<h1>재료 및 방법</h1><h2>토양미생물의 분리 및 동정</h2><p>유기물이 풍부한 토양에서 수집한 토양 시료를 멸균된 생리식염수 \( (0.85 \%\) \(\mathrm{NaCl}\), \(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 로 희석한 후 nutrient agar 배지를 사용하여 평판 도말법으로 미생물을 분리하였다. Gram 염색 및 광학 현미경을 통하여 균주의 형태적 특성을 관찰하였으며, glucose fermentation test, catalase test, oxydase test, 그리고 casein hydrolysis test 등과 같은 생화학적 검사를 통하여 분리한 미생물의 기초적인 특성을 확인하였다. 분리한 균주의 동정은 미생물의 생육정도에 따른 탄소원의 이용도를 비교하여, Bacillus 속 균주를 동정하는 API-50 CH/B kit (bioMerieus Co., France)를 사용하였다.</p><h2>배지 및 시약</h2><p>분리한 균주의 생육 및 고분자 중합체를 생산하기 위한 배지의 조성은 \( 5.0 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\) \(\mathrm{K}_{2}\mathrm{HPO}_{4} \), \( 1.0 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\) \(\mathrm{NaCl} \), \(0.2 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(0.6 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\), \((\mathrm{NH}_{4})_{2}\) \(\mathrm{SO}_{4} \) 와 \( 2.5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) yeast extract 이었다. 배지의 탄소원은 \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 의 포도당을 사용하였으며 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 별도로 멸균한 후 배지에 첨가하였다.</p><p>배지에 사용한 시약 및 Gram 염색 시약들을 비롯하여 glucose fermentation test, catalase test, oxydase test, 그리고 casein hydrolysis test용 시약 및 가스 크로마토그라피 분석용 시약 등은 Sigma사 (Sigma Chemical Co., USA)에서 구입하여 사용하였다. 균주의 생육을 위한 유기질소원으로써 이용성을 알아보기 위해 사용한 간장박은 간장의 대량 생산과정에서 발생하는 부산물로써 (주)오복식품에서 수급하여 본 실험에 사용하였으며, 간장박의 주요 구성성분은 탄수화물 (약 \( 17 \% \))과 단백질 (약 \( 33 \% \))이었다.</p><h2>고분자 중합체의 생산</h2><p>고체 배지에서 자란 균주의 콜로니를 한 백금이 취하여 \( 250 \mathrm{~m} \mathrm{l}\) 플라스크에 멸균시킨 \( 50 \mathrm{~m} \mathrm{l} \) 의 배양액에 접종한 후, \( 200 \mathrm{rpm} \) 의 교반 속도로 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 동안 진탕 배양하였다. 탄소원의 농도는 \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 이었으며, 초기 배양액의 \( \mathrm{pH} \) 는 멸균 전에 6.5~6.8로 조절하였다.</p><p>본 배양은 전 배양과 동일한 배지를 사용하였으며, \( 500 \mathrm{m} \mathrm{l} \) 플라스크에 멸균시킨 \( 100 \mathrm{~m} \mathrm{l} \) 의 배양액에 전 배양액을 \( 5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 농도로 접종하여 전 배양과 동일한 조건으로 배양을 실시하였다. 배지의 초기 \( \mathrm{pH} \) 는 멸균 전에 6.8로 조절하였고, 실험 목적에 따라 탄소원 및 질소원은 그 조성과 농도의 조건을 달리하여 실험하였다.</p><p>고분자 중합체의 대량생산은 \( 7 \mathrm{l} \) 생물배양기를 사용하여 실시하였다. 초기 \( \mathrm{pH} \) 를 6.8로 조절한 \( 5 \mathrm{l} \) 의 배지를 \( 7 \mathrm{l} \)생물배양기에 주입하고 멸균한 후 전 배양액을 \( 5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 농도로 접종하였다. 배양온도는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 이었으며 통기량과 교반속도는 각각 \( 1.0 \mathrm{vvm} \) 과 \( 500 \mathrm{rpm} \) 이었다. 5 일간 회분식 배양하면서 일정한 시간마다 무균적으로 배양액을 취하여 배지의 \( \mathrm{pH} \), 균체의 건조중량 및 생물고분자의 생산량을 측정하였다.</p><p>일정시간 배양된 균주의 배양액을 \( 8,000 \times \mathrm{g} \) 로 20분 동안 원심 분리하여 균체를 제거한 상등액에 2배의 isopropyl alcohol을 첨가하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 의 온도에서 12시간 동안 방치하였다. 이후 동일한 조건으로 원심분리를 실시하여 상등액을 제거하고 침전된 물질에 일정한 부피의 isopropyl alcohol을 재 첨가 후 voltex mixer를 사용하여 섞어주었다. 본 과정을 2회 반복 실시하여 고분자 중합체를 세척하고, 다시 증류수에 녹인 다음 dialysis membrane (Spectrum Co., USA)을 이용하여 저분자물질과 염 성분을 제거한 후, \( -55 \) \( { }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 0.06 \mathrm{mTorr}\)의 진공압력으로 24시간동안 동결건조를 실시하였다.</p><h2>고분자 중합체의 조성당 측정</h2><p>토양에서 분리한 미생물이 생산한 고분자 중합체의 구성물질을 가스 크로마토그라피를 사용하여 확인하였다. 표준 시료를 포함한 시료의 전처리 과정은 \( 0.5 \mathrm{mg} \) 의 시료에 methanol과 acetyl chloride를 20:1\((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 비율로 혼합 한 용매를 \( 300 \mu \mathrm{l} \) 을 가하고 교반 하면서 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 동안 방치한 후, \( t \)-buthanol \( 30 \mu \mathrm{l} \) 을 첨가하여 분해반응을 정지시켰다. 실온에 30 분간 방치시킨 후, 질소 가스를 이용하여 시료를 건조하고, \( 100 \mu \mathrm{l} \) 의 Tri-Sil Z (Pierce Co., USA)를 가하여 실온에 2시간 방치한 뒤에 분석하였다. 분석에 사용된 기종은 HP 5890 series II (Hewlett Packard Co., USA)이었으며, 검출기는 flame-ionization을 사용하였고, HP 7673 injector를 사용하여 시료를 주입하였다. 사용한 컬럼은 \( 5 \% \) 의 phenylmethyl siliconed로 표면에 처리된 실리카 컬럼 (Supelco, Bellefont, Pa)으로 크기는 \( 30 \mathrm{~m} \times \) \( 0.32 \mathrm{~mm} \) 이었다. 운반가스는 산소가 제거된 질소가스를 사용하였으며 유속은 \( 2.9 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 이었다. 분석 온도는 \( 140^{\circ} \mathrm{C} \)에서 분당 \( 7^{\circ} \mathrm{C} \) 씩 상승시켜 \( 260^{\circ} \mathrm{C} \) 까지의 범위에서 분석하였다.</p><h2>고분자 중합체의 분자량 측정</h2><p>Gel permeation chromatography (GPC)를 사용하여 토양에서 분리한 균주가 생산한 고분자 중합체의 분자량 측정하였다. TSL PW XL 컬럼 (Viscotek, USA)을 장착한 Vis-coteck 사(USA)의 GPC를 사용하여 분석하였으며 RI detec-tor를 사용하여 분자량을 측정하였다. 이동 상으로 \( 1.0 \mathrm{ml} / \) \( \mathrm{min} \) 유속의 증류수를 이용하였고, 시료의 농도는 \( 5.0 \mathrm{mg} / \) \( \mathrm{ml} \) 이었으며 주입 전에 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) (pore-size) filter로 거른 후, 1 회 분석에 \( 100 \mu \mathrm{l}\) 를 주입하였다. 표준 곡선은 분자량 \( 5.8 \times 10^{3} \) 에서 \( 1.0 \times 10^{6} \) 까지의 pullulan (Sigma Co., USA)을 사용하여 작성하였다.</p><h2>균체량의 측정</h2><p>건조균체량은 일정시간 배양한 배양액을 \( 8,000 \times \mathrm{g} \) 로. 20분간 원심분리하여 상등액을 제거한 침전물을 배양액과 동일한 부피의 증류수를 사용하여 2회 세척한 후, \( 105^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 동안 건조하여 측정하였다.</p>
시료를 어디에서 수집했어?
토양