<h1>재료 및 방법</h1><h2>시료 제조</h2><p>본 실험에 사용한 밤나무(Castanea crenata)잎은 전라도 장수군 일대 밤나무자생 야산에서 채취하여 실험재료로 사용하였다. 열수추출물의 경우 시료의 10배의 증류수를 첨가하여 \(85^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였으며, 에탄올추출물과 아세톤추출물의 경우 \( 70 \% \) 에탄올 또는 아세톤을 시료 중량의 10배 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상징액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 추출물을 여과, 농축 및 동결건조 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 냉장실에 보관하여 본 실험의 시료로 사용하였다.</p><h2>전자공여능 측정(Elctron donating ability)</h2><p>전자공여능은 Blois 방법[1]을 변형한 1.1-diphenyl-2-pic-rylhydrazyl (DPPH) free radical 소거법으로 측정하였다. DPPH는 자신이 가지고 있는 홀수의 전자 때문에 \( 517 \mathrm{~nm} \) 에서 강한 흡수 스펙드럼을 보이나 페놀성 화합물과 같이 수소 전자를 제공해 주는 전자공여체와 반응하게 되면 전자를 제공하는 hydrogen radical을 받아 phenoxy radical을 생성하게 되며 흡수 band도 사라지게 되고 안정한 분자가 된다. 즉 농도별 시료액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)와 \( 99.9 \% \) ethanol에 용해 한 \( 0.2 \mathrm{mM} \)의 DPPH \( 0.05 \mathrm{ml} \)를 넣고 교반한 후 암소에 30분 반응 후 517 \( \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 대조군에 대한 흡광도 감소치를 DPPH 라디칼 소거활성으로 하여 항산화 활성도를 나타내었다. 이때 상대 활성의 비교를 위하여 양성대조군으로 BHA를 사용하였다.</p><h2>ABTS radical cation 소거능 측정</h2><p>ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+• cation decolorization assay 방법에 의하여 측정하였다. \( 7 \mathrm{mM} \) 2,2-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline- 6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS)와 \( 2.4 \mathrm{mM} \) potassium persulfate를 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+•을 형성시킨 후 ethanol로 희석 하여 ABTS+ • \( 0.1 \mathrm{ml} \)에 시료 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 가하여 1분 동안 방치한 후 \( 732 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Elastase 저해활성 측정</h2><p>Elastase 저해활성 측정은 Cannell 등의 방법에 따라 측정하였다. 추출물을 일정 농도가 되도록 조제하여 \( 0.5 \mathrm{ml} \)씩 시험관에 취하고, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) buffer \( (\mathrm{pH} 8.6\))에 녹인 porcine pancreas elastase \((2.5 \mathrm{U} / \mathrm{ml})\) 용액 \( 0.5 \mathrm{ml} \)을 가한 후 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) buffer \( (\mathrm{pH} 8.6 \))에 녹인 기질 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide \( (0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)을 첨가하여 20분간 반응시켜 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 \( 405 \mathrm{nm} \)에서 측정하였다. Elastase 저해 활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p><h2>Collagenase 저해활성 측정</h2><p>Collagenase 저해활성 측정은 Wúnsch 등 방법에 따라 측정하였다. 즉 반응구는 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} 7.5\))에 4 \( \mathrm{mM} \mathrm{CaCl}_{2} \)를 첨가하여, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg \( (0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)를 녹인 기질액 \( 0.25 \mathrm{ml} \) 및 시료용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)의 혼합액에 collagenase \( (0.2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml})\) \(0.15 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 \( 6 \% \) citric acid \( 0.5 \mathrm{ml} \)을 넣어 반응을 정지 시킨 후, ethyl acetate \( 1.5 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 \( 320 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p><h2>통계처리</h2><p>실험 결과는 3회 반복 측정 후 평균 \( \pm \) SD로 나타내었다. 통계분석은 SAS program (SAS Institue, Cary, NC, USA)을 이용하여 분산분석한 후 Duncan의 다중검정을 실시하였으며, 상관관계를 분석하였다.</p>
전자공여능은 Blois 방법[1]을 변형한 1.1-diphenyl-2-pic-rylhydrazyl (DPPH) free radical 소거법으로 측정하였다. DPPH는 자신이 가지고 있는 홀수의 전자 때문에 517 \mathrm{~nm}517 nm 에서 강한 흡수 스펙드럼을 보이나 페놀성 화합물과 같이 수소 전자를 제공해 주는 전자공여체와 반응하게 되면 전자를 제공하는 hydrogen radical을 받아 phenoxy radical을 생성하게 되며 흡수 band도 사라지게 되고 안정한 분자가 된다. 즉 농도별 시료액 0.1 \mathrm{ml}0.1ml와 99.9 \%99.9% ethanol에 용해 한 0.2 \mathrm{mM}0.2mM의 DPPH 0.05 \mathrm{ml}0.05ml를 넣고 교반한 후 암소에 30분 반응 후 517 \mathrm{nm}nm 에서 흡광도를 측정하였다. 대조군에 대한 흡광도 감소치를 DPPH 라디칼 소거활성으로 하여 항산화 활성도를 나타내었다. 이때 상대 활성의 비교를 위하여 양성대조군으로 BHA를 사용하였다. 위의 설명은 밤나무잎 추출물 실험 중 무엇을 측정하기 위한 실험인가?
전자공여능 측정(Elctron donating ability)