<h1>실험결과</h1><h2>혈관내피세포 성장 실험결과</h2><p>본 연구자들은 lycopene이 혈관내피세포의 세포생물학적 기능에 미칠 수 있는 효과를 알기 위한 일련의 실험들을 수행하였다. 먼저, 혈관 내피세포 성장에 lycopene이 어떤 역할을 하는지 알기 위하여, 소 대동맥 내피세포에 lycopene을 전 처리한 후 세포성장이 대조군과 어떤 차이가 있는지 조사해 보았다. Lycopene의 전 처리는 다양한 농도 \( (0 \sim 10 \mu \mathrm{M}) \)로 처리하였으며, WST assay로 세포성장 정도를 평가하였다. Lycopene의 처리시간 및 농도 별 세포성장 실험결과는 Fig. 1에서 보는것과 같이, lycopene의 농도가 증가할수록 세포성장이 증가함을 볼 수 있었다. 이와 같이 농도 의존적으로 세포성장이 증가하는 것은 lycopene이 혈관내피세포의 성장을 촉진시킴을 의미한다.</p><h2>혈관내피세포 사멸 실험결과</h2><p>위의 결과에서 보듯이 lycopene이 혈관내피세포의 성장을 촉발하였으므로, 본 연구자들은 세포성장과 반대 기능인 내피세포의 세포사멸에는 lycopene이 어떠한 영향을 끼치는지 조사하였다. 내피세포는 세포 외 기질에 부착하여 성장하는 세포로서 세포사멸이 일어나면, 세포는 원형의 탈착부유 세포로 변한다. 따라서 원형의 탈착부유 세포 수를 세어 전체 세포 수에 대한 원형부유세포 수의 비율로 세포사멸 정도를 결정하였다. 세포사멸에 관한 양성 대조군을 얻기 위하여 etoposide로 세포사멸을 유도하였고, 양성 대조군의 처리조건과 동일하게 혈청기아 상태에서 lycopene 처리를 함으로써, 세포사멸의 영향에 미치는 lycopene의 영향을 평가하였다. 세포사멸에 관한 실험결과는 Fig. 2에서 보듯이, 다양한 농도의 lycopene을 처리한 어느 경우에서도 세포사멸의 정도가 음성 대조군의 결과와 의미 있게 차이 나는 실험군이 관찰되지 않았다. 이와 같은 결과는 lycopene이 내피세포의 사멸에는 영향을 미치지 않음을 의미한다.</p><h2>혈관내피세포의 세포이동 실험</h2><p>혈관내피세포의 생리활성 중 하나인 세포이동은 혈관신생 및 상처치유 과정에 일어나는 현상이기 때문에 혈관내피세포 의 세포이동에 관한 lycopene의 효과를 알기 위한 연구는 lycopene의 혈관 기능을 이해하는 데 중요하다. 본 연구에서는 혈관내피세포에 thymidine을 처리하여 세포성장을 중지시킨 뒤 스크래퍼를 이용하여 창상선을 만든 후 시면적에 이동한 세포 수를 세어 혈관내피세포 이동 정도를 평가하였다. Fig. 3에서 보듯이 혈관내피세포의 이동 정도는 lycopene의 농도가 증가함에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과를 통하여 lycopene의 혈관기능은 혈관신생 유도 및 상처 치유와도 연계되어 있음을 예측할 수 있다.</p><h2>백혈구의 내피층 부착에 관한 실험결과</h2><p>동맥경화발생은 초기에 혈관 내벽의 염증으로 인해 시작되는 것으로, 혈관의 염증반응은 동맥경화발생과 밀접한 관계가 있다. 염증반응의 초기 단계에는 혈액에 존재하는 백혈구가 혈관 내피층에 부착된다. 즉 백혈구의 혈관 내피층 부착은 동맥경화 발생의 초기단계의 한 현상이다. 본 연구자들은 백혈구의 in vitro 내피세포 부착실험으로 동맥경화발생에 미치는 lycopene의 효과를 평가하였다. 양성대조군 실험을 위하여 lipopolysaccharide (LPS, \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), Sigma-Aldrich)를 사용하였다. LPS는 그람양성균의 세포벽 외막을 구성하는 물질로 염증 반응을 유도한다. 또한 내피세포에 LPS를 처리하게 되면 케모카인의 분비가 유도되어, 분비된 케모카인의 활성으로 백혈구의 내피층 부착이 일어나게 된다. 실험결과, lycopene을 내피세포에 처리한 경우, LPS에 의해 유도되는 림프구인 THP-1 세포의 내피세포 부착 정도가 lycopene의 처리 농도가 증가할수록 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 4). 이와 같은 결과는 lycopene이 혈관내의 염증 반응을 억제할 수 있음을 의미한다.</p><h2>세포신호전달물질의 활성에 미치는 lycopene의 효과 실험 결과</h2><p>Mitogen activated protein kinases (MAPK)는 다양한 세포 생리활성에 관여하는 세포신호전달물질이다. MAPK 중에서 중요한 family member로는 extracellular signal regulated kinase (ERK), c-Jun-N-terminal kinase (JNK), p38 MAPK 등이 있으며 이들은 혈관내피세포의 기능에 다양한 역할을 하고 있다. 한편, 활성화된 eNOS에 의해 만들어지는 산화질소(nitric oxide)는 혈관확장, 세포성장에 관여하는 등 혈관내피세포에서 여러가지 중요한 생리적 기능에 관여하는 혈관 조절인자로 잘 알려져 있다. 따라서 lycopene이 관여하는 세포생리활성에 이와 같은 세포신호전달물질이 어떤 역할을 하는지 알기 위한 실험을 진행하였다. 먼저, lycopene이 MAPK나 eNOS의 활성을 촉진하는지 알아보았다. 실험 결과, Fig. 5에서 보는 것과 같이 lycopene의 처리는 ERK, p38 MAPK 그리고 JNK의 활성을 촉진시켰으나, eNOS의 경우에는 영향을 미치지 않았다. MAPK들의 활성 패턴은 ERK, p38 MAPK의 경우, 5 분에 인산화가 극대화 되었고, 그 이후 1시간 까지 활성이 계속 유지된 반면, JNK의 경우는 \(5 \sim 15\)분에 활성이 최대치로 되었다가 30분 이상이 되면 다시 음성 대조군 수준으로 저하되는 것을 확인하였다.</p><h2>혈관내피세포 기능에 관여하는 세포신호전달물질 역할 규명에 관한 연구 결과</h2><p>Lycopene에 의해 조절되는 신호전달물질들을 다시 한번 요약해보면 lycopene은 ERK, p38 MAPK 그리고 JNK의 활성을 촉발하였지만, eNOS의 활성에는 아무런 영향을 주지 않았다. 또한 MAPK가 lycopene의 생리활성에 얼마나 특이적으로 관여하는지 알기 위하여 각 신호전달물질의 억제제를 전 처리한 후 lycopene의 생리활성의 변화를 관찰하였다. 흥미롭게도 p38 MPAK의 억제제인 SB-203580와 ERK의 억제제인 PD-98059의 전 처리는 lycopene에 의해 유도되는 세포성장을 감소시켰다(Fig. 6A). 이는, p38과 ERK MAPK가 lycopene에 의해 촉발되는 세포성장에 관여함을 의미한다. 한편, Fig. 6B에서 보는 바와 같이 THP-1의 내피세포 부착에는 어느 억제제도 lycopene의 이종세포간 세포 부착 증진 효과를 변화시키지 않았다. 이는 MAPK와 eNOS가 lycopene 유발 이종세포간 부착에는 관련이 없음을 의미한다. 마지막으로 Fig. 6C에서 보는 바 와 같이 lycopene에 의해 유발되는 혈관내피세포 이동은 SP-600125 (JNK 억제제) 전 처리의 경우에 세포이동이 가장 많이 억제되었다. 이는 JNK가 lycopene 유발 내피세포이동에 직접적으로 관여함을 의미한다. 내피세포이동에 JNK가 연계되어 있음은 다른 연구에서도 확인되었다. 종합해보면, lycopene에 의해 활성화되는 MAPK들은 각각 다른 내피세포활성에 관여함을 확인하였다. 즉, ERK와 p38 MAPK는 내피세포 성장에 관여하고, JNK는 내피세포이동에 각각 다르게 연계되어 있으며, 이는 lycopene이 보다 다양한 혈관기능에 관여할 가능성이 있음을 암시한다.</p>
Lycopene를 전 처리한 농도는 얼마인가?
\( (0 \sim 10 \mu \mathrm{M}) \)