<h1>재료 및 방법</h1><p>실험을 위하여 옥수수 (Zea mays L. cv Golden Cross Bantam 70) 종자를 1 차 증류수에 2-4 시간 불린 후에 Hetz 등의 방법을 작용하여 젖은 paper towel에 일렬로 배열하여 동심원으로 감아 세우고, 증류수 또는 처리하고자 하는 농도의 알코올이 포함된 용액 \( 100 \mathrm{ml} \) 에 하부를 담가 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(3\)일간 생장시켰다. RNA 및 단백질 추출 재료로는 \(3\)일된 옥수수의 뿌리 끝 \( 1 \mathrm{cm} \) 를 채취하여 액체질소 존재 하에 막자 사발을 이용하여 파쇄하였다.</p><p>RT-PCR 수행을 위해서 easy-BLUE \( { }^{\mathrm{TM}} \) Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Korea) 을 이용하여 total RNA를 추출하였다. 역전사는 \( 2 \mu \mathrm{g} \) 의 RNA와 \( 1 \mu \mathrm{g} \) 의 Oligo dT 를 넣어 total volume이 \( 15 \mu \mathrm{l} \) 가 되도록 조절하고 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(5\)분 동안 incubation시킨 후 \(200\) units의 M-MLV reverse transcriptase (Promega, USA)를 가하여 M-MLV 공급사가 제공한 표준 방법을 따라 수행하였다. AO1 과 AO2에 특이적인 primer 들과 대조구로 옥수수 actin primer를 이용하여 Thermocycler (WhatmanBiometraⓇ, Germany)를 이용하여 40cycle (각 cycle은 \( 94^{\circ} \mathrm{C}\) 30초, \( 57^{\circ} \mathrm{C}\) 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 30초로 구성)의 PCR 을 수행 하였다. 사용한 primer의 염기서열은 다음과 같다.</p><p>AO 1 - Forward: GGAGAGTCTCGAAGCTAAGTCCAA - Reverse: GCCCTCGATCTGGCCCAAGTCT</p><p>AO2 - Forward: GGAGAATCTGGAGGCTAAAACTGG - Reverse: ACCTTCCACCTGCCCCAAATCG</p><p>Actin - Forward: GTGACAATGGCACTGGAATG - Reverse: GGCCCATGCCGACCATGACA</p><p>단백질 추출, native-PAGE와 zymogram을 활용한 알데히드 산화효소의 활성 측정 그리고 Western 분석은 이전 보고와 동일하게 실시하였다.</p><h1>결과 및 고찰</h1><p>에탄올의 효과를 관찰하기 위하여 옥수수가 생장하는 \(3\)일간 에탄올을 \( 0.2-1.0 \% \) 구간에서 처리하고 단백질을 추출하여 indole-3-carboxyaldehyde를 기질로 zymogram법에 의하여 알데히드 산화효소의 활성을 검출한 결과 농도 구간에 따라서 알데히드 산화효소의 활성 변화가 관찰되었다. 뿌리에 처리된 에탄올의 농도가 \( 0.4 \% \) 이하에서는 알데히드 산화효소의 활성이 대조구에 비하여 약간 낮았지만 에탄올의 농도가 \( 0.8 \% \) 이상이 되면 대조구에 비하여 오히려 높았다. 동일한 조건에서 크산틴 탈수소효소의 활성에는 변화가 없었으므로 관찰된 변화는 일반적인 단백질 함량의 변화에 의한 것이 아니라 특정 농도의 에탄올에 대한 알데히드 산화효소 고유의 반응인 것으로 판단되었다. 에탄올에 의하여 증가된 알데히드 산화효소의 활성이 에탄올의 산화산물인 아세트알데히드를 제거하기 위한 것인지 확인하고자 아세트알데히드를 기질로 zymogram test를 실시하였으나 알데히드 산화효소는 아세트알데히드에 대하여 아무런 활성을 나타내지 않았다. 식물의 알데히드 산화효소는 아세트알데히드에 대하여 활성을 나타낸다는 논문이 있기는 했었지만, 본 실험의 결과는 알데히드 산화효소가 일반적으로 고리 구조를 포함하는 알데히드 화합물에 활성을 나타내며 아세트알데히드 제거에는 활성을 나타내지 않는다는 동물에서의 실험 결과와 일치하는 것이었다.</p><p>에탄올에 의한 알데히드 산화효소의 활성 증가가 알데히드 산화효소 유전자의 전사(transcription) 증가에 기인한 것인지 확인하고자 농도별로 에탄올이 처리된 옥수수 뿌리에서 RNA를 추출하여 역전사시킨 후 각각 AO1 과 AO2 에 특이적인 primer 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 그러나 에탄올 처리에 의하여 변화하는 알데히드 산화효소의 활성과는 달리 AO1 과 AO2 의 mRNA 수준에는 뚜렷한 변화가 나타나지 않았다.</p><p>에탄올에 의한 알데히드 산화효소의 활성 증가는 알데히드 산화효소 단백질의 함량 증가와 관계가 있었다. 알데히드 산화효소를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 Western 분석결과 처리된 에탄올의 농도 증가에 따라서 알데히드 산화효소 단백질의 함량이 현저히 증가하였다. 이러한 알데히드 산화효소 단백질의 함량 증가는 에탄올에 의하여서만 이루어질 뿐 메탄올이나 이소프로판올에 의해서는 거의 영향을 받지 않았다. 이 결과들은 관찰된 알데히드 산화효소의 활성 증가가 알데히드 산화효소 단백질 함량 증가에 기인하며 옥수수 뿌리는 저산소 조건에서 정상적인 생리반응에 의하여 경험할 수 있는 에탄올에 대하여만 반응하고 약리적으로 처리된 메탄올이나 이소프로판올에 대하여는 반응하지 않는다는 것을 의미한다. 에탄올에 의하여 알데히드 산화효소의 함량이 높아지기는 하지만 Western 분석에 사용한 항체는 AO1 과 AO2를 모두 인식하는 것으로서 AO1 과 AO2 각각의 변화는 구분되지 않았다. Westerm 분석에 의한 알데히드 산화효소 단백질의 함량 조사 결과는 에탄올 농도 증가에 정비례하여 증가하는 반면 zymogram에 의한 활성 조사는 에탄올 \( 0.4 \% \) 이하에서는 감소하고 \( 0.8 \% \) 이상에서 증가하는 양면성을 나타내었다. 알데히드 산화효소의 조절은 단백질 함량 조절 외에도 몰리브덴 조요소(cofactor)를 필요로 하는 다른 효소들과 마찬가지로 알데히드 산화효소의 활성형 (active form)과 비활성형(inactive form) 사이의 비율 변화에 의해서도 이루어질 수 있는 것으로 제시되었다. 그러므로, 저농도의 에탄올 존재하에서 알데히드 산화효소의 함량이 증가하는 데에도 활성 증가가 나타나지 않는 이유가 저농도의 에탄올 존재 하에서는 전체 알데히드 산화효소 중 비활성형 효소의 비율이 높기 때문일 것으로 사료된다.</p>
뿌리에 에탄올을 처리했을 때, 에탄올의 농도가 \( 0.4 \% \) 이하에서는 알데히드 산화효소의 활성이 어떻게 나타났어?
대조구에 비하여 약간 낮았지만