<h2>LDH 동위효소의 기질의존성 측정 및 최적 \( \mathrm{pH} \)</h2><p>정제된 칠성장어 간조직 LDH 동위효소와 chromatofocusing에 의해 정제된 \( \mathrm{pH} 7.45 \mathrm{} \) LDH 분획의 기질농도에 대한 효소 활성 저해정도를 알아보기 위해 \( 100 \mu \mathrm{M} \)에서 \( 10 \mathrm{mM} \)까지 pyruvate 농도를 증가시키면서 효소 활성의 변화를 측정하였다.</p><p>정제된 칠성장어 간조직 LDH 동위효소와 대구 liverspecific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지시킨 \( 0.1 \mathrm{M} \) acetate buffer \((\mathrm{pH} 4.0, 4.5, 5.0, 5.5)\), \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.0, 6.5, 7.0)\), \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris- HCl buffer ( \( \mathrm{pH} 7.5,8.0,8.5, 9.0\)) 및 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium carbonate buffer \( (\mathrm{pH} 9.5,10.0,10.5) \) 에서 반응시킨 후 활성을 측정하여 최적 \( \mathrm{pH} \) 를 확인하였다.</p><h2>항혈청 조제 및 항원-항체 반응</h2><p>정제한 liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 \( 0.06,0.1,0.13 \mathrm{mg} \) 을 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer에 녹여 동량의 Freund's complete adjuvant에 완전히 유화시킨 후, 뉴질랜드 화이트 순종 토끼의 thigh muscle과 dorsal muscle에 8일 간격으로 3 회 주사하였다. 최종 면역주사 4일 후 항응고제를 사용하지 않고 심장 천공법으로 채혈하였으며 혈액은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 방치 후 혈병을 제거하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 시간 방치한 후, \( 1,000 \times \mathrm{g} \)에서 20 분간 원심분리하여 얻은 상등액을 \( 20,000 \times \mathrm{g} \) 에서 30분간 원심분리한 후 상등액을 항혈청으로 사용하였다. 항혈청은 정제하여 사용하였다. Eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 와 꺽지 \( \mathrm{A}_{4} \) 에 대한 항혈청은 제조된 것을 사용하였다. 칠성장어 간조직 추출액과 chromatofocusing에 의해 정제된 \( \mathrm{pH} 7.45\) 의 분획의 동위효소 1 unit에 대해 liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \), eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 및 꺽지 LDH \( \mathrm{A}_{4} \) 에 대한 항혈청을 \( 25,50,100,200 \mu \mathrm{l} \)를 가한 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12시간 방치시킨 다음 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(20,000 \times g \) 에서 원심분리하였으며 복합체를 형성하지 않고 상등액에 남아 있는 효소의 활성을 측정하였다.</p>
상등액에 남아 있는 효소의 활성을 측정을 위해 샘플을 어떻게 준비했어?
liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \), eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 및 꺽지 LDH \( \mathrm{A}_{4} \) 에 대한 항혈청을 \( 25,50,100,200 \mu \mathrm{l} \)를 가한 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12시간 방치시킨 다음 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(20,000 \times g \) 에서 원심분리