<h1>결 과</h1><h2>호중구의 자연 세포사멸에 대한 MAC의 영향</h2><p>호중구의 형태적 관찰은 Fig. 2A에서 나타낸 바와 같이 호중구 세포사멸의 현상을 가장 특징적이고 간단하게 확증할 수 있는 방법이다. 이 방법은 호중구의 세포 특성상 다른 어떠한 세포보다도 세포사멸 동안 핵이 농축되고 그 후 분획으로 된것이 잘 나타나고 세포질에 액포가 나타나는 것을 쉽게 관찰할 수 있다. 호중구를 분리하여 배양 상태에서 20시간을 방치하면 \( 50-60 \% \)의 세포는 핵의 응축등 세포사멸의 형태를 보인다. 6시간 동안 배양한 호중구는 거의 형태적 변화를 보이지 않았으나 \( 20 \mu \mathrm{M} \) 농도의 MAC를 6시간 투여하였을 때 \( 50 \% \)정도에서 세포사멸의 형태를 보였다. Fig. 2B에서와 같이 이러한 세포사멸을 annexin-V와 PI 염색으로 관찰하였을 때도 MAC를 처리한 경우 annexin-V와 Pl에 염색되는 세포의 비율이 처리하지 않은 대조군에 비교하여 현저히 증가하는 것으로 나타났다\( (60 \pm 5 \% \) vs \( 1 \pm 0.5 \%, P<0.001) \). 이러한 결과는 MAC에 의하여 호중구의 자연 세포사멸이 유도된다는 것을 알 수 있다. Fas와 결합하여 세포사멸을 유도하는 Fas 항체(lgM 형)를 6시간 처리하였을 때도 \( 60-70 \% \)정도의 세포사멸을 보이는 것과 비교하여 MAC는 Fas 자극에 의한 세포사멸과 유사한 것으로 보인다. 또한 세포사멸이 일어나는 세포에서 특징적으로 나타나는 DNA 조각들이 전기영동에서 뚜렷하게 나타났다(Fig. 2C). MAC의 세포사멸에 대한 효능을 농도별로 측정하였을 때 \( 20 \mu \mathrm{M} \)의 농도에서 현저히 세포사멸이 증가하여 \( 30 \mu \mathrm{M} \)의 농도에서 \( 95 \% \)이상 세포사멸을 보였다(Fig. 3). 시간에 따른 세포사멸을 관찰하였을 때 배양 6시간 후 대부분의 호중구는 생존하였으나 \( 20 \mu \mathrm{M} \)의 농도에서 \( 54 \pm 10 \% \)의 세포사멸을 보임으로써 배양 후 마른시간 내 세포사멸이 일어난다는 것을 알 수 있으며 Fas-항체에 의한 세포사멸 유도와 비숫한 의존 형태를 보였다.</p><h2>호중구의 세포사멸 지연에 대한 MAC의 영향</h2><p>호중구의 세포사멸을 지연시킨다고 알려진 LPS, GMCSF, dibutyryl-cAMP, dexamethasone, 및 IL-8로 호중구를 20시간 처리하였을때 세포사멸된 세포의 수가 현저히 감소하였다. 이들 약물을 처리하기 1시간 전에 \( 10 \mu \mathrm{M} \)농도의 MAC를 투여하고 20시간 배양 후 세포사멸을 측정하였다. MAC를 처리한 세포에서는 이들 세포사멸 지연 약물이나 사이토카인들이 들어 있더라도 세포사멸이 현저히 일어나지 않음으로써 MAC는 세포사멸의 지연에는 큰 영향이 없다는 것을 알 수 있다(Fig. 4). Serine protease의 억제제인 4-(2-aminoethyl)-benzenesulphonyl fluoride (AEBSF)는 자연 세포사멸을 천천히 억제하였으나 MAC에 의한 세포사멸 유도를 충분히 막지는 못하였다.</p><h2>MAC에 의한 세포사멸 유도에서 caspase의 영향</h2><p>본 연구에서는 caspase에 대한 억제제가 MAC에 의한 세포사멸에 어떠한 영향을 미치는가를 조사하였을 때 pancaspase 억제제인 ZVAD-fmk에 의하여 MAC의 세포사멸에 대한 영향은 충분히 봉쇄되었다. 또한 caspase-3 및 caspase-8에 특이적인 억재제인 zDEVD-fmk 및 zIETD-fmk를 \( 100 \mu \mathrm{M} \)의 농도로 전처리를 하였을 때도 MAC에 의한 세포 사멸은 억제되었다(Fig. 5A). Fig. 5B의 Western blot 결과에 서 보는 바와 같이 MAC를 처리한 세포에서 procaspase-8과 procaspase-3의 단백질이 절단되어 그 양이 약물을 처리하지 않은 세포들에서보다 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 그러나 procaspase-9의 양은 anti-Fas 항체를 처리한 경우 현저히 감소하였으나 MAC를 처리한 경우에서는 약물을 처리하지 않고 20시간 배양한 경우와 차이를 보이지 않았다. 이들 결과는 MAC에 의한 세포사멸은 caspase-8과 caspase-3를 통한 세포사멸이라는 것을 제시하고 있다. 본 연구진들은 그전의 연구에서 호중구의 세포사멸에서 FADD의 양이 배양 후 짧은 시간에서 증가하고 항세포사멸 단백질로서 bcl-2군에 속하는 Mcl- 1의 양은 현저히 감소한다고 보고하였는데 MAC 처리 6시간 후 이들 단백질의 양적 변화는 관찰되지 않았다(Fig, 5C).</p><h2>MAC에 의한 세포사멸에서 미토큰드리아 막의 손상과의 관계</h2><p>Fig. 6은 배양된 호중구에서 \( \mathrm{DiOC}_{6}(3) \)의 세포 내 염색이 줄어드는 것을 보여 주고 있다. 이러한 사실은 호중구의 자연 세포사멸은 미토콘드리아 막 투과성이 증가하여 막전위가 소실됨으로써 일어날 수 있다는 것을 보여 준다. MAC를 처리한 세포에서 이러한 \( \mathrm{DiOC}_{6}(3) \)의 소실이 농도에 따라서 현저히 증가하는 것은 MAC에 의한 세포사멸이 미로콘드리아의 손상에 의하여도 일어난다는 것을 알 수 있다(Fig. 6). 그러나 caspase-8의 억제제인 zIEID-fmk를 전처리한 경우 MAC에 의한 막 전위의 소실은 억제되지 않는 것으로 보아 비록 MAC가 미토콘드리아의 막 손상을 유발하나 세포사멸에는 직접적으로 영향을 주지는 못하는 것으로 추측된다.</p><h2>MAC에 의한 세포사멸에서 항산화제의 영향</h2><p>항산화제인 \( \mathrm{n} \)-acetylcystein과 glutathione은 호중구의 자연 세포사멸을 지연시키는 작용을 보였으나 MAC에 의한 세포사멸은 억제시키지 못하였다(Fig. 7). 또한 NADPH-oxidase의 활성에 의한 \( \mathrm{O}_{2} \)의 생성을 억제하는 diphenylene iododium을 전처리하였을 때도 MAC에 의한 세포사멸은 억제되지 않았다.</p>
Fig. 2A를 확인하면 호중구의 형태적 관찰이 어떤 방법임을 알 수 있지?
호중구 세포사멸의 현상을 가장 특징적이고 간단하게 확증할 수 있는 방법