<h3>자성 bead의 blocking 및 핵산의 capturing</h3><p>First-strand full-length cDNA/mRNA hybrid를 streptavidin (CPG, New Jersey, USA)으로 coating된 MPG (magnetic porous glass) 입자에 capturing시켰다. 핵산 결합전에 \( 100 \mathrm{ul} \)의 bead (\(1\%\) 현탁액: \( 1 \mathrm{mg} \) 의 bead는 \( 800 \mathrm{pmol} \) 의 biotin화된 25-mer oligonucleotide를 결합시킬 수 있음)를 \( 10 \mathrm{ul} \)의 \( 40 \mathrm{ug} / \mathrm{ul} \) DNA-free tRNA를 첨가하여 blocking 시켜, 얼음 위에서 혼합하면서 1시간 방응 시켰다. 핵산 capturing 직전에 magnetic stand를 이용하여 bead를 분리하며, pipetting하여 상청을 제거하였다. Blocking 절차 후에 bead를 \( 500 \mathrm{ul} \) 의 \( 2 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \) 및 \( 50 \mathrm{mM} \) EDTA, \(\mathrm{pH} 8.0\) 용액으로 3회 세척하며, \(100 \mathrm{ul}\)의 \( 2 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \) 및 \( 50 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \mathrm{pH} 8.0 \) 용액에 현탁 하였다. cDNA (약 \( 0.5 \mathrm{ug}) \) 를 bead sedimentation을 방지하기 위하여 carrier로서 \( 100 \mathrm{ug} \) 의 tRNA 존재하에 온화하게 혼합하면서 30분간 실온에서 capturing하였다. 비 결합된 cDNA를 제거 후, bead를 \( 100 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) tDNA를 포함한 \( 500 \mathrm{ul} \) 의 \( 2 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \) 및 \( 50 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \mathrm{pH} 8.0 \) 용액으로 4회 세척 하였다. 최후로, cDNA를 \( 100 \mathrm{mM} \mathrm{NaOH}, 5 \mathrm{mM} \) EDTA를 처리한 bead로부터 elution 시킨 후, alkaline gel에 loading하였다 (Fig. 2).</p><h3>First-strand cDNA 준비</h3><p>mRNA의 \( 2 \mu \mathrm{g} \) 는 first-strand XhoI primer-adapter \( 1 \mu \mathrm{g} \) 와 함께 \( 65^{\circ} \mathrm{C}\), 10분간 변성시켰다. 역전사반응은 \( 50 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{Tris-HCl}, \mathrm{pH} 8.3,75 \mathrm{mM} \mathrm{~KCl}, 4.5 \mathrm{mM} \mathrm{~MgCl}_{2}, 10 \mathrm{mM} \) DTT와 각 \( 3 \mathrm{mM} \) 의 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP를 포함한 total \( 20 \mu \mathrm{l} \)의 용액에서 실시하였다. 또한, 방사선표식을 위하여 반응용액에 \(1 \mu \mathrm{l} \) \( \left[\mathrm{a}-^{32} \mathrm{P}\right] \mathrm{dGTP}(3000 \mathrm{Ci} / \mathrm{mMol}, 10 \mathrm{mCi} / \mu \mathrm{l} \), Amersham, UK)를 첨가하였다. Thermal cycler (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems, USA)를 이용하여 primer 회합반응을 수행하였으며, 반응액은 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 전처리한 후, 반응혼합액에 pFLC-Ⅲ를 첨가하였다. 그 후, 회합반응은 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 가 될 때까지 1분에 \( 1^{\circ} \mathrm{C} \)씩 하강시켰다. 그리고 다시 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 연속처리 후, 1시간에 걸 쳐 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)까지 상승시킨 후, 10분간 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 처리하였다. First-strand 합성량을 계산하기 위하여 \( 0.5 \mu \mathrm{l} \) 의 방사선 표식 반응용액을 DE-81 paper상에 spot한 후, 방사능을 측정하여 incorporation (cpm)을 계산하였다.</p>
mRNA의 역전사반응을 실시한 장소는 어디야?
Thermal cycler