<h3>Single-strand cDNA 의 oligo (dG) tailing</h3><p>Single-strand cDNA의 oligo (dG) tailing반응을 \( 200 \mathrm{~mM} \) sodium cacodylate, \( \mathrm{pH} 6.9\), \( 1 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2}, 1 \mathrm{~mM} \mathrm{~CoCl}_{2},1 \mathrm{mM} \) 2-mercaptoethanol, \( 100 \mathrm{mM} \) dGTP 및 \( 32 \mathrm{unit} \)의 terminal deoxynucleotidyl transferase (Takara, Japan)가 포함된 용액에서 수행하였다. 시료를 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), 30 분간 반응시킨 후, EDTA를 최종 농도 \( 50 \mathrm{mM} \) 이 되도록 첨가하며 phenol/chloroform 및 chloroform추출을 1 회 수행한 후, \( \mathrm{EtOH} \) 로 침전시켰다.</p><h3>Second-strand cDNA 합성</h3><p>Oligo (dG)가 tailing된 first-strand cDNA를 최종량 \( 60 \mathrm{ul} \)로 반응액을 조성하였다[\( 3 \mathrm{~ul} \)의 second-strand low buffer, \( 3 \mathrm{ul} \)의 second-strand high buffer, 600ng 의 second-strand SacI primer-adapter, \( 0.25 \mathrm{mM} \) dNTP, \( 0.5 \mathrm{mM} \) beta-NADH, \( 15 \mathrm{unit} \)의 Ex Taq DNA polymerase (Takara), \( 150 \mathrm{unit} \)의 Ampligase, DNA ligase, \( 3 \mathrm{unit} \)의 Hybridase, RNase H 포함]. PCR반응은 "hot start"법을 이용하였으며, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 반응시킨 후, \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 분당 \( 0.3^{\circ} \mathrm{C} \) 씩 하강시키면서 primer 회합을 수행하였다. 그 후 반응액은 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15분간 처리후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 연속 반응시켰다. 회합/신장 cycle을 3회 반복한 후 마지막으로 \( 1 \mathrm{ul} \) 의 \( 0,5 \mathrm{M} \) EDTA, \( 1 \mathrm{ul} \)의 \( 10 \%\) SDS 및 \( 2 \mathrm{ul} \) 의 proteinase \( \mathrm{K}(10 \mathrm{ug} / \mathrm{ul}) \) 를 첨가하여, 시료를 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15분간 반응시켰다. 시료를 phenol/chloroform 및 chloroform 추출한 후, EtOH로 침전시켰다.</p><h3>제한효소 절단, Cloning 및 염기서열 결정</h3><p>cDNA를 SalI/XhoI 및 BamHI으로 절단하였다. 시료에 \( 1 \mathrm{ul} \)의 \( 0.5 \mathrm{M} \) EDTA, \( 1 \mathrm{ul} \)의 \( 10 \%\) SDS 및 \( 2 \mathrm{ul} \)의 proteinase K \((10 \mathrm{~ug} / \mathrm{ul}) \) 를 첨가한 후, \( 45 \mathrm{C} \) 에서 15분간 반응시켰다. 시료를 phenol/chloroform 처리하며 Sephadex (G100) chromatography로 분획한 후, ethanol 침 전시켰다. \( 140 \mathrm{ng} \) 의 cDNA를 lambda pFLC-Ⅲ vector에 \( 12^{\circ} \mathrm{C}\), O/N ligation 반응시켰다. 시료를 전기영동 한 agarose gel로부터 lambda arm을 정제하기 위하여 agarase를 이용하였다. Ligation 된 cDNA는 phenol/chloroform 및 chloroform추출 후, phage에 pakaging하였다. Plasmid DNA를 RNase A 처리 후, 추출하였다. DNA 염기서열은 Dye Terminator kit를 이용하여 Applied Biosystem DNA sequences 377로 결 정하였다. DNA hybridization은 \(7\%\) PEG 6000, \(10\%\) SDS, \(100 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) salmon sperm DNA가 포함된 hybri 용액에서 \( 65^{\circ} \mathrm{C}\), O/N 반응시켰다. Hybridization 반응 후, 필터를 \( 2 \times\)SSC 및 \( 0.1 \% \) SDS 용액을 이용하여 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 세척하였다. 염기 서열의 상동성은 BLAST (http://wWw.ncbi.nlm.nih.gov/)를 이용하여 분석하였다.</p>
회합/신장 cycle에서 사용하는 회합방법은?
primer 회합