<h1>재료 및 방법</h1><h2>농약표준용액 및 시약</h2><p>시험 농약은 딸기에 등록되어 있는 침투이행성 농약 \(3\)종 (azoxystrobin, prochloraz, thiamethoxam)을 선정하였다.</p><p>분석에 사용한 표준품은 Dr. Ehrenstorfer GmbH (Ausberg, Germany)에서 구매하여 사용하였고, 각각의 농약은 acetonitrile으로 \( 1,000 \mathrm{~mg} / \mathrm{L} \)의 stock solution을 제조한 다음 이를 희석하여 \( 10 \mathrm{~mg} / \mathrm{L} \)의 혼합 working solution을 제조하였다.</p><p>분석에 사용한 용매 acetonitrile, glacial acetic acid (\(100\%\))는 Merck사 (Darmstadt, Germany)의 HPLC Grade를 사용하였고, formic acid (\( >98 \% \) purity)와 ammonium acetate (\(99 \% \) purity)는 Sigma Aldrich (St. Louis, MS, USA)에서 구입하여 사용하였다. \(3\)차 증류수는 Millipore사의 Milli-Q system (Bedford, USA)을 사용하여 제조하였다. QuEChERS 전처리를 위한 시약 및 제품은 Agilent (California, CF, USA)에서 구입하였고, 추출 및 정제에는 Agilent QuEChERS Extract Kit AOAC \(2007\). \(01\) (\(6 \mathrm{~g}\) \(~\mathrm{MgSO}_{4}\), \(1.5 \mathrm{~g} \) sodium acetate (\(\mathrm{NaOAc}) \))와 Agilent QuEChERS dispersive SPE \( 2 \mathrm{~mL} \) fatty and wax (\(150 \mathrm{~mg}\) \(~\mathrm{MgSO}_{4}\), \(~50 \mathrm{~mg}\) primary secondary amine, \( 50 \mathrm{~mg} \) \( \mathrm{C}_{18}\))을 사용하였다.</p><h2>시험작물 및 포장시험</h2><p>딸기는 '매향'(Fragarid X ananassa Duch 'Maehyang') 품종으로 경남 사천시에서 thiamethoxam과, 전북 완주군에서 azoxystrobin과 prochloraz-manganese를 이용하여 시설 양액재배 농가에서 시험을 진행하였다. 시험기간은 \(2017\)년 \(5\)월 \(1\)일부터 \(6\)월 \(10 \)일까지 진행하였다. 시험농약은 azoxystrobin \( 21.7 \% \) 액상수화제(상표명: 오티바), prochloraz-manganese \( 50 \% \) 수화제(상표명: 스포르곤) 및 thiamethoxam \( 10 \% \) 입상수화제(상표명: 아타라)를 이용하였다. 시험조건은 농도, 살포횟수 및 살포물량을 다르게 하여 처리하였고, 농약을 근부 부위에 투여하였다. 딸기에 시험농약 살포조건으로 azoxystrobin은 \(2000\)배 희석을 한 후 \(7\)일 간격으로 \(2\)회(수확\(7\)-\(0\)일 전), \(3\)회(\(14\)-\(7\)-\(0\)일 전) 관주처리하였고, 농약 최종살포 \(2\)시간 후 샘플을 채취하였다. Prochloraz-manganes는 \(2000\)배 희석하여 \(7\)일 간격으로 \(2\)회(수확 \(7\)-\(0\)일 전)살포하였고, 살포물량을 \( 50 \mathrm{~mL} / \)주, \( 100 \mathrm{~mL} / \)주로 하여 잔류량을 비교하였다. Thiamethoxam은 \(10\)일 간격으로 \(2\)회(수확 \( 10-0 \)일 전)살포하였고, 살포농도(희석배수 \( 500\), \(1000\), \(2000 \)배)와 살포물량 \( (50 \mathrm{~mL} \) /주, \( 100 \mathrm{~mL} \) /주)을 달리하여 처리구별로 잔류량을 비교하였다. 시료채취 시기는 azoxystrobin, prochlorazmanganese는 \(0\) (\(2\)시간 후), \( 7\), \(14\), \(24\), \(40 \)일, thiamethoxam은 \( 0\), \(7\), \(21 \)일에 병\(\cdot\)해충 피해가 없고 상품성이 있는 딸기를 \( 1.5 \mathrm{~kg} \)이상 채취하였고, 시험샘플은 꼭지를 제거한 딸기를 폴리에틸렌 비닐에 담은 후 신속히 실험실로 운반하여 분석까지 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 이하에서 보관하였다. 잔류농약 분석 전 시험샘플을 드라이아이스와 함께 분쇄하여 분석샘플로 이용하였다.</p><h2>딸기 중 azoxystrobin 분석법</h2><p>딸기 \( 15 \mathrm{~g} \)을 \( 50 \mathrm{~mL} \) plastic tube에 칭량 후 \( 15 \mathrm{~mL}\) \(1 \% \) acetic acid가 포함된 acetonitrile를 첨가한 후 \( 1300 \mathrm{~rpm}\) (\(1600\) MiniG), SPEX sample Prep, Metuchen, NJ, USA) \(5 \)분 동안 진탕하였다. 진탕 후 Agilent QuEChERS Extract kit AOAC \(2007\). \(01\) (\(6~ \mathrm{~g}\) magnesium sulfate (\(\mathrm{MgSO}_{4}\)), \(1.5 \mathrm{~g} \) sodium acetate \( (\mathrm{NaOAc}) \)를 첨가한 후 \( 1300 \mathrm{~rpm}\), \(30 \)초간 흔든 다음 \( 3500 \mathrm{~rpm} \) (Combi-\(514\)R, Hanil, Gimpo, Korea)에서 \(5 \)분간 원심분리하여 상징액 \( 8 \mathrm{~mL} \)를 취하였다. 상징액 \( 8 \mathrm{~mL} \)를 Agilent QuEChERS dispersive kit \( 15 \mathrm{~mL}\) (\(1200 \mathrm{~mg}\) \(\mathrm{MgSO}_{4}\), \(400 \mathrm{~mg}\) PSA)에 첨가한 후 \(2 \)분간 voltex mixer를 이용하여 흔든 다음 \( 3500 \mathrm{~rpm}\), \(5 \)분간 원심분리 하였다. 원심분리한 시료 \( 4 \mathrm{~mL} \)를 취하여 감압농축 후 \( 5 \mathrm{~mL}\) n-hexane : acetone (\( 95: 5\), \(\mathrm{v} / \mathrm{v} \)) 혼합용매로 재용해하였다. Florisil (FL) cartridge ( \( 1 \mathrm{~g} \) )을 이용하여 SPE 정제작업을 진행하였다. FL cartridge에 n-hexane으로 \( 5 \mathrm{~mL} \)로 conditioning 한 후, 시료 추출액 \( 5 \mathrm{~mL} \)를 loading하고, \(1\)차 전개액(n-hexane \( : \) acetone \( =90: 10\), \(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)을 \( 5 \mathrm{~mL} \) 흘려버리고, \(2\)차 전개액(n-hexane : acetone \( =70: 30\), \(\mathrm{v} / \mathrm{v}\)) \(20 \mathrm{~mL} \)를 이용하여 용출하였다. 용출액을 \( 40{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 이하에서 감압농축하여 \( 10 \mathrm{~mL} \) acetonitrile로 재용해 한 후 UHPLC/PDA를 과 같은 조건으로 분석하였다.</p><h2>딸기중 prochloraz 및 thiamethxam과 대사물질 분석법</h2><p>딸기 중 QuEChERS 분석법은 의 연구를 참고하여 실시하였다. 딸기 \( 15 \mathrm{~g} \) 샘플을 \( 0.1 \% \) formic acid가 포함된 acetonitrile \( 15 \mathrm{~mL} \)를 첨가하여 \( 1300 \mathrm{~rpm} \)에서 \(5 \)분간 추출한 후 \( 4 \mathrm{~g}\) \(~\mathrm{MgSO}_{4}\), \(1 \mathrm{~g}\) \(~\mathrm{NaCl}\), \(1 \mathrm{~g}\) \(~\mathrm{NaCitrate}\), \(0.5 \mathrm{~g} \) disodium citrate sesquihydrate를 첨가한 후 \(30 \)초가 진탕 후 \( 3500 \mathrm{~rpm} \)에서 \(5 \)분간 원심분리 하였다. 위의 상등액 \( 1 \mathrm{~mL} \)을 취하여 \(150 \mathrm{~mg}\) \(\mathrm{MgSO}_{4}\), \(25 \mathrm{~mg} \) PSA (Primary Secondary Amino)이 첨가 된 \( 2 \mathrm{~mL} \) tube에 첨가한 후 \( 12000 \mathrm{~rpm} \)에서 \(5 \)분간 원심분리 한 후 상등액 \( 0.5 \mathrm{~mL} \)를 취하여 \( 0.2 ~\mu \mathrm{m} \) syringe filter를 통과시킨 후 \( 0.5 \mathrm{~mL} \) acetonitrile과 합친 후 vial에 넣은 후 LC-MS/MS로 와 같은 조건으로 분석하였다. Clothianidin은 Thiamethxam의 대사물질로서 Thiametthoxam과 동시에 분석을 하였다. Thiamethoxam의 총 잔류량은 농약 잔류분 정의(RDA \(2012\))를 참고하여 thiamethoxam과 clothianidin의 잔류량 합으로 계산하였다.</p><h2>표준검량선 작성 및 회수율 시험</h2><p>시험농약 \(4\)종 azoxystrobin, clothianidin, thiamethoxam 및 prochloraz를 Dr. Ehrenstorfer GmbH (Ausberg, Germany)에서 구매 후 acetonitrile으로 \( 1,000 \mathrm{~mg} / \mathrm{L} \)의 stock solution을 제조하였다. 준비한 stock solution을 acetonitrile로 \( 10 \mathrm{~mg} / \mathrm{L} \) working solution 제조하였다. 제조한 working solution을 이용하여 LC는 \( 0.05\), \(0.1\), \(0.2\), \(0.5\), \(1.0\), \(2.0\), \(5.0 \mathrm{~mg} / \mathrm{L} \) 용액을 acetonitrile로 희석하여, LC-MS/MS는 \( 0.01\), \(0.05\), \(0.1\), \(0.2\), \(0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 수준으로 무처리 시료를 이용해 희석하여 matrix matched 표준용매를 만들었고, 의 기기분석조건에서 나타난 chromatography 상의 peak 면적을 기준으로 검량선을 작성하였다. 기기의 정량 한계를 파악하기 위해서 LC에서 \( 0.01\), \(0.025\), \(0.05\), \(0.1 \mathrm{~mg} / \mathrm{kg} \), LC-MS/MS에서는 \( 0.005\), \(0.01\), \(0.025\), \(0.05 \mathrm{~mg} / \mathrm{kg} \) 표준용액을 기기에 주입하여 S/N ratio가 \(3\) 이상 일 때를 검출한계, \(10\) 이상일 때 정량한계로 설정하였다. 또한 위의 농도의 peak 면적 값을 이용해 검량선의 직선성을 평가하였다.</p><p>시험농약의 회수율 시험을 위해 무처리 시료에 표준용액 \(10 \mathrm{~mg} / \mathrm{kg} \)을 이용하여 \( 0.1\), \(1.0 \mathrm{~mg} / \mathrm{kg} \) 수준으로 첨가하였다 (\( \mathrm{n}=3 \)). 표준용액 첨가 후 무처리 시료와 혼합 후 \(30 \)분간 방치한 후 상기의 방법으로 회수율을 산출하였다.</p>
딸기에 등록되어 있는 침투이행성 시험 농약 \(3\)종은 무엇이야?
azoxystrobin, prochloraz, thiamethoxam