<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>Lycopene은 Sigma-Aldrich (USA)사에서 제공하는 시약을 구입하여 DMSO에 녹여 사용하였다.</p><h2>세포배양</h2><p>소 대동맥 내피세포(Bovine Aortic Endothelial Cell:BAEC)은 세포 외 기질에 부착하여 자라는 부착세포(adhesion cell)로, 소의 대동맥에서 추출한 후 계대 수 3에서 8사이의 일차세포를 실험에 사용하였다. BAEC은 \( 20 \% \) 소태아혈청 (fetal bovine serum: FBS, Wel GENE Inc., Korea)과 \( 0.5 \% \) L-Glutamine, \( 0.5 \% \) 항생제(streptomycin/penicillin)가 포함된 DMEM (glucose \( 1 \mathrm{~g} / \) liter Wel GENE Inc.)을 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다.</p><p>THP-1 (human acute monocytic leukemia cells)은 부유세포(suspension cell)로 T-25 flask에 배양하였으며, \( 10 \% \) 소태아 혈청과 \( 0.5 \% \) 항생제(streptomycin/penicillin)가 포함된 RPMI1640 (Wel Gene Inc.)를 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배 양하였다.</p><h2>세포성장 실험</h2><p>세포성장은 WST (high sensitive water soluble tetrazolium salt)를 이용하여 살아있는 세포내의 dehydrogenase와 반응 정도를 측정하여 평가하였다. 혈청기아 상태인 DMEM에 BAEC을 16시간 동안 배양한 후, 다양한 농도의 lycopene을 처리한 뒤, 시간 별로 microplate leader (BIO-RAD, USA)를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>세포사멸 실험</h2><p>전면 성장한 BAEC을 \( 0.5 \% \)FBS가 첨가된 DMEM에 16 시간 동안 배양한 후 다양한 농도의 lycopene을 처리하였고, 양성 대조군으로 etoposide (Sigma-Aldrich) \( 100 \mu \mathrm{M} \)을 처리하였다. 총 처리 시간은 24 시간 이었고, 시간 경과에 따른 변화를 현미경으로 관찰하여 기록하였으며, 세포사멸 세포(탈착, 원형인 부유 상태에 있는 세포)를 계산하여 세포사멸 비율을 결정하였다.</p><h2>세포이동 실험</h2><p>전면 성장한 BAEC에 \( 2 \mathrm{mM} \) thymidin (Sigma-Aldrich)를 24시간 동안 처리하여 세포의 성장을 중지시킨 후 PBS (phosphate buffered saline)로 2회 세척하였다. 그 후 스크래퍼(scraper)를 이용하여 창상선을 만든 후 다시 PBS로 2회 세척한 뒤 각 농도 별로 lycopene을 처리하여 24시간까지 시간 별로 확인하였다. 세포이동 정도는 동일 배율로 관측되는 현미경 시야 내의 일정한 크기의 구역(visual field)으로 이동한 세포 수를 세어 평가하였다.</p><h2>세포부착 실험</h2><p>BAEC을 전면 성장 시킨 후에 혈청 기아배지를 이용하여 16 시간 동안 추가로 배양했다. 또한 THP-1세포를 배양한 후 \( 10 \mu \mathrm{M} \)의 Calcein AM (Sigma-Aldrich)을 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 45분간 염색시키고, PBS를 이용하여 3회 세척하였다. Calcein AM으로 염색시킨 THP-1을 BAEC이 부착된 기판 위에 동량으로 첨가하여, 부착된 THP-1 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다. 부착된 세포와 전체 세포의 비율을 계산하여 정량화 하였다.</p><h2>Western Blot</h2><p>전면 성장한 BAEC에 \( 10 \mu \mathrm{M} \)의 lycopene을 0, 5, 15, 30, 60분 동안 처리한 후 분해 완충액(\( 50 \mathrm{mM}\) Tris, \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \), \( 0.1 \mathrm{mM} \) PMSF, \( 1.0 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{Na} \) Vanadate, \(1\%\) [v/v] Triton X-100, \( 10.0 \% \) Glycerol, \(\mathrm{pH} 7.4\))으로 분해 시킨 뒤 원심분리한 상층액을 획득하여 BCA assay로 단백질 정량을 하고 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리 시켰다. 분리 시킨 단백질은 PVDF (polyvinylidene fluoride) 막으로 이동시켜 고정하고 분석하고자 하는 표적 단백질에 해당하는 1차 항체는 p~eNOS, p~ERK, p~p38, p~JNK (Cell signaling, Danvers, MA, USA) 와 Actin (Santa Cruz, CA, USA)을 표적으로 하는 항체로 원액을 \(1:1,000\) 비율로 희석하여 반응시켰다. 2차 항체는 HRP conjugated goat anti rabbit 또는 mouse 항체 (Millipore, Billerica, MA, USA)를 \(1:2,000\) 비율로 희석한 후 사용하였다. 2차 항체 반응 후 화학발광 검출법을 통해 X-ray film에 발광 부위를 노출한 후 단백질 검출을 하였고, 이를 통해 세포 신호 전달 분자의 활성 변화를 관찰하였다.</p><h2>단백질 인산화 효소 및 산화질소 생산 효소 억제</h2><p>단백질 인산화 효소 및 산화질소 생산효소 억제제를 처리하여 세포성장, 이종세포 간의 부착 및 세포이동에 어떠한 영향을 미치는 지 알아보기 위하여, 혈청기아 상태인 DMEM에 BAEC을 16시간 동안 배양한 후, SB-203580 (\(10 \mu \mathrm{M}\), p38 MAPK 억제자, Enzo Life Sciences, USA), SP-600125 (\( 10\mu \mathrm{M}\), JNK 억제자, Enzo Life Sciences), PD-98059 (\( 20\mu \mathrm{M}\), ERK 억제자, Enzo Life Sciences) 그리고 L-NAME (\( 2.5\mu \mathrm{M}\), eNOS 억제자, Sigma-Aldrich)의 인산화 억제제를 1시간 동안 처리 한후 lycopene \( 10 \mu \mathrm{M} \)을 처리하여 세포성장 및 세포이동 실험을 전에 기술한 방법과 동일하게 수행하였다.</p><h2>통계분석</h2><p>실험결과는 mean\( \pm \)S.E로 나타내었고 분석된 데이터는 실험자료로부터 one-way ANOVA를 이용하여 유의성이 있을 경우 post-hoc test를 실시하여 \( 95 \% \) 수준에서 유의성을 검증하였다.</p>
Lycopene을 어디에 녹여서 사용해야해 ?
Lycopene