<h2>Colony 활성 염색과 Endoxylanse 합성 측정</h2><p>효모의 형질전환체 colonies로부터 endoxylanase의 발현유무를 조사하기 위해 Congo red 염색법을 사용하였다. 즉, \( 1 \% \) xylan을 함유한 YPDG 평판배지에서 48시간 동안 자란 효모 형질전환체 colonies를 증류수로 세척 · 제거하고 \( 0.1 \% \) Congo red 용액으로 30분간 반응 후, \( 1 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \) 로 30분간 탈색하여 형성된 투명환을 측정함으로써 endoxylanase의 발현 유무를 확인하였다.</p><p>Endoxylanase 활성은 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS) 방법을 사용하여 측정하였다. 증류수에 현탁시킨 \( 1.0 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) oat spelt xylan(Sigma, St. Louis, U.S.A) 용액 \( 50 \mu \mathrm{L} \)와 100 \( \mathrm{mM} \) 인산 완충액 (\(\mathrm{pH} 6.5\)) \( 100 \mu \mathrm{L} \), 배양액 \( 50 \mu \mathrm{L} \)를 혼합하여 반응한 후 DNS 시약 \( 700 \mu \mathrm{L} \)를 첨가하여 반응을 정지시키고 끓는 물에서 5분간 방치하였다. 이 후 \( 550 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하고, xylose를 표준시료로 사용하여 작성한 표준 곡선과 비교하여, 유리된 환원당의 양을 결정하였다. 효소 활성의 \(1 \mathrm{unit}\)는 위의 조건하에서 1분 동안 xylan으로부터 1 \( \mu \mathrm{mole}\)의 환원당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.</p><h2>Immunofluorescence Microscopy</h2><p>YPDG 배지에서 48시간 배양한 균체를 원십분리 \( (8000 \) \( \mathrm{rpm}\), 10분)하여 균체 침전물을 얻고, 이를 인산완충액(PBS, \( \mathrm{pH} 7.4\))에서 두 번 세척한 후 PBS에 \( \mathrm{OD}_{690}=20 \)로 희석하였다. 면역항체염색은 c-myc monoclonal antibody(mAb) 9E10(Covance Inc., U.S.A.)를 1차 항체 (\(1:500\))로 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), 1.5시간 반응 후 세척하고 fluorecein - isothiocyanate (FITC) - labeled anti-mouse IgG(H+L) (KPL Co., U.S.A.)를 2차 항체 \( (1: 100) \)로 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), 1시간 반응 후 세척하였다. 면역항체 염색한 균체의 형광 분석은 confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, LSM 510 META, Germany)를 이용하였다.</p><h2>Xylan 분해 효소반응과 Thin-layer chromatography 분석</h2><p>\( 20 \mathrm{mM} \) 인산 완충액 \( (\mathrm{pH} 6.5\))에 용해된 oat spelts xylan OSX과 corncob xylan CCX을 endoxylanase 표면발현 생촉매 효소반응의 기질로 사용하였다. Xylan 용액 \( 5 \mathrm{~mL} \)과 효모 생촉매 용액 \( 5 \mathrm{~mL} \)을 혼합하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \sim 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 반응시킨 후 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 열처리하였다. 최종 기질 농도는 \( 2 \sim 8 \% \), 최종 생촉매 농도는 \( 0 \sim 25 \mathrm{unit} / \mathrm{mL} \) 범위에서 사용하였다. Endoxylanase에 의해 가수분해된 xylan 분해산물은 thin-layer chromatography(TLC)를 이용하여 분석하였다. 즉, 각각의 반응액 \( 5 \mu \mathrm{L} \)씩을 TLC plate(Merck Co., Darmstadt, Germany)에 점적한 후 chloroform:acetic acid:water(\(6:7:1\), \( \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)을 전개용매로 사용하여 3회 전개하였다. 전개된 TLC plate는 ethanol-sulfuric acid(\(95:5\))를 sprayer로 사용하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 발색시켰다. Standards로는 xylose(Sigma, St. Louis, U.S.A), xylobiose, xylotriose(Megazyme, Ireland)를 사용하였다. TLC 상의 반응생성물 spots은 image analyzer(FluorChem 5500, Alpha InnoTech. U.S.A.)를 사용하여 정량분석하였다.</p>
colonies로부터 어떤 물질의 발현유무를 확인하는 것이 목표인가?
endoxylanase