<h2>SDS-PAGE</h2><p>정제된 단백질을 확인하기 위하여 Laemmli의 방법에 따라 \( 11 \% \)의 polyacrylamide 겔을 이용하여 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)를 수행하였다. 정제된 효소액에 Laemmli's sample buffer를 첨가하여 5분간 중탕가열한 후, 전기영동을 수행하였고 GelCode Blue Stain Reagent (Pierce Biotechnology)를 이용하여 단백질을 가시화하였다.</p><h2>효소의 활성측정</h2><p>Agarase 활성은 아가로스에서 생성된 환원당을 Somogy-Nelson법으로 정량하여 확인하였다. 기질용액으로 \( 0.2 \% \)\( (\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 아가로스를 포함하는 활성완충용액( \(50 \mathrm{mM}\) Tris-\(\mathrm{HCl}\) \( \left(\mathrm{pH}\right. 7.0\)), \(300 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(1 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl}_{2}) \)을 중탕가열한 후, \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)까지 냉각시켜 사용하였다. 기질용액 \( 1 \mathrm{ml} \)에 재조합 AgaJA3 효소액 \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시키고, 반응 용액 \( 0.5 \mathrm{ml} \)에 Somogy 시약(\(10\%\) \( \mathrm{CuSO}_{4} 80 \mathrm{ml}\), \(1 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \)\( 100 \mathrm{ml}\), \(\mathrm{Na}_{2} \mathrm{SO}_{4} 180 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 71 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{C}_{4} \mathrm{H}_{4} \mathrm{O}_{6}\mathrm{KNa} \)\( 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 40 \mathrm{~g} / \) D.W. 1 \(\mathrm{l}\)) \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 효소반응을 중지시키고 10분간 중탕가열하였다. 실온으로 냉각된 용액에 arseno-molybdate 시약 \( 2 \mathrm{ml} \)를 첨가하고 원심분리 \( (14,000 \times g \), 5분)를 행한 후 상층액의 흡광도를 \( 550\mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 1분당 \(1\mu \mathrm{mole}\)의 galactose를 생산하는 한천분해 효소의 양을 \(1 \mathrm{unit}\)로 정의하였고 galactose를 이용하여 표준적정곡선을 작성하였다.</p><h2>\( \mathrm{pH} \)에 따른 한천분해 효소의 활성측정</h2><p>\( \mathrm{pH} \)에 따른 한천분해효소의 활성은 \( \mathrm{pH} \)를 \( 3.0 \)에서 \( 10.0 \)까지 변화시키며 측정하였다. 넓은 \( \mathrm{pH} \) 범위에서 사용가능한 완충용액인 \( 50 \mathrm{mM} \) GTA (3,3-dimethyl-glutaric acid, Tris(hydroxymethyl)-aminomethane, 2-amino-2-methyl-1,3-pro-panediol) 완충용액 \( (300\mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(1 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl}_2) \)을 이용하여 \( \mathrm{pH} 3\sim10\)에서의 활성측정도 수행하였다.</p><h2>반응온도에 따른 한천분해 효소의 활성측정</h2><p>기질용액으로 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 아가로스를 포함하는 활성완충용액 \( (50 \mathrm{mM} \) GTA-\(\mathrm{HCl}\) \( (\mathrm{pH} 5.0)\), \(300 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(1 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl}_{2} \) )을 중탕가열한 후, \( 25 \sim 60^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도별로 냉각시켜 이용하였다. 기질용액 \( 1.0 \mathrm{ml} \)에 효소액 \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 각 온도에서 30분간 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다.</p><h2>한천분해 효소의 열안정성 측정</h2><p>기질용액으로 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 아가로스를 포함하는 활성완충용액 \( (50 \mathrm{mM} \mathrm{GTA}-\mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 5.0)\), \(300 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(1 \mathrm{mM} \mathrm{~CaCl}_{2} \) )을 중탕가열한 후, \( 25 \sim 60^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도별로 냉각시켜 이용하였다. 효소액 \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 각 온도별로 0.5시간, 1시간, 1.5시간, 2시간 열처리한 후, 기질용액 \( 1.0\mathrm{ml} \)를 첨가하여 각 온도에서 30분간 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다. 측정된 효소활성은 열처리전의 효소활성과 비교하였다.</p><h2>한천 가수분해산물의 thin-layer chromatography (TLC) 분석</h2><p>효소액을 이용한 아가로스 분해산물은 TLC로 분석하였다. 기질용액으로 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 아가로스를 포함하는 활성완충 용액 \((50 \mathrm{mM} \mathrm{GTA}-\mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 5.0)\), \(300 \mathrm{mM}\mathrm{NaCl}\), \(1 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl}_{2}) \)을 중탕가열한 후 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)까지 냉각시켜 사용하였다. 기질용액 \( 1 \mathrm{ml} \)에 효소액 \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24 그리고 48 시간 반응시킨 후, Silica gel 60 TLC plate (Merck, Darmstadt, Germany)을 이용하여 분해산물의 분석을 수행하였다. 아가로스 분해산물을 \( \mathrm{n} \)-butanol/acetic acid/ \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) (\(2/1/1\) \( (\mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v})) \)를 이용하여 전개한 후 건조시켰고 표면에 \( 10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)를 뿌린 후 다시 건조시켰으며 이후 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 가시화시켰다. 표준물질로 neoagarohexaose (Sigma, USA)와 neoagarotetraose (V-Labs Inc. St. Covington, LA, USA), galactose (ACROS, USA)를 사용하였다.</p>
정제된 단백질을 눈에 보이게 하기 위해서 어떻게 했어?
정제된 효소액에 Laemmli's sample buffer를 첨가하여 5분간 중탕가열한 후, 전기영동을 수행하였고 GelCode Blue Stain Reagent (Pierce Biotechnology)를 이용