<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물체 준비</h2><p>본 연구에 사용한 벼 종자(Oryza sativa L. cv. Dongiin)는 \( 0.05\%\) Spotak 용액에 넣어 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 하룻밤 소독한 뒤, 증류수로 5회 세척하였다. 소독한 종자는 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 암실 조건에서 젖은 티슈 페이퍼를 사용하여 발아시킨 뒤 Yoshida 용액으로 옮겨 16/8 시간의 명암 주기, 습도 \( 70 \% \), 온도 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 로 유지된 성장 챔버에서 키웠다. 단백질체 분석을 위해 4주간 키운 벼잎을 수확하였고 수확 즉시 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 초저온 냉동고에 보관하였다.</p><h2>Azo 합성</h2><p>본 연구에 사용한 Azo 계면활성제의 합성은 이전에 보고되었던 방법에 따라 수행하였다. 플라스크에 \( 0.857 \mathrm{~mL} \)의 4-n-hexylaniline ( \( 4 \mathrm{mM}, n=4, \) C6 )을 \( 4.8 \mathrm{~mL} \)의 염산 (\( 10 \% \))과 \( 8 \mathrm{~mL} \)의 \( \mathrm{ddH}_{2} \mathrm{O} \)에 넣은 뒤 10분간 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \)에서 교반하였다. 이후 \( 4 \mathrm{~mL} \)의 아질산나트륨 (\( 1 \mathrm{mM} ~\mathrm{NaNO}_{2} \))을 첨가하면서 같은 온도조건에서 5분, 탄산나트륨 (\( 2 \mathrm{mM} ~ \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \))을 조금씩 첨가하면서 3분간 교반했으며, 교반이 끝난 용액은 냉장 보관하여 차갑게 준비된 상태의 \( 8 \mathrm{~mL} \)의 아황산나트륨 (\( 8 \mathrm{mM} ~ \mathrm{Na}_{2} \mathrm{SO}_{3} \))이 담긴 플라스크에 여과한 뒤 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하여 재결정화될 수 있도록 하였다. 마지막으로, 재결정화된 화합물을 정제하였고 이전 보고된 방법에 따라 ESI (electrospray ionization)-MS 및 \( { }^{1} \mathrm{H} \)-핵자기공명(NMR) 분석을 이용하여 Azo의 구조를 확인하였다</p><h2>벼 잎 단백질 추출</h2><p>추출방법 및 과정은 먼저 파우더 상태의 벼 잎 \( 200 \mathrm{mg} \) 에 high density sucrose (HDS) buffer [\(37.5 \mathrm{mM}\) hydroxyethyl piperazinee-thanesulfonic acid (HEPES), \(\mathrm{pH} 8.0\),\(37.5 \%\)(\(\mathrm{w} / \mathrm{w}\) \( 1.215 \mathrm{M} \) ) sucrose, \( 7.5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) glycerol, \( 15 \mathrm{mM} \) ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA), \( 15 \mathrm{mM} \) ethylene-glycol-tetraacetic acid (EGTA), \( 1 \mathrm{mM} \) dithiothreitol (DTT), 100x Halt \( { }^{\mathrm{TM}} \) protease inhibitor cocktail을 추가하여 균질화시켜 준 뒤 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 \( 600 \mathrm{~g} \) 로 원심분리 시켜 상등액을 모았다. 위의 과정을 2번 더 반복하여 남은 침전물에서 상등액을 추가적으로 얻었으며 이때, 원심분리 조건은 동일하되 HDS 용액은 처음의 절반, 3분의 1로 줄여가며 사용했다. 남아있을 지도 모르는 잔여물들을 제거하기 위해 얻어진 모든 상등액을 합친 뒤 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분간 \( 600 \mathrm{~g} \)로 원심분리를 추가적으로 수행하였다. sucrose의 최종 농도를 \( 12 \sim 13 \% \) 로 낮추어 주기 위해 얻어진 투명한 상등액을 \( \mathrm{ddH}_{2} \mathrm{O} \) 과 \( 1: 2 \) 의 비율로 희석하였다. 마지막으로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 90 분간 \( 21,000 \mathrm{~g} \) 로 원심분리한 뒤 얻어낸 상등액을 \( 0.07 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v} )\) \(\beta \)-mercaptoethanol을 포함한 \( 12.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) trichloracetic acid (TCA)/acetone을 이용하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 침전시켜 벼 잎으로부터 단백질을 얻었다.</p>
발아된 벼 종자를 키우기 위해 적절한 습도와 온도로 옳게 짝지어진 것은 뭐야?
습도 \( 70 \% \), 온도 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)