<h1>결과 및 고찰</h1><h2>분석 조건 확립</h2><p>최적의 분석 조건을 확립하기 위해 resolution과 overlapping으로 정확하게 구현하기 위해 ACN 용매를 기본으로 하는 분석조건을 확립하였다. 선행문헌을 통해 다양한 분석 조건을 검토하였지만 목표로 하는 느릅나무 잎에 포함된 지표 성분 2종을 분석하기 위한 최적의 분석 조건은 확인되지 않았다. 따라서 반복적인 분석 조건 개발 및 검정을 통해 확립된 분석 조건에서 크게 5개의 peak를 검출할 수 있는 조건을 확인하였다. Peak들은 \( [\mathrm{M}-\mathrm{H}]^{-} \)의 negative 모드에서 이온 형태로 m/z (mass-to-charge ratio)의 \( 353\left(\mathrm{MS}^{2} 191\right)\), \(353\left(\mathrm{MS}^{2} 191\right) \), \( 609\left(\mathrm{MS}^{2} 301\right)\), \(463\left(\mathrm{MS}^{2} 301\right)\), \(593\left(\mathrm{MS}^{2} 285\right) \)값을 얻었고 선행문헌, PubChem, ChemSpider 등의 정보를 비교하여 예상화합물들로 확인하였다. 검출된 5개의 peak들은 매우 유사한 극성과 형태로 존재하여 상대적으로 산업적 활용성이 뛰어나며 쉽게 구할 수 있는 일반적인 2종의 성분을 선정하였다. 느릅나무 잎 추출물에 포함된 지표 성분 2종을 순수 분리하여 NMR을 이용한 구조 동정과 MS, \(\mathrm{MS}^{2} \), HRMS 성분 비교를 통해 3-O-caffeoylquinic acid (chlorogenic acid)와 5-O-caffeoylquinic acid (neochlorogenic acid)임을 확인하였다.</p><h2>정량분석 결과</h2><p>특이성은 blank 시료를 측정하여 시험 물질의 retention time과 동일한 위치에서 간섭 피크의 유무를 확인하였으며 간섭 피크가 없음을 확인하였다. 직선성은 표준 용액 \( 5-50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 농도를 각 1회 측정하여, 표준 용액의 농도와 피크 면적의 결정 계수를 산출하였고 판정기준은 결정 계수 \( \mathrm{r}^{2} \)이 0.998 이상인 것으로 하였고 0.9983 으로 적합 하였다. 검출 한계는 검량선에 근거한 표준편차와, 검량 선의 기울기를 이용한 계산법을 바탕으로 계산 하였고 계산식은 LOD (limit of detection) \( =3.3 * \sigma / \mathrm{S} \)이다. 정량 한계는 검량선에 근거한 표준 편차와, 검량선의 기울기를 이용한 계산법을 바탕으로 계산하였고 계산식은 LOQ (limit of quantification) \( =10 * / \mathrm{S} \)이다. 검출 한계와 정량 한계의 \( \sigma \)는 반응의 표준편차를, S는 검량 선의 기울기를 말한다. 시료 잔류는 표준 용액에서 blank로 오염되는 시료 잔류의 경우 \( 0.002 \% \) 이하 기준으로 본 시험에서는 보이지 않았다.</p><h2>장기 보존 안정성 실험 결과</h2><p>\( 25,40 \% \) 의 상대습도 조건에서 0, 1, 3, 6개월마다 분석을 진행하였고 느릅나무 잎 추출물에 포함된 3-O-caffeoylquinic acid와 5-O-caffeoylquinic acid 지표 물질의 함량은 반복 수의 평균으로 계산하였을 때 감소하지 않고 유지되었고 표준 물질인 두 성분 모두 3개월까지 각각 \( 1.5,0.2 \% \) 감소로 큰 변화를 보이지 않았지만 마지막 6 개월에 \( 5.9,18.0 \% \)가 감소하여 감소폭이 커지는 경향을 나타내었다.</p><h2>가혹 조전 온도 안정성 시험 결과</h2><p>느릅나무 잎 추출물을 온도 70의 조건에서 2일 간격으로 16일동안 총 8회의 분석을 실시하였으며, 분석결과 느릅나무 잎 추출물에 포함된 3-O-caffeoylquinic acid는 \( 60.2 \% \) 감소하였고, 5-O-caffeoylquinic acid는 \( 51.3 \% \) 감소하였다. 표준 물질인 3-O-caffeoylquinic acid는 \(7.7\%\) 감소하였고 5-O-caffeoylquinic acid는 \( 29.4 \% \) 가 감소하였다. 느릅나무 잎 추출물 보다 표준물질의 감소 폭이 상대적으로 적게 나타났다.</p><h2>가혹 조건 광선 안정성 시험 결과</h2><p>느릅나무 잎 추출물을 직사광선에 노출시킨 후 2일 간격으로 16일 동안 총 8회의 분석을 실시하였으며 분석결과 느릅나무잎 추출물에 포함된 3-O-caffeoylquinic acid는 \( 37.6 \% \) 감소하였고, 5-O-caffeoylquinic acid는 \( 29.1 \% \) 감소하였다. 표준 물질인 3-O-caffeoylquinic acid는 \( 4.4 \% \) 감소하였고 5-O-caffeoylquinic acid는 \( 27.1 \% \) 가 감소하였다. 느릅나무 잎 추출물 보다 표준물질의 감소 폭이 상대적으로 적게 나타났다. 느릅나무 잎 추출물의 장기 보존 안정성 시험 및 가혹 조건 실험의 결과에 따르면 느릅나무 잎 추출물의 3-O-caffeoylquinic acid, 5-O-caffeoylquinic acid는 직사광선이 닿지 않는 상온조건에서는 3개월까지 일정한 함량을 유지할 수 있는 것으로 확인되었다. 3개월 이후에는 지표 성분이 비교적 큰 폭으로 감소하나, 그 감소폭이 일반적 함량 기준인 \(80-120\%\) 이내이므로 직사광선이 닿지 않는 상온조건에서는 6개월까지 \( 80 \% \) 이상의 함량으로 보관이 가능할 것으로 확인 되었다. 특히, 잎 추출물은 고온이나 직사광선에 노출되는 경우 급격한 감소세를 보이며, 단기간에 함량 기준에 미달하게 되므로 함유량을 안정적으로 유지하기 위해서는 고온과 직사광선에 노출되는 환경은 피해야 할 것으로 사료 된다.</p><p>결론적으로 느릅나무 잎의 지표성분으로 선정된 3-O-caffeoylquinic acid (chlorogenic acid)와 5-O-caffeoylquinic acid (neochlorogenic acid)는 추출물에 함유된 성분으로 확인되었고, 유효성이 검정된 UPLC-PDA 크로마토그램을 통해 장기 보존과 가혹 조건 안정성 평가결과, 느릅나무 잎 추출물은 다양한 성분들이 혼합된 상태이지만 단일성분보다 안정성이 취약하여 장기 보존과 가혹 조건에서 급격히 감소하는 경향이 나타났다. 이전의 유사한 결과에 따르면 caffeoylquinic acids는 온도, 광, 용매 등의 다양한 조건에서 구조적 차이에 따라 안정성에 차이가 있음을 보였고 이는 분해 또는 cis로 입체 이성질체화 등으로 변화되어 안정성이 떨어지는 경향을 나타내었다. 또한 2종의 지표 성분의 안정성을 비교할 경우 상대적으로 3-O-caffeoylquinic acid가 보다 뛰어난 것으로 확인되었고 이러한 결과는 느릅나무 잎 추출물의 장기 보존과 가혹 조건 안정성 평가에서 5-O-caffeoylquinic acid 보다 3-O-caffeoylquinic acid 가 손실이 적은 것으로 나타났기 때문이다. 따라서 느릅나무 잎 추출물 상업적 활용성을 높이기 위해서는 3-O-caffeoylquinic acid의 함량을 높이는 재배법과 수확 시기 등을 고민해볼 필요가 있다.</p><h1>초록</h1><p>Ulmus parvifolia 잎의 약리학적 지표 성분을 제시하기 위해 간단하고 신뢰할 수 있는 HPLC 분석방법을 개발하였다. 지표 성분들은 NMR 및 UPLC-QTof-MS 분석에 의해 neochlorogenic acid (trans-5-O-caffeoylquinic acid, 5-CQA)과 chlorogenic acid (trans-3-O-caffeoylquinic acid, 3-CQA)로 구조 동정 되었다. HPLC를 이용하여 두개 화합물을 포함한 잎 추출물의 정성/정량 분석 방법을 평가하였다. 잎 \( 30 \% \) 에탄올 추출물과 지표 성분의 안정성 테스트는 6개월 동안 평가되었다. 그러나 안정성 조사 기간 동안 추출물과 지표 성분들 각각의 함량에 대한 유의한 변화는 관찰되지 않았다.</p>
저자들은 느릅나무 잎에 포함된 지표 성분 2종을 분석하기 위한 최적의 분석 조건을 확인하였는가?
NO