<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주</h2> <p>본 연구에 사용한 균주는 2001년부터 2003년까지 부산지역의 냉각탑수에서 분리한 레지오넬라균 중에서 L.pneumophila serogroup 1으로 동정된 것으로 Table 1과 같으며, 표준균주는 L. pneumophila ATCC 33152 (serogroup 1)를 사용하였으며, 기타 경남 마산 및 진주 지역의 냉각탑수에서 분리된 L. pmeum-ophila serogroup 1을 함께 사용하였다. Pulsed-filed gel electro-phoresis 실험은 Lee 등의 방법으로 살시하였다.</p> <h2>균의 분리 및 동정</h2> <p>냉각탑수에서 레지오넬라균의 분리 및 동정은 Park 등의 방법에 따랐다. 냉각탑수 1L를 채수하여 \( 0.2 \mu \mathrm { m } \) 멸균 여과지를 통과시킨 후 여과지를 절단하여 여액 20ml에 부유하여 50℃에서 30 분간 열처리하였다. 열처리한 검체 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 를 항생 물질[polymyxin B sulfate 79,200 unit/l, vancomycin 5g/l), cyclohexamide (80g/l), glycine (3g/l) ]과 영양물질 [L-cystei \( \mathrm { n } \cdot \mathrm { HCl } (0.4g/l) \), ferric pyrophosphate (0.25g/l)] 이 첨가된 buffered charchoal yeast extract (BCYE, Difco) 한천배지에 접종하여 90% 습도를 유지한 35℃ 배양기에서 10 일간 배양하였다. 균의 동정은 4 일 후부터 자라나온 회백색의 집락을 BCYE 한천배지와 혈액한천배지에 동시에 접종하여 BCYE 한천배지에서는 자라나 혈액한천배지에서는 자라지 못하는 균 (L-cystein 요구주)을 대상으로 무포자의 그람 음성 간균을 Legionella 속으로 추정하여, 혈청학적으로 동정하였다. 혈청형의 확인은 Legionella antisera (Denka Seiken, Japan)를 사용하여 슬라이드 응집법으로 실시하여, Legionella pneumophila serogroup 1에 응집된 균을 PFGE 분석에 사용하였다.</p> <h2>Gel plug의 준비</h2> <p>레지오넬라균을 BCYE 한천배지에 접종하여 35℃ 에서 48시간 배양한 후 TES buffer ( 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 100mM NaCl, pH8.0) 3ml에 균을 현탁하여 bioMerieux Vitek colorimeter 10% 의 투명도로 균 농도를 조절하였다. 균 현탁액을 12,000rpm 에서 10 분간 2회 세척한 후, 균 침전물을 TES buffer \( 300 \mu l \) 로 재 부유한 후, 1.2% Seakem gold agarose (FMC Bio Products, USA) \( 300 \mu l \) 를 첨가하여 plug를 만들어 4℃에서 5 분간 굳혔다. Plug의 lysis는 lysis buffer 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 50mM EDTA (pH 8.0), 1% Sarcosyl, 1mg proteinase K, 1mg lysozyme, \( 20 \mu \mathrm { g } \) RNase A } 를 1ml 씩 첨가하여 50℃ 에서 48 시간 처리하였고, 상온에서 멸균증류수로 5분간 1회, TE buffer (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)로 5 분간 2회 세척한 후 TE buffer를 첨가하여 사용할 때까지 냉장 보관하였다.</p> <table border><caption>Table \( 1 \). L. pneumophila ATCC 33152 and 39 isolates used in this study</caption> <tbody><tr><td>Year</td><td>Isolates</td><td>Area of origin</td><td>Year</td><td>Isolates</td><td>Area of origin</td></tr><tr><td rowspan = 15>2001</td><td>BJ 0101</td><td>Busanjin-gu</td><td rowspan=12>2002</td><td>BJ 0221</td><td>Busanjin-gu</td></tr><tr><td>BJ 0102</td><td>Busanjin-gu</td><td>KJ 0223</td><td>Kumjung-gu</td></tr><tr><td>BJ 0103</td><td>Busanjin-gu</td><td>KJ 0224</td><td>Kumjung-gu</td></tr><tr><td>JG 0106</td><td>Jung-gu</td><td>SS 0227</td><td>Sasang-gu</td></tr><tr><td>BJ 0107</td><td>Busanjin-gu</td><td>YJ 0228</td><td>Yeonje-gu</td></tr><tr><td>KS 0109</td><td>Gangseo-gu</td><td>SS 0234</td><td>Sasang-gu</td></tr><tr><td>DL 0118</td><td>Dongnae-gu</td><td>JG 0237</td><td>Jung-gu</td></tr><tr><td>HW 0145</td><td>Haeundae-gu</td><td>YG 0239</td><td>Yeonje-gu</td></tr><tr><td>DG 0152</td><td>Dong-gu</td><td>JJ 0240</td><td>Jinju</td></tr><tr><td>SG 0154</td><td>Seo-gu</td><td>MS 0241</td><td>Masan</td></tr><tr><td>YD 0156</td><td>Yeongdo-gu</td><td>HW 0260</td><td>Haeundae-gu</td></tr><tr><td>HW 0157</td><td>Haeundae-gu</td><td>HW 0261</td><td>Haeundae-gu</td></tr><tr><td>HW 0158</td><td>Haeundae-gu</td><td rowspan=7>2003</td><td>DL 0303</td><td>Dongnae-gu</td></tr><tr><td>HW 0159</td><td>Haeundae-gu</td><td>DL 0304</td><td>Dongnae-gu</td></tr><tr><td>DG 0160</td><td>Dong-gu</td><td>DL 0306</td><td>Dongnae-gu</td></tr><tr><td rowspan=5>2002</td><td>JG 0203</td><td>Jung-gu</td><td>DL 0310</td><td>Dongnae-gu</td></tr><tr><td>JG 0209</td><td>Jung-gu</td><td>JG 0322</td><td>Jung-gu</td></tr><tr><td>BJ 0210</td><td>Busanjin-gu</td><td>HW 0325</td><td>Haeundae-gu</td></tr><tr><td>JG 0211</td><td>Jung-gu</td><td>DG 0326</td><td>Dong-gu</td></tr><tr><td>SH 0214</td><td>Saha-gu</td><td>Reference strain</td><td colspan=2>L. pneumophila ATCC 33152</td></tr></tbody></table>
냉각탑수 1L를 채수하여 \( 0.2 \mu \mathrm { m } \) 멸균 여과지를 통과시킨 후 어떻게 하였어?
여과지를 절단하여 여액 20ml에 부유하여 50℃에서 30 분간 열처리하였다.