<h1>재료 및 방법</h1><h2>벡터 제작</h2><p>먼저, 쌍자엽식물용 과발현 벡터를 제작하기 위해, intact CaMV 35S 프로모터(\( 351 \mathrm{bp} \)), 애기장대 UBQ3 프로모터 (\( 1.25 \mathrm{~kb} \)), 애기장대 UBQ10 프로모터 (\( 0.9 \mathrm{~kb} \)) 부위를 PCR로 증폭하여 pPZP211 벡터의 HindIII-PstI 위치에 클로닝하였다. \( -90 \sim -47 \) 부위가 제거된 modified CaMV 35S 프로모터를 제작하기 위해, \( -46 \sim+8 \) 의 core 부분을 PCR로 증폭하여 pBluescrpt Ⅱ KS (pBSIIKS) 벡터(Stratagene, Netherlands)의 EcoRI-PstI 위치에 클로닝 하고, 클로닝 된 벡터의 HindIII-EcoRI 위치에 CaMV35S 프로모터의 B 도메인(\( -343 \sim -91 \))을 클로닝 하였다. 재조합된 modified CaMV35S 프로모터(B-core 도메인)를 pPZP211 벡터의 HindIII-PstI 위치에 클로닝 하였다. pPZP211에 각각 클로닝 된 UBQ3, UBQ10 그리고 modified CaMV 35S 프로모터의 뒷 부위의 Sad-EcoRI 위치에 Nos termi-nator를 클로닝 하여, 제조된 벡터를 각각 pFGL847, pFGL846, pFGL571이라 명명하였다. Modified CaMV 35S 프로모터에 대한 대조구 벡터로 intact CaMV 35S 프로모터::omega 서열::Nos terminator를 pPZP211 벡터에 클로닝 하여 이를 pFGL772라 명명하였다. Omega 서열은 유전자의 전사에는 영향을 미치지 않으며 해독의 효율을 높이는 기능을 가지는 것으로 보고되어 있다. 제조된 벡터의 프로모터 활성을 확인하기 위해, \( \beta \) -glucuronidase (GUS) 유전자의 암호화 부위를 pFGL846, pFGL847, pFGL571, pFGL772 벡터의 BamHI-Sad 위치에 각각 클로닝 하였으며, 다른 리포터 유전자로 synthetic Green Fluorescence Protein (sGFP) 유전자의 암호화 부위를 pFGL571 벡터의 PstI-Xbal 위치에 클로닝 하였다.</p><p>RNAi 벡터의 제조를 위해, 벼의 OSEMF1 유전자(AF326768)의 세 번째 인트론 부위 중 \( 204 \mathrm{bp} \) 를 PCR로 증폭하여 pBSIIKS 벡터의 HindIII-EcoRI 위치에 클로닝 하여 RNAi 벡터로 사용할 수 있는 pFGL727을 제조하였다. 위 실험의 PCR 과정에 사용된 프라이머는 Table 1 에 나타내었다.</p><h2>식물 재료 및 생장 조건</h2><p>애기장대(Arabidopsis thaliana)는 Columbia ecotype을 사용하였다. 애기장대 종자는 \( 70 \% \) ethanol에서 1분, \( 10 \% \) clorox에서 10 분간 소독한 뒤 증류수로 3회 이상 세척하고, 암상태로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2일 동안 두어 춘화처리를 처리한 다음, vitamin B5, \( 1.5 \% \) sucrose, \( 0.7 \% \) microagar가 포함된 MS (Murashige and Skoog) 배지에 발아하였다. 발아된 애기장대 종자는 \( 22^{\circ} \mathrm{C} \) 의 단일 조건(light \( 8 \mathrm{hr} / \) dark \( 16 \mathrm{hr} \) )에서 배양하였고, 10-12일 후 흙으로 옮겨 장일조건(light \( 16 \mathrm{hr} / \) dark \( 8 \mathrm{hr} \) )에서 배양하였다.</p><p>pFGL727 벡터가 유전자 발현 억제에 이용될 수 있는지 확인하기 위한 형질전환 식물체로는 벼의 유전자에 대한 RNAi 형질전환체를 사용하였다. 이 형질전환체 제조를 위해 OsDEG10의 암호화 부위 일부를 pFGL727 벡터에 각각 역방향으로 클로닝 한 후 RNAi 벡터를 제조하였다</p>
쌍자엽식물용 과발현 벡터를 제작하기 위해 어느 부위를 PCR로 증폭했어?
intact CaMV 35S 프로모터(\( 351 \mathrm{bp} \)), 애기장대 UBQ3 프로모터 (\( 1.25 \mathrm{~kb} \)), 애기장대 UBQ10 프로모터 (\( 0.9 \mathrm{~kb} \))