<h1>재료 및 방법</h1><h2>시약</h2><p>브라질린은 Chem Faces (Wuhan, Hubei, China)에서 구매하였으며, TNF- \( \alpha\)는 Sigma-Aldrich (St. Louis,MO, USA)에서 재료를 구매하여 사용하였다. IL-17A 및 IFN- \( \gamma\)는 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구매하였다.</p><h2>세포배양</h2><p>본 실험에서 사용된 HaCaT 인간 각질형성세포주는 CLS (Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Baden-Wurttemberg, Germany)에서 구입하였다. 세포주는 \( 5\%\) \(\mathrm{CO}_{2}\), \(37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양조건에서 \(10\%\) Fetal bovine serum (Welgene, Gyeongbuk, Korea), \(1\%\) Penicillin-Streptomysin (Gibco, Grand Island, NY, USA)이 포함한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Welgene, Gyeongbuk, Korea)으로 배양하였다. 주 2-3회 \( 1 \times \)Trysin-EDTA solution (Welgene, Gyeongbuk, Korea)을 이용하여 \(100 \mathrm{mm} \) 세포 배양 접시에서 \( 3.0 \times 10^{5} \) cells로 분주하여 계대배양을 실시하였다.</p><h2>RNA 추줄 및 Real time RT-PCR</h2><p>HaCaT 세포를 35 mm cell culture plate (\( + \))FBS DMEM 배지 조건에서 24 시간 배양한 후 (\( - \))FBS DMEM 배지로 옮겨 2시간 또는 48시간 동안 세포를 배양하였다. Trizol (Ambion, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 세포를 충분히 용해시킨 뒤 \( 1.5 \mathrm {mL}\) EP 튜브로 옮긴 후 \( 200 \mu \mathrm{L} \) chloroform을 추가 분주하고 12,000 rpm, \(4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 획득하였다. 상층액에 \( 400 \mu \mathrm{L} \) 2-propanol을 넣고 상온에서 10분간 반응시킨 뒤 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), \( 12,000 \mathrm {rpm}\)에서 원심분리하여 total RNA를 추출하였다. RNA를 \( 1.5 \mu \mathrm{g} \) 로 정량한 뒤 Revertra ace - \( \alpha \) - kit (Toyobo, Osaka, Japan)를 이용하여 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분, \( 99^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 조건에서 cDNA로 역전사 시켰다. 합성된 cDNA \( 1 \times\) Tris/EDTA buffer (sigma aldrich, St. Louis, MO, USA)로 희석하여 사용하였다. Real time RT-PCR은 StepOnePlus Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) 장비를 사용하였고, 각각의 유전자별 Taqman probe (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 다음 조건에서 PCR 반응을 수행하였다. PCR조건은 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 2분, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 10분, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 15초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 1분으로 총 45 회 실시하여 실시간으로 유전자의 발현 변화를 관찰하였다. 위 실험에 사용된 probe들은 Table 1에 별도로 표기하였다.</p><h3>Western blot을 이용한 단백질 발현 분석</h3><p>RIPA Buffer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)와 Protease and Phosphatase Inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific) 혼합액을 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 분주하여 세포를 용해시킨 후 \( 14,000 \mathrm{rm}\), \(4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 15분간 원심분리를 통해 단백질을 추출하였다. \( 10 \% \) polyacrylamide gel에서 \( 135 \mathrm{~V} \) 에서 50분간 전기영동을 수행한 뒤 Polyvinylidene fluoride (Invitrogen, Waltham, MA, USA) 막으로 transfer하고 실온에서 1시간 동안 \( 10 \% \) (w/v) skim milk로 blocking하였다. \( 1 \times \) TBS-T로 1분간 3회 세척 후 1차 항체(1:1000)를 치리하여 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응시켰다. \( 1 \times \) TBS-T로 10 분간 5 회 세척한 뒤 2 차 항체(1: 10000)를 처리하여 실온에서 1시간 동안 교반하였다. \( 1 \times \) TBS-T로 10분간 5회 washing 단계를 수행하고 ECL solution (Bio-rad, Hercules, CA, USA)과 반응시켰다. 이후 이미지 처리 장치(Microchemi-DNR, Neve Wamin, Israel)를 이용하여 단백질 발현을 시각화 하였고, 단백질 정량분석을 위해 Image J (N.I.H, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 사용하였다. 실험에서 사용한 항체들의 정보는 Table 2에 별도로 설명하였다.</p>
배양에 사용된 medium에서 Fetal bovine serum의 농도는 몇 \(\%\)야?
\(10\%\)