{~pg} \) 이다.</p><p>한 개의 embryo에 microinjection하는 DNA 또는 RNA의 정확한 양을 알기 위해서는 먼저 embryo에 microinjection하는 DNA나 RNA 용액의 부피를 알아야한다. Embryo에 microinjection하는 sample의 부피는 hemacytometer와 heavy oil (Sigma)을 이용하여 측정하였다. Embyro에 microinjection하게 되는 DNA나 RNA 용액과 동일한 부피의 sample을 injector를 이용하여 heavy oil에 loading을 하게 되는 데, 이 때 loading된 용액은 구의 형태를 띠게 되므로 hemacytometer로 이 구의 반지름을 측정하여 구의 부피를 계산한다(구의 부피 \( \left.=4 / 3 \pi r^{3}\right) \). 이 구의 부피와 한 embryo에 한번 microinjection한 sample의 부피는 동일하므로, 이 부피를 이용하여 알고 있는 농도의 stock DNA나 RNA로부터 한 embryo당 microinjection한 DNA나 RNA의 양을 산출해 낼 수 있다.</p><h2>Microscopte 관찰</h2><p>Embryo의 관찰은 Stereo-Microscope (Leica)과 inverted fluorescence-microscope (Olympus)로 관찰하고, 사진은 DP70 디지털 카메라 (Olympus)로 촬영하였다.</p>
HEK293 cell에 DNA를 transfection하여 24 시간 경과한 후 cell을 harvest하여 배지를 제거하고 cell을 용해시킬때 사용하는 것은 무엇인가?
RIPA buffer