<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>\([\gamma\)-\(^{3} \) P]ATP는 New England Nuclear Science Inc. (Boston, MA)에서, ECL Western blot detention kit는 GE Healthcare (Piscataway, NJ)에서, DMEM과 fetal bovine serum은 Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)에서 구입하였다. mMessage mMachine \( ^{\mathrm{IM}} \)은 Ambion Inc. (Austin, TX)에서 구입하여 사용하였고, 특별한 언급이 없는 한 모든 시약은 Sigma-Aldrich Chemicals (St. Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다.</p><h2>개구리 난자에 mRNA의 미세주사</h2><p>PMSG를 주사한 발톱개구리의 난소를 채취한 후, collagenase \( (2.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)를 처리하여 Stage VI 의 난자를 얻은 후, mMessage mMachine을 이용하여 합성한 일정량의 mRNA를 IM300 micromanipulator (Narishige USA Inc., Long Island, NY)를 이용하여 미세주사 하였다. 12 또는 16 시간 후 난자에 \( 500 \mathrm{nM} \)의 progesterone을 처리하여 세포주기를 재개시켰다. 세포주기의 재개는 동물극 쪽의 백색 반점의 생성유무로 확인하였다. 각 난자 당 \(5 \mu l \)의 Tris buffer ( \( 250 \mathrm{mM} \) sucrose, \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-HCl (pH 8.0), \( 0.0.1 \% \) NP40, \( 0.1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.2 \mathrm{mM} \) EGTA, \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 10 \mathrm{mM} \mathrm{NaF}, 10 \mathrm{mM} \) sodium pyrophosphate, \( 5 \mathrm{mM} \beta \)-mercaptoethanol, \( 1 \mu \mathrm{M} \) microcystin, \( 4 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) aprotinin, \( 0.7 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) pepstatin, \( 0.2 \) \( \mathrm{mM} \mathrm{PMSF} \), and \( 0.5 \mathrm{gg} / \mathrm{ml} \) leupeptin)를 처리하여 파쇄한 후 원심 분리히여 중간층을 SDS PAGE에 사용하였다.</p><h2>세포내에서의 Wee1 단백질의 위치 관찰</h2><p>Hek293 세포에 Wee1A, Wee1B 또는 Myt1을 형질전환한 후 16시간 배양하었다. 세포는 미토콘드리아의 염색을 위해 Mito-Tracker로 1시간 처리하였고, \( 4 \% \) paraformaldehyde를 이용하여 고정시켰다. 핵 부위는 \( 1 \mathrm{~ul} \)의 4'6-Diamidino-2- phenylindole (DAPI) 용액 \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \), Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)으로 염색하였다. V5 향체(Invitrogen Corp. Carlsbad, CA)를 \( 1 / 1,000 \)로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고, 다시 FITC가 결함된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)를 \(1:1,000\) 비율로 회석하여 1 시간 반응시킨 후, 형광 현미경 Axio Vision 3.1 (Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.</p><h2>Chimeric construct의 제조</h2><p>WeelA의 1번에서 289번 아미노산과 Wee1B의 1번에서 199번 아미노산을 아미노 도메인으로 명명하고 아미노산이 바뀌지 않도록 redundant codon을 이용하여 PCR 방법으로 Nhel 자리를 생성하여 연결하였다. 사용한 primer는 WeelA: ctgaaagcaacatggctagccggtatacaactgaattc, ctaatatgoctagccgctat gaaaaagaat, Wee1B: attcttttcatagcggctagocatattag, ctaatatggc tagocgctatgaaaagaat이다. 카르복실 쪽은 WeelA의 569, Wee1B의 482 아미노산 이후를 Bfrl 자리를 이용하여 연결하였다. 사용한 primer는 WeelA: caggatgaatcatgaccttangcaactctgtcac, gtgacagagttgcttaaggtcatgattcatcctg. Wee1B: tatggtcta cttaagaatgatccaccc, gtggatcattcttaagtagaccataaaag이다.</p><h2>In vitro kinase assay와 Western blot</h2><p>Hek 293세포를 \(10 \% \) FBS를 포함하는 DMEM (Invitrogen Corp.)에서 \( 70 \% \)가 되도록 배양한 후 Lipofectamine \( 2000^{\text {IM }} \) (Invitrogen Corp.)을 이용하여 Wee1A와 Wee1B를 형질전환하였다. 24시간 후 세포를 Tris-NP40 lysis buffered solution (50 mM Tris \( (\mathrm{pH} 7.6), 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \(0.01 \% \) \( \mathrm{NP40}, 4 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) aprotinin, \( 0.7 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) pepstatin, \( 0.2 \mathrm{mM} \) PMSF, \( 0.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) leupeptin, \( 1 \mu \mathrm{M} \) microcystin-LR, \( 1 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaVO}_{4} \), and \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{NaF} \) )에서 파쇄한 후, 원심분리로 상충액을 분리하였다. \( 1 \mu \mathrm{g} \)의 anti-V5 항체를 이용하여 면역침전한 후 면역침전체를 phosphorylation buffered solution (50 \( \mathrm{mM} \) Tris-HC (pH 7.6), \( 5 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl} 21 \mathrm{mM} \mathrm{ATP}, 4 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) aprotinin, \( 0.7 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) pepstatin, \( 0.2 \mathrm{mM} \) PMSF, \( 0.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) leupeptin, and \( 500 \mu \mathrm{Ci} / \mathrm{ml}\left[\gamma^{3}{ }^{3} \mathrm{P}\right] \mathrm{ATP}(3,000 \mathrm{Ci} / \mathrm{mmol} \), New England Nuclear Science Inc., Boston, MA)에서 PKA catalytic subunit (Promega Corp., Madison, WI)을 첨가하여 30분간 반응시켰다. 반응물을 \( 8 \% \) SDS-PAGE을 이용하여 분리한 후 필름에 노출시켜 인산화 정도를 측정하였다. Western blot을 위해서는 면역침전물을 SDS-PAGE 후 membrane에 옮겨 V5 항체나 anti-phospho Akt substrate 항체 (Cell Signaling, Danvers, MA)를 2시간 동안 처리하고, \( 1: 5,000 \) 비율로 horseradish peroxidase가 붙은 2차 항체(GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 1시간 처리한 후, ECL 방법으로 단백질을 확인하였다.</p>
<h2>개구리 난자에 mRNA의 미세주사</h2>는 임신마혈청고나도트로핀을 주사한 발톱개구리의 난소를 채취한 뒤에 collagenase \( (2.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)를 처리하여 Stage VI 의 난자를 얻은 후,무엇을 이용해서 합성한 일정량의 mRNA를 IM300 micromanipulator 를 이용하여 미세주사 하였지?
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