<h1>결과 및 고찰</h1><h2>활성유도분획법으로 황금 유효분획물 선정</h2><p>제2형 당뇨 치료를 위한 새로운 타겟으로 인슐린 신호전달을 조절하는 MG53 신규 단백질을 타겟으로 황금추출물에서 활성 유도분획법을 통해 칼럼분획물로부터 MG53-IRS-1 결합 억제 스크리닝을 통해 가장 높은 저해활성을 갖는 유효분획물 Fr. 10번을 선발하였고 MID에 활성을 나타낸 타겟 성분을 순수분리 연구를 실시하였다(data not shown). 그러므로 유효성분 규명 및 in vivo 실험을 위한 활성이 강하게 나타난 Fr. 10번과 동등하고 유사한 패턴으로 지표물질들이 다량 함유된 표준 유효분획물 대량제조가 필요하여 분취 스케일 업 연구를 실시하였다.</p><h2>분취를 위한 HPLC 분석조건 확립</h2><p>산업적 활용을 위해서는 비용단가 문제가 가장 큰 이슈이며 개발 초기단계 전부터 원료소재 확보를 비롯한 분석, 생산 등에 대해 고민하여 진행해야 한다. 최적의 분석조건을 확립하기 위해서는 산업적으로 활용이 어려운 ACN이 아닌 MeOH 용매를 기본으로 하는 분석조건을 확립하였다. 선행문헌을 통해 다양한 분석조건을 검토하였지만 목표로 하는 유효분획물에 포함된 지표성분 8종을 분석하기 위한 최적의 분석조건은 확인되지 않았다. 반복적인 분석조건 개발 및 검정을 통해 확립된 분석조건은 Table 1과 같으며, 크게 4개의 peak를 검출할수 있는 조건을 확인하였다(Fig. 1A). 검출된 4개의 peak들은 flavone의 구조로 매우 유사한 극성과 형태로 존재하여 MeOH을 분석조건에서 낮은 resolution과 overlapping으로 정확하게 분리되지 않았다. 그러나 표준 유효분획물에 포함된 8종의 지표성분들을 순수 분리하여 NMR을 이용한 구조동정과 분리된 표준폼을 이용한 MS 성분비교 추적을 통해 화합물들이 peak 1,2 , peak 3,4 , peak 5,6 , peak 7,8 번이 각각 하나의 peak로 존재하는 것을 확인하였다.</p><h2>분석에서 분취까지 스케일 업 연구</h2><p>Preparative-HPLC, MPLC, 개방형칼럼과 호환되는 효율적이고 예측 가능한 순수 단일성분 분리 및 정제 최종목표를 달성하기 위해서는 분석 HPLC와 분취 칼럼크로마토그래피 사이에서 동등한 선택성과 성능이 보장되어야 한다. 그러므로 스케일 업을 위한 크로마토그래피 이론에 대해 이해하고 숙달해야 한다. 또한 gradient elution 방법을 수정보완하고 추출물 샘플 주입 중 분취 장비의 역압(Back pressure)의 증가로 일어나는 초기 유속 감소를 피하기 위해 충분히 잘 녹이는 용매와 초기 유속을 저속으로 하여 확산을 방지하고 스테인레스 상업용 분취용 칼럼과 최대 \(100-200 \mathrm{bar} \) 의 압력을 견딜 수 있는 2개의 분취용 Armen MPLC과 K-Preb LAB기기를 사용하여 겪게 되는 문제를 해소하였다.</p><p>HPLC 분석조건에서 확인된 MeOH/DW를 이동상으로 하는 gradient elution과 유속 \(1.0\mathrm{mL} / \mathrm{min} \)조건에서 확인된 분석조건을 기반으로 칼럼의 직경이 18.9배 늘어남에 따라 동일한 조건에서 prep. scale-up calculator (https://ymc.de/preparative-lc-scale-up-calculator.html)를 이용하여 유속을 약 \(20.0\mathrm{mL} / \mathrm{min} \)로 증가시켜 preparative-HPLC와 Armen MPLC 분취실험을 진행하였다. Preparative-HPLC결과에서는 \(100 \mathrm{mg} \) 추출물에서 HPLC 비교로 동일한 패턴을 보임을 확인(Fig. 1B)하여 MPLC에 추출물 \( \mathrm{g} \) 로딩하여 Frs. \( +8\) 번 \(179.1 \mathrm{mg} \)을 \(17.9 \% \)의 수율, 추출물 \( 7 \mathrm{g} \) 일 때는 Frs. \( 7+8 \) 번 \(1232.4 \mathrm{mg} \)을 \(17.6 \% \)의 수율로 비슷한 결과를 확인하였다(Fig. 1C, D). 황금 추출물을 \(10 \mathrm{g} \)을 로딩한 K-Preb LAB에 스케일 업 진행에서는 칼럼 직경이 118.1배 늘어남에 따라 유속을 약 \(100.0 \mathrm{mL} / \mathrm{min} \)로 증가시켜 Frs. 2-5번 (\(1684.4 \mathrm{mg} \) )을 \(16.8 \% \)의 수율로 유사하게 확보하였다(Fig. 1E). 연속적으로 대량 표준 유효분획물 스케일 업 제조를 위해 개방형칼럼을 이용하여 황금추출물 \(100 \mathrm{g} \)을 유사한 이동상 조건 \(50 \% \) MeOH \(20\mathrm{L}\), \(70 \%\) MeOH \(16 \mathrm{L}\), \(100\%\) MeOH \(12\mathrm{L}\) 순서로 용출하는 칼럼크로마토그래피를 실시하고, 이를 5회 반복하여 표준 유효분획물을 대량으로 Frs. \( 2+3 \) 번 \(127.4( \mathrm{g}) \) 을 \(12.7\% \)의 수율로 확보하고 HPLC, preparative-HPLC, MPLC 크로마토그램과 동일한 패턴을 나타냄을 최종확인 하였다(Fig. 2). 초기 활성유도분획법으로 선정한 활성 분획물 Fr. 10번과 동일한 표준 유효분획물을 확보하기 위해 스케일 업 진행한 각각의 시료를(Armen MPLC Frs. \( 7+8 \), K-Preb LAB Frs. 2-5, 개방형 칼럼 Frs. \( 2+3 \) 에 대해 샘플농도 \(1,000 \mathrm{ppm} \) 으로 TLC (전개용매 \( 70\% \) MeOH) 및 UPLC-QTof-MS로 추출물 및 표준 유효분획물을 fingerprint 및 profiling 비교분석하여 동등성을 확인하였다(Figs. 3, 4). 반복적인 분취방법을 통해 최종 MG53-IRS-1 결합 억제제 저해 효능이 있는 표준화된 제조공정을 확립하였고 peparative-HPLC, MPLC, 개방형칼럼 유효분획물의 제조량과 회수율은 Table 1과 같으며, 분석 및 분취조건에서 확립된 크로마토그래피 조건 및 제조공정에 대한 표준절차방법을 구축하였다.</p>
산업적 활용을 위해서 비용단가 문제는 가장 중요한 요소야?
YES