<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물재료</h2><p>본 실험에 이용한 GM 벼 Cr7-1 계통은 농촌진흥청에서 토양미 생물로부터 유래한 Bt 유전자를 작물에 적합하도록 살충성 염기의 일부분을 변형시킨 유전자, CryIAcl를 벼에 형질전환하여 해충저항성 벼로 개발한 것으로 non-GM 벼 (낙동벼)와 같이 Oryzae sativaL., Japonica 종이다. 실험에 이용한 대조작물로는 콩, 배추, 감자, 고추, 상추, 참외, 들깨, 토마토, 완두, 피망, 고구마 등을, 벼 대조구로는 간척벼, 계화벼, 그루벼, 금남벼, 금오벼, 금호1호, 금호2호, 낙동벼, 남감벼, 남원벼, 남천벼, 남평벼, 내풍벼, 농안벼, 다산벼, 대립1호, 대산벼, 대안벼, 대야벼, 대진벼, 대청벼, 동안벼, 동진벼, 동해벼, 둔내벼, 만금벼, 봉광벼, 삼백벼, 상산벼, 상주벼, 상주찰벼, 삼천벼, 서안벼, 서진벼, 소백벼, 신선찰벼, 신운봉벼, 장안벼, 조령벼, 주안벼, 중화벼, 진부벼, 진부올벼, 진부찰벼, 진미벼, 청명벼,추청벼, 아랑향찰, 안산벼, 안중벼, 양조벼, 영남벼, 영해벼, 오대벼, 오봉벼, 운봉벼, 운장벼, 일미벼, 화남벼, 화동벼, 화서벼, 화선찰벼, 화성벼, 화신벼, 화영벼, 화중벼, 향남벼, 향미 1 호, 향미2호, 탐진벼, 팔공벼 등 71 개 품종을 이용하였다. 또한, Cr7-1과 같은 유전자 운반체로 형질전환하여 얻은 계통들을 대조하였고, 자체개발한 GM 작물로 벼, 콩, 고추, 감자, 배추, 들깨 등을 PCR 검출 대조구로 사용하였다.</p><h2>분자생물학적 검정</h2><p>DNA 추출 및 Southern blot 분석 : 식물체의 genomic DNA는 각 시료 \( 1 \mathrm{~g} \) 씩을 취하여 막자사발에 넣고 액체질소를 가하여 분말화 한 후 DNeasy Plant kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, USA)를 이용하여 \( 260 / 280 \mathrm{~nm} \) 값이 \( 1.8\) ~ \(2.0 \) 사이인 추출액을 각 실험에 이용하였다.</p><p>유전자변형 식물체의 도입유전자 특성 확인을 위해서 Southern blot을 수행하였으며, 방법은 추출한 genomic DNA \( 5 \mu \mathrm{g} \) 를 제한효소 PstI과 ClaI으로 각각 달리 처리하여 절단하고 \( 1 \% \) agarose gel 상에서 전기영동 한 다음 denaturation 과정을 수행하였다. 이 후 nylon membrane (Hybond-N+, Amersham, Uppsala, Sweden)에 겔의 DNA를 전이시키고, Membrane의 DNA 단편들을 UV-crosslink \((1200\times \mu \mathrm{J} / \mathrm{cm}^{2} )\) 로 고정한 후 hybridization buffer \( (0.5 \mathrm{M}\) \(\mathrm{Na}_{2}\) \(\mathrm{PO}_{4}\) \(\mathrm{pH} 7.2\), \(1 \% \) BSA, \(7\%\) SDS, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 10 \mathrm{mg}/\mathrm{mL} \) salmon sperm testicle DNA)로 1시간 동안 pre-hybridization하였다. Hybridaization은 Random primer DNA labeling kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 이용하여 미리 형질전환 벡터를 PstI으로 절단하여 준비한 \( 2.1 \mathrm{~kb} \) 의 mCrylAc 단편 DNA를 프로브로하고 \( { }^{32} \mathrm{P} \) 로 labeling하여, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16~18시간 동안 hybridization 하였다. Membrane은 washing solution (1st solution, 2X SSC, \( 0.1 \% \) SDS; 2 nd solution, 1X SSC, \( 0.1 \% \) SDS; 3rd solution, \( 0.2 \%\) SSC, \(0.1 \% \) SDS으로 처리하고 X-ray 필름 (Super RX, Fuji, Tokyo, Japan)에 감광하여 형질전환체의 도입유전자 특성을 확인하였다.</p><p>면역학적 방법을 이용한 유전자 발현 확인 : 도입유전자의 단백질 발현 확인을 위하여 immunostrip 검정 (lateral flow strip test)을 실시하였다. 각 시료를 마쇄하고 추출액을 넣어 단백질을 추출한 후, bar 도입유전자에 대해서는 Trait LL Test Strip (Strategic Diag-nostics Inc., Newark, USA)을, CryLAcl 도입유전자에 대해서는 CrylAb-1Ac ImmunoStrip Test (Agdia, Elkhart, USA)을 이용하여 제조사가 제공한 방법에 따라 immunostrip 검정을 수행하였다.</p><p>인접서열 분석 : 선발계통에 대한 genomic DNA 상의 도입 T-DNA의 인접서열을 확인하고자 Kim (2005b)의 방법에 따라 두 단계로 실시하였다. 먼저, genomic DNA를 HincII로 절단하고. 이 후 AD1 (5'-TAATACGACTCACTATAGCAATTAACCCTCACTAAAGGGA-3')와 AD2 (5'-TCCCTTTAG-3')으로 구성된 adaptor를 ligation하였다. 두 번째 단계로, adaptor에 대한 Al (5'-TAATACGACTCACTATAG-3') 및 A2 (5'-GACTCACTATAGCAATTAAC-3')의 특이 프라이머를 제작하고, T-DNA의 right border에 대해서 RB1(5'-GAAGGAGCCACTCAGCAAGC-3') 및 RB2 (5'-GGACAAGCCGTTTTACGTTTG-3')를, left border에 대해서는 LB1 (5'-ATAAGGCTGTGTGTCCTTTG-3') 및 LB2 (5'-ACTGAATTCGAGCTCCTGAC-3')의 primer를 제작하여 단계별로 PCR를 수행하였다. 이후 증폭된 PCR 산물은 \(1\%\) agarose gel에 전기영동하고 Gel Extraction kit (Qiagen)를 이용하여 정제 후, pGEM-T easy vector (Promega, Madison, USA)에 삽입하여 염기서열을 확인하였다. 확인된 염기서열은 NCBI BLAST 분석을 이용하여 동일성 분석을 수행하였다.</p><p>특이 프라이머 제작 및 PCR 검정 : 식물 발현벡터의 유전정보 및 T-DNA의 인접서열을 바탕으로 해충저항성 GM 벼의 선발계통에 대한 검정 특이 프라이머를 제작하였다. 제작한 프라이머는 그 특이성을 확인하고자 온도, 프라이머 농도 및 DNA의 농도에 따른 영향을 조사하였고, 프라이머의 검정 정확성을 확인하기 위하여 각종 작물별, 계통별 및 세대별 등 다양한 확인 실험을 수행하였다.</p><p>기본적인 PCR 반응은 한 시료 당 총 \( 25 \mu \mathrm{L} \) 로 하여, \( 2.5 \mu \mathrm{L} \) 의 \( 10 \times \) PCR buffer (Ampliqon, Herlev, Denmark) \( 2 \mu \mathrm{L} \) 의 dNTP \( (2.5 \mathrm{mM} \) each, Ampliqon), \( 1.5 \mu \mathrm{L} \) 의 \( 1.5 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{MgCl}_{2} \) (Ampliqon), 각각 \( 10 \mu \mathrm{M} \)의 forward와 reverse primer, Taq DNA polymerase 는 TEMPase Hot Start DNA polymerase (Ampliqon)를 \( 1.25 \mathrm{unit}\) 첨가하고, \( 20 \mathrm{ng} \) 의 template DNA가 포함되도록 조성하여 수행하였다. PCR반응 조건은 Dyad Peltier Thermal cycler (Bio-Rad, Hercules, USA) 를 이용하여, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간 실시하고, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 40초, \( 72{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분간 35 cycle로 하였으며, 마지막 단계로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 \( 2 \% \) agarose gel 상에서 전기영동 하여 UV로 확인하였다.</p>
추출액을 만드는 데 이용한 도구의 이름은 무엇인가?
NanoDrop Spectrophotometer ND-1000