<h1>결과</h1><h2>Ras에 의해 암화된 NIH3T3 세포에서 dynamin-2 단백질의 발현 증가 및 분포 변화</h2><p>정상적인 NIH3T3 세포에 비해 Ras에 의해 암화 (transformation)된 세포 (NIH3T3 (Ras))에서 dynamin-2는 Ras 신호전달 단백질인 Grb2 와의 상호작용이 증가하였다. 하지만 dynamin-2와 Grb2 의 발현 자체가 증가한 것인지, 아니면 이들 두 단백질간의 상호작용만이 증가한 것인지는 현재까지 알려진 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 이들 세포에서 두 단백질의 발현을 먼저 관찰하였다. 정상적인 NIH3T3 세포와 Ras에 의해 암화된 NIH3T3 (Ras) 세포에서 이들 단백질의 발현을 생화학적인 방법인 western blot으로 확인한 결과 Grb2 의 경우 발현의 차이를 볼 수 없는 반면 dynamin-2는 NIH3T3 (Ras) 세포에서 그 발현이 현저히 증가함을 확인하였다. 공초점 레이저현미경을 통해 관찰된 dynamin-2는 NIH3T3 세포에서 세포질 내에 전반적으로 분포하고 있었으며, 특히 핵 주변에서 그 발현이 세포질에 집중되어 있음이 확인되었다. 반면, NIH3T3 (Ras) 세포에서는 NIH3T3 세포에 비하여 발현이 증가되었음을 불 수 있었으며, 세포질 가운데 특히 세포막 쪽에 그 발현이 집중되어 있음을 관찰할 수 있었다.</p><h2>Ras에 의해 암화된 NIH3T3 세포에서 dynamin-2 RNA의 발현 증가</h2><p>NIH3T3 (Ras) 세포에서 dynamin-2 단백질의 발현 증가가 dynamin-2 mRNA의 발현 증가로부터 유래하는지 확인하기 위하여 competitive RT-PCR 을 수행하였다. 이를 위해 NIH3T3 세포와 NIH3T3 (Ras) 세포로부터 추출한 \( 0.5 \mu \mathrm{g} \) 의 RNA블 주형으로 하여 cDNA 를 합성하고, 다양한 농도의 internal standard (재료 및 방법 참고)와 함께 PCR 을 수행하였다. 그 결과 NIH3T3 세포에서는 0.002 attommole의 internal standard와 함께 PCR 을 수행하였을 때 dynamin-2 PCR 산물 (\(725-\mathrm{bp}\))과 internal standard PCR 산물 (\(476-\mathrm{bp}\))의 양이 거의 비슷하였으나, NIH3T3 세포에서는 0.2 attommole의 internal standard와 함께 PCR 을 수행하였을 때 두 산물의 양이 비슷함을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 dynamin-2의 mRNA 양이 NIH3T3 세포에 비해 NIH3T3 세포에서 약 100 배 증가하였음을 의미하는 것이다.</p><p>이에 반해 Grb2 의 경우 동일한 실험을 두 세포에서 수행한 결과, 두 세포에서 모두 20 attommole의 internal standard와 함께 PCR 을 수행하였을 때 Grb2 PCR 산물 (\(653-\mathrm{bp}\))과 internal standard PCR 산물 (\(595-\mathrm{bp}\))의 양이 비슷하였다. 이는 Grb2의 경우 단백질뿐만 아니라 mRNA 의 양도 두 세포사이에 변화가 없음을 의미하는 것이다.</p><h2>Ras에 의해 암화된 NIH3T3 세포에서 dynamin-2 promoter activity의 변화</h2><p>NIH3T3 (Ras) 세포에서 dynamin-2 mRNA의 발현이 증가함을 확인하였으므로 어떠한 전사인자가 dynamin-2 유전자 발현에 중요한 역할을 하는지 알아보고자 dynamin-2의 promoter를 pCAT-Basic vector에 cloning한 후, 여러 종류의 5'-deletion mutants를 제작하고 이들의 promoter activity (CAT activity)를 NIH3T3 (Ras) 세포에서 확인하였다. 각각의 deletion mutant에 대한 promoter activity를 정량해본 결과 start codon (AUG)로부터 \(300-\mathrm{bp}\) upstream을 이상을 포함하고 있는 construct들 (pCAT2-300, pCAT2-400, pCAT2-500, pCAT2-1000, pCAT2-2000, pCAT2-3000)은 모두 상당한 활성을 나타내고 있으나 \(200-\mathrm{bp}\)만을 가지고 있는 construct (pCAT2-200)의 경우 그 활성이 현저히 감소함을 볼 수 있었다. 이러한 결과는 start codon으로부터 \(200-\mathrm{bp}\)와 \(300-\mathrm{bp}\) upstream 사이에 dynamin-2의 promoter activity를 결정하는 중요한 전사인자들의 결합 위치가 존재함을 의미하는 것이다.</p>
Grb2 의 경우 같은 실험을 두 세포에서 수행한 결과, 두 세포에서 모두 20 attommole의 internal standard와 함께 어떤 방법을 적용시켰을때 Grb2 PCR 산물 (\(653-\mathrm{bp}\))과 internal standard PCR 산물 (\(595-\mathrm{bp}\))의 양이 비슷하게 나오는 거니?
PCR