<h1>결 과</h1><h2>U937 세포의 증식 및 형태에 미치는 esculetin의 영향</h2><p>인체 혈구암세포인 U937 세포의 증식에 미치는 esculetin의 영향을 MTT assay를 이용하여 조사한 결과, Fig. 1A에 나타난 바와 같이 \( 30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 esculetin 처리시간이 증가함에 따라 암세포의 증식이 감소하여 24시간 처리군의 경우에는 약 \( 70 \% \) 정도의 증식억제 효과가 나타났다. 이러한 증식억제에 따른 암세포의 형태 변화를 위상차 현미경을 이용하여 관찰한 결과, Fig. 1에서와 같이 esculetin 처리시간이 증가할수록 전체적인 세포의 밀도가 감소하였고 심한 형태적 변형이 관찰되었다.</p><h2>Esculetin에 의한 apoptosis의 유발</h2><p>Esculetin 처리에 의한 U937 세포의 증식억제 및 형태변화가 apoptosis 유발과 연관이 있을 것으로 예상되어 apoptosis 유발의 정도를 flow cytometry를 이용하여 정량적인 분석을 한 결과는 Fig. 1B에 나타난 바와 같다. 정상 배지에서 자란 암세포에서는 apoptosis가 거의 유발되지 않은 것으로 나타났지만 esculetin의 처리시간이 증가할수록 sub-G1의 비율이 증가하여 24시간 처리군에서는 sub-G1의 비율이 \( 70 \% \) 이상으로 나타났다. 이는 esculetin 처리에 의한 U937 세포의 증식 억제 및 형태변화가 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 의미한다.</p><h2>Bcl-2 family의 발현 및 Bcl-2/Bax의 binding activity에 미치는 esculetin의 영향</h2><p>Esculetin 처리에 의한 암세포의 apoptosis 유발에 관여하는 유전자의 탐색을 위하여 먼저 Bcl-2 family에 속하는 몇가지 유전자 발현의 정도에 미치는 esculetin의 영향을 RT-PCR 및 Western blot analysis 방법으로 조사하였다. Fig. 2에 나타낸 바와 같이 esculetin 처리 시간 의존적으로 extrinsic pathway에 의하여 유발되는 Bid의 단편화 현상이 관찰되었다. 또한 Bcl-2/Bax의 결합력을 조사한 결과, Fig. 2C에 나타난 바와 같이 esculetin 처리에 의하여 Bcl-2 및 Bax의 mRNA 및 단백질 수준에서는 아무런 변화가 관찰되지 않았지만 Bcl-2/Bax의 결합력은 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. 이는 esculetin 처리에 의한 apoptosis 유발에 있어서 외재적 및 내재적 경로가 모두 관여하여 apoptosis 유발 관련 효소들의 활성화가 이루어지고 있음을 시사하여 주는 것이다.</p><h2>TRAIL, DR4, DR5, Fas 및 FasL의 발현에 미치는 esculetin의 영향</h2><p>외재적 경로를 통한 apoptosis 과정에 있어서 중요한 역할을 하는 죽음의 수용체에 속하는 유전자들의 발현 변화를 관찰한 결과, Fig. 3에 나타난 바와 같이 DR4 및 FasL의 발현이 단백질 수준에서 현저하게 증가하는 것으로 나타났다. 이는 esculetin에 의한 apoptosis 유발에 있어서 죽음의 수용체들의 증가와 같은 외재적 경로의 활성화를 통한 Bid 단백질의 단편화가 중요한 역할을 한다는 것을 보여주는 결과이다.</p><h2>IAP family의 발현에 미치는 esculetin의 영향</h2><p>다음은 esculetin에 의한 apoptosis 유발에 있어서 caspases의 활성을 억제하는 것으로 알려진 IAP family가 관여하는지의 여부를 조사하였다. Fig. 4A 및 B에 나타난 바와 같이 조사된 IAP family 중 XIAP가 단백질 수준에서 발현이 감소하는 것으로 나타나, esculetin이 XIAP의 발현을 감소시켜 caspases의 활성을 억제하지 못하게 함으로서 apoptosis 유발을 촉진시키는 것으로 생각되어 진다.</p><h2>\( \beta \)-catenin, CAD 및 ICAD의 발현에 미치는 esculetin의 영향</h2><p>Apoptosis 유발 시 활성화된 caspase-3은 여러 종류의 기질 단백질의 분해를 유발하게 되는 것으로 알려져 있으므로 몇 가지 중요한 기질 단백질의 발현이 esculetin 처리에 의하여 어떠한 변화가 유발되는 지를 조사하였다. Fig. 4B에서와 같이 세포내 골격 유지와 세포 유착에 관여하는 \( \beta \)-catenin 및 DNA의 단편화에 관여하는 것으로 알려진 DFF45/ICAD의 발현의 감소 또는 단편화 현상이 관찰되었다. 즉 esculetin 처리에 의한 apoptosis 유발은 caspase-3의 활성화와 이에 따른 기질 단백질들의 분해가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.</p><h2>Caspase-3 inhibitor에 의한 apoptosis의 억제</h2><p>이상의 결과들을 살펴볼 때 esculetin에 의한 apoptosis 유발에 있어서 caspase-3의 활성이 중요한 역할을 하는 것으로 생각되어 caspase-3 저해제가 esculetin에 의한 apoptosis에 어떠한 영향을 주는 지를 조사하여 보았다. Fig. 5A에서 나타난 바와 같이 esculetin 처리에 의하여 유도되는 apoptosis가 caspase-3 저해제인 z-DEVD-fmk 선 처리에 의하여 거의 완벽하게 억제되는 것으로 나타났다. 또한 esculetin에 의한 형태 변화 및 caspase-3의 기질 단백질들의 발현 변화에서도 동일한 결과가 나타났다. 따라서 esculetin에 의하여 유발되는 apoptosis에 있어서 caspase-3이 중요한 조절자로서 역할을 하는 것으로 생각된다.</p>
esculetin 처리에 의한 U937 세포의 증식 억제 및 형태변화가 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 의미하는 근거가 뭐야?
정상 배지에서 자란 암세포에서는 apoptosis가 거의 유발되지 않은 것으로 나타났지만 esculetin의 처리시간이 증가할수록 sub-G1의 비율이 증가하여 24시간 처리군에서는 sub-G1의 비율이 \( 70 \% \) 이상으로 나타났다.