<h1>재료 및 방법</h1><h2>길항세균 분리</h2><p>논토양에서 벼의 근권 미생물을 분리하기 위하여 무균적으로 발아시킨 볍씨를 \( 0.6 \% \) agarose 배지 위에 치상하고, 벼 뿌리로부터 \( 1 \sim 2 \mathrm{~cm} \) 거리에 논토양 \( 0.5 \mathrm{~g} \) 을 놓고 28에서 48시간 항온처리한 후, 뿌리를 갈아서 현탁액으로 만든 다음 LC배지에 도말하여 균주를 분리하였다. 본 연구에 사용한 길항균 RRj 228균주는 농촌진흥청 공동연구팀으로부터 분양 받아 사용하였다.</p><h2>길항세균 동정</h2><p>분리한 길항세균을 동정하기 위하여 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology를 이용하여 생리, 생화학적인 특성을 조사하였고, 분자유전학적 분류법은 16S rDNA sequence 분석법으로 실시하였다. 추출한 rDNA는 PCR을 수행하여 증폭시켜서 pGEMT-T vector에 삽입한 후, 염기서열결정은 자동염기서열분석기(ABI 3100, Applied Biosystem, USA)를 사용하여 분석하였다. 결정된 염기서열은 NCBI의 등록 염기서열과 비교하여 분석하여 동정하였다.</p><h2>길항세균의 항균스펙트럼</h2><p>순수 분리한 세균 중에서 항균력이 뛰어난 Pseudomonas sp. RRj 228균을 재배작물 주요병원균인 Colletotrichum acutatum KACC40804 (고추탄저균), Phytopthola capsici (고추역병균), Botrytis cinerea (잿빛곰팡이균), Pythium ultimum (모잘록병원균) 및 Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum (토양병원균)에 대한 PDA plate 대치배양법으로 항균력을 조사하였다. Colletotrichum acutatum은 (주)청미바이오에서 분양을 받았으며, PDA plate는 \( 1 / 5 \) strength PDA로 각 병원균과 RRj 228균을 동시에 접종하여 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 ~ 6일 간 배양한 다음 생육저지대를 측정하여 항균활성스펙트럼으로 조사하였다.</p><h2>배양여액과 배양여액 추출물의 항균효과</h2><p>Pseudomonas RRj 228 을 NB배지에 접종하여 \( 26^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5일간 정취배양 한 다음, 배양액을 원심분리를 실시하여 배양여액을 얻고, 배양여액을 고체배지 제조에 0.5 배, 10 배, 100 배의 희석농도로 첨가하였다. 배양여액을 첨가한 배지에 고추탄저균 C. acutatum 모잘록병균 P. ultimum 토양병원균 R. solant를 접종하여, 균의 생육정도로 항균효과를 측정하였다. 배양여액추출물은 \( \mathrm{CHCl}_{3} \) 을 이용하여 배양여액을 추출하고, 회전농축기로 완전히 농축시킨 다음, DMSO에 녹여 배지에 \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 첨가하였다. 대조구에는 추출물용해에 사용한 DMSO \( 500 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 균의 생육 정도를 측정하였다.</p><p>\( \mathrm{ED}_{50} \) 값은 probit analysis software로 산출하였다. \( \mathrm{ED}_{50} \) 측정에 사용한 균주는 고추탄저균 C. acutatum 모잘록병균 P. ultimum 토양병원균 R. solani를 배양여액과 추출물을 첨가한 배지에 접종하여 생육정도를 측정하였다.</p><h2>항균물질의 분리정제</h2><p>고추탄저균에 대해 강력한 항균활성을 나타내는 물질을 분리하기 위하여 RRj 228 균을 NA배지에 접종한 후 \( 26^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 일간 배양한 후 NB배지에 접종하여 \( 26^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 일간 정치배양하였다. 배양액을 원심분리로 균체를 제거하고 \( \mathrm{pH} \) 를 7.0으로 조정한 다음 ethylacetate로 추출하여 물질분리에 이용하였다. 병원균 배양에 추출물을 처리하여 항균활성을 확인하였고, 항균물질을 분리하기 위하여 open column chromatography를 실시하였다. 시료를 \( 180 \mathrm{~g} \) 의 silica gel (Kiesel gel 60, 70-230 mesh: Merck, Germany) column에 가한 다음 n-hexane:ethylacetate (\(4:1\), \(3:2\), \(1:1\), \(2:3\), \(1:4\) \(\mathrm{v} / \mathrm{v} \)) 및 ethylacetate 등의 용매조건으로 용출시켜 89개의 fraction을 얻었으며, 물질의 분리 pattern을 확인하기 위하여 TLC를 실시한 다음 Rf값이 유사한 것을 6개 그룹으로 나누어 회수하였다. 항균활성을 나타내는 물질은 column 용매조건 n-hexane:ethylacetate (4:1)과 n-hexane:ethylacetate (3:2)에서 용출되어져 나왔다. 활성이 있는 그룹을 농축한 결과 \( 4.67 \mathrm{~g} \) 의 시료를 획득하였다. 1 차 column에서 얻은 항균활성물질을 2 차 column으로 \( 80 \mathrm{~g} \) 의 silica gel (Kiesel gel 60, 70-230 mesh: Merck, Germany)이 충진된 column에 가한 다음 \( \mathrm{n} \)-hexane:ethylacetate (\(1:0\), \(4:1\), \(8: 5\), \(8: 7\), \(8: 10\), \(8: 20\), \(8: 40\) \(\mathrm{v} / \mathrm{v} \)) 및 ethylacetate 등의 용매조건으로 용출시켜 150개의 fraction을 얻었으며, 물질의 분리 pattern을 확인하기 위하여 TLC를 실시하여 Rf값이 유사한 것을 9 개 그룹으로 나누어 회수하였다. 활성을 나타내는 6, 7번 그룹을 농축하여 \( 4 \mathrm{~g} \) 을 얻어 인접한 물질을 제거하기 위하여 TLC를 실시하였다. TLC는 chloroform:ethylacetate (\( 5: 1\), \(\mathrm{v} / \mathrm{v} \)) 조건으로 preparative TLC (\( 20 \times 10 \mathrm{~cm}\), \(0.25 \mathrm{~mm} \), Kiesel gel 60, F254, Merck)를 실시하였다. TLC를 통하여 \( 78.6 \mathrm{mg} \) 의 항균활성물질을 순수 분리하였다.</p><h2>항균물질 구조동정</h2><p>순수 분리한 항균물질의 구조분석을 위하여 질량분석은 double-focusing high-resolution (HR) mass spectrometer (JEOL JMS DX-303: JEOL Ltd, Tokyo, Japan)으로 electron impact (EI) mode, chemical ionization(CI) mode에서 분석하였고, fast atom bombardment (FAB) mass 방법으로 분자량을 측정하였다. 시료의 matrix로는 glycerol과 Xe를 혼합액으로 사용하였다. 핵자기공명 (\( { }^{1} \mathrm{H-NMR}\),\( ^{13} \mathrm{C-NMR}\), DEPT, \({ }^{1} \mathrm{H}-{ }^{1} \mathrm{H} \)COSY, HMQC, HMBC) 분석은 Bruker AMX-500 (\(500 \mathrm{MHz}\)) NMR spectrometer (Bruker Analytische Messtechnik Gmbh, Rheinstetten, Germany)로 측정하였다. 분리한 물질은 \( \mathrm{CD}_{3} \mathrm{OD} \) 에 녹여 측정하였으며, 내부표준 물질로는 tetramethyl silane (TMS)을 사용하였다.</p>
본 연구에 사용한 균주는 어떤 균주인가요?
길항균 RRj 228균주