<h1>서 론</h1><p>트립토판 중합효소 알파 소단위체(분자량=28,600Da)는 \( (\alpha / \beta)_{8} \) barrel 구조로 알파나선구조 5 개와 베타 병풍구조 6개로 이루어진 1-188 잔기의 N-domain과 3개의 알파나선구조와 2개의 베타병풍구조로 구성된 189-286 잔기의 C-domain으로 이루어져 있다. 트립토판 생 합성에서 \( \alpha \) 반응은 indole 3-glycerol phosphate를 indole과 D-glyceraldehyde 3-phosphate로 분해하며, prosthetic group이나 이황화결합를 가지고 있지 않아 folding 연구에 좋은 재료가 되고 있다.</p><p>알파 소단위체의 4 번 베타구조와 4 번 알파 구조 사이에 있는 loop의 두 번째 자리인 139 번과 8 번 알파나선구조의 열한 번째 자리에 위치한 258번 페닐알라닌을 트립토판으로 각기 치환하여 치환된 잔기가 트립토판 중합효소 \( \alpha \) 소단위체의 전체적인 구조에 미치는 영향이 보고되었다. 구조 형성시 139 번과 258번의 트립토판은 각각 \( \alpha 1 \) 과 \( \alpha 2 \) domain 의 리포터로 사용 가능하다고 제안된바 있다.</p><p>알파 소단위체는 대장균내에서 유전공학적인 방법으로 과량 발현시켰을 때 수용성인 상태로 발현되나, 96 번 잔기가 프롤린에서 류신으로 치환되었을 때 (P96L) 단백질이 inclu-sion body (응집체)로 대부분 존재한다. P96L에 F139W와 F258W 를 각각 이중 치환한 P96L/F139W, P96L/F258W와 삼중 치환한 P96L/F139W/F258W는 모두 수용성인 형태로 발현되었다.</p><p>본 실험에서는 트립토판 잔기 치환체의 형광을 이용하여 돌연변이체, P96L/F139W, P96L/F258W 와 P96L/F139W/F258W의 트립토판 주변 환경에 대하여 조사하였다.</p><h1>재료 및 방법</h1><h2>박테리아 균주, 파아지, 플라스미드</h2><p>대장균 균주 RB797 (F' lacli proL8/arg Nal Rif recA sup lac proXIII) 는 돌연변이 단백질들을 발현하는데 사용하였다. \( trpA \) 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 ptactrpAMK-M13 는 단백질의 과생산 과정에 사용하였다. \( trpA \) 유전자는 \( \mathrm{D} \)-락토오스에 의해 과발현이 유도되는 \( t a c \) 전사조절인자를 가지고 있다.</p><h2>효소와 시약</h2><p>모든 시약은 순도가 높은 것을 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다.</p><h2>단백질의 과생산 및 분리방법</h2><p>야생형 및 돌연변이 단백질들은 대장균 RB797에서 과생산하고 분리하였다. 단백질의 과생산은 plasmid를 가진 대장균을 20ml TYS ( \( 1\% \) bactoTrypton, \( 0.5\% \) yeast extract, \( 0.5 \% \) NaCl 배지에서 약 16 시간 배양한 후, 이를 \( 1 \mathrm{~L} \) 새로운 TYS배지로 읆겨 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도가 약 \( 0.4 \sim 0.6 \) 가 될 때 최종농도가 \( 1 \% \) 가 되게 락토오스를 첨가하여 induction을 시키고 24 시간을 더 배양하였다. 이렇게 배양된 대장균은 원심분리( \( 6,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분)하여 수확(harvest)한 후 \( 10 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{KPO}_{4} \) (pH 7.8), \( 5 \mathrm{mM} \) EDTA, 0.2mM PMSF, 0.2mM DTT \( 100 \mathrm{ml} \) 에 대장균을 현탁하고 원심분리하여 용액을 제거하는 방법을 2회 반복하여 여분의 배지성분을 제거하였다. 수확된 대장균은 같은 용액 \( 15 \mathrm{ml} \) 에 다시 현탁시켜 초음파 파쇄기를 사용하여 깬 후 원심분리(15,000 rpm에서 20분)로 침전물를 제거하고 단백질 추출액을 얻었다. 단백질 추출액은 황산암모늄 ((\( \left.\mathrm{NH} 4)_{2} \mathrm{SO}_{4}\right) \quad 35-50 \% \) 포화(100\% 포화; \( 70 \mathrm{~g} / 100 \) \( \mathrm{ml}) \) 농도에서 침전된 분확을 얻어 이를 이온크로마토그래피로 순수분리하였다. 이온크로마토그래피는 Protein-Pak \( { }^{\mathrm{TM}} \) DEAE 5PW(WATERS사) 컬럼을 사용하여 HPLC(High Performance Liquid Chromatography, WATERS사)로 분리 하였다. 이때 사용된 완충용액은 \( 5 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.2 \mathrm{mM} \) PMSF, \( 0.2 \mathrm{mM} \) DTT 가 포함된 \( \mathrm{KPO}_{4}(\mathrm{pH} 7.8) \) 이며, \( \mathrm{KPO}_{4}(\mathrm{pH} \) 7.8) 농도를 \( 10 \mathrm{mM} \) 에서 \( 500 \mathrm{mM} \) 로 증가시켜 용출시켰다. 순수 정제된 단백질 분획의 순도는 SDS-전기영동을 실시하여 Coomassie Brilliant Blue R로 염색하여 확인하였다.</p>
이온크로마토그래피는 무엇을 사용해서 HPLC로 분리했어?
Protein-Pak \( { }^{\mathrm{TM}} \) DEAE 5PW(WATERS사) 컬럼