<h1>재료 및 방법</h1><h2>유용효소 생산 균주의 분리</h2><p>본 실험에서는 유용효소를 생산하는 균주의 분리를 위하여 부산시 사하구 일대 가정하수의 일부를 채취하여 시료로 사용하였으며, 배양배지는 LBM, R2A, M9 배지를 사용하였다. 배지의 조성은 LBM 배지는 polypeptone \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), yeast extract \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \( \mathrm{NaCl} 5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)에 탄소원으로 glucose \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)을 첨가하였으며, R2A배지는 yeast extract \( 0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), proteose peptone \( 0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), casamino acids \( 0.5\mathrm{~g} / \mathrm{l} \), glucose \( 0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), soluble starch \( 0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), Na-pyruvate \( 0.3 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \(\mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\) \(0.3 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7_{2} \mathrm{O}\) \(0.05 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 이고, M9의 배지조성은 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \) \( 6 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\), \(\mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 3 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\), \(\mathrm{NH}_{2} \mathrm{Cl} \mathrm{~g} / \mathrm{l}\), \(\mathrm{NaCl}\) \(0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)와 같다. 각 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 180 \mathrm{rpm} \)으로 3회 반복하여 진탕 배양한 균주를 \( 1 \% \) tributyrin이 첨가된 LB 고체 배지에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하여 생육활성대(growth-clear zone)을 형성하는 것을 lipolytic 효소 활성 양성균으로 하였으며, HC ratio (clear zone의 크기/colony의 크기)가 높은 균을 선별하여 사용하였다.</p><h2>분리된 균주의 동정 및 유연관계 분석</h2><p>선별된 균주는 Bergey's manual의 Systematic bacteriology를 근거로 형태학적, 생리학적, 생화학적 특성을 파악 하였다. 또한 선별된 균주의 정확한 동정을 위하여 선별된 균주의 염색체 DNA를 다음과 같이 분리하였다. 전 배양한 균주를 LB배지에 \( 20 \mathrm{ml} \) 에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) shaking incubator에 12시간동안 진탕 배양하였다. 배양된 균주를 집균하여 \(1 \times\) TE butter (\( 50 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \( \mathrm{pH}8.0\))에 현탁하고, 현탁액을 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 동결시켰다. \( 25 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \( \mathrm{pH}8.0\)에 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 용해한 lysozyme 용액 \( 400 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 가끔 흔합해주면서 실온에서 용해한 후 얼음에 45분간 방치하였다. \( 800 \mu\mathrm{l} \) STEP buffer \( (0.5 \% \) SDS, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \( \mathrm{pH}8.0\), \( 400 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) proteinase)를 첨가해 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간동안 lysis하고 phenol-chloroform으로 정제하였고, 정제한 sample을 \( 99 \% \) 에탄올로 침전시켜 가느다란 유리봉으로 염색체 DNA를 감아 회수하였다. \( 70 \% \) 에탄을로 세정하여 건조한 후 멸균수에 용해 시켜 염색체 DNA를 분리하였다. 이렇게 분리된 DNA를 주형으로 하여 PCR반응을 수행하였으며, PCR에 사용된 primer는 E. coli 의 16S rDNA의 upstream 9-27bp와 downstream 1,542-1,525bp의 영역을 oligonucleotide로 작성하였다 (primer 1: 5'-GAGTTTGATCCTGGCTAG-3', primer 2 : 5 '-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'). PCR은 Thermal cycler (Takara thermal cycler)를 사용하여, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \(55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분의 조건으로 30회 수행하였다. 증폭된 단편은 pGEM T-easy vector (promega, USA)에 cloning하여 16S rDNA 유전자의 염기서열을 결정한 다음 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST를 통해 상동성을 비교하였다. 동정된 균주와 유사한 종들간의 유연관계를 알아보기 위해 16S rDNA를 기초로 하여, ClustalX program을 이용하여 phylogenetic analysis를 수행하였다.</p><h2>균주의 생육도 측정</h2><p>선별된 균주의 생육정도를 조사하기 위하여, 전 배양시킨 균주를 LB배지 \( 100 \mathrm{ml} \)에 접종하여 37, 50 및 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 180 rpm, 48시간동안 진탕 배양하였다. 배양시간에 따른 균체의 생육정도는 진탕 배양한 배양액을 3시간 간격으로 \( 1\mathrm{ml} \)를 취해서 UV-VIS spectrophotometer (Ultrospec 2100 pro, Amersham)를 사용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>고체배지에서의 lipolytic 효소의 활성</h2><p>각각의 기질을 첨가한 고체배지 상에서 선별된 균주의 lipolytic 기질에 대한 분해능을 확인하기 위하여 Emulsion LB (EL) agar medium과 Chromogenic EL (CE) agar medium을 사용하였다. 사용된 EL 고체배지의 조성은 다음과 같다. \( 45 \mathrm{ml} \) 의 \( 200 \mathrm{mM}\mathrm{NaCl}\), \(10 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl}_{2},5 \% \) gum arabic solution에 기질로써 \( 1 \% \) tributyrin 또는 \( 1 \% \) olive oil을 첨가하여 waring blender (Heidolph DIAX900, Germany)로 2분간 균질화한 Emulsion \( 50 \mathrm{ml} \)에 LB 고체배지 \( 450 \mathrm{ml} \) 를 혼합하여 EL 고체배지를 준비하였다. CE 고체배지는 \( 1 \% \) olive oil을 기질로 첨가한 EL 배지에 \( 1 \% \) phenol red를 첨가하여 사용하였다. 선별된 균주를 tributyrin을 기질로 한 EL고체배지와 olive oil을 기질로 한 CE 고체배지에 획선을 그어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 72시간동안 배양하여 생육활성대의 형성을 확인하 였다. 또한 선별된 균주를 \( 1 \% \) Tween 20이 첨가된 LB 고체배지(Tween 20-LB 고체배지)에 획선을 그어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 정치 배양하여 생육활성대의 생성여부를 관찰하였다.</p><h2>액체배지에서의 lipolytic 효소의 활성 측정</h2><p>Lipolytic 효소의 양적인 활성 측정은 기질로서 p-NP butyrate를 사용하여 Sigurgisladottir등의 방법을 약간 변형 하여 수행하였다. Acinetobacter sp. BD5를 LB 액체 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), 12시간동안 배양한 후 배양상등액을 조효소로 사용하였다. 배양 시간별 효소 활성은 6시간 간격으로 배양상등액을 일정량(\(1 \mathrm{ml} \)) 취하여 수행하였다. 효소활성의 최적온도는 배양상등액 \( 250 \mu \mathrm{l} \)에 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer\( (\mathrm{pH}7.1) \) \(650 \mu \mathrm{l} \)와 \( 25 \mathrm{mM}\) p-NP butyrate \( 100 \mu \mathrm{l}\) 를 기질로 사용하여 37, 50, 60, 70 및 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후 \(100 \mathrm{mM} \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3}\) \(250 \mu \mathrm{l}\)를 첨가하여 반응을 중지시키고, UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 \( 420 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 효소 활성의 1 unit은 분당 \( 1 \mu \mathrm{mol}\) p-nitrophenol을 형성하는데 필요한 효소의 양으로 정의하고, 활성은 최대일 때를 \( 100 \% \)로 하여 상대적인 활성으로 나타내었다. 효소 활성의 최적 \(\mathrm{pH}\)는 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium acetate \( (\mathrm{pH} 4.0-6.0) \), potassium phosphate\( (\mathrm{pH} 7.0-8.1) \), Tris-\(\mathrm{HCl}\) (\( (\mathrm{pH} 9.0-9.8) \)과 glycine-\(\mathrm{NaOH}\)\( (\mathrm{pH} 10.6) \)를 사용하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 측정하였다.</p>
부산시 사하구 일대 가정하수는 본 실험에서 시료로 사용될 수 있어?
YES