<h2>역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)</h2><p>세포를 \( 0.45 \times 10^{6} \) cells/well로 12 시간 배양 후에, FBS를 첨가하지 않은 무혈청 배지로 교체하여 시약을 처리하여 배양 후, 세포를 모아 Trizol \( 700 \mu 1 \) 를 첨가하고 chloroform \( 140 \mu 1 \) 을 첨가하여 \( 13,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C}, 15 \) 분간 원심분리하여 시료를 준비하였다. 상층액을 취한 후 동량의 isopropanol을 처리하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 시간 방치한 뒤 \( 13000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \), 15 분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨다. \( 70 \% \) 의 에탄올로 세척하고 DEPC-DW(Diethylpyrocarbonate-distilled water) \( 25 \mu l \)로 녹였다. \( 260\mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였으며 MMLV RTase 와 RNase inhibitor를 이용하여 cDNA를 합성한 후, STAT3, SOCS3, Actin primer와 cDNA \( 2 \mu l \) 를 이용하여 STAT3는 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45 초, \( 51^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45 초간 23 cycles으로 합성하였고 SOCS3는 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 25 초, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 25 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 25초간 27 cycles로 합성하였다. 합성된 STAT3와 SOCS3는 \( 1 \% \) Agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다. 본 실험에 사용한 primer sequences (SOCS3; Forward-5'-CTGCGGGCTGGCGAAGG AAA, Reverse-5'-GCTGGCTTGGTGCCCTCCAG, STAT3; Forward-5'-GGAGCAGAGATGTGGGAATG, Reverse-5'CTTGGTGGTGGAGGAGAACT, Actin; Forward-5'-GGCAT CGTCACCAACTGGGAC, Reverse-5'-CGATTTC CCGCT CGGCCGTGG)을 사용하였다.</p>
SOCS3를 합성하기 위해서 사용하는 reverse primer는 5'-GCTGGCTTGGTGCCCTCCAG이다.
YES