<h1>재료 및 방법</h1><h2>시험재료</h2><p>부산시 소재 자갈치 어시장에서 1999년 4월에 선도가 양호한 냉동 까치복을 구입하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 의 냉장고에 저장하여 두고 실험에 사용하였다.</p><h2>독성의 검사</h2><p>독성시험은 Ministry of Health and Welfare 중의 복어독 검사법에 의거하여 시행하였다. 즉, 시료 \( 10 \mathrm{~g} \) 에 \( 0.1 \% \) 초산완충 용액을 \( 25 \mathrm{ml} \) 가하고 열탕 중에서 가열하여 충분히 독소를 추출한 후 Toyo filterpaper(No.5)로 여과하고 잔사는 \( 0.1 \% \) 초산용액으로 다시 세정하여 여액을 합쳐 \( 50 \mathrm{ml} \) 로 정량하여 공시액으로 하였다. 공시액은 증류수로 알맞게 희석하여 ICR계 생쥐(수컷, \(19-21\mathrm{~g}\))의 복강에 \( 1 \mathrm{ml} \) 주사한 후, 독성치를 TTX의 치사시간으로부터 계산하여 MU (mouse unit) 단위로 나타내었다. 1MU는 주사한 후 30 분 이내에 치사시킬 수 있는 양에 해당하는 TTX를 의미한다.</p><h2>테트로도톡신의 분리 및 정제</h2><p>독소는 Fig. 1 과 같은 방법으로 분리하고 부분 정제하였다. 즉, 복어의 간장에 \( 1 \% \) 초산/메탄올 용액을 첨가하여\( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 15분간 원심분리하였다. 잔사에 다시 동일한 방법으로 2회 독소를 추출하여 모은 상충액을 디클로로메탄으로 탈지하였다. 수용성 층을 분리하여 잔류하여 있는 디클로로메탄을 진공증발기내에서 제거한 후 Diaflo YM-2 (Amicon)로 한외여과하였다. 여액을 감압 농축하여 Bio-gel P-2 칼럼(\(5.6\mathrm{~cm}\) I.D. \( \times 50 \mathrm{~cm}) \) 에 넣어 \( 0.1 \mathrm{M} \) 초산용액으로 용출시켜 독성획분을 얻어 농축하였다. 독성획분은 다시 Bio-gel P-2 칼럼(\(2.0\mathrm{~cm}\) I.D. \( \times 94 \mathrm{~cm}) \) 상에서 \( 0.03 \mathrm{M} \) 초산용액으로 용출시켜 독성획분을 모아 동결 농축하여 정제하고, 이것을 기기분석에 사용하였다. 한편 한외여과법 대신에 활성탄 칼럼(\(2.0\mathrm{~cm}\) I.D. \( \times 25 \mathrm{~cm}) \) 을 사용하여 \( 20 \% \) ethylalcohol에 용해시켜 만든 \( 1 \% \) acetic acid로써 독성획분을 용리하고 그 이후는 상기의 방법과 동일하게 독소를 정제하였다.</p><h2>HPLC 에 의한 독소의 분석</h2><p>HPLC 분석기기는 Gilson 712 system을 사용하였으며, YMC-Pack AM-314 ODS column(\(6\mathrm{~mm}\) ID \( \times 300 \mathrm{~mm} \) )상에서 \( 2 \mathrm{mM} \) sodium 1-heptane sulfonate / \( 0.05 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 7.0\)) 용액과 methanol 흔합액(99:1)을 \( 1 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 의 속도로 흘려 용출시키고, \( 3 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \) 로 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 가열한 후 형광 검출기로 분석하여, 여기파장 \(380\mathrm{nm} \), 형광파장 \( 505 \mathrm{~nm} \) 에서 검출하였다.</p>
냉동 까치복을 구입하고나서 몇 \( ^{\circ} \mathrm{C} \) 의 냉장고에 저장하여 두고 실험에 이용했어 ?
\( -20^{\circ} \mathrm{C} \)