<h1>재료 및 방법</h1><h2>시약</h2><p>L. monocytogenes 배양을 위한 Tryptic soy broth와 yeast extract는 Difco사로부터 구입하였다. Taq DNA polymerase와 PCR을 위한 모든 시약은 Takara사 (일본)에서 구입하였다. 그 외 모든 시약은 따로 언급이 없을 경우 Sigma제를 사용하였다.</p><h2>Primers</h2><p>모든 primer는 제노텍(대전)에서 구입하여 사용하였으며 이를 Table 1에 정리하였다.</p><h2>균주</h2><p>본 실험에 사용된 리스테리아 균주는 총 13종의 표준균주였고 이중 7종은 L. monocytogenes 였다(Table 2). 이들은 국립수의과학검역원(안양)에서 분양받아 TSBY 배지 (Tryptic soy broth에 \( 0.6 \% \) yeast extract를 첨가한 배지)에서 배양한 후 사용하였다.</p><h2>DNA 분리정제</h2><p>리스테리아 균체로부터 DNA를 분리하기 위해 guanidine thiocyanate/phenol/chloroform method를 사용하였다. 이를 간략히 기술하면 약 \( 0.5 \mathrm{ml} \)의 리스테리아 배양액에 \( 0.25 \mathrm{ml} \)의 solution D (4\(\mathrm{M}\) guanidine thiocynate,\( 0.025 \mathrm{M} \) sodium citrate, \( 0.5 \% \) sarcosyl)와 \( 0.5 \mathrm{ml} \)의 phenol-chloroform(1:1)을 첨가하여 약 1시간 정도 tumbling시키고 원심분리하여 수용액층을 회수한 후 DNA를 isopropanol로 침전시켰다. 얻어진 pellet을 \( 70 \% \) ethanol로 세척한 후 말려서 증류수에 녹여 PCR에 사용하였다.</p><h2>PCR 조건</h2><p>각각의 PCR 반응액에는 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 8.3), 50 \) \( \mathrm{mM} ~\mathrm{KCl}, 1.5 \mathrm{mM} ~\mathrm{MgCl}_{2}, 200 \mu \mathrm{M} \) dNTPs, 2.5 units Taq DNA polymerase, \(100 \mathrm{pmol}\) primer과 DNA template가 함유되도록 하되 총 부피는 \( 50 \mu \mathrm{l} \)가 되도록 하였다. 각 시료는 thermocycler (Perkin-Elmer 2400, Foster, CA)에서 증폭 cycle을 시작하기 전에 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 DNA를 변성시킨 후 cycle로 진입하게 하였으며 45 cycle을 종료한 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7분간 연장반응시킨 후 반응을 종료하였다. 각 cycle은 \( 94^{\circ} \mathrm{C}\) 1 분, \( 35^{\circ} \mathrm{C}\) 2분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 2분으로 하였다.</p><h2>Data 분석</h2><p>discrimination index는 다음 식을 이용하여 계산하였다.</p><p>\( D=1-\frac{1}{N(N-1)} \sum_{j=1}^{s} n_j(n_j-1) \)</p><p>여기서 \(D\)는 numerical index of discrimination, \(N\)은 사용된 균주 총수, \(s\)는 RAPD type의 수, \(n_{j} \)는 \( j \) type에 속하는 균주의 숫자를 의미한다.</p>
뭐로부터 DNA를 분리하려고 guanidine thiocyanate/phenol/chloroform method를 사용했어?
리스테리아 균체