<h1>재료 및 방법</h1><h2>실혐 재료</h2><p>두충잎 분말은 그린내츄럴(Jindo, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Folin-Ciocalteu reagent, gallic acid, 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH), ferric ferricyanide, \( \alpha \)-tocopherol 및 indole-3-carbinol은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 인체 비소세포폐암세포(human non-small cell lung cancer cell, A549), 결장암세포(human colon cancer cell, SNU-C4), 자궁경부암세포(human cervical cancer cell, HeLa) 및 인체 배아 폐 상피세포(human embryonic lung epithelial cell, L132)는 American Type Culture Collection (Manassa, VA, USA)의 세포주를 배양하여 사용하였다. RPMI-1640, fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin 및 trypsin-EDTA 는 HyClone (Logan, UT, USA)의 제품을, Cell Counting Kit-8 (CCK-8)은 Dojindo (Kumamoto, Japan)의 제품을 사용하였다.</p><h2>아세톤 추출물 제조</h2><p>두충잎 분말은 \(60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4시간 건조한 후 재분쇄하여 \(100-300 \mu \mathrm{m} \) 크기의 입자만을 시로로 사용하였다. 두충잎 분말에 10배(\(\mathrm{w/w}\))의 아세톤을 넝고 항온진탕조를 사용하여 상온에서 2시간 동안 추출하였다. 상온에서 원심분리 \( (2,000 \times g,\) 5분\( ) \) 하여 상징액을 얻고 \(60 ^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 아세톤을 증발시켜 두충잎 아세톤 추출물을 제조하였다.</p><h2>총 폐놀성 화합물 함량</h2><p>두충잎 아세톤 추출물의 총 페놀성 화합물 함량은 Folin-Ciocalteu reagent를 사용하여 측정하였다. 두충잎 추출물에 Folin-Ciocalteu 시약을 부가허여 상온에서 3분간 반응시키고, \(10\%~\mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 용액을 넣고 상온에서 1시간 정치시킨 후 \(725\mathrm{nm}\)에서의 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 mg gallic acid equivalent \( (GAE)/ \mathrm{g} \)-추출물로 나타내었다.</p><h2>In vitro 항암 활성</h2><p>두충잎 아세톤 추출물의 암세포 증식억제 활성은 CCK-8을 이용하여 측정하였다. 두충잎 추출물을 에탄올에 용해한 뒤 배지에 희석하여 사용하였고, 이때 에탄올의 최종 농도가 \(0.1\%(\mathrm{v/v}\))이 초과되지 않도록 하였다. 암세포(A549, SNU-C4, HeLa) 와 정상세포(L132)는 \(5\%\) FBS와 penicillin-streptomycin이 포함된 RPMI-1640 배지에서 \(5\%~\mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 조건으로 24시간 배양허였다. 이후 배양액을 신선한 배지로 교체한 뒤 희석한 두충잎 추출물을 농도별로 처리하고 동일 조건에서 배양하였다. 앙성대조군인 indol-3-carbinol을 농도별로 처리허여 암세포 증식억제 활성을 비교하였다. 24시간 후 실힘군과 대조군의 배양액을 제거한 후 각각 CCK-8 용엑과 serum-free RPMI-1640을 첨가하여 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 450nm 에서 흡광도를 측정하였다. 암세포 증식억제 활성(%)은 (대조군의 흡광도-실험군의 흡광도)/대조군의 흡광도 \( \times 100 \) 으로 계산하였다.</p>
Folin-Ciocalteu reagent를 사용하여 무엇의 함량을 측정하였나요?
총 페놀성 화합물 함량