<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료</h2><p>소목은 2001년 조선대학교 약학대학의 우은란교수 연구팀에서 추출한 것을 실험에 사용하였다.</p><h2>시료의 조재</h2><p>문헌조사 및 전통한약에 기초하여 소목을 Fig. 1에 따라 조제한 식물의 메탄올 엑기스 및 각 용매 분흭물에 대하여 농축한 후 동결 건조하여 가루상태가 된 시료를 \( 0.5 \% \) DMSO 용액에 녹여 0.45 membrane filter로 여과멸균하여 실험에 사용하였다.</p><p>소목은 \(\mathrm{MeOH}\) 추출(M), Methylene chloride fraction (D), \(\mathrm{EtOAc}\) fraction (E), \( \mathrm{n}-\mathrm{BuOH} \) fraction (B), water fraction (H)해서 동량을 합한 후 25, 50, 100\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 사용하였다.</p><h2>세포주 및 세포배양</h2><p>실험에 사용한 세포주는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받은 mouse 섬유아세포인 NIH3T3 세포를 이용하였고, 이세포들은 plastic petri dishes상에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\) \(\mathrm{~CO}_{2} \) humidified incubator에서 \( 10 \% \) fetal bovine serum, penicillin \( (100 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \) 및 streptomycin \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 이 존재하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (Life Technologies, Inc.) 조건에서 배양하였고, exponential phase의 세포들을 \( 0.025 \% \) trypsin-EDTA를 이용해서 계대배양을 하였다. 배양액의 \( \mathrm{pH} \) 는 7.2-7.4 로 \( 10 \mathrm{mM} \) HEPES buffer와 \( 0.37 \% \) sodium bicarbonate를 이용해서 적정하였다.</p><h2>Mutagen</h2><p>Methylmethane sulfonate (MMS, Sigma)는 \( 9 \mathrm{M} \) 용액을 DMEM을 이용하여 실험에 유용한 농도로 희석해서 이용하였다.</p><h2>MTT 분석법</h2><p>MTT ((4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltertrazolium bromide) dye assay는 1988년에 Alley등 방법에 의해서 수행하였다. NIH3T3 세포를 96 well pate에 \( 1 \times 10^{3} \) cells \( / \mathrm{ml} \) 씩 각각 triplicate seeding하고 24시간동안 배양 후 serum이 들어가지 않은 배지에서 MMS \( 1 \mathrm{mM}\), 1시간동안 처리 후 phosphate-buffered salin (PBS, \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}\), \(3 \mathrm{mM} \mathrm{~KCl} \), \( 12 \mathrm{mM} \mathrm{~Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\), \( 2 \mathrm{mM} \mathrm{~KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\))로 2회 세척한 후 정상배양액과 정상배양액에 다양한 농도로 소목추출액을 희석해서 6시간동안 배양한다. \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\) MTT dye를 각각의 well에 첨가한 후 4시간동안 배양하고, MTT dye가 함유된 배양액을 버리고 dimethylsulfoxide (DMSO)로 살아있는 세포를 용해시켜 ELISA reader로 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p><h2>세포형태관찰</h2><p>세포 수 \( 4 \times 10^{5} \)을 \( 35 \mathrm{mmdish} \) 에서 배양하고, MMS \( 1 \mathrm{mM} \), 1시간동안 처리한 후 PBS로 2회 세척한 후 정상배양액과 정상배양액에 다양한 농도로 소목추출액을 희석해서 6시간동안 배양하고, 대조군으로 MMS를 처리하지 않은 세포에 소목추출액을 처리하였다. 위상차현미경을 이용하여 세포형태를 관찰하였다.</p><h2>세포고사형태관찰</h2><p>세포형태관찰과 마찬가지의 방법과 같이 세포에 소목추출액을 처리하고, \( 0.025 \% \) trypsin-EDTA를 이용하여 단세포화 시킨 후 \( 15 \mu \mathrm{M} \) AO(acridine orange)로 염색하였다. 이세포들을 Zeiss Axioskop 2 Plus fluorescence microscope의 fluorescence filter (excitation \( 450 - 490 \mathrm{nm}\) 그리고 dicroic \(510 \mathrm{nm} \) )와 long-bond-pass emission filter \( 520 \mathrm{nm} \)를 이용해서 살아있는 세포들의 핵을 염색해서 관찰하였다.</p><h2>DNA fragmentation 분석법</h2><p>세포형태관찰과는 달리 \( 60 \mathrm{mmdish} \)에서 소목추출액을 처리하고 수거하여 \( 1000 \mathrm{rpm} \)에서 2분동안 원심분리 한다. 상충액을 제거하고 PBS로 2회 세척하고, proteinase K reaction buffer \(( 10 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\)\((\mathrm{pH} 8.0 \)), \(0.5\%\) SDS를 넣고 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 반응시켰다. Phenol/chloroform으로 2회 가하여 수층을 회수하고, 수층의 2배의 \( 95 \% \mathrm{~EtOH} \) 를 넣고 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간동안 DNA를 침전시켰다. 공기 건조로 완전히 말린 후 TE buffer \( (\mathrm{pH} 8.0\)) 을 이용하여 녹인다. \( 1.5 \% \) 아가로스 겔에 DNA를 전기영동하고 EtBr로 염색한 후 UV-transilluminator에서 확인하였다. \(200\mathrm{bp} \) 간격의 DNA ladder가 관찰되는지 여부로 세포고사 유도를 확인하였다.</p>
실험에 사용할 소목을 추출한 대학 이름은 어떻게 될까?
조선대학교