<h1>재료 및 방법</h1><h2>유기물 분해세균의 분리</h2><p>다양한 유기물을 분해할 수 있는 세균을 분리하기 위해 먼저 섬유소 분해능을 갖는 세균을 1차 분리하였다. 분리원은 우리나라 전통음식인 김치와 된장, 청국장 등 식용 가능한 재료를 이용하였다. 적당히 희석한 시료를 CMC (Carboxymethyl cellulose, Difco) \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)을 포함하는 \( 3 \% \mathrm{~NaCl} \) TSB 한천평반배지 (Tryptic soy broth \( 3 \mathrm{~g}, \mathrm{NaCl} ~30 \mathrm{~g} \), agar \( 18 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) )에 도말하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 2일간 배양한 후 \( 0.1 \% \) congo red 염색약으로 염색하여 콜로니 주위에 투명환을 형성하는 균주를 선별하였다.</p><h2>분리균주의 다양한 유기 중합체 분해능 확인</h2><p>섬유소 분해능이 있는 균주를 대상으로 하여 지질, 단백질, 녹말의 분해능을 확인하였다. 이를 위하여 섬유소 분해 활성을 나타내는 350여 개의 콜로니를 선별하여 상기의 각각의 유기물이 첨가된 TSB 한천평판배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)배양기에서 2일간 배양한 후 지질 분해능과 단백질 분해능은 직접 눈으로 확인하였고, 녹말 분해능은 요오드 용액을 처리하여 콜로니 주위에 투명환을 형성하는 균주를 최종 선별하였다.</p><h2>분리균주의 생장 특성 및 동정</h2><p>분리균주의 최적 생장 조건 \( (\mathrm{pH} \), 온도, 염도)은 서로 다른 조건에서 배양하면서 일정시간 간격으로 시료를 취하여 \(660 \mathrm{nm} \)에서의 흡광도를 측정하여 확인하였다. 분리균주는 생장 특성과 이화학적 특성, 그리고 당 이용능 시험인 API 50 CHB kit (BioMerieux, France) 결과 등을 근거로 하여 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 의하여 동정하였으며, 16S rRNA 염기서열 분석을 통한 동정을 병행하였다.</p><h2>효소 활성 측정</h2><p>분해효소의 활성은 다음과 같이 흡광도법으로 측정하였다. 섬유소분해효소의 활성은 3, 5-dinitrosalicylic acid (DNS) 법에 의거하여 CMC로부터 유리되는 환원당의 농도로 측정하였다. 녹말분해효소의 활성은 DNS법에 의거하여 녹말이 분해될 때 유리되는 환원당의 농도로 측정하였다. 단백질 분해효소의 활성은 azocasein으로부터 유리되는 peptides의 양을 측정하였다.</p><h2>분리세균의 생장에 따른 세포외 효소 활성 변화</h2><p>분리균주를 NB (Nutrient broth, Difco) 배지에 접종하여 \( 180 \mathrm{~rpm}, 35^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 배양하면서 1시간 간격으로 시료를 채취하여 \( \mathrm{pH} \) 변화와 세포외 섬유소분해효소의 활성을 측정하였다. 먼저 시료를 6,000× g에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 구경 \( 0.22 \mu \mathrm{m} \)의 막여과지로 여과한 용액을 이용하여 효소 활성을 측정하였다.</p>
세포외 섬유소분해효소의 활성을 계측하기 위해 분리균주를 어떻게 했는가?
NB (Nutrient broth, Difco) 배지에 접종하여 \( 180 \mathrm{~rpm}, 35^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 배양하면서 1시간 간격으로 시료를 채취