<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포배양</h2><p>실험에 사용한 세포주는 한국세포주은행에서 분양받은 mouse 섬유아세포인 NIH3T3 세로를 이용하였고, 이 세포들은 plastic petri dishes상에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) \( \mathrm{CO}_{2} \) humidified incubator 에서 \( 10 \% \) fetal bovine serum, penicillin \( (100 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \) 및 strep-tomycin \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 이 존재하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (Life Technologies, 미국) 조건에서 배양하였고, expo-nential phase의 세포들을 \( 0.025 \% \) trypsin-EDTA를 이용하여 계대배양하였다.</p><h2>옻 추출물(RVSE)의 제조와 성분 분석 및 fisetin의 이용</h2><p>옻추출물은 생명의 나무(주)로부터 제공받았는데 그 제조 과정은 다음과 같다. 우선 옺나무의 목재부를 \( 10 \mathrm{~cm} \)의 길이로 절단하여 그늘에서 1개월 정도 건조한 다음, \( 400 \mathrm{~g} \)의 건조된 옻나무에 \( 99.9 \% \)의 아세톤 1 liter를 가하고 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 일간 방치하여 노란색을 띤 추출물을 얻었다. 이 추출물에 동량의 물을 가하고 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 교반한 다음 실온에서 식히고 No. 2 여과지(Whatman, 미국)를 이용하여 여과한 후 여과물을 회전식 진공증발기(Resona Co., 스위스)로 농축한 후 원심진공건조하여 조추출물을 얻었는데 수율은 \( 1.1 \% \) 였다. 이 추출물을 DMSO로 녹여 \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 농축용액을 만들고 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하여 필요한 농도만큼 의석하여 사용하였다. HPLC 분석 결과 이 추출물에는 알레르기 반응을 유발하는 urusiol이 존재하지 않고, fisetin, butein, fustin, sulfretin등 의 flavonoid가 포함되어 있음을 규명하였다. 이들 flavonoid 성분들은 Sigma (미국)에서 구입하여 각각 적정 용매로 농축 용액을 만들어 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하여 실험을 수행할 때 필요한 양만큼 희석하여 사용하였는데, 본 연구 목표인 UVB에 의한 세포고사를 감소시키는 효과는 fisetin이 제일 우수한 것으로 본 연구팀에 의해 선정되었다.</p><h2>세포 형태 분석</h2><p>세포를 \( 35 \mathrm{~mm} \) 배양접시에 동일 양을 분주하여 하루를 배양한 후 UVB \( \left(200 \mathrm{~J} / \mathrm{m}^{2}\right) \)를 처리한 후 조건에 맞는 농도의 옻 추출물 및 fisetin을 처리하였다. 48시간 동안 배양한 후 세포들의 형태가 어떻게 변화하였는지를 현미경 \( (\times 200) \)으로 관찰하였다.</p><h2>Trypan blue 배제 분석</h2><p>자외선을 조사하거나 조사하지 않은 세포들을 대상으로 옻추출물 또는 fisetin을 적정시간 처리한 후 phosphate-buffered saline (PBS, \( 150 \mathrm{mM}\ \mathrm{NaCl}, 3\ \mathrm{mM}\ \mathrm{KCl}, 12\ \mathrm{mM} \) \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 2\ \mathrm{mM}\ \mathrm{KH}{ }_{2} \mathrm{PO}_{4} \) )로 세척하고 trypsin-EDTA를 이용하여 수확하였다. 수확한 세포를 PBS \( 200 \mu l \)로 희석하고 같은 양의 \( 0.8 \% \) trypan blue (Sigma)를 첨가하였다. Hemocy-tometer를 사용하여 약 200개 정도의 세포에 대해 trypan blue가 세포로 흡입된 그룹과 그렇지 않은 그룹으로 나누어 세포의 수를 세어 trypan blue가 흡입된 세포 수 \(/\) total 세포의 수의 퍼센트를 구해 세포의 생존율을 알아보았다.</p><h2>4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 염색에 의한 핵 분절 분석</h2><p>자외선을 조사하거나 조사하지 않은 세포들을 대상으로 옻추출물 또는 fisetin을 적정시간 처리한 후 세포를 수확하고, 수확한 세포를 PBS \( 200 \mu l \)로 희석한 후 DAPI를 첨가하였다. DAPI를 첨가한 후 실온에서 20 분간 염색한 후에 핵의 분절 정도를 형광현미경(Zeiss Axioskop 2 Plus)을 사용하여 관찰하였다.</p><h2>Annexin V 결합분석</h2><p>자외선을 조사하거나 조사하지 않은 세포들을 대상으로 옺추출물 또는 fisetin을 적정시간 처리한 후 세포를 수확하고, 수확한 세포를 PBS \( 200 \mu 1 \) 로 희석한 후 Annexin V (BM Roche, 독일)를 첨가하였다. Annexin V 를 첨가한 후 실온에서 15분간 염색한 후에 Annexin V 결합 정도를 형광현미경 (Zeiss Axioskop 2 Plus)을 사용하여 관찰하였다.</p>
mouse 섬유아세포인 NIH3T3 세로는 어떤 조건에서 배양되었어 ?
plastic petri dishes상에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) \( \mathrm{CO}_{2} \) humidified incubator 에서 \( 10 \% \) fetal bovine serum, penicillin \( (100 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \) 및 strep-tomycin \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 이 존재하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (Life Technologies, 미국) 조건