<h1>고 찰</h1><p>본 연구에서는 wt SOD1과 mutant SOD1 (G93A)이 HtrA2 serine protease의 기질임을 in vitro에서 확인 하였다. 또한 antioxidant enzyme 기능을 하는 wt SOD1과 mutation에 의해 ALS를 유발하는 것으로 알려져 있는 SOD1 (G93A) 단백질을 대장균 내에서 높은 순도로 정제할 수 있는 적정 조건과 시스템을 확립하였다. 발현을 유도하기 전에는 확인하기 어려웠던 \( 45 \mathrm{kDa} \) 크기의 GST-SOD와 GST-G93A 단백질을 IPTG로 GST-fusion 단백질의 발현을 유도하면 적은양의 배지에 배양하여도 많은 양의 soluble form SOD1과 mutant SOD1 (G93A) 단백질을 회수할 수 있었다. 이렇게 pGEX system을 이용하여 단일정제 방법으로 간단하게 다량의 SOD1 단백질을 얻을 수 있어, 다양한 생화학적 실험 연구에 이용할 수 있는 reagent를 용이하게 확보할 수 있다.</p><p>HtrA2 단백질 고유의 기능인 serine protease activity를 이용한 in vitro cleavage test로 \(14\sim21\mathrm{Da}\) 사이에서 4개의 단백질 fragment가 확인 되었고, 이 중 \(19 \mathrm{kDa} \)과 \(21 \mathrm{kDa} \) fragment들은 FLAG antibody를 이용한 Western blot analysis로 확인할 수 있었다. 따라서 SDS-PAGE system과 Western blot analysis를 이용하여 Th-SOD1과 \( 19,21 \mathrm{kDa} \) fragment들의 크기를 비교한 결과, HtrA2가 주로 SOD1의 N-terminus에 존재 하는 amino acid residue를 절단하여 단백질 fragment를 생성한다는 것을 알 수 있다. 또 다른 두 개의 밴드는 GST 항체, FLAG 항체, SOD1 항체들과는 반응하지 않으므로 C-terminal FLAG tag과 SOD1 항체가 인지하는 부위가 HtrA2에 의해 제거된 fragment임을 알 수 있다. Thrombin에 의해 절단되어 생성되는 SOD1의 N-terminus 앞쪽의 flanking amino acid와 C-terminal FLAG을 포함하여 170개의 amino acid로 이루어져 있는 Th-SOD1의 분자량 \(23\mathrm{kDa} \)을 기준으로 하여, SOD1의 어느 amino acid가 HtrA2에 의해 절단되어 \( 19 \mathrm{kDa} \)과 \( 21 \mathrm{kDa} \) fragment들이 생성되는 지 그 cleavage site를 추론할 수 있다. 이 중 major band인 \( 21\mathrm{kDa}\) 은 SOD1의 N-terminus로부터 9번째 leucine (L)과 10번째 lysine (K) 사이의 peptide bond가 HtrA2에 의해 절단되어 생성되는 fragment일 것이라 예상할 수 있다. 또 다른 minor cleavage site는 23번째 glutamine (Q)과 24번째 lysine (K) 사이의 peptide bond일 것으로 예상할 수 있다. 정확한 cleavage site를 알기 위해서는 이 fragment들을 정제하여 N-terminal amino acid sequencing을 수행할 펼요가 있을 것으로 생각한다. HtrA2 serine protease가 인지하는 특정 amino acid sequence는 아직 정확하게 알려겨 있지 않지만, peptide libraries를 기질로 이용하여 확인한 실험 결과에 의하면 HtrA2는 주로 aliphatic residue와 small non-polar residues 사이를 자른다고 보고되어 있다. 그러나 HtrA2가 기질을 선택할 때 protein-protein interaction을 중재하는 PDZ domain이 중요한 역할을 할 수 있으므로, HtrA2에 의한 기질단백질의 cleavage site 결정은 amino acids sequence는 물론, 단백질의 conformation도 중요한 역할을 할 것이다.</p><p>최근 연구들을 살펴보면 HtrA2 serine protease에 의해 apoptosis 조절 단백질로 알려진 HS1-associated protein X-1 (HAX-1), apollon, XIAP등이 절단된다는 보고들이 있다. HtrA2에 의해 SOD1이 절단된다는 본 연구결과를 바탕으로 ROS 관련 세포사멸자극에 의해 HtrA2가 cytosol로 release 되면서 superoxide radical을 제거하는 SOD1의 기능 조절에 관여할 수 있다는 가능성을 제시한다. 또한, 정상적인 상태에서는 mitochondria의 intermembrane에 존재하는 HtrA2 단백질이 mitochondria에 위치하는 mutant SOD1 (G93A)을 절단하여 제거할 수 있지만, mnd2 mouse에서처럼 HtrA2의 protease domain의 mutation에 의해 inactive HtrA2로 존재하게 되면 mutant SOD1 (G93A)의 제거가 정상적으로 이루어 지지 않아 보다 더 많은 aggregate를 형성하게 되어 mitochondria의 dysfunction을 야기할 순 있다.</p><p>ALS환자에서 발견되는 mutant SOD1 G93A 의 경우는 세포내에서 형성되어 mitochondria의 apoptosis 조절 단백질들과 binding한다고 알려져 있는데, GST-G93A가 wt GST-SOD1 보다 더 insoluble하다는 결과는 mammalian cell 에서 확인된 결과와 유사하며 대장균에서도 mutant SOD1 (G93A)이 쉽게 aggregate를 형성 할 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 mutant SOD1의 aggregate형성과 퇴행성 뇌질환의 발병기전과의 상관관계를 연구하는 데 있어서 대장균을 이용한 단백질 발현 시스템의 이용이 가능하다는 것을 말해준다.</p><p>본 실험의 결과와 여러 연구결과들을 바탕으로 HtrA2의 serine protease는 caspase-independent 세포사멸 이외에도 SOD1과 같이 세포 내에서 중요한 역할을 하는 여러 단백질의 기능을 조절할 뿐만 아니라 disease의 발병에도 중요한 역할을 담당하는 필수적인 조절인자로 작용할 수 있다는 가능성을 제시한다.</p>
본 연구에서 wt SOD1이 HtrA2 serine protease의 기질임을 확인했어?
YES