<h2>Thiocyanate에 의한 항산화 활성 측정</h2><p>Ohkawa의 방법에 따라 먼저 linoleic acid로 유도된 과산화 지질 용액에 \( 70 \% \) ethanol과 ammonium thiocyanate 용액 (\( 0.3 \mathrm{~g} / \mathrm{ml}\) in \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)), ferrous chloride 용액 (\( 2.45 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) in \( 3.5 \%\)) hydrochloric acid)을 혼합한 후 정확히 3분 후에 \( 500 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이때 활성의 비교를 위하여 BHT를 \( 0.05 \%\) 농도로 사용하였다.</p><h2>TBA (2-thiobarbituric acid)에 의한 항산화 활성 측정</h2><p>Linoleic acid (\( 25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) in EtOH)를 기질로 하여 \( 0.2 \mathrm{M} \) phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 7.0\))와 각 시료 용액을 가하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1주일 동안 과산화 지질을 유도하였다. 과산화 지질 측정은 반응액에 \(35 \% \) trichloroacetic acid와 \(0.75 \% \) aqueous TBA를 혼합하고 가열처리 한 후 \( 70 \% \) trichloroacetic acid를 가한 다음 원심분리 하여 그 상등액을 \( 532 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Tyrosinase 활성 측정</h2><p>Tyrosinase 활성은 Masamoto 등의 실험 방법을 약간 변형하여 측정하였다. In vitro mushroom tyrosinase 활성 저해 능력을 측정하기 위하여 \( 1.5 \mathrm{ml} \) plastic cuvette에 \( 2.5 \mathrm{mM} \) 3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) \( 0.3 \mathrm{ml} \), 시료 추출물 \( 0.05 \mathrm{ml} \) 및 \( 0.1 \mathrm{M} \) phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 6.8 \)) 을 혼합하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 먼저 반응시켰다. 여기에 \(1,380 \mathrm{units/ml} \) mushroom tyrosinase (\(2,500 \mathrm{unit}\), Sigma Chemical Co., St. Louis MO, USA) \( 0.05 \mathrm{ml} \) 를 넣은 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분간 반응시키면서 \(475 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 대조구는 시료가 들어있지 않는 시료 용해 용액을 사용하였고, 양성대조구는 tyrosinase 저해제로 알려진 \( 0.6 \mathrm{mM} \) kojic acid를 사용하였다. 이때 tyrosinase 활성 저해율(%)은 다음의 공식에 의하여 산출하였다.</p><p>\(\text{Tyrosinase 활성 저해율} (\%)=100-[(\mathrm{A}-\mathrm{B}) / \mathrm{A}] \times 100 \)</p><p>\(\mathrm{A}\)는 시료가 들어있지 않은 반응액의 0.5-1분 사이의 흡광도 차이</p><p>\(\mathrm{B}\)는 시료가 들어있는 반응액의 0.5-1분 사이의 흡광도 차이</p><h2>통계처리</h2><p>실험으로부터 얻어진 결과치는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차 (mean \(\pm\) SD)로 표시하였다.</p>
Thiocyanate에 의한 항산화 활성 측정단계에서 우선시로 수행한 방법은 뭐야?
Ohkawa의 방법