<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포 배양 및 지방세포 분화</h2><p>실험에 사용된 세포는 ATCC에서 구입한 3T3-L1과 본 연구실에서 확립한 사람의 중간엽줄기세포를 각각 \( 10 \% \)의 소 일반 혈청과 혈청이 공급된 DMEM 배양액을 이용하여 배양을 하였다. 세포가 배양용기에서 \( 70 \% \) 이상 배양되었을 때 \( 10 \% \) 소 태아 혈청과 \( 1 \mu \mathrm{M} \) dexamethasone, \( 0.5 \mathrm{mM} \) methyl-isobutylxanthine, \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin를 첨가하였다. 처리 후 48시간 후 \( 10 \% \) 소 태아 혈청과 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin 배양액으로 추가 배양을 실시하였다. 그리고 매 48시간마다 \( 10 \% \) 소태아 혈청이 포함된 DMEM 배양액으로 배양을 실시하였다.</p><h2>지방세포 염색</h2><p>분화된 세포의 지방 분화 정도를 측정하기 위하여 세포가 배양된 세포는 PBS로 세척하였으며 세척한 세포는 \( 3.7 \% \) formaldehyde를 이용하여 30분 고정처리한 후에 Oil-Red O지방세포 염색시약을 이용하여 1시간 정도 염색을 실시하였으며 PBS로 2-3번 수세한 후 현미경하에서 관찰하여 지방세포 분화 정도를 관찰하였다.</p><h2>RNA 분리 및 RT-PCR</h2><p>Total RNA를 분리하기 위하여 세포가 배양되고 있는 세포 배양기에서 배양액을 제거한 후 PBS로 2번 수세하고 trypsin-EDTA로 5분간 처리하여 세포를 수거하였다. 수거한 세포는 세포수를 측정한 후 Trizol reagent를 이용하여 total RNA를 분리한 후 DEPC water를 이용하여 정량 후 실험 사용 전까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하였다. cDNA를 합성하기 위하여 total RNA \( 2 \mu \mathrm{g} \)과 random primer를 총 \( 12 \mu \mathrm{l} \)가 되도록 한 후 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 처리하고 \( 4 \mathrm{ul} \)의 \( 5 \times \) First strand buffer와 \( 2 \mu \mathrm{l} \) \(0.1 \mathrm{M} \mathrm{DTT} \)를 첨가 한 다음 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 처리하였다. 2분 처리 후 Superscript Ⅱ RNaseH-Reverse transcriptase 1\( \mu \mathrm{l} \) (\( 200 \mathrm{unit}\))를 첨가하여 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 50분간 그리고 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 처리하였다. RT-PCR 산물은 사용전 까지 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하였다. PCR의 반응은 eppendorf사의 gradient PCR을 이용하여 수행하였으며 조건은 \( 100 \mathrm{pM} \)의 각 primer (Table 1)와 \( 5 \mathrm{mM} \)의 각 \( \mathrm{dNTP}\), \(0.5 \mathrm{unit}\)의 Taq polymerase를 사용하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 5분간 변성시킨 후 본 사이클에서 \( 95^{\circ} \mathrm{C}\) 1분, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 40초간 35사이클 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에 5 분간 진행 한 후 \( 1 \% \) agarose gel에 전기 영동하여 결과를 분석하였다.</p><h2>SiRNA를 이용한 유전자 전이</h2><p>아로마테이즈 유전자의 발현부위의 유전정보를 이용하여 Invitrogen의 합성툴을 이용하여 총 3종의 siRNA를 제작하였으며, 이중 발현율이 가장 우수한 siRNA 한종을 선택하여 계속 실험을 진행하였다. 유전자의 안정된 발현을 위하여 \( 2 \mathrm{mg} \)의 벡터를 약 \( 50 \% \) 정도의 세포가 자란 6 well plate에서 유전자 전이를 실시하였다. 유전자 전이를 위해서 먼저 Fugene 6와 벡터의 비율을 \(6:1\) 비율로 혼합하여 전이시켰으며 전이 후 \( 10 \% \) FBS가 포함된 배양액을 첨가하여 유전자 발현율을 증가시켰으며 각 실험조건에 따라 수행된 세포는 6-7일간 배양 한 후 지방관련 유전자의 발현양상을 검증하기 위하여 RNA를 추출하였으며 이를 통하여 DNA를 합성 한 후 각 유전자의 발현율을 검증하였다.</p><h3>세포 분화</h3><p>3T3-L1 cell을 분화시키기 위하여 DMEM 배양액에 \( 10 \% \)FBS와 dexamethason \( 500 \mathrm{nM} \), 3-isobutyl-1-methylxanthine\( 0.5 \mathrm{mM} \) 그리고 Insulin \( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 첨가하여 배양을 실시한다. 세포가 배양됨에 따라 대략 2-7일간 배양을 하며, 이후 세포 분화 검증을 위하여 Oil-red O 염색을 통하여 지방세포 분화정도를 측정하였으며, 일부 세포는 RT-PCR을 위하여 세포를 추출한 후 추후 발현율 검증을 위하여 \( -72^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하여 실험에 이용하였다.</p>
실험에 사용된 세포는 어디에서 구입하였는가?
ATCC