<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주 및 배양</h2><p>배양본 실험에 사용한 균주는 한국식품연구원과 한국미생물보존센터에서 분양받은 표준균주 및 본 연구실에서 신규 분리한 균주들 중에서, 홍국색소 생산능이 우수한 것으로 조사된 Monascus sp. MK2 균주를 발효 홍국마 제조에 실험균주로 선발하여 본 실험에 사용하였다. 그리고 발효 홍국마의 제조를 위해 Monascus sp. MK2의 전배양 기본배지로 \( 3 \% \) rice powder, \( 0.15 \% \quad \mathrm{NaNO}_{2}, 0.1 \% \quad \mathrm{M}_{8} \mathrm{SO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 및 \( 0.25 \% \) \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \mathrm{pH} 6.0 \) 로 구성된 Lin's 배지를 사용하였으며, 본배양은 전 배양과 동일한 Lin's 배지에 Monascus sp. MK2 전배양액을 \( 2 \% \) (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 접종한 후 초기 \( \mathrm{pH} 6.0 \), 배양온도 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 130 \mathrm{rpm} \)으로 5일간 진탕 배양하여, 발효 홍국마의 제조를 위한 종균으로 사용하였다.</p><h2>발효 홍국마의 제조</h2><p>본 실험에 사용한 마 시료는 2009년 경북 안동에서 재배한 병마(Dioscorea batatas Dence.)를 구입하였으며, 구입 직후 \( 4^{\circ} \)에 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다. 발효 홍국마를 제조하기 위하여 마는 흐르는 물에 세척하여 뿌리 표면에 부착된 이물질을 없애고 말단 부분과 껍질을 제거한 후, 약 \( 3 \mathrm{~mm} \)정도로 절단하고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 항량 건조하여 냉동보관 하면서 사용하였다. 발효 홍국마의 제조는 건조된 마를 물에 침지한후 불림을 행하였으며, 침지 후 물빼기를 실시한 다음 \( 100 \mathrm{~g} \)씩 배양통에 분취하였다. 이후 \( 121 \mathrm{C} \)에서 15분간 가압 멸균하고 실온으로 냉각시킨 다음 Monascus sp. MK2 배양액을 \( 4 \% \)\( (\mathrm{v} / \mathrm{w}) \)로 접종 한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7일간 발효를 하였으며, 배양체의 덩어리 형성을 방지하고자 하루에 3회 규칙적으로 흔들어 주었다. 발효가 완료된 후에는 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수분함량 \( 10 \% \) 이하로 건조한 후 분쇄하여 냉동보관 하면서 실험에 필요한 시료로 사용하였다.</p><h2>발효 홍국마 색소 측정</h2><p>발효 홍국마로부터 색소의 측정은 에탄올을 농도별로 하여 각각 추출한 후 추출액을 \( 6,000 x \mathrm{~g} \)에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 적정배수까지 희석하여 UV-VIS spectropho-tometer (Hewlett Packard 8453, Germany)를 사용하여 yel-low 색소는 \( 400 \mathrm{~nm} \), orange 색소는 \( 470 \mathrm{~nm} \) 및 red 색소는 \( 500 \mathrm{~nm} \)에서 측정한 흡광도 값을 각각의 홍국색소 값으로 나타내었다. 또한 red 색소와 yellow 색소의 생성량을 \( 500 \mathrm{~nm} / 400 \) \( \mathrm{nm} \)의 비율로서 상대적으로 비교하였고, 1.0을 기준으로 하여그 이상은 red 색소의 생성 비율이 높은 것으로 그 이하는 yellow 색소의 생성 비율이 높은 것으로 나타내었으며, 이때 흡광도(OD) 1.0을 1 unit로 나타내었다</p><h2>HPLC를 이용한 Monacolin K의 정량</h2><p>발효 홍국마로부터 monacolin K의 정량은 에탄올을 농도별 \( (0,25,50,75 \) 및 \( 95 \%) \)로 하여 각각 추출한 후 추출액을 \( 6,000 \times \) g에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 사용하였다. 즉, monacolin K의 추출은 홍국쌀 \( 1 \mathrm{~g} \)에 \( 0-95 \% \) 에탄올 \( 20 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 150 \mathrm{rpm} \)으로 3시간 동안 교반하고 정치시킨 후 \( 6,000 \times \) g에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 membrane filter ( \(0.45 \mathrm{μm} \), Millipore)로 여과하여 시료로 사용하였으며, 이때 사용한 HPLC 분석조건은 다음과 같다. Monacolin K의 정량은 Luna 5 μ Phenyl-Hexyl column\( (250 \times 4.6 \mathrm{~mm} \), Phenomenex Inc., USA)이 장착된 HPLC(Sykam, Germany)를 이용하여 flow rate : \( 1.0 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \), UV\( 237 \mathrm{~nm} \) 에서 검출하면서 injection volume 20 μl로 하여 aceto-nitile: \( 0.1 \% \) Phosphoric acid=\( =55: 45 \)의 비율로 용출시킨 후 표준monacolin K (Sigma co., USA)를 이용하여 peak의 면적비로써 비교 정량분석 하였다.</p><h2>DPPH radical 소거활성</h2><p>발효 홍국마 에탄올 농도별 추출물의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical 소거활성은 Blois 등의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 농도별 시료 200 μl에 DPPH 용액을 800 μl를 가하여 혼합한 다음 실온에서 10분간 반응시킨후 \( 525 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이때 DPPH radical 소거활성은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 비교하여 나타내었으며, 양성대조군으로 ascorbic acid를 사용하였다.</p><h2>총 폴리페놀 함량</h2><p>발효 홍국마 에탄올 농도별 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 농도별 시료 50 μl에 \( 2 \% \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 용액 \( 1 \mathrm{ml} \)을 가하고, Folin &Ciocalteu's phenol reagents 50 μl를 혼합한 다음 실온에서 30분간 반응시킨 후 \( 760 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 tannic acid (Sigma co., USA)를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 작성한 검량선으로부터 총 폴리페놀 함량을 계산하였다.</p><h2>ACE 저해활성</h2><p>발효 홍국마 에탄올 농도별 추출물의 ACE 저해활성의 측정은 Cushman과 Cheung의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 시료 100 μl에 \( 100 \mathrm{mM} \) sodium borate buffer \( (\mathrm{pH} 8.3 \) ) 100 μl를 가한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 전배양시켰다. 여기에 기질로서 hippuril-L-histidine-L-leucine (HLL, Sigma, U.S.A)용액 50 μl를 가하여 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후 1 NHCl 250 μl를 가하여 반응을 정지시켰다. 여기에 ethyl acetate \( 1 \mathrm{ml} \)를 가하여 30초간 vortexing한 다음 \( 1,500 \times \) g으로 15분간 원심분리 한 후 상등액 800 μl를 취하였다. 이 상등액을 \( 120^{\circ} \mathrm{C} \)에서 40분간 완전히 건조시킨 후 동일조건의 \( 100 \mathrm{mM} \) sodiumborate buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.3) \( 1 \mathrm{ml} \)을 가하여 완전히 용해시켜 \(228 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 ACE 저해활성을 계산하였다.</p>
발효 홍국마 에탄올 농도별 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정을 위해 변형하여 사용한 방법은 뭐야?
Folin-Denis법