<h2>인접서열 분석</h2><p>Southern blot 분석으로부터 event 계통, Cr7-1이 1 copy의 유전자가 삽입되어 있음을 확인하였으며, 이에 따라 도입유전자의 분자생물학적 특성 분석을 위해서 T-DNA 삽입부위의 인접서열을 Kim(2005b)의 방법에 따라 단계적으로 수행하였다. 먼저, 추출한 gDNA를 제한효소 HincII로 처리하여 1st PCR을 수행하였고, 이를 바탕으로 2nd PCR을 수행하여 agarose gel 전기영동으로 T-DNA의 right border (RB) 및 left border (LB) 부위의 증폭된 밴드를 확인하였다. 증폭된 RB와 LB의 PCR산물은 pGEM-T easy vector에 cloning하여 염기서열을 분석하고, 이들 염기서열에 대하여 NCBI blast 검색을 실시하여 확인한 인접서열을 Figure 4에 나타내었다. 검색 결과 운반체 내의 T-DNA 이외의 염기는 확인되지 않아서, T-DNA만이 벼 genome에 삽입되었음을 알 수 있었다. 또한 T-DNA의 인접서열에 대한 벼 genome의 유사성 분석 및 삽입위치를 확인한 결과, 유사성 있는 염기서열은 확인되지 않았으며, T-DNA의 삽입부위는 벼 genome 제 1염색체 내의 9,296,530번 염기서열 부위로 삽입되어 있음을 확인할 수 있었다.</p><p>GMO 검출에 있어서 35 S 프로모터 및 Nos 터미네이터 등을 대상으로 하는 일반적인 screening 검정방법은 자연 상의 바이러스 등에 의한 오염 또는 감염으로 잘못된 양성 반응을 나타낼 수 있고, gene-specific 및 construct-specific 방법은 변형된 유전자와 운반체로 많은 유전자변형체의 생산에 이용되고 있기 때문에 잘못된 반응을 야기할 수 있으며, 또한 동일한 운반체로 삽입되었을 때 다른 유전자변형체 간 구분이 어렵다는 점이 잘 알려져 있다 (Huang and Pan 2005; Taverniers et al. 2005; Pan et al. 2006). 반면 도입유전자의 작물 genome 내 삽입부위의 인접서열을 알고 있다면 계통 특이 (event-specific) 마커를 작성하여 유전자변형 작물의 더욱 세밀한 검출 및 동정에 이용할 수 있다.</p><h2>특이 프라이머를 이용한 PCR 조건 확립</h2><p>혹명나방저항성 GM 벼의 특이적인 마커를 개발하고자, 상기 분석으로 확인된 도입유전자의 벡터 내의 염기서열과 벼 genome 내의 T-DNA 삽입부위의 염기서열을 바탕으로 계통특이(event-specific) 프라이머를, 또한 T-DNA 내의 목적유전자의 염기서열을 바탕으로 구조특이(construct-specific) 프라이머 쌍을 제작하였다. Table 1에 나타낸 프라이머 쌍은 GM 벼에 대한 예비 PCR실험을 통해서 비특이적으로 증폭되는 PCR산물을 생산하지 않는 프라이머 쌍들을 최종적으로 선발한 것이다. 일반적으로 프라이머의 특성에 따라 genome 상에 유사성 염기의 존재 및 낮은 프라이머의 annealing 온도에 의해 비특이적인 증폭산물을 나타낼 수 있기 때문에 최적의 PCR 분석을 위해서는 안정적이고 특이적으로 증폭반응을 나타낼 수 있는 프라이머 쌍의 개발이 제시되고 있다(Malhotraet al. 1998; James et al. 2003; Lim et al. 2007). 선발된 구조 및 계통 특이 프라이머에 대한 최적 PCR 조건을 파악하고자 DNA 농도, annealing 온도 및 프라이머 농도를 달리하여 PCR반응을 수행하였다. 먼저 Cr7-1의 DNA 농도를 \(10\sim 200 \mathrm{ng} \)의 범위에서 단계별로 조절하고, \(20 \mu \mathrm{M} \) 의 프라이머 농도로 하여 PCR를 실시한 결과, 구조 특이 프라이머 (TPCry-5'1/3'), RB를 바탕으로 한 계통특이 프라이머(Mrs-5'/MrRB-3') 및 LB의 계통특이 프라이머 (Mrs-5'/MrLB-3')에 대하여 각각 \( 258 \mathrm{bp}\), \(341 \mathrm{bp} \) 및 \( 236 \mathrm{bp} \) 에서 특이적인 PCR 증폭산물을 얻었다 . DNA 농도에 대한 밴드 감도를 확인해 보면, \( 1 \mathrm{ng} \) 농도에서도 특이적인 밴드를 확인할 수 있었고, \( 10 \mathrm{ng} \) 농도부터 확연한 밴드를 형성하여 최대 농도인 \(200 \mathrm{ng} \)까지 증폭밴드를 확인할 수 있었다. 그러나 밴드의 강도 면에서 \(10\mathrm{ng} \) 농도 이상에서는 큰 차이를 나타내지 않아 최적의 농도로 \( 10 \mathrm{ng} \) 에서 \( 100 \mathrm{ng} \) 의 농도 범위가 적절할 것으로 파악되었다. 이의 결과로 본 구조 및 계통특이 프라이머는 낮은 DNA 농도에서도 특이적인 검정이 가능할 것으로 생각된다. Lim 등 (2007)은 프라이머에 대한 DNA 농도별 실험에서 \( 25 \mathrm{ng} \) 이상의 농도부터 확연한 밴드를 확인할 수 있었다고 했는데, 이는 프라이머의 특성, 중합효소의 활성 및 annealing 온도 등 여러 요인에 의해 반응이 좌우 될 수 있기 때문으로 여겨진다. 앞서 DNA 농도 범위가 확인되어, 적정 프라이머 농도를 결정하기 위해서 DNA 농도를 \( 20 \mathrm{ng} \) 으로 하고 프라이머 농도를 \(5\sim 100 \mu \mathrm{M} \) 범위에서 각각 달리하여 PCR을 수행한 결과, \( 10\mu \mathrm{M} \) 농도 이상에서 뚜렷한 증폭산물의 형성을 나타내어 Cr7-1에 대한 구조 및 계통특이 프라이머의 검정을 위한 최적 사용 농도로 \(10\sim 50 \mu \mathrm{M} \) 범위가 적당한 것으로 확인되었다. 이어 적정 annealing 농도를 파악하기 위해서 \( 55.0 \sim 75.0{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 범위에서 각각 달리하여 PCR을 실시한 결과, 높게는 \( 65.0^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 확인 가능한 것으로 나타났으며, \(56.5\sim 61.0^{\circ} \mathrm{C} \) 범위가 3종의 프라이머 쌍 모두에 대하여 가장 적절한 온도조건으로 확인되었다. 이상의 결과를 종합해 보면 혹명나방저항성 GM 벼, Cr7-1의 검정을 위해 개발된 구조 및 계통특이 프라이머 쌍의 최적 PCR조건은 \( 10\sim 100 \) \( \mathrm{ng} \) 의 DNA 농도 범위로 사용하고, 프라이머는 \( 10\sim 50 \mu \mathrm{M} \) 농도로, \( 56.0 \sim 61.0^{\circ} \mathrm{C} \) 의 annealing 온도 범위가 가장 적절한 반응조건인 것으로 확인되었으며, 이들 프라이머 쌍은 넓은 범위의 PCR반응 조건에서 적용 가능하리라 보여진다.</p>
증폭된 RB와 LB의 PCR산물은 어떤방법으로 분석했어 ?
pGEM-T easy vector에 cloning하여 염기서열을 분석