<h2>PCR 분석에 의한 유전자 도입확인</h2><p>Ferritin 유전자의 형질전환을 통해 얻어진 T0세대 식물체는 총 73 개체로 온실에서 순화 후, pot로 이식하여 생장시겼다. 이들 식물을 대상으로 유전자의 도입 여부를 확인하기 위하여 잎조직을 사용하여 전 DNA를 추출 후, \( { }^{35} \mathrm{~S} \) 프로모터 부위의 특이 염기서열을 이용하여 primer롤 합성하고 PCR 분석을 한 결과는 Fig. 3과 같다.</p><p>형질전환된 식물체에서는 PCR 증폭에 의해서 예상 크기인 \( 300 \mathrm{bp} \) 의 밴드가 증폭되었으나, 형질전환되지 않은 식물체의 경우에는 밴드가 보이지 않았다. PCR 분석에 의해 형질전환체로 확인된 개체수는 61 개체로써 품종 및 프로모터별로 나누어 충북대학교 실험포장에 옮겨, Southern blot 분석 및 Northern blot 분석, Western blot 분석, 후대육성 및 철분함량을 측정하는데 이용하였다.</p><h2>Southern blot 분석에 의한 형질전환체 분석</h2><p>PCR 분석에 의해서 일차적으로 유전자 도입여부를 확인한 61 개체 중에서 품종별 및 프로모터 별로 각각 3 개체씩 선발하여 전 DNA를 추출 후, 제한효소 EcoRI으로 절단한 후 Southern blot 분석을 실시한 결과는 Fig. 4와 같다.</p><p>조사한 12 개체 모두에서 ferritin 유전자의 예상 크기인 \( 750 \mathrm{bp} \) 가 벼 염색체에 integration 되어 있었으며, single copy 및 two copy로 도입되어 있음을 확인할 수 있었다. 이들 결과로 볼 때 형질전환체의 확인은 PCR 분석에 의해 얻어진 data만으로는 신뢰할 수 없었는데, 이러한 결과는 PCR 반응상의 partial annealing에 의한 비특이적 염기서열의 증폭이나 polymerase의 부적절한 반응 등에 의하여 기인하는 것으로 생각된다.</p><h2>Northern blot 분석에 의한 형질전환체의 발현조사</h2><p>Southern blot 분석에 의하여 확인된 형질전환체를 대상으로 프로모터에 따라 조직특이적으로 유전자의 발현양상을 알아보기 위해 프로모터 별로 1개체씩을 선정하여 Northern blot 분석을 수행한 결과는 Fig. 5 와 같다. 먼저 \( { }^{35} \mathrm{~S} \)-ferritin이 도입된 형질전환체는 잎을 시료로 사용하였으며, pGTF, pZ4F 및 pGBF이 도입된 형질전환체는 출수 30일 후, 성숙종자의 종피를 벗겨낸 종자를 시료로 사용하여 전 RNA를 추출하였다. 그 결과 형질전환 되지 않은 wild type에서는 ferritin 유전자가 발현되지 않았으나, 형질전환체에서는 뚜렷하게 발현하고 있음을 보여주었다. 또한 프로모터 간의 발현량은 \( { }^{35} \mathrm{~S}\)-ferritin, pZ4F 의 형질전환체에서 거의 유사하였으며, pGTF, pGBF이 도입된 형질전환체에서는 높은 량으로 발현하고 있음을 알 수 있었다. 이들 결과로부터 ferritin 유전자가 본 연구에서 사용된 프로모터에 따라 발현시킬 수 있는 system이 확립하였음을 시사하였다.</p><h2>Western blot 분석에 의한 형질전환체의 단백질 발현</h2><p>벼 형질전환 식물체들에서 ferritin 단백질이 어느정도 프로모터에 따라 발현하고 있는지를 조사하기 위하여 성숙한 잎 \(({ }^{35} \mathrm{~S}\)-ferritin) 및 배유(pGTF, pGTF, pZ4F)로부터 soluble protein을 추출하여 SDS-PAGE에 의해 분획한 후, 나이론 membrane에 옮겨 Western blot 분석을 실시한 결과는 Fig. 6과 같다. 그 결과 wild type과 형질 전환 계통 중에서 한 개체만을 제외하고 ferritin antibody에 의하여 밴드가 검출되었다. 이는 도입된 ferritin 유전자가 사용된 프로모터에 의하여 mRNA로 전사되어, protein으로 번역이 이루어진 것으로 생각된다. 그러나 lane 2 (pGTF)의 경우 mRNA 수준에서는 전사가 되었으나, protein을 만드는 과정에서 변이가 일어난 것으로 예상할 수 있다. 이런 결과로부터 ferritin 유전자를 벼 세포내에 형질전환한 식물체들에서 종자 특이 프로모터에 의해 예상헸던 ferritin 단백질이 안정적으로 발현하고 있음을 알 수 있었다.</p>
T0세대 식물체는 무엇을 통해 얻어졌는가?
Ferritin 유전자의 형질전환