<h1>결과 및 고찰</h1><h2>CCD-986sk내에서의 세포생존율 평가</h2><p>노랑어리연꽃 추출물 및 분획물 cell viability와 실험에 사용될 농도 범위 결정을 위해 MTT assay를 수행하였다. CCD-\(986\)sk 세포에 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물을 \( 5,10,25,50,75 \), \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도로 처리한 결과, \( 25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 이하의 농도에서 세포생존율이 \( 90 \% \)이상으로 나타내어 CCD-986sk 세포의 생존율에 큰 영향을 나타내지 않음을 확인 할 수 있었다(Fig. 1).</p><h2>활성산소종(ROS) 억제 효과</h2><p>피부에 UVB의 노출은 활성산소종(ROS) 생성을 야기시키며(Fisher 등, 1997; Yoon 등, 2003; Han 등, 2013), 이때 생성되는 ROS는 피부세포 내에서의 여러 신호 전달 체계를 통해 피부 주름과 관련된 전사인자들을 활성화 시킨다(Lee 등, 2012). 이는 광노화를 방어하고 자외선으로부터 보호제를 개발하는데 있어서 ROS의 역할이 중요함을 시사하여 준다. 따라서 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물의 ROS 억제효과를 알아보기 위하여 CCD-986sk 세포에서의 UVB 조사에 따른 ROS 생성을 측정한 결과, UVB 로 유도된 그룹에서는 정상군에 비해 ROS 생성률이 증가하였으며, 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물을 농도별로 처리한 결과 농도 의존적으로 ROS 생성을 감소시키는 것을 확인하였다. 그 중 노랑어리연꽃 EA 분획물이 \( 25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 농도에서 \( 50 \% \) 이상의 ROS 발현을 억제시켰으며 Park 등 (2014)의 말채나무 잎 추출물이 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도에서 ROS 생성을 억제 시키는 활성을 나타낸 것에 비해 노랑어리연꽃 EA 분획물이 더 우수한 효능을 나타냄을 확인 할 수 있었다(Fig. 2).</p><h2>CCD-986sk 세포내 pro-collagen 합성 및 MMP-1 발현 측정결과</h2><p>피부 노화의 중요한 임상증상인 주름, 피부탄력감소의 원인으로는 진피 내 세포 외 기질 단백질의 감소를 들 수 있다. 자외선의 자극을 받은 섬유아세포내에서는 collagenase, elastase, gelatinase등의 MMPs에 의하여 분해되어 콜라겐 섬유의 길이와 분포에 손상을 초래하게 되며 피부 세포의 주름과 관련된 콜라겐들은 섬유아세포내에서 프로콜라겐이라는 전구물질의 형태로 합성된다(Chung 2003; Kim 등, 2015). 자외선에 의해 이러한 프로콜라겐의 양이 감소함에 따라 콜라겐 양이 감소하게 된다. 따라서 프로펩타이드와 MMP-1의 양을 측정함으로써 세포내에서의 콜라겐 합성 정도를 파악할 수 있다. 따라서 프로콜라겐의 합성을 촉진 및 MMP-1의 발현을 억제 시킬 수 있는 소재는 탄력 있는 피부를 만들어 주는 화장품 원료로서 사용 가능성이 높다고 생각되며 이에 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물을 이용하여 pro-collagen 합성 및 MMP-1 발현 실험을 수행하였 다. 그 결과, 노랑어리연꽃 \( \mathrm{MeOH} \) 추출물의 경우 \( 5,10,25 \) \( \mu \mathrm{g} /\mathrm{mL} \)의 농도에서 \( 6,16,28 \% \)의 pro-collagen 합성을 나타내었으며, EA 및 \( \mathrm{BuOH} \) 분획물은 \( 5 \mu \mathrm{g}/\mathrm{mL} \) 농도에서는 낮은 합성율을 나타내었지만 \( 10,25 \mu \mathrm{g} /\mathrm{mL} \) 농도에서는 높은 활성을 나타내었다. 특히 EA 분획물의 경우 최고 농도인 \( 25 \mu \mathrm{g} /\mathrm{mL} \)의 농도에서는 대조군에 비해 \( 40 \% \) 이상의 높은 생성율을 나타내어, Hwang 등 (2015)의 보고에서 자주달개비 메탄올 추출물은 25 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 농도에서 \( 28 \% \) pro-collagen을 합성능을 나타낸 것과 비교하였을 때 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물의 pro-collagen의 활성이 우수함을 확인 할 수 있었다(Fig. 3). 또한 노랑어리 연꽃 추출물 및 분획물의 MMP-1 활성 저해를 측정한 결과, UVB로 발현된 MMP-1을 모든 추출물에서 농도 의존적으로 저해를 시켰지만, EA 분획물이 \( 5,10,25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)에서 \( 10,28,46 \% \)의 저해율을 나타내었으며, \( \mathrm{BuOH} \) 분획물의 경우 \( \mathrm{EA} \) 분획물과 같은 농도구간에서 각각 \( 7,15,32 \%\)로 발현을 저해 하는 것을 확인하였다. 이는 Lee와 Lee (2013)에 보고된 청미래덩굴 에탄올 추출물의 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)에서의 \( 25.1 \% \)의 저해 활성보다도 뛰어난 활성임을 확인 할 수 있었다(Fig. 4). 이러한 결과로 보아 노랑어리연꽃 분획물은 섬유아세포내에서의 UV-B로 인한 procollagen 감소를 증가 시켜주며, 증가된 MMP-1 발현양을 저해시켜 줌으로써 주름 생성을 예방할 수 있는 소재임을 확인하였다.</p><h2>CCD-986sk 세포내 pro-collagen, MMP-1의 protein 및 mRNA 발현 측정 결과</h2><p>ELISA를 통해 pro-collagen의 합성능과 MMP-1의 발현 저해를 정량적으로 확인 하였으며, CCD-986sk 세포에서 단백질과 RNA을 추출하여 protein 및 mRNA level에서의 노랑어리연꽃 EA 와 \( \mathrm{BuOH} \) 분획물의 효과를 확인하기 위하여 westem blot과 RT-PCR을 이용하여 활성을 측정하였다. UVB를 조사한 그룹에서는 pro-collagen 발현이 UVB를 조사하지 않은 그룹에 비해 \( 40 \% \) 이상 발현이 저해 되었으며, MMP-1의 발현은 UVB 조사한 그룹이 조사 하지 않은 그룹에 비해 4배 이상 발현률이 증가하였다. 여기에 노랑어리연꽃 EA 와 \( \mathrm{BuOH} \) 분획물을 농도별로 처리한 결과 pro-collagen protein 발현 증가에서는 낮은 활성이 확인 되었지만, MMP-1 저해 활성의 경우 두 분획물 모두 농도 의존적으로 저해시키는 것이 확인 되었다. EA 분획물은 \( 25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}\)의 농도에서 \(38 \% \)의 저해율을 나타내었으며, \( \mathrm{BuOH} \) 분획물의 경우 같은 농도인 \(25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)에서 \( 35\% \)의 저해율이 나타냄을 확인 하였다(Fig. 4). mRNA 발현에서는 EA와 \( \mathrm{BuOH} \) 분획물의 경우 농도 의존적으로 pro-collagen 발현이 증가 하였으며, EA 분획물의 경우 최고 농도인 \( 25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)에서 \( 33 \% \)의 활성을 나타내었고,\( \mathrm{BuOH} \) 분획물의 경우 \( 25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 농도에서 \(53\% \)의 우수한 procollagen 활성을 나타내었다. MMP-1의 저해 활성 또한 \( \mathrm{BuOH} \) 분획물에서 우수한 저해 활성을 나타내었으며, \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도에서 \(40\% \) 이상 MMP-1 발현을 감소시키는 것을 확인하였다(Fig.5). Lee 등 (2013)은 생물전환 지실 추출물의 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)에서 \(50\% \) MMP-1 저해 활성이 나타나는 것으로 보고하였는데, 노랑어린연꽃은 \(10\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 농도에서 \(40 \% \)이상의 MMP-1 저해 활성을 확인하여 저농도에서도 높은 활성을 확인 할 수 있었다. 따라서 노랑어리연꽃 EA 및 \( \mathrm{BuOH} \) 분획물은 CCD-986sk 세포내에서 ROS와 같은 노화 인자의 생성 억제와 동시에 피부의 주요 구성성분인 콜라겐의 합성 및 분해 억제 효능을 통해 항노화 소재로서의 활용가치가 있는 것으로 판단되며, 앞으로 임상 수준에서 안전성 및 효능 연구를 진행 할 예정이다.</p><h1>초 록</h1><p>본 연구는 새로운 기능성 화장품 소재 개발을 위해 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물을 이용하여 섬유아세포내에서의 항노화 효과를 확인 하고자 하였다. 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물의 CCD-986sk 세포를 이용하여 항노화 효과를 측정한 결과, EA분획물이 UVB에 의해 증가된 ROS 발현을 \( 50 \% \) 이상 억제하였으며, \( \mathrm{BuOH} \) 분획물의 경우 pro-collagen mRNA 발현을 \(25\mu\mathrm{g} / \mathrm{mL}\)에서 \(50 \% \) 이상 발현을 증가시켰다. EA 분획물과 \(\mathrm{BuOH} \) 분획물 모두 MMP-1 protein과 mRNA발현을 농도 의존적으로 저해시켰으며, \( \mathrm{BuOH} \) 분획물의 경우 \(10 \mu\mathrm{g} / \mathrm{mL} \)에서 \( 40 \% \) 이상의 MMP-1 mRNA 발현 억제율을 확인하였다. 이는 노화 인자인 활성산소종의 생성 억제와 주름과 밀접한 관련이 있는 콜라겐의 합성 및 분해억제를 통해 항산화 및 주름 개선 효과가 있는 것으로 판단되었으며 특히 EA와 \( \mathrm{BuOH}\) 분획물의 높은 효능이 확인되었다. 따라서 노랑어리연꽃 EA 및 \( \mathrm{BuOH} \) 분획물은 화장품 분야에서 항노화 소재로서의 활용가치가 있을 것으로 사료된다.</p>
노랑어리연꽃과 말채나무 잎 추출물 중 어떤 것이 ROS 생성을 억제시키는 데에 더 우수한 효능을 나타내었나요?
노랑어리연꽃