<h2>재조합 DNase I 처리에 따른 기질 DNA 분해 특성</h2><p>재조합 DNase I의 기질 DNA 분해 특성 조사 이전에 본 연구에서 사용한 host cell (S. cerevisiae 2805와 P. pastoris GS115) 배양 상등액을 기질 DNA (calf thymus DNA, Sigma)에 처리하여 분해되는지를 알아보았다. 실험결과, 효모 S. cerevisiae 2805 배양상등액은 분해하지 않는 반면 P. pastoris GS115 배양상등액은 반응 20 분부터 분해하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 Pichia는 자체 DNase가 세포 외로 어느 정도 생산되고 있음을 알 수 있었다.</p><p>기질 DNA의 분해 패턴을 알아보기 위하여 DNase I [bovine pancreatic DNase I (SIGMA), S. cerevisiae 재조합 DNase I, P. pastoris 재조합 DNase I]의 처리 양에 따라 분해 패턴의 차이를 알아보았다. 먼저 DNase I을 0.5 unit 되게 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 기질 DNA에 처리하여 분해 패턴을 알아보았다. 그 결과 상업용 bp-DNase I은 반응 20분부터 분해되기 시작하였으나 S. cerevisiae 재조합 DNase I로는 기질 DNA가 분해되지 않았는데 이는 기질 DNA가 분해되기 위해서는 반응시간을 늘리거나 처리하는 재조합 DNase I의 양(unit)를 늘려야 함을 알 수 있었다. P. pastoris 재조합 DNase I을 처리하였을 때는 상업용 DNase I을 처리하였을 때보다 더욱 빠른 분해 패턴을 보였다.</p><p>재조합 DNase I 1 unit를 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 기질 DNA에 처리하여 분해 패턴을 조사한 결과, 0.5 unit로 처리하였을 때보다 빨리 분해되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 S. cerevisiae 재조합 DNase I을 처리하였을 때는 반응 10분부터 분해가 되는 것을 확인하였으며, P. pastoris 재조합 DNase I을 처리하였을 때는 상업용 bp-DNase I과 S. cerevisiae 재조합 DNase I을 처리하였을 때 보다 빠른 분해 패턴을 확인하였다.</p><p>재조합 DNase I 10 unit를 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 기질 DNA에 처리하여 분해 패턴을 조사한 결과, 상업용 DNase I은 3분, S. cerevisiae 재조합 DNase I은 20분, P. pastoris 재조합 DNase I은 1분 이내에 기질 DNA를 완전히 분해하였다. S. cerevisiae 재조합 DNase I을 처리한 경우 상업용 bp-DNase I 보다 효율이 다소 떨어졌는데, 본 연구에 사용한 소 췌장 DNase I의 경우 1개의 N-linked 당쇄부가 부위인 208번째 아스파라긴에 당쇄부가가 되어 분해 패턴이 약간 느린 것으로 사료된다. 반면 P. pastoris 재조합 DNase I으로 처리하였을 때 1 분 이내에 DNA가 분해됨으로써 상업용 bp-DNase I와 S. cerevisiae 재조합 DNase I으로 처리하였을 때 보다 훨씬 뛰어난 DNA 분해능을 가졌음을 확인할 수 있었다.</p><p>재조합 세포를 이용하여 단백질 발현시 숙주균의 생리적 특성에 따라 발현 단백질의 glycosylation 여부나 온도, \( \mathrm{pH} \)등의 최적 활성 조건의 차이에 의해 동일한 단백질도 specific activity가 다른 사례가 보고되었다. 최근 연구결과에 따르면 Alkalimonas amylolytica 유래 \( \alpha \)-amylase를 생산하기 위하여 재조합 숙주균으로 E. coli와 P. pastoris를 사용하여 이들이 생산한 \( \alpha \)-amylase의 특성을 분석한 바 있다. E. coli와 P. pastoris에서 발현된 \( \alpha \)-amylase의 specific activity는 \( \mathrm{pH} 9.5 \) 와 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 각각 \( 16.0 \mathrm{unit}/ \mathrm{mg} \) 과 \( 16.6 \mathrm{unit} / \mathrm{mg} \) 을 나타내었으며, 효소의 최적 \( \mathrm{pH} \) 와 \( \mathrm{pH} \) 안정성은 유사하였다. 반면 발현된 효소의 specific activity는 최적 온도와 열 안정성에서 차이가 나타났다. E. coli와 P. pastoris에서 발현된 \( \alpha \)-amylase의 최적 온도 및 specific activity는 각각 \( 50^{\circ} \mathrm{C}\), \(16.4 \mathrm{unit} / \mathrm{mg} \) 과 \( 55^{\circ} \mathrm{C}\), \(18.8 \mathrm{unit} / \mathrm{mg} \) 로 나타났으며, P. pastoris에서 발현된 효소의 specific activity는 최적 온도와 열 안정성에서 차이가 나타났다. E. coli와 P. pastoris 에서 발현된 \( \alpha \)-amylase의 최적 온도 및 specific activity는 각각 \( 50^{\circ} \mathrm{C}\), \(16.4 \mathrm{unit} / \mathrm{mg} \) 과 \( 55^{\circ} \mathrm{C}\), \(18.8 \mathrm{unit} / \mathrm{mg} \) 로 나타났으며, P. pastoris에서 발현된 효소의 specific activity가 다소 높았다. 또한 재조합 숙주균으로 P. pastoris GS115를 사용하여 발현시킨 Colletotrichum lindemuthianum 유래 chitin deacetylase (CDA)의 경우 동일한 숙주 유래 효소의 specific activity가 차이를 보였으며, 이는 온도나 \( \mathrm{pH} \) 등의 조건에 기인함을 확인하였다. 따라서 재조합 숙주균의 종류에 따라 발현되는 단백질의 specific activity의 최적 활성 조건이 다를 수 있음을 알 수 있다.</p><h2>Loop DNA의 제작 및 분해 패턴</h2><p>다양한 DNA 기질의 분해 패턴을 알아보기 위하여 PCR을 통하여 \( 266 \mathrm{bp} \)의 loop DNA를 제작하였다. 이렇게 제작된 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 loop DNA 기질에 재조합 DNase I을 처리하여 반응한 후, polyacrylamide DNA 전기영동으로 분해 패턴을 분석하였다. 분석 결과, loop DNA 역시 분해되는 것을 확인 하였으며 이는 DNase I으로 DNA를 분해할 때 linear DNA 뿐만 아니라 loop 형태로 되어있는 DNA도 분해할 수 있기 때문에 RNA 취급 실험시 재조합 DNase I 처리가 유용함을 알 수 있다.</p><p>DNase I을 생산하기 위해 대장균과 동물세포주 COS-1을 사용한 사례가 있는데 재조합 대장균을 이용할 때에는 발현된 DNase I이 세포 내에 존재하기 때문에 정제가 어려워 정제된 효소의 비활성이 \( 1,000 \mathrm{unit} / \mathrm{mg} \) protein 이하로 낮은 문제점이 있으며, 또한 대장균에서는 glycosylation이 되지 않아 효소의 기능이 천연의 효소와 차이가 나는 것으로 보고되었다. 또한 동물세포주인 COS-1은 glycosylation은 되지만 효소의 생산성이 낮았다. 이에 본 연구에서는 glycosylation이 될 수 있을 뿐만 아니라 세포 밖으로 분비, 생산할 수 있는 S. cerevisiae와 P. pastoris와 같은 재조합 효모균을 제조하고 배양 상등액에 존재하는 DNase I을 과발현하였다.</p>
DNase I을 0.5 unit 되게 얼마의 기질 DNA에 처리하여 분해 패턴을 알아봤어?
\( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)