<h2>ROS 생성량 측정</h2><p>HaCaT 세포에 복분자 씨앗 추출물을 농도별로 처리했을 때 ROS의 생성량을 측정하기 위해 96-well white plate에 각 well 당 \( 2 \times 10^{5} \mathrm{cells}/\mathrm{well} \)세포가 되도록 심어준 후 24 시간을 안정화하였다. 이후, 배양된 배지를 제거하고 복분자 씨앗 추출물을 농도별로 처리한 후 24 시간 배양하였다. 그 후 제조사의 매뉴얼에 따라 ROS Glo \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) assay를 수행하였다.</p><h2>Prostaglandin \(E_{2}\) \({PGE}_{2}\) 생성량 측정</h2><p>세포배양액 내의 \( {PGE}_{2} \) 생성량은 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM배지를 이용하여 \( 5 \times 10^{4} \mathrm{cells}/ \mathrm{mL} \) 로 조절한 후 12 well plate에 접종하고, \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24 시간 배양하였다. 세포에 1\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 LPS 를 처리 한 뒤 1 시간 후에 \( 5,10,25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 복분자 씨앗 추출물을 처리하여 24 시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 상등액을 취하여 \({PGE}_{2}\) 를 측정하였다.</p><h2>RNA 분리 및 mRNA 발현 측정</h2><p>RNA는 UVB와 IFN- \( \gamma\)/TNF\(\mathrm{}-\alpha \) 를 조사한 후 24 시간 뒤에 TRI-solution \({}^{TM}\) (BioScience Technology)시약을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 분리하였다. \( 5 \times 10^{5} \) 세포에 \( 1 \mathrm{~mL} \) 의 Trizol 시약을 넣고 세포를 용해시켜 상온에 5 분간 방치한 후, 여기에 0.2 \( \mathrm{mL} \) 의 chroloform을 추가하고 잘 혼합한 후 13,000\( \mathrm{rpm} \) 로 10 분간 원심 분리하였다. 분리된 RNA는 diethyl procarbonate가 첨가된 증류수에 용해시킨 후 ELISA reader로 RNA purify를 측정한 뒤, 260\( \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하고 농도를 정량하여 실험에 사용하였다. cDNA 합성은 GoScript \({}^{TM}\) Reverse Transcriptase를 사용하여 합성하였으며, PCR은 \( \mathrm{GoTaq}^{\circledR} \) Flexi DNA Polymerase와 각각의 primer를 이용하여 실험하였으며, 실험에 사용된 primer 염기서열은 Table 1과 같다.</p><h2>Western blot을 이용한 단백질의 발현 측정</h2><p>COX-2, filaggrin 활성을 보기 위하여 HaCaT 세포를 6-well plate에 각 well당 \( 5 \times 10^{5} \) cells/well이 되도록 seeding 후 24 시간동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 복분자 씨앗 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24 시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척한 뒤, RIPA buffer를 이용하여 HaCaT세포를 분해하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 정량하여 20\( \mu \mathrm{L} \) 의 단백질을 10\( \% \) 의 SDS-PAGE gel에서 전기 영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (\(5\%\) skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. COX-2와 filaggrin protein 각각의 1차 항체를 \(1: 1,000\)으로 희석하여 4\( ^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 over night한 다음, 다시 10 분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 mouse anti-rabbit IgG HRP의 각각의 2 차 항체를 \(1: 1,000\)로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 3회 washing한 뒤 LAS 4,000 image analyzer (Fugifilm life science, Tokyo, Japan) 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량 하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>결과 통계처리는 SPSS 12.0 을 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(ANOVA: analysis of variance)프로그램을 이용하여 t-test를 이용하여 통계적 유의수준 \( p<0.01,0.005,0.001 \) 에서 검증하였다.</p>
통계적 유의수준은 \( p<0.01,0.005,0.001 \) 에서 검증하였나요?
YES