<h2>Lactate dehydrogenase 동위효소의 정제: affinity chromatography</h2><p>피루브산 유사물이며 LDH에 대해 경쟁적 억제제인 ox-amate를 결합시킨 sepharose gel에 LDH를 NADH와 함께 가하면 결합된다. NADH 대신 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer를 가하면 \( \mathrm{A}_{4} \)와 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소는 abortive complex (\(\mathrm{E-NAD}^ + \)-피루브산)를 형성하는 정도의 차이로 인해 oxamate에 대한 친화 정도가 다르므로 정제할 수 있다. 따라서 시료를 가한 후 \( 0.2 \mathrm{mM}\) NADH가 함유된 buffer를 유입하면 LDH를 제외한 단백질이 모두 용출되고, \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer를 유입 시 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소가 용출되었고, 평형 buffer를 유입 시 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소가 용출되었다. 그리고 종의 진화에 따라 LDH 하부단위체 \(\mathrm{A}\), \(\mathrm{B}\) 및 \(\mathrm{C}\)의 분화정도가 다르므로 LDH 동위효소는 역학적 특성의 차이로 인해 affinity chromatography 상에서 다양한 정제 양상을 나타내므로 이를 비교하여 동위효소의 기능은 물론 진화상의 유연관계를 고찰할 수 있다. 풀망둑 골격근 조직의 LDH \(\mathrm{A}_{4} \) 동위효소는 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer를 유입한 후 33-72번 분획 (\(53-96 \mathrm{ml}\))에서 용출되었다(Fig. 2). 심장, 눈 및 뇌 조직을 합한 조직액의 LDH 동위효소는 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer를 유입한 후 45-61번 분획(\(72-98 \mathrm{ml}\))에서 용출되었고(Fig. 3) \( \mathrm{A}_{4} \)에 이어 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 용출되므로 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)가 \( \mathrm{B}_{4} \)보다 \( \mathrm{A}_{4} \)와 유사한 것으로 나타났다. 전기영동을 실시하여 단일밴드로 정제된 분획만 모아 농축한 후 다시 전기영동하여 골격근에서 정제한 \( \mathrm{A}_{4} \)는 단일밴드로 정제되었으나 눈 조직에서 정제한 LDH는 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 와 \( \mathrm{C}_{3} \mathrm{~A} \)가 함께 분리되었다(Fig. 4 A ). 그리고 골격근의 정제한 \( \mathrm{A}_{4} \) 분획은 SDS-PAGE 결과 단일 단백질로 확인되었으며 하부단위체 \( \mathrm{A} \)의 분자량은 \( 34,000 \mathrm{Da} \)로 확인되었다(Fig 4B).그리고 다른 종들의 LDH 동위효소의 affinity chromatog-raphy에서 용출되는 양상과 비교하면 \( \mathrm{NAD}^{+} \)유입 후 고등어 \( \mathrm{A}_{4} \)는 \(40-56 \mathrm{ml}\), 생쥐 \( \mathrm{A}_{4} \)는 \(66-92 \mathrm{ml}\)에서 용출되었고, buffer 유입 후 고등어 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 는 \(20-45 \mathrm{ml}\), 모래 무지 \( \mathrm{A}_{4} \)는 \(44-52 \mathrm{ml}\), 칠성장어 \(46-76 \mathrm{ml}\), 소 \( \mathrm{B}_{4} \) 는 \(66-72 \mathrm{ml} \)에서 용출되어 고등어 \( \mathrm{A}_{4} \)가 분화되어 기능이 뚜렷하고, \( \mathrm{A}_{4} \)와 \( \mathrm{C}_{4} \)가 독립된 것으로 보고되었다. 본 실험의 풀망둑의 \( \mathrm{A}_{4} \)가 \( \mathrm{NAD}^{+} \)유입후 \( 53-96 \mathrm{ml} \)에서 확인되어 고등어 \( \mathrm{A}_{4} \)와 생쥐 \( \mathrm{A}_{4} \)사이에서 분리되었고, eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)도 \( \mathrm{A}_{4} \)에 인접해 용출되므로 고등어 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)와 달리 \( \mathrm{A}_{4} \)와 유사하게 진화되었음을 알 수 있었다. 따라서 풀망둑 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소는 고등어와 같이 분화된 종의 \( \mathrm{A}_{4} \)와 \( \mathrm{B}_{4} \) 사이의 역학적 특성을 나타냈으며, buffer 유입 후 용출되는 모래무지 \( \mathrm{A}_{4} \)와 칠성장어 LDH 보다 \( \mathrm{A}_{4} \)의 역학적 특성에 유사하였다.</p>
LDH를 제외한 단백질이 모두 용출시키고 싶으면 무엇을 넣어야 해?
\( 0.2 \mathrm{mM}\) NADH가 함유된 buffer