<p>CRP 단백질의 분리는 crp 유전자가 expression vector인 pRE2에 클론된 pRE2crp와 온도에 민감한 repressor 단백질을 포함하는 pRK248을 이용하였다. 그리고 숙주세포로 CA8445를 이용하였으며 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양한 후 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에 서 heat induction하여 대량으로 생산하였다. 이어 P-11, Hydroxyapatite, CM sephadex, Affi-gel blue 등의 수지를 이용하여 분리한 뒤 \( 12.5 \% \) SDS-PAGE로 확인한 결 과 \( 95 \% \) 이상 순수하였다. 그리고 분리된 CRP의 확인을 위하여 cAMP의 존재 유무에 따라 proteolytic di-gestion을 통하여 CRP를 확인하였다.</p><p>CRP 절단반응은 TB[transcription buffer, \( 40 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl}\left(\mathrm{pH}\right. \) 8.0), \( 100 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}, 10 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2}, 1 \mathrm{M} \) DTT, \(5\%\) glycerol]에서 CRP 단백질과 chymotrypsin의 무게 비율을 200: 1 이 되게 사용하였다. cAMP의 농도는 각각 0.1,0.2, 0.3,0.5,1,3 그리고 \( 5 \mathrm{mM} \) 이며 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 항온 후 trypsin에 의한 절단실험에서 전혀 \( \alpha \)-CRP 생성을 관찰할 수 없었다. 이것은 야생형과 S83G CRP 모두 cGMP의 결합에 의한 CRP의 구조가 CAMP 결합에 의한 구조와 다르다는 것을 의미한다.</p><p>단백질 변성실험은 \( 222 \mathrm{~nm} \) 의 고정된 파장에서 온도를 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 \( 1^{\circ} \mathrm{C} / \mathrm{min} \) 일정하게 증가하면서 S83G CRP에 대한 변성과정을 molar ellipticity 값을 측정하였다. 그리고 그래프에 나타내는 모든 값들은 용액 자체의 기여를 제거한 순수한 CRP 단백질에 의한 값들이다. Molar ellipticity는 Jasco 710 spectrapolarimeter(Basic Science Research Institute)로 측정하였으며 path length \( 0.1 \mathrm{~mm} \) 인 round cell을 사용하였다. 용액은 TB를 사용했으며 사용된 단백질의 량은 \( 0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 이고 cAMP의 농도는 각각 0,0.1 그리고 \( 5 \mathrm{mM} \) 이다. 온도평형을 위해 샘플을 cell에 주입한 후 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 항온하였다. 그리고 샘플의 안정성과 잡음 정도를 보기 위해 \( 200 \sim 260 \mathrm{~nm} \) 파장범위에서 CD spectra와 HT를 동시에 5회씩 측정하였다.</p><p>Fig. 3에서 보듯이 S83G CRP에서 일반적으로 온도에 따른 단백질의 변성에서 볼 수 있는 그래프를 보여준다. 그리고 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 가까이에서 급격한 molar ellipticity 값의 상승을 볼 수 있다. 이 결과는 UV spectrophotometer을 이용하여 일정한 파장에서 온도를 증가시키며 측정한 CRP 단백질의 변성 그래프와 동일한 경향을 보여준다. 또한 Fig. 4 에서 \( 0.1 \mathrm{mM} \) cAMP가 존재할 때 S83G CRP의 변성그래프가 Fig. 3과 비교해서 오른쪽으로 이동했음을 볼 수 있다. 이것은 cAMP의 결합으로 CRP의 N-terminal domain 부위가 열에 안정한 즉 compact한 구조로 변화되었음을 의미한다. 그리고 Fig. 5 에서 \( 5 \mathrm{mM} \) cAMP가 존재할 때 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 molar ellipticity가 계속 증가하는 그래프를 나타내는 것으로 보아, 단백질의 변성이 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 보다 더 높은 온도에서 끝남을 예상할 수 있다. Analytical gel chromatography 기술[6]을 이용한 연구에 의하면 낮은 cAMP 농도에서(micromolar cAMP 농도) 거의 elution volume의 변화를 관찰 할 수 없었으나 높은 농도의 cAMP에서(millimolar cAMP 농도) 아주 뚜렷한 변화가 관찰되었다. 이것은 첫 번째 CAMP가 CRP의 결합부위인 cAMP binding pocket에 결합할때는 거의 구조적인 변화가 크지 않으나 추가적인 cAMP의결합으로 매우 구조적으로 압축된 compact한 구조로 변화되었음을 의미한다.</p>
단백질 변성실험 샘플은 CD spectra와 HT를 1회씩 측정하였나요?
NO