<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물재료 및 시료 추출물의 제조</h2><p>실험에 사용된 복분자 씨앗은 경상북도 김천시 삼도봉 오미자 농장에서 구입하여 세척후 건조하여 분쇄한 후 실험재료로 사용하였다. 분쇄된 씨앗 100\( (\mathrm{~g}) \) 을 \( 70 \%\) \(\mathrm{EtOH} \) 에 24 시간 침적시키고 추출된 여액을 감압 농축하였다. 70\( \%\) \(\mathrm{EtOH} \) 용매 침적추출과 농축하는 과정을 3 회 반복 하였으며 동결건조를 통하여 건조된 70\( \%\) \(\mathrm{EtOH} \) 에탄올 추출물 3.9\( (\mathrm{~g}) \) 을 얻었다.</p><h2>시약</h2><p>세포배양에 사용된 dulbecco's modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin, 0.4\( \% \) trypan blue stain은 Hyclone (Logan, UT, USA)에서 구입하였으며, haemacytometer (Marienfeld, Germany), MTT는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 항산화와 mRNA발현에 측정된 시약인 ROS-Glo assay, GoScript\({}^{TM}\) Reverse Transcriptase, GoTaq Flexi DNA Polymerase는 Promega Corporation (Madison, WI, USA)에서 구입하였으며, 그 외 항염증 및 피부 장벽 측정에 사용된 시약인 \( \mathrm{PGE}_{2} \) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kit는 R\&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서, RIPA buffer, HaltTM Protease Inhibitor Cocktail Kit, BSA kit는 Thermo scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였고 antibody중 COX-2 cyaman chemical (Ann Arbor, MI, USA), iNOS BD Biosciences Pharmingen (Heidelberg, Germany) filaggrin antibody 의 anti-rabbit IgG horseradish peroxidase-conjugated antibody는 Santa cruz Biotechnology (Santa cruz, CA, USA)에서 구입하였다.</p><h2>세포배양</h2><p>사람의 각질형성세포주(human keratinocyte cell)는 HaCaT세포는 계명대학교로부터 분양 받아 사용하였다. 세포는 10\( \% \) FBS과 1\( \% \) penicillin/streptomycin \( (100 \mathrm{U} / \mathrm{mL}) \) 을 첨가한 DMEM배지를 사용하였으며, 37\( ^{\circ} \mathrm{C}) \), 5 \( \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.</p><h2>MTT assay에 의한 세포 독성 측정</h2><p>HaCaT 세포를 96 well plate에 5\( \times 10^{3} \mathrm {cells} / \mathrm{well} \) 이 되게 0.18\( \mathrm{mL} \) 분주하고, 복분자 씨앗 추출물을 각각 5, 10, 25, 50, 100 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 농도로 조제하여 0.02\( \mathrm{~mL} \) 첨가한 후 37\( ^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24 시간 배양하였다. 여기에 5\( \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농도로 제조한 MTT 용액 0.02\( \mathrm{~mL} \) 를 첨가하여 4 시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.15\( \mathrm{~mL} \) 를 가하여 실온에서 15분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 540\( \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p>
\( 70 \%\) \(\mathrm{EtOH} \) 에 분쇄된 씨앗 100\( (\mathrm{~g}) \) 을 침적시킨 시간이 24시간인가?
YES