<h2>in vitro Excision</h2><p>Phage DNA 추출은 "Wizard \( { }^{\mathbb{Ⓡ}} \) Lambda Preps DNA Purification System" (Promega, USA, cat. #A7290)을 사용하였다. 1회 증폭한 phage stock을 적어도 \( 1 \times 10^{10} \mathrm{pfu} \) 사용하여 실험하였다. in vitro에서 Cre recombinase에 의한 excision을 하기 위해서 phage DNA를 다시 정제하였다. Phage DNA의 여과는 "MicroSpin S-400 HR column" (Amersham Bioscience, cat. #27-5140-01)을 이용하였다. 정제 phage DNA의 agarose gel 전기영동 해석을 하여 phage DNA의 정량 및 품질확인을 하였다. EtBr을 포함한 \( 1 \% \) agarose gel에 \( 2 \mu \mathrm{L} \) 및 \( 5 \mu \mathrm{L} \) 의 시료를 정량 marker ( \( \lambda \)DNA 각 \( 5 \mathrm{ng}, 10 \mathrm{ng}, 30 \mathrm{ng}, 40 \mathrm{ng} \), \( 50 \mathrm{ng} \) )와 함께 단시간 전기영동한 후, 시료를 marker와 비교하여 결정하였다. Phage DNA를 plasmid로 변환하기 위하여 phage DNA의 Cre recombinase를 반응시켜 절출하였다. 통상 New England BioLabs의 Cre recombinase (cat. #M0298 S)를 사용하였다. Kit 내에는 pLox2+control DNA가 포함되어 있으며 control로서 매회 사용하였다. 직선화 한 pLox 2+의 길이는 \( 3.65 \mathrm{~kb} \)로 양쪽으로부터 약 \( 350 \mathrm{bp} \)의 위치에 loxP 부위가 존재하고 있다. 2 개의 loxP 부위간에 복제 origin이나 ampicillin 내성유전자가 위치하고 있고, 이들 2 개의 loxP 부위간에 조환이 일어나면 환상의 ampicillin내성 plasmid가 만들어진다 (Fig. 3). Excision에서 절출한 plasmid DNA를 대장균에 도입시켰다. 박테리아는 ElctroMAX \( { }^{\mathrm{TM}} \) DH10B\( { }^{\mathrm{TM}} \) T1 Phage Resistant Cells (Invitrogen, cat. #12033-015), 전기융합장치는 Disposable Microelectroporation Chamber (Whatman, cat. #11608-031), CELL-PORATOR \( { }^{\mathbb{Ⓡ}} \) Pulse Control and Power Supply (Invitrogen LIFE TECHNOLOGIES \( { }^{\mathrm{TM}} \) )을 사용하였다.</p><h3>cDNA의 \( \mathbf{5}^{\prime} \) 말단 및 \( 3^{\prime} \) 말단의 sequence 해석</h3><p>BigDye \( ^{\mathrm{R}} \) Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem사)를 이용하여 cDNA의 5'말단 및 3'말단의 염기를 해석하였다. 5'말단배열 해석용 primer (M13-21 seq. primer)로서는 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3', 3'말단배열 해석용 primer로서는 RV-M primer; 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3' 및 T7 promoter primer; 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'를 사용하였다.</p><h3>Fox-hunting system을 이용한 Agrobacterium library 작제</h3><p>cDNA insert를 혼합물체로 강발현 대장균 plasmid vector로 옮겨 필요량의 대장균을 수집, plasmid 추출 후, Agrobacterium에 도입하여 Agrobacterium library를 제작하였다. 완전장 cDNA의 번역개시 ATG codon이 promoter뒤에 반드시 결합되도록 완전장 cDNA를 강발현 vector와 함께 디자인하였다. 그래서 우선 강발현형 binary vector에의 삽입 공정을 위하여 완전장 cDNA를 특정 제한효소로 절단하여 insert cDNA를 회수하며 동일의 제한효소로 절단한 강발현 vector에 도입하였다. 이와 같이 구축된 vector를 대장균에 cloning하고, colony-PCR법에 의해 순도를 확인 한 후, Agrobacterium에 도입하여 library를 구축하였다.</p>
Wizard \( { }^{\mathbb{Ⓡ}} \) Lambda Preps DNA Purification System을 사용해서 무엇을 하였나?
Phage DNA 추출