<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>본 실험에서 사용한 중국산 황금 \( 10 \mathrm{~kg} \)은 2017년 1월 군내 유통 도매 경동시장 진흥건재약업사에서 구매하여 확보하였고, 한국생명공학연구원 한국식물추출물은행(Korea Plant Extract Bank)에서 동정하고 식물표본실에 증기표본을 보관하였다(PBC-448,485).</p><h2>시약 및 기기</h2><p>Ethanol (EtOH) 용매(SK chemical, KR)는 추출물 제조를 위해 사용하였으며, 타겟 화합물 분석과 분리를 위해 high performance liquid chromatography (HPLC)용 methanol (MeOH, Honeywell, Moris Plains, NJ, USA)과 acetonitrile (ACN), Honeywell, Moris Plains, NJ, USA), formic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), leucine enkephalin (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하여 ultraperformance liquid chromatographyequadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTof-MS, Waters, Milford, MA, USA), PDA (Waters, Milford, MA, USA), HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), preparative-HPLC (PLC, Gilson, Middleton, WI, USA), Armen MPLC (Gilson, Middleton, WI, USA), K-Preb LAB MPLC (YMC, Kyoto, Japan) 기기를 이용하여 진행하였다. 구조분석을 위해 Bruker Biospin Advance Ⅱ 900 NMR spectrometer ( \( { }^{1} \mathrm{H} \) NMR \( 900 \mathrm{MHz}{ }^{13} \mathrm{C} \) NMR \( 225 \mathrm{MHz} \) ), Bruker AVANCE Ⅲ HD 700(\({ }^{1} \mathrm{H} \) NMR \( 700 \mathrm{MHz},{ }^{13} \mathrm{C} \) NMR \( \left.175 \mathrm{MHz}\right) \) Bruker AM400 ('H NMR \( 400 \mathrm{MHz}{ }^{13} \mathrm{C} \) NMR \( 100 \mathrm{MHz} \), Billerica, MA, USA)에 DMSO- \( d_{6} \) (Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA, USA)를 사용하여 분석하였다.</p><h2>황금 추출물 제조</h2><p>음건한 황금 \( 10 \mathrm{~kg} \) 다목적 분쇄기(DSMP-370, Korea)를 이용하여 잘게 분쇄하고 \( 94 \% \) ethanol (\( 94 \% \) EtOH)을 가하여 실온에서 24시간 3회 반복 추출한 후 여과하였다. 얻어진 여액을 감압 농축하여 \( 94 \% \) EtOH 추출물(\( 1.14 \mathrm{kg}\), 수율 \( 11.4 \% \))을 얻었다.</p><h2>UPLC-QTof-MS 분석조건</h2><p>황금 칼럼분획물의 지표물질의 정성분석을 위해 UPLC-QTof-MS 분석은 BEH\( \mathrm{~C}_{18}\) (\(2.1 \times 100 \mathrm{~mm}\),\( 1.7 \mu \mathrm{m} \)) 칼럼관과 PDA 검출기, MS를 장착한 UPLC에 유속 \( 0.4 \mathrm{mL} / \mathrm{min} \) , 용매는 \(0.1 \% \) formic acid가 포함된 증류수 (A)와 ACN (B)을 사용하여 수행하였다. UPLC 이동상의 용매조성은 \(0.0-1.0 \mathrm{min} \) \(20\%\) B, \(1.0-11.0 \mathrm{min} \) \(60 \%\) B, \(11.0-12.0 \mathrm{min} \) \(60-100\%\) B, \(12.0-13.4 \mathrm{min} \) \(100\%\) B, \(13.4-13.5 \mathrm{min} \) \(20\%\) B 조건을 이용하였으며, 시료는 \( 2 \mu \mathrm{L}\) (\(1\mathrm{mg}/ \mathrm{mL}\)) 주입하여 분석을 실시하였다.</p><h2>HPLC-DAD 분석조건</h2><p>황금의 지표성분 화합물들의 위치를 확인하기 위해, HPLC에 YMC ODS AQ (\( 250 \times 4.6 \mathrm{~mm}\), \(5 \mu \mathrm{m} \)) 칼럼관과 diode array detection (DAD) 검출기를 장착하고 칼럼오븐의 온도를 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지하여 각 분획물에 대한 분석을 진행하였다. A용매는 \( 0.1 \% \) formic acid가 포함된 증류수로, B용매는 \( 0.1 \% \) formic acid가 포함된 \( \mathrm{MeOH} \)으로 준비하였다. HPLC 이동상 조건은 \(0.0-5.0 \mathrm{~min} 50 \% \) B, \(5.0-50.0 \mathrm{~min}\) \(50-75 \% \) B, \(50.0-55.0 \mathrm{min}\) \(75 \% \) B, \(55.0-57.0 \mathrm{~min}\) \(75-50 \% \) B, \(57.0-60.0 \mathrm{min}\) \(50 \% \) B를 유속 \( 1.0 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \)로 흘렸으며, 시료는 \( 5 \mu \mathrm{L}(1 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) \) 주입하여 분석을 실시하였다(Table 1).</p><h2>분취기기 및 개방형칼럼을 이용한 황금 유효분획물 제조</h2><p>Preparative-HPLC에 YMC ODS AQ (\( 250 \times 20 \mathrm{~mm}\), \(10 \mu \mathrm{m} \)) 칼럼관을 장착하여 HPLC와 동일현 분석조건에서 유속을 \( 20.0 \) \( \mathrm{mL} / \mathrm{min} \)로 변경하여 흘렸으며, 시료는 \( 1.0 \mathrm{~mL}(100 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 주입하여 분취를 실시하였다. Armen MPLC에는 YMC ODS AQ (\( 250 \times 50 \mathrm{~mm}\), \(10 \mu \mathrm{m} \)) 칼럼관을 장착하고 초기 이동상 조건을 수정하여 \(0.0-10.0 \mathrm{~min}\) \(40 \%\) B, \(10.0-70.0 \mathrm{~min}\) \(40-60 \% \) B, \(70.0- 72.0 \mathrm{~min}\) \(60-76 \% \quad \) B, \(72.0-95.0 \mathrm{~min}\) \(76-100 \%\) B, \(95.0-100.0 \mathrm{~min}\) \(100 \%\) B, \(100.0-105.0 \mathrm{~min}\) \(100-40 \%\) B, \(105.0-120.0 \mathrm{~min}\) \(40 \%\) B 를 유속 \( 50.0 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) 로 흘렸으며, 시료는 \( 1 \mathrm{~mL} \) 또 \( 7 \mathrm{~mL}(1 \mathrm{~g} / \mathrm{mL}) \) 주입하여 분취를 실시하였다. K-Preb LAB MPLC에는 YMC ODS AQ (\(550 \times 50 \mathrm{~mm}\), \(10 \mu \mathrm{m} \)) 칼럼관을 장착하고 이동상 초기 조건을 수정하여 \(0.0-5.0 \mathrm{~min}\) \(50 \%\) B , \(5.0-15.0 \mathrm{~min}\) \(50-60 \%\) B, \(15.0-35.0 \mathrm{~min}\) \(60-80 \%\) B, \(35.0-55.0 \mathrm{~min}\) \(80-100 \%\) B, \(55.0-57.0 \mathrm{~min}\) \(100 \%\) B, \(57.0-67.0 \mathrm{~min}\) \(100-50 \%\) B, \(67.0-88.0 \mathrm{~min}\) \(50 \%\) B를 유속 \( 80.0 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \)로 흘렸으며, 시료는 \( 10 \mathrm{~mL}(1 \mathrm{~g} / \mathrm{mL} )\) 주입하여 분취를 실시하였다. 개방형칼럼(open column, \( 15 \times 45 \mathrm{~cm} \)) 에서는 추출물 (\( 100.0 \mathrm{~g} \))을 Asahi C18 충진제 (\( 2.23 \mathrm{~kg} \))에 충진하고 이동상 조건을 MeOH과 DW를 혼합하여 \( 50 \%(4 \mathrm{~L}) \rightarrow 70 \%(2 \mathrm{~L}) \rightarrow 100 \%(4 \mathrm{~L}) \)를 흘려 대량 분획물을 얻었다(Table 1).</p>
추출불을 분획하기 위해 사용한게 뭐야?
개방형칼럼