<h1>재료 및 방법</h1><h2>시약</h2><p>본 실험에 사용한 pectin, polygalacturonic acid(sodium salt), mono-galacturonic acid 및 그 밖의 탄소원으로 사용된 시약은 Sigma사 제품을 사용하였고, polypeptone, yeast extract 등 질소원으로 사용된 시약은 Difco사 제품을 사용하였으며, 기타시약은 특급시약을 사용하였다.</p><h2>균주의 분리 및 동정</h2><p>경남 일대의 토양 100여종을 균원 시료로 하여 균을 분리하였다. 균 분리용 기본배지로서는 LB 고체 배지 ( \(\mathrm{NaCl} \) \( 5 \mathrm{g} \), tryptone \( 10 \mathrm{~g} \), yeast extract \( 5 \mathrm{~g} \), agar \( 15 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) ) 를 \( \mathrm{pH~} 8.0 \) 으로 조정하여 사용하였다. 균원 시료를 3단 희석하여 도말한 배지를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12시간 배양하여 나타난 colony를 LBP 고체 배지 ( \( \mathrm{NaCl} \) \( 5 \mathrm{~g} \), tryptone \( 10 \mathrm{~g} \), yeast extract \( 5 \mathrm{~g} \), polygalacturonic acid \( 5 \mathrm{~g} \), agar \( 15 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) )에 tooth picker 한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12시간 배양하여 Wood의 방법으로 colony 를 분리하였다. 즉, colony가 나타난 배지상에 \( 0.7 \% \) cuperic acetate로 염색시켜 생성된 halo zone의 크기에 따라 균주를 1차 선별하였다. 선별된 균주를 polygalacturonic acid를 함유한 액체배지에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 36시간 진탕 배양한 후 배양액을 원심분리하여 균체를 완전히 제거한 상등액을 효소원으로하여 pectinase 활성을 측정하여 가장 활성이 높은 균주를 BS-214로 명명하였다. 균주의 보존은 agar plate (\( 4^{\circ} \mathrm{C} \)) 와 glycerol에 stock (\( -20^{\circ} \mathrm{C} \)) 하였다.</p><p>선별된 균주의 세포형태 및 포자는 위상차 현미경(Nikon Co., Japan)으로 조사하였으며, 생화학적 특성은 Bergey's manual of systematic bacteriology에 따라를 검토하여 동정하였다.</p><h2>균주의 생육도 및 효소 활성 측정</h2><p>선별된 균주의 생육에 따른 pectinase의 생산량을 조사하기 위하여, 효소생산용 액체배지 (polygalacturonic acid \( 1 \% \), yeast extract \( 0.25 \% \), \( \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \) \( 0.02 \% \), \( \mathrm{KCl} \) \( 0.05 \% \), \( \mathrm{CaCl}_{2} \) \( 0.02 \% \), \( \mathrm{pH} 8.5 \) 조정)에 분리균 BS-214를 접종하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 200 \mathrm{~rpm} \) 으로 60시간 진탕 배양하였다. 균의 생육도는 Spectronic 20(Bauch and Lomb Co., USA)과 Ultrospec 4050(Phamacia Biotech., Sweden)으로 \( 660 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도로 나타내었다. 효소활성 측정을 위하여 배양액을 \( 12,000 \mathrm{~rpm} \) 으로 10분간 원심분리하여 균체를 완전히 제거한 상등액을 조효소원으로 사용하였고, 기질로서는 polygalacturonic acid를 증류수에 녹인 후 \( 0.1 \mathrm{M} \) NaOH로 \( \mathrm{pH} \) 를 8.5로 조정하여 \( 15,000 \mathrm{~rpm} \) 으로 30분간 원심분리하여 상등액을 사용하였으며, 효소활성은 Bertheau 등의 방법 [1]을 다음과 같이 약간 변형시켜 측정하였다. 즉, 반응액으로는 적당히 희석한 효소액 \( 100 \mu \ell \) 과 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \) buffer ( \(\mathrm{pH} 9.0 \) ) \( 200 \mu \ell \) 에 기질 \( 200 \mu \ell \) 을 첨가하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시킨 후 \( 10 \mathrm{mM} \) thiobarbituric acid \( 5 \mathrm{m} \ell \) 과 \( 0.5 \mathrm{M} \) \( \mathrm{HCl} \) \( 2.5 \mathrm{m} \ell \) 을 첨가하여 water bath에서 45분간 끓인 후 급냉하고, \( 3000 \times \mathrm{g} \) 에서 5분간 원심분리하여 Spectronic 20 (Bauch and Lomb Co., USA)으로 \( 550 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 이때 pectinase 활성은 위 조건에서 \(\text{흡광도(O. D.)} =0.1 \)을 \( 1 \mathrm{~unit} \)로 나타내었다.</p><h2>삼지닥나무의 Pectin 분해력 측정</h2><p>삼지닥나무(Edzeworthia papyrifera)의 pectin 분해력을 측정하기 위하여 삼지닥나무 분말 \( 0.5 \% \) 를 첨가한 LB 액체배지에 분리균을 접종하여 정치배양 한 후 pectin 분해 정도를 광학현미경(Olympus CH30), Japan)으로 관찰하였다.</p>
션별된 균주의 세포형태는 Bergey's manual of systematic bacteriology으로 조사하였나?
NO