<h2>Raw 264.7 세포에 대한 금은화 추출 분획 및 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 의 세포독성</h2><p>조절된 Raw 264.7 세포를 96 well plate에 \( 100 \mu 1 \) 씩 분주하여 4 시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 가 공급되는 배양기에서 세포를 부착 시킨 후, 금은화 추출물 각 분획을 농도별로 \( 10 \mu 1 \) 씩 첨가하여 24 시간 동안 배양하여 세포 생존율을 아래의 MTT assay (Sigma, USA)방법으로 측정하였다. 또한 분주한 Raw 264.7세포에 \( 10 \sim 100 \mu \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 4 시간 처리하여 MTT as-say로 분석하여 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 에 의해 \( 50 \% \) 의 세포 사멸을 보이는 산화 스트레스의 조건 \( \left(\mathrm{IC}_{50}\right) \) 을 설정하였다.</p><h2>MTT assay</h2><p>Raw 264.7 세포에 대한 금은화 추출 각 분획 및 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 의 세포독성, 에틸 아세테이트 분획의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 로부터의 세포보호 효과를 MTT assay로 측정하였다. 시료 처리된 세포 각각의 well에 MTT 용액 \( (5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 을 \( 10 \mu 1 \) 씩 처리한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 시간 동안 배양하여 상등액을 제거하였다. 형성된 MTT for-mazan 결정체를 dimethyl sulfoxide (DMSO) \( 100 \mu 1 \) 에 용해시켜 ELISA reader (Molecular devices, USA)로 formazan의 흡광도가 최대가 되는 \( 540 \mathrm{~nm} \) 의 파장에서의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.</p><h2>Microarray analysis</h2><p>세포보호 효과가 확인된 금은화 추출 에틸 아세테이트 분획 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 및 양성 대조군으로 동량의 BHA가 각각 처리된 Raw 264.7 세포를 1 시간 배양한 후, \( \mathrm{IC}_{50} \) 농도의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 처리하여 4 시간 동안 배양하여 상등액을 제거하고 TRIzol® REAGENT (Invitrogen, USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. Total RNA 정량 및 정성분석은 RNA nano kit (2100 Bioanalyzer System, Agilent Techologies, USA)를 사용하였으며, migration 및 peak pattern, 28S/18S ribosomal RNA의 비율 등을 고려한 RIN(RNA Integrity Number) 값은 9.5 이상이었다. 각 total RNA로부터 target cRNA의 합성(amplifica-tion and labeling) 및 혼성화 반응(nucleic acid hybridization)은 Agilent's Low RNA Input Linear Amplification Kit PLUS (Agilen 분획에 의한 Technology)를 이용하여 수행하였다. \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 에 의한산화 스트레스(\( \left(\mathrm{IC}_{50}\right) \) 가 유도된 음성 대조군 시료는 cyanine 3, 실험군으로 금은화 추출 에틸 아세테이트 분획에 의한 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 로부터 세포보호 효과 또는 \( \mathrm{BHA} \) 의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 로부터 세포보호 효과 시료는 cyanine 5 로 각각 증폭 및 라벨시켰다. 증폭 및 라벨된 cRNA는 RNase Mini Spin Columns (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 정제하고, ND-1000 pectropho-tometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 이용하여 정량하였다. \( 750 \mathrm{ng} \) cRNA를 이용하여 hybrid-ization buffer를 만들고 Agilent Whole Mouse Genome Oligo Microarray (44K)에서 혼성화 반응을 실시하였다. Hybridiza-tion image는 Agilent DNA microarray Scanner를 이용하여 스캔하였으며, 데이터 quantification은 Agilent Feature Extraction software를 이용하였다. 모든 데이터의 normal-ization (LOWESS)과 fold-changed gene의 선택은 Gene-Spring GX 7.3 (Agilent Technology)으로 수행하였다. 각 실험군에서 flag-out gene들은 제거하였으며, normalized ratio는 signal channel intensity 중간값을 control channel intensity 중간값으로 나누어 산출하였다. Gene selection을 위한 func-tional annotation은 Gene Ontology \( { }^{\mathrm{TM}} \) Consortium (http://www.geneontology.org/index.shtml) DB 정보를 따랐으며, GeneCards (http://www.genecards.org/), DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/), 그리고 Medline databases (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 이용하여 기능연구를 위한 데이터 mining을 수행하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>실험결과는 SPSS program (ver. 12.0.01)을 이용하여 실험군당 평균±표준편차로 표시하였고 통계적 유의성 검정은 분산분석(ANOVA test)을 한 후 \( p< 0.05 \) 수준에서 Tukey's test를 이용하여 상호검정하였다.</p>
분주한 Raw 264.7세포에 \( 10 \sim 100 \mu \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 4 시간 첨가하고 나서 어떻게 조정했어?
산화 스트레스의 조건 \( \left(\mathrm{IC}_{50}\right) \)