<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료 및 시약</h2><p>실험동물의 마취제로 사용한 Enflurane은 일성신약주식회사, Xylazine은 Haver (New York, NY, USA) 제품을 이용하였다. 세포배양에 사용된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)-low glucose 배지, fetal bovine serum (FBS) 및 pen-icillin/stereptomycin은 GIBCO-BRL (Grand Island, NY, USA)에서, p38 MAPK 억제제인 SB203580은 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서, COX-2 일차항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고, 기타 실험 재료는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.</p><h2>세포배양 및 Lipopolysaccharide (LPS)에 의한 COX-2 단백질 분석</h2><p>실험에 사용한 A549 세포와 RAW264.7 세포는 American Type Culture Collection에서 구입하였다. 세포는 \( 10 \% \) FBS와 \( 1 \% \) penicillin/stereptomycin을 첨가한 DMEM-low glucose 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건으로 24 시간 동안 배양하였으며 2~3일 간격으로 계대 배양하여 실험에 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 씻은 다음 각 세포를 \( 2 \times 10^{5} \) cells \( / \mathrm{ml} \) 로 분주한 뒤 세포의 염증반응을 유발하는 LPS에 의한 COX-2 단백질의 발현을 보기위하여 \( 0,0.1,1 \) 및 \( 2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도의 LPS를 12시간 동안 처리하여 베양하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 세포를 scraper로 긁어모아 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm} \) 으로 5 분간 원심분리 하여 상등액을 제거하고 \( \mathrm{IPH} \) lysis buffer \( [50 \mathrm{~nm} \) Tris \( (\mathrm{pH} \) 8.0), \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 5 \mathrm{mM} \) EDTA, 0.5\% NP40, \( 100 \mathrm{mM} \) PMSF, leupeptin \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \), Aprotinin \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}, 1 \mathrm{M} \) DTT] \( ] \)로 현탁시켰다. \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 동안 현탁시킨 세포를 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)에서 20분 동안 원심분리한 후 단백질을 분리하였다. 추출한 단백질은 정량하여 DTT가 첨가된 2xSDS-loading buffer [Tris-Cl (pH 6.8) \( 100 \mathrm{mM} \), glycerol 20\%, bromophenol blue \( 0.2 \% \), SDS \( 4 \% \), dithiothreitol \( 200 \mathrm{mM}] \) 와 섞어 \( 98^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 가열 후 10\% SDS-PAGE gel로 전기영동하여 Immoblion-P-membrane (Milipore, USA)에 transfer 시켰다. Membrane은 COX-2 일차항체와 반응시키고 anti-rabbit 이차항체와 반응시켰다. 항체들에 대한 발현분석은 Horseradish Peroxidase-linked 이차항체에 의해 발현되는 ECL Western Blot Analysis 시스템을 이용하여 결과를 얻었다.</p><h2>실험동물 그룹</h2><p>실험동물은 체중 \( 260 ~ 300 \mathrm{~g} \) 정도의 Sprague-Dawley 종 수컷 횐쥐를 사용하였다. 실험군은 각각 정상군(Sham), 허혈-재관류 처치군(I/R), mepacrine을 전처치한 허혈-재관류 처치군 (Mepa+I/R) 및 아스피린을 전처치한 허혈-재관류 처치군 \( (\mathrm{ASA}+\mathrm{I} / \mathrm{R}) \) 으로 분류하였다. 정상군은 허혈-재관류 처치군과 동일하게 수술하되 복부절개만 시행하였고, 나머지군은 허혈-재관류 처치군과 동일하게 처리하였다. Mepacrine \( (60 \mathrm{mg} / \) \( \mathrm{kg}) \) 및 아스피린 \( (10 \mathrm{mg} / \mathrm{kg}) \) 은 허혈-재관류 처치 30분 전에 복강 내로 주사하였다.</p><h2>쥐에서 허헐-재관류에 의한 급성 폐손상의 유도</h2><p>장의 허혈-재관류에 의한 급성 폐손상을 유도하기 위하여 ketamine \( (80 \mathrm{mg} / \mathrm{kg}) \) 과 xylazine \( (16 \mathrm{mg} / \mathrm{kg}) \) 을 복강 내로 주사하여 마취한 후 개복술을 시행하여 bulldog 클램프를 이용하여 1시간 동안 상장간막동맥(superior mesenteric artery)의 혈류를 차단하였다. 그 후 클램프를 풀고 4시간 동안 재관류(reperfusion)시켜 급성 폐손상을 유발하였다.</p><h2>소장 및 폐장 조직의 myeloperoxidase 할성도 측정</h2><p>호중구의 장관 및 폐장 조직 내 침윤 정도를 알아보기 위하여 Goldblum 등의 방법에 따라 myeloperoxidase (MPO) 활성도를 측정하였다.</p><p>실험동물을 마취한 뒤, 양측 폐장 및 소장 일부를 절제하고 액체질소로 급속냉각 후 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다. \( \mathrm{MPO} \) 활성도를 측정하기위해, \( 4.0 \mathrm{ml} \) 의 \( 20 \mathrm{mM} \) potassium phosphate 완충용액( \( \mathrm{pH} \) 7.4)에 조직을 녹인 후 Polytron PT 1200 ho-mogeniger (Kinematica \( \mathrm{AG} \), Swizerland)를 이용하여 조직을 분쇄하여 균질액을 만든 뒤 \( 18,000 \mathrm{rpm} \) 으로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 원심분리(Beckman, J2-M1 high Speed centrifuge, USA)하였다. 그 후 상등역은 제거하고 침전물에 \( 0.5 \% \) hexadecyl-trimethylammonium bromide \( (50 \mathrm{mM} \) potassium phos-phate, \( \mathrm{pH} \) 6.0) \( 4.0 \mathrm{ml} \) 를 첨가한 후 90 초간 sonication (Vibracell, Sonics \& Material Inc, USA)하였다. 이후 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)의 항온수조에서 2시간 반응시켜 조직 내에 있는 \( \mathrm{MPO} \) 분해효소를 불활성화 시킨 후 폐장 분쇄액 \( 1.0 \mathrm{ml} \) 를 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 20,000 \) \( \mathrm{rpm} \) 에서 2분간 원심분리하여 상등핵을 분리하였다. 상등핵 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 를 취하여 o-dianisidine이 함유된 \( 500 \mu \mathrm{M} \) 과산화수소 용액 \( 2.9 \mathrm{ml} \) 와 반응시키고 시간에 따른 흡광도의 변화 \( (\mathrm{dA} / \mathrm{dt}) \) 를 \( 460 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. \( \mathrm{MPO} \) 활성도 \( (\mathrm{U} / \mathrm{g} \) of wet tissue)는 측정한 흡광도 변화를 조직의 무게로 나누고 이 값에 \( 13.5 \) 를 곱하여 구하였다.</p><h2>소장 및 폐장 조직의 형태학적인 관찰</h2><p>장관 및 폐장 조직의 손상을 확인하기 위하여 실험동물을 충분히 마취한 뒤, 양측 폐장 및 소장 일부를 절제하고 \( 10 \% \) 포르말린 용액에 담근 다음 조직을 박절하고 hematoxy-line-eosin 용액으로 염색 후 검경하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>모든 성적은 평균±표준오차로 표시하였고, 각 성적의 유의성은 ANOVA test 후에 Student-Newman-Keuls multiple comparison test를 이용하여 \( \mathrm{p} \) 값이 \( 0.05 \) 보다 작은 경우를 통계적으로 유의하다고 판정하였다.</p>
Xylazine과 함께 실험동물의 마취제로 사용된 것은 뭐야?
Enflurane