<h1>결과 및 고찰</h1><h2>배양 정상 간세포에 대한 계란 노른자 단백질 가수분해물의 세포독성</h2><p>계란 노른자 단백질을 Alcalase로 가수분해시켜 한외여과막장치를 사용하여 분자량 한계범위가 각각 \( 10 \mathrm{~KDa}, ~5 \mathrm{~KDa} \) 및 \( 1 \mathrm{~KDa} \)인 막을 차례로 통과시켜 얻은 가수분헤물들 \((10 \mathrm{~K}, 5 \mathrm{~K} \) 및 \( 1 \mathrm{~K} \) 가수분해물)을 배양 정상 간세포 (Chang)에서의 세포독성을 축정하여 Fig. 1에 나타내었다. 가수분해물을 첨가하지 않은 군의 세포 생존율을 \( 100 \% \)로 볼 때 가수분해물을 첨가한 첨가군에서는 모두 \( 100 \% \) 이상의 세포 생존율을 나타내었고, 특히 분자량 한계범위가 \( 5 \mathrm{~KDa} \)인 막은 통과하고 \( 1 \mathrm{~KDa} \)인 막은 통과하지 않은 가수분해물 \( (5 \mathrm{~K} \) 가수분해물)의 경우 \( 5 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \)을 첨가하였을 때 세포 생존율이 \( 130 \% \) 이상으로 가장 높게 나타났다. 따라서 본 실험에서 사용한 가수분해물들은 배양 정상 간세포에 독성믈 나타내지 않을 뿐만 아니라 오허려 세포 증식효과가 있는 것으로 나타났다.</p><h2>\( t\)-BHP 농도별 세포괴사에 대한 가수분해물들의 항산화 작용</h2><p>\( t\)-BHP의 농도에 따른 정상 간세포의 생존력을 \( t\)-BHP 2시간 처리 후 촉정한 결과, \( 225 ~\mu \mathrm{M} \)의 \(t\)-BHP 처리군에서 \( 50 \% \) 정도의 세포생존을 보였오므로 \( 225 ~\mu \mathrm{M}~t\)-BHP를 \( \mathrm{IC}_{50} \)으로 정하였다 (Fig. 2). 또한, \( t \)-BHP 농도별 세포괴사에 대한 계란 노른자 단빽질 가수분해물들의 항산화작용을 측정한 결과, \( \mathrm{IC}_{50} \)의 \( t\)-BHP농도에서 가수분해물 첨가군이 비첨가군에 비해 \( 5 \sim 21 \% \) 정도 세포 생존율이 증가하였으며, 특히 \( 5 \mathrm{~K} \) 가수분해물의 세포 생존율이 가장 높게 나타났다.</p><p>현재까지 \( t \)-BHP에 의한 간세포의 괴사를 설명하기 위하여 2가지의 메카니즘이 사용-되고 있는데, 하나는 Masaki 등에 의해 보고된 것으로 \( t \)-BHP에 의해 유발된 세포막의 지질과산화는 DPPD \((\mathrm{N}, \mathrm{N}^{\prime} \)-diphenyl- \( \rho \)-phenylene diamine)와 같은 항산화제들에 의해 방지될 수 있다는 것이다. 다른 하나는 세포괴사의 매카니즘은 항산화제의 영향을 받지 않고 지질과산화를 발생하여 미토콘드리아의 기능을 손실시킨다는 것이다. 또한, Pascoe 등은 \( \cdot~ \mathrm{OH} \) (hydroxyl radical)나 \(\mathrm{LOO}~\cdot\) (lipid radical)과 같은 활성산소계는 \( \alpha \)-tocopherol과 같은 소수성 막과 결합되어 있는 항산화제의 소비를 유도하여 세포의 방어효과를 감소시킨다고 보고하였으며, Fariss 등은 간세포 세포질에서 가장 풍부한 비단백질 thiol기를 가진 reduced glutathione (GSH)의 감소가 세포의 생존에 영향을 미친다고 보고하였고, Masaki 등은 \( t \)-BHP의 세포독성에 대해 철 킬게이트제인 deferoxamine이 GSH의 소비를 억제함으로써 세포괴사를 지연시켰으며, 항산화제인 DPPD나 catechol은 GSH의 대사과정이나 칼슘의 세포내 항상성에는 관계없이 \(t\)-butyl alkoxyl radical에 의해 생성되는 \(\mathrm{L}~\cdot\)을 소거함으로서 세포괴사를 지연시킨다고 보고하혔다. Benjamin 등은 calf, thymus로부터 분리한 \( 6 \mathrm{~KDa} \) 정도의 thymic 펩타이드가 간의 MDA생성을 감소시키는 동시에 간 GSH의 감소를 막으며 vascular endotherial cell에서는 endogenous 항산화물질을 증가시켜서 세포과사를 지연시킨다고 보고한 바 있다.</p><h2>\( t\)-BHP로 유발된 세포괴사에 대한 가수분해물의 농도에 따른 항산화작용</h2><p>계란 노른자 단백질 가수분헤물의 농도에 따른 항산화효과를 관찰하기 위하여 세포괴사를 유발하는 \( t\)-BHP를 첨가하였을 때 세포 생존율이 가장 높은 \( 5 \mathrm{~K} \) 가수분해물을 사용하여 배양 간세포에 전처리한 다음, \( t \)-BHP로 세포의 산화작용을 유발시켜 세포의 생존율을 측정하였다 (Fig. 3). 가수분해물을 농도별로 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 및 \( 7.5 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml}\)을 첨가하여 측정한 결과 \( 1.0 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml}\)일 때 \( 80 \% \) 정도로 가장 높은 세포 생존율을 나타내었다. Pascoe 및 Reed는 항암제로 glutathione (GSH)를 소비하여 반응산소종을 생성하는 adriamycin (ADR)의 사용에 의해 발생되는 심근경색은 ADR이 산화-환원되는 동안 활성 산소계의 생성과 GSH의 소비와 관련이 있다고 판단하여 이에 대한 \( \alpha \)-tocopherol의 효과를 측정한 결과, 세포내 \( \alpha \)-tocopherol의 농도가 \(0.6\sim 1.0 \mathrm{nmole}/\mathrm{cells}\)일 때 세포생존율이 가장 높게 나타나 \( \alpha \)-tocopherol은 자유라디칼 소거제로서 작용한다고 추정하였다. 또한, Younes 및 Siegers는 세포의 지질과산화는 \( \alpha \)-tocopherol의 합량에 의존한다고 보고하였으며, Liebler 등은 간세포내에서 \( a \)-tocopherol의 항산화효과에 있어서 ascorbic acid의 작용을 검토한 결과, ascorbic acid 단독으로 사용헸을 때는 prooxidant로 작용하였으나 \( \alpha \)-toco-pherol과 병용사용에 의해 \( \alpha \)-tocopherol의 감소를 방지하는 것으로 보아 상승제로 작용한다고 보고하였다.</p><h2>세포배양계에서 항산화효소 활성에 미치는 가수분해물의 영향</h2><p>세포배양계에서의 계란 노른자 단백질의 \( 5 \mathrm{~K} \) 가수분해물이 항산화 효소활성에 미치는 효과를 관찰하기 위하여 ca-talase, SOD, glutathione peroxidase 및 glutathione-5- trans-ferase (GST)의 활성을 검토하였다. \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)로 분해하여 무독화시키는 catalase의 경우, \( t\)-BHP로 유도된 실험군을 \( t \)-BHP를 첨가하지 않은 대조군과 비교하였을 때는 유의성있는 변화가 관찰되지 않았지만, \( 5 \mathrm{~K} \) 가수분해물과 \( t \)-BHP를 함께 첨가한 실험군을 대조군과 비교하였을 때는 대조군보다 1.5배 유의성있게 증가하였다 (\(\mathrm{P}<0.05\), Fig. 4). 이러한 catalase 활성의 증가는 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 및 유기과산화물의 축적을 방지하며, 나아가서 \(\cdot~ \mathrm{OH} \)의 생성도 감소시켜 지질, 단백질 및 DNA 등의 세포구성 성분의 산화를 억제할 것으로 사료된다.</p><p>Superoxide anion을 제거하는 SOD 활성의 경우, \( t\)-BHP로 유도된 실험군에서는 \(t\)-BHP를 첨가하지 않은 대조군에 비해 활성이 약간 증가하였고, \( 5 \mathrm{~K} \) 가수분해물과 \(t\)-BHP를 함께 첨가한 실험군에서는 대조군에 비해 약간 감소하였지만, 유의성있는 변화는 관찰되지 않았다 \( (\mathrm{P}<0.05\),Fig. 5). 또한, Lipid peroxide 및 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)의 분해를 촉매하는 GSH peroxidase의 경우, \(t\)-BHP로 유도된 실험군은 대조군보다 1.4배, \( 5 \mathrm{~K} \) 가수분해물과 함께 사용한 실험군은 대조군보다 1.8배 증가하여 대조군보다 활성이 유의성있게 증가하였다 \( (\mathrm{P}<0.05 \), Fig. 6). 한편, 생체내에서 GSH와 conjugation되면서 여러 가지 세포독성을 가지는 이물질의 무독화 작용과 산화적 피해로부터 세포를 방어하는 역할을 하는 GST의 경우, \( t \)-BHP로 유도된 실험군에서는 \( t \)-BHP를 첨가하지 않은 대조군에 비해 활성이 1.5배, \( 5 \mathrm{~K} \) 가수분해물과 \( t\)-BHP를 함께 첨가한 실험군에서는 대조군에 비해 1.8배 증가하는 경향을 나타내었다 (\(\mathrm{P}<0.05 \), Fig. 7)</p><p>이 결과는 최 등이 배양간세포 \( \left(\mathrm{AC}_{2} \mathrm{~F}\right) \)에서 녹용의 항산화효소 활성을 측정한 결과, catalase, GSH peroxidase 및 GST 활성은 \( t\)-BHP 처리군보다 녹용과 \( t \)-BHP를 함께 처리한 실험군에서 더 높은 활성을 나타내었고, SOD 활성만 실험군이 대조군에 비해서 약간 낮은 활성을 나타내었다고 보고한 결과와 일치하였다.</p><p>이상의 결과로 볼 때 \( t\)-BHP의 처리로 세포괴사를 유발시킨 후, \( 5 \mathrm{~K} \) 가수분해물을 첨가하였을 때 세포 생존율이 증가하는 것은 catalase, GSH peroxidase 및 GSH reductase 등의 항산화효소 활성의 증가에 기인하는 것으로 사료된다.</p>
본 실험에서 노른자 단백질 가수분해에 사용한 효소는 무엇인가?
Alcalase