<h1>재료 및 방법</h1><h2>시료제조</h2><p>본 실험에서는 전라남도 나주시 (주)영산포 식품으로부터 지원 받은 홍어 (Raja kenojet)를 냉동 보관한 상태로 실험실로 운반하여 완전해동한 후 홍어표면을 수돗물로 두 번, 증류수로 한번 세척하였다. 이를 멸균한 거즈로 표면의 물기를 제거한 다음 10\(^{\circ} \mathrm{C} \)에서 습도를 \( 60-90\%\)로 설정하여 10일 동안 발효 시키면서 발효기간에 따라 가식부와 내장을 세절하여 열수추출한 후 동결 건조기(Freeze dry system/Freezone 4.5, Labconco Co, England)에서 동결 건조한 것을 시료로 사용하였다. 홍어 내장 및 가식부를 마쇄하여 환류 냉각기를 부착시킨 플라스크에 시료 1\(\mathrm{~g} \)당 30\( \mathrm{~mL} \)의 증류수를 넣고 30분간 100\(^{\circ} \mathrm{C} \)로 3회 반복 추출한 액을 여과지(Whatman No.2)로 여과하고, 여과된 액을 다시 동결 건조하여 홍어 가식부 및 내장의 열수추출물로 하였다.<h2>ACE (Angiotensin Converting Enzyme) 저해활성 측정</h2>항고혈압 효과는 본태성 고혈압의 원인물질인 ACE (Angiotensin Converting Enzyme, peptidyldipeptide hydrolase,EC 3.4.15.1)의 저해활성으로 측정하였으며, Cushman과 Cheung의 방법을 변형하여 측정하였다. ACE \( 0.38\mathrm{mg} \)을 \(300\mathrm{mM} \) Sodium chloride를 포함한 \(50\mathrm{mM}\) HEPES \(\mathrm{HCl} \) Buffer ( \( \mathrm{pH}8.3 \) ) \(3\mathrm{mL} \)에 용해시켰으며, 기질인 Hippuryl-His-Leu (HHL)은 \(300\mathrm{mM} \) Sodium chloride를 포함한 \( 50\mathrm{mM} \) HEPES HCl Buffer ( \( \mathrm{pH}8.3 \) )에 용해시켜 \(0.3\% \)의 HHL 기질용액을 만들었다. 홍어 각 부위별 열수추출물 시료는 \(0.5 \%\), \(1\%\), \(2\% \)로 제조하여 시료 \(50 \mu \mathrm{L} \)에 \(0.3\%\) HHL 기질용액 \(200\mu \mathrm{L}\)을 첨가하여 \(37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 preincubation 시켰다. 반응액에 ACE 용액 \(50\mu \mathrm{L} \) 첨가한 후 \(37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분 반응시킨다. 반응이 끝나면 \(1\mathrm{M} \mathrm{~HCl} \) \(250\mu \mathrm{L} \)를 첨가하여 반응을 정지시키고 ethyl acetate \(2,000\mu \mathrm{L} \)를 가하여 60초간 강하게 shake한 다음 \(3000\mathrm{rpm} \)에서 2분간 원심분리 시켜 상징액 \(1\mathrm{mL} \)을 취한다. 이 상징액을 \( 140^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 건조 후 3차 증류수 \(3\mathrm{mL} \)을 가해 용해시켜 \(288\mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정한 후 계산식(Inhibitory ratio \( \left.(\%)=C-S / C-S^{\prime} \times 100\right) \) 에 따라 ACE 저해율을 나타내었다. 앞의 식에서 S는 Sample의 흡광도이고, C는 Control (sample 대신 증류수를 넣은 군)의 흡광도이며, S'는 Sample 대조군 \((\mathrm{HCl}\)에 의한 반응 정지 후 효소를 넣은 군)의 흡광도를 나타낸 것이다.</p><h2>일반성분 분석</h2><p>항고혈압 효과를 나타내는 물질의 일반성분을 분석하기 위하여 수분의 정량은 일정량의 홍어내장과 가식부의 열수 추출물을 채취하여 고온 건조 후 그 감량의 항량 값을 수분으로 하였으며, 환원당 정량은 DNS법에 의하여 환원당을 정량하였다. 즉, 시료를 \(0.01\mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 로 조제하고, 시료 1에 DNS 시약 \(3\mathrm{mL} \)을 넣고 끓는 물에서 5분간 끓였고, 흐르는 물에서 식힌 후 550\(\mathrm{~nm} \)에서 비색정량하였다. 환원당 함량은 미리 구하여둔 standard curve로 시료의 농도를 환산하였으며, 순단백질 정량은 Biuret법에 의거하여 순단백질을 정량하였다.</p><h2>원소분석</h2><p>홍어의 항고혈압 효과를 나타내는 물질의 대략적인 성분을 알기 위하여 원소분석기(EA1110, CE Instruments, Italy)를 사용하여 분석하였다. 원소분석기는 pure copper를 충전한 반응관에 GC colume과 TCD(thermal conductive detector)를 사용하였다. 회화온도는 \(1000 ^{\circ} \mathrm{C} \), Oven 온도는 \(60^{\circ} \mathrm{C} \) 이고, 이동상은 helium gas를 사용하였으며, flow rate는 \(120\mathrm{mL} / \mathrm{min} \) 이었다.</p><h2>유리아미노산 분석</h2><p>항고혈압 효과가 높았던 홍어 내장 열수 추출물의 ACE 억제 peptide의 아미노산 조성을 알기 위하여 홍어 내장 열수 추출물을 동결건조하고, buffer는 lithium buffer, reagent는 ninhydrine, analytic time은 \( 3\mathrm{hr} / \mathrm{L} \) sample, injection volume은 \(20\mu \mathrm{L} \)로 아미노산 자동분석기(Bio-chrom 20, Pharmacia Biotech, England)로 질소화합물의 종류와 양을 분석하였다.</p><h2>Sephadex G-25 column chromatography에 의한 항고혈압성 물질의 조분리 및 성분 분석</h2><p>Sephadex G-25 (MWCO : \(5\mathrm{kD}\)) \(100\mathrm{g} \)을 10배 부피의 buffer (\(50\mathrm{mM}\)-sodium phosphate, \(0.1 \mathrm{M}\) sodium chloride, \( \mathrm{pH}7.0 \) )에 넣고, 이를 water bath (\(99^{\circ} \mathrm{C} \))에서 가끔씩 손으로 흔들어 주면서 1시간 동안 중탕한 후 충분히 식혀서 column (2.5 \(\times \) 100 \(\mathrm{~cm}) \)에 충전하였다. 시료는 syringe filter \( (0.2\mu \mathrm{m}) \)로 여과하여 Sephadex G-25 column (1.25 \(\times\) 100 \(\mathrm{cm}) \)에 주입하고 buffer (\(50\mathrm{mM}\)-sodium phosphate, \(0.1 \mathrm{M}\) sodium chloride, \( \mathrm{pH}7.0 \) )로 \( 0.4 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \)의 속도로 용출하여 10 분간격으로 \( 4 \mathrm{~mL} \)씩 분획을 모아 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서 측정하여 분획물 (A, B, C)을 만들었다.</p>
시료 제조를 위해 몇일 동안 발효시켜야 하는가?
10일