<h2>LDH 동위효소의 열에 대한 안정성</h2><p>대구 간조직을 thermostatic circulator를 사용하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 를 유지시키면서 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 및 60 분간 열처리 한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 방치시킨 다음 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(20,000 \times \mathrm{g} \)에서 1시간 동안 원심분리하여 상등액을 얻은 후 효소활성을 측정하고 단백질을 정량하였으며, 전기영동을 실시한 후 densitogram을 얻어 하부단위체 A, B 및 C가 불활성화되는 정도를 측정하였다.</p><h2>LDH 동위효소의 정제</h2><h3>열처리 및 affinity chromatography</h3><p>대구 간조직은 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 25 분간 열처리하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 방치한 후, 원심분리하여 변성된 단백질을 제거하고 상등액을 affinity chromatography 시료로 사용하였다. Oxamate gel의 준비는 \( \mathrm{O}^{\prime} \) Carra의 방법을 변형하여 실시하였다. \( 0.5 \mathrm{M} \mathrm{} \) KCl과 \( 0.2 \mathrm{mM} \mathrm{} \) NADH를 첨가한 칠성장어 간조직 및 대구 간조직은 \( 0.2 \mathrm{mM}\) NADH 를 함유한 \( 0.05 \mathrm{M}\) potassium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 6.85\), 이하 buffer로 칭함)로 평형시킨 oxamate column \( (25 \times 85 \mathrm{~mm}) \) 에 각각 가하였다. Column으로부터 단백질이 용출되지 않을 때까지 \( 0.2 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{} \) NADH를 함유한 buffer로 씻어준 후, \( 1.6 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NAD}{ }^{+} \)를 함유한 buffer와 buffer를 차례로 유입시키면서 용출액을 \( 2.5 \) \( \mathrm{ml} \) 씩 분획하였고, 각 분획은 LDH 동위효소의 활성을 측정하고 단백질을 정량하여 elution profile을 작성하였다. 칠성장어 LDH는 ultrafiltration에 의해 농축하여 정제 용액으로 사용하였고, 대구의 liver-specific \( C_{4} \) 동위효소를 함유한 분획들도 농축하고 \( 0.05 \mathrm{M} \) Tris- \( \mathrm{} \) HCl buffer \( (\mathrm{pH} 8.5)\) 로 교환한 후 ion exchange chromatography의 시료로 사용하였다.</p><h3>DEAE-Sephacel chromatography</h3><p>열처리와 affinity chromatography에 의해 부분 정제된 대구 간조직의 LDH 동위효소를 \( 0.05 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer \( (\mathrm{pH} 8.5 \), buffer로 칭함)로 평형 시킨 DEAE-Sephacel column (\( 15 \times 200 \mathrm{~mm} \) )에 가하였다. Buffer \( 10 \mathrm{ml} \)를 유입시킨 후 대구의 LDH 동위효소는 \(0-0.3 \mathrm{M}\)의 \(\mathrm{NaCl}\) 농도구배를 형성한 buffer \( 140 \mathrm{ml} \)를 유입시켰다. 용출액은 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 분획하여 각 분획의 LDH 동위효소 활성을 측정한 다음 elution profile을 작성하였다. 전기영동 후 LDH \( \ \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 포함한 분획만을 모아 농축시킨 후 전기영동 하여 LDH 및 단백질을 염색하여 정제도를 확인하였고 항원 및 시료로 사용하였다.</p><h3>Chromatofocusing</h3><p>Chromatofocusing gel PBE 94 (Pharmacia) column \( (10 \times \) \( 300 \mathrm{~mm} \) )의 상부에 Sephadex G-50을 \( 2 \mathrm{~cm} \) 넣은 후 \( 0.025 \mathrm{M} \) Tris- \( \mathrm{CH}_{3}\) \(\mathrm{COOH} \) buffer \( (\mathrm{pH} 8.3)\)를 bed volume의 15 배 정도를 서서히 가하여 평형시킨 후 칠성장어 간조직 추출액을 가하였다. Polybuffer 96을 14배(1:13) 희석하여 만든 poly-buffer \( 96-\mathrm{CH}_{3}\) \(\mathrm{COOH}\) \((0.0075 \mathrm{M}\), \(\mathrm{pH} 6.0)\) 를 \( 7.8 \mathrm{~cm} / \mathrm{hr} \) 의 속도로 흘려주면서 \( \mathrm{pH} 6.0-8.0\) 의 구배를 형성하였다. 용출액은 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 분획하여 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하고 LDH의 활성 및 \( \mathrm{pH} \)를 측정하여 elution profile을 작성하였다.</p>
칠성장어 LDH는 어떻게 사용했어?
ultrafiltration에 의해 농축하여 정제 용액으로 사용