<h1>재료 및 방법</h1><h2>DNA추출</h2><p>본 실험에 사용된 능이버섯은 경북 울진 매전면에서 채집한 것이다. 능이가 배양이 되지 않기 때문에 Gardes등의 방법에 따라 자실체에서 직접 DNA를 추출하였다. \( 1.4 \mathrm{M} \) \(\mathrm{Nacl}\), \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris-Hcl, \( 20 \mathrm{mM} \) EDTA 및 \( 2 \% \) CTAB의 lysis buffer에 동결건조한 능이버섯 자실체를 넣고 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 90분간 처리하였다. 이를 \( 2000 \mathrm{~g} \) 에서 5분간 원심분리하여 상층액을 취하였고 상층액과 같은 양의 chloroform을 첨가하였다. 분리된 액상에서 상등액을 제거한 다음 2배의 isopropanol을 첨가한 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 처리하여 DNA 를 침전시켰다. \( 13000 \mathrm{~g} \) 에서 30분간 원심분리하여 침전된 DNA pellet을 추출하였고 이를 \( 70 \% \) ethanol로 세척한 다음 공기건조한 후 100 \( \mu \mathrm{l} \) 의 TE buffer ( \( 10 \mathrm{mM} \) Tri-Hcl, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA)를 첨가하였다.</p><h2>ITS Primer</h2><p>Sarcodon aspratus 및 Lepista속 균주의 ITS 영역을 증폭하기 위하여 White 등에 의해 보고된 fungi의 ITS 영역 증폭 primer를 이용하였으며, 이들의 oligomer 염기서열과 진균류의 일반적인 rDNA gene cluster로서 16 S ribosomal DNA, ITS Ⅰ 과 5.8S ribosomal DNA 그리고 ITS2 영역 및 28 S ribosomal DNA 등을 증폭하였으며 이 중 16S ribo-somal DNA 와 28S ribosomal DNA 는 일부분을 나머지는 전부분을 증폭하였다.</p><h2>반응액의 조성과 PCR 조건</h2><p>ITS 영역 증폭을 위한 PCR reaction mixture의 조성은 RAPD 방법과 동일하게 Bioneer PCR kit를 사용하였다. 본 실험은 MJ Research PTC 150 minicycler에서 수행하였으며 thermal cycle의 program은 primer ITS 1과 2, ITS 3과 4의 반응 조건을 달리하여 실험하였다.</p><p>ITS primer 1 과 2 의 반응 조건은 template DNA 변형을 위해 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분간 predenaturation 한 다음, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초간 denature, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 exten-sion을 1분씩 처리하여 DNA를 증폭시키는 것을 1 cycle로 하여 40 cycle로 수행하였다. ITS primer 3과 4 의 반응 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분간 predenaturation 한 다음, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초간 denature, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 elongation 을 1분씩 처리하여 DNA를 증폭시키는 것을 1 cycle로 하였다. 이번 실험에서는 40 cycle로 수행하였으며, DNA 증폭이 끝난 후 최종적인 합성을 위해 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 안정화한 다음, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관 사용하였다.</p><h2>PCR product의 정제 및 ITS 염기서열 분석</h2><p>ITS 영역의 PCR product는 \( 5 \mathrm{ng} / 100 \mathrm{ml} \)의 농도로 ethi-dium bromide를 첨가한 \( 1 \% \) 의 agarose gel (Sigma Co.)에서 1 X TAE buffer에서 \( 50 \mathrm{mV} \) 로 electrophoresis하였다. UV transilluminator상에서 나타나는 DNA band를 확인한 후, QIA-quick PCR purification kit (Qiagen Inc., USA)를 이용하여 정제하였다.</p><p>정제된 PCR 산물을 이용하여 Perkin-Elmer applied bio-systems ABI 377A sequencer (Perkin-Elmer Co., USA)를 이용하여 PRISM Dye Dideoxi Terminator Cycle Sequencing Kit로 분석하였다. 얻어진 염기서열을 Gen Bank 데이터베이스에 등록된 것들과 상동성을 비교하였다.</p><p>염기서열은 Sequencher (Gene codes Co., USA), Clustal X를 이용하여 alignment 시킨 후, 최종 세부 정열은 수작업으로 보정하였다.</p>
template DNA 변형을 위해 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 몇 분간 predenaturation 했을까?
3분간