<h1>결 과</h1><h2>Sulforaphane은 인간 연골암 세포주 HTB 94에서 세포 사멸을 유도한다</h2><p>Sulforaphane (SFN)은 여러 종양세포에서 항암효과와 염증 유발인자의 활성저해 및 세포사멸에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그러나 연골암세포에서 SFN에 의한 세포사멸에 대한 연구는 미비하여, 본 연구에서는 인간 연골암 세포주 HTB-94 세포에 SFN을 처리하여 세포사멸에 미치는 영향 및 이의 분자적 기전을 알아보았다. HTB-94 세포에 SFN을 24시간 처리하여 세포형태를 위상차 현미경을 이용하여 확인한 결과 세포의 부피 감소와 더불어 SFN의 처리농도가 높아질수록 세포사멸 정도가 증가함을 알 수 있었다. 이에 세포사멸정도를 정량화 하고자 MTT assay를 한 결과 SFN의 처리농도가 증가 할수록 세포생존률이 감소함을 확인할 수 있었다. 유세포분석기(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS)를 사용하여 세포사멸 정도를 확인해 본 결과 세포사멸을 나타내는 Sub G1기 세포수가 SFN \( 10 \mu \mathrm{M} \) 에서 \(9.03\%\), \( 20 \mu \mathrm{M} \) 에서 \( 15.17 \%\), \(30 \mu \mathrm{M} \) 에서 \( 32.3 \% \) 정도 증가하였으며, \( 50 \mu \mathrm{M} \) 에서는 \( 48.76 \% \) 정도로 거의 반 정도의 세포사멸이 일어난 것으로 확인되었다. 이는 연골암세포의 사멸정도가 SFN 처리농도 의존적으로 일어남을 확인할 수 있었다. 본 연구결과를 종합해 볼 때, SFN은 인간 연골암 세포주인 HTB-94에서 처리농도 의존적으로 세포사멸을 유도하는 것을 확인할 수 있다.</p><h2>Sulforaphane은 HTB-94에서 p53과 caspase-3 활성 의존경로를 통하여 세포사멸을 유도한다</h2><p>위의 실험결과를 토대로 연골암 세포주 HTB-94에서 SFN 처리 시 일어나는 세포사멸에 관련된 분자적기전을 알아보고자 세포사멸 주요 관련단백질로 알려진 p53 단백질의 발현정도를 Western blot analysis를 통해 알아본 결과 SFN 처리농도 의존적으로 발현량이 증가함을 확인 할 수 있었다. 본 실험에 사용되어진 HTB-94 세포는 mutant p53 genotype을 가지는 세포주로 알려져 있어 세포사멸 신호전달계에는 p53 단백 질이 관여되지 않을 것으로 예상하였으나, SFN 처리 시 급격한 발현량의 증가가 관찰되지는 않았지만 농도의존적인 양상으로 p53 단백질의 축적을 확인할 수 있었다. 이는 SFN 처리에 의한 세포사멸에 p53 단백질이 관여함을 말해주는 결과라 하겠다. 반면, DNA의 분해를 통해 세포사멸을 일으키는 것으로 알려진 pro-caspase 3의 발현량을 확인해 본 결과 SFN 처리 농도의존적으로 감소되어짐을 알 수 있었다. 이는 pro-caspase 3의 절단을 통한 caspase-3의 활성을 의미하는 것으로 DNA 분해를 통한 세포사멸을 의미하는 것이라 할 수 있다. Fig. 3B는 loading control로 사용된 actin 단백질과 p53, pro-caspase 3의 발현량을 densitometric analysis를 통해 정량화한 것이다. 세포사멸의 결과로서 caspase-3의 활성에 의해 세포 내 DNA가 \( 180 \sim 200 \mathrm{bp} \) 의 길이로 잘려지는 특징을 이용한 DNA Fragmentation 실험을 행한 결과 기대한 것처럼 SFN 처리농도가 높아짐에 따라 DNA의 단편정도가 증가함을 관찰할 수 있었다. 이에 세포 내 핵의 분해를 확인하고자 핵 염색액인 DAPI를 이용하여 핵 염색을 실시한 결과, \( 30 \mu \mathrm{M} \) SFN 처리군에서 핵 분해단편을 확인할 수 있었으며, \( 50 \mu \mathrm{M} \) SFN 처리 시 핵분해 단편을 가진 더 많은 세포를 확인할 수 있었다. 연골암 세포주에 SFN 처리 시 세포형태 변화가 관찰되어 세포골격 단백질인 actin을 염색하는 phalloidin staining을 한 결과 대조군에서는 선명하고 길게 뺃은 actin fiber를 관찰할 수 있었으나, SFN이 처리된 세포군에서는 actin fiber의 응축 및 세포부피 감소 등을 확인할 수 있었다. 위의 결과를 종합해 볼 때, SFN 에 의한 연골암 세포주 HTB-94에서의 세포사멸은 p53 및 caspase-3 의존적인 활성기전을 통해 이루어짐을 알 수 있었다.</p>
여러 종양세포에서 항암효과와 염증 유발인자의 활성저해 및 세포사멸에 영향을 미치는 물질은 뭐지?
Sulforaphane