<h1>결과 및 고찰</h1><p>곤충은 지구상에서 가장 많은 종과 수를 유지하고 있는 생물로서, 이의 다양성을 이용하여 고효율 효소, 생체활성물질, 바이오소재, 및 신소재의 개발에 많은 노력과 투자를 하고 있다. 본 연구는 자생하고 있는 곤충의 추출물을 이용한 항산화 생물소재 개발의 일환으로서 약 200여종의 곤충을 채집하고 이의 4가지 용매 추출물에서 항산화활성의 프로파일을 검토하였다. 항산화 실험은 방법과 실험의 종류가 매우 다양하며, 빠른 시간에 할 수 있어서 예비 스크리닝에 가장 많이 쓰이는 방법 중의 하나로 알려져 있다. 본 실험에서는 최초 스크리닝에는 200여종의 곤충을 다양한 추출 용매를 이용하여 추출한 다음, DPPH 및 FRAP assay, hydroxy radical scavenging assay를 통하여 항산화 효과를 비교하고자 하였다. DPPH는 매우 안정한 free radical로서 \( 517 \mathrm{~nm} \) 에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물이다. DPPH가 가진 radical은 알코올등의 유기용매에서 매우 안정하며 항산화 기작 중 proton-radical scavenger에 의하여 탈색되기 때문에 항산화 활성을 육안으로 쉽게 관찰할 수 있을 뿐 아니라 광홉수가 되는 비율을 이용하여 항산화제의 활성을 나타낼 수 있다. 실험결과 대조군으로 사용된 BHT는 약 \( 90 \% \)내외의 활성을 나타내었으며, 땅강아지 추출물의 경우 4종의 추출용매에서 약 \( 40 \% \) 내외의 DPPH 활성을 나타내었고, 추출 용매별로는 에탄올, DW, DMSO, 메탄올의 순서로 활성이 높게 나왔다.</p><p>FRAP활성은 화합물의 환원력(ferric reducing ability)을 측정하는 것으로 ferric tripyridyltriazine ( \( \mathrm{Fe}^{\mathrm{Ⅲ}} \)-TPTZ)가 환원 제(antioxidant)에 의해서 파란색의 ferrous tripyridyltriazine ( \( \mathrm{Fe}^{\mathrm{Ⅰ}} \)-TPTZ)로 될 때 홉광도를 측정하여 환원력을 알아보는 것으로 본 실험에서 땅강아지 추출물의 활성을 15 분의 경과했을 때 FRAP value를 구하여 확인한 결과 에탄올, DW, DMSO, 메탄올의 순으로 활성이 나타났다. 시간에 따른 FRAP의 활성은 시간이 지남에 따라 활성이 점진적으로 증가하는 것을 알 수가 있었다. 시간에 따른 활성의 증가의 폭은 에탄올 추출물에서 높게 나타났는데 약 8분 이전에는 DW 의 활성이 높게 나타났다. 이후 에탄올의 활성이 더 높게 나타나는 것을 알 수 있었다. 땅강아지의 antioxidant protein (ATX1)와antioxidant enzyme peroxiredoxin (Prx)의 발현 패턴을 과산화수소를 처리하여 확인해 본 결과, 과산화수소 처리 후 시간에 따라 증가하는 현상을 보여주었는 데 이는 산화스트레스에 대한 반응으로 나타나는 것으로 보고된 바 있다. 곤충 추출물 여러 종을 조사해 본 바에 의하면, 땅강아지 추출물의 활성은 뽕나무하늘소(Apriona germari)와 함께 Hela cell (Human epithelial carcinoma cell line)의 증식을 빠르게 증가시켜 주는 것으로 나타났다. 이 외에도 신혈관 형성을 증가시키며, keratinocyte의 wound healing을 증가시켜주는 효과가 있는 것으로 나타났다. 본 실험에서는 항산화와 관련하여 positive control로 이용되는 butylated hydroxy toluene (BHT; \(5 \mathrm{mM}) \)를 이용한 비교 실험을 하였는데, BHT의 경우 DPPH 활성실험에서는 큰 효과를 나타내었지만 FRAP 활성실험에서는 낮은 활성을 보이는 것으로 보아 실험 원리에 따른 차이로 사료된다. 다만 산화제의 종류 및 작용 기작이 여러 경로를 경유하게 됨으로 본 실험에서 나타났듯이 화합물 수준에서의 실험은 어느 정도 한계를 가지는 것으로 보여 진다. 땅강아지 추출물의 hydroxy radical scavenging activity 정도를 알아본 결과 DW와 메탄올 추출물에서 다소 높은 활성이 나타났다. 항산화 실험에서 용매에 따른 추출물의 항산화 활성이 매우 다양하게 나타나는 것을 알 수 있는데, 이는 추출 용매의 화학적 특성과 관련이 있는 것으로 PI (polarity index)값에 따른 차이로 사료 된다. 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 세포의 대사에 매우 유해한 물질이나, 세포내 신호 전달 및 조절 과정 중에 많은 부분을 담당하는 것으로 알려져 있다. 과산화수소는 활성산소종의 일종으로 세포 내에서 다양한, 생리학적 조절(pathophysiologrical conditions)부분 을 담당하고 있는데, 염증 반응(inflammation), nitric oxide(NO) 합성 등이 대표적이다. 산화물에 의한 영향으로 최근 천식과 관련된 보고가 많은데, 산화물의 경우 주로 호홉기를 통하여 체내로 들어오게 된다. 이 경우 산화제의 농도가 놓아지면 면역관련 세포인 Th1, Th2 세포의 비율에 차이가 생겨 천식으로 발전 할 수 있다고 추정된다. 뿐만 아니라 체내에서 정상수준을 벗어난 산화물은 각종 호르몬, 사이토가인 등에 영향을 주어 여러 종류의 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 산화물의 억제제로는 체내에 superoxide dismutase라는 물질이 있는데 체내 신진대사의 능력에 따라 그 활성이 좌우된다. SOD는 산화제를 과산화수소로 변환시키고 최종적으로 무해한 형태의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 등의 물질로 만든다. 최근 이러한 작용을 외부에서 보충해주는 형태의 항산화제에 대한 개발이 많이 진행 중에 있는데, 이러한 연장선에서 곤충자원은 천연물로서 오랫동안 이용되어져 오면서 이용방법, 부작용 등 많은 검증과정을 거쳤다고 볼 수 있다.</p><p>Oilive oil의 구성 물질인 tyrosol과 \( \beta \)-sitosterol을 이용한 항산화관련 실험 중 RAW \( 264.7 \) 세포주에서 tyrosol과 sitosterol을 처리하면 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 Cox-2의 단백질 발현이 감소하는 것으로 알려져 있다. Cox-2의 활성은 ROS에 의해 증가하는 것으로 보고되어 지고 있는데, 항산화제는 ROS의 활성을 감소시켜 Cox-2의 활성을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 천연항산화 제인 resveratrol은 ROS를 감소시킴으로서 Cox-2의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 Cox-2의 활성을 알아보고자 Cox-2 promoter sequence 부분을 이용하여 luciferase 활성 실험을 수행 하였다. 땅강아지 물 추출물의 경우 Cox-2의 활성이 2.9배 정도 증가하는 것으로 나타났는 데, 이는 추출물 자체에 Cox-2의 활성을 높이는 물질이 포함되어 있는 것으로 사료 되는데 이에 대한 연구는 추후 계속 진행 되어야 한다고 본다. 반면에 DMSO 추출물에서는 약 \( 70 \% \) 정도 활성이 감소하는 것으로 나타났으며, 에탄올 추출물에서의 Cox-2의 활성은 약 \( 40 \% \) 정도 억제 하는 것으로 나타났다. 추출 용매에 따라 다른 활성을 보여 주었는데 이는 용매의 특성에 따른 경과로 보여 진다. Cox-2는 염증반응 이외에도 Alzheimer's disease (AD)와 관련이 있다는 보고가 있는데, 항염중 약물은 AD의 진행을 억제한다는 연구결과가 보고되고 있다.</p><p>산화제는 세포내에서 신호전달, 면역작용에의 관련 등 많은 부분을 담당하고 있다. 하지만 많은 경우 산화스트레스를 유발하여 각종 질병을 유도하는 것이 주지의 사실로서 이를 억제하기 위한 다양한 방법들이 보고되고 있다. 노화 과정을 거치면서 산화스트레스를 제거해 주는 능력이 현저히 떨어지는 경향을 보이게 되는데 이를 대처하는 방법으로 항산화제를 섭취하는 방법이 있고, 이에 대한 개발 및 산업화한 시장이 성장하고 있다. 항산화제의 공급원으로서는 식품에서부터 합성 화합물까지 많은 종류가 개발되어지고 있다. 개발 과정에서 효능과 안전성 부분에서 많은 노력이 필요한데, 특히 안전성 부분에 많은 시간이 필요한 것이 사실이다. 최근에는 이러한 문제를 피하고자 이전부터 많이 이용되어진 식품, 한약재 등에서 유효한 물질을 연구하는 경향이 두드러지고 있다. 본 연구에 사용된 땅강아지 또한 국내는 물론 중국, 유럽 등에서 예로부터 약제로 많이 이용되어져 왔으며, 이에 대한 효능 또한 피부질환에서부터 염증 질환까지 다양한 용도로 사용되어져 왔다. 본 연구결과 땅강아지 추출물의 항산화 활성 또한 약재로서 그 기능을 가지리라 사료된다.</p>
지구에 존재하는 생물 중 가장 많은 종과 수를 유지하는 것은 무엇이니?
곤충