<h1>연구방법</h1><h2>시약 및 세포주</h2><p>Fetal bovine serum, antibiotic, 세포배양 접시는 BioClone, Sigma, Falcon사로부터 각각 구입하였다. PCR primer는 Cosmo사로부터 제작하여 사용하였으며, trichostatin A는 Sigma-Aldrich사로부터 구입하여 사용하였다.</p><h2>세포 배양 및 trichostatin A 처리</h2><p>Mouse C2C12 myoblast 세포는 \( 10 \% \) FBS, \( 100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)의 페니실린 G, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) streptomycin sulfate를 함유하고 있는 Dulbeccco's Modified Eagles' Medium(DMEM)을 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\left(5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \)의 incubator에서 배양하였다. 세포는 6 wells plate에서 배양하였으며, 각각의 \( 30 \mathrm{~mm} \) well에 \( 2 \mathrm{mI} \) 당 \( 2 \times 10^{4} \) 세포를 분주하고 24시간 후 여러 가지 농도 \( (0, 8, 16, 31.3, 62.5, 125 \mathrm{nM} \) )의 trichostatin A을 처리하여 3일 동안 배양하였다. Trichostatin A 처리 시간에 따른 세포 형태와 유전자 발현의 변화를 살펴보기 위하여 세포를 \( 2 \mathrm{ml} \) 당 \( 2 \times 10^{4} \) 세포를 분주하고 24시간 후 \( 62.5 \mathrm{nM} \) 의 trichostatin A를 24, 48, 72시간 동안 처리한 후 대조군과 비교하였다. 모든 실험은 똑같은 조건의 세포 3 세트를 구성하여 실시하였다.</p><h2>Immunofluorescent staining</h2><p>C2C12 myoblast 세포를 6 wells 배양 plate에 고정시키기 위하여 \( 3.7 \% \) formaldchyde(pH 7-8)를 함유하고 있는 PBS \( 1\mathrm{ml} \)를 각각의 well에 10분간 처리하였다. 그 후 PBS 용액으로 고정된 세포를 헹군 후 \( 0.2 \% \) trinton X-100과 \( 10 \% \) goat serum을 포함하고 있는 PBS로 상온에서 15분간 처리하여 세포를 permeabilization했다. 다음은 C2C12 myoblast 세포에 mouse IgG monoclonal smooth muscle \( \alpha \)-actin primary 항체 (Sigma, St. Louis, MO)를 1:1000 비율로 회석시킨 \( 600 \mu \mathrm{l} \) 의 PBS를 각각의 well에 상온에서 30분간 배양시켰다. 다음 세포는 PBS로 3번 씻어낸 후 1:250 비율로 희석된 Alexa488-conjugated goat anti-mouse IgG secondary 항체(Molecular Probes, Eugene, OR)로 상온에서 30분간 더 배양하였다. 마지막 단계로서 세포를 PBS로 3번 헹군 후 핵의 변화를 살펴보기 위하여 \( 1.5 \mu \)\( \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 \( 4^{\prime}, 6 \)-diamidino-2phenylindole(DAPI)를 이용하여 세포를 염색한 후 PBS로 3번 헹궈내었다. 세포 배양 plate상에서의 smooth muscle \( \alpha \)-actin protein 단백질의 발현 정도는 디지털 이미지 체계를 갖춘 Axiovert 200 epifluorescence 현미경(Zeiss, Germany)을 이용하여 사진 촬영을 하여 관찰하였다.</p><h2>Total RNA 추출과 complementary DNA(cDNA) 합성</h2><p>대조군과 trichostatin A로 처리된 세포를 RNeasy RNA extraction kit(Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 추출하였다. 그 다음 추출된 RNA를 ultrapure water에 용해시킨 후 ultra-violet(UV) \( 260 \mathrm{~nm} \)에서 농도를 측정하였다. cDNA는 \( 0.5 \mu \mathrm{g} \)의 total RNA와 first strand cDNA synthesis kit (Roche)을 이용하여 합성하였다. cDNA 합성조건은 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분, \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60분, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분순으로 진행되었고, final vol-ume은 \( 20 \mu 1 \)로 하였다.</p><h2>Real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR)</h2><p>Transgelin, smooth muscle a-actin, p21, cyclin D1 mes-senger RNA(mRNA) 발현을 측정하기 위하여, double-stranded DNA dye인 SYBR Green(Perkin Elmer, Boston, MA)을 이용하여 fluorescence real-time PCR을 실시하였다. PCR 조건은 총 4 단계로 구성되어 있으며, 1 단계는 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \), 2분으로 1 cycle이며, 2 단계는 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \), 10분이며, 3 단계는 총 30 cycles의 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \), 15초와 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \), 1 분으로 구성되었다. 마지막 단계에서는 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20초, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \), 15초로 구성되었다. 본 실험에서 사용한 primer sequences는 표 1에 나타난 바와 같다. SYBR Green 분석은 ABI PRISM 7700 system(PE Applied Biosystems)을 이용하였으며, 모든 샘플은 최소한 2회 이상 반복 측정하였으며, 각각의 target mRNA의 발현은 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) mRNA양으로 보정하였다.</p><h2>자료분석</h2><p>본 실험에서 얻은 자료는 SPSS(version 12.0) 통계 프로그램을 이용하여 처리하였다. 측정치는 평균±표준오차(Mean± SE)로 표시하였으며, 그룹간의 비교를 위하여 one-way ANOVA와 Tukey's post-hoc test를 실시하였으며, 통계적 유의수준은 \( \alpha=.05 \) 로 설정하였다.</p>
세포배양 접시는 어떤 회사에서 구매했니?
Falcon