<h1>결과 및 고찰</h1><h2>PCR에 의한 혈전용해효소 유전자의 크로닝 및 염기서열 결정</h2><p>헐전용해 효소를 강력하게 생산하는 B. subtilis BB-1(KFCC 11344P)의 chromosomal DNA를 분리한 후 B. subtilis로부터 이미 보고된 공통적인 혈전용해효소 유전자들의 연결순서 영역으로 부터 forward와 backward의 primer를 각각 \( 25 \mathrm{mer} \)씩 합성하여 \( 1,145 \mathrm{bp} \)의 PCR 산물을 얻었다. 앞서 설명한 것과 같이 5'과 3' 양쪽에 인위적인 제한효소 ВаmH1과 EcoR1 자리를 이용하여 PCR 산물을 pBluescript II SK(-)에 subcloning한 후 재조합된 DNA를 agarose gel상에서 확인하였고 혈전용해효소 의 유도적인 대량발현을 위하여 Bacillus와 E. coli의 shuttle vector인 pEB vector에 크로닝하여 대량발현계를 구축하였고 Bacillus host인 B. sub-tilis 168 에 형질전환 결과 Fig. 4 과 같이 높은 혈전용해활성을 보였으며, 본 유전자를 BCF-1으로 명명하였다.</p><p>BCF-1의 염기서열 결정은 T7, T3 primer를 이용하여 양방향으로 염기서열을 확인하고 DNA assembly를 실시하여 최종 중복되는 연결순서에 의해 전체적인 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 NCBI상의 Genbank를 통해 search한 결과 nattokinase와 유전자가 \( 99 \% \) 이상 유사함을 확인하였다. Nattokinase는 Sumi 등이 이미 임상 실험에서 안전성 및 안정성을 보고한 바 있다. 이 효소를 natto에서 분리하여 실험을 이행하였고, 따라서 natto 자체를 상품화하여 판매되고 있지만 이 효소의 유전자를 크로닝하여 그 재조합 DNA를 대량 발현시키거나 혹은 의학적 이용은 전무한 실정으로 본 연구에서 이를 새롭게 크로닝하고 Bacillus에서 대량발현시키고자 하였다.</p><h2>재조합 균주 배양 및 분비발현</h2><p>Bacillus 유래 유전자 발현 host인 168 strain은 protease 활성이 비교적 적은 host로 여기에 앞의 재료 및 방법에서 구축된 pEB-BCF-1 을 형질전환시켰다. Fig. 7에서 보는 바와 같이 약 \( 30 \mathrm{kDa} \)의 protein이 배양상등액에 주 단백질로 생성됨을 확인 할 수 있었고 특히 배양 8시간 만에 대량으로 발현, 분비됨을 확인할 수가 있었다.</p><h2>혈전용해효소 순수분리</h2><p>재조합 균주에서 헐전용해효소는 배양상등액의 회수, \( 70 \% \) ammonium sulfate를 이용한 침전, 투석 그리고 FPLC gel filteration의 4단계에 의하여 분리 정제하였다. 모든 과정은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 실시하였으며, \( 12.5 \% \) acrylamide gel의 SDS-PAGE 상에 전기영동을 실시한 결과 약 \( 30 \mathrm{kDa} \)의 단일 band로 순수분리 됨을 Fig. 8에서 확인 할 수 있었다.</p><h2>항원-항체반응</h2><p>순수분리된 혈전용해효소를 토끼를 통하여 항체를 제작하였다. 이 항체를 이용하여 B. subtilis BB-1, 대량발현 vector에 크로닝된 B. subtilis 168 균과 순수분리된 단백질을 western blotting를 실시하였을 때 Fig. 9와 같이 약 \( 30 \mathrm{kDa} \)의 B. subtilis BB-1과 크로닝된 균 그리고 순수 분리된 단백질에서 동일한 band가 확인 되었다.</p><h2>혈전용해효소 생산 최적 \( \mathrm{pH} \) 및 온도</h2><p>순수분리된 혈전용해효소 생산의 최적 \( \mathrm{pH} \)와 온도를 검토한 결과 Fig. 10과 같이 \( \mathrm{pH} 7.0 \), 온도 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 가장 높은 활성을 나타내었다.</p><h2>혈전용해효소 기질특이성 조사</h2><p>Protease기질인 skim milk, casein, gelatin, blood agar를 이용하여 순수 분리된 혈전용해효소의 기질에 대한 특이성을 비교하였다. 동일한 양의 효소를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 동안 반응시킨 후 분해환을 측정한 결과, Fig. 11에서 보는 바와 같이 skim milk에서 아주 약한 분해능을 보였으나, casein, gelatin, blood agar plate에서는 전혀 분해능을 보이지 않았다. 특히 blood agar plate에서의 분해가 전혀 없는 것으로 볼 때, 혈관 내에서 부작용으로 발생할 수 있는 적혈구 파괴 현상은 일어나지 않을 것으로 판단된다.</p><h2>혈전분해 양상 조사</h2><p>크로닝된 혈전용해효소가 fibrin을 직접적으로 분해하는 형태인 fibrinolytic enzyme인지 아니면 plasminogen을 plasmin으로 활성화하여 fibrin을 분해하는 plasminogen ac-tivator type 인지를 조사한 결과 Fig. 12과 같이 plasmi-nogen이 있는 상태인 plasminogen-rich fibrin plate와 plas-minogen-free fibrin plate에서 동시에 분해되는 것으로 보아 직접적으로 fibrin을 분해하는 fibrinolytic enzyme인 것을 알 수 있으며, 특히 plasminogen이 있을 경우갸 없는 경우보다 fibrin의 분해능이 증가된 것을 관찰할 수 있는데 이것은 두 가지 type의 시너지 효과에 의한 것으로 생각된다.</p>
BCF-1의 전체적인 염기서열 확인을 위해 양방향으로 사용된 것은 뭐야?
T7, T3 primer