<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물발현 벡터 구축</h2><p>벼 형질전환을 위한 Ti-plasmid는 pCAMBIA2300의 binary 벡터를 사용하였다. Miraculin 유전자(AB512278)는 NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 염기서열 정보를 기반으로 ORF 말단부위에 제한효소 Xho Ⅰ 및 BamH Ⅰ 인식서열을 첨가하여 유전자를 합성하였다(https://www.bioneer.co.kr). 합성한 miraculin 유전자의 총 염기는 \( 727 \mathrm{bp} \)로 개시 및 종지 코돈이 잘 포함되었다. 또한 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위하여 C-말단 영역에 2xFLAG-tag (DYKDDDDK) 서열을 첨가하여 pCAMBIA2300벡터에 클로닝 하였다. 또한 miraculin 유전자 발현을 위해 사용한 프로모터는 Kim 등(2003)이 보고한 고구마 유래 산화스트레스 유도성 SWPA2 (sweetpotato peroxidase anionic 2)를 분양 받아 miraculin 유전자 앞에 클로닝 하였다. 형질전환체 선발을 위한 선발 마커는 bar 유전자를 사용하여 Ti-plasmid 벡터를 완성하였다(Fig. 2A). 구축한 벡터는 electroporation방법에 의해 Agrobacterium tumefaciens 균주 EHA105에 도입하여 초저온 냉동고 \( \left(-80^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에 저장하였고 일부는 식물형질 전환에 사용하였다.</p><h2>형질전환 셀 라인 육성 및 도입유전자 확인</h2><p>형질전환 벼 육성을 위하여 농촌진흥청으로부터 분양 받은 동진 벼(Oryza sativa L. var. Japonica cv. Donginbyeo) 종자를 \( 70 \% \) EtOH에서 30초, \( 2.5 \% \) sodium hypochlorite 용액에서 15분간 소독하였으며, 멸균된 증류수를 이용하여 3회 이상 세척한 후 \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 2,4-D가 포함된 N6 고체배지에 파종하여 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3주 동안 암 배양하였다. 암 배양하여 형성된 callus를 선발하여 \( 100 \mathrm{mM} \) acetosyringon이 포함된 Agrobacterium 현탁액에 담가 10분간 접종한 후 callus를 멸균된 필터페이퍼 위에서 5분간 건조시켜 \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 2,4-D와 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) glucose, \( 100 \mathrm{mM} \) acetosyringon이 포함된 N6 고체배지에 치상하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3일간 공동배양 하였다. 3일 후 감염된 callus는 멸균된 증류수로 3회이상 세척하여 \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 2,4-D와 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) glucose, \(400 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) carbenicillin과 \( 6 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) PPT (phosphinothricin)가 들어간 N6 고체배지에 callus 생장 및 형태를 관찰하여 선발된 형질 전환 셀라인을 2주마다 계대배양하여 육성하였다. 선발된 형질전환 셀 라인은 현탁배양에 이용하였다(Fig. 2B). 형질전환 callus 셀 라인으로부터 miraculin 유전자 도입 여부를 확인하기 위해 선발된 셀라인으로부터 genomic DNA를 분리하여 PCR 분석을 수행하였다. PCR 분석은 SWPA2-Fw (5'-CCAATTAAAGTCCCCAACCA-3')와 Miraculin-Rv (5'-ACGGTGGGACAGAAAACAAG-3') primer set를 이용하였으며, PCR 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 pre-denaturation 시킨 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분간 denaturation, \( 57^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분간 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분간 extension을 30 cycles로 수행하였고, 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 extension을 실시하여 분석하였다(Table 2).</p>
miraculin 유전자는 제한효소 Xho Ⅰ 및 BamH Ⅰ 인식서열을 이용한 유전자 분해를 통해 만들어지는가?
NO