<h1>결과 및 고찰</h1><h2>Colony 활성 염색</h2><p>숙주세포인 BL21(DE3)과 pTCGT1 단독 발현, pGro7과의 공발현 형질전환체를 CS 배지 (cgt와 groEL/ES 유도제를 첨가하지 않은 배지, \( 1 \mathrm{mM} \) IPTG와 \( 1 \mathrm{mg} \) L-arabinose/\( \mathrm{ml} \)의 함유 배지)에 도말하여 \( 37{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20시간 배양 후 iodine 증기에 의해 colony 활성 염색을 한 결과, 유도제 비첨가 배지에서는 전분 분해 활성이 전혀 나타나지 않은 반면, 유도체 첨가한 pTCGT1 단독 발현과 pGro7과의 공발현에서 큰 전분 분해 환을 형성하여 CGTase의 활성을 나타내었다. 이 결과로 CGTase 단독발현과 GroEL/ES 공발현에서 모두 성공적으로 CGTase가 발현됨을 알 수 있었다. CGTase 단독발현인 경우 생산된 CGTase의 대부분은 비가용성 봉입체로 생산됨은 이미 보고된 바 있다.</p><h2>L-arabinose 농도에 따른 CGTase의 활성과 GroEL/ES와의 공발현 효과</h2><p>CGTase를 soluble한 형태의 발현을 증가시키기 위해 GroEL/ES와의 공발현을 행하였다. 먼저 GroEL/ES 발현에 있어서 L-arabinose의 최적 농도를 결정하였다. CGTase 발현을 위한 IPTG 최적 농도는 \( 1 \mathrm{mM} \)로 결정되었으며, \( 10 \mathrm{ml} ~LB \) \( (20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin과 \( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) chloramphenicol 포함) tube에서 \( 0.4 \sim 0.5 \mathrm{OD}_{600} \) 일 때 \( 0 \sim 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도의 L-arabinose를, \( 0.8 \sim 1.0 \mathrm{OD}_{600} \)일 때 \( 1 \mathrm{mM} \)의 IPTG를 첨가하였다. IPTG 첨가 후 4시간 동안 유도한 후 균체를 회수하였다. 그 결과 균체증식은 L-arabinose 농도가 증가할수록 조금씩 증가하였고, 가용성 분획에서의 CGTase 활성은 \( 0.3 \mathrm{mg} \) L-arabinose/ \( \mathrm{ml} \)에서 가장 높은 \( 0.66 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \)로 나타났다. 그리고 CGTase와 GroEL/ES 단백질의 발현 양상을 알아보기 위해, 균체를 가용성과 비가용성 분획으로 나누어 SDS-PAGE를 행하였다. 그 결과 \( 60 \mathrm{kDa} \)의 GroEL은 대부분 가용성 분획에서 나타났고, CGTase band는 GroEL/ES의 공발현에 의해 가용성 분획에서 \( 70 \mathrm{kDa} \)의 뚜렷한 CGTase band를 확인할 수 있었다. 이것은 과 생산된 GroEL/ES chaperone 단백질이 CGTase 봉입체를 가용화하며, 또한 unfolding 된 CGTase 단백질을 활성형의 3차 구조로 환원시키는 역할을 한 것으로 사료된다.</p><h2>IPTG 첨가 시기에 따른 soluble CGTase의 생산</h2><p>GroEL/ES chaperone의 최적 유도 시간을 결정하기 위해 working volume \( 80 \mathrm{ml} \) baffled flask에 접종 후 배양 2시간 째 \( 0.3 \mathrm{mg} \) L-arabinose/ \( \mathrm{ml} \)을 첨가하고, 이후 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5시간 때 각각 \( 1 \mathrm{mM} \) 의 \( \mathrm{IPTG} \) 를 첨가하였다. 그 결과, L-arabinose 첨가 후 1.5시간 유도시킨 후 \( 1 \mathrm{mM} IPTG를 첨가하는 것이 \( 0.73 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \)로 가장 높게 나타났다. 그리고 CGTase 활성은 IPTG 첨가 후 2.5시간 경과 후 (배양 6시간 째) 활성이 최고 수준에 달하고, 그 이후에는 큰 활성의 증가가 없거나 감소하였다. 이는 배양 4시간 동안 세포의 성장이 급속히 이루어지면서 6시간 이후로 산물의 생성도 빨라지게 되고, 과잉 생산된 단백질의 응집되는 속도도 빨라지게 되었기 때문이다. L-Arabinose를 첨가하고 1.5시간 후 IPTG 첨가한 경우, 배양 12시간 째 가용성 및 비가용성 분획을 전기영동하고 CGTase band \( (70 \mathrm{kDa}) \)를 Image analyzer로 scanning 분석하였다. CGTase 단독 발현에서는 가용성 분획에서 CGTase band 비율이 \( 18.8 \% \)로 나타났고, GroEL/ES 공발현에서는 \( 27.9 \% \)로 약 \( 32 \% \)가 증가하였다. 그리고 단독 발현에서는 CGTase 총 단백질 중 \( 20.8 \% \)가 가용성 분획으로 전환되었지만, 공발현에서 \( 33.6 \% \)가 가용성 분획으로 전환되었다. 이 결과는 GroEL/ES chaperone과의 공발현으로 비가용성 CGTase의 많은 양이 가용성 CGTase 단백질으로 전환되었음을 나타낸다.</p><p>이상의 결과로부터 CGTase와 GroEL/ES의 공발현계는 CGTase의 용해도 향상 및 활성형 생산에 효과가 큰 있는 것으로 사료된다.</p>
유도체를 첨가한 배지에서는 무엇의 활성을 볼 수 있었어?
CGTase