<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물 재료 및 DNA 분리</h2><p>S. demissum의 cpDNA 분석을 위해 국립식량과학원 고령지 농업연구소로부터 분양 받은 계통 중 하나인 SD9가 이용되었으며, S. demissum 특이적 분자마커 개발을 위해서는 SD9에 더해 S. demissum의 SD7 계통 하나가 추가되었으며, 이외 재배종 감자인 ‘서홍'(SH), '하령'(HR), '대지'(DJ)와 감자 야생종 S. acaule (P1310970, SA), S. berthaultii (PI310981, SB1), S. brevicaule (PI205394, SB2), S. candolleanum (PI210035, SC4), S. cardiophyllum (PI341233, SC1), S. chacoense (PI201846, SC3), S. commersonii (PI558050, SC2), S. iopetalum (PI230459, SI), S. kurtzianum (PI498422, SK), S. jamesii (PI578236, SJ), S. microdontum (PI310979, SM2), S. mochiquense (P1338616, SM1), S. pinnatisectum (PI190115, SP), S. stoloniferum (PI160224, SS), S. vernei (PI230468, SV2), S. verrucosum (PI160228, SV1)의 계통이 이용되었다.</p><p>모든 식물 재료는 기내 또는 온실에서 관리 및 유지되었으며, Genomic DNA Extraction kit (Plants) (RBC, New Taipei City, Taiwan)를 이용하여 약 \( 100 \mathrm{mg} \) 의 잎을 채취하여 DNA를 분리하였다.</p><h2>엽록체 전장유전체 분석</h2><p>S. demissum cpDNA 분석은 S. demissum 계통 SD9를 대상으로 genomic DNA를 추출하고 Macrogen (Macrogen, Seoul, South Korea)의 Illumina Hiseq2000 (Illumina, SanDiego, CA, USA)의 플랫폼을 이용하여 진행되었다. 확보된 전체 염기서열 정보에서 cpDNA 염기서열 추출과 유전체 서열 조립을 위해 파이젠에 구축된 생물정보학 파이프라인(http://phyzen.com), 4.06 beta version CLC genome assembler (CLC Inc,Rarhus, Denmark), Nucmer 등이 이용되었다. 이후, 앞서 보고된 \( 155,533 \mathrm{bp} \) 의 S. berthaultii cpDNA(KY419708, Park 2017; Kim et al. 2018)와 비교하고 구성된 대표 콘티그들을 BLASTZ 분석한 후, 일부 영역을 편집하여 정렬하여 그 구조와 염기서열을 확인하였다.</p><p>S. demissum cpDNA의 유전자 분석은 Blast search를 기반하여 Geseq 프로그램을 이용하여 진행하였으며, S. demissum cpDNA의 유전자지도는 OGDraw (Organellar GenomeDRAW; http://ogdraw.mpimp-golm.mpg.de) 프로그램을 이용하여 작성되었다.</p><h2>엽록체 전장유전체의 비교</h2><p>S. demissum cpDNA 분석의 결과로 얻이진 전체 염기서열은 기존의 연구결과로 NCBI (the National Center for Biotechnology Information)에 등록되이 있는 가지과 (Solanaceae)에 속한 10 개 종의 cpDNA 전체 염기서열과 비교하여 계통수를 작성하였다. 비교된 10 개 종은 Capsicum annuum (JX270811), S. berthaultii (KY419708), S. bulbocastanum (DQ347958), S. chacoense (MF471371), S. commersonii (KM489054), S. hougasii (MF471372), S. lycopersicum (NC007898), S. nigrum (KM489055), S. stoloniferum (MF471373), S. tuberosum (KM489056 및 NC008096)이며, S. demissum을 포함하는 총 12개의 전체 cpDNA로부터 엽록체 코딩 서열을 분석하고 이를 대상으로 Kimura 2-parameter 모델과 1,000번의 Bootstrap 옵션을 이용한 Maximum likelihood 방법에 의해 계통수를 분석하였다.</p><p>PCR 기반의 S. demissum 특이적 분자마커 개발을 위해서는 확보한 S. demissum cpDNA 전체 염기서열을 S. acaule (MK036506), S. brevicaule (MK036507), S. bulbocastanum (DQ347958), S. chacoense(MF471371), S. commersonii (KM489054), S. stolonioferum (MF471373), S. tuberosum (KM489056)의 cpDNA 전체 염기서열과 함께 EMBL (http://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalw2)의 ClustalW2에 의해 다중 정렬되었으며, 이 결과를 통해 S. demissum 특이적 InDel 영역이 구명되었다.</p><h2>PCR 기반의 분자마커 개발</h2><p>8 종의 cpDNA 전체 염기서열을 대상으로 한 다중 정렬의 결과로 구명된 S. demissum 특이적 InDel을 대상으로 S. demissum 특이성 검증이 수행되었다. 각각의 InDel 영역에 특이적인 프라이머를 제작하였으며, S. demissum과 S. tuberosum을 포함하여 총 21개의 유전자 계통, S. demissum (SD7 및 SC9), S. tuberosum (감자품종 '서홍(Seohong)', '하령(Haryeong)' 및'대지(Daeji)'), S. acaule (SA), S. berthaultii (SB1), S. brevicaule(SB2), S. candolleanum (SC4), S. cardiophyllum (SC1), S.chacoense (SC3), S commersonii SC 2), S. iopetalum SI, S. kurtzianum (SK), S. jamesii (SJ), S. microdontum (SM2), S. mochiquense (SM1), S. pinnatisectum (SP), S. stoloniferum (SS), S. vernei (SV2) and S. verrucosum (SV1)을 대상 으로 PCR 을 수행하였다. 총 25 ul 볼름 (약 \( 20 \mathrm{ng} \) genomic DNA, \( 0.5 \mathrm{mM} \) dNTPs,\( 10 \mathrm{pMol} \) each primer, 1 U Taq polymerase (Genetbio, Daejeon, South Korea))으로 Thermocycler (Biometra, Göttingen, Germany)를 이용하여 PCR 한 후, 핵산염색용액인 RedSafe (Intron Biotechnology, Seongnam, South Korea)를 이용하여 \( 1 \% \) agarose gel에서 확인하였다.</p>
S. demissum의 계통수를 작성할 때, S. demissum의 cpDNA 염기서열과 비교한 과는 무엇인가?
가지과 (Solanaceae)