<h1>재료 및 방법</h1><h2>조직 추출액의 준비</h2><p>대구(Gadus macrocephalus)는 생체 재료상에서 구입하였고, 칠성장어(Lampetra japonica)는 강원도 인제군 오색에서 채집하여 동결된 상태를 유지시키며 실험실로 운반하였다. 칠성장어와 대구의 간조직을 적출하여 증류수로 세척한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 6.85\))를 각 시료 조직의 3 배\( (\mathrm{V} / \mathrm{W}) \) 가한 다음 얼음에 채운 glass homogenizer로 파쇄하였으며, 이 용액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(20,000 \times \mathrm{g} \)에서 1 시간씩 2 번 원심분리(Hitachi 20 PR-52D)하여 상등액을 시료로 사용하였다. 또한 칠성장어 간조직 일부는 chromatofocusing을 실시하기 위해 \( 0.025 \mathrm{M} \) Tris- \( \mathrm{CH}_{3}\) \(\mathrm{COOH} \) buffer \( (\mathrm{pH} 8.5)\) 를 사용하여 파쇄하였다. 조직추출액은 \( 0^{\circ} \mathrm{C} \)에서 차게한 후 glass wool을 채운 column에 2번 통과시켜 지방을 제거하였다.</p><h2>LDH의 활성측정 및 단백질 정량</h2><p>LDH의 활성은 \( 1.5 \mathrm{mM} \) pyruvate와 \( 0.14 \mathrm{mM} \mathrm{} \) NADH를 함유한 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 6.85)\) \( 3 \mathrm{ml} \) 에 시료를 가한 다음 NADH로부터 \( \mathrm{NAD}^{+} \)로 산화되는 정도를 spectrophotometer (Shimadzu UV-160A)를 사용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \), \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 활성단위는 1분 동안 감소되는 흡광도 1.0 을 1unit로 하였다. Affinity chromatography 과정 중 각 분획의 단백질은 Bradford의 방법으로 \( 595 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 정량하였고, chromatofocusing 경우에는 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Polyacrylamide gel 전기영동</h2><p>LDH 동위효소의 정제도와 항원과 항체의 반응정도를 확인하기 위해 \( 7.5 \% \) acrylamide separation gel과 \( 2.5 \% \) acryl-amide stacking gel을 만들어 polyacrylamide vertical slab system (Hoefer SE250)으로 실시하였다. Tris-glycine buffer \( (\mathrm{pH} \mathrm{8.3)} \) 를 사용하여 \( 100 \mathrm{~V} \)에서 15 분간 전개시킨 후 \( 200 \mathrm{~V} \) 에서 2시간 15분 동안 thermostatic circulator (LKB 2219)를 사용 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지시키면서 전기영동 하였으며 LDH를 염색하고 단백질은 silver nitrate로 염색하였다.</p>
칠성장어와 대구의 간조직을 어떻게 파쇄 했어?
간조직을 적출하여 증류수로 세척한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 6.85\))를 각 시료 조직의 3 배\( (\mathrm{V} / \mathrm{W}) \) 가한 다음 얼음에 채운 glass homogenizer로 파쇄