<h2>배추 완전장 cDNA library로부터 Bromelain 유전자 분리 및 기능해석</h2><p>파인애플 (Ananas comosus)의 줄기에서 얻어지는 Bromelain은 단백질 분해효소 중 cystein protease로 분류되는 protease의 복합체이다. 파인애플은 중세 시대부터 세계 여려 곳에서 민간 약용물질로서 사용이 되어왔으며, 파인애플로부터 추출되어진 bromelain은 보조소화제, 소염제 (Mynott 등 2002; Manhart 등 2002; Gaspani 등 2002; Maurer 2001),항 혈청 응고제, 항암작용, cytokines 조절 및 면역작용, 피부 좌멸조직 제거, 순환계 활성 증강 등의 의학품으로써 효과가 있는 것으로 보고되어 있다 (Engwerda 등 2001). 배추의 완전장 cDNA library로부터 Bromelain 유전자를 분리하여, 그 기능을 분석하기 위하여 배추 형질전환체를 육성하여 그 특성을 살펴보았다.</p><h3>Bromelain 유전자를 도입한 형질전환 서울배추의 작성</h3><p>Bromelain 유전자를 삽입한 식물발현 벡터를 배축법 (Takasaki 등 1997: Kuginuki 등 2001)에 의하여 서울배추에 도입하였다. Agrobacterium을 감염시킨 절편체를 callus 유도배지에서 배양 10일 후부터 callus가 형성되기 시작하였다. 또한 재분화 배지에 2회째의 계대배양 후기부터 callus에서 부정아가 형성되기 시작하였으며 3회 계대배양에서는 많은 multi-shoot가 발생하였다. 이들 작은 신초들은 성숙배지에서 초장이 \( 7-8 \mathrm{~cm} \) 정도 될 때까지 성장시킨 후, kanamycin \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)이 포함된 MS hormone free 배지로 옮겨 발근을 유도하였다. 발근된 개체는 pot에 옮겨 순화시켰으며, \( 8-10^{\circ} \mathrm{C}\), 40일간 저온처리 후, 개화를 유도하였다. 개화된 개체는 뇌수분에 의해 T1을 획득하였다.</p><h3>약제내성에 의한 T1 형질전환체 선발 및 T2 transgenic event 선발</h3><p>항생제 내성실험을 위하여 뇌수분에 의해 획득한 T1 25 개체의 자식종자를 Hyg \(50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)이 포함된 1/10 MS배지에 멸균하여 치상하였다. 치상 10 일 후, 발아, 생육 및 고사 정도를 판정하여 18개체 \( (72 \%) \)가 형질전환체임을 확인하였다. 이들 18개체 (이하 계통이라 함)들을 배지로부터 pot로 옮겨 본엽 5-6매 정도까지 성장시킨 후, 위와 같이 저온처리 후 자식종자 (T2)를 획득하였다. T2를 계통 당 15-20립을 Hyg \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)이 포함된 1/10 MS배지에 치상하였다. 치상 5일 후 지속적 성장여부에 관한 계통 내 분리 유무를 판정하여 생사를 결정하였으며, 그 결과를 Table 1에 나타냈다. 18계통 중 6계통은 비형질전환체, 7 계통은 도입된 유전자가 헤테로, 5계통은 도입된 유전자가 호모이었다 (Table 2).</p><h3>Transgenic event의 형질전환 확인 및 Bromelain 유전자의 발현</h3><p>도입유전자가 호모상태인 형질전환체임을 확인하기 위하여 6-8, 6-17 및 6-20으로부터 각각 3개체의 total DNA를 template로 35S promoter primer, 35S와 bromelain primer 조합 및 NPTII primer를 이용하여 PCR반응을 실시하였다. 그 결과, 유전자를 도입하지 않은 비형질전환체에서는 PCR 산물이 검출되지 않았으나 Transgenic events에서는 목적 size의 DNA 단편이 명확히 검출되었다. 또한 NPTII 유전자와 도입시킨 Bromelain 유전자의 발현 여부를 확인 하기 위하여 6-4, 6-8, 6-12, 6-17 및 6-20의 mRNA를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과, \( \beta \)-actin primer에서는 wild type를 포함한 모든 transgenic event 식물체에서 균일한 발현정도의 산물이 증폭되었으며, NPTII 및 Bromelain 유전자 특이적 primer에서는 목적크기의 발현 산물이 증폭되었다 (Fig. 7).</p><h3>Transgenic event의 무름병 내성</h3><p>비형질전환체 및 호모 3계통 (6-4, 6-12 및 6-20)에 무름 병균을 접종하고 시간 경과에 따라 발병엽율을 조사하였다. 접종 5일후의 상처접종에서 6-4 및 6-12는 wild type과 유사한 발병엽율을 나타냈으나, 6-20은 발병엽율이 \(75.3\%\)로 낮게 나타났다. 접종 5일후의 무상처 접종에서는 wild type, 6-4 및 6-12는 모두 \( 100 \% \)의 잎 발병율을 나타낸 반면, 6-20은 \(62\%\)로 무름병 내성이 증진되었음을 알 수 있었다. 금후, 6-20은 뿌리 썩음병 및 나방류의 내성에 관한실험이 진행될 것이다. 또한 형질전환된 배추를 육종소 재로 활용하여 내병충성 품종을 육성할 것이며, 단백질 가수분해 효소인 bromelain을 추출하여 사료첨가제, 가축의 유방염 치료제, 항주름 치료제, 각질박리 치료제, 및 보습효과가 탁월한 화장품 첨가제 등에 널리 사용할 수 있을 것으로 생각된다.</p>
Bromelain 유전자를 삽입한 식물발현 벡터를 어떤 방법에 의해 서울배추에 도입하였는가?
배축법