<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>실험에 사용된 현미와 율무는 부산 부전시장에서 한국산 으로 구입하여 세척한 후 동결 건조한 다음 분쇄한 후 각각 5 배의 메탄올을 넣고 3 회 추출하였다. 회전식 진공 농축기(Buchi oil & 461, Switserland)를 이용하여 농축한 후 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 실험에 사용하였다. 세포 배양에 사용된 DMSO의 최종농도는 \( 0.1 \% \) 이하가 되도록 하였다.</p><h2>Ames 돌연변이 유발 실험</h2><p>Salmonella typhimurium TA100은 S. typhimurium LT-2의 histidine auxotroph로서 미국 California 대학의 B.N. Ames 박사로부터 제공받아 정기적으로 histidine 요구성, deep rough \( (rfa)\) 돌연변이, \( uvr B \) 돌연변이, R factor 등의 유전형질을 확인하면서 실험에 사용하였다. 간접 돌연변이 유발물 질인 \( \mathrm{AFB}_{1} \)은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 DMSO에 녹여 실험에 사용하였고 직접 돌연변이원인 MNNG는 Sigma Chemical Co.에서 구입하여 증류수에 녹여 실험에 사용하였다. 간접돌연변이원인 \( \mathrm{AFB}_{1} \)의 경우 활성화를 위하여 Maron과 Ames의 방법에 따라 S9 mixture를 첨가하였다. 항돌연변이 실험은 미리 건열 멸균시킨 glass cap tube에 S9 mix 혹은 phosphate buffered saline(PBS) \( 0.5 \mathrm{ml} \), 하릇밤 배양된 균주 \( 0.1 \mathrm{ml}\left(1 \sim 2 \times 10^{9}\right. \) cells/ml) 와 돌연변이 유발물질 \( (50 \mu \mathrm{l}) \)을 가한 후, 시료를 \( 1.25 \mathrm{mg} / \) plate 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 예비 배양한 다음 histidine/ biotin이 첨가된 top agar \( \left(45^{\circ} \mathrm{C}\right) 2 \mathrm{ml} \) 씩을 가하고 vortex하여 minimal glucose agar plate에 도말하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양한 후 revertant 숫자를 계수하였다. 돌연변이 억제효과의 정도(inhibition rate)는 아래식에 의해 계산하였다.</p><p>Inhibition rate \( (\%)=100 \times[(a-b) /(a-c)] \)</p><p>여기서 a는 돌연변이원에 의해 유도된 복귀돌연변이원수, b는 시료를 처리하였을 때의 복귀돌연변이의 수이며, c는 돌연변이원과 시료가 없을 경우의 자연복귀돌연변이원의 수이다.</p><h2>암세포 배양 및 증식 억제 실험</h2><p>한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 인체 위암세포(AGS)와 인체 결장암세포(HT-29)를 분양받아 본 실험실에서 배양 하면서 실험에 사용하였다. AGS와 HT-29 암세포를 100 units \( / \mathrm{ml} \)의 penicillin-streptomycin과 \( 10 \% \) fetal calf serum (FCS)가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. 배양 중인 세포를 1 주일에 2 번 refeeding하고 1 주일 후 PBS로 세척한 뒤 \( 0.05 \% \) trypsin- \( 0.02 \% \) EDTA (Gibco Co., USA)로 부착된 세포를 분리하여 원심분 리 한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 \( 75 \mathrm{~mm}^{3} \) cell culture flask에 \( 10 \mathrm{ml} \)씩 일정수 분할하여 주입하고 계속 6~7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. 계대 배양 시 각각의 passage number를 기록하였고 passage number가 10회 이상일 때는 새로운 암세포를 액체 질소 탱크로부터 꺼내어 다시 배양하여 실험하였다. 암세포 증식 억제 실험은 암세포 배양과 동일한 방법으로 배양하되 원심분리한 후 집적된 암세포를 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 24 well plate에 20,000 cells/ \(\mathrm{ml} \)의 농도를 seeding하여 18시간 배양하였다. 각 시료 유기용매 추출물을 첨가하여 2일마다 배지로 교체해서 배양 6일 후에 증식된 세포를 \( 0.05 \% \) trypsin- \( 0.02 \% \) EDTA로 분리 하여 각 세포수를 hemocytometer로 측정하여 대조군과 비교하여 암세포 성장 억제효과를 관찰하였다.</p><h2>통계 분석</h2><p>실험 결과는 mean\( \pm \)SD으로 나타내었고 분석된 실험 데이터는 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 oneway ANOVA를 실시하여 유의성이 있을 경우에 post-hoc test로 Duncan's mutiple range test를 실시하여 \( 95 \% \) 수준에서 유의성을 검증하였다.</p>
MNNG는 식염수에 녹여 실험에 사용하였나요?
NO