<h1>결과 및 고찰</h1> <p>의약학적으로 매우 중요한 Helicobacter pylori urease를 재조합 plasmid를 이용하여 다량의 고 순도의 재조합 효소를 정제하는 방법에 관한 연구는 이미 보고한 바 있다. 본 연구에서는 최소한의 크로마토그라피 과정을 통하여 효소를 고도 정제하기 위하여 항원-항체 간의 상호 작용 또는 기질-효소 간의 결합 친화력를 바탕으로 한 affinity column을 이용한 간편한 정제 방법의 개발을 모색하고자 하였다.</p> <p>먼저, 정제한 rabbit anti-H. pylori urease IgG를 CNBr-activated Sepharose 수지에 coupling시켜서 제조한 column에 핵산성분 등 기타 세포 내 고분자를 제거하기위해 DEAE-Sepharose column으로 1차 정제한 재조합H. pylori urease 함유 시료를 적용시켜 보았을 때, 항원-항체 반응이 매우 강력하게 일어났음을 알 수 있었다. 즉, col-umn을 초기 적용 완충액인 PED ( \( \mathrm { pH } 7.2 \))로 충분히(4배 col-umn 부피) 세척한 후에 \( 1 \mathrm { ~M } \) KCI, \(20 \% \) DMSO를 각각 함유하는 PED( \( \mathrm { pH } ~7.2 \)) 완충액, 냉 초순수 (Milipore 급) 등으로 각각 용출시켜 보았으나 urease활성이나 단백질은 검출되지 않았다. \( 1 \mathrm { ~N } \) NaOH 용액을 가하였을 때에야 높은 \( \mathrm { pH } \)에 의해 활성이 소실된 H. pylori urease가 용출되어 나옴을 분획의 SDS-polyacrylamide 전기 영동 분석으로 확인할 수 있었다. 따라서 용출 용매의 \( \mathrm { pH } \) 변화에 의거하여 항체 affinity chromatography column에흡착된 urease를 분리할 수있는 가능성을 확인하였다. PED ( \( \mathrm { pH } ~7.2 \))완충액으로 시료를 다시 적용한 후 \( 100 \mathrm { ~mM } \) glycine HCl ( \( \mathrm { pH } ~3.2 \)) 및 \( 100 \mathrm { ~mM } \) 탄산 ( \( \mathrm { NaHCO } _ { 3 } - \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } \), \( \mathrm { pH } ~10.5 \)) 완충액으로 각각 용출한 결과 \( 100 \mathrm { ~mM } \) 탄산 완충액에서 Fig. 1의 \( 12 \% \) SDS- polyacrylamide 전기 영동의 결과에 제시된 바와 같이 비교적 순수한 urease효소가 분리됨을 확인 하였다(lane 4). 그러나 정제된 효소는 column에서 분리된 직후, 다량의 중성 인산 완충액으로 즉시 투석하였음에도 불구하고 그 비활성 (specific activity)이 \( 35.8 \mathrm { ~U } / \mathrm { mg } \)으로서 외견상 정제된 정도에 비하여 다소 감소된 것으로 나타나 높은 \( \mathrm { pH } \)에의 노출이 효소 활성의 감소를 초래한 것으로 추정된다. 항원-항체 간의 상호작용을 이용하는 affinity chromatography에서는 그 해리 상수가 \( 10 ^ { -8 } \sim 10 ^ { -12 } \mathrm { ~M } \)로 매우 높아서 통상적으로 꽤 혹독한 조건 하에서만 용출되는 예가 흔한 것으로 알려져 있다. 한편 DEAE-Sepharose column으로 1차 정제한 시료를 urease효소의 기질인 urea를 epoxy- activated Sepharose 6B에 coupling시킨 epoxy-urea affinity column에 적용하여 기질-효소 간의 친화력을 이용하여 호소를 정제하고자 하였다. Epoxy-activated Sepharose 6B는 Sepharose 6B resin에 1,4bis-(2, 3-epoxypropxy-) butane과 같은 비교적 긴 친수성 spacer arm을 함유하고 있으며, -OH, -SH 혹은 \(- \mathrm { NH } _ { 2 } \) 기를 함유한 저 분자량의 리간드를 coupling할 수 있는 특성을 가지고 있다. 이 경우에는, 앞의 항체-affinity chromatography에서와는 대조적으로, 결합되었던 효소가 본래의 기질을 함유한 \( 100 \mathrm { ~mM } \) urea-HEB ( \( \mathrm { pH } ~7.5 \)) 완충액으로 용이하게 용출되었는데 비교적 높은 순도와 비활성 ( \( 87.9 \mathrm { ~U } / \mathrm { mg } \)) 의 urease 효소를 얻을 수 있었다 (Table 1). 단지 이 경우에는 urease의 smaller subunit인 UreA peptide band의 강도가 다소 감소한 것이 관찰되었으나 그 이유는 분명치 않다 (Fig. 2, lane 4). 결론적으로, 본 연구에서는 특이 항체 및 기질을 이용한 affinity column chromatography를 이용하여 의약학적으로 중요한 H. pylori urease를 간단한 방법으로 정제하는 방법을 모색하였는데 항체 affinity chromatography의 경우 효소의 천연 활성이 유지될 수 있도록 좀더 온화한 용출 방법의 모색이 필요한 것으로 나타났다.</p> <table border><caption>Table 1. Affinity purification of the recombinant H. pylori urease from E. coli BL21(pHU1013).</caption> <tbody><tr><td>Purification steps</td><td>Specific activity ( \( \mathrm { ~U } / \mathrm { mg } \))</td><td>Purification (fold)</td></tr><tr><td>Crude extract</td><td>5.7</td><td>1.0</td></tr><tr><td>DEAE-Sepharose</td><td>28.9</td><td>5.1</td></tr><tr><td>CNBr-Sepharose-Anti-urease-IgG *</td><td>35.8</td><td>6.3</td></tr><tr><td>Epoxy-Sepharose-Urea *</td><td>87.9</td><td>15.4</td></tr></tbody></table>
Purification steps가 CNBr-Sepharose-Anti-urease-IgG *일때 Specific activity ( \mathrm { ~U } / \mathrm { mg } U/mg)의 값은 몇이야?
35.8