<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주, 배지 및 배양조건</h2><p>E. coli DH5\(\alpha\)(recA1 endA1 gynA96 thi1 halRI7 supE44 relA1 lacZM15)는 재조합 DNA 조작을 위한 숙주세포로써 사용되었고, 효모. S. cerevisiae EBY100(MATa ura3-52 trp1 leu2-1 his3200 pep4::HIS3 prb11.6R can1 GAL1)은 endoxylanase 표면발현을 위한 숙주세포로 사용되었다. E. coli 는 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) ampicillin을 포함하는 LB 배지 \( (1 \% \) Bacto-tryptone, \( 0.5 \% \) Bacto-yeast extract, and \( 0.5 \% \mathrm{NaCl}) \)에서 배양하였고, 효모 형질전환체의 선별과 전 배양을 위해 YNBCAD \( (0.67 \% \) yeast nitrogen base without amino acids, \( 2 \% \) glucose, and \( 0.5 \% \) casamino acids) 배지를 사용하였다. Colony 활성염색을 위한 형질전환체 배양과 플라스크 배양은 YPDG(\(1\%\) yeast extract, \(2\%\) Bacto-peptone, \( 1 \% \) glucose, and \( 1 \% \) galactose) 배지를 사용하였다. Flask 배양은 \( 500 \mathrm{~mL} \) baffled flask(working volume: \( 50 \mathrm{~mL} \) )로 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(200 \mathrm{rpm}\)에서 수행하였다.</p><h2>표면발현 plasmid의 구축 및 형질전환</h2><p>Bacillus sp. 유래 endoxylanase 유전자(xynB; 642 bp; 213 amino acids; GeneBank access code U5167)는 pAEDX-1을 template로 사용하여 PCR 증폭하였다. 두 개의 primers는 sense primer로 5 '-ACGGCTAGCATGTTTAAGTTAAAAAGAAATTCTTAGI-3' 그리고 anti-sense primer를 5'-ACGGGATCCTTACCACACAGTTACATTAGAACTTC-3을 제작하였다. Sense primer 부위에는 NheI 제한효소 인식부위를 가지며, anti-sense primer에는 BamHI 제한효소 인식부위를 가지고 있다. PCR 증폭 후 xynB는 NheI와 BamHI 제한효소로 처리하여 효모 표면발현 벡터인 pCTcon에 subcloning하여 재조합 plasmid pCTXYN\((6.8 \mathrm{~kb}) \)을 구축하였다. 구축된 재조합 plasmid는 E. coli DH5\(\alpha \)에서 증폭, 추출하여 EZ-Yeast Transformation Kit(BIO101, Vista, CA, USA)를 사용하여 효모 숙주세포 S. cerevisiae EBY100에 형질전환하였다.</p><h2>균체농도, 잔존환원당 및 plasmid 안정성</h2><p>균체농도는 일정시간마다 채취한 배양액을 적당한 비율로 희석하여 분광광도계 (Simadzu UV-160A, Japan)를 사용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 탁도 \( \left(\mathrm{OD}_{600}\right) \)로 측정하였다. 배양액을 \( 3,000 \times \mathrm{g} \)에서 5분동안 원심분리한 후 배양 상등액을 얻고, dinitro-salicylic acid 방법을 사용하여 잔존환원당 (포도당 \(+\) 갈락토스) 농도를 측정하였다. Plasmid 안정성은 배양액을 YPD 평판배지에 도말한 후 자란 colony를 선별배지인 YNBCAD 배지로 toothpicking한 다음 형성된 colony수의 비(백분율)로 측정하였다.</p>
E.coil는 LB 배지에서 배양되었는데 LB 배지가 포함하는 물질은 무엇인가?
Bacto-tryptone