<h1>고 찰</h1><p>본 연구에서는 인체 혈구암 U937 세포를 대상으로 esculetin의 항암기전을 조사하였다. 이를 위하여 먼저 정상배지 및esculetin이 함유된 배지에서 자란 암세포의 증식의 정도 및 형태 변화를 비교하였다. Fig. 1A 및 C에서 알 수 있듯이 esculetin의 처리 시간 의존적으로 암세포의 증식이 감소되었으며, 심한 형태적 변형을 유발하였다. 이러한 증식의 억제 및 형태변화가 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있을 것으로 기대되어 flow cytometry를 이용하여 정량적으로 분석한 결과, Fig. 1B에서와 같이 apoptosis 유발 세포군에 해당하는 sub-G1기에 속하는 세포들의 빈도가 esculetin 처리 시간 의존적으로 증가되어 esculetin 처리에 따른 U937 세포의 증식 억제 및 형태 변화는 apoptosis 유발과 직접적인 연관이 있음을 알 수 있었다.</p><p>한편 미토콘드리아 외막에 존재하는 Bcl-2 family에 속하는 단백질들은 네 가지의 Bcl homology (BH) domains (BH1–BH4) 중 최소한 한 개의 domain을 포함하고 있으며, 미토콘드리아 보존과 미토콘드리아에 의해 유도되는 apoptosis를 조절하는 중요한 조절자이다. 이들 중 대표적인 단백질로는pro-apoptotic 유전자인 Bax와 anti-apoptotic 유전자인 Bcl-2가 존재하는데 이들은 서로 dimer 형태로 결합하여 존재하지만 여러 가지 자극에 의하여 발현 수준에 변화가 유발되면 apoptosis가 일어나는 것으로 알려져 있다. 따라서 esculetin이 Bcl-2 family의 발현에 어떠한 영향을 미치는 지를 조사한 결과, Fig. 2에서와 같이 Bid의 단편화 및 Bcl-2/Bax 결합력의 감소를 유발되어 esculetin에 의한 암세포의 apoptosis 유발에 있어서 Bcl-2 family에 속하는 유전자들의 dimer 형성 균형의 교란이 중요한 역할을 하는 것으로 생각되어진다.</p><p>외재적 경로를 통한 apoptosis에 있어서 죽음의 수용체에 속하는 유전자들 중, TRAIL은 DR4 및 DR5와 결합하고 FasL는 Fas와 결합함으로서 apoptosis를 유발하는 것으로 알려져 있다. 이러한 죽음의 수용체에 속하는 단백질들이 esculetin에 의하여 어떠한 변화가 유발되는지를 확인한 결과, Fig. 3에서와 같이 DR4 및 FasL의 발현이 증가하는 것으로 나타나 esculetin에 의한 apoptosis 유발은 외재적 경로가 어느 정도 관여하는 것으로 생각되어진다. Apoptosis 유발에 있어서 effector caspase인 caspase-3은 apoptosis의 최종 단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데, 전사 조절인자인 nuclear factor kappa B (NF-\(\kappa\)B)에 의해 조절 받는 것으로 밝혀진 IAP family에 속하는 유전자들 중 일부는 caspase-3과 직접적인 결합을 통하여 이들의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한 caspase-3이 활성화되면 세포의 생존에 필요한 여러 기질 단백질들을 분해시킴으로서 apoptosis가 유발되는데, 대표적인 기질 단백질인 \(\beta\)-catenin은 세포내 골격의 유지와 다양한 부착성 세포의 전사 조절에 중요한 역할을 하며 정상 세포의 경우 \(\beta\)-catenin은 \(92 \mathrm{kDa}\)의 분자량을 가지나 apoptosis가 일어나면 \(62-72 \mathrm{kDa}\)로 단편화가 일어난다. 또 다른 기질 단백질로는 DNA 단편화에 관여하는 DFF40/CAD와 DFF45/ICAD가 존재하는데 이들은 서로 복합체를 형성하고 있으며, apoptosis가 유발되면 caspase-3에 의하여 ICAD의 두 군데 Asp 잔기에서 단편화가 일어나는 것으로 알려져 있다. 따라서 esculetin이 IAP family 및 caspase-3 기질 단백질의 발현에 어떠한 영향을 미치는지를 조사한 결과, Fig. 4에 나타난 바와 같이 XIAP의 발현이 esculetin 처리시간 의존적으로 감소하였고, caspase-3 기질 단백질인 β-catenin 및 DFF45/ICAD의 단편화 현상이 유발되어, esculetin에 의한 apoptosis에 있어서 caspase-3의 활성 증가가 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 따라서 caspase-3의 활성을 인위적으로 억제하였을 경우 esculetin에 의한 apoptosis가 억제되는지를 조사한 결과, esculetin에 의해 증가된 sub-G1의 비율이 caspase-3 inhibitor인 z-DEVD-fmk 선 처리에 의하여 현저하게 억제되었으며, 이러한 결과는 형태 변화 및 caspase-3 기질 단백질들의 발현 변화도 억제하는 것으로 나타나, esculetin에 의해 유발되는 apoptosis는 caspase-3이 중요한 조절자로서 작용한다는 것을 알 수 있었다.</p><p>이상의 결과에서 esculetin에 의한 인체 혈구암세포인 U937 세포에서의 증식억제 및 형태 변화는 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있었으며, 이러한 apoptosis 유발에는 죽음의 수용체, Bcl-2 family 및 IAP family의 발현 변화와 그에 따른 caspase-3의 활성화에 의한 기질 단백질들의 단편화 현상과 직접적인 연관성이 있음을 알 수 있었다. 본 연구의 결과는 esculetin의 생화학적 항암기전과 연관된 실험의 기초 자료로서 그 가치가 매우 높을 것으로 생각된다.</p>
FasL는 Fas와 결합해 무엇을 유발하는가?
apoptosis