<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주 및 plasmids</h2><p>본 연구에서 plasmid 구축 및 증폭을 위한 E. coli 숙주세포는 DH5 \( \alpha \) (recAl endAl gyrA96 thil hsdR17 supE44 relA1 lacZAM15)를 사용하였고, DNase I 발현을 위한 효모 숙주세포는 invertase 결손 변이주(suc2-9) 및 uracil 영양요구성 변이주(ura3-52)인 Saccharomyces cerevisiae 2805 (MAT \( \alpha \) pep \( 4:: \) HIS 3 prol- \( \delta \) canl GAL2 his \( 3 \delta \) ura3-52) histidine 영양요구성 변이주인 Pichia pastoris GS115 (Invitrogen, USA) 균주를 사용하였다. S. cerevisiae에 형질전환할 DNase I 유전자 공여 plasmid는 GAL10 promoter와 \( \mathrm{MF} \alpha \) 분비신호서열 하류에 bovine pancreatic 유래의 DNase I 유전자(bp-DNase I)를 cloning한 pGAL-MF \( \alpha- \) DNase I을 사용하였다. P. pastoris 벡터에는 메탄올 대사에 관련된 유전자에서 유래된 프로모터 AOX1 와 \( \mathrm{MF} \alpha \) 분비신호서열을 함유하고 있다. 또한 영양요구성 요구 선별표지로 이용할 수 있는 HIS4 유전자가 메탄올 자화효모의 선별 표지로 사용되었다.</p><h2>재조합 plasmid 구축</h2><p>효모 S. cerevisiae에서의 DNase I plasmid 구축은 bovine pancreatic 유래 DNase I 유전자를 함유한 pNaDNI을 tem-plate로 PCR 증폭하였다.</p><p>PCR 증폭에 사용한 두 개의 primer는 [(sense primer) 5'-GCTCTAGATTGAAAATAGCTGCTTTCAAT-3'와 (anti-sense primer) 5'-GCGTCGACTATGTCAATGTAACTTCCAC-3']로 제작하였다. Sense primer 부위에는 XbaI 제한효소 인식부위를 가지며, anti-sense primer에는 SalI 제한효소 인식부위를 가지고 있다. PCR 증폭 후에 plasmid DNA mini-prep kit (Geneall Biotechnology CO., LTD)를 이용하여 정제하였다. 얻어진 단편은 XbaI/SalI 으로 처리되고 동일한 제한효소에 의해 pGAL-MFQ-EGL의 egl 유전자 대신에 DNase I 유전자가 치환되어 pGAL-MF \( \alpha \)-DNaseI \( (6.4 \mathrm{~kb})\)을 구축하였다.</p><p>또한 효모 P. pastoris에서의 DNase I plasmid 구축은 bovine pancreatic 유래 DNase I 유전자를 함유한 pNaDNI을 template로 PCR 증폭하였다.</p><p>PCR 증폭에 사용한 두 개의 primer는 [(sense primer) 5'-CTCGAGAAAAGATTGAAAATAGCTGCTTTCAATATTAG-3'와 (anti-sense primer) 5'-GAATTCTATGTCAATGTA-ACTTCCACGG-3']로 제작하였다. Sense primer 부위에는 XhoI 제한효소 인식부위를 가지며, anti-sense primer에는 EcoRI 제한효소 인식부위를 가지고 있다. PCR 증폭 후에 plasmid DNA mini-prep kit를 이용하여 정제하였다. 얻어진 단편은 XhoI/EcoRI 으로 처리하였고 동일한 제한효소에 의해 처리된 pPIC9 \( \alpha \) vector (Invitrogen, USA)에 삽입하여 pPEXI \( (8.8 \mathrm{~kb}) \) 을 구축하였다.</p>
P. pastoris 벡터에 함유되어 있는 메탄올 대사와 연관있는 유전자에서 유래되어진 것은 무엇인가요?
프로모터 AOX1