<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료</h2><p>Nodakenin은 서울대학교 약학대학 성상현교수로부터 제공받았다. Mouse monoclonal anti-DNP IgE antibody와 dinitriphenol-conjugated human serum albumin (DNP-HSA), Evans blue, 그리고 세포 배양을 위한 배양액인 Dulbecoo's Modified Eagle's Medium (DMEM)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였다. P-Nitrophenyl-N-acetyl- \( \beta \) -D-glucosaminide는 MP Biomedicals, LLC (Solon, OH, USA)로 부터 구입하여 사용하였다.</p><h2>세포배양</h2><p>RBL-2H3세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)로부터 구매하였으며, 10\% FBS와 \( 100 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \) 의 penicillin-streptomycin이 첨가된 Eagle's minimal essential medium (WelGENE, Inc., Daegu, Korea) 배지에서 2-3일마다 배양액을 교환해 주었으며, 배양 환경은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 로 유지되는 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 배양하였다.</p><h2>동물</h2><p>수컷 ICR mice (aged 7 weeks)는 Orient Bio (Gangneung, Korea)로 부터 구매하여 온도 \( 20-22^{\circ} \mathrm{C} \) 와 습도 \( 40-50 \% \) 의 환경에서 사육하였다. 모든 동물들은 표준화 된 사료와 물을 제공하였으며, 연세대학교의 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (Wonju, Korea)가 본 연구의 동물실험을 승인하였다.</p><h2>수동피부과민반응 측정</h2><p>Anti-DNP-specific IgE \( (0.5 \mu \mathrm{g}) \) 는 각각의 ICR mice의 귀에 피하주사로 주입하였으며, 24시간 후에, nodakenin을 25에서 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 의 농도로 경구투여 하여, 1 시간 후에 \( 3 \% \) Evans blue와 혼합된 DNP-HSA (200 μg)응 정맥주사 하였다. 항원 처리 2 시간 후에 ICR mice를 안락사 시키고 귀의 항원-항체반응에 의한 Evans blue 염색약의 양을 육안으로 관찰하였다. 또한, \( 500 \mu \mathrm{g} \) formamide에 해당 귀를 절개 후, \( 63^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하루 동안 반응시켜 \( 620 \mathrm{~nm} \) 의 흡광도로 염색약의 양을 측정하였다.</p><h2>\( \beta \)-hexosaminidase 방출량 측정</h2><p>탈과립 현상의 표지 물질인 \( \beta \)-hexosaminidase의 방출량을 측정함으로써 알러지 반응 억제 정도를 세포 수준에서 알아보았다. RBL-2H3 세포는 24-well plates에 각 well당 200,000 세포가 되도록 분주한 후, 12시간을 배양하였다. Anti-DNP-spe-cific IgE를 \( 200 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 농도로 각 well에 감작시켜 12시간 배양하였다. IgE에 감작된 세포는 PIPES buffer (25 mM PIPES, pH 7.2, \( 110 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 4 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}, 0.4 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}, 40 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{HCl}, 5.6 \mathrm{mM} \) glucose, \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl} \), and \( 0.1 \% \mathrm{BSA} \) 로 두 번 세척하였고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 동안 PIPES buffer에 녹인 noda-kenin응 농도별로 처리하였다. 세포는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간 DNP-\( \mathrm{HSA}(25 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \) 와 반응시켰으며 안정화를 위해 5 분간 얼음 위에 두었다. \( \beta \)-hexosaminidase 방출량을 측정하기 위해서, 항원-항체 반응이 일어난 세포가 존재하는 well의 PIPES buf-fer 상충액과 B-hexosaminidase의 기질인 \( 0.1 \mathrm{M} \) citrate buffer \( (\mathrm{pH} \) 4.5)에 녹인 P-nitrophenyl-N-acetyl- 3 -D-glucosaminide를 96-well plate에서 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 시간 동안 반응시켰고, \( 0.1 \mathrm{M} \) carbonate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 10.5)를 처리하여 반응을 종결시킨 뒤, microplate reader를 이용하여 \( 405 \mathrm{~nm} \) 의 파장으로 홉광도를 측정하였다.</p><h2>세포 생존율 측정</h2><p>세포 생존율은 Ez-Cytox Enhanced Cell Viability Kit (Daeil Labservice, Seoul, Korea)를 이용하여 측징하였다. RBL-2H3 세포는 96-well plate에 분주하였고 12시간 후에 \( 200 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) anti-DNP-specific IgE를 감작시켰다. 12시간 후에, nodakenin과 \( 25 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \mathrm{DNP-HSA} \) 를 23시간 동안 처리하였다. Ez-Cytox Kit reagent는 세포가 있는 배양액에 투여하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 microplate reader를 이용하여 450 \( \mathrm{nm} \) 파장으로 흡광도를 측정하였다.</p><h2>RNA 추출과 역전사 중합효소 연쇄 반응 측정(RT-PCR)</h2><p>RBL-2H3 세포는 6-well plate에 분주한 뒤, \( 200 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) anti-DNP-specific IgE를 감작시켜 하루 동안 배양하였다. PIPES buffer로 두 번 세척 한 후, nodakenin을 농도 별로 처리하고, 1 시간 동안 DNP-HSA \( (25 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \) 를 처리하였다. 반응 후에, 세포를 PBS로 세척하고, TRI reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. Total RNA는 spectrophotometer를 이용하여 정량하여 \( 1 \mu \mathrm{g} \)의 RNA를 이용하였고, cDNA 합성 및 PCR은 Accupower RT/PCR premix kit (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR조건은 IL-4의 경우, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 45초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 45초로 35 cycle을 수행하였으며, TNF-0의 경우, \( 94^{\circ} \mathrm{C} 1 \) 분, \( 49^{\circ} \mathrm{C} \) 45초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 45초로 35 cycle을 수행하였다. PCR 산물은 \( 2 \% \) agarose gel로 전기영동을 한 후, ethidium bromide을 첨가하여 밴드를 가시화 하였다. 사용된 primer는 다음과 같다. rat IL-4 sense 5'- accttgctgtcaccectgttc-3'; rat IL-4 antisense \( 5^{\prime} \)-ttgtgagcgthhactcattc- \( 3^{\prime} \); rat TNF-a sense \( 5^{\prime} \)-caag-gaggagaagttcccaa-3'; TNF-a antisense 5'-cggactocgtgatgtctaag-\( 3^{\prime} ; \beta \)-actin sense \( 5^{\prime} \)-atgccatcctgcgtctggacctggc- \( 3^{\prime} \); and \( \beta \)-actin antisense \( 5^{\prime} \)-agcattgcggtgcacgatggaggg- \( 3^{\prime} \).</p><h2>통계처리</h2><p>모든 실험 결과는 평균 \( \pm \) 표준편차(means \( \pm \mathrm{SEM} \) )로 나타내었다. 통계처리는 Dunnett's test로 검정하였고 정상 대조군과 비교하여 \(<0.05 \) 이하의 경우 유의적인 차이가 있다고 판정하였다.</p>
알러지 반응 억제 정도를 세포 수준에서 알아보려면 어떻게 해야돼?
탈과립 현상의 표지 물질인 \( \beta \)-hexosaminidase의 방출량을 측정