<h2>Norovirus 검출</h2><p>농축된 시료에서의 norovirus 검출은 국립환경과학원의 지하수 중 norovirus 관리 매뉴얼에 따라서 실시하였다. 140 pl의 최종 농축시료에서 Viral RNA Mini Kit를 이용하여 바이러스의 핵산을 추출하였다. GI 및 GII형의 핵산 검출에 필요한 primer는 기존 문헌에 따라서 제작하였다. 5씨의 RNA를 \( 10 \mathrm{pmol} \) 의 GI-R1M 혹은 GII-R1M과 AccuPower RT Premix 를 섞어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 동안 cDNA를 합성하였다. 5\( \mu 1 \) 의 cDNA, \( 10 \mathrm{pmol} \)의 primer 그리고 \( 2 \times \mathrm{PCR} \) premix 를 섞어 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 30 \mathrm{sec}, 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 30 \mathrm{sec}, 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 45 \mathrm{sec} \) 조건으로 30 cycle의 1차 PCR을 실시하였다. 이때 norovirus GI 의 검출을 위한 primer로는 GI-F1M/GI-R1M을, norovirus GII의 검출을 위한 primer로는 GII-F1M/GII-R1M를 각각 이용하였다. \( 5\mu \mathrm{l} \)의 PCR 산물을 주형으로 하여 GI은 GI-F2/GI-R1M, GII는 GII-F3M/GII-R3M primer를 각각 \( 10 \mathrm{pmol} \) 씩 이용하여 위와 동일한 방법으로 nested reverse transcription (RT)-PCR을 실시하여 norovirus 양성 여부를 판정하였다. 최종 PCR 산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel에 전기영동시켜 QIAquick Gel Extraction Kit로 정제하여 Solgent사에 염기서 열분석을 의뢰하여 바이러스의 염기서열을 결정하였다.</p><h2>계통분류학적 분석</h2><p>Norovirus의 염기서열은 NCBI의 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/)에 등록된 바이러스 유전자 데이터베이스와 비교하여 최종 판정하였다. 계통분류학적 분석은 Clustal W (http://WWW.ebi.ac.uk/Tools/ msa/clustalw2/)를 이용한 multiple alignment를 수행하였으며, MEGA (ver.4.0)를 이용하여 계통수를 작성하였다. 계통수의 추정방법에는 Neighbor-joining법이 사용되었다. 부트스트랩(bootstrap) 값은 1,000 으로 설정하였다.</p><h2>통계분석</h2><p>norovirus 검출률과 이화학적 수질인자 및 지표 박테리아들과의 상관관계는 SPSS software를 이용한 chi-square test로 분석하였다. 이때 신뢰한계는 \( p<0.05 \) 로 설정하여 통계적 유의성을 결정하였다.</p>
norovirus GII의 검출을 위한 primer로는 무엇을 이용하였나?
GII-F1M/GII-R1M