<h1>고 찰</h1><p>ER stress 상황을 유도하는 방법은 여러 가지가 있으며, 그중 조직 손상을 초래하는 대표적 원인인 hypoxia를 통해 ERstress를 유도할 수 있다. Hypoxia에 노출된 세포를 얻기 위하여 경동맥, 추골동맥 등의 혈관을 직접 결찰하여 hypoxia를 초래한 후 세포를 추출할 수 있으며, in vitro에서 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) \( 1 \sim 2 \% \) 이하의 \( \mathrm{O}_{2} \) 나머지는 \( \mathrm{N}_{2} \)로 채운 저산소 상태의 chamber에 배양된 세포를 보존하는 방법을 이용할 수도 있고, 본 연구에서와 같이 화학적으로 hypoxia 상태를 유도하는 것으로 알려진\( \mathrm{CoCl}_{2} \)나 Deferoxanine (DFA) 등의 물질로 세포를 처리하여 얻기도 한다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)의 cobalt ions는 ferrous ions의 antagonist로서 heme내 철 이온을 치환하여 heme protein \( \mathrm{O}_{2} \) sensor 내에 구조적 변화를 일으킴으로써 hypoxia를 유도한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 신경세포(PC12)를 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)로 처리하여 hypoxia를 유도한 후 apoptosis을 통해 세포가 사멸 되는 초기 과정에서의 ER 반응을 알아보았다. 따라서 우선 신경세포가 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)에 의해서 hypoxia 상태가 만들어지는지를 확인하기 위해 저산소증에 대한 대사과정에서의 전사인자의 일종으로 hypoxia에 특이적으로 발현되는 hypo-xia-inducible factors (HIF)의 발현을 관찰하였다. Hypoxia 상태에서 HIF1 alpha는 mRNA의 expression이 증가하는 것이 아니라 p300과 같은 인자와 결합해서 핵내로 translocation하여 post-transcription에서 중요한 역할을 하지만, 초기 hypo-xia상태에서도 control보다는 전사발현 수준이 증가하는 것이 알려져 있어서, 본 실험에서는\( \mathrm{CoCl}_{2} \)에 의한 HIF1 alpha의 발현을 hypoxia 유도로 간주하고 관찰하였다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리한 세포군에서는 control에 비교하여 현격한 차이는 아니지만 약 1.5배 정도의 HIF1 alpha 발현증가를 확인하였다(Fig. 1). 결국,DFA와 함께 신경세포에서도 hypoxia 유도물질로 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 사용하는 것이 가능하다는 것을 말한다.</p><p>최근 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)는 hypoxia를 유도할 뿐만 아니라 DNA 손상을 유도하고, DNA손상 반응을 활성화시킨다고 보고되었다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)처리에 의해서 PC12 세포는 hypoxia 상태에 이르는 것을 확인하였으나, apoptosis의 증거를 얻기 위해, 그리고 apoptosis를 유도하는 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)의 농도와 처리시간을 결정하기 위하여, apoptosis 특이적으로 관찰되는 DNA fragmentation실험을 하였다(Fig. 2). 무 처리된 control의 genomic DNA는 fragmentation이 나타나지 않았다. 그러나 positive control로 사용한 chemical hypoxia inducible drug인 DFA와 ER stressinducible drug인 tunicamycin의 경우는 처리 2일째에 DNAfragmentation이 관찰된다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리한 경우는 처리 dose에 관계없이 1일째는 DNA fragmentation이 관찰되지 않지만 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리 2일째는 모두 DNA fragmentation이 관찰되었고 농도를 높이 할수록 더욱 강한 DNA fragmentation이 관찰되었다. 이 실험은 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리함으로써 PC12 세포에서 apop-tosis를 유도할 수 있다는 것을 증명하였으나, 이 결과를 다시 한 번 확인하기 위하여, 또 다른 apoptosis 특이적인 세포변화, 즉 apoptotic body를 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리한 다음 Hoechst 33342로 염색하여 형광현미경에서 관찰하였고, Fig. 3에서 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리한 세포에서 정상세포 핵과는 다르게 핵의 응축이 일어나 세포 조각으로 나눠지려는 초기 단계의 apoptotic body (화살표)가 형성되는 것을 관찰할 수 있다.</p><p>이상에서 PC12 세포에 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리함으로서 hypoxia 유도와 함께 apoptosis가 유도된다는 것이 증명되었다. 그렇다면 이때에 ER stress mechanism은 어떻게 response하는지를 알기 위하여 ER stress 관련 인자들의 발현을 실험하였다. 먼저 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리에 따른 ER lumenal chaperone의 발현변화를 알기 위하여 ER lumen에서 chaperone으로 작용하는 Bip의 발현을 관찰하였다(Fig. 4A). Tunicamycin에 의한 ER stress유도보다는 약하지만 발현변화가 관찰될 정도로 Bip 유전자의 발현이 관찰되었다. 그리고 ER 막을 관통하는 ER mem-branous chaperone인 calnexin 유전자의 발현 역시 상승(약1.5배)하는 것이 확인되었다(Fig. 4B). PC12 세포에서 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리하였을 때에는 ER inducible drug를 처리할 때만큼은 ERstress chaperone이 상승 발현하지는 않지만, 약한 발현상승은 분명하게 관찰되었다. 이 결과는 PC12 세포에 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리에 의한 hypoxia/apoptosis 유도시에 ER stress mechanism이 관련되어 있다는 것을 말하는 것이다. 한편, ER lumen에서 신생단백질의 구조결정시 산화환원반응에 깊이 관여하 는ERp72, ERp29, PDI의 발현양이 증가하지 않았다. 오히려 이들의 발현이 하강하였다(Fig. 4D). 이는 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리에 의한 세포생리적 변화는 신생단백질의 과정에는 관여하지 않는다는 것을 의미한다. ER membrane을 구성하는 대표적인 단백질로서, 세포질에 존재하는 proteasome의 ubiquitin-like domain에 결합하는 Ribophorin I (Rpn1)의 발현은 control에 비해서 1.5배 이상 증가하였다. 이 결과는 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리에 의해서 ER이 형태적으로 증가한 것을 말한다. 즉, PC12 세포에 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리함으로 인하여 ER stress response를 수행하기 위하여 혹은 초기 단계의 apoptosis 유도로 인한 ER chaperone의 증가로 말미암아 ER의 용적이 커진 것으로 사려 된다(Fig. 4C).</p>
조직 손상을 초래하는 대표적 원인 중 하나는 무엇인가요?
hypoxia