<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주 및 배양 조건</h2><p>대장균 KAM32 균주( \( \triangle a c r B, \triangle y d h E) \) 와 emeA 유전자로 형질전환된 KAM32 /emeA균주는 LB 배지, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 배양하였으며, 성장의 모니터링은 \( 650 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도로 측정하였다. 대장균 KAM32 균주는 대장균의 주요한 다제배출 펌프단백질 유전자인 acrB및 ydhE를 결손하여 다양한 항생제에 대해 초감수성을 나타내는 균주로서, 항생제 내성유전자 클로닝에 매우 적합한 균주이다. 본 실헙에 사용된 EmeA를 발현하는 대장균 KAM32/pTEF71 형질전환 균주(KAM32/emeA)는 이전 보고에서 클로닝된 균주를 사용하였 다. 플라스미드 pTEF71는pBR322의KpnI과NruI사이트에 emeA 유전자가 삽입된 형태로 제작되었으며, 대장균 KAM32에서 EmeA를 잘 발현하는 것으로 보고되었다.</p><h2>EmeA 아미노산 서열 분석</h2><p>EmeA의 소수성 분석 및 막관통 구조 분석은 GENETIX-WIN (Ver. 5.0) software와 SOSUI (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/) 프로그램 을 이용하였다. EmeA homologue는 EmeA 유전자(Accession No. AB091338)의 아미노산 서열을 바탕으로 NCBI-BLAST2 (http://www.ebi.ac. uk/blastall/)에서 검색하였고, 각각의 유사단백질의 아미노산 서열을 바탕으로 GENETIX-WIN (Ver. 5.0) software와 CLUSTAL W 프로그램(http://align.genome.jp/)을 이용하여 multiple sequence alignment와 dendrogram을 작성하였다.</p><h2>약제 감수성 시험</h2><p>각종 약제의 미생물에 대한 최소생육저해농도(minimal inhibitory concentration, MIC)는 Difco사의 Muller-Hinton broth를 이용하여 NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standard)의 방법에 따라 표준액체희석법으로 실시하였다.</p><h2>Ethidium bromide와 acriflavine 약제의 세포 내 축적</h2><p>대장균 KAM32 균주와 KAM32/ emeA 균주를 LB 배지, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 대수증식기까지 배양한 후, 원심분리하여 \( 2 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{MgSO}_{4} \) 를 포함하는 Tanaka 완충액으로 1회 세척하였다. 세균을 다시 \( 0.1 \) M MOPS-tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 완충액 \( (\mathrm{pH} 7.0) \) 에 현탁시켜 실험에 사용하였다. 세균현탁액 \( 2 \mathrm{ml} \) 를 형광 분광광도계용 큐벳에 담고, 에너지원으로 포도당 \( 20 \mathrm{mM} \) (최종농도)을 공급하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하면서, 형광광도의 변화를 관찰하였다. 5 분간 방치 후 \( 10 \mathrm{uM} \) 의 ethidium bromide (EtBr)나 \( 4.2 \mathrm{uM} \) 의 acriflavine을 세포 현탁액에 첨가하였으며, ethidium bromide의 경우 형광의 증가가, acriflavine의 경우 형광의 감소가 완만해 졌을 때, \( 40 \mathrm{uM} \) 의 carbonyl cyanide-m-chlorophenylhydrazone (CCCP)를 첨가하 였다. 형광은 Hitachi F2000 형광 분광광도계를 사용하였으며, 세포 속에 남아있는 형광의 양은 상대적인 수치로 표시하였 다. Ethidium bromide의 excitation 파장은 \( 500 \mathrm{~nm} \), emission 파장은 \( 580 \mathrm{~nm} \) 를 사용하였으며, acriflavine의 excitation 파장 은 \( 468 \mathrm{~nm} \), emission 파장은 \( 499 \mathrm{~nm} \) 를 사용하였다.</p><h2>Ethidium bromide 약제 배출활성 측정</h2><p>Ethidium bromide의 세포 외 배출활성 촉정실험은 Morita 등의 방법을 변형하여 실시하였다. Ethidium bromide는 세포 내의 이중나선 DNA에 결합하여 형광의 증가를 나타낸다. 대장균 KAM32균주와KAM32/emeA) 균주를 LB배지, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 대수증식기까지 배양한 후, 원심분리하여 \( 2 \mathrm{mM} \) \(\mathrm{MgSO} 4 \) 를 포함하는 Tanaka 완충액으로 1회 세척하였다. 회수된 세포를 다시 \( 10 \mathrm{uM} \) ethidium bromide와 \( 40 \mathrm{uM} \) CCCP의 존재하에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 배양하여 세포 내에 ethidium bromide를 축적시켰다. 그 후 세포를 \(2 \mathrm{mM} \) \(\mathrm{MgSO}_{4} \) 와 \( 20 \mathrm{mM} \) KCl, 그리고 \( 10 \mathrm{uM} \) ethidium bromide가 포함된 0.1 M MOPS-TMAH (pH 7.0) 완충액으로 세번 세척한 후, 동일한 완충액에 현탁시켰다. Hitachi 2000 형광 분광광도계로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 를 유지하면서, 세포 현탁액에 최종농도 \( 20 \mathrm{mM} \) 의 포도당을 에너지원으로 공급하면서 형광의 증감을 관찰하였다.</p><h2>Reserpine에 의한 약제 배출활성의 저해</h2><p>세포 현탁액은 약제 배출활성 측정실험의 경우와 동일하게 준비하였다. \( 0 \mathrm{uM} \) 에서 \( 100 \mathrm{uM} \) 까지 여러 가지 농도의 re-serpine을 세프 현탁액에 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 방치한 후, 최종농도 \( 20 \mathrm{mM} \) 의 포도당을 공급하였다. Reserpine의 ethidium bromide 배출활성에 대한 \( IC_{50} \) 는 포도당 공급 직후 20초간의 초기감소속도를 기준으로 계산하였다.</p>
SOSUI 프로그램과 GENETIX-WIN (Ver. 5.0)를 통해 무엇을 분석할 수 있어?
EmeA의 소수성 분석 및 막관통 구조 분석