<h2>RT-PCR analysis</h2><p>실험에 사용된 RNA는 사포닌을 전처리 한 HDF 세포로부터 추출하였다. 추출을 위해 세포는 Trizol®로 분해시키고 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), \(12,000 \times g\) 에서 15 분 동안 원심분리 한 뒤 cholroform을 첨가하였다. Isopropanol은 상등액에 \(1:1\) 비율로 첨가되었고 RNA pellet은 원심분리에 의해 얻어졌다. Ethanol로 씻어낸 뒤, 추출된 RNA는 diethyl pyrocarbonate - treated RNase - free waster에 녹이고 GENios® microplate reader (Tecan Austria BmbH )를 이용하여 \( 260 \mathrm{~nm} \) 에서 정량하였다. 같은 양의 RNA (\( 1 \mu g \))는 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 1 \mathrm{X} \) reverse transcriptase (RT) buffer, \( 1 \mathrm{~mm} \) dNTPs, \( 500 \mathrm{ng} \) of oligo (dT) 15 primers, \( 140 \mathrm{U} \) of murine Moloney leukaemia virus (MMLV) reverse tran-scriptase 그리고 \( 40 \mathrm{U} \) of RNase inhibitor를 포함하는 master-mix 에 45 분 동안 방치함으로써 역전사 되었다. PCR은 MMP-1, MMP-2 그리고 glyceraldehydes-3-phosphate de-hydrogenase (G3PDH) mRNA를 증폭시키기 위해 automatic Whatman thermocycler (Bionmetra, Kent, UK)를 사용하여 수행되었다. 원하는 cDNA를 증폭시키기 위해 사용된 프라이머 시퀀스는 다음을 따른다. MMP-1 (forward primer: 5-ATGCTGAAACCCTGAAGGTG-3, reverse primer: 5-CTGCT TGACCCTCAGAGACC-3), MMP-2 (forward pri-mer: 5'- TGCTGAAGGA CACACTAAAGAAGA-3', reverse primer: \( \quad \) 5'-TTGCCATCCTTCTCAA AG TTGTAGG-3'), G3PDH (forward primer: 5'-TGAAGGTCGGTGTG AAC GGATTTGGC-3' reverse primer: 5'-CATGTAGGCCAT GAGG ATCCA CCAC-3) PCR 생성물을 \( 2\% \) agarose gel에 전기영동 시킨뒤 ethidium bromide로 염색하였으며, AlphaEase® gel image- analysis software (alpha Inotech, San Leandro, CA, USA)를 사용하여 정량하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>각 실험은 3 회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각 각의 시료농도에 대해 평균표준편차로 나타내었다. 각 시료 농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student's test 한 후 \( p<0.05 \) 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.</p>
HDF 세포로부터 RNA를 추출하기 위해서는 어떤 과정이 선행되어야 하는가?
사포닌을 전처리