<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>까마중(Solanum nigrum L.)의 비효소적 항산화 방어계를 조사하기 위하여 경북 안동시 송천동에서 자생한 것을 2000년 8월에 채취하여 각 부위별로 세척 후 음건 세절하여 사용하였고, 항산화 효소계는 부위별 생체시료를 \( -28^{\circ} \mathrm{C} \)에 냉동 보관하여 사용하였다.</p><h2>비효소적 항산화 방어계</h2><h3>추출</h3><p>비효소적 항산화 방어계의 추출은 음건 세절한 시료 \( 1 \mathrm{~kg} \)을 \( 80 \% \) methanol에 3일간 침지하여 여과한 추출물과, \( 80 \% \) methanol에 6시간 환류 추출한 후 여과한 methanol추출을 각각 농축하여 Fig. 1과 같은 방법으로 분획하였다.</p><p>까마중의 항산화 활성물질의 분리는 \( 80 \% \) methanol로 환류 추출한 ethyl acetate 분획을 silicagel ( \( 110 \mathrm{~g} \)) column chromatography (\(\text{chloroform} \rightarrow \text{chloroform} : \text{methanol} = 7: 1 \rightarrow \text{ethyl acetate} \rightarrow \text{methanol}\))를 실시하여 \( 50 \mathrm{ml} \) 씩 분취하였다. 각 분취액을 TLC (\(\text{thin layer chromatography}, \text{chloroform} : \text{methanol} =7: 1 \) )로 확인하여 유사한 분획끼리 합하고 농축하여 6개의 분획물을 얻었고, 이 분획들의 DPPH free radical 소거활성을 측정하였다. 이 중 활성이 가장 높았던 분획을 Sephadex LH-20 column chroma-tography에 의하여 7개의 소분획으로 분리한 후 DPPH free radical 소거활성을 측정하였다.</p><h3>동정</h3><p>항산화물질의 동정은 GC/MS (Hewlett Packard 6890/ 5973)를 사용하였고, column은 Ultra-2 (Crosslinked \(5\%\) \(\mathrm{PH} \) ME Siloxane), oven 조건은 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 시작하여 분당 \( 2.5^{\circ} \mathrm{C} \) 씩 \( 230^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 승온하였다. 운반기체는 \( \mathrm{He} \) 가스를 사용하였으며, 유속은 \( 0.8 \mathrm{m} \ell / \mathrm{min} \) 로 분석하였다. Fig. 2 는 까마중을 \( 80 \% \) methanol로 6시간 환류 추출 후 Fig. 1과 같이 분획하여 ethyl acetate분획을 농축하여 GC/MS로 분석한 크로마토그램이다.</p><h3>DPPH free radical 소거활성 측정</h3><p>Cuvette 내에 농도별 시료와 \( 300 \mu \mathrm{M} \) DPPH ( 1,1- diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 용액을(홉광도가 1.0 이 되도록 용액을 희석) 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응 후 \( 515 \mathrm{~nm} \) 에서 대조구와의 홉광도 차이를 측정하였다. 시료처리에 의한 억제율은 DMSO (dimethylsulfoxide)가 처리된 대조구와 비교하여 계산하였고, \( \mathrm{IC}_{50} \) (Inhibitor Concentration \(50\%\))값은 \( 50 \% \) DPPH free radical을 제어시키는 시료농도를 계산하였다.</p><h2>효소적 항산화방어계</h2><h3>POD (Peroxidase) 활성</h3><p>POD활성을 측정하기 위한 조효소액의 조제는 식물체 부위 및 시기별로 생체중 각각 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 \( 0.05 \mathrm{M} \) 인산 완충액 (\( \mathrm{pH} 7.8\)) \( 5 \mathrm{~m} \ell \) 과 함께 마쇄한 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 으로 20분간 원심분리 하여 얻었다. POD 활성은 pyrogallol (Sig-ma}, Cot# P-0381)을 기질로 사용하고 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 조효소액에 \( 2.9 \mathrm{ml} \) assay buffer를 첨가하여 \( 420 \mathrm{~nm} \) 에서 20초간 상온에서 홉광도 변화를 조사하였다.</p><h3>SOD(Superoxide dismutase) 활성</h3><p>SOD 활성은 xanthine oxidase와 cytochrome C를 이용한 McCord와 Fridovich[16]의 방법에 따라 측정하였다. 조효소액은 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 \( 0.05 \mathrm{M} \) 인산 완충액( \( (\mathrm{pH} \mathrm{7.8)} 5 \mathrm{m \ell} \) 과 함께 마쇄한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 으로 20분간 원심분리하여 얻어진 상등액을 사용하였다. 활성 측정은 Xanthine / xan-thine oxidase system을 superoxide radicals (\( \mathrm{O}_{2} \cdot \)) 의 공급원으로 이용하여 superoxide radical에 의한 환원속도를 \( 550 \mathrm{~nm} \) 에서 150초간 홉광도 변화를 측정하였다. SOD의 1 unit은 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응을 시작하여 150 초간 \( 550 \mathrm{~nm} \) 에서 홉광도 변화를 조사하여, xanthine oxidase 활성이 \( 50 \% \) 억제되는 것으로 정의하였다.</p><h3>POD, SOD의 동위효소 패턴</h3><p>POD, SOD의 동위효소 패턴은 Beauchamp와 Fridovich의 방법에 준하여 수행하였다.POD의 동위효소 패턴은 \( 12 \% \) acrylamide gel을 사용하여 \( 15 \mathrm{mV} \) 에서 15 분, \( 25 \mathrm{mV} \)에서 45 분간 단백질은 전기영동 하였고, 발색반응은 ben-zidine solution과 \(3\%\) hydrogen peroxide를 \(1:1\)로 혼합해서 사용하였다. SOD의 동위효소 패턴은 \( 13 \% \) acrylamide gel에서 \( 215 \mathrm{~V} \) 로 40 분간 전기영동 하였고, gel의 염색은 negative 염색용액오로 30 분간 암 상태에서 발색반응을 보았다. 단백질 정량은 Bradford 방법에 준하여 실시하였다.</p>
SOD 활성은 xanthine oxidase와 cytochrome C를 이용한 무엇과 Fridovich의 방법에 따라 측정하였는가?
McCord