<h1>재료 및 방법</h1><h2>벼 미숙종자 유전자은행 제작 및 구조분석</h2><p>본 연구의 공시품종은 일품벼이었고, 출수 후 20 일 경과한 미숙종자를 재료로 사용하였다. 출수 후 20 일이 지난 미숙종자틀 채취하여 액체질소에 넣어 냉동시킨 시료를 이용하여 RNA틀 분리하였다. Total RNA 분리는 Trizol 용액(Invitrogen Life Technologies)를 이용하여 분리한 후 PolyA Tract mRNA 분리 시스템 (Promega)으로 Poly(A) mRNA를 분리하였다. cDNA는 ZAP-cDNA Gigapack III Gold 클로닝 키트 (Clontech)를 이용하여 합성하였으며, 합성된 cDNA 는 Uni-ZAP XR 벡터에 클로닝 하였다. 합성된 벼 미숙종자 cDNA 은행의 클론을 집단으로 in vivo excision하여 개별 클론을 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하고 96 well 밀리포어 멀티스크린 (Millipore MANANLY50, MAFBNOB50)을 이용하여 대량으로 플라스미드 DNA를 분리하였다.</p><p>염기서열은 각 클론의 \( 5^{\prime} \) 말단을 BigDye terminator ver 3.1 (Applied Biosystems)과 SK 프라이머 ( \( 5^{\prime} \) - cgctctagaactagtggatc-3')를 이용하여 염기서열분석 반응을 수행한 후 ABI 3100 염기서열분석기 (Applied Biosystems)를 사용하여 결정하였다.</p><h2>Unigene 선발 및 Nipponbare 완전장 cDNA와 비교분석</h2><p>각 클론의 발현유전자 염기서열을 결정한 후 SeqMan 프로그램(DNASTAR)을 사용하여 벡터 염기서열부분과 불명확한 말단 염기서열 및 cDNA가 삽입되지 않은 클론을 제거하고 염기서열 정보분석을 실시하였다. 미숙종자에서 발현하는 unigene은 SeqMan 프로그램을 이용하여 \( 100 \mathrm{bp} \) 씩 \( 95 \% \) 의 상동성으로 분석을 하여 얻어진singleton 유전자와 cluster된 contig 유전자로부터 선발하였다.</p><p>염기서열의 상동성은 국립농업과학원 농업생명공학정보센터 (http://www.niab.go.kr)에 설치된 webblast 및 NCBI의 BLAST (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)을 이용하여 분석하였다.</p><p>일품벼 유래 7,509 개 발현유전자와 일본 -농업생물자원연구소에서 분리한 32,127 개의 Nipponbare 완전장 cDNA와의 비교분석 연구는 BLASTN 분석을 통해 공통 발현유전자틀 선벌하고 아울러 공통 발현유전자에 속하지 않는 일품 벼 유래의 발현유전자들을 분리하였다.</p><h2>벼 염색체 mapping</h2><p>미숙종자에서 발현하는 7,509 개 unigene의 각 염색체벌 위치는 벼 12 개 염색체 염기서열정보를 이용하여 결정하였다. 벼 염색체 염기서열정보는 TIGR Pseudomolecule ver. 5 내 염색체 서열 정보를 기반으로 하였으며, BLASTN 분석을 통해 미숙종자 unigene 염기서열 길이 유사성에 대하여 \( 95 \% \) 이상의 상동성을 나타내는 염색체 내 지역을 판별하여 해당 지역을 unigene 서열의 염색체 내 위치로 결정하였다.</p><h2>NCBI COG DB 기반 유전자 기능분류</h2><p>미숙종자로부터 얻은 7,509 개의 unigene에 대한 발현유전자 기능분류는 NCBI에서 Arabidopsis 등 7개 주요 진핵생물 단백질 서열로부터 구축된 COG (Clusters of Orthologous Groups of proteins) DB 인 KOG DB를 기반으로 하여 수행하였다. 먼저, BLASTX 분석을 통해 KOG DB 내 서열 중, unigene 서열 각각에 대해 가장 높은 유사성을 가지는 단백질 서열을 검색하였다. 이때 검색 조건으로 e-value 가 \( 1.0 \mathrm{e}-20 \) 이하인 것들만을 추출하여 유사서열이 아닌 것이 나올 확률을 최소화하였다. 다음으로 이렇게 얻어진 KOG DB 내 단백질 유사서열의 분류정보를 바탕으로 unigene 서열의 기능 분류를 수행하였다.</p>
본 실험에 사용된 미숙종자들을 어디에 넣어 얼렸는가?
액체질소