<h1>결과 및 고찰</h1><h2>GABA 생산균주의 분리 및 선발</h2><p>180 여종의 젓갈과 김치 시료를 각각 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 취한 후 멸균 생리식염수를 이용하여 단계별로 희석한 다음 BCP 배지에 도말하였다. BCP 배지상에서 균체주변으로 형광색환을 나타내는 86 종의 균주를 1 차적으로 선별하였다. 선별된 균주들을 MRS agar배지에 2회 계대배양하여 순수분리된 균주들을 MRS broth에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 배양하였다. 배양후 얻은 배양액을 silica gel TLC상에 점적하여 표준품인 GABA와 \( \mathrm{R}_{\mathrm{f}} \) 치가 같은 균주들을 2차 선발하였다. 2차 선별된 균주들을 MRS broth에 \( 1 \% \) MSG를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간 정치배양 후 배양 상등액을 TLC상에 점적하여 GABA spot이 크고 진한 3개의 균주를 GABA 고생산 균주로 최종 선별하였다. 선별된 3개의 균주를 아미노산 분석한 결과 AML15 균주가 GABA 생성능이 가장 우수한 것으로 조사되어 본 실험균주로 사용하였다. 아미노산 분석에서 GABA와 glutomic acid의 retention time은 110.4분과 45.2분으로 각각 조사되었다.</p><h2>분리균주의 동정</h2><p>GABA 생산균주로 선별된 AML15의 \( 16 \mathrm{~S} \) rDNA 부분 염기서열을 분석하여 얻은 \( 450 \mathrm{bp} \) 의 염기서열을 NCBI의 Genebank에 등록된 nucleotide data base와 비교하여 본 결과 Lactobacillus brevis ATCC 367의 동일 영역 염기서열과 \( 99 \% \) 의 유사도를 나타내었다. 이와 같은 결과를 토대로 AML15 strain을 Lactobacillus brevis로 동정하였고, L. brevis AML15로 명명하였다.</p><h2>Glutamic acid 첨가에 의한 GABA의 생산</h2><p>GABA는 glutamic acid가 glutamic acid decarboxylase에 의하여 탈탄산이 이루어지면서 생성된다[25]. 따라서 본 연구에서는 L. brevis AML15균주를 MRS broth배지에 \(5\%\) (w/v) MSG 첨가 후 초기 pH를 4.0,5.0과 6.0으로 조정하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간 정치배양하였다. 그 결과 초기 pH를 4.0으로 조정한 배지에서는 균주의 생육이 나타나지 않았으며 pH의 변화도 나타나지 않는 것으로 조사되었다. 초기 pH를 5.0과 6.0으로 조정한 배지에서는 모두 균주의 생육이 나타났으며 생육도와 pH의 변화는 큰 차이가 없는 것으로 조사되었다. 초기 pH 조정에 따른 GABA와 MSG의 함량변화를 조사한 결과 초기 pH를 4.0으로 조정한 배지에서는 균주의 생육이 나타나지 않았으므로 GABA의 생성 및 첨가한 MSG의 함량변화가 나타나지 않았다. 초기 pH를 5.0과 6.0으로 조정한 배지에서는 GABA의 생성과 MSG의 함량변화를 확인할 수 있었으며 특히, 초기 pH를 6.0으로 조정한 배지보다 초기 pH를 5.0으로 조정한 배지에서 GABA 함량이 \( 3,604 \mathrm{nM} / \mu \mathrm{l} \) 더 높아졌으며, MSG 함량도 \( 2,752 \mathrm{nM} / \mu 1 \) 더 낮아지는 것으로 조사되었다. 초기 pH 조절에 따른 GABA 생성능을 확인하였을때 초기 pH를 5.0으로 조정한 배지에서 가장 높은 GABA의 생성능이 나타남에 따라 GABA 고생성을 위 한 배지의 초기 pH를 5.0으로 조정하여 실험하였다. 다음으로 MRS broth에 \(5\%\) (w/v) MSG 첨가 후 초기 pH를 5.0으로 조정하여 72시간 정치배양하면서 경시적으로 GABA와 MSG의 함량변화를 조사하였다. 그 결과 GABA의 생성은 12 시간 배양하였을 경우에는 큰 변화가 없었으나 24시간 배양이후 급격히 증가하여 48시간 배양하였을 때 가장 높은 GABA 생성이 나타났으며 48 시간 이후에는 일정하게 유지되는 것으로 조사되었다. 반대로 MSG의 함량 변화는 GABA의 생성과 반대의 경향으로 나타났으며 12시간 배양하였을 경우에는 MSG의 함량변화가 나타나지 않았으며 24 시간 배양이후 MSG의 함량이 급격히 감소하는 것으로 조사되었다. 상기의 결과는 MSG 농도 \( 5 \% \) 이상에서는 균체 증식과 GABA 생산 모두 저해를 받았다는 강의 결과와 상이함을 보였으며 최 등의 결과와 일치하였다. 균주의 생육도는 48 시간이 최대증식기인 것으로 보이며, GABA의 생성과 비교하였을 때 균주의 배양시간은 48 시간이 가장 적당한 것으로 사료된다. 다음의 실험결과로 미루어보아 GABA 고생산 배양조건은 MSG broth 배지에 \(5\%\) (w/v) MSG 첨가 후 배지의 초기 pH를 5.0으로 조정하여 48 시간 배양하는 것이 가장 적합한 것으로 사료된다.</p><h2>PLP첨가에 따른 GABA의 생산증가</h2><p>Pyridoxal phosphate (PLP)는 비타민 \( \mathrm{B}_{6} \) 의 보조효소이며 GAD 효소활성에 필요한 조효소로 작용한다. GABA 생산 배지에 PLP를 0,10,50과 \( 100 \mu \mathrm{M} \) 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 정치배양하였다. 그 결과 PLP를 농도별로 첨가했을 때와 PLP를 첨가하지 않았을 때 균의 생육도는 비슷하게 나타난 것으로 조사되었으며 pH의 변화가 없는 것으로 조사되었으며, PLP의 첨가는 균주의 생육도와 pH의 변화에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다.</p><p>PLP 첨가유무에 따른 AML15번 균주의 GABA 함량은 PLP를 첨가하지 않았을 때 \( 9,606 \mathrm{nM} / \mu \mathrm{l} \) 생산되었으며 PLP를 \( 10 \mu \mathrm{M} \) 첨가하였을 때 \( 10,424 \mathrm{nM} / \mu \mathrm{l} \) 로 \( \mathrm{GABA} \) 함량이 \( 1,169 \mathrm{nM} / \mu \mathrm{l} \) 더 증가되었다. MSG의 함량은 PLP를 첨가하지 않았을 때 \( 10,207 \mathrm{nM} / \mu \mathrm{l} \) 감소되었으며 PLP를 \( 10 \mu \mathrm{M} \) 첨가하였을 때 \( 384 \mathrm{nM} / \mu 1 \) 로 MSG 함량이 \( 1,159 \mathrm{nM} / \mu 1 \) 더 감소되어 MSG에서 GABA로의 전환력이 높아지는 것으로 조사되었다. PLP의 첨가농도가 증가되어도 GABA 생산량과 MSG의 함량에는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 이 결과를 토대로 PLP의 첨가는 균주의 생육도와 pH에 큰 영향을 주지않으며 PLP의 첨가농도는 \( 10 \mu \mathrm{M} \) 이 가장 좋은 것으로 사료된다.</p><p>PLP를 \( 10 \mu \mathrm{M} \) 첨가하였을 때 GABA 생성량이 가장 좋았다는 실험 결과는 Komatsuzaki 등의 결과와 일치하였다. 이상의 결과를 토대로 \( 5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 이상의 고농도 MSG로부터 GABA 생산에 관한 연구와 MSG에서 GABA로의 전환에 필요한 GAD 효소에 관한 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.</p>
순수분리된 균주들을 MRS broth에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 배양해서 얻은 배양액을 무엇과 \( \mathrm{R}_{\mathrm{f}} \) 치가 같은 균주들을 2차 선별했어?
GABA