<h1>결 과</h1><h2>STME의 성숙지방세포에서의 중성지방 축적 억제 효과</h2><p>산두근(Sophora tonkinensis Gapnep)은 콩과에 속하는 약재로 이미 백혈병, 폐암세포에 항암 효과 및 식중독 미생물에 항균효과를 가지고 있는 것으로 보고되어 있다. 오늘날 비만은 질병으로 분류하고 있으며 무한 증식을 가장 큰 특징으로 하는 암세포와 비슷하게 비만세포 또한 계속적인 증식을 이어나가며 세포 내에 중성지방을 축적하는 또 다른 특징을 가지고 있다. 따라서, 산두근 메탄올 추출물(STME)이 지방세포의 분화 및 중성지방 축적에 어떠한 영향을 미치는 지 검토하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포의 성숙지방세포로의 유도와 함께 STME를 각각 \( 10, 50, 100, 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)로 처리하였다.</p><p>앞서 재료 및 방법에서도 설명하였듯이, 지방전구세포에서 성숙지방세포로의 유도 및 분화에는 몇 가지의 단계(Day 0, 2, 4, 6)와 분화유도제를 필요로 한다. STME의 중성지방 축적 억제효과는 가장 마지막 단계인 Day 6, 즉 분화가 완료된 성숙 지방세포에서 Oil Red O 염색 후 위상차현미경으로 관찰하였다. Fig. 1A의 결과에 제시한 것처럼 Day 6 때의 분화 유도가 끝난 성숙지방세포의 세포 형태 및 지방세포 내의 중성지방 축적(lipid droplet)량은 대조군에 비해 STME를 농도별로 첨가한 세포에서는 농도 의존적으로 지방 축적량이 감소되는 것을 확인 할 수 있었으며, \( 200 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서는 현저한 차이를 확인할 수 있었다. 중성지방 축적량을 정량적으로 조사하기 위하여 중성지방을 염색한 Oil Red O 염색 성분을 isopropanol로 용해시킨 후 흡광도를 측정 하였다. 그 결과 Fig. 1B에 나타낸 것과 같이 대조군에 비해 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있었으며 STME 처리 최고 농도인 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서는 약 \( 70 \% \) 정도 지방 축적량이 감소됨을 확인하였다.</p><p>이러한 중성지방 축적의 현저한 감소는 STME에 의한 기능적인 활성인지 혹은 지방전구세포에 독성으로 인한 세포의 사멸에 의한 것인지 검토할 필요가 있었다. 따라서 \( 10 \sim 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 범위의 농도에서 3T3-L1 지방전구세포에 대한 세포 독성을 검토한 결과 실험한 모든 농도에서 \( 90 \% \) 이상의 생존율을 보였으므로 현재 실험 범위의 농도에서는 STME의 독성에 의한 효과가 아니라 중성지방 축적 억제 효과에 의한 것임을 알 수 있었다(data not shown).</p><h2>STME의 mitotic clonal expansion (MCE) 억제 효과</h2><p>지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화는 지방전구세포의 증식(preadipocyte proliferation), 성숙지방세포로의 분화(differentiation), 성숙지방세포의 증식(proliferation)으로 나누어 진행되지만, 지방세포로의 분화가 일어나기 위해서는 adipogenic signal induction, growth arrest (G1 phase), mitotic clonal expansion, re-enter cell cycle과 같은 아주 복잡하고 질서 정연한 단계를 거친다. 이중 mitotic clonal expansion 단계는 정지되었던 세포주기가 분화유도제의 자극에 의해 세포주기가 다시 움직여 세포 수가 2~4배 증가하는 단계이다. 이 mitotic clonal expansion 단계를 억제하면 성숙 지방세포로의 분화가 더 이상 진행되지 않는다는 연구 결과가 이미 보고되어 있다. 따라서 본 연구는 STME가 이러한 활성을 나타내는지 알아보기 위하여 3T3-L1 지방전구세포의 분화유도를 위하여 분화유도제를 처리함과 동시에 STME를 \( 100, 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리하여 Day 1, Day 2의 기간 동안 세포수의 변화를 측정하였다. Fig. 2의 결과와 같이 대조군으로 사용한 3T3-L1의 경우 Day 0에서 분화유도제를 첨가하고 분화유도 하였을 때 Day 1에서 1.9배, Day 2 에서 2.4배로 세포수가 증가하는 것을 확인하였다. 하지만 STME \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)를 첨가한 경우, Day 1 에서 1.3배, Day 2 에서 1.7배 증가하였으며 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서는 Day 1에서 1.3배, Day 2에서 1.3배로 더 이상의 세포수 증가를 확인할 수 없었다. 이상의 결과로 STME는 3T3-L1의 mitotic clonal expansion 단계를 억제시키는 것을 알 수 있었다.</p><h2>STME의 지방세포 분화 조절 인자들의 발현에 미치는 영향</h2><p>지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화는 복잡한 단계를 거치게 되며 관련된 여러 조절인자들의 발현 촉진 과정을 거치게 된다. 이러한 분화 과정에서 가장 중추적인 역할을 하는 것이 peroxisome proliferation activated receptor gamma(\(PPAR \gamma \) )와 CCAAT enhancer binding protein (C/EBP) family라고 불리는 전사인자들이다. 분화 유도 물질은 이러한 전사 인자들의 발현을 촉진시킴으로써 지방전구세포를 지방세포로 분화시킨다. 먼저\(C/EBP \beta \)는 전구지방세포에서 분화유도제에 의해 발현 유도되어 실질적인 지방세포 분화를 담당하는 \(PPAR \gamma \) 와 \( C/EBP \alpha \)의 발현을 유도하는 단백질로 분화초기 clonal expansion (Day 2) 과정에서는 발현량이 많으나 성숙지방세포(Day 6)가 되면 발현이 저하되는 특징을 나타낸다. 한편, \( C/EBP \alpha \)는 \( PPAR \gamma \)의 발현을 유도할 뿐만 아니라 \( PPAR \gamma \) 와 협력하여 지방세포의 성숙분화를 담당하는 유전자의 발현을 제어하고 있는 것으로 알려져 있다. \( PPAR \gamma \)는 핵 내 수용체형의 전사인자로써 같은 수용체형 전사인자 \( RXR\alpha \) (\(retinoid \times \ receptor \alpha \) )와 heterodimer를 형성하여 여러 종의 지방산이나 지방산 대사산물의 내인성 ligand로써 결합하여 전사능이 활성화된다. 또한, 지방세포의 성숙분화시기에 유도되며 지방세포 특이적 유전자의 promoter영역에 존재하는 PPAR 결합영역인 PPRE (PPAR responsive element)에 결합하여 그 유전자의 발현을 유도한다. 따라서 여기서 언급한 초기의 \( C/EBP \beta \), 성숙기의 \(PPAR \gamma \)와 \( C/EBP \alpha \)의 발현에 STME가 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 세포는 2가지 단계로 MCE 단계(Day 2)와 완전분화 단계(Day 6)의 세포를 이용하였으며, 단백질 발현량의 변화는 Western blot analysis를 행하여 확인하였다. 그 결과 Day 2와 Day 6에서 이들 전사인자들의 확연한 발현 차이를 확인할 수 있었다. 먼저, Fig. 3A의 결과에 의하면 지방세포 분화초기단계에 발현이 유도되는 \( C/EBP \beta \)는 Day 2의 단계에서 농도 의존적으로 발현이 저하되는 것을 확인하였다. 완전분화 단계의 Day 6의 결과에서는 \( C/EBP \alpha \)가 STME 농도에 따라 농도 의존적으로 발현이 확연히 저하되는 것을 확인할 수 있었으며 \(PPAR \gamma \) 또한 발현이 저하되었다. SREBPIc의 유전자 또한 발현이 농도 의존적으로 저하됨을 확인하였으며 이 유전자는 지방산이나 콜레스테롤 합성에 필수 전사인자인 SREBP (sterol regulatory element binding protein)의 하나이며 \(PPAR \gamma \) ligand 생성에도 관여하는 것으로 보고되어 있다. 따라서 STME는 지방세포 분화 및 지방산 합성 관련 유전자의 발현을 억제하여 성숙지방세포로의 분화 및 지방 축적을 억제하는 것으로 사료된다.</p><h2>STME의 처리에 의한 세포주기의 변화분석</h2><p>앞선 결과에 의하면 STME의 처리에 따라 MCE의 억제 및 관련 유전자들의 발현 억제를 확인 할 수 있었다. 지방전구세포는 분화유도제에 의해 세포가 증식-분화-증식의 다단계를 거치면서 성숙지방세포로 분화되기 때문에 STME가 이러한 세포주기 변화에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포(Day 0)에 분화유도제와 STME를 처리하여 세포주기 변화가 확인 가능한 14시간째에 회수하여 FACS analysis를 시행하였다. Fig. 4에서 확인되는 것처럼 분화유도제만 처리한 대조군에서는 sub-G1기의 개체군이 \( 6.7 \% \), G1기 개체군이 \( 16.9 \% \), S기 개체군이 \( 42.17 \% \), G2/M기 개체군이 \( 41.3 \% \)로 세포주기 별로 고루 분포하고 있음을 확인할 수 있었다. 이에 비해 STME를 처리한 세포에서는 STME의 농도가 \( 10, 50, 100, 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)으로 증가할수록 G1기 개체군의 비율이 \( 33.68 \%, 39,39 \%, 48.03 \%, 55.14 \% \)로 계속 증가되었으며, 상대적으로 S기 개체군의 비율이 \( 38.2 \%, 31.4 \%, 16.5 \%, 5.1 \% \)로 점점 감소하는 것을 알 수 있었다. 즉, STME의 처리 농도가 증가될수록 세포들은 세포주기에서 G1기의 분포가 높아져 STME는 지방전구세포의 G1 arrest를 유도함을 확인 할 수 있었다.</p><h2>STME의 처리에 의한 세포주기의 G1 arrest 관련 단백질들의 발현 변화</h2><p>Fig. 4의 결과에서 STME는 3T3-L1 세포의 세포주기를 G1기에서 정지시킴으로서 분화를 억제하는 것을 확인 할 수 있었다. 이것을 보다 명확하게 분석하기 위해서 G1 arrest에 관계하는 단백질들의 발현량의 변화를 검토하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포(Day 0)에 분화유도제와 STME를 처리하여 14시간 반응시킨 후 회수하여 Western blot analysis를 시행하였다. 확인한 단백질은 세포주기 G1기에서 S기로의 전이에 필수적인 단백질인 Cdk2, pRb, phospho-pRb 및 전사인자 E2F-1과, G1기 전이를 저해하는 Cdk inhibitor p21의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, STME의 처리 농도가 증가될수록 Cdk2의 발현량이 감소되었으며, Rb 단백질의 인산화가 확연하게 감소함과 동시에 전사인자인 E2F-1의 발현 감소가 확인되었다. 더 뚜렷한 변화는 Cdk2 inhibitor인 p21의 발현량이 현저하게 농도 의존적으로 증가함을 확인 할 수 있었다. 이와 같은 결과는 STME의 처리에 의해 p21의 발현량이 증가되며 이로 인해 Cdk2의 활성이 억제되고, 이어서 전사인자인 Rb의 인산화를 저하시켜 세포주기가 G1기에서 정지되는 것으로 사료된다.</p>
지방세포로의 분화가 일어나기 위해서는 adipogenic signal induction, growth arrest (G1 phase), mitotic clonal expansion, re-enter cell cycle과 같은 아주 복잡하고 질서 정연한 단계를 거친다. 이중 mitotic clonal expansion 단계에 대해 설명하시오.
정지되었던 세포주기가 분화유도제의 자극에 의해 세포주기가 다시 움직여 세포 수가 2~4배 증가하는 단계이다.