<p>본 연구에서는 전사억제제(transcription inhibitor)로 알려져 있는 actinomycin D를 처리시 특이적으로 STAT3가 인산화 되는 것을 확인하였다. Actinomycin D에 의해 유도되는 STAT3 인산화는 JAK2 활성을 저해하는 SOCS3 단백질의 발현 감소에 의하여 야기됨을 확인하였고, STAT3의 탈인산화를 유도한다고 알려진 tyrosine phosphatase인 SHP-1 발현과 무관하였다. 또한 다른 전사 저해제에서도 동일한 현상을 확인하였다.</p><h1>재료 및 방법</h1><h2>세포 배양 및 시약</h2><p>본 연구에 사용한 신장암세포주인 Caki는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 세포주 배양을 위한 배지는 \( 10 \% \) 태아우혈청(fetal bo-vine serum, Hyclone laboratories, Lagan, Utah, USA)과 \( 1 \% \) Antibiotics, \(0.2\%\) Gentamycin을 첨가한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco BRL, Grand Island, NY) 을 사용하였으며 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 로 유지되는 \( 5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) 배양기를 이용하여 배양하였다. 실험에 사용된 약제인 actinomycin D와 DRB는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.</p><h2>Western blotting</h2><p>단백질의 발현을 알아보기 위해서 Western blot을 실시하였다. 세포를 \( 0.45 \times 10^{6} \) cells/well로 12 시간 배양 후에, FBS를 첨가하지 않은 무혈청 배지로 교체하여 시약을 처리하여 배양 후, 세포를 모아 \( 32 \mu 1 \) lysis buffer (137 mM NaCl, \( 15 \mathrm{mM} \) EGTA, \( 0.1 \mathrm{mM} \) sodium orthovanadate, \( 15 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl} 2,0.1 \% \) Triton X-100, \( 25 \mathrm{mM} \) MOPS, \( 100 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride, and \( 20 \mathrm{mM} \) leupeptin, \( \mathrm{pH} \) 7.2)를 첨가하고 5 분 간격으로. 15 초 동안 3번 vortex하여 세포를 파쇄한 후 13,000 \( \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \), 15 분간 원심분리하여 시료를 준비하였다. 시료는 \( 562 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 단백질을 정량하였으며, \( 10 \% \) sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에서 단백질을 분리한 후, immobilon mem-brane (Milipore, Bedford, MA, USA)으로 transfer하였다. Membrane은 5\% milk/TBST (20 mM Tris-HCl, \( 137 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaCl}\), \(0.1 \% \) Tween 20, \(\mathrm{pH}\) 7.4)로 실온에서 1 시간 유지한 후, p-STAT3, STAT3, p-STAT1, STAT1, SOCS3, p-JAK2, SHP-1, ERK (Santa Cruz, CA, USA)를 희석한 \(5\%\) milk/TBST로 실온에서 12시간 유지하였다. Anti-mouse 또는 rabbit Ig horse-radish peroxidase/TBST (Amersham Buckinghamshire, England)로- 1시간 반응 후 Enhanced Chemiluminoscence (ECL, Pierce, IL, USA)용액을 가하여 발색시켜서 단백질 발현을 확인하였다.</p>
시료 \( 562 \mathrm{~nm} \)에서 무엇을 이용하여 단백질을 정량 했습니까?
흡광도