<h2>세포독성 측정</h2><p>세포 독성은 Rakib (34)의 방법에 준하여 MTT assay법을 사용하였다. 시료 및 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 가 처리된 세포의 배지를 제거하고 PBS 로 세척 후 MTT 시약을 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도가 되게 PBS에 녹여 이를 \( 100 \mu \mathrm{l} / \) well씩 분주하고 은박지를 씌워 3 시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubater에서 반응시켰다. MTT 시약을 제거하고 PBS로 세척 후 DMSO 를 \( 200 \mu \mathrm{ll} / \) well씩 분주하여 생성된 formazan crystal 을 녹인 후 96 well plate에 \( 100 \mathrm{\mu l} / \) well씩 옮겨서 Anthos2020 model Microplate Reader (Anthos Labtech Instruments, Wals., Austria)로 \( 570 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Apoptotic sub-G1기 분석</h2><p>Apoptotic sub-G1기 분석은 Kim 의 방법에 준하여 분석하였다. 시료 및 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 가 처리된 세포의 배지를 제거하고 PBS로 세척(3 회)후 \( 70 \% \) 에탄올 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 처리하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 고정하였다. 다시 PBS \( 1 \mathrm{ml} \) 로 세척(3 회)하고 1 \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 RNase와 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 PI가 함유되어있는 PBS를 500 \( \mu 1 \) 씩 처리한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분간 반응시켰다. 이를 Facs용 tube로 옮겨 Facs Caliular flow cytometer (BD Bioscience, San Jose, CA)를 이용하여 10,000개의 세포 DNA 함량을 분석하였다. 데이터는 CellQuestPro software (BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.</p><h2>핵의 형태학적 변화 분석</h2><p>Hoechst33258 염색은 Islam 의 방법에 준하여 실시하였다. 시료 및 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 가 처리된 세포의 배지를 제거하고 PBS로 세척 (3 회)후 \( 4 \% \) paraformaldehyde로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 동안 고정하였다. 고정한 세포를 PBS로 3 회 세척한 후 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) Hoechst33258이 함유된 PBS를 5 pl처리하여 상온에서 30 분간 염색하였다. 그리고 Fluorescence microscope (Olympus DP70 Digital Camera System)을 이용하여 핵 염색을 관찰하였다.</p><h2>Caspase-3 발현 분석</h2><p>Western blot 분석은 Kim의 방법에 준하여 실시하였다. 시료 및 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 가 처리된 세포의 배지를 제거하고 PBS로 세척(3 회) 후 처리구별로 모아서 lysis buffer를 \( 700 \mu 1 \) 씩 처리하여 세포 파쇄기로 1 분간 파쇄하고 원심분리 \( (3,000 \mathrm{rpm}\), 5분) 후 상등액만을 따로 모았다. Acrylamide \( 10 \% \) gel을 이용하여 전기영동 후 western blot transfer kit를 이용하여 transfer 하였다. 그 membrane을 \( 5 \% \) BSA에 24시간 blocking 시키고 1XTTBS로 세척(15 분, 3 회)하였다. 다시 \( 5 \% \) BSA 에 각각의 caspase-3, \( \beta \)-actin을 \( 5 \% \) BSA에 \( 1: 1000,1: 2000 \) 으로 희석시켜 반응시킨 후 1XTTBS 로 세척(15 분, 3 회)하고 \( 5 \% \) BSA에 각각 의 2차 항체(goat-anti rabbit, goat-anti mouse)를 적정 비율로 희석시켜 반응시키고 1XTTBS로 세척(15 분, 3 회)하였다. 각 membrane을 3M paper로 수분을 제거하고 양 면을 ECL용액에 1 분씩 반응시킨 후 감광 kit를 이용하여 감광하였다.</p><h2>항산화능 측정</h2><p>항산화능은 Blois의 방법[2]에 준하여 실시하였다. 시료 추출물을 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 과 \( 0.25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 제조한 후 \( 0.3 \mathrm{mM} \) DPPH/methanol 용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 에 시료 \( 0.6 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 Spectrophotometer (X-ma 3000pc, Human corporation, Seoul, Korea)를 이용하여 \( 517 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>총 페놀 함량 분석</h2><p>총 페놀 함량 측정에는 Folin-Deins법을 사용하였다. 시료 추출물 \( 5 \mathrm{mg} \) 을 증류수 \( 10 \mathrm{ml} \) 에 녹여 여과하여 사용하였다. 시료 \( 200 \mu \) 를 증류수 \( 2.6 \mathrm{ml} \) 과 Folin-Ciocalter's phenol 시약 \( 200 \mu 1 \) 를 첨가하여 6 분간 상온에서 반응시켰다. \( 7 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)\( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 용액 \( 2 \mathrm{ml} \) 을 첨가하고 90 분간 정치한 후 \( 750 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 gallic acid 20,60,80,100, \( 500 \mathrm{ppm} \) )를 사용하였다.</p>
시료 및 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)가 처리된 배지에 무엇을 첨가하였는가?
\( 70 \% \) 에탄올 \( 1 \mathrm{ml} \)