<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물 재료 및 MeJA 처리</h2><p>Rapid cycling B. oleracea 인 TO1000DH3 (Brassica oleracea var. acephala)와 브로콜리 Early big (Brassica oleracea var. italica Plenck) 두 계통이 본 실험에 사용되었다. 종자를 상토에 파종하여 16 시간의 광주기, \( 22^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( 50 \% \) 상대습도 조건에서 3주 간 키웠다. 3주 자란 TO1000DH3와 Early big 유묘 에 \(200 \mu \mathrm{M} \) 의 MeJA를 분사하였고, 12,24 및 48 시간 후에 뿌리를 제거한 지상부를 채취하였다. MeJA 를 처리하여 준비된 샘플은 글루코시놀레이트 함량 분석과 RNA 추출을 위하여 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다.</p><h2>글루코시놀레이트 추출 및 HPLC 분석</h2><p>MeJA 처리 후 샘플링하여 얻은 시료는 동결건조하여 파쇄하였다. 건조된 분말 시료 \( 100 \mathrm{~mg} \) 을 \( 2 \mathrm{~mL} \) 튜브에 넣고 끓는 \( 70 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v})\) methanol을 \( 1.5 \mathrm{~mL} \) 첨가하여 혼합하였다. \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분동안 글루코시놀레이트를 추출하여 원심분리 (\(12,000 \mathrm{~rpm}, 10 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C} \) ) 후 상층액을 수거하였다. 동일한 과정으로 총 3회 추출하여 각 상층액을 모두 합하였다. 미니 칼럼 충진용 DEAE Sephadex A-25 는 초순수에 녹여 sodium acetate \(0.5\mathrm{M}\)을 넣고 \( \mathrm{H}^{+} \)형태로 활성화시켰다. Mini-column에 상기의 활성화된 DEAE Sephadex A-25 를 넣은 후 글루코시놀레이트 추출물을 로딩 후 추출물이 다 빠지면 증류수 \( 2 \mathrm{~mL} \) 을 로딩하여 컬럼을 세척하였다. Aryl sulfatase solution ( \( 115 \mathrm{~mg} / 5 \mathrm{~mL}) \) \( 75 ~\mu \mathrm{L} \) 를 넣은 후 16 시간 동안 상온에서 정치하였다. 초순수 \( 1.5 \mathrm{~mL} \) 로 글루코시놀레이트를 용출하였고, \( 0.45 ~ \mu \mathrm{m}\) hydrophilic PTFE syringe filter (직경 \( 13 \mathrm{~mm} \) )로 여과한 후 HPLC용 vial병에 넣어 냉장 보관하였다.</p><p>글루코시놀레이트 함량 분석은 1200 series HPLC system를 사용하였고, 분석 컬럼은 Inertsil ODS-3 column (\( 150 \times 3.0 \mathrm{mm} \) I.d., particle size \( 3 \mu \mathrm{m} \)) 을 사용하였다. 컬럼 온도는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \), 검출 파장은 \( 227 \mathrm{~nm} \), 유량은 \( 0.2 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) 로 설정하였고, 시료는 automatic injector를 사용하여 \( 10 ~\mu \mathrm{L} \) 주입하였다. 초순수와 acetonitrile를 이동상 용액으로 사용하였다. Acetonitrile를 18 분까지는 \( 7 \rightarrow 24 \% \) 로 증가시키고, 32 분까지는 \( 24 \% \) 를 유지시키고 \( 32.1 \) 분에 \( 24 \rightarrow 7 \% \) 로 감소, 40 분까지 \( 7 \% \) 를 유지시켰다. 각 GSL 성분의 정량은 외부 표준물질인 sinigrin (\( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \)) 의 HPLC 피크 면적과 각 성분의 면적을 비교하고 그 값에 response factor를 적용하여 정량화( \( \mu \mathrm{mol} / \mathrm{g}\) dry wt.) 하였다.</p><h2>RNA 추출 및 전사체 분석</h2><p>MeJA 를 처리하여 준비한 TO1000DH3와 Early big 샘플 로부터 TRIzol을 이용하여 total RNA를 추출하였다. 전사체 정보 생산을 위해 Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2(catalog #RS-122-2001; Illumina, CA, USA)를 이용하여 paired-end library를 제작하였으며, RNA-seq은 염기서열 생산은 HiSeq2500 platform을 이용하여 수행되었다. Short read의 전처리 과정을 위하여 SolexaQA에서 제공하는 DynamicTrim과 LengthSort 프로그램을 사용하였으며 \(\text{phred score} \mathrm{Q} \geq 20 \), \(\text{short read length} \geq 25 \) 기준으로 clean read를 선발하였다.</p><p>Quality trimming을 통해 얻은 clean read들은 Bowtie2 프로그램을 이용하여 TO1000DH3의 reference genome (GCA_000695525.1)에 mapping하여 유전자 발현양을 비교 분석하였다. 데이터의 편차에 대한 normalization은 DESeq library를 이용하여 수행하였다. 획득한 전사체 중 글루코시놀레이트 생합성 경로 관련 유전자는 110 개의 Arabidopsis thaliana 유전자를 이용하여 BLAST 분석 (e-value \( 1^{e^{-10}} \), identity 70 이상)을 통해 선발하였다. 샘플 간 차별적으로 발현하는 유전자 (DEGs)는 발현값이 2 배 이상 차이가 나는 \( \geq 2 \) fold change와 FDR (False Discovery Rate)값 0.01 이하인 조건을 동시에 만족하는 전사체를 선발하여 분석하였다. 선발된 DEGs의 GO 분석은 web-based 분석 툴인 Plant Transcriptional Regulatory Map 을 이용하여 cut-off value를 FDR 값 0.05 이하로 설정하여 다중 비교 검정을 보정하였다.</p>
MeJA 를 처리하여 준비된 샘플은 몇 도의 온도에서 보관하였나요?
\( -80^{\circ} \mathrm{C} \)