<h1>재료 및 방법</h1><h2>HEK293 cell의 RNA 정제 및 cDNA library 제작</h2><p>Human embryo kidny cello인 HEK293 cell을 \( 10 \% \) FBS가 함유된 DMEM 배지에 \( 70 \% \) confluent하게 배양하고 trypsin으로 세포를 부유시킨 후 RNA 정제 kit(Boeringer Menheim 사)를 이용 total RNA를 얻었다. Total RNA를 template로 하고 oligo dT를 primer로 하여 reverse transcriptase로 RT-PCR을 행하므로서 primary strand cDNA library를 얻었다.</p><h2>PCR을 통한 SPTLC1과 SPTLC2 gene의 증폭 및 cloning</h2><p>제조한 cDNA library로부터 SPTLC1과 SPTLC2을 증폭시키기 위하여 PCR을 사용하였다. SPTLC1의 primer로는 5SPT1F (BgⅢ) : 5' - ccgagatctatggcgaccgccacggagca - 3' 및 3SPT1R (BgⅢ) : 5' - ccgagatctctagagcaggacggcctgggcta - 3'를 사용하였으며 SPTLC2의 primer로는 5SPT2F (XhoI) : 5' - ccgctcgagatgcggecggagcccggag - 3' 및 3SPT2R (XhoI) : 5' - ccgctcgagtcagtcttctgtttcttcatacg - 3' 를 사용하였다. 먼저 SPTLC1 및 SPTLC2는 Promega사(USA)의 pGEM-T easy vector에 PCR product 들을 삽입하여 E. coli DH5\(\alpha\) (recA endA) competent cell에 형질전환 시켰다. E. coli 발현 vector로는 \(\left(\mathrm{His}_{6}\right) \)-tag과 Xpress epitope을 발현시킬 수 있는 pRset series (Invitrogen 사)를 사용하였다. pGEM-T/SPTLC1은 BgⅢ로 가수분해하여 약 \( 1.5 \mathrm{~kb} \) DNA 조각을 pRset A vector에, pGEM-T/SPTLC2는 XhoI으로 가수분해하여 약 \( 1.7 \mathrm{~kb} \) DNA 조각을 pRset A vector에 삽입시키고 DH5\(\alpha\)에 형질전환시켰다. 재조합 plasmid들을 여러 종류의 제한효소로 가수분해하여 agarose gel 전기영동을 행하고 DNA sequencing으로 염기서열을 확인하였다.</p><h2>대장균 BL21에 SPTLC1 및 SPTLC2의 overexpression</h2><p>Overexpression용 E. coli 숙주세포로는 BL21 (DE3)pLysS을 사용하였다. Electroporation 용 competent cell \( \left(1 \times 10^{9}\right. \)cell)을 만들어 \( 0.1 \mathrm{~cm} \) cuvette에 \( 40 \mu \mathrm{l}\) 씩 넣은 다음, pRSET B/ SPTLC 및 pRSET A/SPTLC2 DNA를 \( 1 \mu \mathrm{l}\) 과 섞어 \( 1.8 \mathrm{kV} \)에서 \( 5 \mathrm{msec} \)의 전류를 흘렸다(MicroPulser Electroporation Apparatus, Bio-Rad, USA). 형질전환된 BL21 균을 \( 35 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도의 chroramphenichol과 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도의 ampicillin이 함유된 LB plate에서 선별하였다. 선별된 pRSET B/SPTLC1 및 pRSET A/SPTLC2을 재조합한 BL21균을 chroramphe-nichol과 ampicillin이 들어있는 LB 액체배지에 배양하여 최종농도가 \( 1 \mathrm{mM}\) IPTG가 되도록 첨가함으로서 단백질을 발현시켰다. \( 10 \% \) acrylamide gel상에서 SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분리한 다음, nitrocellulose 종이에 전기적으로 단백질을 이동시키고 western blot을 행하였다. Ponceau 액으로 단백질들의 band를 확인한 다음 \( 5 \% \) skim milk로 blocking하고 1차 항체는 \(\left(\mathrm{His}_{6}\right) \)-tag에 대한 polyclonal antibody (sc-803, Santa Cruz Biotechnology Inc., USA)를 사용하였으며 2차 항체는 horse radish peroxidase가 부착된 anti-rabbit antibody(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., USA)를 사용하였다. 기질로는 Amersham 사의 ECL kit를 사용하였고, ECL용 hyperfilm에 감광시켜 발현된 SPTLC1 및 SPTLC2 단백질을 확인하였다.</p>
Total RNA로 부터 primary strand cDNA library를 얻기 위해서는 어떤 배지를 써야하나요?
DMEM 배지