<h1>결 과</h1><h2>Zebrafish에서 hHtrA2를 발현시키기 위한 plasmid 제작과 이용</h2><p>hHtrA2의 생리적 기능을 연구하기 위해서는 적절한 동물모델에서 hHtrA2를 발현할 수 있는 시스템의 정립이 필요하다. 이를 위하여 척추동물인 zebrafish를 동물모델로 선택하였고, 이 zebrafish에서 특정 유전자를 발현하기 위해 가장 널리 사용되고 있는 pCS2+ plasmid에 134에서 458 amino acid residue로 이루어진 mature HtrA2를 encoding하는 hHtrA2 cDNA를 cloning하였다. Zebrafish에서 hHtrA2의 발현양상을 용이하게 분석하기위하여 hHtrA2의 C-terminus에 GFP를 fusion시켰다. Zebrafish에서 hHtrA2의 생리적 기능을 비교 분석하기 위한 일환으로 serine protease activity를 갖고 있는 wild type hHtrA2 뿐만 아니라, 306 amino acid residue의 serine을 alanine으로 바꾸어 serine protease activity를 상실한 mutant hHtrA2를 발현하는 construct들을 제작하였다. 이 plasmid들은 zebrafish embryo에 microinjection하여 embryo의 발생단계에서 hHtrA2의 발현 양상을 연구하는 데 사용하였다. 또한, in vitro에서 합성한 mRNA를 zebrafish embryo에 microinjection하여 특정 유전자의 발현양상을 연구할 수 있다. 이를 위해 pWG-GFP plasmid를 Nsi I site restriction enzyme으로 절단, linearlize하여 zebrafish embryo에 microinjection할 hHtrA2 mRNA를 합성하기 위한 template로 이용하였다.</p><h2>Mammalian cell에서 hHtrA2의 발현양상 비교 분석</h2><p>Zebrafish embryo에 microinjection하여 발현 시스템을 정립하기 전에 HEK293 cell에 pWT-GFP나 pS306A-GFP plasmid를 transfection하여 hHtrA2의 발현양상을 immunobloting 방법으로 확인하였다. ExPASy Molecular Biology Server Program (http://us.expasy.org/tools/pi_html)을 이용하여 단백질의 분자량을 이론적으로 계산하면 mature hHtrA2은 \( 34.98 \mathrm{~kDa} \)이고 GFP는 \( 26.94 \mathrm{~kDa} \)이므로 hHtrA2-GFP fusion 단백질의 분자량은 \( 61.92 \mathrm{~kDa} \)이다. SDS-polyacrylamide gel 상에서 약 \( 64 \mathrm{~kDa} \) 의 hHtrA2-GFP fusion 단백질을 관찰할 수 있는데, 이는 이론적인 분자량의 수치와 거의 유사하다.</p><p>Immunofluorescent staining assay를 이용하여 cell 내에서 WT-GFP나 S306A-GFP fusion 단백질이 발현되는 양상과 cellular localization을 확인하였다. NLS sequence를 포함하는 pRFP-NLS plasmid를 hHtrA2 발현 vector와 co-transfection한 후 cell의 nucleus는 RFP의 발현으로 관찰하고, GFP fusion 단백질과 RFP의 merge 유무로 WT-GFP나 S306A-GFP가 nucleus에 존재하는 지 여부를 확인하였다. WT-GFP와 S306A-GFP 각각이 RFP와 merge가 되지 않는다는 것은 GFP-fusion 단백질이 nucleus에 존재하지 않는다는 것을 말해준다. Mitochondria에 주로 존재하는 full-length HtrA2와 는 달리 N-terminus에 존재하는 MTS를 제거한 WT-GFP와 S306A-GFP의 경우는 주로 cytosol에서 발현되는 것을 관찰할 수 있는데, 이는 기존의 연구 결과와 일치한다.</p>
hHtrA2를 발현할 수 있는 시스템의 정립이 적절한 동물모델에서 요구되는건 무엇을 연구하기 위해서인가?
hHtrA2의 생리적 기능