<h1>결과 및 고찰</h1><p>화합물 1은 황색 무정형의 분말 형상으로서, TLC 전개 후, \( 10 \% \) 황산을 분무하여 가열시 갈색으로 발색 되었다. Negative FAB/MS에서 \( m/z \) 301 \( [\mathrm{M}-\mathrm{H}]^{-} \) 분자이온 peak가 관측되이 분자량을 302 \( [\mathrm{M}] \)로 확인하였다. IR spectrum으로부터 공역화된 카보닐기 (\( 1617 \mathrm{~cm}^{-1} \)), 수산기 (\( 3358 \mathrm{~cm}^{-1} \))와 이중결합 (\( 1589 \mathrm{~cm}^{-1} \))이 있는 것으로 확인되었다. \( { }^{1} \mathrm{H} \)-NMR ( \( 600 \mathrm{MHz} \), pyridine- \( d_{5} \), \( \delta_{\mathrm{H}} \) ) spectrum에서 3개의 olefin methine proton signal \( \delta_{\mathrm{H}} \) 7.89 (\( 1 \mathrm{H}\), \(\mathrm{d}\), \(J=1.8 \mathrm{~Hz}\), \(\mathrm{H}-2^{\prime} \)), \( \delta_{\mathrm{H}} \) 7.82 (\( 1 \mathrm{H}\), \(\mathrm{dd}\), \(J=8.4\), \(1.8 \mathrm{~Hz}\), \(\mathrm{H}-6^{\prime} \)) \( \delta_{\mathrm{H}} \) 7.27 (\( 1 \mathrm{H}\), \(\mathrm{d}\), \(J=8.4 \mathrm{~Hz}\), \(\mathrm{H}-5^{\prime} \)) 를 통해 1,2,4-삼치환 벤젠 구조가 존재함을 예상하였다. 또한 2개의 olefin methine proton signal \( \delta_{\mathrm{H}} \) 7.89 (\( 1 \mathrm{H}\), \(\mathrm{d}\), \(J=7.2 \mathrm{~Hz}\), \(\mathrm{H}-5 \)), \( \delta_{\mathrm{H}} \) 6.36 (\( 1 \mathrm{H}\), \(\mathrm{d}\), \(J=7.2 \mathrm{~Hz}\), \(\mathrm{H}-6 \)) 을 통해 1,2,3,4-사치환 벤젠 구조가 존재함을 예상하였다. 이를 통해 이 화합물이 flavonol 화합물임을 예상하였다. \( { }^{13} \mathrm{C} \)-NMR (\( 150 \mathrm{MHz} \), pyridine-\( d_{5}\), \(\delta_{\mathrm{C}} \)) spectrum에서 탄소수가 15개임을 확인하였고, 이를 통해 flavonol임을 확인하였다. 1개의 conjugated ketone carbon signal (\( \delta_{\mathrm{C}} \) 176.6), 7개의 oxygenated olefin quaternary carbon signal ( \( \delta_{\mathrm{C}} \) 167.3; 164.2 ; 152.5 ; 147.2 ; 145.4 ; 135.8 ; 133.0)을 확인하였고, 2개의 olefin quaternary carbon signal (\( \delta_{\mathrm{C}} \) 127.5 ; 115.7)을 확인하였으며, 5개의 olefin methine carbon signal [\( \delta_{\mathrm{C}} \) 121.9; 119.7; 117.8; 116.1; 112.7 \)]을 확인하였다. 위의 data 를 문헌값과 비교하여 화합물 1을 \(3'\),\(4'\),7,8-tetrahydroxyflavonol, melanoxetin 으로 구조 동정 하였다.</p><p>화합물 2는 백색 무정형의 분말 형상으로서, TLC 전개 후, \( 10 \% \) 황산을 분무하여 가열시 진한 갈색으로 발색 되었다. Negative FAB/MS에서 \( m/z \) 167 \( [\mathrm{M}-\mathrm{H}]^{-} \) 분자이온 peak가 관측되어 분자량을 168 [\( \mathrm{M} \)]로 확인하였다. IR spectrum으로부터 ester기(\( 1617 \mathrm{~cm}^{-1} \)), 수산기(\( 3550 \mathrm{~cm}^{-1} \))와 이중결합(\( 1612 \mathrm{~cm}^{-1} \)) 이 있는 것으로 확인되었다. \( { }^{1} \mathrm{H} \)-NMR ( \( 600 \mathrm{MHz} \), pyridine-\( d_{5}\), \(\delta_{\mathrm{H}} \)) spectrum에서 3개의 olefin methine proton signal \( \delta_{\mathrm{H}} \) 8.11 (\( 1 \mathrm{H}\), \(\mathrm{d}\), \(J=2.4 \mathrm{~Hz}\), \(\mathrm{H}-2 \)), \( \delta_{\mathrm{H}} \) 7.81 (\( 1 \mathrm{H}\), \(\mathrm{dd}\), \(J=8.4\), \(2.4 \mathrm{~Hz}\), \(\mathrm{H}-6 \)), \( \delta_{\mathrm{H}} \) 7.27 (\( 1 \mathrm{H}\), \(\mathrm{d}\), \(J=8.4 \mathrm{~Hz}\), \(\mathrm{H}-5 \))를 통해 1,2,4-삼치환 벤젠 구조가 존재함을 예상하였다. 또한 하나의 methoxy proton signal \( \delta_{\mathrm{H}} \) 3.75 (\( 3 \mathrm{H}\), \(\mathrm{s}\), \(7-\mathrm{OCH}_{3} \)) 을 관측하였고, 이를 통해 이 화합물이 phenyl 화합물임을 예상하였다. \( { }^{13} \mathrm{C} \)-NMR (\( 150 \mathrm{MHz} \), pyridine-\( d_{5}\), \(\delta_{\mathrm{C}} \)) spectrum에서 methoxy (\( \delta_{\mathrm{C}} \) 51.5) 를 제외하고 탄소수가 7개임을 확인하였고, 이를 통해 phenyl methanoid 화합물임을 확인하였다. 1개의 ester carbon signal (\( \delta_{\mathrm{C}} \) 167.2), 2개의 oxygenated olefin quaternary carbon signal (\( \delta_{\mathrm{C}} \) 152.4; 147.0)을 확인하였고, 1개의 olefin quaternary carbon signal (\( \delta_{\mathrm{C}} \) 126.9)을 확인하였으며, 3개의 olefin methine carbon signal [\( \delta_{\mathrm{C}} \) 122.8; 117.6; 116.1]을 확인하였다. 위의 data를 문헌값과 비교하여 화합물 2를 3,4-dihydroxybenzoic acid methylester, protocatechuic acid methyl ester 으로 구조 동정 하였다.</p><p>Flavonol 화합물과 phenolic 화합물들의 경우 주로 항산화, 항염, 당뇨 등의 활성이 보고되어 있다. 특히 melanoxetin(1)의 경우 항산화 물질로서 가장 많이 알려진 화합물인 quercetin과 구조적 유사성이 매우 높아 해당 화합물의 높은 항산화 활성을 기대 할 수 있음을 확인하였다. 따라서 큰금계국 추출물, 분획물과 분리한 화합물 2종의 ABTS와 DPPH radical 을 이용한 radical scavenging assay를 실시하였다. Ascorbic acid (vitamin C)와 소거활성능을 비교하여, \( \mathrm{mg} \) Vitamin C 당량 \( (\mathrm{VCE}) / \mathrm{g} \) 건조 중량 (DW)으로 측정치를 나타내었다.</p><p>ABTS radical을 이용한 측정에서 추출물은 \( 730.9 \pm 2.1 \mathrm{mg} \) \( \mathrm{VCE} / \mathrm{g} \) DW, EtOAc 분획물은 \( 859.2 \pm 0.9 \mathrm{mg} \mathrm{VCE} / \mathrm{g} \) DW, n-BuOH 분획물은 \( 327.4 \pm 5.6 \mathrm{mg} \mathrm{VCE} / \mathrm{g} \) DW, 그리고 \( \mathrm{H_{2}O} \) 분획물은 \( 113.0 \pm 0.3 \mathrm{mg} \mathrm{VCE} / \mathrm{g} \) DW의 소거활성능을 나타내었다 (Table 1). 추출물과 분획물의 높은 항산화능은 이전 연구에서 보고한 chalcone 화합물이나 이번에 분리한 화합물들의 경우에서 확인 할 수 있는 높은 함량의 flavonoid 화합물과 phenolic 화합물들에서 기인한 것임을 예상할 수 있다. EtOAc 분획에서 가장 높은 소거활성능을 보였는데, 이는 다른 분획물들에 비해 비배당체 화합물의 함량이 높음에서 기인함을 예상할 수 있는데, 이는 비배당체가 배당체보다 항산화능이 높다는 문헌보고와 유사하였다. 분리한 화합물들의 경우 melanoxetin은 \( 204.4 \pm 1.6 \mathrm{mg} \mathrm{VCE} / \mathrm{g} \) DW, protocatechuic acid methyl ester은 \( 59.9 \pm 1.6 \mathrm{mg} \mathrm{VCE} / \mathrm{g} \mathrm{DW} \) 의 소거활성능을 나타내었다(Table 1). 특히 melanoxetin은 quercetin과 거의 유사한 활성능을 보이고 있음을 문헌조사를 통해서 알 수 있었다.</p><p>DPPH radical을 이용한 측정에서도 ABTS와 거의 비슷한 양상을 나타내었다(Table 1). 다만, ABTS radical에 비해 추출, 분획물들의 값이 줄어들었는데, 이는 DPPH assay ( \( 80 \% \) methanol)는 비극성 용매 시스템에서 radical 소거능을 측정하기 때문에 배당체와 같은 극성 물질의 소거능이 거의 포함되지 않기 때문인 것으로 추측된다.</p><p>결론적으로, 큰금계국 (C. lanceolata) 꽃으로부터 \( \mathrm{SiO_{2}} \)와 ODS을 이용한 column chromatography를 반복하여 1종의 flavonol과 1종의 benzoyl 화합물을 분리하였고, 이를 NMR, IR, FAB/MS 를 분석하여 화합물의 구조를 동정하였다. 추출물과 EtOAc 분획물에서 높은 radical scavenging 활성을 보였고, 분리한 화합물 중 화합물 1은 quercetin 수준의 높은 radical scavenging 활성을 ABTS 와 DPPH radical에서 보임을 확인하였다. 이러한 결과는 큰금계국(C. lanceloata)의 꽃에서 추출한 화합물의 높은 radical 소거활성능이 산화 스트레스로 인한 다양한 질병을 개선 할 수 있는 건강기능식품소재 개발에 좋은 후보가 될 수 있음을 시사한다.</p>
화합물2에 분무하는 황산의 농도는?
\( 10 \% \)