<h2>형질전환된 담배의 PCR 확인</h2><p>최종적으로 얻게 된 형질전환체를 보다 정확하고 빠른 시간 내에 많은 양을 분석하기 위하여 PCR 방법으로 형질 전환체를 분석하였다. 형질전환체에 클로닝된 NPT-Ⅱ (neomycin phosphotransferase) gene을 primer로 사용하였고 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 20초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 1분을 35 cycle로 반응시켰다. NPT-Ⅱ gene 은 binary vector pIG121-Hm의 선택 표지로써 PCR에 의해 amplify되며 간접적으로 T-DNA 형질전환됨을 확인할 수 있었다. C4H activity 조사시 stress를 주지 않았을 때 대조구가 비슷한 양상을 나타내었다. Stress를 주었을 때 대조구와 비교하여 3 promoter는 1.3 배 activity가 높아졌으며 4 번은 1.4배, 6은 2 배, cyc600 은 1.1배 높아졌다. 이런 것으로 보아 이 promoter들은 UV에 response하는 promoter이며 앞으로 stress에 저항하는 유전자의 promoter로써 유용하다고 사료된다. CASC-C4H construct로 형질전환된 개체는 NPT Ⅱ gene의 일부인 \( 553 \mathrm{bp} \) size의 bands를 나타내어 PCR로 각 형질 전환체를 확인하였다.</p><h2>형질전환된 담배의 Southern blotting 분석</h2><p>GUS histochemical assay와 PCR 을 통해 확인된 담배 형질전환체에 대하여 Southern blot 분석으로 형질전환 여부를 조사하였다. 먼저 형질전환체의 genomic DNA (\( 15 \mu \mathrm{g} \))을 분리한 다음 제한 효소 HindII, PstI 으로 절단하고 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기영동 하였다. Size fraction된 DNA를 nylon membrane으로 boltting 시키고 NPTII gene을 probe로 사용하여 Southern blot 분석하였다. Fig. 5 에 나타난 바와 같이 lane 1은 대조구이며, lane 2,3,5,7,9 는 약 \( 1 \mathrm{~kb} \) 에서 positive signal을 보여 형질전환체임이 확인되었다.</p><h2>형질전환된 담배의 C4H 효소활성 측정</h2><p>C4H 는 고등식물의 다양한 phenolic compounds 생합성에 있어 중요한 역할을 하는 가수분해 효소이다. C4H en-zyme은 다양한 defense에 관련된 key enzyme인 것으로 밝혀졌다. 클로닝된 형질전환체에 sesquiterpene cyclase-C4H gene으로 형질전환된 전환체는 UV 등의 환경 스트레스에 강하게 반응하여 무처리에 비해서 UV를 쬐어준 후 12 시간이 지났을 때의 반웅이 강하게 나타나는 것을 볼 수 있다. 이와 같은 스트레스에 대한 반응은 시간이 경과함에 따라 가속될 것이라 예상되었다.</p><p>Sesquiterpene cyclase-GUS로 형질전환된 담배는 UV stress를 주었을 때 promoter 3 번의 경우는 GUS 발현량이 대조구에 비하여 약 1.3 배 높아졌다고 보고 되었다. 이런 결과를 미루어 UV에 response 하는 promoter라고 가정할 경우 C4H gene의 발현 량도 UV 에 조사에 의하여 높아질 것으로 기대하였다. 그러나 이런 경우는 담배에 이미 intact 한 C4H gene이 존재하고 정상적으로 발현하기 때문에 feed back inhibition도 가정하였다. 그러나 스트레스 환경에서 일반적으로 C4H activity가 증가하는 것으로 알려져, feed back inhibition은 크게 문제가 되지 않을 것으로 사료되었다. 본 연구에서는 CASC 3,4,6 으로 형질전환된 담배에 UV 를 조사하여 12시간 후에 C4H activity를 조사하였다. C4H activity 조사시 stress를 주지 않았을 때 대조구와 비슷한 양상을 나타내었다. Stress를 주었을 때 대조구와 비교하여서는 3 promoter는 1.3 배 activity가 높아졌으며 4 번은 1.4 배, 6은 2배, cyc 600 은 1.1 배 높아졌다(Fig. 6). 이런 것으로 보아 이 promoter들은 UV에 response하는 promoter이며 앞으로 stress에 저항하는 유전자의 promoter로써 유용하다고 사료된다.</p>
PCR 방법으로 형질 전환체를 분석한 이유가 뭐야?
최종적으로 얻게 된 형질전환체를 보다 정확하고 빠른 시간 내에 많은 양을 분석하기 위하여