<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>본 실험에 사용한 허브 원료는 모두 (주)이에스기술연구소(군포, 대한민국)에서 건조 분말을 구입하여 원료 표준화를 위해 분쇄한 후 입도 \( 500 ~\mu \mathrm{m} \) 이하의 것만을 추출용 시료로 사용하였다.</p><h2>허브 추출물 제조</h2><p>겨자(mustard), 계피(cinnamon), 딜씨드(dillseed), 로즈마리(rosemary), 마조람(marjoram), 메이스(mace), 바질(basil), 백후추 (white pepper), 샐러리(celery), 세이지(sage), 월계수 잎(bay leaf), 오레가노(oregano), 카다몬(cadamon), 커민(cumin), 코리안 더(coriander), 클러브(clove), 타임(thyme), 튜메릭(turmeric), 페뉴그릭(fenugreek), 흑후추(black pepper)의 \(20\)가지 건조 분말에 각각 \(1\):\(20\) (\(\mathrm{w}:\mathrm{v}\)) 비율로 \( 80 \% \) ethanol (\( \mathrm{v} / \mathrm{v} \))을 혼합한 후 \(30 ^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(2 \)시간 동안 진탕추출하였다. 추출액을 원심분리 \( (1,600 \times \mathrm{g} \), \(10 \)분) 후 상등액을 취해 감압여과(Whatman, Buckinghamshire, UK)한 다음 감압농축 및 동결건조하여 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹인 후 분석용 시료로 사용하였다. 동결건조 시료는 deep freezer에 보관하였으며, 시료는 \( 1 \mathrm{~mg} / \mathrm{mL} \) 농도로 제조하여 실험을 진행하였다.</p><h2>추출용매 선정을 위한 타임추출물의 제조</h2><p>타임 분말과 증류수, 에탄올, 메탄올, \( n \)-헥산을 각각 \(1\):\(25\)(\(\mathrm{w}:\mathrm{v}\))의 비율로 혼합하여 \(4 \)시간 동안 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 진탕추출하였다. 추출액을 원심분리 \( (1,600 \times \mathrm{g}\), \(20 \)분)하여 상등액을 취하고 감압여과 (Whatman, Buckinghamshire, UK)한 다음 진공농축한 후 동일 부피만큼 에탄올을 가하여 총 플라보노이드 함량을 분석하였다. 분석 실험은 \(3\)회 반복하여 측정하였다.</p><h2>반응표면분석법을 이용한 추출조건 최적화</h2><p>타임 분말의 플라보노이드 추출조건 최적화를 위한 실험을 반응표면분석법(response surface method, RSM)의 하나인 중심합성계획법(central composite design)으로 설계하였다. 독립변수 (\( \mathrm{Xn} \))는 추출온도 (\( \mathrm{X}_{1} \)), 시료농도 (\( \mathrm{X}_{2} \)), 추출시간 (\( \mathrm{X}_{3} \))을 각각 \( -1\), \(0 \), \(1 \)의 \(3\)가지 범위로 추출조건을 계획하였으며, 총 플라보노이드 함량 (\( \mathrm{Y}_{1} \))으로 종속변수 (\( \mathrm{Yn} \))를 설계하였다. 실험모델 설계는 Design Expert \( 6.0 \) (Stat-Ease Inc,. Minneapolis, MN, USA)를 사용하였다.</p><h2>총 폴리페놀 함량 분석</h2><p>총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법에 의해 측정하였다. \( 0.1 \mathrm{~mL} \)의 시료에 \( 0.05 \mathrm{~mL} \)의 Folin-Ciocalteu phenol reagent를 혼합 후 \(4\)분간 방치시키고, \( 20 \% \)의 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3}\) \(1.5 \mathrm{~mL} \)를 가하여 \(2\)분간 반응시킨 다음 \( 760 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 총 폴리페놀 함량을 계산하였다. 표준물질로는 chlorogenic acid를 사용하였으며, 함량은 추출물 \(\mathrm{g}\) 당 chlorogenic acid equivalent (CAE)로 나타냈다.</p><h2>총 플라보노이드 함량 분석</h2><p>Hwang 등의 방법을 응용하여 총 플라보노이드 함량을 분석하였다. \( 0.5 \mathrm{~mL} \)의 시료와 \( 5 \mathrm{~mL} \)의 diethylene glycol을 혼합한 다음 \( 0.5 \mathrm{~mL}\) \(1 \mathrm{~N}\) \(\mathrm{NaOH} \)를 추가하여 \(1 \)시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시킨 다음 흡광도를 \( 420 \mathrm{~nm} \)에서 측정하여 총 플라보노이드 함량을 계산하였다. 표준물질로는 naringin을 사용하였으며, 추출물 \( \mathrm{g} \) 당 naringin equivalent(NE)로 함량을 나타냈다.</p><h2>DPPH radical 소거능 측정</h2><p>DPPH radical 소거능은 Blois의 방법을 일부 변형하여 분석하였다. 시료 \( 40 ~\mu \mathrm{L} \)와 메탄올에 \( 0.4 \mathrm{~mM} \)의 농도로 용해한 \(1\),\(1\)diphenyl-\(2\)-picrylhydrazy (DPPH) 용액 \( 160 ~\mu \mathrm{L} \)를 혼합한 다음 \(30 \)분간 차광상태에서 반응시킨 후 microplate reader (VERSAmax, Molecular Device LLC, San Jose, CA, USA)로 \( 515 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도를 측정하였다. DPPH radical 소거능은 [\(1\)-(시료구/무 첨가 대조구] \(\times 100 \)으로 계산하였다.</p>
허브 추출물 제조에는 몇 가지의 건조 분말이 들어 가는가?
\(20\)