<h1>결과 및 고찰</h1><p>지금까지 포유동물에는 Wee1A, Wee1B 그리고 Myt1, 3 가지 종류의 Weel kinase가 존재한다고 알려져 있다. 생쥐의 Wee1A 단백질과 Wee1B 단백질은 \( 26 \% \)의 아미노 도메인 상동성을 갖고, \( 38 \% \)의 카로복실 도메인, kinase 활성을 갖는 중간 도메인은 매우 높은 \( 73 \% \)의 상동성을 갖는다. 그러나 Myt1 인산화효소는 kinase 도메인을 제외하고는 다른 Wacl kinase들과 거의 상동성을 나타내지 않는다(Fig. 1). V5가 달린 Wee1A, B 그리고 Myt1 kinase를 Hek293 세포에 형질전환 시킨 후 세포내의 위치를 관찰하였을 때, Wee1A와 Wee1B는 핵 내에 주로 존재하는 반면에 Myt1 kinasc는 주로 핵 외부의 ER부위에 존재하였다(Fig. 2). 이는 Wee1A와 Wee1B에만 nuclear localization signal (NLS)로 추정되는 아미노산 서열이 존재하고 Myt1에는 존재하지 않는다는 사실과 일치한다. 그러므로 본 연구에서는 주로 Wee1A와 Wee1B를 비교하여 그들의 차이점을 규명하고자 하였다.</p><p>Wee1A와 Wee1B의 차이점을 규명하고자 각각의 유전자를 in vitro에서 mMessage mMachine \( { }^{\mathrm{TM}} \)을 이용하여 mRNA로 전사한 후, 일정량의 mRNA를 발톱개구리의 stage IV 난자에 미세 주사하였다. 개구리의 난자는 세포주기가 G2의 마지막 상태에 정지 되어있는데, 분리된 난자에 progesterone, insulin 또는 insulin like growth factor(IGF)를 처리하면 세포주기가 재개된다. 개구리 난자의 세포주기 재개는 동물극쪽에 생성되는 백색 반점의 유무로 관찰할 수 있다. 각각 다양한 양의 Wee1A 또는 Wee1B mRNA를 주사한 후 단백질이 합성되고 축적될 수 있도록 16시간을 배양하였다. 그 후 각자의 난자에 \( 500 \mathrm{ng} \)의 progesterone을 처리하고, 8 시간 후 난자를 채집하여 단백질의 양을 Westem blot을 이용하여 분석하였다(Fig. 3). Wee1 인산화효소는 세포주기 억제 호소이므로, Wee1A나 Wee1B를 주사한 경우 progestereon에 의해 유도되는 난자세포주기의 재개가 주사한 mRNA의 농도에 비례하여 지연됨을 확인 할 수 있었다(data not shown). 비록 동일양의 mRNA블 주사하였지만 단백질의 발현 정도에는 차이가 있었다. 동일한 vector에 동일한 promotor, 그리고 동일한 3' untranslated region을 이용하여 클로닝을 하였으므로, 이러한 효과는 발현의 차이라는 보다는 발현된 후 단백질의 안정성의 문제라고 사료되었다. 특히 Wee1A의 경우 progesterone 처리 후(세포주기가 재개된 후) 대부분의 단백질이 분해되었고, 일부 단백질은 SDS-PAGE상에서 이동도가 감소하여 더 커다란 크기로 나타나는 것을 볼 수 있다. 이러한 단낵질의 SDS-PAGE상에서의 이동도의 감소 현상은 주로 단백질의 인산화 또는 단백질 분해를 위한 ubiquitina-tion에 의해 일어난다. 단백질의 인산화 정도를 측정하기 위해서 각각의 단백질을 과발현한 후 V5 항체를 이용하여 면역침전법을 수행하였다. 그 후 세포주기 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PKA와 [ \( \left.\gamma^{32} \mathrm{P}\right] \)ATP를 이용하여 PKA에 의한 인산화 정도를 측정하였다(Fig. 4A). 기존에 Wee1B는 PKA에 의해 인산화된다는 보고가 있었으므로 PKA에 의한 Wee1A의 인산화를 관찰하였다. Weel 인산화효소는 자기인산화활성(autophosphorylation activity)을 가지고 있으므로, PKA를 첨가하지 않은 경우에도 Wee1A가 인산화가 됨을 볼 수 있었으나(Fig, 4A, 5,6,8 lanc), PKA를 첨가한 경우 인산화가 증가함을 관찰할 수 있었다.(Fig. 4A, 7 lane). 이러한 인산화는 잘 알려져 있는 PKA의 억제제인 H89를 처리하면 관찰할 수 없었으므로(Fig. 4A, 8 lanc), Wee1A의 인산화는 PKA에 특이적임을 알 수 있다. 이를 확인하기 위하여 in vitro 전사, 해독을 통하여 \( S^{35} \)-Methione이 함유된 단백질을 합성하고 여기에 PKA를 첨가하여 인산화 반응을 시켰을 경우, SDS-PAGE상에서 Wee1A와 Wee1B 단백질의 이동도가 감소함을 관찰 할 수 있었다(data not shown). 이러한 결과는 PKA에 의해 Wee1A와 Wee1B가 인산화될 수 있음을 증명하는 것이다. 그러나 Wee1A의 PKA에 의한 인산화정도가 미비하므로 다른 인산화효소가 작용하는지를 관찰하였다.</p><p>Wee1A의 경우 세포주기 조절에 관여한다고 알려진 polo like kinase (plk)에 의하여 인산화된다는 것이 보고된 바 있으며, 또한 음성되먹임작용(negative feedback)에 의하여 WeelA의 기질인 \( \mathrm{Cdc} 2 / \mathrm{cyclinB} \) 복합체에 의해 인산화된다는 것이 알려져있다. 이에 본 연구에서는 세포 주기, 세포 증식에 관여한다고 알려진 Akt와 AuroraA 인산화효소 \( [6,9] \)에 의한 Wee1의 인산화를 측정하였다. 이를 위하여 Wee1A 와 Wee1B를 Hek293 세포에 형질전환하고 Akt 유전자를 동시형질전환한 후, 면역침전법을 수행하였다. 분리된 면역침전법을 SDS-PAGE상에서 분리한 후, Akt substrate specific 항체를 이용하여 인산화 정도를 측정하였다. 그림 3B에서 보이는 것처럼 Akt는 Wee1A들 인산화시키고 Wee1B는 인산화시키지 못하였다. 이러한 결과는 Wee1A와 Wee1B의 인산화에 의한 조절 기작이 상이함을 나타낸다. 그러나 Aurora A kinase는 Wee1A, Wee1B 모두를 인산화시키지 않았다 (date not shown).</p>
연구의 목적은 Wee1A, Wee1B와 관련하여 무엇을 밝히는 것인가?
차이점