<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포배양과 봉독</h2><p>실험에 사용한 HCT116세포(human colorectal carcinoma cell)는 American type culture collection (Rockville, MD USA)에서 분양 받아 사용하였으며, \( 1 \% \) antibiotics (GIBCO-BRL, Invitrogen Co., Grand Island, USA), \(10\%\) fetal bovine serum (FBS) (GIBCO-BRL)가 포함된 dulbecco's modified eagle's medium (DMEM, Carlsbad, CA, USA)배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다. 봉독은 한국농촌진흥청 (국립농업과학원)에서 지원 받아 멸균된 3차 증류수에 희석하여 사용하였다.</p><h2>MTT 측정</h2><p>봉독 농도에 따른 세포생존율을 측정하기 위해 세포 \( \left(1 \times 10^{4}\right. \)cells/well)를 96 well plate에 분주하여 24시간 안정화시킨 후, 봉독을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양한 다음 3[4,5-dimethylthiazol\(_2\)-yl]-2.5-diphenyltetra-zolium bromide (MTT) (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) 시약을 처리하여 4시간 반응시켰다. 반응 후 상등액을 제거하고 dimethylsul foxide (DMSO, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA)을 처리하여 생성된 formazin을 용해한 다음 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Western blot 분석</h2><p>세포 내 존재하는 단백질을 분리하기 위하여 total lysis buffer (\(50 \mathrm{mM}\) Tris, \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(5 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{mM} \) DTT, \( 0.5 \% \) nonidet P-40, \(100 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride, \( 20 \mathrm{mM} \) aprotinin, \( 20 \mathrm{mM} \) leupeptin, \(\mathrm{pH} 8.0\))를 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 분 간 용해한 후, 원심분리(\( 12,000 \mathrm{rpm}\), 10 분)하여 상등액을 취하였다. 또한 세포질/핵 내 단백질을 분리하기 위해 세포에 buffer A [\( 10 \mathrm{mM} \) Hepes \( (\mathrm{pH} 7.9\)), \( 1.5 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{MgCl}_{2}\), \(10 \mathrm{mM} \mathrm{~KCl}\) , \( 0.5 \mathrm{mM} \) DTT, \( 300 \mathrm{mM} \) Saccharose, \(0.1\%\) NP-10, \( 0.5 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride]를 가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 분 용해시킨 후 원심분리(1,000 rpm, 1 분)로 pellet (핵 단백질)을 분리하였다. 분리된 pellet을 buffer B [\( 20 \mathrm{mM} \) Hepes \( (\mathrm{pH} 7.9\) ), \( 20 \% \) glycerol, \(100 \mathrm{mM} \mathrm{~KCl}\), \(100 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}_{2}\), \(0.2 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.5 \mathrm{mM} \) DTT, \( 0.5 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride]로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 15분 용해 하여 원심분리(\( 10,000 \mathrm{rpm}\) rpm, 5 분)로 핵 내 단백질을 분리하였다. 위와 같은 방법으로 추출한 단백질을 SDS-polyacrylamide gel 전기영동 후 단백질을 nitrocellulose membrane (Schleicher \(\&\) schuell, Keene, NH, USA)로 전기이동시켰다. 특이 단백질을 탐색하기 위하여 \(5\%\) skim milk가 함유된 TBS-T로 1시간 반응시켜 비특이적인 단백질을 blocking 후, 특정 단백질에 대한 항체 HIF-1\(\alpha\), HIF-1\(\beta\), ERK1/2, AKT, p38, JNK, \( \beta \)-actin (Snata Cruz Biotechnology Inc., CA, USA)을 \(2.5\%\) skim milk가 함유된 TBS-T \( (10 \mathrm{mM} \) Tris, \( 150 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl} \) and \( 0.1 \% \) Tween-20)에 \(1: 1,000\)으로 희석하여 반응시켰다. 반응된 membrane에 특정항체 대한 이차항체를 처리 한 후 enhanced chemil luminoesence (ECL, Amersham Life Science Co., Arlington Heights, IL, USA)를 사용하여 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 발현량을 분석하였다.</p><h2>RT-PCR</h2><p>세포의 RNA를 추출하기 위해 TRlzol (Invitrogen Co., Grand Island, NY, USA)를 사용하였으며, OD260과 OD280에서 흡광도를 측정하여 동량의 total RNA와 oligo (dT)을 RT premix kit (Bioneer, korea)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 특정 primer (VEGF; forward 5'-ctgagcctctctaccccagg-3', reverse 3'-gagcaggaagaggatgaggg-5') ( \( \beta- \) actin; forward 5'-agggtgtgatgggtatggg-3', reverse 3'-caggatcttcatgaggtagtc-5') 유전자 중심으로 PCR 방법으로 증폭하여 cDNA을 \(1.5\%\) agarose gel로 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr)로 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.</p><h2>HRE promoter 활성 분석</h2><p>pGL3-HRE-luciferase 사용하여 실험을 수행하였다. 6-Well plate에 세포( \( 1 \times 10^{4} \) cells/well) 배양한 후, PGL3-HRE-luciferase와 pCMA-\(\beta\)-galactosidas을 DNA transfection reagent (TranslT-LT1 transfection reagent, Mirus, Madison, WI, USA)을 사용하여 12 시간 cotransfection 하였다. 배지를 교체하고 명시된 시료를 처리하여 12 시간 배양 후 lucferase와 \(\beta\)-galactosidase의 효소 활성을 commercial kits (Promega, Madison, WI)을 사용하여 측정하였다. \( \beta \)-galactosidase는 대조군으로 사용하였다.</p><h2>통계처리 분석</h2><p>실험 결과의 통계적 처리는 student's t test 및 analysis of variance (ANOVA)로 하였으며, \(P\) 값 \(<0.05\)을 유의한 차이의 한계로 하였고, 실험결과의 표현은 means\( \pm \)S.E로 하였다.</p>
HCT116세포(human colorectal carcinoma cell)는 어디에서 분양 받아 사용해?
American type culture collection