<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주</h2><p>항균활성 측정을 위하여 구강병원균인 그람 양성세균 3 종 [Streptococcus mutans KCTC 3065 (brain heart infusion; BHI agar, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)), Streptococcus salivarius subsp. thermophilus KACC 11857 (corynebaterium agar, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)), Streptococcus sanguinis KACC 11301 (BHI agar, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \))], 그람 음성세균 1종 [Pophyromonas gingivalis KCTC 5352 (tryptic soy agar; TSA with hemin menadione solution, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \))], 진균 1종[Candida albicans KACC 30062 (yeast malt agar; YMA, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \))]을 농업유전자원정보센터(Korean Agricultural culture collection, KACC)와 한국생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 분양받아 사용하였다.</p><h2>추출물 조제 및 분획</h2><p>경남 고성 지역에서 2009년 9-10월에 채집한 사방오리나무 시료 \( 100 \mathrm{~g} \)에 \( 99.8 \% \) methanol (MeOH)을 첨가하여 실온에서 4시간 동안 진탕한 후 3회 반복 추출하였고 회전 감압농축기 (Ratavapor R-121, Buchi, Switzerland)로 농축하였다. 이렇게 얻어진 MeOH 추출물은 용매별로 분획하여 hexane (HX) 분획물, dichloromethane (DCM) 분획물 그리고 ethyl acetate (EA) 분획물을 얻었으며 이를 시료로 사용하였다.</p><h2>Gallic acid (GA) 분리</h2><p>항균활성이 뛰어난 EA 분획물을 recycling preparative high performance liquid chromatograph (prep HPLC; JAI, Japan)를 사용하여 활성물질을 분리하였다. 분석에는 멀티컬럼(GS-310 particle size \( 13 ~\mu \mathrm{m} \), JAI, Japan)을 사용하였고, 물질의 구조분석 및 동정에는 HPLC (CBM-20A, Shimadzu, Japan)와 gas chromatograph mass spectrometry (GC/MS; HP6890, Agilent, USA), NMR (Brucker advance 400, Switzerland)을 이용하였다. 분리한 물질은 \( 3 \mathrm{~mg/disc} \) 농도로 조제하여 구강병원균에 대한 항균활성을 측정하였다.</p><h2>구강병원균에 대한 항균활성 측정</h2><p>구강병원균 5종에 대한 항균효능은 paper disc 법으로 측정하였다. MeOH 추출물 및 각 분획물은 \( 15 \mathrm{~mg/disc} \) 농도로 측정하였으며, 양성대조군으로 사용한 tetracycline은 \( 120 ~\mu \mathrm{g/disc} \) 농도로 조제하여 사용하였다. 각 균주의 최적 배양조건에서 24시간 배양하여 clear zone (\( \mathrm{mm} \))의 직경으로부터 각 분획물의 항균활성을 측정하였다.</p><h2>구강병원균의 증식 억제효과 측정</h2><p>분획물 및 GA가 S. mutans와 S. salivarius의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여 각 균의 최적 배지에 \( 1.5 \mathrm{~mg/ml} \) 농도의 DCM과 EA 분획물, 1.5-, \( 3 \mathrm{~mg/ml} \) 농도의 GA를 각각 첨가하여 2시간 간격으로 16시간 동안 생균수를 측정하였다. 양성대조군으로는 \( 2 \mu \mathrm{g/ml} \) 농도의 tetracycline을 사용하였으며, 음성대조군으로 \( 1.0 \% \) (\( \mathrm{w/v} \))의 glucose를 첨가하여 비교하였다.</p><h2>구강병원균의 산 생성 억제효과 측정</h2><p>분획물 및 GA가 S. mutans와 S. salivarius의 산 생성능에 미치는 영향을 조사하였다. 각 시험관에 균 현탁액(\( O.D_{600}= 1.2 \)) \( 2 \mathrm{~ml} \)에 농도별로 조제한 분획물 또는 GA \( 0.5 \mathrm{~ml} \), 또는 \( 2 \% \) glucose solution을 \( 1 \mathrm{~ml} \) 첨가하여 혼합한 뒤 최적 배양온도에서 배양하면서 30분 간격으로 240분 동안 변화하는 pH를 측정하여 산 생성 억제 정도를 확인하였다.</p><h2>치주균의 부착능 저해효과 측정</h2><p>각 균의 최적 배지에 \( 1 \% \) (\( \mathrm{w/v} \))의 sucrose와 macfarland No. 0.5로 조절한 균 배양액을 1:100의 비율로 혼합한 용액 \( 2.48 \mathrm{~ml} \)에 농도별로 조제한 분획물 또는 GA를 \( 20 ~\mu \mathrm{l} \) 첨가하였다. 최적 배양온도에서 24시간 배양 후 \( 2 \mathrm{~mM} \) phosphate buffer (pH 7.2)로 3번 세척하였으며, 부착된 cell은 \( 2 \mathrm{~ml} \)의 buffer에 현탁한 후에 \( 550 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 부착능 저해정도를 계산하였다.</p><h2>구취억제 효능 실증 실험</h2><p>MeOH 추출물과 GA의 구취억제 효능 측정은 cysteine challenge test 방법에 준하여 oral chroma (CHM-1, ABILITO, Japan)를 사용하여 측정하였다. 최근 6개월 이내 특별한 투약경력이 없는 건강한 사람 5명을 실험대상자로 선정하여 실험 전 3시간 동안 음식물 섭취 및 칫솔질과 같은 일체의 구강위생관리를 제한하였다. 모든 실험 대상자에 대하여 5분 간격으로 2회 기저 구취수준을 측정한 뒤, 구취 유발을 위해 \( 3 \mathrm{~mM} \)의 cysteine 용액 \( 10 \mathrm{~ml} \)을 30초간 양치하도록 하였다. 각 실험군은 \( 2 \% \) 추출물 또는 \( 2 \% \) GA를 추가로 처리하게 하였으며, 대조군은 시판되는 가그린 민트\( { }^{Ⓡ} \)용액을 처리하게 한 뒤 4분 뒤 구취를 포집하여 구취성분인 황화수소, 메틸머캅탄, 황화디메틸을 측정하였다. 모든 개별 실험은 5명의 실험참가자를 대상으로 3회씩 반복 측정하여 volatile sulfur compound (VSC) relative ratio로서 구취제거 효과를 계산하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>수집된 자료는 SPSS 18.0 for Windows (SPSS INC., USA)를 이용하여 분석, 처리하였다.</p>
MeOH 추출물을 어떻게 분획하였나요?
용매별로 분획