<h2>EmeA의 ethidium bromide 세포 외 배출활성</h2><p>Fig. 3의 약제축적 측정실험의 결과를 확인하기 위해서, 이번에는 실제로 EmeA가 약제를 배출하는지를 확인하였다. 시약은 EtBr을 사용하였다. CCCP와 EtBr의 존재 하에서 장시간 EmeA 발현균주를 탈에너지화하고, 세포 내에 EtBr을 다량 축적시켰다. Fig. 4에 나타낸 바와 같이, 탈에너지화 과정에서 세포 내에 축적된 ethidium bromide의 양은 대장균 KAM32나 EmeA 발현균주 모두 비슷하였으나, CCCP제거 후에 에너지원으로 포도당을 제공하였을 때, KAM32 균주는 세포내 축적된EtBr의 양의 감소현상이 나타나지 않았으나, EmeA 발현균주는 급격한 형광의 감소를 보였다. 이는 세포 내에 축적되어 있던 ethidium bromide를 EmeA가 에너지 의존적으로 배출하는 활성을 직접적으로 증명하는 결과이다.</p><h2>Reserpine에 의한 EmeA 배출활성의 저해</h2><p>Reserpine은 다양한 약제배출 펌프단백질을 저해하는 저해제로 널리 알려져 있다. 이 중에는 항암제 배출단백질인 P-glycoprotein, B. subtilis의 Bmr, L. lactis. LmrP, 그리고 S. aureus의 NorA, 그리고 E. coli의 EmrE 등이 있다. 이에 본 연구에서는 EmeA가 매개하는 ethidium bromide 배출활성에 대한 reserpine의 영향을 관찰하 였다. Fig. 5에 나타낸 바와 같이 reserpine은 매우 강한 저해 활성을 보여, 최종농도 \( 100 \mathrm{uM} \) 의 reserpine-을 첨가하였을 경 우에 EmeA의 활성을 완전히 저해하였고, \( 50 \% \) 저해농도 \( \left(IC_{50}\right) \) 는 \( 12.6 \mathrm{uM} \) 로 계산되었다. 동물세포에 존재하는 다제 배출펌프인 P-glycoprotein과 MRP-1 등의 저해제로 알려져 있는 reserpine뿐만 아니라, verapamil과 biricodar, timcodar가 포도상구균 등의 그람양성 세균의 efflux pump에 있어서도 강력한 저해 효과를 가진다는 보고가 있다. MRSA와 VRE 등 임상에서 심각한 문제가 되고 있는 항생제 내성 그람양성균에 의한 감염성질환의 극복을 위해서는, 여러 가지 약제에 한꺼번에 내성을 나타내는 다제배출 펌프단백질에 대한 지속적이고 광범위한 연구가 필요하다. 또한 세포외 막이 없는 그람양성세균에 있어서 유력한 약제 내성 원인기작의 하나로 지목되고 있는 다제 배출펌프의 저해제를 기존의 약물이나 천연물로부터 찾고, 기존의 항생제와의 병용방법에 대한 연구가 항생제 내성세균 문제에 대한 가능성이 높은 해결책이라 할 수 있다.</p><h1>요 약</h1><p>Enterococcus faecalis ATCC 29212 균주의 염색체로부터 클로닝된 다제 내성 유전자 emeA의 발현은 항생제 및 여러 약제에 대해 내성을 나타내며, DAPI와 Hoechst 33342 등을 배출하는 것으로 보고되었다. 본 연구에서는 약제 초감수성 숙주균주인 대장균 KAM32에 emeA 유전자를 발현시키고, 다제배출 펌프단백질인 EmeA의 생화학적인 특징에 대해 발표한다. EmeA는 393개의 아미노산으로 구성되어 있으며, Major Facilitate Super Family의 전형적인 특징인 12개의 막관통구조를 가지고 있었다. 또한 Lactococcus lactis의 Blt 및 Staphylococcus aureus의 NorA, 그리고 Escherichia coli의 TetA 등과 아미노산 서열에서 상당한 유사성을 나타내었다. 형광기질인 ethidium bromide와 acriflavine을 이용한 약제축적활성 실험에서 EmeA를 발현하는 균주는 대조균주에 비해 현저하게 낮은 세포내 약제축적을 나타내었으며, ethidium bromide를 이용한 약제배출활성 실험에서 EmeA 발현균주는 에너지 의존적인 ethidium bromide 배출활성을 나타내었다. 또한 약제배출 팸프단백질로 알려져 있는 reserpine은 EmeA의 ethidium bromide 배출활성에 대해서도 강력한 저해활성을 나타내었다.</p>
EtBr 시약을 사용하여 무엇을 확인하기 위해 약제축적 측정실험 결과를 확인했을까요?
실제로 EmeA가 약제를 배출하는지