<h2>Nitric oxide (\(\mathrm{NO}\)) 생성량 측정 및 cell viability 측정</h2><p>\(\mathrm{NO}\)의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite양을 측정하였다. 대식세포를 세포 배양판에 \( 5 \times 10^{5} \) cells/ml의 세포가 되도록 재부유하여 LPS의 자극하에 24시간 배양하고 그 배양 상층액 내의 \(\mathrm{NO}\)를 Griess 시약과 반응시켜 측정하였다. \( 100 \mu \mathrm{l}\) 의 세포배양 상층액을 취하여 동량의 Griess 시약 [\( 1 \% \) sulfanilamide ( \( 30 \% \) acetic acid)와 \(0.1\%\) N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride (\(60\%\) acetic acid) 혼합액]을 가하여 상온에서 20 분간 반응시켰다. \(\mathrm{NO}\)의 활성 정도는 ELISA 판독기를 사용하여 \( 800 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도 범위에서 \( 540 \mathrm{~nm} \) 흡광도를 측정하였다.</p><p>세포독성 실험은 mitochondrial dehydrogenase activity의 index를 나타내는 MTT colorimetric reduction assay 법으로 시료가 세포생존율에 미치는 영향을 분석하였다. 96-well microtiter plate (Nunc, Vangaard, Neptune, NJ)에 RAW 264.7 macrophage를 \( 1 \times 10^{5} \) cells/well의 농도로 분주하였다. 분주 24시간 후 각 시료가 함유되어 있는 배지를 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 씩 넣어 48시간 동안 배양하였다. Plate에 \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\) 3-(4,5- dimethylth-iazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT, Sigma) 용액을 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가하여 4 시간 동안 배양시키고 formazan을 형성시키 후 조심스럽게 상등액을 제거하였다. DMSO \( 150 \mu \mathrm{l} \)을 첨가하여 formazan을 녹인 후 \( 570 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>혈전분해능 측정</h2><p>혈전용해 활성의 측정에 있어서는 Astrup와 Hullertz의 방법을 변형하여 사용하였다. \(0.4\%\) Fibrinogen (Sigma)을 sodium borate buffer ( \( 10 \mathrm{mM} \) sodium borate, \( 160 \mathrm{mM} \) boric acid, \( 40 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \). Merk)에 녹인 다음 직경 \( 87 \times 10 \mathrm{~mm} \) petridish에 \( 10 \mathrm{ml} \)을 넣은 후 thrombin (\(1,000 \mathrm{unit}/\mathrm{ml}\) Sigma) \( 20 \mathrm{unit}\)를 첨가하여 실온에 30분간 방치하여 응고시켰다. 응고된 fibrin plate 에 각 시료를 적당량 점적하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응시켜 용해된 분해면적을 측정하였으며, 활성의 세기를 측정하기 위하여 혈전분해효소 plasmin과 비교 후 \(\mathrm{unit}\)로 환산하여 단위를 정하였다.</p><h2>SOD 유사활성(Superoxide dismutase -like activity: SODA) 측정</h2><p>추출물의 SOD 유사활성은 Marklund 와 Marklund의 방법에 따라 과산화수소 \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \) 로 전환시키는 반응을 촉매하는 pylogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. 시료를 농도별로 희석하여, 시료 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 에 \( \mathrm{pH} 8.5\)로 보정한 Tris-\(\mathrm{HCl}\) buffer (\( 50 \mathrm{mM} \) tris [hydroxymethyl] amino-methane, \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \mathrm{pH} 8.5\)) \(150 \mu \mathrm{l} \) 와 \( 7.2 \mathrm{mM} \) pyrogallol \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응시킨 후 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{~HCl}\) \(50 \mu \mathrm{l} \)를 가하여 반응을 정지 시켰다. 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양은 ELISA reader를 사용하여 \( 420 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 시료 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(\(\%\))로 나타내었다.</p><p>SODA(\(\%)=\left(1-\frac{A}{B}\right) \times 100 \)</p><p>\( \mathrm{A} \) : 시료 첨가구의 흡광도, \( \mathrm{B} \) : 시료 무첨가구의 흡광도</p>
SODA(\(\%)=\left(1-\frac{A}{B}\right) \times 100 \) 식에서 \( \mathrm{B} \) 는 무엇을 나타내는가?
\( \mathrm{B} \) : 시료 무첨가구의 흡광도