<h1>결과 및 고찰</h1><h2>\( \gamma \)-TMT 형질전환체의 분자생물학적 분석</h2><p>배양 후 shooting 및 rooting과정에서 선발된 담배 형질전환체는 대조체와 비교하여 형태적인 차이는 발견되지 않았다. 재분화된 식물체의 genome에 \( \gamma \)-TMT 유전자가 도입되었는가를 확인하기 위하여, PCR 분석을 실시하였다. 형질전환식물체로부터 분리한 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR 증폭을 실시한 결과, Figure 1에 나타낸 바와 같이 CaMV 35S 프로모터 부위와 \( \gamma \)-TMT 유전자에 대한 primer 조합에서 예상크기와 일치하는 \( 0.4 \mathrm{kb} \) 의 PCR 증폭산물을 얻었으며 증폭산물의 염기서열 분석 (결과 미제시)을 통해서 형질전환된 유전자임을 확인하였다. 형질전환 담배에서 도입된 \( \gamma\)-TMT 유전자가 발현하고 있는지의 여부를 확인하기 위해 RT-PCR 분석을 실시한 바, 대조구 개체에서는 보이지 않는 예상크기의 형질전환된 들깨 \( \gamma \)-TMT에 대한 RT-PCR 산물이 모든 형질전환체에서 증폭되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 대조구 담배의 total RNA에서 \( \gamma \)-TMT에 대한 RT-PCR 산물이 증폭되지 않은 것은 담배 내에 존재하는 \( \gamma\)-TMT 유전자 서열이 형질전환 되어진 들깨 \( \gamma\)-TMT 의 염기서열과 상동성이 낮거나 발현량이 많지 않기 때문인 것으로 추정된다.</p><h2>토코페롤 함량 분석 및 다른 토코페롤 합성 유전자의 발현 분석</h2><p>토코페롤 함량 및 농도의 분석을 위해 유전자의 도입이 확인된 두 종류의 형질전환체 및 대조 식물체 잎으로 HPLC 분석을 실시하였다. 형질전환체 및 대조 식물체의 토코페롤 함량과 성분은 거의 유사하였으며, \( \alpha \)-토코페롤 이외의 다른 형태의 토코페롤은 거의 검출되어지지 않았다. 담배의 경우 잎조직 뿐 아니라 종자에서도 토코페롤은 대부분 (\(>95\%\)) \( \alpha \)-토코페롤 형태로 존재하는 것으로 보고된 바 있으며 (Abbasi et al. 2007), \( \gamma \)-TMT 효소는 토코페롤 합성단계의 최종단계에 관여하여 gamma-type의 토코페롤을 alpha type 으로 전환하는 역할을 수행하게 된다. 따라서, 형질전환 담배의 a-토코페롤 함유량이 대조 식물과 유사한 점은 담배내 \( \gamma \)-토코페롤 함유량이 매우 낮아 \( \alpha \)-토코페롤로 변환되지 못했기 때문인 것으로 생각된다. 또한, \( \gamma \)-TMT 형질전환 식물체내에서 과발현된 \( \gamma \)-TMT효소가 상위 단계의 토코페롤 합성과정에 관여하는 HPT, TC 유전자의 발현에 미치는 영향을 확인하고자, 대조구와 형질전환체를 이용하여 RT-PCR 분석을 실시하였다. 그 결과, 대조 식물체와 비교해서 형질 전환체의 토코페롤 합성 관여 유전자인 HPT, TC의 발현량 은 큰 변화를 보이지 않았다.</p><h2>색소 분석</h2><p>토코페롤 합성의 전구물질로 사용되는 phytyldiphosphate (phytyl-DP)는 다른 중요한 항산화물질로 알려져 있는 카로테로이드와 클로로필의 생합성 대사 전구물질로도 사용된다 (Rise et al. 1989; Shintani 2006). 담배 식물체내의 \( \gamma \)-TMT 발현이 클로로필 및 카로테노이드 합성에 영향을 주는지를 알아보고자 T1 형질전환 식물체내 농도를 측정하였다. 분석 결과 \( \gamma\)-TMT 형질전환체에서 클로로필-b 함유량은 대조 식물체와 거의 비슷했지만, 클로로필-a는 대조 식물체와 비교하여 형질전환담배 No. 2 line에서는 \( 45 \%(\mathrm{P}<0.01) \) 함량이 증가하였고, 카로테노이드 함량은 \( 39 \%(\mathrm{P}<0.02) \)증가하였다. 이러한 색소의 변화현상은 \( \gamma \)-TMT RNAi 실험에서도 관찰되어졌는데 (Abbasi et al. 2007), \( \gamma \)-TMT 효소의 발현량 증가로 phytyl-DP의 생성이 증가되었지만 토코페롤 합성의 첫단계 효소인 HPT 효소의 제한된 활성으로 인하여 토코페롤 합성이 증가되지 않았고 남은 phytyl-DP가 카로테노이드와 클로로필 생합성과정에 이용되었기 때문인 것으로 생각된다.</p><h2>형질전환 식물체의 염 스트레스 저항성</h2><p>최근에 토코페롤 생합성 관련 유전자를 이용한 형질전환 식물체에서 건조나 염과 같은 산화 스트레스 저항성 변화에 대한 연구가 보고되었다 (Liu et al. 2008; Abbasi et al. 2007). \( \gamma\)-TMT 발현 담배를 이용하여 염에 대한 저항성 정도를 알아보고자 종자파종 후 2 주된 형질전환체 및 대조 식물체를 각기 다른 농도의 NaCl 이 함유된 1/2 MS 배지에 치상하여 4주간 배양 후 형태적인 특징을 관찰하였다. 형질 전환 식물체의 생육정도는 대조 식물체와 비교하여 \( 100 \mathrm{mM} \) NaCl 배지에서는 거의 비슷했지만, \( 200 \mathrm{mM} \) 이상에서는 잎의 크기나 생육이 증가하는 것으로 나타났으며, \( 400 \mathrm{mM} \) 이상의 NaCl 배지에서는 두 종류의 식물체 모두 생육하지 못하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 Abbasi 등(2007)이 \( \gamma \)-TMT RNAi 방법을 사용하여 담배 내 \(\alpha\)-토코페롤 합성이 감소되었을 때 염 저항성이 감소하였다는 보고와 일치하지만, 식물체내 토코페롤 성분의 변화 없이 염 저항성이 나타났다는 점은 \(\alpha\)-토코페롤이 염 저항성에 관여한다는 기존의 보고와는 다른 매우 흥미로운 결과이다. 이러한 염 저항성의 증가는 카로테노이드와 같은 다른 산화스트레스에 관련된 항산화성물질의 증가와 연관된 것으로 추정되며, 염 저항성에 \(\alpha\)-토코페롤이 필수적이지는 않는 것으로 보인다.</p>
대조구 개체에서는 보이지 않는 예상크기의 형질전환된 들깨 \( \gamma \)-TMT에 대한 RT-PCR 산물이 모든 형질전환체에서 어떻게 되는 것을 확인할 수 있었는가?
증폭