<h2>Electroporation 방법에 의한 형질전환</h2><p>pEB 벡터에 혈전용해효소 유전자가 삽입된 plasmid DNA를 B. subtilis 168 competent cell에 가하여 얼음에 10분 간 방치하였다. Electroporator Gene Pulser \( { }^{R} \mathrm{II} \) (Bio Rad Co., USA)의 electric field strength \( (\mathrm{kV} / \mathrm{cm}) \)와 resistance \( (\Omega) \), capacitance \( (\mu \mathrm{F}) \)를 선택한 후 혼합된 cell을 cuvette에 미리 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온 수조에서 가온한 expression medium( \( 4 \times \) Penassay medium : \( 2 \times \) washing buffer) \( 1 \mathrm{m \ell} \)을 가하고 세포를 부유시켜 회수하였다. 그 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 항온수조에서 3시간 동안 배양한 다음 kanamycin \( (25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m \ell}) \)이 포함된 Luria Bertani 배지에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하였다.</p><h2>혈전용해효소 활성측정</h2><p>헐전용해효소 활성을 측정하기 위해 Astrup[2]방법에 따라 fibrin을 기질로 하는 fibrin plate법을 응용하였다. 즉 \( 0.4 \% \) Fibrinogen (from bovine plasma. Sigma Co., USA)을 \( 10 \mathrm{ml} \)의 sodium borate buffer ( \( 10 \mathrm{mM} \) sodium borate, \( 160 \mathrm{mM} \) boric acid, \( 40 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \), Merck Co., Germany)에 녹인 후 직경 \( 87 \times 15 \mathrm{~mm} \) petri dish에 넣고 thrombin \( 1 \mathrm{NIH} \) \( \mathrm {unit} \mathrm {/ml} \)) \( 20\mathrm{ unit}\)를 첨가하여 실온에 30분간 방치하여 응고시켰다. 응고된 fibrin plate에 시료를 적당량 loading하여 6 시간동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시켜 용해된 분해면적을 측정하였다. 표준혈전 분해효소로 \(1\mathrm{ unit}\)의 plasmin을 사용하여 비교하였다.</p><h2>재조합 균주의 배양 및 분비발현</h2><p>재조합 균주의 배양에 따른 혈전용해효소의 분비발현을 측정하기 위하여 kanamycin \( (10 \mathrm{mg} / \mathrm{m \ell}) \)이 포함된 \( 10 \mathrm{~m} \ell \)의 Luria-Bertani broth에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 동안 배양하였다. 이중 \( 5 \mathrm{~m} \ell \)를 취하여 \( 500 \mathrm{~m} \ell \)의 액체 배지에 다시 접종한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 진탕 배양(\( 150 \mathrm{rpm} \))하면서 생육단계인 대수 증식기, 정지기, 사멸기의 배양 상등액을 회수하여 SDS-PAGE의 단백질 전기영동을 실시하여 확인하였다.</p><h2>혈전용해효소의 정제 및 단백질 확인</h2><h3>Ammonium sulfate에 의한 효소의 농축</h3><p>재조합 균주를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 배양한 후 배양 상등액을 ammonium sulfate로 \( 70 \% \) 포화시킨 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 침전시키고 원심분리 \( \left(13,000 \times g, 30 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)하여 얻은 침전물을 \( 20 \mathrm{mM} \) sodium acetate buffer (\(\mathrm{ pH}\ 5.2\))에 용해하여 동일 buffer로 투석을 실시하였다. 투석 후 다시 원심 분리하여 침전물을 제거한 다음 얻어진 효소액을 다음 정제단계에 사용하였다.</p>
유전자가 삽입된 DNA를 어디에서 배양했나요?
항온수조에서