<h3>Full-length cDNA의 RNase protection 및 TAP처리</h3><p>First-strand cDNA는 RNase protection을 위해 RNase I(RNase ONE \( { }^{\mathrm{TM}} \), Promega, USA) \(20 \mathrm{unit} \)를 사용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), 30분간 처리하였다. 또한 Cap제거를 위하여 \(150 \mathrm{unit} \)의 TAP (Nippon Gene, Japan)를 사용하였다.</p><h3>Full-length cDNA의 capturing</h3><p>Full-length cDNA는 미리 block시킨 \( 500 \mathrm{ul} \)의 자성 bead를 이용하여 capturing하였다. 비결합된 cDNA를 제거한 후에 bead를 \( 100 \mathrm{ug} / \mathrm{ml}\) tRNA가 포함된 \( 0.5 \mathrm{M} \) EDTA, \( \mathrm{pH} 8.0 \) 용액으로 4회 세척하였다. 그 후, \( 0.4 \%\) SDS, \(50 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) tRNA 용액으로 1회, \(20\%\) glycerol, \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}, 0.2 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 10 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{Tris-HCl} \), pH \( 7.5 \) 용액으로 1회, \( 50 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \mathrm{tRNA} \) 가 포함된 nuclease-free 멸균수로 2회, nuclease-free멸균수로 1회, 1x RNase H buffer (\( 20 \mathrm{mM} \mathrm{~Tris-HCl}\),\( \mathrm{~pH} 7.5\) , \( 10 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{MgCl}_{2}, 20 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}, 0.1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.1 \mathrm{mM} \) DTT)로 1 회 세척하였다. Bead로부터 full-length cDNA를 분리하기 위하여 시료를 \( 0.1 \%\) SDS 및 \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA가 첨가된 \( 100 \mathrm{ul} \) 의 RNase H buffer (2 units)로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 연속 반응시켰다. 불완전한 RNase H 처리로 인하여 bead로부터 제거되지 않은 cDNA fraction (약 \( 60 \% \) 의 cDNA가 결합됨)을 제거하기 위하여 \( 100 \mathrm{ul} \)의 Tris-formate buffer, \( \mathrm{pH} 9.0 \) 용액에서 \( 65^{\circ} \mathrm{C}\), 10분간 alkaline 가수분해를 수행하였다. 반응 후, bead로부터 cDNA가 들어있는 수층을 분리 하기 전에 \( 5 \mathrm{ul} \) 의 \( 10 \%\) SDS 및 \( 1 \mathrm{ul} \) 의 \( 0.5 \mathrm{M} \) EDTA를 첨가하였다. Alkaline elution을 3회 반복하며, 동시에 alkaline처리 fraction 및 RNase H-fraction도 함께 제거시켰다. Single-strand cDNA를 phenol/chloroform으로 1회 추출하며, G50 Sephadex chromatography에 주입하였다. 방사선 표식 fraction을 튜브에 수집하고 \( 2 \mathrm{ug} \) 의 glycogen을 첨가 후, cDNA를 EtOH로 침전시켰다.</p>
First-strand cDNA에서 RNase I를 사용하여 몇도에서 처리했는가?
\( 30^{\circ} \mathrm{C}\)