<h1>결과 및 고찰</h1><h2>벼 미숙종자 유전자은행 제작 및 구조분석</h2><p>미숙종자 \( 100 \mathrm{ng} \) 의 cDNA를 \( 1 \mathrm{ug} \) 의 Uni-ZAP 벡터에 삽입한 후 Gigapack III Gold Packaging Extract에 Packaging하여 cDNA 은행을 제작한 결과 \( 2.5 \times 10^{6} \mathrm{pfu} / \mathrm{ml} \) 의 packaged phagemids를 얻었다. 벼의 유전자가 32,000 개 정도임을 감안할 때 본 연구에서 제작된 미숙종자 유전자은행은 전체 유전자의 약 78 배 양을 나타내어 미숙종자전체 유전자를 포함하고 있다고 생각되어진다. 대량 발현유전자분석을 위하여 \( 1 \times 10^{5} \) 의 phagemids를 in vivo excision 시킨 후 33,792콜로니를 개별 선발하여 균주는 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하고, 96 well 멀티스크린을 이용하여 DNA를 분리하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 저장하였다. 각각 분리된 DNA를 EcoRI, XhoI 제한효소로 처리한 후 \( 1.2 \% \) 아가로즈 겔에 전기영동하여 삽입 단편을 확인 한 결과 \( 0.75 \mathrm{~kb}-3.5 \mathrm{~kb} \) 의 단편을 포함하고 있는 것으로 나타났다. 최근 각종 동식물에서 CAP trapper 방법 (Carnini et al. 1996; Kawai et al. 2001; Kikuchiet al. 2003; Seki et al. 1998)을 이용하여 \(1-10\mathrm{kb}\) 길이의 완전장 cDNA를 제작하여 유전체 해독과 유전자 기능 연구를 위하여 많이 사용하고 있다. 그러나 이 방법을 이용하여 유전자은행을 제작하면 많은 기술과 비용이 소요된다. 따라서 본 연구에서는 일반적인 방법인 poly(A) RNA를 분리 한 후 oligo(dT) 프라이머와 역전사효소를 이용하여 cDNA 를 합성하여 양질의 미숙종자 발현유전자 은행을 얻을 수 있었다.</p><p>클론 각각의 염기서열 결정은 96well PCR plate를 이용하여 각각의 well에 \(200 \mathrm{ng}\) 의 DNA, 5pmol의 SK 프라이머, Bigdye terminater sequence reaction \(2 \mathrm{ul}\), 5X buffer \(1 \mathrm{ul}\)를 넣은 후 염기서열분석 반응을 시키고 ABI 3100 염기서열분석기를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 33,792 클론(96well \( \times 352 \) plate)의 염기서열을 결정한 후 서열을 교정하여 25,668 클론의 염기서열을 얻을 수 있었다. 부분 염기서열이 결정된 종자 형질 관련 유전자의 완전염기서열은 primer extension 방법을 이용하여 나머지 중간 부위의 염기서열을 결정하였고, 결정된 염기서열을 GenBank 에 등록하였다.</p><h2>미숙종자 발현 unigene 선발 및 특성분석</h2><p>구조유전체연구가 수행됨과 동시에 동.식물의 유전자 명명 및 기능을 밝히기 위한 기능유전체 연구 재료로 완전장 cDNA 분리와 발현유전자분석이 매우 중요시되고 있다. 벼의 발현유전자정보는 현재 NCBI dbEST (database of Expressed Sequence Tags)에 1,248,660 개 (February 27, 2009) 수록되어 있으며 unigene으로는 40,739 개를 나타내고 있다. 벼의 유전자는 32,000 여개로 추정되므로 대다수의 유전자가 포함되어 있을 것으로 생각된다.</p><p>본 연구에서는 미숙종자 발현유전자 대량 염기서열 분석 및 기능분류를 위하여 미숙종자 발현 unigene을 분리하였다. 미숙종자에서 발현되는 25,668 개 클론 중 중복클론을 제외한 unigene 분리를 위하여 DNASTAR의 SeqMan 프로그램을 이용하여 basecalling과 clustering을 실시한 결과 2 개 이상의 클론이 중복된 contig 2,869개와 singleton 4,640개 등 미숙종자에서 발현하는 unigene 7,509개를 얻었다.</p><p>미숙종자 25,668 개 클론으로부터 분석된 전체 염기서열 길이는 \( 14,113,886 \mathrm{bp} \) 였으며 1 개 클론의 평균 길이는 \( 550 \mathrm{bp} \) 정도로 확인되었다. 염기서열 분석의 성공률은 \( 76 \% \) 였으며 유전자 중복클론은 21,028 개로 나타났다. 이와 같이 많은 클론들이 중복을 나타내는 이유는 미숙종자 형성시기에 조직 특이적으로 많이 발현하고 있는 종자 저장단백질인 glutelin과 prolamin 유전자와 전분 합성 관련유전자의 발현이 매우 높았기 때문으로 추정된다. Cluster 내 중복된 클론 수를 도표로 정리한 결과, 그중 1,000 개 이상의 클론으로 구성된 cluster는 3개 있었으며 glutelin 유전자로 밝혀진 발현유전자들은 구조를 분석한 후 GenBank에 등록 하였다(Accession Number EF122456, EF122460). 염기서열을 결정한 벼 미숙종자 발현유전자중 glutelin 유전자는 전체의 약 \( 30 \% \) 를 차지하고 있었다. 이러한 결과를 미루어 생각할 때 벼 유래 미숙종자 발현 유전자은행을 제작할 경우에는 유전자의 중복을 피하기 위하여 glutelin 유전자를 최대한 제외시킨 유전자은행 작성이 필요하다.</p><p>Umezawa 등은 콩 유래 10 종의 cDNA 은행으로부터 37,834 개 클론을 분리하고 발현유전자분석을 수행하여 68,661개의 염기서열로부터 22,674개 cluster와 15,255 개의 singleton을 분리 한바 있으며, 이때 60 개 이상의 클론을 포함하는 cluster는 10 개 미만으로 보고 하였는데, 본 연구의 결과와는 다소 차이가 있었다. 이러한 경향은 앞서 설명한 바와 같이 벼 미숙종자유래 발현유전자에는 종자저장단백질 및 전분합성 유전자가 다량으로 포함되어 있기 때문으로 추정된다.</p>
대량 발현유전자분석을 위한 과정 중 DNA를 분리하여 저장하는 과정은 어떻게 진행되지?
\( 1 \times 10^{5} \) 의 phagemids를 in vivo excision 시킨 후 33,792콜로니를 개별 선발하여 균주는 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하고, 96 well 멀티스크린을 이용하여 DNA를 분리하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 저장하였다.