<h2>\( \mathrm{NO} \) 및 \( \mathrm{PGE}_{2} \) 측정</h2>

<p>RAW\( 264.7 \) 세포를 이용하여 \( 5 \times 10^{5} \) cells/well 농도로 \( 48 \) well
plate에 분주하고 \( 12 \)시간 배양하였다. ALM\( 16 \)을 각 농도별로 \( 3 \)시간 전처리 한 후, LPS (\(1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)를 \( 24 \)시간 처리하였다. 세포배양액으로 분비된 \( \mathrm{NO} \)의 양은 Griss 시약 \( (0.1 \% \) N-(\( 1 \) naphathyl)-ethylenediamine, \( 1 \% \) sulfanilamide in \( 5 \% \) phosphoric acid)을 사용하여 측정하였다. 세포의 상층액 배지와 Griess 시약을 \( 1: 1 \)로 혼합하여 차광상태에서 \( 10 \)분간 반응시킨 후 ELISA microplate reader를 사용하여 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으
며, sodium nitrite를 이용하여 표준곡선을 작성하여 \( \mathrm{NO} \) 함량을 계산하였다. 세포 배양액으로 분비된 \( \mathrm{PGE}_{2} \)의 양은 \( \mathrm{PGE}_{2} \) enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) kit (R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 측정하였다.</p>

<h2>Pro-inflammatory cytokines 분비량 측정</h2>

<p>세포 배양액 내의 cytokine의 양을 측정하기 위하여 RAW\( 264.7 \) 세포를 \( 48 \) well plate에 \( 5 \times 10^{5} \) cells/well로 분주하여 배양하였다. 이후 ALM \(16 \)을 농도별로 \( 3 \)시간 전처리하고, LPS (\(1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)를 처리하여 \( 24 \)시간 동안 배양하였다. 세포의 상층액 배지 \( 100 \mu \mathrm{L} \)를 취하여 IL-\(1 \beta \), IL-\( 6 \), TNF- \( \alpha \) 분비량을 ELISA assay kit (R&D system)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 측정하였다.</p>

<h2>NF-\( \kappa\)B DNA-binding activity 측정</h2>

<p>RAW\( 264.7 \) 세포에 protease inhibitor cocktail Ⅰ (EMD Biosciences)과 \( 1 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)를 첨가한 PER-Mammalian protein extraction buffer (1:20, w/v) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 첨가하여 균일화한 후, \( 14,000 \times g, 4^{\circ} \mathrm{C}, 5 \) 분간 원심분리 하였다. 침전물은 PBS로 세척 한 후 \( 150 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NaCl}\), \( 1 \% \) NP-\( 40 \), \( 0.05 \%\) sodium deoxcholate, \( 0.1 \% \) SDS, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} \) 7.4), \( 50 \mathrm{mM} \) glycerophosphate, \( 20 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NaF}\),
\( 20 \mathrm{mM}\) ethylene glycol tetraacetic acid, \( 1 \mathrm{mM} \) dithiothreitol, \( 1 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{Na}_{3} \mathrm{VO}_{4} \), protease inhibitors를 포함한 RIPA buffer를 첨가하여 혼합한 후, \( 16,000 \times g, 4^{\circ} \mathrm{C}, 5 \)분간 원심분리 하여 핵 분획물(Nucleus fraction)을 얻었다. 핵 분획물의 NF-\( \kappa \)B DNA-binding activity는 NF-\( \kappa \)B (p\( 65 \)) Transcription Factor Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 제조업체의 지침에 따라 측정하였다.</p>


<h2>Western blot 분석</h2>

<p>RAW\( 264.7 \) 세포에 protease inhibitor mixture ( \( 0.1 \mathrm{mM} \) PMSF, \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) aprotinin, \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) pepstatin A, \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) chymostatin)가 포함된 \( 20 \mathrm{mM} \)의 Tris-HCl 완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 7.4)을 첨가한 후, \( 16,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C}, 15 \) 분간 원심분리하여 상등액만을 얻었다. 각 시료의 단백질은 Bradford assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량하였고, \( 7.5 \% \) 와 \( 12 \% \) sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis에서 분리시킨 후 Hybond enhanced chemiluminescence (ECL) nitrocellulose membrane (Bio-Rad)에 transfer하였다. Membrane을 \( 5 \% \) 무지방유(skim milk)가 포함된 blocking 완충액에서 blocking 하였다. 각 단백질에 특이적인 \( 1 \)차 항체로 반응시킨 후, \( 2 \) 차 항체로 반응시켰다. 이후 ECL 용액(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway, NJ, USA)으로 반응시킨 후, X-ray film에 감광하여 현상하였다. Band intensity는 Image J (Wayne Rasband,Bethesda, MD, USA)를 이용하여 측정하였다.</p>

<h2>통계처리</h2>

<p>본 실험의 결과는 means \( \pm \mathrm{SD} \) 로 나타내었고 \( (n=3) \), Graph-pad
prism (Ver 5.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 ANOVA 분산분석과 Tukey's multiple comparison test로 유의성 검정을 시행하였다 \( (p<0.05) \).</p>
\( \mathrm{PGE}_{2} \) 측정법에 사용한 세포주의 이름은 무엇인가요?
RAW\( 264.7 \)