<h1>재료 및 방법</h1><h2>시약 및 기기.</h2><p>본 연구에 시용된 사이퍼메트린(cypermethrin) 시약은 중국 Beijing Luckystar사로부터 제공받아 사용하였다. 분석에 사용된 high performance liquid chromatography (HPLC)는 Waters (Micromass UK Ltd., UK)의 제품으로 1525 binary pump, 2489 UV/Visible detector와 2707 autosampler로 구성되어있다. HPLC용 acetonitrile과 water는 Burdick & Jackson (Honeywell International Inc., USA)으로부터 구매하여 사용하였다. 기타 미생물 배양에 필요한 모든 시약들은 특급시약을 사용하였다.</p><h2>사이퍼메트린(cypermethrin)의 생물학적 분해용 미생물 분리</h2><p>부산 인근의 경작지 토양 또는 연안 퇴적물로부터 토양 샘플 \( (0.5 \mathrm{g}) \)을 채취하여 250 삼각 플라스크로 옮긴 다음, 피레스로이드(pyrethroid) 계열 살충제인 사이퍼메트린(cypermethrin)을 최종 농도 \( 50 \mathrm{mg} / \)이 되게 멸균된 mineral salt medium(MSM) 배지 (\( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 6 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 3 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), \( \mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl} 1 \mathrm{g} / \mathrm{L} \), \( \mathrm{NaCl} 0.5 \mathrm{g} / \mathrm{L} \), \( \mathrm{MgSO}_{4} 0.24 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), \( \left.\mathrm{CaCl}_{2} 0.011 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\right) \) \( 50 \mathrm{~mL} \)과 함께 첨가한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C}\) \(, 180 \mathrm{rpm} \)에서 5 일 동안 배양 했다. 5 일 후 배양액 1\( \mathrm{mL} \)을 취허여 다시 사이퍼메트린(cypermethrin)을 최종 농도 100 \( \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 이 되게 멸균된 \( \mathrm{MSM} \) 배지 \( 50 \mathrm{mL} \)과 함께 첨가한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C}\) ,\( 180 \mathrm{rpm} \)에서 5 일 동안 배양 했다. 순차적으로 사이퍼메트린(cypermethrin)의 농도를 높여 \( 200,300 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 까지 수행한 다음, MSM 고체 배지에 콜로니를 도출했다. 도출된 콜로니들은 각각 사이퍼메트린(cypermethrin)을 최종 농도 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 이 되게 멸균된 MSM배지 \( 50 \mathrm{~mL} \) 과 함께 첨가한 후 \( , 30^{\circ} \mathrm{C}, 180 \) \( \mathrm{rpm} \) 에서 5 일 동안 배양한 다음 배양액에 존재하는 잔류 사이퍼메트린(cypermethrin)을 추출한 다음 HPLC를 이용하여 분리 미생물에 의한 사이퍼메트린(cypermethrin)의 분해 정도를 측정했다.</p><h2>16s rDNA 서열에 의한 분리 균주의 동정.</h2><p>두 개의 oligonucleotide 프라이머 5'-GAGITTTGATCCTGGCTCAG-3' (position 9 to 27 E. coli 16S rDNA), 5'-AGAAAGGAGGTGAT CCAGCC-3' (position 1542 to 1525 E. coli 16S rDNA)를 이용하여 분리 균주의 16S rDNA 영역의 증폭을 수행했다. 초기 변성 단계는 \( 95^{\circ} \mathrm{C}\) 1분을 시작으로 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 30초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 1분을 30 cycle 수행하고 최종 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에 10 분간 신장 단계를 수행한다. 이렇게 얻어진 PCR 산물은 pGEM T-easy vector (promega Co., Fitchburg, WI, USA)속에 재조합한다. 선별 균주의 16S rDNA 유전자의 염기서열을 결정한 다음 GenBank Database에서 상동성을 비교하며, 유사 종들과의 유전학적인 유연관계를 알아보기 위하여 ClustalX program을 이용하여 phylogenetic tree를 제작하였다.</p><h2>배양액에서 사이퍼메트린(cypermethrin)의 추출 및 분석.</h2><p>배양 상등액 \( 10 \mathrm{mL} \)에 아세톤/석유에테르 혼합액 \( (1: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v})\) \( 20 \mathrm{mL} \)을 혼합한 다음 ultrasonic bath에서 20 분에 한 번씩 섞어 주면서 1시간 동안 추출을 수행하였다. 분리된 2개의 층들 중에서 상층액을 새 tube로 옮긴 다음 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에서 중탕하며 질소 가스 \( \left(\mathrm{N}_{2}\right. \) gas ) 를 이용하여 완전히 휘발시컸다. Acetonitrile \( 1 \mathrm{~mL} \) 을 첨가하여 시료를 완전히 녹인 다음 \( 0.22 \mu \mathrm{m} \) polytetra-fluoroethylene 멤브레인 필터를 이용하여 여과한 다음, HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석은 Waters의 HPLC를 이용하었으며 XBridge \( ^{\mathrm{TM}} \) C18 ( \( 5 \mu \mathrm{m} \) \( 4.6^{*} 150 \mathrm{~mm} \) 컬럼, Waters)을 사용하였고, acetonitrile:water \( (0.85: 0.15, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 용매를 분당 \( 1 \mathrm{mL} \)씩 흘리며 UV \( 235 \mathrm{nm} \)에서 사이퍼메트린(cypermethrin)을 검출하였다.</p>
사이퍼메트린(cypermethrin)의 생물학적 분해용 미생물 분리에 사용된 멸균 mineral salt medium(MSM) 배지의 조성 중 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \)의 농도는 얼마인가요?
\( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 6 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \)