<h2>정량적 real-time PCR 분석</h2><p>ICER 유전자발현분석은 한우 7개 조직 및 근육 내 조지방 함량에 따른 발현의 차이를 보기 위하여 실시하였다. 한우 7개 조직은 동일개체의 조직을 채취하였으며, 마블링 high 그룹은 근육 내 조지방함량 \( 17-32 \% \)이내 4두를 선발하였고, low 그룹으로 조지방함량 \(6-7\%\) 이내 3두를 선발하여 유전자 발현분석을 실시하였다. 실험의 정확도를 기하기 위하여 시료 당 3회씩을 반복하였다. Real-time PCR은 QuantiTect SYBR Green premix (Qiagen) kit와 ABI 7500 system (ABI)을 이용하여 다음과 같이 수행하였다. 1st cDNA \( 5 \mu \mathrm{l}\)(\(500 \mathrm{ng}\)), \(10 \mathrm{pmol} / \mu \mathrm{l} \) primer 각 \( 1 \mu \mathrm{l}, 2 \times \) QuantiTect SYBR Green \( 10 \mu \mathrm{l} \) 그리고 멸균 증류수로 전체 \( 20 \mu 1 \)로 맞추어 반응을 수행하였다. PCR은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15초, 중합반응은 \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 25초 그리고 합성반응은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20초간 하였고, 전체 40 cycle을 수행하였다. Realtime PCR 종료 후 PCR 산물의 quality를 측정하기 위하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서부터 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)까지 melting temper-ature (TM) 값을 측정하였다. 유전자 발현의 상대적 정량은 \( \triangle \mathrm{Ct} \) 값(ICER 유전자의 \( \mathrm{Ct}-18 \mathrm{S} \mathrm{~rRNA} \) 의 \( \mathrm{Ct} \)값)을 계산하여 \( 2^{-\Delta C t} \)값으로 치환하여 상대적 정량을 계산하였다. Ct 값은 threshold cycle로서 발현 peak가 형성되는 지점의 PCR cycle수로 나타넨다. 따라서 \( \mathrm{Ct} \)값이 클수록 발현량이 적음을 의미한다.</p><h2>ICER 유전자 발현 분석을 위한 통계 분석</h2><p>마블링 high- 및 low 그룹간 ICER유전자의 발현양상의 차이에 대해 ANOVA 모델을 이용하여 분석하였다. 근육내 조지방함량 에 따라 선발된 7두의 한우 개체는 근육 내 조지방함량에 따른 마블링 high 그리고 low 그룹 \( (F A T)_{j} \) 외에 total digestible nutrients (TDN) 수준에 따른 2개의 처리구(TR) 그리고, 도축 시 연령 \( \left(D_{i j k}\right) \)이 유전자발현에 영향하는 요인으로 판단되어, 이들 효과를 고정 효과(fixed effect)로 포함시키고, 도축 시 일령은 공변이(covariate)효과로 처리하였다. 관측치로서 종속변수(y)에 해당하는 유전자발현량은 ICER 유전자의 \( \mathrm{Ct} \) 값을 내부보정 18S rRNA 유전자의 \( \mathrm{Ct} \) 값으로 보정한 발현량 \( (\triangle \mathrm{Ct} \) 값)을 사용하였다. 따라서 분석에 적용된 일반선형모델(GLM)은 다음과 같다.</p><p>\( Y_{i j k}=\mu+T R_{i}+F A T_{j}+b \cdot D_{i j k}+e_{i j k} \)</p><p>마블링 high, low \( (F A T)_{j} \)에 따른 ICER 유전자의 발현차이를 검정하기 위하여 분석모형 내에 고정효과로 처리된 마블링 수준에 대한 최적선형불편추정치(BLUE)를 구한 후 두 그룹간 t-검정을 실시하였다. 최종 ICER 유전자의 발현량은 \( 2^{-\Delta c t} \)의 식에 의하여 계산하였으며, 통계분석은 R-statistical program을 이용하여 수행하였다(http://www.R-project.org).</p>
실험에서 Melting temper-ature값을 잰 온도 구간은 어떻게 되나요?
\( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서부터 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)