<h1>재료 및 방법</h1><h2>Zebrafish의 사육</h2><p>Zebrafish는 적정 생육온도인 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)로 수온을 유지하여 사육하였다. Zebrafish의 산란과 수정은 빛에 의하여 유도되므로 zebrafish 생육과정은 낮 14 시간과 밤 10 시간으로 명암 주기를 조절하여 관리하였다. Brine shrimp (INVE)를 \( 28.5^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지한 \( 2\% \) 소금물에서 18 시간 배양하여 부화시킨 후 깨끗한 물로 소금기를 제거하고 zebrafish 먹이로 사용하였다.</p><h2>Zebrafish 발현 용 hHtrA2 plasmid 제조</h2><p>Zebrafish에서 hHtrA2를 발현시키기 위하여 hHtrA2 cDNA를 pCS2+ expression vector에 클로닝 하였다. Zebrafish에서 발현된 단백질을 용이 하게 관찰하기 위하여 HtrA2의 C-terminus에 green fluorescence protein (GFP)를 fusion 시킨 plasmid를 제작하였다. 아미노산 134-458을 포함 하는 hHtrA2 mature form의 cDNA는 pFlag-hHtrA2 (aa 134-458) plasmid를 Bgl Ⅱ와 Kpn Ⅰ 으로 절단하여 얻었다. Bgl Ⅱ와 Kpn Ⅰ 으로 절단한 pEGFP-N3 plasmid (Clonetech)에 hHtrA2 fragment를 삽입하여 제작한 plasmid를 pEGFP-hHtrA2-GFP라 명명하였다. pEGFP-N3 plasmid의 Xba I enzyme site 주위의 sequence가 TCTAGATC(볼드체는 Dam methylase가 인지하는 nucleotide sequence임)이므로 E. coli 내에서 GATC sequence 중 A의 \( \mathrm{N}^{6} \) position이 Dam methylase에 의해 methylation되므로 Xba I (TCTAGA 인지) 효소로는 이 부분을 절단할 수 없다. 이 문제를 해결하기 위해 pEGFP-hHtrA2-GFP plasmid를 Dam methylase가 결여된 E. coli인 DAM strain에 transformation 시킨 후 Bgl Ⅱ와 Xba I 으로 절단하였다. 이렇게 얻어진 hHtrA2 (aa 134-458)-GFP를 BamH I 과 Xba I 으로 절단한 PCS2+ plasmid에 cloning하여 제작한 plasmid를 pWT-GFP라 명명하였다. Serine 306 residue를 alanine으로 변경하여 serine protease 효소 활성을 제거한 HtrA2 mutant form을 포함하는 pFlag-hHtrA2 (aa 134-458, S306A)로부터 hHtrA2 (S306A) fragment를 얻어 상기에서 설명한 방법으로 plasmid를 제작하여 그 이름을 pS306A-GFP라고 명명하였다.</p><h2>pRFP-NLS plasmid 제조</h2><p>Nucleus targeting vector를 제작하기 위해 red fluorescence protein (RFP)의 C-terminus에 nucleus localization signal (NLS)를 결합시켜 pRFP-NLS plasmid를 클로닝하였다. 이를위해 RFP cDNA fragment는 pDsRed1-N1 plasmid (Clonetech)를 template로 하여 PCR을 통해 얻었다. PCR을 위해 사용한 primer는 RFP-F (5'-GCGCGAATTCATGGTGCGCTCCTCCAAGAAC-3')와 RFP-R (5'-GCGCGCGGCCGCTAGTCGACCAGGAACAGGTGGTGGCGGC-3')이다. 증폭한 RFP fragment는 EcoR I 과 Not I restriction enzyme으로 절단하여 pEGFP-N1 plasmid (Clonetech)에 삽입하여 pRFP를 제작하였다. NLS 부분의 nucleotide를 얻기 위해 N1~N4의 4종류의 primer를 이용하였다: N1 (5'-GCGC GTCGACGATCCAAAAAAGAAAAGAAAGGTAGATCCAAAA-3'), N2 (5'-TAC CTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATC-3'), N3 (5'-A AGAAGAGAAAGGTAGATCCA-3'), N4 (5'-GCGCGGCCGCTTATACCTTTCTC TTCTTTTTTGGATC-3'). 먼저 N1과 N2를 혼합(A)하고 N3와 N4를 혼합(B)한 후 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 열을 가한 후 서서히 냉각시켜 각 complementary strand들을 annealing시켰다. A와 B 반응물을 흔합하여 T4 DNA ligase (Takara)를 이용하여 두 fragment를 ligation하여 PCR template로 이용하였다. 이 NLS template를 N1과 N4 primer를 이용하여 PCR로 증폭한 후 Sal I 과 Not I restriction enzyme으로 절단하여 pRFP (Sal I과 Not I 으로 절단) plasmid에 cloning하여 pRFP-NLS라고 명명하였다.</p>
적정 생육온도인 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)로 수온을 유지하여 사육한 어류는 뭐야 ?
Zebrafish