<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포의 배양</h2><p>Human umbilical vein endotherial cells(HUVEC)은 YoungScience(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였고, 배양은 T75플라스크를 사용하였다. 배지는 EBM-2 배지(Cambrex, Hopkinton, MA, USA)를 기본으로하여 hydrocortisone, epi-dermal growth factor(EGF), basic fibroblast growth fac-tor(bFGF), insulin like growth factor-1 (IGF-1), vascular en-dothelial growth factor(VEGF), ascorbic acid, heparin과 \( 2 \% \) fetal bovine serum(FBS)을 첨가하여 사용하였으며, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 배양하였다.</p><h2>시료의 추출</h2><p>동백꽃 시료는 Fig. 1과 같이 hexane, chloroform, ehtylacetate, butanol 의 유기용매 순서로 극성이 낮은 것부터 높은 순서로 추출하여 분획하였으며, 동결건조 시켜 시료로 사용하였다.</p><h2>시료의 독성 시험</h2><p>HUVECs을 24 well plate당 \( 4 \times 10^{4} \) cell 씩 분주하여 배양한 후 세포가 충분하게 자라면 농도별로 동백꽃 에틸알콜 추출물을 처리하였다. 이를 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 배양하여, trypsin-EDTA로 처리후 hemocytometer를 사용하여 살아있는 세포의 수를 헤아려 대조군과 비교하여 독성의 여부를 판단하였다.</p><h2>신생혈관생성억제 시험</h2><p>신생혈관생성 시험은 24 well-plate(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA)에 \( 150 \mu \) 의 matrigel(Becton/Dikinson, Becton, NJ, USA)을 넣어 고체화 시킨 후 각 well당 \( 2.5 \times 10^{4} \) 개의 세포를 넣어 세포를 부착시킨 후 동백꽃 추출물을 농도별로 투여하여 실시하였다. 3시간 후 tube가 형성되면 불규칙적으로 5면을 선택하여 digital cam-era(Nikon, coolpix 4500)를 이용하여 촬영하였다. NIH program을 이용하여 형성된 tube의 길이를 측정하여 anti-angiogenesis 효과를 판단하였다.</p><h2>Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)법에의한 세포부착 활성 측정</h2><p>HUVECs을 96well에 well당 \( 5 \times 10^{3} \) 개의 cell 이 되도록 분주하여 \( 2 \% \) Fetal bovine serum(FBS)를 첨가한 EBM-2배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 의 조건으로 배양하여 최고조에 도달하도록 배양하였다. 동백꽃 에틸알콜 추출물의 농도를 \(200, 100, 50\) 및 \( 25 \mu \mathrm{g} /well \) 이 되게 첨가하고 20시간 배양한 후, phos-phate buffered saline(PBS)로 세척 후 세포부착 인자를 유도하기 위하여 \( \mathrm{mL} \) 의 농도로 첨가하여 6시간 동안 반응시켰다. 배지 제거후 \( 1 \% \) paraformaldehyde를 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켜 세포를 고정시켰다. 30분 후 PBS \(+0.5\%\) Tween 20으로 두 번 세척하고, \( 10 \% \) FBS로 1시간 동안 blocking 한 다음, 단일 클론 항체 intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1) 및 E-Selectin(BD Bioscience, Bedford, MA, USA)를 \( 10 \%\) FBS가 참가된 PBS에 각각 \( 2,5,5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 씩 녹여 2시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양 후 PBS \(+0.5\%\) Tween 20 으로 세척하고, secondary anti-body(Donkey anti-mouse IgG-HRP: Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 \( 10 \% \) FBS의 PBS에 1000배 희석하여 실온에서 1시간동안 반응시켜, 발색시약(western blotting luminol reagent:Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 첨가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 plate reader(UVM 340, ASYS, Austria)를 사용하여 \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다.</p><h2>Westen bloting</h2><h3>a) Chemical 처리 및 VEGF 자극</h3><p>HUVECs을 \( 100 \mathrm{~mm} \) petri dish에 \( 1 \times 10^{5} \) cell으로 접종하여 배양한 후 최고조에 도달하면 동백꽃 에틸알콜 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양하여 serum-free EBM-2배지로 세척하고 대조군 및 처리군을 serum을 첨가하지 않은 채 overnight 시킨 후 VEGF(BD Science, Bedford, MA, USA)를 \( 50 \mathrm{ng} / \mathrm{mL} \) 가 되게 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 반응시켰다. phosphorylation을 방지하기 위하여 세포를 용해시키기 전 7분간 vanadate \( (100 \mathrm{uM}) \) 과 hydrogenperoxide \( (200 \mathrm{uM}) \) 을 첨가하였다. 그 후 세포를 즉시 냉각시킨 PBS \(+0.1 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{Na}_{3} \mathrm{VO}_{4} \) 로 세척하고 냉각시킨 lysis buffer( \( 150 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}, 10 \mathrm{mM} \) Tris- HCl \( \mathrm{pH}\ 7.4\) ), \( 1 \% \) Triton X-100, \( 1 \mathrm{mM} \) vanadate, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{mM} \) FGTA, \( 0.2 \mathrm{mM} \) PMSF,\( 0.5 \%\) NP-40) 를 첨가하고 20 분간 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응시켰다. Scripper로써 세포를 회수하여 micro eppendorf tube로 옮겨서 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(14,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리하여 단백질은 BCA protein assay kit(Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 농도를 구한 후 VE-Cadherinantibody(BD Bioscience, Bedford, MA, USA)를 사용해 im-munoprecipitation(IP)을 실시하였다.</p><p>IP 는 \( 500 \mu l \) 의 IP buffer \( (0.2 \mathrm{mM} \) sodium vanadate 첨가) 를 넣고 단백질 \( 50 \mu \mathrm{g} \) 과 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 의 anti-VE-Cadherin antibody를 첨가하고 total양을 \( 1 \mathrm{~mL} \) 이 되도록 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 를 첨가하여 vortex한 후\( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응 후 \( 20 \mu 1 \) 의 Protein A/G-agarose(Amersham Science, Uppsia, Sweden)를 첨가한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 반응 후, \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 에서 3 분간 \( 4 \mathrm{C} \) 에서 원심분리하여 상등액을 제거한 다음 IP washingbuffer \( 500 \mu \mathrm{l} \) 를 사용하여 세척 후 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 \( 50 \mu \) l의 \( 4 \times \) Laemmli sample loading buffer를 첨가하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 끓인 후 sample을 \(7.5\%\) SDS-PAGEgel로 전기영동후에 \( 0.2 \mathrm{ um}\)nitrocellulose membrane(Bio-Rad Lab. Hercules, CA, USA)막으로 전이시켰다.</p><h3>b) Protein 확인</h3><p>Ponceau-S(Markham, Ontario, Canada) 시약으로 단백질을 확인하였고 \(5\%\)-non-fat dry milk(NFDM)로 실온에서 1시간 동안 blocking을 실시한 후 VEGFR2, PI3K, \( \beta \)-catenin, VE-cadherin(BD Bioscience, Bedford, MA, USA)등의 pri-mary antibodies를 각각 처리한 후, secondary antibody인 donkey goat HRP를 1:7000의 비율로 반응시킨 후 형광물질인 ECL(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruze, CA, USA)을 이용-해 film에 감광시키고 헌상하였다. Stripping은 strip-ping buffer를 이용하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 행한 후 blocking을 실시하였다.</p>
시료의 추출 과정은 어떠한가?
hexane, chloroform, ehtylacetate, butanol 의 유기용매 순서로 극성이 낮은 것부터 높은 순서로 추출하여 분획하였으며, 동결건조 시켜 시료로 사용하였다.