<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포 배양</h2><p>EpH4와 ras oncogene이 과발현되도록 transfection하여 제작된 EpRas 세포를 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, \(10 \%\) FBS), penicillin G, streptomycin sulfate, Gibco BRL, RockviUe, MD, USA)을 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\) \(5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 키웠다. EpH4 세포는 쥐의 유선 상피세포이며, EpRas 세포는 EpH4 세포에 ras 유전자를 발현시킨 세포로서 Martin Oft 박사(Onyx Pharmaceuticals, California, USA)로부터 제공받아 본 실험에 사용하였다.</p><h2>Apoptosis assay</h2><p>EpH4 세포의 사멸을 관찰하기위해 DNA의 internucleosomal fragmentation을 detection하는 cell death detection ELISA kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)를 사용하였다. TGF-\(\beta \)(\( 5\mathrm{ng} / \mathrm{ml} \), R&D Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA) 처리한 EpH4 세포로부터 각 시간마다 cell lysate를 추출하고 cell death detection ELISA kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)와 반응시킨 후 ELISA reader (Bio-Rad Model 550 Microplate Reader, USA)를 이용하여 세포의 사멸 정도를 측정하였다.</p><h2>RNA 추출 및 Northern blot analysis</h2><p>TGF-\(\beta \)를 처리한 EpH4 세포와 EpRas 세포로부터 total RNA를 RNAeasy kit (QIAGEN Inc. Germany)를 이용하여 추출하고, 추출한 RNA는 \( \mathrm{A}_{260} \)에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 추출한 RNA \( 10 \mu \mathrm{g} \)을 formaldehyde-agarose gel에 전기영동하고, nylon filter로 옮긴 후 \(\alpha-^{32} \mathrm{P} \)로 label된 Gadd45 유전자를 probe로 사용하여 hybridization을 수행하였다. nylon filter를 SSC/SDS solution으로 세 번 씻은 후 autoradiography를 통해 Gadd45b 유전자의 발현을 확인하였다.</p><h2>Deletion mutants 제조 및 promoter 분석</h2><p>Mouse Gadd45b 유전자의 promoter 부위 4,730 base pair를 pGL3-Basic vector (Promega, Madison, WIZ USA)에 cloning 하고 그 염기서열은 sequencing을 통해 확인하였다. 여러 세트의 primer를 설계한 후 PCR을 이용하여 여러 종류의 de­letion mutants를 제작하였다. Promoter activity를 측정하기 위해서 reporter 유전자로 사용하는 luciferase 활성을 측정하였다. Luciferase 활성을 측정하기위해 \( 2.0 \times 10^{5} \)개의 세포를 6-well plate에 분주하고, 24시간 후에 각각의 mutant들을 fugene 6(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)를 이용하여 transfection 시킨 다음 약 40시간 후에 Dual Luciferase Reporter Assay kit(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 각 세포들의 luciferase 활성을 측정하였다.</p><h2>Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)</h2><p>TGF-\(\beta \)를 처리한 EpH4 세포로부터 nuclear extract 추출 한 후, \( 10 \mu \mathrm{g} \)의 nuclear extract를 Gadd45b promoter의 \(+5\)에서 \(+35\)사이의 sequence를 합성하여 \( \gamma^{-{ }^{32} \mathrm{P}} \)로 label한 probe (Fig. 3A)와 반응시켰다. Competition 실험을 위해 label 되지 않은 probe와 동일한 oligonucleotide를 probe의 양에 비해 100배 첨가하였으며, probe를 넣기 전에 nuclear extract와 반응시켰다. 반응액을 \(5 \%\) polyacrylamide gel에 전기영동 시키고, autoradiography로 probe에 binding함을 확인하였다.</p>
추출한 것을 어디에 전기영동했는가?
formaldehyde-agarose gel