<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Protease 생산 균주의 분리 및 동정</h2> <p>여과와 침전을 통해 불순물을 제거한 해수를 멸균 증류수로 \(10 \) 배씩 희석하여 \( 0.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) skim milk가 함유된 LB agar plate에서 \(3 \) 일간 배양한 후, 형성되는 미생물의 집락을 관찰하였다. 다양한 종류의 세균과 곰팡이들이 관찰되었으며, 이 중 skim milk에 대해 가장 강한 분해활성을 나타내는 균주를 분리하였다. 분리된 균주는 밝은 노란색이며, 표면이 매끈하고 볼록한 형태의 집락을 보였다. 정확한 균주의 동정을 위해 \( 16 \)SrDNA 염기서열 \( (1.5 \mathrm{~kb}) \) 을 분석하고 이를 NCBI의 BLAST database에 등록된 다른 균주들의 염기서열과 비교한 결과, Micrococcus luteus OS 139와 \( 0.1 \% \)의 상동성을 보였다. 따라서 분리된 균주를 Microoccus sp. PS-\( 1 \)이라고 명경하 였다.</p> <h2>Mcrococcus sp. PS-\( 1 \)의 최적 배양 및 효소의 생산</h2> <p>Micarococas sp. PS-1는 해수에서 분리하였기 때문에 \( \mathrm{NaCl} \)의 균주 성장과 protease효소 생산 영향을 먼저 조사하였다. \( \mathrm{NaCl} \) 이 성장에 미치는 영향은 \( 12 \) 시간까지는 \( \mathrm{NaCl} \) 의 첨가 유무에 상관없이 비슷한 균주의 성장을 보였고, \( 1 \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{NaCl} \) 첨가 시 가장 높은 균주의 성장을 보였다. \( \mathrm{NaCl} \) 첨가에 따른 효소 생산은 성장의 결과와 유사하게 \( 1 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \)에서 가장 많은 효소를 생산하였고 \(3\) 과 \( 7 \mathrm{M} \mathrm{ NaCl} \)의 첨가 시 효소의 생산이 저해되는 것을 확인하였다. 따라서 protease생산 균주인 Micrococcus sp. PS-\(1 \)은 균주의 성장과 관련하여 염의 농도에 대헤서는 tolerance를 나타내는 것으로 추정되었다.</p> <table border><caption>Table \( 1 \). Effect of nitrogen sources on the protease production of Micrococcus sp. PS-\( 1 \)</caption> <tbody><tr><td>Nitrogen sources</td><td>Protease production (unit/ \( \mathrm{ml} \))</td></tr><tr><td>Control</td><td>\( 0.6 \pm 0.2 \)</td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>\( 0.8 \pm 0.1 \)</td></tr><tr><td>Ammonium sulfate</td><td>\( 0.7 \pm 0.0 \)</td></tr><tr><td>Casamino acid</td><td>\( 4.0 \pm 0.1 \)</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>\( 423.8 \pm 0.2 \)</td></tr><tr><td>Malt extract</td><td>\( 12.4 \pm 0.1 \)</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>\( 1.8 \pm 0.1 \)</td></tr><tr><td>Skim milk</td><td>\( 632.5 \pm 0.2 \)</td></tr><tr><td>Soytone</td><td>\( 21.8 \pm 0.2 \)</td></tr><tr><td>Soy bean meal</td><td>\( 26.4 \pm 0.1 \)</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>\( 15.6 \pm 0.1 \)</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>\( 4.3 \pm 0.1 \)</td></tr></tbody></table> <p>효소 생산을 촉진하기 위해 LB broth에 \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 유기/무기 질소원을 첨가하여 Micrococcus sp.의 성장과 효소생산을 확인한 결과, gelatin과 skim milk를 첨가한 배지에서 protease 생산이 유도되는 것이 확인되었다. 또한 효소 생산에 가장 적합한 배양시간을 확인한 결과, 배양 후 \(12\) 시간까지는 효소의 생산이 없다가 \( 18 \) 시간 이후 급격히 증가하였으며, 효소의 최대 생산은 배양 후 \( 72 \) 시간까지 유지되었다. 배양 중 배지의 색은 맑고 연한 노란색에서 점점 연한 분홍색으로 변하였고 특유의 냄새도 관찰되었다.</p> <p>초기 배양 \( \mathrm{pH} \) 에 따른 균주의 성장과 protease 생산을 알아보기 위해 배양액의 \( \mathrm{pH} \)를 \( 4.0 \) ~ \( 11.0 \)까지 맞춘 후 \( 12\) 시간 간격으로 조사한 결과, 산성 \( (\mathrm{pH}\) \( 4.0 \) ~ \( 5.0 )\)의 조건에서는 균주의 성장이 관찰되지 않았으나, 균주의 최대성장은 \( \mathrm{pH} 7.0 \) 에서 나타났으며, pH \( 10.0 \) 이상에서는 균주의 성장이 급격히 감소하였다. 한편 초기 배양액의 \( \mathrm{pH} \) 에 따른 효소의 생산은 배양액의 \( \mathrm{pH} \) 가 균주의 성장에 미치는 영향과 비슷한 경향을 보였다. 즉, \( \mathrm{pH}\) \( 6.0 \) 에서 \( \mathrm{pH}\) \( 9.0 \) 사이에서 최대의 효소 활성을 보였으나 \(\mathrm{pH}\) \( 4.0 \) ~ \( 5.0 \)와 pH 10.0 11.0에서는 효소의 생산이 감소하 였다. Protease 생산균주인 Micrococcus sp. PS-\( 1 \)은 염기성 조건에서 효소의 생산이나 균주의 성장이 우수하였다.</p> <p>따라서 분리균주 Micrococcus sp. PS-1은 LB배지에 \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) skim milk와 \( 1\%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) \( \mathrm{NaCl} \) 을 첨가하고 \( \mathrm{pH} \) \(7 \)의 조건에서 균주의 성장이나 protease의 생산이 가장 높은 것으로 나타나 이후의 실험에서는 이를 protease를 생산하기 위한 최적배지로 사용하였다.</p> <table border><caption>Table 2. Summary of purification step for the protease of Micrococus sp. PS-1</caption> <tbody><tr><td>Purification step</td><td>Total enzyme activity (unit)</td><td>Total protein (\(\mathrm{mg}\))</td><td>Specific activity</td><td>Purification fold</td><td>Yield</td></tr><tr><td>Crude enzyme</td><td>\(555,960\)</td><td>\(860.0\)</td><td>\(646.46\)</td><td>\(1.00\)</td><td>\(100.00\)</td></tr><tr><td>Ultra filtration</td><td>\(520,606\)</td><td>\(440.0\)</td><td>\(1183.20\)</td><td>\(1.83\)</td><td>\(93.64\)</td></tr><tr><td>Acetone precipitation</td><td>\(309,596\)</td><td>\(85.9\)</td><td>\(3604.14\)</td><td>\(5.58\)</td><td>\(55.69\)</td></tr><tr><td>Dialysis</td><td>\(301,616\)</td><td>\(28.4\)</td><td>\(10620.29\)</td><td>\(16.43\)</td><td>\(54.25\)</td></tr></tbody></table> <h2>효소의 부분정제</h2> <p>최적생산배지 \(11\)에 Micrococcus sp. PS-\(1 \)을 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \(48 \)시간 동안 배양하여 조효소핵 얻고, 이를 ultrafiltration한 결과, \( 10 \mathrm{kDa} \) 이하의 분획에서 protease 활성을 나타냈다. \( 10 \mathrm{kDa} \) 이하의 분획을 대상으로 acetone을 사용하여 \( 40 \) ~ \(60 \% \) \((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)까지 포화시켜 침전한 결과, total protein은 \( 85.9 \mathrm{mg} \) 으로 줄었고, specific activity는 \( 3604.14 \mathrm{unit} / \mathrm{mg} \) 으로 나타났다. 이후 dialysis tube MWCO \(15 \mathrm{kDa}) \) 를 이용하여 acetone 침전물을 dialysis한 결과, total protein 양은 \( 28.4 \mathrm{mg} \) 이었고 specific activity는 \( 10620.29 \mathrm{unit} / \mathrm{mg} \) 으로 높아졌다. 최종으로 부분 정제된 protcase의 수율은 \( 54.25 \% \) 이고, 정제도는 \( 16.43 \) 배로 증가하였다.\( 12 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) native polyacrylamide gel에 부분 정제된 효소액을 \( 5 \mathrm{X} \) zymography sample buffer에 섞어 loading하여 전기영동한 후 TRANS-BLOT 법을 사용하여 zymography한 결과, \( 35.0 \mathrm{kDa} \) 과 \( 37.5 \mathrm{kDa} \) 크기의 band에서 clear zone이 관찰되었으나, 효소액과 buffer를 \( 100^{\circ}C \) 에서 \( 10 \) 분간 끓인 후, \( 12 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) denature gel로 전기영동했을 때 protease 활성은 소실되었다(data not shown). 이는 2-mercaptoethanol이 protease의 disulfide bond를 분해하여 효소가 불활성화되어 효소활성이 사라진 것으로 추측된다.</p>
본문의 Table \( 1 \). Effect of nitrogen sources on the protease production of Micrococcus sp. PS-\( 1 \)에서 질소원이 Ammonium chloride일 때 Protease production은 얼마야?
\( 0.8 \pm 0.1 \)