<h1>재료 및 방법</h1><h2>시료제조</h2><p>본 실험에 사용된 어리연꽃은 국내산으로 광주광역시에 소재한 농업회사법인 (주)로터스그린에서 구매하여 사용하였으며, 국립생물자원관 생물자원연구부 식물자원과의 확증표본(NIBRVP 0000592689)으로 생물 종 판별 시스템에 의해 확인되었다. 어리연꽃의 전초는 음건한 후 실온에서 methyl alcohol 에 3일 동안 침지시키고 이 과정을 3회 반복하여 농축 후 동결 건조하여 추출물을 얻었다.</p><h2>시약 및 기기</h2><p>세포독성 측정에 사용된 세포주는 마우스 멜라노마 세포인 B16F10으로 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, mushroom tyrosinase, tyrosine, L-DOPA, 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyl-tetra zolium-bromide (MTT)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 세포배양을 위해 dulbecco's modified eagle medium, fetal bovine serum, penicillin/strepto-mycin, trypsin 250,0.4\( \% \) trypan blue stain와 RIPA buffer는 Hyclone (Logan, UT, USA)에서 구입하여 사용하였다. cAMP와 PKA kit는 Enzo (Famingdale, NY, USA)에서 구매하였으며, 1차 항체 mouse anti-microphthalmia-associated transcription factor (MITF), TRP1, TRP2, goat anti-tyrosinase와 mouse-anti-goat IgG rabbit-anti-mouse IgG 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX, USA)에서 구입하였다. mRNA 측정된 시약인 Go Script \( ^{\mathrm{TM}} \) Reverse Transcriptase, GoTaq Flexi DNA Polymerase는 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하여 사용하였다. 또한 사용된 측정기기는 ELISA reader (Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 분석하였다.</p><h2>MTT assay에 의한 세포 생존율 측정</h2><p>세포를 48-well plate에 \( 5 \times 10^{4} \) cells/well 이 되게 500 \( \mu \mathrm{L} \)씩 분주하고, 5\( \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 배양 하였다. 배양 후 어리연꽃 추출물을 농도별로 처리 한 후 48시간 배양하였다. 배양 후 5 \( \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농도로 제조한 MTT 용액 50 \( \mu \mathrm{L} \) 를 첨가하여 3시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 500\( \mu \mathrm{L} \) 를 가하여 실온에서 15 분간 반응 시킨 뒤 microplate reader로 540 \( \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Tyrosinase 저해활성 및 Melanin synthesis측정</h2><p>Tyrsosinase 저해활성 측정은 버섯유래의 tyrosinase와 B16F10세포내에서의 cellular tyrosinase 저해활성을 측정하였다. 먼저 버섯 유래의 tyrosinase 저해능은 0.175 \( \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} \) )6.8 100 \( \mu \mathrm{L} \) 에 10 \( \mathrm{mM} \) L-DOPA를 녹인 기질액 40\( \mu \mathrm{L} \) 및 시료용액 20 \( \mu \mathrm{L} \) 의 혼합액에 mushroom tyrosinase125 \( (\mathrm{U} / \mathrm{mL}) 40 \mu \mathrm{L} \) 를 첨가하여 25\( ^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475 \( \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였으며, B16F10에서 유래된 cellular tyrosinase 저해활성은 \( 5 \times 10^{4} \) cells/well에 lysis buffer ( 67 \( \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer, 1 \(\%\) triton X-100, 0.1 \( \mathrm{mM} \) phenylmethyl sulfonyfluoride) 80\( \mu \mathrm{L} \) 를 첨가한 후 얼음에 방치한 후 13,200\( \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리 하여 얻어진 상등액을 효소용액으로 사용하여 67 \( \mathrm{mM} \) phosphate buffer, \( \mathrm{pH} \) 6.8에 녹인 8.0 \( \mathrm{mM} \) 의 L-DOPA 160 \( \mu \mathrm{L} \)를 기질로, 세포 상등액 40\( \mu \mathrm{L} \) 을 첨가하여 37\( ^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60 분간 반응한 후, 생성된 DOPA chrome의 양을 490\( \mathrm{nm} \) 에서 측정하였다.</p><p>멜라닌 함량 측정은 상기의B16F10세포의 원심분리 후 남은 pellet을 이용하여 멜라닌 함량 측정에 사용하였다. 상등액이 제거 된 pellet을 건조 시킨 뒤 1 \(\mathrm{N}\) \( \mathrm{NaOH}\) 1\( \mathrm{~mL} \) 를 넣어 80\( ^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 시간 반응시킨 후 405 \( \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p>
어리연꽃의 추출물을 어떻게 얻는가?
음건한 후 실온에서 methyl alcohol 에 3일 동안 침지시키고 이 과정을 3회 반복하여 농축 후 동결 건조