<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포주, 바이러스 및 시약</h2><p>BHK 세포주(일본 이화학연구소 분양)는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), humidified \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator (\( 5 \% \mathrm{CO}_{2}-95 \% \) air)내에서 \( 10 \% \) calf serum (BD)이 포함된 Eagle's minimum essential medium (BD, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다. NDV; Miyadera strain는 국립보건연구원(National Institute of Health, Seoul, Korea)에서 분양받은 BHK 세포에서 증식하였다. 증식된 바이러스 stock들은 monolayer BHK 세포주상 plaque forming units의 assay를 통 하여 적정하였다. 모든 시험에 사용된 시약들은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA) 사로부터 구입하여 사용하였다.</p><h2>시료 추출</h2><p>오배자 시료는 대구시내에 위치한 한약방으로부터 구입하여 사용하였다. 오배자 시료 \( 10 \mathrm{~g} \) 을 각각 메탄올 (\( 100 \mathrm{~mL} \))로 상온에서 24시간동안 추출하여 Whatman filter paper을 사용하여 여과하였다. 그리고 메탄올을 제거하기 위하여 여과액을 감압농축(\(40 { }^{\circ} \mathrm{C} \) )하여 동결건조 한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하여 활성 시험의 재료로 사용하였다.</p><h2>효소 활성 검정</h2><p>오배자 추추물은 시판하는 다양한 glucosidase에 대하여 효소 활성 억제를 보였다. glycosidase의 assay는 Lee 등의 방법에 따라 수행하였다. \( \alpha \)-glucosidase와 다른 glucosidase의 활성 분석을 위하여 기질로 p-nitrophenol (PNP) glycosides (\(1 \mathrm{mM}\))를 포함하는 \( 50 \mathrm{mM} \) phosphate 완충용액 \(\mathrm{pH}6.7 \)을 조제하여 사용하였다. 시료를 완충용액에 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), 5 분 효소 반응 개시 후 기질을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 10 \) 분 간 효소 반응을 수행하였다. 효소반응 종료는 3 배 vol.의 \( 1 \mathrm{M}\) \(\mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 를 첨가하여 반응을 종한 후 \( \mathrm{OD}_{405} \) 를 측정하여 흡광도 변화로부터 효소저해활성을 계산하였다. 활성단위인 1 unit는 활성측정 조건에서, 1분 동안 PNP \( 1.0 \mu \mathrm{mol} \) 을 생성하는데 사용된 효소 양으로 정하였다. 억제율 계산은 아래와 같이 하였다.</p>\(\text{Inhibition} (\%)=\frac{\text { Activity control }-\text { Activity sample }}{\text { Activity control } \times 100} \)<h2>Syncytium 형성 및 cytopathic 효과</h2><p>BHK cell의 표적 세포 단일층(monolayer)은 96 well microtiter plate에 5 multiplicity of infection 농도의 NDV를 감염시킨 후표시된 농도의 시료를 첨가하여 배양하였다. 그런 후 NDV 감염 세포주에서 syncytium 형성여부와 cytopathic 효능 (CPE), cytopathic units (CPU) 정량을 광학현미경으로 관찰하였다.96 well microtiter plate에 배양된 BHK 세포주에 2배 희석 농도가 되게 하여 VSV를 감여시킨 후 CPU 정량을 하였다. CPU는 세포병변효과가 일어나는 추출물 농도 이전의 최대 희석 배율로 정하며, 세포병변효과에 내성을 갖는 물질의 최대 희석농도를 의미한다.</p><h2>Cell growth</h2>96 well plates에 BHK 세포를 분주한 후 2 배 농도로 희석된 오배자 추출물을 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(\mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. BHK 세포 성장은 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt (SigmaAldrich)를 이용한 colorimetric 방법에 준하여 결정하였다.<h2>적혈구응집(Hemagglutination) 및 혈구흡착(hemadsorption)</h2><p>바이러스 당단백질 NDV-hemagglutinin-neuramidase (NDV-HN) 생합성은 NDV 감염 세포주의 용해물에 혈구응집단위(hemagglutination units, HAU를 결정하여 정량하였다. 세포 표면에서 NDV-HN 발현유무는 혈구흡착(hemadsorption, HAD)의 정량으 로 결정하였다.</p><p>6-well plates (Falcon; BD, Detroits, MI, USA)에 \(1 \mathrm{HAU}/ \mathrm{mL} \) 농도의 NDV를 \( 2 \mathrm{~mL} \) 처리하여 감염시킨 후 14시간, \(37 { }^{\circ} \mathrm{C} \), humidified \(5\%\) \( \mathrm{CO}_{2}-95 \% \) air incubator에서 BHK 세포의 Confluent 배양을 수행하였다. 배양한 배지를 제거한 후 냉각된 식염수(chilled saline)에 있는 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 닭 적혈구 (chicken red blood) 세포 \( 2 \mathrm{~mL} \) 를 각각의 well에 분주 한 후 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C}\), 30분간 정치하였으며, 가끔씩 가겹게 흔들어 주었다. 흡착되지 않은 혈구세포를 제거 한 후, cell layer를 냉각한 식염수 \( 2 \mathrm{~mL} \)로 3회 씻어주었다. 적혈구 세포는 \( 1 \% \) 암모니아가 포함된 멸균수로 swollen 후 \( \mathrm{OD}_{550} \) 를 측정하여 정량하였다.</p><h2>통계분석</h2><p>모든 실험은 3회 이상 반복하여 실시하였으며, 실험 결과는 SAS (Statistical Analysis System, SAS Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 one-way ANOVA 분석을 실시하였으며, Duncan의 다범위 검정(Ducan's multiple range test)을 통하여 \( 5 \% \) 수준에서 시료간의 유의적인 차이를 검증하였다.</p>
CPU는 어떻게 정해져?
세포병변효과가 일어나는 추출물 농도 이전의 최대 희석 배율