<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료 및 시약</h2><p>청국장 제조에 사용된 대두는 2011년 국내에서 수확된 국산 대두를 구입하여 사용하였으며, 청국장 발효 균주를 분리하기 위해 가정, 대중음식점 그리고 기존 제품으로 판매되고 있는 청국장 등을 시료로 수집하여 사용하였다. 미생물 배양용 배지로는 luria-bertani media (LB)를 사용하였으며 균주의 단백질 분해능을 조사하기 위한 배지로는 \( 1 \% \) skim milk를 포함하는 표준한천배지를 사용하였고 구성시약은 Difco Lab. (Detroit, MI, USA)사의 제품을 사용하였다. GABA함량 측정에 필요한 시약들은 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA), Junsei Co. (Tokyo, Japan), 그리고 Yakuri Co. (Kyoto, Japan)의 제품을 구입하여 사용하였다.</p><h2>청국장 발효균주의 분리</h2><p>수집된 각 시료 \( 5 \mathrm{~g} \)을 시험관에 넣고, 멸균된 증류수 \( 10 \mathrm{~ml} \)를 가한 후 교반하여 충분히 혼합한 뒤 30분간 방치하였다. 방치된 시료의 상등액에 멸균된 증류수를 가하여 \( 10^{-6} \sim 10^{-7} \)까지 단계별로 희석하고 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \)의 항온수조에서 15분간 방치하여 열에 약한 미생물들을 1차 제거하였다. 각 시료 \( 0.1 \mathrm{~ml} \)를 skim milk배지(\(10\% \) skim milk, \( 1 \% \) tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \mathrm{~NaCl} \), \( 2 \% \) agar, \( \mathrm{pH} 7.5) \)에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2일 동안 배양하였다. 배양결과 skim milk배지 상에서 clear zone의 크기가 크고 선명하며, 성장속도가 빠른 colony만을 선별하여 청국장 발효실험에 사용하였다.</p><h2>선별균주를 이용한 청국장 제조</h2><p>청국장은 대두 \( 15 \mathrm{~g} \)을 24시간 동안 초순수에 침지하여 충분히 불린 후 체로 걸러 물기를 제거한 뒤 발효용기에 넣고 호일로 감싸 autoclave로 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에 50분간 증자하였다. 증자된 대두는 clean bench 안에서 \( 45 \sim 50^{\circ} \mathrm{C} \)로 냉각한 후 LB broth에서 24시간 동안 종배양하고 6시간 동안 주 배양한 1차 선별균주를 \( 2 \% \) 접종하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 72시간 동안 발효시켜 제조하였다. 균주들 가운데 청국장고유의 점질물을 형성하지 못하는 균주들을 실험 대상에서 제외하고, 점질물의 생성량이 많은 균주들을 후보균주들로 분리하여, 청국장 발효능과 각종활성을 측정하였다.</p><h2>Protease activity 및 점질물 생성능 측정</h2><p>Protease활성을 측정하기 위해서 LB broth에 배양한 1차 선별균주를 \( 15,000 \mathrm{~rpm} \)으로 \( 15 \mathrm{~min} \)동안 원심 분리한 뒤 상등액을 micro filter로 여과◦제균 하여 조효소액으로 사용하였다. 멸균된 paper disc를 \( 1 \% \) skim milk plate 위에 올려놓고, 조효소액 \( 0.02 \mathrm{~ml} \)을 적점한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 72시간 동안 반응시켜 생성된 clear zone을 측정하여 protease활성을 비교하였다.</p><p>점질물 생성능을 측정하기 위해 대두 \( 15 \mathrm{~g} \)을 24시간 동안 초순수에 침지하여 충분히 불린 후 체로 걸러 물기를 제거한 뒤 발효용기에 넣고 호일로 감싸 autoclave로 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에서 50분간 증자하였다. 증자된 대두는 clean bench안에서 \( 45\sim 50^{\circ} \mathrm{C} \)로 냉각한 후 LB broth에서 24시간 동안 종배양하고 6시간 동안 주 배양한 1차 선별균주를 \( 2 \% \) 접종하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 72시간 동안 발효시켜 청국장을 제조하였다. 완성된 청국장의 점질물이 늘어나는 길이와 굵기, 점질물의 양을 비교하여 점질물 생성능을 측정하였다.</p>
Difco Lab.은 어느 국가에 있는 회사인가?
USA