<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>본 연구에 사용된 참느릅나무 잎 \( 10 \mathrm{kg} \)을 합천생약가공 영농조합법인에서 수집한 시료를 구매하여 한국생명공학연구원 해외생물소재센터 백진협 박사(International Biological Material Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Daejeon, Korea)의 분류 동정을 거쳐 선별하였고 선정된 증거 표본은 한국생명공학연구원 해외생물소재센터 표본실에 보관하였다(KRIB 0085027).</p><h2>시약 및 기기</h2><p>Ethanol (EtOH) 용매(SK chemical, KR)는 추출물 제조를 위해 사용하였으며, 타겟 화합물 분석과 분리를 위해 high performance liquid chromatography (HPLC)용 methanol (MeOH, Honeywell, Moris Plains, NJ, USA)과 acetonitrile (ACN, Honeywell, Moris Plains, NJ, USA), tifluoroacetic acid (TFA, Tokyo Chemical Industries, Co., Ltd., Japan), formic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), leucine enkephalin (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하여 ultraperformance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTof-MS, Waters, Milford, MA, USA), photodiode array (PDA, Waters, Milford, MA, USA), HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), preparative-HPLC (PLC, Gilson, Middleton, WI, USA) 기기를 이용하여 진행하였다. 구조분석을 위해 Bruker AM400 \(({}^{1}H\) NMR \(400 \mathrm{MHz} \), \( { }^{13} \mathrm{C} \) NMR \( 100 \mathrm{MHz} \), Billerica, MA, USA)에 methanol-\( d_{4} \) (Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA, USA)를 사용하여 분석하였다.</p><h2>참느릅나무 잎 추출물 제조 및 분리</h2><p>동결건조(CleanVac \(8\) Hanil Science Medical, Daejeon, Korea)한 참느릅나무 잎 \( 100.0 \mathrm{g} \)을 다목적 분쇄기(DSMP-370, Korea)를 이용하여 잘게 분쇄하였다. 그 중 \( 100.0 \mathrm{mg} \) 잎 시료에 \( 30 \% \) ethanol\( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)을 가하여 25 와 50\({}^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1, 3, 5시간 3회 반복 추출(SDN-900H, SD Ultrasonic Cleaner, Seoul, Korea, \( 40 \mathrm{kHz} \), 주기당 15분 추출과 15분 대기로 3주기 반복)한 후 여과하여 얻어진 여액을 감압 농축하여 최적 추출 조건을 확인하였다. 지표성분 분리를 위해 \( 10 \mathrm{kg} \)을 (주)삼우다연 GMP 시설에 의뢰하여 원물 10배의 \( 30 \% \) 주정\( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)으로 \( 50{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3시간 2회 반복 추출한 후 \( 21.6^{\circ} \mathrm{Brix} \)로 농축 하였다. 얻어진 느릅나무 잎 추출물을 한국생명공학연구원 정읍 분원 생물공정지원팀에 동결건조(50L PVTFD 50 R, 일신)로 농축 하였다(약 \( 1.72 \mathrm{kg} \), 수율 \( 17.2 \%) \). 개방형 칼럼(\( 80 \times 15 \mathrm{cm})\) 분취 방법으로 확보된 느릅나무 잎 유효분획물 2번을 prep-HPLC (PLC, Gilson, Middleton, WI, USA)에 Atlantis T3 OBD \((5 \mathrm{mm}, 250 \times 19 \mathrm{mm})\) 칼럼을 사용하여 (A)는 \( 0.1 \% \) TFA (tifluoroacetic acid) 증류수로 (B)는 \( 0.1 \% \) TFA \( \mathrm{CH}_{3} \mathrm{CN} \)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 0.0-4.0 \({~min} ~5 \%(B)\), 4.0-23.0 \({~min} ~5-13 \%(B)\), 23.0-40.0 \({~min} ~13-17\%(B)\), 40.0-41.0 \({~min} ~17-90\% (B)\), 41.0-50.0 \({~min} ~90 \% (B)\), 50.0-51.0 \({~min} ~90-5\% (B)\) 조건으로 UP Fr. 2-3-3 (neochlorogenic acid, trans-5-O-caffeoylquinic acid), UP Fr. 2-3-5 chlorogenic acid (trans-3-O-caffeoylquinic acid)를 각각 30.7 및 108.0 \(\mathrm{mg} \) 분리하였다.</p>
참느릅나무 잎 추출물을 제조하기 위해 사용되는 용매는 뭐야?
Ethanol (EtOH) 용매