<h1>결 과</h1><h2>Jurkat T 세포에서 PMA에 의한 LIMK 및 cofilin의 인산화 변화</h2><p>이전 연구에서 RhoA의 활성화는 EL4 T세포의 표면에 microvilli의 형성을 유도하였다. 이것은 Microvilli형성에 small GTPase RhoA가 관여한다는 것을 의미한다. 따라서 RhoA의 하류에 존재하는 신호전달자의 활성화가 microvilli 형성에 미치는 영향을 알아보고자 시도하였다. 여러 문헌 보고에 의하면 RhoA는 Rho-associated kinase (ROCK) 를 활성화 하고 ROCK는 LIMK를 활성화 하며 LIMK는 cofilin의 활성화 조절을 통하여 actin cytoskeleton의 변화를 유도하는 것으로 알려 졌다. 이러한 신호 전달이 Jurkat T cell에서도 영향을 미치는지 확인하였다. RhoA를 직접 활성화 시키는 RhoA 활성제로 알려진 PMA를 처리하여 보았다. Cofilin은 actin depolymer로 작용을 하는데 이것은 LIMK의 작용을 받아서 p-cofilin이 되면 활성이 저해되고 cofilin이 되면 활성화가 되어 actin의 depolymer로 작용하여 F-actin cytoskeleton의 형성을 방해한다. PMA 처리 후 Jurkat T cell에 LIMK의 인산화가 증가하는 것을 확인하였고 cofilin의 경우에도 대조군에 시간 의존적으로 p-cofilin이 증가하는 것을 확인하였다. 이것으로 보아 PMA는 RhoA 및 ROCK를 통해서 인간 T세포에도 LIMK, cofilin의 인산화에 영향을 미치는 것으로 사료되며 이러한 변화가 세포 생물학적 영향을 확인하기위해 microvilli의 변화를 관찰하였다.</p><h2>Jurkat T 세포에서 PMA에 의한 강회된 microvilli formation</h2><p>Fig. 1에서 보았듯이 PMA에 의한 신호전달은 LIMK와 cofilin의 활성에 영향을 미쳤다. 이러한 활성이 microvilli에 나타나는 영향을 관찰하기위해 PMA처리 후 세포의 표면을 SEM을 통해서 관찰 하였다. PMA 처리 후 세포표면에 나타난 microvilli는 대조군과 비교하여 훨씬 크기가 강화된 micovilli가 나타난 것이 관찰되었다. 이것은 p-cofilin의 양의 증가로 상대적으로 F-actin 파괴자인 co-filin의 양이 줄어들어 F-actin의 양이 대조군에 비해 많아졌고 이것이 microvilli의 크기를 강화 시키는데 영항을 미쳤을 것으로 사료된다.</p><h2>Actin cytoskeleton은 microvilli형성에 필요하다.</h2><p>CytD는 F-actin cytoskeleton의 형상을 방해하는 저해제로 actin cytoskeleton이 직접적으로 microvilli의 형성에 관여하는지 학인해 보기 위헤 CtyD를 처리한 Jurkat T 세포의 표면을 SEM으로 관찰하였다. 그 결과 Fig. 3에서 보듯 CtyD 처리 세포 표면에서 microvilli가 사라지는 것을 관찰 할 수 있었다. 이것은 microvilli형성에 있어 cytoskeleton이 필요하다는 것을 의미한다.</p><h2>CytD의 처리는 cofilin의 인산화를 감소시킨다.</h2><p>Fig. 3에서처럼 CytD 처리 후 microvilli가 사라지는 것을 알았는데 이것이 cofilin의 인산화와 관련성을 알아보고자 하였다. Fig. 4에서 보듯이 p-cofilin은 대조군에 비해 시간이 지날수록 인산화가 사라지는 것을 알 수 있었으며 p-cofilin의 감소는 활성 형 cofilin의 상대적 증가를 유도하는 것으로 활성형 cofilin에 의해서 F-actin cytoskeleon의 감소로 이어져 전체적으로 microvilli 형성에 영향을 미쳤을 것으로 사료된다.</p><h2>CytD는 T세포 극성을 사라지게 한다.</h2><p>CytD는 F-actin cytoskeleton의 형성 방해를 통해서 microvilli가 사라지는 것을 알았다. F-actin은 세포의 골격 형성에 기본 근간을 제공하는 것으로 microvilli와 세포 극성 등에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 이러한 극성 형성에 F-actin의 관련성을 알아보기 위해 EL4 T세포를 이용하였다. EL4 T세포 는 전형적으로 극성을 유지하는 세포로 Fig. 5A에서 보듯 세포의 앞 쪽 면에는 다량의 F-actin이 산재해 있으며 극성의 뒤 쪽 면(p-ezrin)에서는 약간의 F-actin이 존재하는 것으로 나타났다. 이러한 극성의 형성 유지는 CytD처리에서 알 수 있듯 세포 극성이 사라지고 round form을 형성하는 T세포를 관찰할 수 있었다. 뒤쪽에 축적되어 있던 p-ezrin은 세포막 전체적으로 확산되는 결과를 가져왔다. P-ezrin의 N-말단 도메인을 통해서 세포막 단백질인 ICAM-1, CD44, CD45 등과 결합하고 C-말단 부분은 F-actin과 결합을 형성하는 단백질인데 CytD에 의해서 F-actin이 분해되어 결과적으로 N-말단만이 세포막 단백질과 결합을 형성하여 세포막으로 확산되어진 것으로 사료된다. 이것은 T 세포의 극성 형성에 F-actin이 필요하다는 것을 의미한다.</p>
RhoA이 활성화되면 EL4 T세포의 표면에서 형성되는 것은 무엇인가?
microvilli