<h2>추출물 제조</h2><p>각각의 콩잎 분말 \( 1 \mathrm{~g} \)에 \( 80 \% \) 주정을 \( 30 \mathrm{~mL} \) 가하여 상온에서 \(12\)-\(16\)시간 추출하여 원심분리 후 상층액을 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \)-membrane filter로 여과하여 추출물을 제조하였다. 이 추출물은 이소플라본, 총 phenolics, 총 flavonoids 및 라디칼 소거활성 측정 시료로 사용하였다.</p><h2>이소플라본</h2><p>이소플라본 분석은 Lee 등의 연구방법에 준하여 HPLC로 분석하였다. 분석에 사용된 컬럼은 Lichrophore \(100\) RP C\(18\) (LichroCART \(125\)-\(4\), \( 5 \mu \mathrm{m} \), \(125 \mathrm{~mm} \times 4 \mathrm{~mm} \), Merck KGaA, Darmstadt, Germany)이며 이동상 용매는 \( 0.2 \% \) acetic acid 함유 HPLC 등급의 water (A용매)와 \( 0.2 \% \) acetic acid 함유 HPLC 등급의 acetonitrile (B용매)로 분석하였다. 각 이동상 용매의 조건은 A 용매 기준으로 \( 100 \% \) (\(0\)분), \( 90 \% \) (\(15\)분), \( 80 \% \) (\(25\)분), \( 75 \% \) (\(35\)분), \( 65\% \) (\(45\)분) 및 \( 65\% \) (\(50\)분)로 설정하였다. 시료 주입량은 \( 20 \mu \mathrm{L} \)로 설정하였고 이동상 속도는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 분당 \( 1 \mathrm{~mL} \)의 유속으로 diode array detector를 통과하여 \( 254 \mathrm{nm} \)에서 검출하였다.</p><h2>총 phenolics 및 총 flavonoids 분석</h2><p>총 phenolics 함량은 Folin Denis법으로 측정하였다. 추출물 \( 0.5 \mathrm{~mL} \)에 \( 25 \% \) \(\mathrm{Na_2CO_3}\) 용액 \( 0.5 \mathrm{~mL} \)를 가하여 \(3\)분간 정치시킨 뒤 여기에 folin-ciocalteu phenol 시약 \( 0.25 \mathrm{~mL} \)를 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(1\)시간 동안 반응시켜 \( 750 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 phenolics 함량은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.</p><p>총 flavonoids 함량은 Lee 등의 방법에 준하여 측정하였다. 추출물 \( 0.5 \mathrm{~mL} \)를 시험관 분주한 후 여기에 diethylene glycol \( 1 \mathrm{~mL} \)및 \( 1 \mathrm{~N}\)-\(\mathrm{NaOH}\) \(0.01 \mathrm{~mL} \)를 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온수조 에서 \(1\)시간 반응시켜 \( 420 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 flavonoids 함량은 rutin을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.</p><h2>항산화 활성</h2><p>DPPH 라디칼 소거활성은 Hwang 등의 방법에 준하여 측정하였다. \( 1.5 \times 10^{-4} \mathrm{M} \) DPPH용액 \( 0.8 \mathrm{~mL} \)에 추출액 \( 0.2 \mathrm{~mL} \)를 가한 후 암실에서 \(30\)분 반응시켜 \( 525 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조구는 시료 대신에 추출용매를 취하여 실험하였다. ABTS 라디칼 소거활성은 \( 7 \mathrm{mM} \) ABTS용액과 \( 2.45 \mathrm{mM} \) potassium persulphate를 \(1:1\)로 혼합하여 암실에서 \(12\)-\(16\)시간 방치시켜 ABTS 양이온을 형성시켰다. 양이온이 형성된 ABTS 용액과 메탄올을 희석시켜 \( 732 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 값이 \( 0.7 \pm 0.02 \)로 제조된 ABTS\( + \) 용액 \( 0.9 \mathrm{~mL} \)에 추출물 \( 0.1 \mathrm{~mL} \)을 가하여 \(3\)분후 \( 732 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조구는 시료 대신에 추출 용매를 취하여 실험하였다.</p><p>Hydroxyl 라디칼 소거활성은 시험관에 \( 10 \mathrm{mM} \) \(\mathrm{FeSO_4}\)-EDTA 용액 \( 0.2 \mathrm{~mL} \), \( 10 \mathrm{mM} \) \(2\)-deoxylribose \( 0.2 \mathrm{~mL} \), 추출물 \( 1.2 \mathrm{~mL} \)와 \( 10 \mathrm{mM} \) \(\mathrm{H_2O_2}\) \(0.4 \mathrm{~mL} \)를 순차적으로 첨가 하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(4\)시간 반응시켰다. 반응 후 여기에 HPLC water에 용해된 \( 1 \% \) TBA와 \( 2.8 \% \) TCA를 각각 \( 1 \mathrm{~mL} \)씩 가한 후 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 끓는 물에서 20분 간 발색 시키고 냉각 후 \( 525 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조구는 시료 대신에 PBS 취하여 실험하였다. 모든 항산화 활성은 실험구와 음성대조구의 흡광도 차이를 \( \% \)로 나타내었으며 아래와 같은 식에 의해 산출하였다.</p><p>항산화 활성 (\( \% \)) \(= (1-\)(실험구 흡광도 값\(/\)음성대조구 흡광도 값) \(\times 100 \)</p><h2>통계분석</h2><p>통계처리 실험 결과는 SPSS \(12.0\) package를 사용하여 분산 분석을 수행하였고 평균 \( \pm \) 표준편차로 나타내었다. 각 시료 분석 결과에 대한 유의성 검정은 분산 분석 후 \( p<0.05 \) 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였다</p>
총 phenolics 함량은 무슨방법으로 측정하였나요?
Folin Denis법