<h2>DGGE</h2><p>DGGE는 Bio-Rad Dcode \( { }^{ \mathrm{TM}} \) universal mutation detection system (Bio-Rad, USA)를 이용하여 수행하였다. DGGE run-ning 조건은 두 경우 모두 \( 8 \% \)의 polyacrylamide gel을 사용하였고 denaturant의 농도는 16S rRNA gene 일 때 \( 40 \sim 60 \% \), 28S rRNA gene 일 때 \( 35 \sim 55 \% \)로 제작 하였으며 두 경우 모두 \( 50 \mathrm {~V} \)로 \( 14 \mathrm {~hr} \) 동안 전기영동하여 EtBr로 염색한 후 UV를 이용하여 확인하였다.</p><h2>DGGE band elution 및 sequencing</h2><p>산성누룩의 Total DNA DGGE running에서 관찰 되는 16S rRNA gene, 28S rRNA gene band pattern에 의해 band로 판단한 부분을 E-tube에 담은 후 \( 100 \mu \mathrm{l} \)의 TE buffer를 넣고 elu-tion 과정을 진행하였다. \( - 70^ {\circ} \mathrm{C} \)와 \( 60^ {\circ} \mathrm{C} \)를 번갈아 가면서 열렸다 녹였다를 2번 반복하여 DNA가 용출 되도록 유도하고 \( 4^ {\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight 하였다. 용출된 밴드를 주형 DNA로 사용하여 16S rRNA gene 대상은 338F-GC, 518R primer, 28S rRNA gene 대상은 GCNL-1, LS-2 primer를 이용하여 DNA를 증폭하였다. 증폭된 산물은 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)로 정제 한 뒤 (주)코스모진텍에 의뢰하여 sequencing을 수행하였다.</p><h2>순수 분리된 미생물의 동정</h2><p>순수분리된 세균을 PCA에 도말하여 \( 25^ {\circ} \mathrm{C} \)에서 2일간 배양한 후 Insta Gene Matrix (Bio-Rad, USA)를 이용한 colony PCR을 수행하였다. 증폭을 위한 반응은 누룩의 total genomic DNA를 이용한 16S rRNA gene의 경우와 동일한 조건으로 수행하였다. 진균의 경우 PDA에 도말하여 \( 25^ {\circ} \mathrm{C} \)에서 5일간 배양한 후 균체를 액체질소로 균질화 하였으며, PCR 증폭은 누룩의 total genomic DNA를 이용한 28S rRNA gene의 경우와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다. 세균과 진균의 PCR 산물은 (주)코스모진택사(한국)에 의뢰하여 sequencing을 수행하였다.</p><h2>염기서열 분석</h2><p>확보된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST, http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)에 등록되어 있는 database를 사용하여 검색하였으며, 높은 유사성을 가지는 염기서열을 기초로 하여 group별로 정리한 후, PHYDIT(developed by Dr. J. Chun, version 3.2) 운영프로그램을 이용하여 CLUSTAL_X software, version 1.64b에 의한 align-ment와 similarity를 통해 sequence data들을 비교하였다.</p>
DNA 용출을 위해 어떤 온도환경에서 얼렸다 녹였다를 반복해?
\( - 70^ {\circ} \mathrm{C} \)와 \( 60^ {\circ} \mathrm{C} \)