<h1>재료 및 방법</h1><h2>근권미생물의 분리 및 보관</h2><p>균원시료는 경상남도 창녕, 경상북도 성주, 고령 일원에서 일반적으로 재배되고 있는 무, 배추, 수박, 참외, 마늘 등 채소류의 뿌리를 수집하여 균원시료로 이용하였다. 근권미생물은 균원시료인 뿌리를 잘 세척하고 그 크기가 \( 1 \mathrm{mm} \)가 되게 절단하여 그 \( 1 \mathrm{g} \)에 \( 0.85 \% \mathrm{~NaCl} \) 멸균수 \( 10 \mathrm{m}\ell \)를 첨가하고 3단 희석한 후 Nutrient agar (NA) 배지나 Tryptic soy broth (TSB) 배지에 \( 100 \mu \mathrm{m} \)씩 도말한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 배양하여 순수 독립 colony 만을 분리하여 근권미생물로 사용하였다.</p><p>근권미생물의 보관은 NA 배지나 TSB 배지 \( (\mathrm{pH} 6.0 \sim 7.0 \))에서 \( 30 \sim 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3-5일 동안 진탕 배양시킨 후 미생물 세포의 수가 \( 1 \mathrm{m} \ell \)당 콜로니 형성단위(clony forming unit; cfu)로서 \( 10^{8} \sim 10^{9} \)개 포함되어 있는 배양액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하거나 동결건조기로 건조하여 분말상태로 보관하면서 사용하였다.</p><h2>병원성 진균의 배양 및 보관</h2><p>모잘록병균은 본 연구실에서 분리◦동정하여 보관 중인 Pythium ultimun과 Rhizoctonia solani AG-4을 이용하였고, 각종 식물의 병원성 진균에 대한 길항력조사를 위해 사용한 병원성 진균으로는 Alternaria altrata, Collectotrichum gloeosporioides, Fusarium moniliforme, Fusarium oxysporum, F. oxysporum cucumerinum, F. oxysporum niveum, Glo-eosporium sp. Gloeosporium juglandis, Glomerella sp. G. cingulata, G. lagenaria, Penicillium italicum, P. digitatum, Phytophthora capsici, Stemprhylium solani, Didymella bryoniae, Sclerotinia sclerotiorum 등을 농촌진흥청 식물병리과, 한국과학기술원 유전자은행(KCTC), 경북대학교 농생물학과 등에서 분양받아 이용하였다. 이들 병원성 곰팡이 균주는 PDA (Potato Dextrose Agar) 배지상에서 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 조건으로 \( 4 \sim 10 \)일간 배양한 다음 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하면서 사용하였다.</p><h2>길항력조사</h2><p>모잘록병균에 길항하는 미생물의 선발은 분리균과 병원균을 대치배양(pairing plate culture)하여 생육억제환의 크기로 선발하였다. PDA 배지에서 키운 병원균체 덩어리를 PDA 배지 중앙에 올려놓고 가장자리 4곳에 순수분리한 미생물을 한 백금이씩 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 7 \sim 10 \)일간 배양한후 병원균의 균사체의 생장억제 정도(inhibition zone)를 조사하여 생성된 clear zone의 길이(\( \mathrm{mm} \))나 대치배양거리 \( 5 \mathrm{cm} \)에 대한 생육억제정도(\(\%\))로 길항력을 나타내었다.</p><h2>세균의 동정</h2><p>길항미생물의 동정은 3가지 방법으로 행하였다. 먼저 Bergey's mannual of systematic bacteriology의 방법에 준하여 미생물의 형태학적, 배양학적, 생리◦생화학적 특성을 조사하며, 두 번째는 미생물의 세포벽의 지방산의 조성으로 자동 동정하는 Microbial ID Inc.의 Sherlock system (미생물동정장치, GC : HP Co., 6890 series)을 이용하여 제조사가 추천하는 방법에 따라 분석하였고, 세번째는 16S rDNA sequence 법은 길항균의 염색체 DNA를 추출한 후 PCR primer로 R14 (5'-\( \mathrm{ACg} \mathrm{~ggC} \mathrm{~ggT} \mathrm{~gTg} \) TAC-3')와 R15 ( 5'-\( \mathrm{gCC} \mathrm{~AgC} \mathrm{~AgC} \mathrm{~CgC} \mathrm{~ggT} \) A-3')를 이용하여 PCR 산물을 얻고 이를 분석 의뢰하였으며, 그 sequencing data는 ribosomal database (http://rdp.cme.msu.edu/html/analyses. html)에서 상동성을 검색하여 동정하였다.</p>
균원시료로부터 근권미생물을 얻기 위해 육성을 며칠 정도 했는가?
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