<h1>실험방법</h1><h2>실험동물</h2><p>본 실험에 사용된 동물은 생후 6~8주, 체중은 \( 250 \sim 300 \mathrm{g} \)의 성체 Sprague-Dawley 계 웅성 흰쥐를 이용하였다. 실험 동물 중 허약하거나, 신경학적으로 이상이 발견된 개체는 제외시켰다. 실험군은 흰쥐 좌골신경 압좌손상 후 Needle TENS를 적용한 군으로 기간별로 1일, 3일, 5일, 7 일 적용군으로 세분화하였다. 이에 대조군은 좌골신경 압좌손상 후 Needle TENS를 적용하지 않은 상태에서 드레싱만 해주었으며, 역시 1일, 3일, 5일, 7일 군으로 세분화하였다. 이들 군은 각각 7마리씩으로 구성하여 총 56마리의 Sprague-Dawley 계 웅성 흰쥐를 이용하였다.</p><h2>실험방법</h2><h3>1) 좌골신경손상 유발 방법</h3><p>럼푼(Xylazine hydrocholride: 바이엘코리아)과 케타민(Ketamine hydrochloride: 바이엘코리아)을 \( 1: 1 \) 비율로 혼합하여 흰쥐의 복강내에 주입 \( (0.7 \mathrm{m} \ell) \)하여 마취 시킨후, 하퇴뒷부분(슬와부 아래 \( 1 \mathrm{cm} \) 부분)을 \( 70 \% \) 알코올로 닦아내고 삭모하였다. 세로방향으로 \( 1 \mathrm{cm} \) 절개하여 좌골신경 주위의 근육을 근막을 통하여 근육에 직접적인 손상을 피하고 동시에 좌골신경을 분리하여 경골신경과 비골신경으로 분지하기 직전의 부위를 직선 지혈 겸좌로 30 초간 압좌하였다. 처치 후 다시 봉합하였고, 2차감염을 막기 위해 곧바로 드레싱하였다.</p><h3>2) Needle TENS 적용</h3><p>본 실험에 이용되어진 needle은 행림침구사 제품 stainless steel 호침(길이 \( 3 \mathrm{cm} \), 직경 \( 0.17 \mathrm{mm} \) )사용하였으며, TENS제품은(PG-306 Japan)이며, 주파수는 \( 2 \mathrm{Hz} \) (연속파 \( 0.5 \mathrm{~msec} \) duration), 근수축이 일어날 정도의 강도로 1회 치료시간은 15분, 치료횟수는 1일 1회로 정하여 7일간 needle TENS를 적용하였다.</p><p>needle을 적용한 위치는 제2요추 횡돌기부위와 경골조면tibial tuberosity과 비골두 head of fibula사이 부위에 \( 10 \mathrm{mm} \)깊이이고, TENS의 전극은 단극식 unipolar technique배치법에 따라 하였다. 실험군의 조직은 needle TENS를 실시한 후 곧바로 \( 0.9 \% \mathrm{~NaCl} \)을 이용하여 심장관류를 실시하였고, pH 7.2~7.4의 \( 8 \% \) paraformaldehyde용액을 이용하여 조직 전고정을 하였다. 좌골신경을 분지로 내는 척수 요수부를 절취하여 면역조직화학반응을 실시하기 위해 \( 8 \% \) paraformaldehyde로 두시간 후고정하였으며, \( 25 \% \) sucrose 용액에 1일간 4C 냉장보관하였다. 대조군은 Needle TENS를 적용하지 않았고 실험과정은 위와 동일하다.</p><h3>3) 조직절편 제작과정</h3><p>후고정을 끝낸 후 절취한 척수 요수부는 극저온냉동기로 영하 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)로 냉동하였고, 미세절단기(microtome, Bright 5040 )를 사용하여 \( 30 \mu \mathrm{m} \) 두께로 잘랐으며, \( 0.01 \mathrm{M} \) phosphate buffer saline(PBS)에 처리하였다가 1차항체에 옮겨 담았다.</p><h3>4) 면역조직화학반응</h3><p>신경전달의 변화를 관찰하기 위해서, 척수의 요수부 조직 절편을 1차 항체인 NGF(mouse, 희석률 \( 100 \% \) Anti-NGF, sigma)를 실온(\( 24^{\circ} \mathrm{C} \)) 에서 1일간 처리하였다. \( 0.01 \mathrm{M} \) phosphate buffer saline에 10분간 3회 수세과정을 실시하고, 2차 항체(goat anti-mouse IgG, 1:50, sigma)를 실온에서 90분간 처리하였다. 이후 \( 0.01 \mathrm{M} \) phosphate buffer saline로 10분 3회 수세를 실시하고 3차로 streptavidine을 실온에서 30분간 처리하였다. 다시 \( 0.01 \mathrm{M} \) phosphate buffer saline 로 10분간 3회 수세를 실시하고 ABC(avidine-biotin peroxidase complex)를 실온에서 30분간 처리하였다. 처리한 조직을 다시 \( 0.01 \mathrm{M} \) phosphate buffer saline(PBS)에 10분 3회 수세를 하고 \( 200 \mathrm{m} \ell \) 3차 증류수에 \( 5 \mathrm{g} \)의 DAB(\( 3^{\prime} 5^{\prime} \)-diaminobenzidine)를 넣어 녹인 용액을 여과지를 이용하여 여과한 후 이 용액에 조직을 10분간 처리하였으며, 10분 후에 \( 0.03 \% \) (\( 60 \mu \ell \) / \( 200 \mathrm{m} \ell) \) Wasserstoffperoxid \( 30 \% \) \( \mathrm{H_{2}O_{2}} \)(Perhydrol)를 처리하였다. 다시 \( 0.01 \mathrm{M} \) phosphate buffer saline 에 10분간 3회 수세하였고, 3차 정류수에 10분간 3회를 수세하였다. 이렇게 처치한 cresyl violet acetate 용액에 3분간 침수시켰고, 흐르는 물에 3회에서 4회 침수로 수세하였다. 이후 \( 50 \% \), \( 70 \% \), \( 80 \% \), \( 90 \% \), \( 95 \% \), \( 100 \% \)(I), \(100 \% \)(II) 알코올에 탈수과정을 거치고 Xylene(I), Xylene(II)에서 청명과정을 거친 후 PMM(perment mounting media)을 이용하여 cover glass로 봉입하는 mounting 과정을 실시하였다. 이렇게 처리된 조직의 면역조직화학반응은 Image-proplus 3.0 for windows(Media Cybernetics, USA)를 이용하여 사진촬영을 실시하고 반응양상을 분석하였다.</p><h3>5) 결과처리</h3><p>광학현미경으로 관찰 후 말초신경손상 후 시간의 경과에 따른 NGF의 발현 변화를 보기 위해 SAS 6.12를 이용해 one-way ANOVA와 t-test를 실시하였으며 유의수준은 0.01과 0.001에서 보았다.</p>
흰쥐의 좌골신경손상을 유발시키는 방법은 뭐야?
세로방향으로 \( 1 \mathrm{cm} \) 절개하여 좌골신경 주위의 근육을 근막을 통하여 근육에 직접적인 손상을 피하고 동시에 좌골신경을 분리하여 경골신경과 비골신경으로 분지하기 직전의 부위를 직선 지혈 겸좌로 30 초간 압좌