<h1>재료 및 방법</h1><h2>항진균 펩티드 생산균주의 분리</h2><p>항진균 펩티드 생산균주는 갈반병에 감염된 버섯으로부터 Cho 등의 방법에 따라 분리하였다. 갈변이 형성된 느타리버섯 조직 약 \( 1 \mathrm{~cm}^{2} \)를 멸균한 칼로 잘라내어 \( 10 \mathrm{~mL} \) 멸균수에 넣고 분쇄한 이에 멸균수로 희석하였다. 희석액 \( 200 \mu \mathrm{L} \)를 Pseudomonas Agar F(PAF; Bacto-peptone \( 10 \mathrm{~g} \), Bacto-tryptone \( 10 \mathrm{~g}\) ,\({\mathrm{K}_{2}} \mathrm{HPO}_{4} \) \( 1.5 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{MgSO}_{4}\) \(1.5 \mathrm{~g} \), glycerol \( 10 \mathrm{~mL} \), agar \( 15 \mathrm{~g} / 1 \mathrm{~L} \) 증류수)평편배지 위에 도말하고, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양하여 자외선등 아래에서 형광성을 확인하고 선별한 세균들은 버섯조직함몰검정법을 이용하여 병원성을 평가하였다. 분리한 균은 glycerol \( 20 \% \)를 함유한 PAF 성장배지 \( 1.5 \mathrm{~mL} \)에 저장하여 초저온냉동고 (\( -70{ }^{\circ} \mathrm{C} \))에 보관하였다.</p><h2>푸른곰팡이의 분리</h2><p>표고버섯에 피해를 주는 푸른곰팡이는 버섯 종균 생산농가 또는 재배농가에서 병이 발생한 톱밥배지를 수집하여 푸른곰팡이가 발생한 부분 약 \( 1 \mathrm{~cm}^{2} \)를 멸균한 칼로 잘라내어 멸균수 \(40 \mathrm{mL} \)에 넣고 분쇄한 후에 면직포를 이용하여 톱밥배지 및 불순물을 제거하였다. 이 혼합액을 멸균수로 희석하고, Potato dextrose agar 평편배지 위에 도말하여 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48-60시간 배양 한 후, colony 형성을 확인하여 분리하였다. 분리한 균주는 다시 PDA 평편배지 위에 접종하여 48-72시간 동안 배양하여 균주가 충분히 자란 후, 배지를 멸균수 \( 30 \mathrm{~mL} \)에 넣어 현탁하고, 면직포에 여과하여 포자현탁액을 얻었다. 포자는 \( 20 \% \) glycerol 수용액에 현탁하여 초저온냉동고 (\( -70^{\circ} \mathrm{C} \))에 저장하였다.</p><h2>향진균 활성 측정 방법</h2><p>항진균 활성을 측정하기 위하여 PDA 고체배지에 Trichoderma harziamum H1 균주 배양액을 배지의 우측에 \( 30 \mu \mathrm{L} \) 접종하고 \( 2-3 \mathrm{~cm} \) 떨어진 좌측에 균주 배양액을 원심분리하여 균주는 침전시키고 항진균 펩티드를 포함하는 상징액만 취하여 원액 50\( \mu \mathrm{L} \)를 점적한 필터디스크를 위치한 다음 배양하였다. 푸른곰팡이는 모든 방향으로 성장하나 향진균 펩티드를 함유한 디스크 부위에는 성장하지 못하여, 균사의 비대칭 성장을 보였다. 이때 곰팡이 성장이 저해된 부분인 비대칭 부위의 면적을 측정하였으며, 곰팡이 생육억제 면적이 클수록 푸른곰팡이에 대한 펩티드의 항진균 활성이 우수한 것으로 평가하였다. 억제면적은 Adobe photoshop CS 프로그램을 이용하여 측정하였다.</p><h2>톱밥배지에서 푸른곰팡이 발생면적 측정</h2><p>톱밥배지에서의 항진균 펩티드의 항진균 활성을 측정하기 위하여 곰팡이가 발생한 톱밥배지의 표면이 젖도록 항진균 펩티드를 1회 처리하였다. 곰팡이 억제 효과를 측정하기 위해서는 표고버섯을 재배하는 중에 톱밥배지에서 푸른곰팡이의 발생면적을 평가하여야 하며, 평가방법을 개발하여 '색상선택법'으로 명명하였다. 톱밥배지 전체를 사진으로 찍은 후 사진의 색상을 컴퓨터로 분석하면 RGB 세 가지 색상으로 분석이 되며, 이는 각각 0-255 사이의 값을 가지게 된다. 이 세가지 색상의 조합으로 모든 색상이 표현되는데 본 실험에서 사용한 푸른곰항이의 색상 범위는 R: 100-140, G: 110-150, B: 110-150이며, 이는 사진을 찍을 때의 날씨 또는 시간에 따라 차이가 있기 때문에 약간의 변화를 주며 면적을 측정하였다. Adobe photoshop CS 프로그램을 이용하여 위의 색상범위를 선택하고 푸른 색상범위의 색을 가지고 있는 면적이 표현이 되면, 이의 픽셀수를 계산하여 곰팡이의 발생면적의 변화를 측정하였다.</p>
분리한 균주는 다시 PDA 평편배지 위에 접종하여 48-72시간 동안 배양하여 균주가 충분히 자란 후, 배지를 멸균수 30 mL에 넣어 현탁하고, 면직포에 여과하여 어떤것을 얻었나요?
포자현탁액