<h2>16S rDNA 염기서열에 의한 분석</h2><p>V. vulnificus로 동정된 분리 균주의 genomic DNA를 주형으로 하여 진정세균의 universial primer를 사용하여 PCR 를 수행 반응산물을 얻었고 전기영동을 실시하여 \( 1.5 \mathrm{~kb} \) 정도의 전기영동 산물을 얻을 수 있었다. 본 분리균주들의 16S rDNA 염기서열분석 결과 표준균주인 V. vulnificus ATCC 27562 와 \( 99 \% \) 일치하였다. 또한 Vibrio속의 다른 균주들과 분리균주들의 염기서열을 이용한 phylogenetic tree는 Fig. 1과 같으며 대천에서 분리된 2균주 DCH 1, 2 및 다대포 분리 균주인 DDP3는 대조균주와 거의 일치하였으며 다대포에서 분리된 DDP1, 2 균주는 대천의 분리균주와는 약간의 차이를 보였다. 염기서열 분석결과와 API kit 성상들에 의한 동정결과는 일치하였다. 16S rRNA} \) 유전자는 염기서열이 종 특이적으로 잘 보존되어 있어 V. vulnificus외에도 다른 Vibrio종간의 확인에도 유용하게 사용될 수 있으며 Dorsh 등은 \( V \). vulnificus의 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 \( V \). vulnificus 는 다른 비브리오종들과 상당한 거리를 나타내는 Vibrio anguillarum과 상동성이 큰 것으로 보고하였다. 본 연구결과 역시 분리균주들은 대조균주와 높은 상동성을 가지면서 Vibrio anguillarum과는 다른 Vibrio속의 균주들보다 유연관계가 높은 것을 확인할 수 있었다.</p><h2>분리균주의 단배질 발현 특성</h2><p>V. vulnificus를 검출하기 위한 방법들로는 증균배지에 증식시킨 후 선택배지에 도말하여 특징적인 집락을 취하여 각종 생화학 검사를 실시하는 방법이 보편적으로 사용되고 있으며 그 외에 16S rRNA, 23S rRNA 유전자의 염기서열 또는 cytotoxin-hemolysin 유전자의 염기서열 결정법과 항혈청을 사용하는 immunoassay, 표면항원의 분석 등이 있다.</p><p>본 실험에서는 \( V \). vulnificus에 특이적인 외막단백질을 탐색하고 이를 이용한 균주 검출 방법을 개발하기 위하여 표준 균주로 사용된 V. vulnificus ATCC 27562와 해양에서 분리한 균주들의 외막단백질의 발현을 비교분석하였다. 또한 외막 단백질과 cell lysates의 비교를 위하여 분리균주와 표준균주들을 파쇄하여 얻어진 cell lysates의 단백질 전기영동을 실시하였다. \( 35 \mathrm{kDa} \) 에서 표준균주와 DDP-1, DCH-2 및 DCH-3에서 유사 단백 밴드가 확인되었으나 DDP-3 및 DCH-1에서는 밴드가 확인되지 않았으며 전체적인 단백밴드는 많은 차이를 보여 cell lysate를 이용한 Vibrio vulnificus의 검출방법에는 적합하지 않았다(Fig. 2). 외막단백질만을 분리하여 전기영동으로 분석한 결과 \( V \). vulnificus 표준균주 및 분리균주들은 \( 40 \mathrm{kDa} \) 부근에서 공통 단백질 밴드를 확인할 수 있었으나 V. parahaemolyticus는 \( 40 \mathrm{kDa} \) 근처에서 발현되는 단백질 분자량이 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 분리균주의 신속한 동정과 검출을 위해 종 특이적인 유전자의 증폭, RFLP등의 많은 연구 보고가 이루어지고 있으며 또한 특이적인 표면항원을 탐색하여 ELISA와 Western blotting과 같은 면역학적 방법으로 다른 균주와의 pattern을 비교 분석하여 동정하는 방법의 연구도 진행되고 있다. 본 실험에서도 종 특이적인 외막단백질을 분리, 정제하여 이에 대한 항체로써 균주를 분리 및 동정할 수 있는 면역학적 방법에 따른 동정을 위한 기초 자료로 사용하고자 하였다. Cell lysates를 분리하여 표준균주로 사용된 V. vulnificus ATCC 27562 와 해양에서 분리한 균주들을 비교한 결과 표준 균주와 분리균주 사이에서의 단백질 패턴은 차이가 많았다. 그러나 외막단백질 발현 양상에서는 공통의 단백밴드를 확인할 수 있었으며 이를 이용한 종 특이적 항원에 대한 연구가 진행된다면 신속진단법에 개발에 응용이 가능할 것으로 사료된다.</p>
API kit 성상들에 의한 동정결과는 일치한다는 사실을 판명하기 위해 무엇을 했어?
염기서열 분석