<h2>SDS 및 Azo 계면활성제를 사용한 단백질 가용화 및 FASP 방법을 이용한 고순도 단백질체 절편화</h2><p>벼 잎에서 단백질을 분리 후, 이전에 보고되었던 FASP 방법을 이용하여 고순도 단백질체 절편화를 수행하였다. 먼저, TCA/acetone에 침전시킨 단백질 (\( 300 \mu \mathrm{g} \)) 을 \( 30 \mu \mathrm{L} \) 의 denaturation buffer [\( 4 \%\) SDS and \( 100 \mathrm{mM} \) DTT in \( 100 \mathrm{mM} \) tetraethylammonium tetrahydroborate (TEAB), \( \mathrm{pH} 8.5 \)]에 녹인 뒤 3분간 초음파 분쇄 처리를 진행하고 \( 99^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 분간 가열하였다. 이를 통해 변성된 단백질을 30K 스핀 필터에 로딩 후 최종 부피가 \( 300 \mu \mathrm{L} \)가 되도록 urea buffer [\(8 \mathrm{M} urea in \(100 \mathrm{mM}\) TEAB, \(\mathrm{pH} 8.5 \)]로 희석하였다. 다음으로 \( 300 \mu \mathrm{L} \) 의 urea buffer을 이용하여 \( 14,000 \mathrm{~g} \) 에서 원심분리를 3 회를 진행하여 샘플 내의 SDS를 제거한 뒤, 상온의 암실 조건에 서 \( 200 \mu \mathrm{L} \) 의 alkylation buffer \( [50 \mathrm{mM} \) iodoacetamide (IAA), \( 8 \mathrm{M} \) urea in \( 100 \mathrm{mM}\) TEAB, \(\mathrm{pH} 8.5 \)]을 추가하여 1시간 동안 시스테인 알킬화를 진행했다. 그 후 단백질을 \( 5 \% \) acetonitrile (ACN)이 포함된 \( 50 \mathrm{mM} \) TEAB buffer에 용해된 trypsin (enzyme-to-substrate ratio [\(\mathrm{w} / \mathrm{w}\)] of \(1:100\))으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16시간동안 보관하였다. Trypsin 으로 절편화된 펩타이드는 원심분리를 통해 수집하였다.</p><p>또한, Azo 계면활성제를 사용한 단백질 가용화 및 절편화 절차의 경우, TCA/acetone에 침전된 단백질을 Azo 계면활성제를 포함한 denaturation buffer [\( 1 \%\) Azo and \( 100 \mathrm{mM} \) DTT in 100 \( \mathrm{mM} \) TEAB, \( \mathrm{pH} 8.5 \)]로 용해시켰다. 샘플을 3분간 초음파 분쇄 처리를 진행하고 \( 99^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 가열한 후, 변성된 단백질을 30K 스핀 필터에 로딩하고 최종 부피가 \( 300 \mu \mathrm{L} \)가 되도록 urea buffer [ \( 8 \mathrm{M} \) urea in \(100 \mathrm{mM}\) TEAB, \(\mathrm{pH} 8.5 \)]로 희석하였다. 해당 방법의 경우 이전에 보고된 것에 따라서 \( 100 \mathrm{~W} \) 고압 수은램프를 사용하여 자외-가시광선(UV-vis)조사를 진행하여 Azo 계면활성제를 분해하는 추가적인 과정을 수행하였다. UV의 조사 후 앞서 언급된 절차와 동일하게 alkylation 및 trypsin을 처리 후 절편화된 펩타이드를 수집하였다.</p>
단백질 가용화 및 절편화 절차에서 Azo 계면활성제를 포함한 denaturation buffer로 용해했지?
YES