<h2>Western blot analysis</h2><p>RAW \( 264.7 \) cell을 \( 6 \)-well plates에 \( 5 \times 10^{5} \) cells/well의 농도로 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 \( 24 \)시간 동안 전 배양한 후, 희석 된 시료 \( (6.25,12.5,25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)와 LPS \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)를 동시 처리하여 동일한 조건하에 \( 24 \)시간 동안 염증을 유도하였다. 이후 세포를 PBS로 \( 2 \)회 세척한 뒤, lysis buffer[1×RIPA (Upstate Cell Signaling Solution, Danvers, NY,USA), \( 1 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride, \( 1 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{Na}_{3} \mathrm{VO}_{4} \), \( 1 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NaF}, 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) aprotinin, \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) pepstatin, and \( 1 \mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{mL} \) leupeptin]로 처리하여 \( 1 \)시간 동안 lysis를 진행 하였으며, 이후 원심 분리(\( 12,000 \) rpm, \( 30 \mathrm{~min}) \) 과정을 거쳐 상등액과 pellet을 분리하였다. 상등액의 단백질 농도는 BCA kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량 하였으며, \( 20 \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 \( 10 \% \) polyacrylamide를 함유한 \( 10 \% \) SDS-PAGE에서 전기영동 한 후, poly-vinylidene difluoride membrane (Milipore, Burlington, \( \mathrm{MA}, \mathrm{USA}) \)에 전이하였다. 전이가 종료 된 membrane은 \( 5 \)% skim Milk (sol. TBST)에 넣고 상온에서 \( 2 \)시간동안 blocking을 실시하였으며, TBST로 \( 10 \)분간 \( 3 \)회 세척한 뒤, TBST로 희석된 \( 1 \)차 항체(iNOS antibody (\( 1:1,000 \), Bio-Rad), COX-\( 2 \) antibody (\( 1:1,000 \), Rockland Immunochemicals,Inc., USA), \( \beta \)-actin antibody clone AC-74 (1:10,000, Sigma)에 담구어 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 overnight하였다. 반응이 끝난 후 TBST 용액으로 \( 4 \)회 세척한 membran을 horseradish peroxidase가 결합된 \( 2 \)차 항체(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, \( \mathrm{USA}) \)를 \( 1: 10,000 \) 비율로 희석하여 \( 90 \)분 동안 반응하였으며, 반응 종료 후 다시 TBST로 \( 10 \)분간 \( 3 \)회 세척한 뒤, ECL kit(Bio-Rad)와 반응시켜 imaging densitometer (model GS-700,Bio-Rad)를 통해 현상하였다. 현상된 \( \mathrm{iNOS} \)와 \( \mathrm{COX}-2 \)의 발현량은 imageJ program ( NIH, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 \( \beta \)-actin 대비 \( \mathrm{iNOS} \)와 \( \mathrm{COX}-2 \)의 면적을 정랑화하여 그래프로 나 타내었다.</p><h2>전염증성 사이토카인(TNF- \( \alpha \),IL-\( 6 \), IL-1 \( \beta \))생성억제 활성 측정</h2>\( 264.7 \) 세포를 \( 24 \)-well plates에 \( 7.0 \times 10^{4} \) cells/well의 농도로 접종하여 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \) 조건에서 \( 24 \)시간 배양한 후, 희석 된 시료 \( (6.25,12.5,25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)와 LPS \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)를 동시 처리하여 동일한 조건하에 \( 24 \)시간 동안 염증을 유도하였다. 이후 회수한 배양 배지를 원심분리(\( 10,000 \)rpm, \( 3 \mathrm{~min}) \)하여 침전물을 제거하였으며, 침전물을 제거한 상등액을 이용하여 배양액 내에 존재하는 전염증성 사이토카인의 함량을 측정하였다. 측정에는 Mouse TNF- \( \alpha \) ELISA Kit (Invitrogen, Carlsbad,CA, USA), Mouse IL-\( 6 \) ELISA Kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), Mouse IL-\( 1 \) \( \beta \) ELISA Kit (R&D Systems Inc.)를 이용하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>모든 실험은 \( 3 \)회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균값 \( \pm \) 표준편차로 나타냈으며 통계적 분석은 각 처리 구간의 유의성 \( (* p<0.05 ; * * p<0.01) \)을 검증을 위해 분산분석 (analysis of variance, ANOVA)후 student's t-test로 다중 비교를 실시하였다.</p>
Western blot anlysis 시 TBST로 희석된 1차 항체의 β-actin의 희석 농도는?
1:10,000