<h2>중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)에 의한 mtDNA의 증폭</h2><p>MtDNA에서 3243, 1555, 7445부위의 \( A \rightarrow G \) 돌연변이 유무를 관찰하기 위하여 mtDNA 3243, 1555, 7445부위가 포함된 mtDNA fragment를 다음과 같이 PCR을 통하여 증폭하였다. PCR Master Mix (Promega Co., U.S.A) ( \(50 \mathrm{~Units} / \mathrm{ml} \) Taq DNA Polymerase, \( 500 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{KCl} \), \( 100 \mathrm{mM} \) \( \text{Tris-} \mathrm{HCl} \) \( \mathrm{pH~} 8.5 \), \( 1 \% \) Triton X-100, \( 400 \mu \mathrm{M} \) dNTP, \( 3 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{MgCl}_{2} \) ) \( 15 \mu \mathrm{l} \), \( 10 \mathrm{~pM} \) forward primer \( 1 \mu \mathrm{l} \), \( 10 \mathrm{~pM} \) reverse primer \( 1 \mu \mathrm{l} \), 주형 \( 2 \mu \mathrm{l} \), 증류수 \( 11 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 \( 30 \mu \mathrm{l} \) 가 되도록 용량을 맞춘 뒤, 초기변성을 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 5 \mathrm{~min} \) 간 하고, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 1 \mathrm{~min} \) 간 변성, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 1 \mathrm{~min} \) 간 결합, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 1 \mathrm{~min} \) 간 연장하는 cycle을 \( 30 \mathrm{~cycle} \) 행한 뒤, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 10 \mathrm{~min} \) 간 추가 연장 반응으로 증폭시켰다. 이렇게 합성된 PCR 생성물을 \( 2 \% \) agarose gel에 전기영동하여 DNA band를 확인하였다. A3243G는 forward primer로 3153부터 3172부위가 포함되는 5 TTCACAAAGCGCCTTCCCCC 3와 reverse primer로 3551부터 3531부위가 포함되는 5 GCGATGGTGAGAGC TAAGGTC 3 를 사용하여 \( 399 \mathrm{~bp} \) 의 DNA band를 확인하였다. 확인된 PCR 생성물 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 Apa Ⅰ 제한효소로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 3 \mathrm{~hr} \) 동안 처리한 뒤 \( 2 \% \) agarose gel에 전기영동하여 돌연변이 존재시에 \( 309 \mathrm{~bp} \) 와 \( 90 \mathrm{~bp} \) 의 digested mtDNA fragment를 관찰하였다. A1555G는 forward primer로 1252부터 1271부위가 포함되는 5 GCCTATATACCGCCATCTTC 3와 reverse primer로 1726 부터 1707부위가 포함되는 5 GGTTTGGCTAAGGTTGTCTG 3를 사용하여 \( 475 \mathrm{~bp} \) 의 DNA band를 확인하였다. 확인된 PCR 생성물 \( 10 \mu \mathrm{l} \)를 Alw 26 Ⅰ 제한효소로 처리한 뒤 \( 2 \% \) agarose gel에 전기영동하여 돌연변이가 존재하지 않을 시에 \( 295 \mathrm{~bp} \) 와 \( 180 \mathrm{~bp} \) 의 digested mtDNA fragment를 관찰하였다. 그리고, A7445G는 forward primer로 7178부터 7198부위가 포함되는 5 CTTCCCAC AACACTTTCTCGG 3와 reverse primer로 7840부터 7821부위가 포함되는 5 GTAAAGGATGCGTAGGGATG 3를 사용하여 \( 662 \mathrm{~bp} \) 의 DNA band를 확인하였다. 확인된 PCR 생성물 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 Xba Ⅰ 제한효소로 처리한 뒤 \( 2 \% \) agarose gel에 전기영동하여 돌연변이가 존재하지 않을 시에 \( 400 \mathrm{~bp} \) 와 \( 262 \mathrm{~bp} \) 의 digested mtDNA fragment를 관찰하였다.</p><h2>정제 및 mtDNA 염기서열 분석</h2><p>PCR 생성물을 Solget사의 PCR purification kit를 사용하여 정제하고 난 후 Bigdye\( { }^{\mathrm{TM}} \) terminator cycle sequencing ready reaction kit (PE Applied Biosystems., U.S.A)를 사용해 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 10 \mathrm{~sec} \) 간 변성, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 5 \mathrm{~sec} \) 간 결합, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 4 \mathrm{~min} \) 간 연장하는 cycle을 25회 실시하는 PCR을 행하여 ddNTP에 형광물질을 부착하였다. 형광물질이 부착된 PCR 생성물을 Sequencing reaction cleanup kit인 Millipore사의 MontageTM SEQ\( { }_{96} \)을 사용해 정제한 뒤 Perkin-Elmer사의 ABI PRISM 3700 DNA analyzer (capillary방식)로 염기서열을 분석하였다.</p>
MtDNA에서 돌연변이 유무를 관찰하기 위하여 mtDNA fragment를 무엇을 통해 증폭하였는가?
PCR