<h2>ROS 및 GSH 측정</h2><p>신장조직은 \( 1 \mathrm{~mM} \) EDTA-\(50 \mathrm{~mM}\) sodium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} ~7.4\))를 이용하여 분쇄하였다. ROS를 측정하기 위하여 혈청과 신장조직에 \( 25 \mathrm{~mM}\) DCFH-DA를 혼합한 후, 형광 광도계를 이용하여 \(0\)분부터 매 \(10 \)분씩 emission wavelength of \( 530 \mathrm{~nm} \)와 excitation wavelength of \( 486 \mathrm{~nm} \)에서 \(30 \)분간 측정한 산출 값을 계산하였다. GSH를 측정하기 위하여 혈청과 신장조직에 \( 0.1 \mathrm{~M} \) Sodium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} ~8.0\))와 OPA solution을 혼합한 후, 실온 \(15 \)분 인큐베이션 후 형광 광도계를 이용하여 emission wavelength of \( 420 \mathrm{~nm} \)와 excitation wavelength of \( 350 \mathrm{~nm} \)에서 측정한 산출 값을 계산하였다.</p><h2>Western blot analysis</h2><p>신장 조직의 세포질단백질을 얻기 위해 \( 100 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) (\( \mathrm{pH} ~7.4\)), \( 5 \mathrm{~mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) (\( \mathrm{pH} ~7.5\)), \( 2 \mathrm{~mM}\) \(\mathrm{MgCl}_{2}\), \(15 \mathrm{~mM}\) \(\mathrm{CaCl}_{2} \), and \( 1.5 \mathrm{~M} \) sucrose, \( 0.1 \mathrm{~M}\) DTT, and protease inhibitor cocktail을 첨가한 buffer A를 넣고 tissue grinder (Bio Spec Product, Bartlesville, OK, USA)로 분쇄한 후 \( 10 \%\) NP-\(40 \) 용액을 첨가하였다. 아이스 위에서 \(20 \)분간 정치시킨 후 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)으로 \(2 \)분간 원심분리 하여 세포질 단백질을 포함하고 있는 상충액을 분리하였다. 핵단백질을 얻기 위해 \( 10 \%\) NP-\(40 \)가 더해진 buffer A에 두 번 헹구고 \( 100 ~\mu \mathrm{L} \)의 buffer C ( \( 50 \mathrm{~mM} \) HEPES, \( 50 \mathrm{~mM} \) \( \mathrm{KCl}\), \(0.3 \mathrm{~mM}\) \(\mathrm{NaCl}\), \(0.1 \mathrm{~mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{~mM} \) DTT, \( 0.1 \mathrm{~mM} \) PMSF and \( 10 \% \) glycerol)를 첨가해 재부유 시킨 뒤 \(10 \)분마다 vortex를 \(3 \)번 하였다. \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)으로 \(10 \)분간 원심 분리한 후 핵단백질을 포함하고 있는 상층액을 얻어 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 각각 냉동 보관하였다.</p><p>신장조직의 세포질 단백질인 SOD-\(1\), catalase, GPx, iNOS, COX-\(2\), TNF-\( \alpha \), IL-\(6\), HO-\(1\), \( \beta \)-actin 및 핵단백질인 Histone, NF-\(\kappa\)B p\(65\), Nrf-\(2 \)의 발현을 측정하기 위해 \( 10 ~\mu \mathrm{g} \)의 단백질을 \(8\)-\(15\%\) SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. \( 5 \% \) skim milk를 함유한 TBS-T (\(0.5\%\) Tween \(20\) in TBS)에 담그고 \(1\)시간 동안 blocking 처리한 후 TBS-T로 \(5 \)분마다 \(5 \)회 세척하였다. 준비된 membrane에 각각의 \(1 \)차 antibody를 처리하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight시킨 다음 TBS-T로 \(10 \)분마다 \(5 \)회 세척하고, 각각 처리된 \(1 \)차 항체에 사용되는 \(2\)차 항체(TBS-T로 \(1:5000 \)로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 \(1 \)시간 \(30 \)분간 반응시 킨 후, TBS-T로 \(10 \)분마다 \(5 \)회 세척하였다. 그리고 ECL 용액 을 GE Healthcare (Arlington Heights, IL, USA)에 노출시킨 후, Sensi-Q\(2000\) Chemidoc (Lugen Sci Co., Ltd., Seoul, Korea)에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 band를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan)프로그램을 사용하여 정량하였다.</p><h2>조직학적 분석</h2><p>신장 조직을 적출한 다음 조직을 절단하고, \( 10 \% \) 중성포르말린에 \(18\)시간 이상 고정시킨 다음, 탈수를 거쳐 파라핀 포매 후 \( 4 ~\mu \mathrm{m} \)의 절편을 제작하였다. 이후 Hematoxylin-eosin (H&E) 염색을 실시하고, 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>실험결과는 평균과 표준편차 (\(\text{mean} \pm \mathrm{SD} \))로 표기하였으며, SPSS \( 22.0 \) for Windows program을 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시한 다음 least-significant differences test로 사후 검증을 실시하여 군 간의 유의성을 측정하였다. 유의수준 \( p \)-value \(<0.05 \)에서 검정하였다.</p>
세포질 단백질을 포함하고 있는 상층액을 어떻게 분리하였나요?
아이스 위에서 \(20 \)분간 정치시킨 후 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)으로 \(2 \)분간 원심분리 하여