<h2>특이 마커를 이용한 GM 작물 및 non-GM 작물에 대한 확인</h2><p>상기 PCR조건 실험을 통하여 특이적 반응이 확인된 프라이머 쌍들이 다양한 non-GM 작물 및 GM 작물에 대하여 비특이적인 증폭산물의 형성을 나타내는지 확인하였다. GM 작물에 대한 확인을 위하여 먼저 자체개발 된 각종 GM 작물로써 벼, 콩, 고추, 감자, 배추, 들깨 등을 이용하여 PCR반응을 실시하였다. 그 결과, Figure 6에 나타낸 바와 같이 Cr7-1 계통의 특이적인 반응밴드 이외에 다른 GM 작물에서는 어떠한 특이적인 밴드도 형성치 않음을 확인할 수 있었으며, 다른 GM 작물과 혼합되어 있어도 Cr7-1의 확인이 가능하다고 보여 진다.</p><p>벼 품종에 있어서 개발 특이 프라이머와 genome 상에 유사 염기 서열의 존재로 비특이적인 반응을 나타낼 수 있기 때문에 국내의 71개 벼 품종으로부터 gDNA를 추출하여 PCR 반응을 수행하였다. Figure 7에서 보는 바와 같이 event Cr7-1 계통은 뚜렷한 특이적인 반응산물을 형성한 반면, 71 개 non-GM 벼 품종에서는 구조 및 계통특이 프라이머에 대하여 어떠한 반응밴드도 확인할 수 없었다. 이는 국내의 벼 품종들이 개발된 프라이머 쌍과 비특이적으로 반응할 수 있는 여타 염기서열도 가지고 있지 않다는 것을 보여주고 있으며, Cr7-1이 여러 벼 품종과 혼재되어 있을 때 이들 특이 마커를 이용한다면 쉽게 구분할 수 있을 것으로 본다. 본 연구에서는 또한 non-GM 작물에 대하여 반응산물의 생산 여부를 확인하였으며, 상기 GM 작물에서 확인된 것처럼 non-GM 작물에서도 특이적인 반응밴드를 형성하지 않는 것으로 나타났다. 이상과 같이 Cr7-1 계통의 검정용 특이 마커를 다양한 작물 및 벼 품종에 적용하여 확인해본 결과, PCR반응에 의해 증폭될 수 있는 작물 genome 상의 어떠한 유사 염기서열도 존재하지 않음이 확인되었으며, 이는 PCR반응에 의해 증폭된 특이적인 산물에 대하여 신뢰할 수 있을 것으로 생각된다.</p><h2>특이 마커를 이용한 GM 벼의 후대 및 계통 간 검정</h2><p>식물 형질전환을 수행할 때 일반적으로 동일한 식물벡터를 이용하여 많은 개체를 얻게 되며, 이 개체들은 genome 상에 각기 다른 위치에 외부유전자가 삽입되기 때문에 서로 다른 개체로 각각의 계통을 이루게 된다. 반면 이들 계통들은 같은 목표유전자를 포함하고 있어 T-DNA 상의 유전자에 대한 검출 마커를 이용하게 되면 계통 간의 구별이 어려워 동일 계통으로 잘못 확인될 수 있다. Genome 상의 도입유전자의 인접서열을 바탕으로 한 계통특이 마커를 구성함으로써 이러한 문제점들을 해결할 수 있게 되었다 (Pan et al. 2006).</p><p>혹명나방저항성 GM 벼 검출을 위해 개발된 특이 마커를 이용하여 event 계통과 동일한 운반벡터로 형질전환 된 여러 해충저항성 GM 벼 계통에 대하여 PCR 분석을 수행하였고, 또한 Cr7-1의 후대 계통에 대하여 동일하게 검출이 가능한지를 앞서 확립된 PCR 조건을 토대로 반응을 수행하였다. 혹명나방저항성 벼도 event Cr7-1 이외에 Cr103, Cr127 및 HCr3~8 등 동일 운반체를 갖는 여러 형질전환 계통이 생산되었으며, 이들 계통으로부터 event 계통을 구별 가능하지 특이 마커를 이용하여 정성 PCR을 수행하고 증폭된 밴드를 확인하였다. T-DNA 상의 유전자를 바탕으로 조성된 TPCry-5'/3' (I)로 증폭한 경우 Figure 9A에서 보는 바와 같이 모든 CryIAcl GM 벼 계통에서 동일하게 검출됨을 확인할 수 있었다. 반면 두 종의 계통특이 마커, Mrs-5'/MrRB-3' (II)과 Mrs-5'/ MrLB3' (III)의 경우에 있어서는 Cr7-1 계통에 대해서만 특이적인 PCR 반응 산물이 형성됨을 확인 할 수 있었다. 이는 동일 유전자를 포함하는 다른 계통에 대해서도 계통특이 마커를 사용하게 되면 쉽게 확인 가능한 것을 보여주고 있다. Event Cr7-1의 T1~T5 세대까지 전개된 후대세대의 gDNA를 추출하여 특이 마커로 PCR을 수행하고 그 결과를 Figure 9B에 나타내었다. 후대세대에 대한 PCR 분석 결과, 모든 세대에서 동일한 특이적인 PCR 증폭밴드를 확인할 수 있었고, 후대세대가 지속적으로 전개되더라도 도입유전자의 안정성에 변화가 일어나지 않는 것으로 분석되었다. 따라서 이들 계통특이 마커를 이용하여 PCR분석을 수행한다면 Cr7-1의 후대 계통에서도 신속하고 정확하게 event 계통임을 판별할 수 있을 것으로 파악되고, 혹명나방저항성 GM 벼, Cr7-1의 안전성 평가 시 효율적인 분석 마커로 이용 가능하리라 생각된다.</p><p>특이 마커를 이용한 검출법 개발은 GMO 환경위해성 평가 심사를 위해서 매우 중요한 사안이며, 국외적으로 상업화된 GM 작물의 대표적인 정성분석으로 RRS 콩 (Berdal and Holst-Jensen 2001)과 MON810, Bt11, NK603, MON863 및 Starlink 옥수수 (Hernandez et al. 2003; Windels et al. 2003; Taverniers et al. 2005; Huang and Pan 2004; Pan et al. 2006) 등에서 수행되어졌고, 국내에서는 상업화 GM 작물은 아니지만 국내개발 벼 (Kim et al. 2005a), 들깨 (Kim et al. 2006), 배추 (Lim et al. 2007) 등에서 특이 마커를 이용한 정성 분석을 수행한 보고가 있다.</p><p>이상의 결과에서 농촌진흥청은 토양미생물로부터 유래한 Bt 유전자를 벼 작물에 삽입시켜 해충저항성 GM 벼 CryLAcl 를 개발하였으며, 환경친화적이고 해충관리의 유용성을 갖는 GM 작물로써 실용화하기 위해 안전성 평가를 추진 중에 있다. 이에 따라 GM 작물의 환경위해성 평가 심사를 위하여 혹명나방저항성 GM 벼의 도입유전자의 확인, 도입유전자의 복제수, 도입유전자의 게놈 내 삽입 위치 및 주변 염기서열들을 확인하였으며, 이를 바탕으로 한 형질전환 벼에 특이적 검출이 가능한 프라이머 쌍을 개발하였다. 개발 특이 마커에 대해서 PCR 반응 조건을 검토한 결과 넓은 범위에서 적용이 가능한 것으로 나타났고, 벼를 비롯한 여러 작물에 유사성 염기서열을 갖지 않아 비특이적이 반응산물을 생산하지 않는 것으로 확인 되었다. 앞으로 형질전환 벼의 후대세대 계통에 대한 안전성 및 마커의 적용가능성 등을 지속적으로 확인하고 개발된 계통특이 마커를 이용한 정성적 분석법 개발의 실험을 수행하고자 한다.</p>
국내의 71개 벼 품종으로부터 gDNA를 추출하여 개발 특이 프라이머로 PCR 반응을 수행한 이유는 뭐야?
개발 특이 프라이머와 genome 상에 유사 염기 서열의 존재로 비특이적인 반응을 나타낼 수 있기 때문에