<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주 및 파아지 분리 재료</h2><p>호염성 파아지 분리에 사용한 균주는 천일염으로부터 분리 동정된 Haloarcular sp. EH-1을 사용하였으며, 일반가정에서 담근 멸치 젓갈을 파아지 분리 재료로 사용하였다.</p><h2>사용배지</h2><p>증균 및 파아지 액체배지는 Sehgal and Gibbons 복합배지를 사용하였으며, 용균반 헝성을 위해서 \( 1.5 \% \) agar가 첨가된 Sehgal and Gibbons 평판배지와 \(0.5\%\) agar가 첨가된 중층배지를 사용하였다. 전자현미경 관찰을 위한 파아지 현탁액으로는 \( 25 \% \mathrm{NaCl} \) 과 \( 0.08 \mathrm{M} \mathrm{MgSO} \) 가 포함된 용액을 사용하였다.</p><h2>파아지의 분리 및 정량</h2><p>파아지의 분리를 위해 Pauling의 방법에 따라 숙주 균을 증균배지에서 대수증식기까지 진탕배양한 다음 여과한 멸치 젓갈을 균배양액에 혼합하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(48\sim72\)시간 진탕배양하였다. 배양액을 원심분리(\(12,000 \mathrm{rpm}\), 10분)하여 상등액을 중층법으로 준비된 평판위에 한방울 떨어뜨려서 플라스틱 용기에 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 57일간 배양하고 용균부 위를 관찰하여 파아지의 존재유무를 확인하였다. 반점 시험으로 배양 상등액의 파아지액을 중층법으로 용균반 형성을 확인한 후, 한 용균반을 선택하여 2회 이상 단일 용균반을 분리하여 파아지를 순수분리하였다.</p><h2>전자현미경에 의한 파아지 형태 관찰</h2><p>200 메시의 구리 그리드에 콜로디온 지지막을 입히고 탄소를 증착시킨 후 농축 정제된 파아지액 \( 3 \mu \mathrm{l} \) 를 묻혀 1시간 정도 건조시키고 \( 1 \% \) glutaraldehyde - \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium cacodylate 완충액 \( (\mathrm{pH} 7.4\))에서 2시간 동안 고정시킨 후 \( 4 \% \) uranyl acetate 용액으로 \(30\sim60\)초 동안 염색을 하고 3 회 수세하여 건조시킨 후 전자현미경(JEM 122 EX-Ⅱ, JEOL, Japan)으로 \( 80 \mathrm{kV} \) 하에서 형태를 관찰하였다.</p><h2>Isolation of halophage DNA</h2><p>Halophage DNA 분리를 위해 먼저 정제된 파아지액에 동량의 \( 20 \%\) PEG 6000 이 늑아있는 \( 2.5 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \) 액을 첨가 하여 \( 4 \mathrm{C} \) 에서 하룻밤 방치한 후 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}\), 10분)하여 모은 침전물을 TE 완충액 \( (1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-Cl, \(\mathrm{pH} 7.5\)) \( 500 \mu \ell \) 로 현탁하였다. 이 현탁액에 동일한 양의 페놀을 첨가하고 10 분간 vortex하여 방치한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}\), 5 분)한 다음 상등액을 분리하고 동일한 양의 페놀/클로로포롬을 첨가해서 잘 혼합한 후 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}\), 5분)하여 분리한 상등액에 다시 동일한 양의 클로로포름을 넣고 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}\), 5분) 하여 상등액을 회수하였다. 이 상등액에 1/10 의 \( 3 \mathrm{M} \) sodium acetate \((\mathrm{pH} 5.2)\)와 2 배의 \( 100^{\%} \) 에탄올 \( \left(-20^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 을 넣어 반응액을 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하룻밤 보관한 후 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}\), 10 분)한 다음, 계속해서 \( 70 \% \) 에탄올로 수세하였다. 모아진 침전물은 건조시키고 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 TE 완충액으로 녹인 다음 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다.</p>
Halophage DNA 분리 하려고 제일 먼저 뭐를 했어?
정제된 파아지액에 동량의 \( 20 \%\) PEG 6000 이 늑아있는 \( 2.5 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \) 액을 첨가 하여 \( 4 \mathrm{C} \) 에서 하룻밤 방치한 후 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}\), 10분)하여 모은 침전물을 TE 완충액 \( (1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-Cl, \(\mathrm{pH} 7.5\)) \( 500 \mu \ell \) 로 현탁