<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물재료</h2><p>낙엽송의 배발생조직 획득을 위해 충북 충주에 위치한 국립품종관리센터 내의 낙엽송 클론 채종원에서 7월초 미숙구과를 채취하였다. 채취한 구과로부터 종자분리는 인편을 뒤로 젖힌 후 상처가 나지 않도록 종자를 조심스럽게 분리하였으며, 분리한 종자표면 살균은 먼저 \( 70 \% \) 에탄올로 1분간 처리 후 \( 2 \% \mathrm{NaClO} \)로 10분정도 침적한 다음 멸균증류수로 수차례 세척하였다.</p><h2>배발생조직 유도</h2><p>배발생조직 유도를 위해 LM (Litvay et al. 1985)배지를 기본으로 하였으며 \( 2.0 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 2,4D, \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\) BA, \(1,000 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) L-glutamine (배지 열소독 후 첨가) 및 \( 3.0 \% \) sucrose를 첨가하였고 \( 0.4 \% \) gellan gum (Sigma)을 첨가시켜 반고형배지로 만들어 사용했다. 종자내의 미숙배 적출은 수술용 메스 (Feather, No 11)를 이용하여 종자를 양분 후 이루어졌으며 배양은 \( 25 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \), 암소에서 8주 동안 새로운 배지교환 없이 수행되었다.</p><h2>배발생조직 증식</h2><p>미숙배로부터 유도한 배발생조직의 증식은 염류의 양을 반으로 줄인 \( 1 / 2 \mathrm{LM} \) 배지에 \( 2.0 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 2,4D, \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\) BA, \( 1,000 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\) L-glutamine 및 \(2.0 \% \) sucrose를 첨가한 배지에 2주 간격으로 계대배양 하여 체세포배 유도에 필요한 조직을 \( 25 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \), 암소에서 증식이 이루어졌다.</p><h2>체세포배 유도</h2><p>배발생조직을 \( 1 / 2 \mathrm{LM} \) 배지에 \( 250 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) L-glutamine, \( 250 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) casein, \( 0.2 \mathrm{M} \) sucrose, \( 15.8 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\) ABA (배지 열소독 후 따로 첨가)가 첨가된 액체배지에 현탁배양 한 후 \( 5.5 \) \( \mathrm{cm} \) 크기의 종이필터 (Whatman)위로 \( 90 \mathrm{mg} \) 세포가 포함된 \( 3 \mathrm{ml} \) 정도의 세포현탁액을 깔아준 후 진공펌프를 이용하여 약 5초간 액체배지만을 제거한 다음 배발생조직이 포함된 종이필터를 \( 0.6 \% \) gellan gum을 첨가한 배지에 치상하는 식으로 체세포배를 발생시켰다. 배양조건은 \( 25 \pm \) \( 1^{\circ} \mathrm{C} \), 암소에서 8주간 새로운 배지로의 교환 없이 연속배양법으로 이루어졌다. 항옥신류인 PCIB, TIBA 및 옥신상승제 phloroglucinol의 농도별 처리에 의한 체세포배 유도효과를 비교하기 위해 \( 15.8 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) ABA 를 대조구로 설정하고 5.0, 20.0 \(\mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 각각의 PCIB 및 TIBA를 ABA와 혼합 혹은 단독으로 첨가하였으며 (Table 1) 또한 옥신 synergist인 phloroglucinol를 \( 5.0 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 농도로 ABA와 공조처리하거나 혹은 단독으로 처리 (Table 2) 하여 체세포배 발생 시 항옥신류 혹은 옥신 synergist의 첨가효과를 배양 8주 후 자엽단계 체세포배의 발생정도를 비교 및 조사하였다.</p><h2>체세포배 발아</h2><p>PCIB 등의 항옥신류 처리 유래의 체세포배 발아 정도를 조사하기 위해 각 처리구의 배발생조직으로부터 유도된 자엽단계 체세포배만을 분리하여 \( 1 / 2 \mathrm{LM} \) 배지에 \( 2.0 \% \) sucrose 및 \( 0.4 \% \) 의 gellan gum을 첨가한 발아배지 위로 평행으로 배양하였고 발아조건은 \( 25 \pm 1^{\circ} \mathrm{C}, 18 / 6 \) 광주기를 가진 광조건 \( \left(50 \mu \mathrm{Em}^{-2} \mathrm{~s}^{-1}\right. \), Philips, F40CW, 40 watt) 하에서 6주 배양 후 신초 등의 기관 분화율 및 식물체 전환율을 조사하였다 (Table 3).</p>
왜 국립품종관리센터 안에 있는 갑엽송 클론 채종원에서 미숙구과를 수집하였어?
낙엽송의 배발생조직 획득을 위해