<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료 및 시료의 제조</h2><p>세포배양을 위한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin / streptomycin / am-photericin (각각 \( 10,000 \mathrm{U} / \mathrm{ml}\), \( 10,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 및 \( 2,500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다. HDF 세포는 (주) LG 생활건강 기술원으로부터 제공받았다. 사포닌 (Sigma 84510), MTT reagent, gelatin, agarose와 spermidine 기타시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.</p><h2>DPPH radical assay</h2><p>Brand-Williams 실험방법을 변형하여 1,1-di-phenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 사포닌의 소거능력을 측정하였다. 시험농도의 사포닌을 DPPH 용액을 가하여 \( 10 \mathrm{sec} \) 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 \( 20 \mathrm{~min} \) 동안 반응 시킨 후 \( 525 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. DPPH radical 함량은 시료 첨 가군과 대조군의 흡광도 비를 \( \% \) 값으로 환산하여 나타내었다.</p><h2>Hydroxyl radical assay</h2><p>Chung 등의 실험방법을 변형하여 hydroxyl radical을 측정하였다. \( 50 \mu \mathrm{l} \) \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{FeSO} 4 \)와 \( 50 \mu \mathrm{l} \)의 \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 이용한 Fenton 반응으로 hydroxyl radical를 발생시켰다. 발생된 radical을 \( 25 \mu \mathrm{l} \)의 \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 25 \mu \mathrm{l} \)의 \( 10 \mathrm{mM} \) 2-de-oxyribose, \( 150 \mu \mathrm{l} \)의 \( 0.1 \mathrm{M} \) phosphate buffer (\(\mathrm{pH} 7.4\))의 존재 하에서 시험농도의 사포닌과 반응시킨 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 4 \mathrm{hr} \) 동안 반응시켰다. 여기에 \( 250 \mu \mathrm{l} \)의 \(2.8\%\) TCA (trichloroacetic acid) 및 \( 250 \mu \mathrm{l} \)의 \(1\%\) TBA (thiobabituric acid)를 첨가한 후에 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)로 가열하였다. 그 후 상온에서 식힌 다음 \( 1,000 \times g \)에서 \( 5 \mathrm{~min} \)동안 원심분리하였다. 회수한 상등액은 \( 532 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였으며 사포닌의 항산화 활성은 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 \( \% \) 값으로 환산하였다.</p><h2>Hydrogen peroxide scavenging assay</h2><p>Choi 등의 실험방법을 변형하여 Hydrogen peroxide에 대한 소거활성을 측정하였다. \( 80 \mu \mathrm{l} \)의 사포닌, \( 25 \mu \mathrm{l} \)의 \( 10 \mathrm{mM} \) hydrogen peroxide 및 \( 100 \mu \mathrm{l} \)의 \( 0.01 \mathrm{M} \) 인산완충용액( \( \mathrm{pH} 5.0 \))을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 5 \mathrm{~min} \) 동안 반응시켰다. 그 후, \( 15 \mu \mathrm{l} \)의 \( 1.25 \mathrm{mM}\) ABTS 및 \( 30 \mu \mathrm{l} \)의 peroxidase \( 37^{\circ} \mathrm{C}\)에서 \( 10 \mathrm{~min} \) 동안 반응시켜 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며 사포닌의 항산화 활성은 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 \( \% \) 값으로 환산하였다.</p>
시험 농도의 사포닌을 측정하기 위해서는 어떻게 해야할까?
DPPH 용액을 가하여 \( 10 \mathrm{sec} \) 동안 잘 혼합한 다음