<h1>결 과</h1><h2>pUC19 plasmid vector에 삽입한 c-myc 유전자의 동정</h2><p>Topo I의 기질로 사용할 c-myc exon 1 유전자 (2111-3075) 가 포함된 c-myc DNA 절편은 HL-60세포에서 분리한 DNA를 주형으로 하여 PCR기법으로 합성하였고, pUC19 plasmid vector에 삽입시켜 만든 pUC-MYC I DNA의 동정 결과는 Fig. 2와 같다. pUC-MYC I DNA를 EcoRI과 Hindlll로 처리하였을때 pUC19 DNA와 PCR product의 DNA 크기가 일치하였고 c-myc 유전자가 삽입된 vector가 제조되었다.</p><h2>CPT가 Topo l의 활성에 미치는 영향</h2><p>pUC19 DNA를 기질로 사용하여 CPT에 의한 Topo I의 활성 변화를 관찰한 결과는 Fig. 3과 같다. 반응 후 eth-idium bromide가 포함되어 있지 않은 gel (A)과 ethidium bromde가 들어있는 gel (B)상에서의 전기영동 양상을 조사하였는데 CPT의 농도 (\( 1,10,100,1000 \mu \mathrm{M} \)) 에 따라 이완(relaxation) 활성이 억제되었으며(3A) 이때 CPT에 의해 절단(nick)이 일어남을 확인할 수 있었다(3B). 또한 합성한 pUC-MYC I DNA를 HindII로 전단한 DNA 절편을 기질로 사용하여 Topo I의 절단에 CPT의 작용 효과를 관찰한 결과는 Fig. 4와 같다. 효소반응 후에 각각 SDS와 pro-teinase \( K \) 를 처리하고 nuclease S 1 반응으로 nick된 DNA를 절단시켜 전기영동을 실시하였는데 역시 CPT 농도(\(1, 10,100,1000 \mu \mathrm{M} \)) 에 따라 Topo I 단독 처리시보다 cleavage를 증가시켰다(4A). 반응후의 생성물 미량(\( 1 \mu \mathrm{l}\)) 을 sense primer (c-myc exon 1)를 첨가하여 PCR기법을 실시한 결과는 CPT에 의해 DNA cleavable complex를 형성한 band가 뚜렷하게 나타났다(4B).</p><h2>CPT를 투여한 HL-60 세포의 Topo I 활성에 미치는 영향</h2><p>세포 (HL60)에서 약물에 의한 Topo의 활성 변화를 보기 위해서 CPT를 투여한 세포의 핵 추출물을 얻어 pUC19 DNA를 기질로 사용하여 효소활성을 측정하였다. Fig. 5의 lane 2-4는 ATP를 첨가하였고 lane 5-7은 ATP를 넣지 않고 반응시켜 전기영동한 결과, lane 5-7 ATP 첨가하지 않은 군이 lane 2-4의 ATP 첨가군에 비해 Topo의 활성이 더욱 억제되어 CPT 투여에 따라 Topo I의 활성이 억제됨을 확인할 수 있었다. 또한 효소 활성 축정에 사용한 핵 추출물내의 CPT 존재 유무를 확인하기 위해 약물 투여한 HL-60세포의 핵 추출물을 분석한 결과, 투여된 CPT 농도에 비례하여 증가된 전형적인 CPT 띠 (\( \mathrm{Em}\), \(435 \mathrm{~nm}\)) 를 형광 spectrophotometer로 확인하였다(Fig. 6).</p><h2>CPT가 Topo I 유전자와 c-myc 유전자 발현에 미치는 영향</h2><p>CPT를 HL-60세포에 투여시 Topo I을 생성하는 유전자 와 c-myc 유전자의 발현에 어떻게 작용하는지 관찰하기 위하여 RT-PCR기법으로 Topo I과 c-myc mRNA 농도를 비교 분석한 결과(Fig. 7), Topo I mRNA의 발현에는 변화가 없었다(lane5-7). 그러나 c-myc mRNA 발현에는 차이가 있었다(lane1-3). 같은 방법으로 총 RNA를 분리하여 전기영동한 후 nylon지에 옮겨 \( { }^{32} \mathrm{P} \) 로 표지한 probe를 사용하여 hybridize한 경우, Topo I 유전자의 발현에는 약물의 농도에 상관없이 일정하였으나 반면, c-myc 유전자 발현에서는 CPT의 농도에 따라 감소 현상을 나타내었다(Fig. 8).</p>
반응 후 eth-idium bromide가 불포함된 gel (A)과 ethidium bromde가 들어간 gel (B)상에서의 전기영동 양상을 조사하였는데 CPT의 농도 (\( 1,10,100,1000 \mu \mathrm{M} \)) 에 따라 이완(relaxation) 활성이 억제되었으며(3A) 이때 CPT로 인해 어떤 현상이 생기지?
절단