<h1>재료 및 방법</h1><h2>시약 및 재료</h2><p>CYP2J2 효소 활성 측정에 필요한 CYP2J2 기질약물 및 대사체인 astemizole, O-desmethyl astemizole, ebastine, hydrox-yebastine 및 terfenadine은 Toronto Research Chemical(North York, Canada)에서 구매하여 사용하였다. \( \mathrm{NADP^{+}} \), glucose-6-phosphate, 및 glucose-6-phosphate dehydrogen-ase은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구매하였고, 및 CYP2J2 효소 활성 저해능 평가를 위한 천연물 10 종은 한국한방산업진흥원에서 분양받아 사용하였다. 인체 간 마이크로솜(H161)과 terfenadine alcohol은 BD Gentest (Woburn, MA)에서 구입하였다. 기타 본 연구에 이용된 시약은 모두 실험에 이용 가능한 최상급을 구입하여 사용하였다.</p><h2>천연물 스크리닝을 통한 CYP2J2 활성 저해제 탐색</h2><p>10 종 천연물의 CYP2J2 효소 활성도 억제에 대한 연구는 CYP2J2의 기질 약물인 astemizole 로부터 생성되는 CYP2J2 매개 대사체인 O-desmethyl astemizole의 생성 속도를 측정함으로써 평가하였다. 즉, astemizole \( (1 \mu \mathrm{M}) \) 만을 혹은 astemizole과 함께 억제제로 천연물 \( (5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 을 \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 인체 마이크로솜을 함유하고 있는 \( 500 \mathrm{mM} \) 인산 완충액 \( (\mathrm{pH} 7.4)\) 에 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 배양하였다. 이후 NADPH 재생성계 \(1.3 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NADP^{+}}\), \(3.3 \mathrm{mM}\) G6P, \(3.3 \mathrm{mM} \) \(\mathrm{MgCl}_2\), 및 \(500 \mathrm{unit}/\mathrm{ml}\) G6PDH)를 첨가함으로써 반응을 시작하였고, 20 분간의 반응 후 내부표준물질로서 \( 100 \mathrm{nM} \) mebendazole을 포함하고 있는 아세토니트릴(acetonitrile) \( 50 \mu \mathrm{l}\) 를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응정지 후, 원심분리기에서 5 분간 원심분리 \( (14,000 \times g) \) 한 후 상층액을 직접 LC-MS/MS 시스템에 주입하였다.</p><h2>Thelephoric acid의 CYP2J2 저해능 평가</h2><p>10 종 천연물의 CYP2J2 효소 활성도 억제 연구를 통하여 강한 저해능을 보인 thelephoric acid에 대하여, CYP2J2 활성 억제 상수( \(\mathrm{IC_{50}}) \) 를 구하는 실험을 수행하였다. 즉, CYP2J2의 기질 약물인 astemizole, ebastine 및 terfenadine으로 부터 생성되는 CYP2J2 매개대사체인 O-desmethyl astemizole, hy-droxyebastine 및 terfenadine alcohol의 생성 속도를 측정하여 억제상수를 측정하였다. 3 종의 CYP2J2 기질 약물 중 하나만을(1 \( \mu \mathrm{M} \) astemizole, \( 1 \mu \mathrm{M} \) ebastine, 또는 \(5 \mu \mathrm{M} \) terfenadine) 혹은 기질약물 한 종과 함께 억제제로 thele-phoric acid \( (0 \sim 20 \mu \mathrm{M}) \) 을 같이 \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 인체 마이크로솜을 함유하고 있는 \( 500 \mathrm{mM} \) 인산완충액 \( (\mathrm{pH} 7.4) \) 에 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 배양하였다. 이후 NADPH 재생성계를 첨가함으로써 반응을 시작하고, 20 분간의 반응 후 내부표준물질 \( (300 \mathrm{nM} \) mebendazole)을 포함하고 있는 아세토니트릴 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응 정지 후, 원심분리기에서 5 분간 원심분리 \( (14,000 \times g) \) 한 후 상층액을 직접 LC-MS/MS 시스템에 주입하였다.</p><h2>LC-MS/MS 분석</h2><p>O-Desmethyl astemizole, hydroxyebastine, terfenadine al-cohol 및 mebendazole (내부표준물질)을 분리하기 위해 Phenomenex 사의 Luna C18 컬럼 \( (2 \times 50 \mathrm{~mm}, 3 \mu \mathrm{m}) \) 을 사용하였고, 이동상은 \( 0.1 \% \) formic acid를 첨가한 물(이동상 A) 및 아세토니트릴(이동상 B)를 사용하였다. ODesmethyl astemi-zole은 \(30\%\) B 등용매(isocratic) 조건에서 분석하였고, hydrox-yebastine 및terfenadine alcohol은 0 분에서 6 분 사이에 이동상 B 조성을 \( 10 \% \) 에서 \( 50 \% \) 로 증가시킨 후, 6.1 분에 이동상 B 조성을 \( 10 \% \) 로 감소시킨 후 10 분까지 유지하면서 분석을 수행하였다. 이 때 이동상의 유속은 \( 0.2 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 으로 유지하였으며, 탠덤질량분석기(Shimadzu 8040 LC-MS/MS system, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 검출하였다. 탠덤질량분석시 이온소스는 전기분무 이온화법(electrospray ionization, positive mode)을 사용하였고, 이온화 전압은 \( 4 \mathrm{kV} \), 탈용매화 온도는 \( 300^{\circ} \mathrm{C} \) 로 조정하였다. 질소가스 흐름 속도의 분무가스는 \( 3 \mathrm{l} / \mathrm{min} \), 커튼가스는 \( 2.0 \mathrm{Arb} \), 보조가스는 \( 10 \mathrm{Arb} \) 으로, 건조 가스는 \( 8 \mathrm{l} / \mathrm{min} \) 으로 조정하였고, 충돌가스(아르곤) 에너지 값(collision energy)은 \( 35 \mathrm{eV} \) (O-desmethyl astemizole), \( 42 \mathrm{eV} \) (hydroxyebastine), \( 36 \mathrm{eV} \) (terfenadine al-cohol), 및 \( 17 \mathrm{eV} \) (mebendazole) 이었다. 분석 물질의 정량을 위하여 SRM (selected reaction monitoring) 정량 모드를 이용하였고, O-desmethyl astemizole, hydroxyebastine, terfenadine alcohol, mebendazole 의 선택 질량으로서는 각각 m / z 445>204, 486>167, 488>452, 및 296>264로 양이온 모드에서 측정하였다.</p><h2>데이터 해석</h2><p>CYP2J2 동효소에 특이한 기질 약물로부터 대사체 생성에 대한 저해제의 CYP2J2 활성 억제에 대한 경수 \( \mathrm{(IC_{50})}\) 는, 스크리닝 단계에서 저해능을 보인 화합물 thelephoric acid의 농도를 달리하면서 \( (0 \sim 20 \mu \mathrm{M}) \), 효소 활성 저해 연구를 수행 후 약동학 분석 프로그램인 WinNonlin (version 2.0, Pharsight, Apex)을 이용하여 비선형 최소자승 회귀분석법을 이용하여 산출하였다.</p>
10 종 천연물의 CYP2J2 효소 활성도 억제에 대한 연구는 CYP2J2의 기질 약물인 이것으로부터 생성되는 CYP2J2 매개 대사체인 O-desmethyl astemizole의 생성 속도를 측정함으로써 평가하였다. 이것은 어떤 물질인가?
astemizole