<h2>배지에 첨가되는 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)의 최적농도</h2><p>배지에 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 의 첨가유무는 접합전달효율에 큰 영향을 미치게 되며 \( 10 \mathrm{mM} \)의 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)가 일반적으로 배지에 첨가되어 왔다. 그러나 최근 K. setae의 연구결과에 따르면 ISP4배지에 \( 50 \mathrm{mM} \)의 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)가 첨가되었 때 무첨가와 \( 10 \mathrm{mM} \) 첨가의 경우에 비해 각각 3.8배와 3.3배 높은 접합전달효율을 보였다. 이러한 결과는 방선균의 종류에 따라 최적농도도 달라질 수 있다는 것을 의미한다. 그러므로 S. platensis에 대한 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)의 최적 첨가농도를 확인하기 위해 최적배지로 선정된 MS배지에 \( 0 \sim 60 \mathrm{mM} \)까지 다양한 농도의 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)를 첨가하여 접합전달을 진행하였다. 그 결과 Table 4 에서 보는 바와 같이 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)를 첨가 하지 않은 실험군에 비해 첨가농도가 증가할수록 접합전달효율이 높아지는 경향을 관찰할 수 있었다. \( 50 \mathrm{mM} \)의 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)를 첨가했을 때 \( 6.4 \times 10^{-6} \)로 가장 높은 접합전달효율을 보였는데 무첨가군에 비해 183배나 높았으며 \( 10 \mathrm{mM} \) 첨가에 비해서도 3.2배 높았다. 이러한 결과는 K. setae의 연구결과와 매우 유사한 것으로 S. platensis의 접합전달을 위해서는 MS배지에 \( 50 \mathrm{~mM} \)\( \mathrm{~MgCl}_{2} \)을 첨가하는 것이 최적 농도라는 것을 확인할 수 있었다.</p><p>지금까지의 연구를 통해 확인된 S. platensis를 위한 최적 접합전달 조건들은 접합전달용 배지로 \( 50 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2} \)가 첨가된 MS배지를 사용하고 열처리하지 않은 \( 1 \times 10^{8} \) 포자와 DNA공여체로써 \( 5 \times 10^{7}\) E. coli를 사용하는 것이다. 따라서 본 조건들을 모두 적용한 결과 \( 9.4 \times 10^{-4} \)이라는 높은 접합전달효율을 획득할 수 있었다. 이것은 Table 1과 같은 초기조건에 비해 400배 이상 향상된 결과로써 특히 부위-특이적 재조합보다 100배 이상 높은 형질전환효율을 요구하는 상동 재조합(homologous recombination)에도 충분히 사용 가능하다는 것을 확인하였다.</p><h2>attB site의 특징</h2><p>본 연구에 사용된 pSET152벡터는 phiC31 유래의 attP site를 포함하고 있어 접합전달에 의해 방선균 내로 도입된 벡터는 integrase에 의해 chromosome의 attB site로 삽입되어 안정하게 유지된다. 지금까지 연구된 결과에 의하면 attP site가 삽입되는 곳은 단일 attB site만이 아니라는 것이 밝혀졌다. 따라서 attP site가 삽입되는 S. platensis의 attB site에 대해 연구하였다. 먼저 본 연구를 통해 얻어진 4개의 접합전달체로부터 chromosome DNA를 각각 추출한 뒤 KpnI으로 절단하고 pSET152의 Apr 내성유전자를 probe로 사용하여 Southern blot hybridization을 수행하였다. 그 결과 4개의 접합전달체로부터 동일한 단일밴드를 확인할 수 있었다. 이것은 S.platensis의 chromosome내에 pSET152벡터가 삽입되는 곳이 한곳만 존재한다는 것을 시사하는 것이다. 또 attB site의 chromosome내의 위치와 염기서열을 확인하기 위해 pSET152가 삽입된 4개의 접합전달체로부터 chromosome DNA를 각각 추출하여 KpnI으로 처리한 뒤 agarose 전기영동을 통해 Southern blot에 확인된 단일밴드부근의 DNA단편을 회수하였다. 얻어진 DNA는 self-ligation을 거쳐 E. coli XL10-Gold로 형질전환되었고, Apr \( (50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)가 첨가된 배지를 사용하여 형질전환체를 선별하여 attB site의 일부가 포함된 chromosome단편을 클로닝하였다. 얻어진 chromosome 단편의 염기 서열은 ATTPR primer를 이용하여 분석하였다. 그 결과 4개의 접합전달체로부터 얻어진 attB site의 right-region은 모두 동일한 염기서열을 보였으며 accession number AB531501로 GeneBank에 등록되었다. 또 이미 밝혀진 다른 방선균 유래 attB site의 right-region 염기서열에 대해 \( 77.8 \% \sim 96.3 \% \)의 상동성을 보였으며 attB site의 chromosome내 위치는 S. platensis chromosome의 pirin 상동체를 코드하는 ORF내에 위치해 있었다. 그러나 attB site의 left-region에 대한 염기 서열은 확인할 수 없었는데 이러한 현상은 다른 연구에서도 보고된 봐 있다. attB site의 계통학적인 분석에서는 S. longisporoflavus의 attB site와 가장 가까웠으며 S.aureofaciens와 가장 멀었다. 또한 S. platensis chromosome의 attB site에 pSET152벡터만의 삽입으로 S. platensis의 표현형이 변화되는지를 확인하기위해 접합전달체와 야생주에 대하여 TGase 생산량과 형태분화를 확인해 보았으나 어떤 변화도 관찰할 수 없었다(자료 미제시). 그러므로 본 연구에서 사용된 접합전달시스템은 S. platensis YK-2의 분자생물학적인 연구를 위해 대단히 안정적이고 효율적인 형질전환방법이라는 것이 확인되었다.</p>
접합전달효율에 큰 영향을 미치는 것은 무엇의 첨가유무인가?
\( \mathrm{MgCl}_{2} \)