<h1>재료 및 방법</h1><h2>된장의 용매 추출 및 분획</h2><p>된장은 화영식품 (주)으로부터 구입하여 동결 건조한 후 분말로 만들었고 헥산으로 3 회 추출하고 잔사물을 2 배의 메탄올로 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 환류냉각기를 사용하여 3 회 추출하였다. 회전식 진공 농축기(Buchi oll & 461, Switzerland)를 이용하여 농축한 후, 다시 클로로메탄올로 추출하고 잔사물을 에틸아세테이트로 추출한 후 마지막으로 부탄올로 추출하고 남은 잔사물을 수층으로 하여 각 추출물의 용매를 제거하고 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 실험에 사용하였다(Fig. 1).</p><h2>사용시약 및 기구</h2><p>세포배양을 위해 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal calf serum (FCS), \(0.05\%\) trypsin- \( 0.02 \% \) EDTA 그리고 \( 100 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \) penicillin-streptomycin을 Gibco사 (USA)로부터 구입하고 사용하였고 세포 배양은 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator (Sanyo, model MCO96, Japan)를 사용하여 실험하였다.</p><h2>암세포 및 암세포 배양</h2><p>한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 인체 위암세포(AGS human gastric adenocarcinoma cell), 인체 결장암세포(HT-29 human colon cancer cell), 인체 간암세포(Hep 3B human hepatocellular carcinoma cell), 인체 골육암 세포(MG-63 human osteosarcoma cells)를 분양받아 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. AGS, HT-29, Hep 3B 그리고 MG-63 암세포를 \(100 \mathrm{units}/\mathrm{ml}\)의 penicillin-streptomycin과 \( 10 \% \) FCS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. 배양 중인 세포를 일 주일에 2 번 refeeding 하고 일 주일 후 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 뒤 \(0.05\%\) trypsin-\(0.02\%\) EDTA (Gibco Co., USA)로 부착된 세포를 분리하여 원심분리 한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 \(75 \mathrm{mm}^{3} \) cell culture flask에 \( 10 \mathrm{ml} \) 씩 일정수 분할하여 주입하고 계속 \( 6 \sim 7\) 일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. 계대 배양시 각각의 passage number를 기록하였고 passage number가 10 회 이상일 때는 새로운 암세포를 액체 질소 탱크로부터 꺼내어 다시 배양하여 실험하였다.</p><h2>암세포 성장 억제 및 DNA 합성 저해 실험</h2><p>암세포 배양과 동일한 방법으로 배양하되 원심분리 한 후 집적된 암세포를 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 24 시간 well plate 에 \(20,000 \text{cells} / \mathrm{ml} \) 의 농도를 seeding하여 하룻밤 배양하였다. 각 시료 유기용매 추출물을 첨가하여 2 일 마다 배지로 교체해서 배양 6 일 후에 증식된 세포를 \( 0.05 \% \) trypsin-\( 0.02 \% \) EDTA로 분리하여 각 세포수를 hemocytometer로 측정하여 대조군과 비교하여 암세포 성장 억제효과를 관찰하였다. DNA 합성 저해 효과 실험은 각 시료 유기용매 추출물 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 및 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 배양 48 시간 후에 \( 3 \mu \mathrm{Ci} / \mathrm{ml} \) 의 \( \left[^{3} \mathrm{H}\right] \) thymidine이 표지화된 배지로 교체한 후 2 시간 동안 배양한 후 표시화된 배지를 제거하고 고형성분을 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 PBS로 2 번 씻은 다음 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 \( 5 \% \) cold TCA를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 냉장 방치하였다. 1 시간 후 TCA를 제거하고 \( 250 \mu\mathrm{l}\) 의 \( 1 \% \) SDS를 첨가하여 cells을 분리하기 위하여 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 동안 가열하였다. Vial에 옮긴 후 \( 125\mu \mathrm{l} \) 의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 로 2 번 씻어내고 \( 3.5 \mathrm{ml} \) 의 cocktail을 첨가한 후 vortexing 하여 Beckman LS 250 Scintillation counter (USA)로 radioactivity를 측정하였다.</p><h2>통계분석</h2><p>실험결과는 Mean\( \pm \)SD 로 나타내었고 분석된 실험 데이터는 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 one-way ANOVA를 실시하여 유의성이 있을 경우에 post-hoc test로 Duncan's mutiple range test를 실시하여 \(95\%\) 수준에서 유의성을 검증하였다.</p>
클로로메탄올로 추출하고 잔사물을 에틸아세테이트로 추출한 후 마지막으로 부탄올로 추출하고 남은 잔사물을 수층으로 하여 각 추출물의 무엇을 제거하였어?
용매