<h1>재료 및 방법</h1><h2>미생물 분리 및 배양</h2><p>본 실험의 미생물은 전통적으로 제조한 청국장 및 이를 제조할 때 사용한 볏짚을 이용하여 분리하였다. 미생물을 분리하기 위하여 청국장과 볏짚 시료 각각을 멸균생리식염수 [\(0.85\%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) \(\mathrm{NaCl}\)]와 1:9 비율로 혼합한 후, homogenizer (Stomacher 400, Seward, England)로 10분간 균질화하여 현탁액을 제조하였다. 이 현탁액을 멸균생리식염수로 십진 희석한 후 tryptic soy agar (TSA; Difco, Detroit, MI, USA)에 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 적가하여 도말하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 14시간 동안 배양한 후 미생물 집락을 순수분리하였다.</p><h2>항균물질 활성 측정</h2><p>실험에 사용된 피검균 B. cereus KCCM 12667 는 tryptic soy broth (TSB, Difco, MI, USA)에 \(1\%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양하였다. 분리 미생물의 B. cereus에 대한 항균활성은 paper disc 방법을 사용하여 확인하였다. B. cereus을 \( 0.4 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종한 tryptic soy soft agar를 중층한 평판배지에 직경 \( 8 \mathrm{mm} \) 의 paper disc (Advantec, Toyo Roshi Kaisha Ltd., Japan)를 올리고 항균물질을 \( 50 \mu \mathrm{l} \)을 적가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 동안 배양한 후 생성된 투명환의 형성유무를 관찰하였다.</p><h2>분리균주의 동정</h2><p>항균활성을 나타내는 분리 균주를 동정하기 위해서 형태학적, 생화학학적 동정과 유전학적 동정을 실시 하였다. 형태학적인 동정은 그람 염색과 포자형성 관찰을 하였다. 생화학적 동정은 API 50 CHB kit (bioMerieux, Marcy IEtoile, France)을 사용하여 49개의 탄소원에 대한 이용성을 조사하고, API 50 CHB database V3.0(http://apiweeb.biomerieux.com)을 통해 동정결과를 얻었다. 유전학적 동정은 16 S ribosomal DNA 염기서열 분석하는 것으로 분리 미생물의 chromosomal DNA를 template로 universal primer인 27 forward primer (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492 reverse primer (5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하여 16S rDNA gene 일부를 증폭하였다. 증폭된 약 \( 1,400 \mathrm{bp} \)의 fragment를 T-vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 결합시켜 형질 전환한 후 T-vector sequencing primer를 통해 염기서열을 분석하고, BLAST search program을 이용하여 GenBank (NCBI)의 ribosomal DNA gene sequence와 비교 동정하였다.</p><h2>생육시기에 따른 항균 활성조사</h2><p>분리 미생물을 glucose minimal medium (\(0.002\%\) ammonium molybdate, \( 0.003 \%\) \(\mathrm{CaCl}_{2} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(0.0002 \%\) \(\mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(1 \% \) Glucose, \( 0.7 \%\) \(\mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\), \(0.15 \%\) \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(0.05 \%\) \(\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(0.004 \%\) \(\mathrm{MnSO}_{4} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(0.5 \% \) yeast extract) \( 500 \mathrm{ml} \)에 \( 1 \%\) \((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 180 \mathrm{rpm} \)으로 교반하여 배양하였다. 0-144시간동안 진탕 배양하는 동안 spectrophotometer (VersaMax ELISA Microplate Reader, Molecular Devices Sunnyvale, CA, USA)로 \( 660 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 생육곡선을 그리고, 생육시기에 따른 항균 활성을 측정하였다. 활성 역가는 분리 미생물 배양액 \( \mathrm{ml} \) 당 AU(activity unit)로 측정하였다. AU는 항균 물질을 2 배씩 점차적으로 희석하여 투명환을 형성하는 최대 희석배수의 역수값을 취하고, 이 값을 \( 1 \mathrm{ml} \)로 환산하는 값에 곱하여 \( \mathrm{AU} / \mathrm{ml} \)로 정하였다.</p>
시료로 부터 얻은 현탁액을 무엇으로 십진 희석하는가?
멸균생리식염수