<p>이를 위하여 사용한 HepG2 및 Hep3B 간암세포는 한국생명공학연구소에서 분주 받아 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 \( 1 \% \) 의 penicillin 및 streptomycin이 포함된 DMEM 배지(Gibco BRL)를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양하였다. \( \beta \)-lapachone은 Biomol (Plymouth Meeting, PA, USA)에서 구입하였으며 순수 alcohol에 녹여 \( 10 \mathrm{mM} \)의 stock 용액으로 제조한 뒤 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하여 적정 농도로 배지에 희석하여 처리하였다. \( \beta \)-lapachone의 처리에 따른 암세포의 형태 변화관찰은 세포배양용 페트리접시에 암세포를 \( 5 \times 10^{5} \)개\( / \mathrm{ml} \) 또는 \( 1 \times 10^{6} \)개\( / \mathrm{ml} \) 정도로 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 다음 \( \beta \)-lapachone을 농도별로 처리하여 24 시간 동안 배양한 후, 도립현미경을 이용하여 200배의 배율로 각 농도에 따른 형태의 변화를 관찰하였다. RT-PCR을 통한 mRNA 발현 변화의 관찰을 위해서는 상기와 동일한 조건에서 준비된 세포를 PBS로 세척하고 TRIzol reagent (Invitrogen Co. Carlsbad, CA, USA)를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 처리하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase (RT)를 이용하여 \( 2 \mu \mathrm{g} \)의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였다. 만들어진 RT product (template cDNA)에 \( 2.5 \mathrm{~mm} \) dNTP, 10X buffer, DEPC water, premixed primer (GenoTech, Korea) 및 Taq DNA polymerase를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다. RT-PCR을 이용하여 분석을 시도한 유전자의 종류는 Table 1에 나타난 바와 같으며, 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다. 그리고 Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석을 위하여 정상 및 \( \beta \)-lapachone이 처리된 배지에서 자란 암세포들을 PBS로 씻어내고 0.05\% tryp-sin-EDTA로 부유시킨 다음 원심분리하여 세포를 모았다. 이렇게 모아진 세포에 적당량의 lysis buffer를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후, \( 14,000 \mathrm{rpm} \)으로 30분간 원심분리하여 그 상층액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 방법에 따라 정량한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 이렇게 만든 동량의 단백질을 \( 8-12\% \) SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)에 전이시킨 후, \( 10 \% \) skim milk를 함유한 PBS-T (\( 0.1\% \) Tween 20 in PBS)에 담구어 상온에서 2시간 정도 incubation하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 PBS-T로 15분 정도 세척하였다. 준비된 membrane에 1차 항체를 처리하여 상온에서 1시간 이상 또는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 세척하고 처리된 1차 항체에 맞는 2차 항체를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 다시 PBS-T로 세척하고 enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Life ScienceCorp. Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다. Western blot analysis를 위해 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science에서 구입하였다.</p>
Acrylamide gel을 \( 10 \% \) skim milk를 함유한 PBS-T (\( 0.1\% \) Tween 20 in PBS)에 담구어 상온에서 2시간 정도 incubation하는 이유는 뭐야?
비특이적인 단백질들에 대한 blocking