<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료와 genomic DNA 추출</h2><p>한국에 자생하는 조팝나무속 14종, 조팝나무(Spiraea prunifolia for. simpliciflora NAKAI), 인가목조팝나무(Spiraea chamaedryfolia var. ulmifolia (Scop.) MAXIM.), 떡조팝나무(Spiraea chartacea NAKAI), 당조팝나무(Spiraea chinensis MAXIM.), 둥근잎조팝나무(Spiraea fritschiana var. obtusifolia NAKAI), 덤불조팝나무(Spiraea miyabei KOIDZ.), 갈기조팝나무(Spiraea trichocarpa NAKAI), 참조팝나무(Spiraea fritschiana SCHNEID), 일본조팝나무(Spiraea japonica L.), 아구장나무(Spiraea pubescens TURCZ.), 꼬리조팝나무(Spiraea salicifolia L.), 산조팝나무(Spiraea blumei G. DON), 공조팝나무(Spiraea cantoniensis LOUR.), 가는잎조팝나무(Spiraea thunbergii SIEBID)를 채집하였다(Table 1). 각 종당 수령 3년 이상의 식물체에서 20개체로부터 잎을 취하였다. 집단간 분석을 위하여 한 개체 당 하나의 잎에서 각각 DNA를 추출하여 집단 간 차이를 비교하는데 사용하였다. 같은 층층나무과의 식나무(Aucuba japonica THUNBERG)를 대조군으로 사용하였다.</p><p>각 식물체로부터 DNA를 추출하기 위하여 Plant DNA Zol Reagent (Life Technologies Inc., Grand Island, New York, USA)를 사용하였는데 사용자의 지침서에 의거하여 추출하였다. 건조시킨 후 TE \( 100 \mathrm{ul} \)에 용해하였다. 3일간 냉장 보관한 후 DNA정량을 체크하여 DNA 농도가 균질하게 조정하였다.</p><h2>ITS 분석</h2><p>ITS1-5.8S-ITS2의 서열은 White 등의 방법에 따랐다. ITS1, ITS2, ITS3, ITS4의 염기 시발체를 이용하여 유전자 증폭(PCR)을 실시하였다(Table 2). 이들은 리보소옴 coding 부위인 18S와 28S rRNA 유전자 부위와 noncoding 부위인 5.8S rRNA 유전자부위를 증폭하였다.</p><p>PCR 반응을 위하여 추출한 각 분류군의 게놈 DNA \( 50 \mathrm{ng} \), 각 dNTP \( 100 \mathrm{uM} \), 시발체 각 \( 0.2 \mathrm{uM}, 1 \mathrm{x} \) enzyme buffer, Taq polymerase \( 2 \mathrm{unit} \)를 넣고 증류수로 전체 \( 50 \mathrm{ul} \) volume이 되도록 추가하였다. 증폭반응은 초기 \( 94^{\circ} \mathrm{C} ~ 90 \mathrm{sec} \) 간 변성한 후, 28 사이클로 \( 94^{\circ} \mathrm{C} ~ 30 \mathrm{sec}, 42^{\circ} \mathrm{C} ~ 60 \mathrm{sec}, 72^{\circ} \mathrm{C} ~ 60 \mathrm{sec} \) 간 실시하였고 추가로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} 5 \) 분간 연장하였다.</p><p>PCR 산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel에서 분리하였으며 ethidium bromide로 염색하여 밴드를 현상하였다. 이때 절편들의 상대적 크기를 비교하기 위해 \( 100 \mathrm{bp} \) ladder DNA marker를 같이 loading시켰다. Alpha Image TM (Alpha Innotech Co, USA)을 사용하여 밴드 양상을 조사하였다. 이후 젤에서 DNA를 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)로 추출하였다. 추출된 DNA를 bluescript vector와 ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystem, USA)로 서열화하였다.</p><h2>계통관계 분석</h2><p>서열에서 결손부위를 포함한 서열 배당은 MEGA4 version 4.0과 Clustal X program으로 분석하였다. 최절약법에 의한 tree (MP)는 heuristic search, branch-swapping options, tree bisection-reconnection에 따랐다. 계통분석의 분지는 PHYLIP version 3.57의 NEIGHBOR, neighbor-joining(NJ) 방법에 의해 구성하였다. Bootstrap 분석은 1,000회 반복법으로 실시하였다.</p><p>분류군 간 유전적 거리(I)와 유전적 동질성(D)은 분류군간 염기쌍의 비교로 산출하였다.</p>
한 개체 당 하나의 잎에서 각각 DNA를 추출하여 어디에 사용했지?
집단 간 차이를 비교하는데 사용