<h2>Xanthine Oxidase 억제 활성</h2><p>Xanthine oxidase에 의해 생성된 superoxide radials 소거활성은 NBT (nitro-blue tetrazolium) 환원법을 사용하여 검정하였다. 즉, \( 0.8 \mathrm{mM} \) xanthine을 포함하는 \( 0.1 \mathrm{mM} \) phos-phate buffer ( \(\mathrm{pH} 8.0\)) \( 0.5 \mathrm{ml} \) 와 \( 0.48 \mathrm{mM} \) NBT를 포함하는 \( 0.1 \mathrm{mM} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH}8.0 \) )에 시료를 농도별로 각각 처리하여 혼합한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 분간 incubation 하였다. 반응물에 xanthine oxidase \( (0.049 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \) 을 \( 1.0 \mathrm{ml} \) 을 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20 분간 incubation시켰다. 그 후, \( 69 \mathrm{mM}\)SDS를 \( 2.0 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 반응을 정지 시킨 후 \( 560 \mathrm{~nm} \) 흡광도에서 측정하였다. 농도별 시료에 따른 NBT 환원에 대한 저해능은 다음과 같은 식으로 계산하였다.</p><p>XO inhibition \( (\%)=\frac{C-S}{C-B} \times 100 \)</p><p>B (blank): \( 0.8 \mathrm{mM} \) xanthine 포함한 \( 0.1 \mathrm{mM} \) buffer \( (\mathrm{pH} 8.0\) )와 \( 69 \mathrm{mM} \) SDS만 첨가한 반응액 흡광도</p><p>C (control): 시료대신 \( 0.48 \mathrm{mM}\) NBT를 첨가한 반응액 흡광도</p><p>S (Sample): 시료 첨가한 반응액 흡광도</p><h2>ACE(Angiotensin I -Converting Enzyme) 저해능 측정</h2><p>ACE저해 활성은 Cushman 등의 방법에 따라 측정하였으며, 조효소액은 rabbit lung acetone powder (Sigma, USA)를 \( 0.3 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \) 을 함유한 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium borate buffer \( (\mathrm{pH} 8.3\)) 에 \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{ml}\)(\(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 의 농도로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 추출한 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), \( 4,000 \mathrm{rpm} \) 에서 40 분간 원심 분리하여 상등액을 ACE 조효소액으로 사용하였다. 기질은 \( 0.3 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \) 이 함유된 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium borate buffer \( (\mathrm{pH} 8.3\))에 HHL (hippuryl- histidyl-leucine)을 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\) \((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 의 농도로 녹인 후 기질로 사용하였다. ACE저해활성은 시료 \( 50 \mu \mathrm{l} \)에 ACE 조효소액 \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 가한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 예비반응 시킨 후, 기질 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 을 가한 후 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응 시켰다. \( 1 \mathrm{N} \mathrm{~HCl} \) \(150 \mu \mathrm{l} \) 로 반응을 정지시키고 ethyl acetate \( 750 \mu \mathrm{l} \) 가한 후, 1 분간 교반하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(5,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심 분리 한 후 상등액 \( 500 \mu \mathrm{l} \) 를 얻었다. 이상등액을 \( 120^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 완전히 건조시켜 \( \mathrm{MeOH}\) \(2 \mathrm{ml} \) 을 넣은 후 \( 228 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로서는 시료 대신 시료용매 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 를 가해 실험 하였으며, ACE 저해 활성효과는 다음 계산식을 이용하여 실험하였다.</p><p>ACE inhibition \( (\%)=(C-S / C-B) \times 100 \)</p><p>S: Sample absorbance. C: Control absorbance. B: Blank absorbance</p><h2>HPLC 분석</h2><p>Flavonoid glycoside 분석을 위한 표준용액 \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) Quercetin, Kaemferol, Myricetin, Apigenine, Luteolin, Rutin을 메탄올에 용해시켜 사용하였고, 시료 \( (10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)는 메탄올에 용해 한 후 Sea-pak C18 cartridge와 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) filter로 여과하여 HPLC 분석용 시료로 사용하였다. 분석용 column은 Octadecylsilane (ODS) C18 \( (4.6 \times 25 \mathrm{~cm}\), \(5 \mu \mathrm{m}) \)을 사용하였고, 용매는 \( \mathrm{MeOH} / \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} / \)Acetic acid \( (5 / 93 / 2\), \(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)와 \( 60 \% \mathrm{~MeOH} \) 를 사용하여 linear gradient해서 55분간 용출 시킨 후 15 분간은 \( 60 \% \mathrm{~MeOH} \) 로서 용출하였다. Total flow rate은 \( 1 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 로 하였고, detector는 UV \( 370 \mathrm{~nm} \) 에서, column temp. oven은 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 로 하여 Shimadzu LC-10AD으로 분석하였다.</p>
superoxide radials 소거활성은 NBT환원법을 사용하여 검정하였나?
YES