<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주와 plasmids</h2><p>재조합 단백질의 발현을 위해 E. coli BL21(DE3)[F\( ^{-} \), ompT, rB\( ^{-} \), mB\( ^{-} \), (DE3)]를 주요 숙주세포로 사용하였다. pET-21 vector에 B. macerans 유래 cgt가 subcloning 되어 있는 pTCGT1 plasmid 내 cgt 발현은 T7 promoter에 의해 조절되고 ampicillin 내성 유전자를 가지고 있다. 그리고 pGro7 plasmid 내 groEL/ES 발현은 araB promoter에 의해 조절되고, pACYC184가 기본 plasmid로 chloramphenicol 내성 유전자를 함유하고 있다.</p><h2>Co-transformation</h2><p>pGro7과 pTCGT1을 E. coli BL21(DE3)에 co-transformation 시켰다. 형질전환된 E. coli 세포는 \( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin (pTCGT1의 선별)과 \( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) chloramphenicol (pGro7의 선별)이 첨가된 LB agar 배지에서 선별하였다. pTCGT1만 함유한 균주는 \( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin이 첨가된 LB agar배지에서 선별하였다.</p><h2>배지와 배양 조건</h2><p>E. coli 배양에는 LB medium \( (1\% Bacto-tryptone, 0.5\% Bacto-yeast extract, 0.5 \% \mathrm{~NaCl}) \)을 사용하였다. cgt 단독 발현을 위한 배지에는 \( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin이 함유된 LB 배지에서 배양하였고, groEL/ES와 cgt 공발현 배지는 \( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin과 \( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) chloramphenicol이 함유된 LB 배지에서 배양하였다. cgt 발현을 위해 \( 0.8 \sim 1.0 \mathrm{OD}_{600} \) 일 때 \( 1 \mathrm{mM} \) IPTG를 첨가하였고, groEL/ES 발현을 위해 \( 0.4 \sim 0.5 \mathrm{OD}_{600} \) 일 때 \( 0.3 \mathrm{mg} ~L-arabinose / \mathrm{ml} \) 첨가하였다. L-arabinose의 최적농도를 결정하기 위해 \( 10 \mathrm{ml} \mathrm{LB} \) tube에서 배양하였다. 그리고 공발현 시 IPTG의 첨가 시기를 결정하기 위해 working volume \( 80 \mathrm{ml} \)의 baffled flask에서 배양하였다.</p><h2>Colony 활성 염색</h2><p>선별된 형질전환체의 전분 가수분해 활성의 검출을 위해 iodine 방법에 의해 전분이 함유된 CS 배지 \( \left (1\% Soluble starch, 0.5\% Bacto-peptone, 0.5\% Bacto-yeast extract, 0.1\% \mathrm{~K_2HPO_4}, 0.02 \% \mathrm{~MgSO_4} \right) \)로 실험하였다. 즉, 숙주세포인 BL21(DE3)과 pTCGT1 단독 발현, pGro7과의 공발현 형질 전환체등 3종을 CS 배지 (1 mM IPTG와 \( 1 \mathrm{mg} ~L-arabinose / \mathrm{ml} \)의 함유 배지)에 도말하여 \( 37{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20시간 배양하여 iodine 증기로 colony 활성 염색을 하였다.</p><h2>SDS-PAGE 분석</h2><p>생산된 CGTase의 응집 또는 가용화 정도를 알아보기 위해 세포 배양액 \( 8 \mathrm{ml} \)을 원심분리하여 침전물만 분리한 후 \( 2 \mathrm{ml} \)의 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충액 \( (\mathrm{pH} 6.0) \)에 현탁하여 1 분 동안 초음파 파쇄하였다. 그리고 \( 2,500 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리 하여 상등액을 가용성 분획 (soluble fraction), 침전물을 다시 \( 1 \mathrm{ml} \)의 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충액 \( (\mathrm{pH} \) 6.0)에 재현탁하여 비가용성 분흭 (insoluble fraction)으로 분리하였다. 각각의 가용성 및 비가용성 분획을 \( 8 \% \) SDS-PAGE로 분석하였다. CGTase와 GroEL/ES 단백질은 Coomassie brilliant blue 염색으로 확인하였고, gel은 Image Analyzer (Image Master VDS, Pharmacia Biotech., USA)로 scanning 분석하였다.</p><h2>CGTase 활성 측정</h2><p>CGTase의 활성은 Leujeune등에 의해 제안된 methyl orange 법으로 측정하였다. 이 방법은 낮은 온도 \( \left(16^{\circ} \mathrm{C}\right) \)와 낮은 \( \mathrm{pH} \)에서 methyl orange와 CD 사이에 inclusion complex를 형성시킴으로써 CGTase의 활성을 유용하게 측정할 수 있는 방법이다. 반응은 \( 1 \% \) 수용성 전분 용액 ( \( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충액, \( \mathrm{pH} 6.0) \)과 \( 0.03 \mathrm{mM} \) methyl orange 용액 ( \( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충액, \( \mathrm{pH} 6.0 \) )을 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충액 \( (\mathrm{pH} 6.0) \)과 잘 섞고, 이 흔합액에 시료 용액을 \( 50 \mu l \) 가하여 \( 50{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응시켰다. 반응 후 \( 75 \mu \ell \)의 \( 6 \mathrm{~N} \mathrm{~HCl} \)을 가하여 반응을 정지시키고 반응액을 \( 16{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 방치한 후 \( 505 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 효소활성은 위와 같은 조건에서 분당 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 \( \alpha \)-CD를 생성하는 효소량을 1 unit로 정의하였다.</p>
pGro7 plasmid 내 groEL/ES 발현은 무엇에 의해 조절되었니?
promoter