<h1>고 찰</h1><p>히스톤이란 DNA와 복합적으로 뉴클레오좀을 구성하는 기본 단백질로서 이러한 뉴클레오좀이라는 작은 구성단위가 반복되어 모든 인간의 유전자가 포함된 염색질(chromatin)을 구성하게 된다. 히스톤 변형, 즉 히스톤 아세틸화는 DNA 메틸화와 함께 DNA의 염기서열에는 변화가 일어나지 않은 상태에서 유전자의 발현을 조절하는 가장 핵심적인 후천적 기작이다. 일반적으로 유전자내의 히스톤 단백질은 아세틸화가 일어나 있는 상태 또는, 탈아세틸화 상태로 존재하게 되는데, 이는 HAT와 HDAC 효소에 의해 각각 그 반응이 일어난다. 이러한 히스톤 단백질의 아세틸화 또는 탈아세틸화에 의한 염색질의 재구성은 특정 유전자의 전사(trans-cription)를 조절하는데 있어 매우 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다. 히스톤 아세틸화는 일반적으로 유전자 발현이 활성화된 경우에 일어나며, HDAC 효소에 의한 탈아세틸화는 유전자의 발현을 억제시킨다. 본 연구에서는 이러한 특정 유전자의 발현을 조절하는 기능이 있는 히스톤 구조의 재편성을 HDAC 효소 억제제인 trichostatin A를 이용하여 C2C12 myoblast 세포에 유도하였을 때 일어나는 유전자의 발현과 세포의 변화를 살펴보았다.</p><p>본 연구의 결과는 HDAC 억제제인 trichostatin A가 C2C12 myoblast 세포를 smooth muscle로 분화시켰다. trichostatin A를 C2C12 myoblast 세포에 처리한 후 형태학적으로 세포의 증식이 trichostatin A의 농도가 높아질수록 더욱 억제되는 것을 현미경상에서 뚜렷이 볼 수 있었으며, 또한 세포가 분화될 때의 특징인 길어짐(elongation)과 주위의 다른 세포들과의 융합(fusion) 현상이 일어났으며, smooth muscle의 전형적인 형태로 분화되었다. 또한 본 연구에서는 유전자의 직접적인 발현을 통해 smooth muscle로의 분화를 검증하기 위해 smooth muscle의 지표로 널리 쓰이는 smooth muscle \( \alpha \)-actin과 transgelin mRNA의 변화를 살펴보았다. Trichostatin A는 농도 의존적(concentration-dependent)으로 smooth mus-cle \( \alpha \)-actin과 transgelin mRNA의 발현을 최대 약 6배, 13배 정도 각각 증가시켰다. 형태학적인 변화는 물론 immuno-fluorescent staining과 smooth muscle marker 유전자 발현의 증가는 C2C12 myoblast 세포를 인위적으로 serum을 포함하지 않은 분화 배지로 배양하지 않은 상태에서 히스톤 단백질의 탈아세틸화를 억제시키자 smooth muscle로 분화함을 명백히 보여준다.</p><p>Trichostatin A에 의한 smooth muscle로의 분화는 히스톤 단백질의 아세틸화의 상태는 세포주기 조절기전에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 즉, trichostatin A가 C2C12 세포의 조절기전에 관여하는 중요한 유전자의 발현을 조절하여 세포의 증식을 억제함과 동시에 분화를 유도하는 기전이 활성화된 것으로 판단된다. 이를 검증하기 위하여 본 연구에서는 trichostatin A를 C2C12 세포에 처리한 후 세포주기 조절유전자인 p21과 cyclin D1 mRNA의 변화를 살펴보았다. Cyclin은 세포주기 기전에 있어서 필수적인 구성요소로서 각각의 cyclin은 cyclin dependent kinase(cdk) 단백질에 결합하여 활성화를 시킨다. 세포주기의 G1 phase를 정상적으로 통과하기 위해서는 D-type와 E-type와 같은 두가지 종류의 cyclin이 필요하며, 특히 D-type cyclin은 결정적인 세포주기 진행에 있어서 결정적인 역할을 한다. Cyclin과 cdk 결합체는 G1 phase에서 헝성되어 retinoblastoma(Rb) 단백질의 인산화(phosphorylation)를 유도한다. Cdk4와 6은 D-type cyclin과 결합하여 세포분열을 촉진하는 자극 또는 환경이 주어지면 활성화되어 세포주기의 진입과 G1 progression을 유도한다. 좀 더 구체적으로 언급하자면 D-type cyclin은 cdk4와 6을 활성화하는 반면, cylin E는 cdk2를 활성화시킨다. 활성화된 cdk4/6-cyclin D1은 G1 phase 초기에 Rb 단백질을 인산화 시키며, 이는 cyclin E를 증가시키고, cyclin E는 cdk2와 결합하여 Rb 단백질의 인산화를 더욱 증가시킨다. 이러한 Rb 단백질의 과인산화(hyper-phosphorylation)는 전사인자인 E2F-1을 활성화시키고 DNA 복제와 유사분열에 필수적인 여러 유전자를 발현시키는 역할을 한다. 따라서 이러한 선행연구를 바탕으로 cyclin D1은 세포가 증식 또는 분열할 수 있도록 하는데 있어서 매우 중요한 역할을 담당함을 알 수 있다. 본 연구에서 cyclin D1 mRNA의 발현은 \( 62.5 \mathrm{nM} \) 의 trichostatin A C2C12 myo-blast 세포에 처리한 후 24시간이 경과하자 급격히 감소하여 대조군의 \( 30 \% \) 정도에 미치지 않았다. 하지만 이렇게 감소된 cyclin D1 mRNA의 발현은 48시간이 지난후 대조군과 차이가 나지 않았다. 이러한 결과는 trischostatin A는 세포 증식을 하는데 있어서 필수적인 cyclin D1의 유전자 발현을 매우 빠른 속도로 조절함을 시사한다. 이렇게 감소된 cyclin D1 mRNA는 결국 cyclin D1 단백질의 발현을 감소시킨다. 이는 세포 분열단계로의 진행에 있어서 필수적인 Rb 단백질의 인산화를 위한 전단계인 cyclin D1과 cdk4/6의 결합을 현저히 감소시킬 것이다. 결국 C2C12 myoblast 세포는 이러한 기전에 의해 증식단계로 진행하지 못하고, 분화단계로의 활성화가 진행된 것으로 사료된다.</p><p>본 연구에서 고찰한 또 다른 세포주기 조전 유전자인 p21은 앞에서 언급하였듯이 세포가 분열과 증식단계로 진행하는데 있어서 필수적인 cdk를 억제하는 유전자이다. p21은 cyclin-cdk 복합체에 결합하여 모든 세포 주기 단계의 전이에 있어서 필수적인 kinase의 활성화를 저해시킨다. p21의 발현은 p53에 의해 활성화되며, 이러한 p21 유전자 발현의 증가는 결국 G1 phase에서 S phase로 세포주기가 진행되지 못하게 한다. 따라서 p21 유전자의 발현 증가는 다양한 모든 형태의 세포의 분화단계에서 나타난다. 앞서 결과에서 살펴보았듯이 trichostatin A로 처리한 C2C12 세포에서 cdk 억제제인 p21이 농도 의존적으로 유의하게 증가하였다. 시간적으로 보았을 때 72시간 동안의 trichostatin A의 처리는 p21 mRNA의 발현을 최대 15배 정도까지 유의하게 증가시켰다. 이러한 p21 mRNA의 증가는 C2C12 myoblast 세포가 세포주기의 G1 phase에서 S phase로 진행하는 것을 억제시키며, cyclin D1 유전자의 발현변화와 함께 smooth muscle로의 분화를 활성화하는데 있어서 중요한 역할을 하였다고 사료된다.</p>
히스톤 아세틸화가 히스톤 변형을 의미해?
YES