<h1>결과 및 고찰</h1><h2>Defensin 분비벡터의 제작</h2><p>Mature defensin의 분자량이 너무 작아서 이것을 효모에서 직접 발현시키기는 것이 불가능할 것으로 생각되어 22개의 아미노산으로 구성된 glucoamylase signal sequence 및 MF \( \alpha 1 \)의 prosequence와 융합단백질로 발현을 시도하고자 하였다. MF \( \alpha 1 \) 의 prosequence를 분리하기 위해 BamHI 인식부위를 함유한 \( 5^{\prime} \) end primer와 Xba I 인식부위를 함유한 \( 3^{\prime} \) end primer를 사용하여 PCR로써 플라스미드 \( \mathrm{YEp} 70 \) \( \alpha \mathrm{T} \)를 template로 사용하여 MF \( \alpha 1 \) 의 prosequence \( 180 \mathrm{bp} \) DNA 단편을 증폭하여 \( \mathrm{pUC19} \) 의 BamHI과 Xba I 인식 부위에 삽입하였다. 플라스미드 DNA 분리 후 제한효소 mapping과 염기서열분석을 통해 정확한 클론을 선별한 후 시험관에서 재구성한 합성 defensin 유전자를 \( \mathrm{MF} \alpha 1 \mathrm{pro-} \) sequence의 \( 3^{\prime} \) 말단에 삽입하고 염기서열분석을 하여 정확히 합성되고 제작된 클론을 선별하였다. 정확히 재구성된 defensin 합성유전자의 염기서열과 유추된 아미노산서열을 Fig. 1에 나타내었다. 이 풀라스미드를 BamHI과 SalI을 처리하여 \( \mathrm{MF} \alpha 1 \) prosequence와 defensin 유전자를 함유한 \( 320 \mathrm{bp} \) DNA 단편을 분리하여 pYEG27의 BamHI/Sal I 부위에 삽입하여 최종적으로 pSMF11을 제작하였다[Fig. 2].</p><h2>Defensin의 발현 및 분비</h2><p>재조합 프라스미드 pSMF11로 형질전환된 효모를 대상으로 활성형의 defensin을 세포외로 분비하는지를 재료 및 방법에 기술한 대로 조사한 결과를 Fig. 3 에 나타내었다. 제조합 플라스미드로 형질전환된 효모균체에는 투명환이 관찰되었으나 PYEG27로 형질전환된 숙주 효모에서는 나타나지 않았다. 따라서 곤충에서 유래한 항균팹티드 defensin이 glucoamylase signal sequence와 MF \( \alpha \) 1의 prosequence에 의해 효모세포에서 processing이 되어 항균활성이 있는 형태로 분비됨을 확인할 수 있었다.</p><p>또한 액체배양 시에도 활성형의 defensin이 분비되는지 조사하기 위해 형질전환체를 \( 5 \mathrm{~m} \)의 YPD broth에서 3일간 배양하고 배양 상등엑 \( 50 \mathrm{~ul } \)를, NB 한천배지에 시험균 \( 1 \% \)를 함유한 \( 5 \mathrm{~m} \in \)의 \( 0.8 \% \) top agar가 깔린 plate에 만든 well [\( 5 \mathrm{~mm} \) 지름]에 loading하고 \( 37 \mathrm{C} \)에서 24시간 배양한 결과 well 주위에 투명환이 생기는 것을 관찰하였다.</p><p>Defensin이 pSMF11의 형질전환체 S. cerevisiae 2805에서 분비되는 정도를 조사하기 위해 배양액을 상등액, periplasmic space 및 cytosolic region의 세 부위로 분획한 후 항균활성을 조사하였다. 효모 배양액을 원십분리하여 상등액과 균체를 분리하고 균체에 효모세포벽 분해효소인 zymolyase를 처리하여 periplasmic fraction을 얻고 glass bead로써 sphaeroplast를 파괴하여 cytosolic fraction을 얻었다. 배양 상등액 원액, periplasmic과 cytosolic fraction의 104 농축액 \( 50 \mu \)을 각각, \( 0.5 \% \mathrm{M} \). luteus를 함유한 \( 0.8 \% \) top agare overlay된 NB plate[\( 1.25 \% \) brain heart infusion, \( 0.54 \% \) mutrient broth, \( 0.25 \% \) yeast extract, \( 1.5 \% \) agar|에 만든 well에 loading하고 배앙한 후 inthibition zone을 관찰한 결과 발현된 defensin이 내부분 세포 외로 분비되어 거의 모든 항균활성이 배양 상등액에 존재하였다 [Fig, 4].</p><h2>Defensin의 항균범위조사</h2><p>황산암모늄으로 농축한 배양 상등액을 사용하여 M. tutetis 이외 임의의 10종의 세균에 대한 항균활성을 조사하였다. 각각의 시험균 배양액 \( 0.5 \% \)를 함유한 \( 0.8 \% \) top agar 로 overlay된 NB plate에 well을 만는 후 배양농축액 \( 50 \mathrm{~ul} \)를 loading하고 \( 37 \mathrm{C} \) 에서 배양하였다. 그람 음성균인 대장균과 Salmonella typhimurium에는 항균활성이 없었으나 병원성균인 Staphylococcus aureus와 Listeria monocytogenes 등에 비교적 강한 항균활성을 나타내었다 [Table 1]. 지금까지 알려진 바에 의하면 곤충 defensin은 그람 음성셰균에는 항균활성이 없으나 그람 양성세균에는 강한 항균활성을 나타낸다. Table 1 에서 그람 양성균인 고초균과 젖산균에 대해서는 항균활성을 나타내지 않았는데 이것은 defensin의 specific activity가 낮기 때문으로 풀이된다.</p><p>이상의 연구 결과에 따라 항균활성을 보유한 곤충 defensin을 호모세포에서 분비가 가능하였고 이러한 결과는 곤중 defensin이 glucoamylase signal sequence와 MF \( \alpha 1 \) prosequence와의 융합 팹티드로 합성된 후 효모의 분비경로를 지나면서 이들 서열들이 signal peptidase와 Kex2 endoprotease 등의 순차적인 작용에 의해 잘려져 최종적으로 항균활성이 있는 mature defensin 서열만 성공적으로 분비되기 때문이다.</p>
pUC19 의 BamHI과 Xba I 인식 부위에 삽입한 것은 무엇인가?
MF \( \alpha 1 \) 의 prosequence \( 180 \mathrm{bp} \) DNA 단편