<h2>DNA 추출, PCR 및 Southern analysis</h2><p>벼 잎 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 \( 14 \mathrm{ml} \) tube에 넣고, 액화질소를 이용하여 곱게 마쇄한 후 DNA추출 용액 (\( 2000 \mathrm{mM} \) Tris-HCl \(\mathrm{pH} 8.0\), \( 500 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}\), \(25 \mathrm{mM} \) EDTA, Sodium bisulfate \( 0.38 \mathrm{~g}/100 \mathrm{ml}\)) \(1 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 유봉으로 잘 혼합한 후, chloroform:isoamyl alcohol (24:1) \( 1 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 10 분간 흔들어 잘 혼합한 다음 \( 3,500 \mathrm{rpm} \) 으로 10분간 원심분리하였다. 상등액을 분리한 후 동일 양의 phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) 를 첨가하여 10회 정도 흔들어 준 후, \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 으로 5분간 원심분리 하였다. 상등액을 새로운 \( 1.5 \mathrm{ml} \) tube에 옮긴 다음 \( 2 \mu \mathrm{l} \) 의 RNase \( (10 \mathrm{mg} /\mathrm{l}) \) 를 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시켰다. 2/3~1 volume의 isopropanol을 첨가하여 DNA를 응축시킨 다음 \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 으로 10 분간 원심분리하여 DNA를 침전시킨 후, \( 70 \% \) 에탄올로 세척하여, \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 으로 5 분간 원심분리 하였다. 상등액을 버리고 DNA를 풍건시킨 다음 \( 70 \mu \mathrm{l}\) 의 TE에 DNA를 녹여서 PCR 분석에 사용하였다. 추출한 DNA를 10~50배로 희석한 다음 시료당 \( 20 \mathrm{ng} \) 을 취하여 PCR 분석에 이용하였다. PCR에 사용한 primer는 pGBF, pGTFm pZ4F의 Bar 유전자 앞에 위치한 35S 프로모터 단편의 특이적인 DNA 증폭을 위하여 forward primer (5'-TTCA ACAAAGGGTAATATCCGG-3')와 reverse primer (5'-CGAAGGATAGTGGGATTGTGC-3')를 합성하여 사용하였다. PCR 반응조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 hot step, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 denaturation, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 40초간 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간extension 과정을 35 cycle 반응시킨 후, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 마지막 extension을 실시하여 증폭하였으며 \( 1 \% \) agarose gel 상에서 35S 프로모터의 도입여부를 확인하였다.</p><p>위에서 추출한 \( 10 \mu \mathrm{g} \) DNA를 EcoRI 제한효소로 절단하였다. 절단된 DNA는 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기영동한 후, Sambrook과 Russell(2001)의 방법에 따라 nylon membrane에 고정시켰다. Probe DNA는 Ladderman labelling kit (TaKaRa)를 이용하여 \( \left(a-{ }^{32} \mathrm{P}\right) \mathrm{dCTP} \)로 방사선표지하였다. Hybridization은 Church와 Gilbert(1984)의 방법에 의하여 수행하였으며, hybridization을 마친 필터는 2X SSC/\(0.1 \%\) SDS 용액으로 상온에서 2번 세척한 후, 0.1X SSC/\(0.1 \% \) SDS 용액으로 상온에서 한번, \( 68^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 한번 세척하였다.</p>
새로운 \( 1.5 \mathrm{ml} \) tube에 옮긴 다음 \( 2 \mu \mathrm{l} \) 의 어떤 용액 \( (10 \mathrm{mg} /\mathrm{l}) \)을 넣고 반응을 진행하였는가?
RNase