<h2>MTT assay</h2><p>MTT assay는 Sladowski 등의 방법에 따라 실행하였다. 즉, 간세포를 베양시킨 96-well plate에 MTT를 총 용량의 \( 10 \% \)가 되도록 넣고, 4시간 배양시킨 다음 원심분리 (\(80 \times \mathrm{g}, 10 \mathrm{~min} \))하였다. 그 후, 배지를 제거하고 EHH : DMSO(dimethyl sulfoxide)가 \( 1: 1~(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)인 용액을 150 \( \mu l \)씩 넣고 20분간 shaking한 다음, 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 mitochondrial dehydrogenase에 의해 MTT dye [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]가 blue formazan을 형성하는 것을 Enzyme-Linked Immuno-sorbent Assay (ELISA) reader로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Catalase 활성에 미치는 가수분해물의 효과</h2><p>배양세포내 catalase 활성도는 Aebi의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 먼저 \( 50 \mathrm{~mM} \) phosphate buffer \((\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}- \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, \mathrm{pH} 7.0\))로 희석 시킨 세포부유액 \( 2 \mathrm{ml} \)에 \( 30 \mathrm{~mM} ~\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)용액 \(1\mathrm{~ml}\)를 첨가하여 \( 240 \mathrm{~nm} \)에서 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)분해에 따른 흡광도의 감소를 측정하였다. 효소의 활성도는 1분동안 분해된\(1~\mu\mathrm{mole}\)의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 \(1 \mathrm{~unit}\)로 정의하였고 단백질 \( 1 \mathrm{~mg} \)을 기준으로 하여 표기하였다.</p><h2>Superoxide dismutase (SOD) 활성에 미치는 가수분해물의 효과</h2><p>배양세포내 superoxide dismutase 활성도는 Oyanagui와 Oberley 등의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, \( 50\mathrm{~mM} \) phosphate buffer \( \left(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{11}-\mathrm{Na}_{2} \mathrm{FPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\right. \), \(\mathrm{pH}~7.8\))로 희석시킨 세포부유액 \( 0.1 \mathrm{~ml} \)에 반응혼합액 \( [1.333 \mathrm{~mM} \) diethylene triamine pentaacetic acid (DETAPAC) \( 13.0 \mathrm{~ml} ~40 \mathrm{~units} /\mathrm{ml}\) catalase \(0.5 \mathrm{~ml}, ~2 \mathrm{~mM} \) nitro blue tetrazolium (NBT) \( 0.5 \mathrm{~ml}, ~1.8 \mathrm{~mM} \) xanthine \( 1.7 \mathrm{~m} \)와 \( 0.33 \mathrm{~M}~ \mathrm{NaCN} ~0.3 ~\mathrm{ml} \)가 \( 50 \mathrm{~mM} \) phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} ~7.8\))에 녹아있는 용액] \( 0.8~ \mathrm{ml}\)를 가한다. 이 혼합액에 \( 0.01 \mathrm{~U} / \mathrm{ml} \) XOD (xanthine axidase)를 \( 0.1 \mathrm{~ml} \) 가한 후, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간 배양시킨 다음 \( 560 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성도는 cytochrome C의 최대 환원을 \( 50 \% \) 저지하는 SOD의 량을 \(1 ~\mathrm{unit}\)로 정의하였고, 단백질 농도를 기준으로 하여 SOD의 \(\mathrm{unit}\)를 표기하였다.</p><h2>Glutathione (GSH) peroxidase 활성에 미치는 가수분해물의 효과</h2><p>배양세포내 glutathione peroxidase 활성도는 Paglia 및 Valentine과 Lawrence 및 Burk[11]의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, \( 50 \ mathrm{~mM} \) potassium phosphate buffer \( \left (\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} - \right. \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, ~ \mathrm{pH} ~ 7.0\))로 희석시킨 세포부유액 \( 0.1 \mathrm{~ml} \)에, 반응혼합액 [ \( 1 \mathrm{~mM}\) ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), \(1 \mathrm{~M} ~ \mathrm{NaN}_{3}, ~0.2 \mathrm{~mM} \) nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), \( 1 \mathrm{~unit} / \mathrm{ml}\) oxidized glutathione-re-ductase (GSSG-reductase) 및 \( 1 \mathrm{~mM} \) GSH가 \( 50 \mathrm{~mM} \) potas-sium buffer \(( \mathrm{pH} ~ 7.0\)) \(1 \mathrm{~ml}\)에 녹아 있는 용액】 \( 0.8 \mathrm{~ml}\)를 넣고, \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 배양시킨 후, \( 2.2 \mathrm{~mM} ~ \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)용액 \( 0.1 \mathrm{~ml} \)를 첨가하여 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서의 NADPH 흡광도 감소를 측정하였다. 효소의 활성도는 단백질 \( \mathrm{mg} \)당 1분간 산화되는 NADPH \( \mathrm{nmole} \)로 표기하였다.</p><h2>Glutathione-S-transferase (GST) 활성에 미치는 가수분해물의 효과</h2><p>배양세포내 glulathione-S-transterase 횔성도는 Habig 등과 Schooder 등의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, \( 0.1 \mathrm{~M} \) potassium phosphate buffer \( \left( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}-\mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\right. \), \( \mathrm{pH} ~ 6.5\))로 희석시킨 세포부유액 \( 0.1 \mathrm{~ml} \)에 \( 0.1 \mathrm{~M} \) potas-sium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} ~6.5\)) \( 1.2 \mathrm{~ml} \)를 가하고 reduced glutathione (GSH), 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB)가 전체부피에 대해서 각각 \( 1 \mathrm{~mM} \)이 되게 첨가한 후, 흡광도\((340 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 효소 활성도는 단백질 \( \mathrm{mg} \)당 1분간 conjugate되는 CDNB의 \( \mathrm{nmole} \)로 정의하였다.</p><h2>단백질 정량</h2><p>배양세포의 단백질 정량은 Smith 등의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, bicinchomimic acid protein kit를 이용하여 bovine serum albumin을 표준단백질로 사용하여 표준검량선으로부터 그 양을 산출하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>본 실험에서 얻은 실험군간의 결과에 대하여 student's t-test를 설시하여 유의성 여부를 검증하였고, \( \mathrm{p} \)값이 0.05이하인 경우에 유의성을 인정하였다.</p>
MTT assay에서 EHH : DMSO(dimethyl sulfoxide)의 비율이 몇인 용액을 사용하나요?
\( 1: 1~(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)