<h1>재료 및 방법</h1><h2>Gal4-UAS system</h2><p>Yeast transcriptional activator인 Gal4는 Drosophila에서 upstream activating sequence (UAS)와 유전자를 삽입하고 Gal4가 UAS에 결합함으로써 유전자 발현을 조절할 수 있다. Gal4 gene은 Drosophila genome에 enhancer-trap line을 생성하기 위해 random position으로 삽입되고 가까운 곳에 있는 genomic enhancer의 조절 하에 Gal4가 발현된다. Gal4의 발현은 tissue-specific pattern으로 일어난다. 그러므로 유전자의 발현은 적절한 Gal4 enhancer-trap line과 crossing 함으로써 UAS-gene transgene 유도함으로 일어난다.</p><h2>Transgenic Drosophila 만들기</h2><p>Kurokawa 박사로부터 받은 사람의 megsin cDNA는 kozakATG로 시작하여 C-Myc+His로 재조합되어 있으며 이를 Kpn I 과 Xba I 으로 자른 후 pUAST vector로 서브클로닝 하였다. 클로닝 된 plasmid를 \( 1 \sim 1.5 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{l} \) 로 정제하여 10\( \mu \mathrm{l} \)을 GenExel(주)에 transgenic fly generation service를 의뢰 하였고, 이를 transposon-mediated mutagenesis를 통해 transgenic Drosophila를 제작 선별하였다. Transposon-mediated mutagenesis는 두 개의 plasmid (defective P element와 helper P element)를 w1118의 embryo에 injection하여 G0 세대의 adult를 모두 각각의 w1118과 crossing 하여 G1세대에서 눈의 색에 색깔을 띠는 adult를 선별하는 방법이다. 이러한 방법으로 32개 line의 color eye line을 확보하였다.</p><h2>Megsin의 발현 및 발현 확인</h2><p>UAS-megsin line을 각각 enhancer-trap Gal4 line (w-;Actin5c-gal4/CyO;+/+)과 crossing 하여 Megsin이 발현되는 form인 w-;Megsin/Actin5c-gal4;+/+(actin-gal4 >UAS-meg-sin)와 발현되지 않는 control, W-;Megsin/CyO;+/+(UAS-meg-sin)을 얻었다. WT과 더불어 actin-gal4 >UAS-megsin, UAS-megsin의 초파리 adult를 harvest 하여 RNA와 단백질을 분리하여 각각 RT-PCR과 Western blotting 을 통해 megsin이발현됨을 확인하였다.</p><h2>항체제작</h2><p>사람의 Megsin 단백질로 polycolonal 항체를 만들기 위해 E. coli 과잉발현 vector (pET28a, novagene)에 kozakATG로 시작하여 C-Myc+His로 재조합 된 사람의 Megsin을 코드하고 있는 cDNA를 삽입하였다. 다량의 단백질을 얻기 위하여 \( 1 \mathrm{~L} \) 배양하고 여기에서 얻어진 단백질을 정제하여 항체제작 서비스 (랩프런티어)를 통해 항체를 제작하였다. 또한 meg-sin peptide 1 (aa 72-86) region을 항원으로 정하고 인공 합성하여 항체제작 서비스 (랩프런티어)를 통해 항체를 제작하였다.</p>
유전자 발현을 조절할 수 있는 방법이 어떻게 돼?
Gal4가 UAS에 결합