<h1>결과 및 고찰</h1><h2>한우 ICER 유전자 서열 및 조직별 발현 양상 분석</h2><p>한우에서 inducible cAMP early repressor (ICER) 유전자를 클로닝하기 위하여 비육 전◦후기 한우 등심조직의 ddRT-PCR 산물 \( 300 \mathrm{bp} \)를 염기서열 결정하였다. 이렇게 얻은 \( 300 \mathrm{bp} \) 염기서열을 한우 등심조직으로부터 도출된 한우 EST (expressed sequence tag)서열 분석 및 BLAST 검색을 통해 4개의 EST 서열의 cluster인 \( 1.6 \mathrm{~kb} \)의 ICER 서열을 얻었다. 이 ICER 유전자 서열로부터 약 \( 1.5 \mathrm{~kb} \)를 증폭할 수 있는 primer를 합성하여 ICER 유전자를 PCR-direct sequencing 하였다. ICER유전자의 단백질 코딩영역(coding region)은 NCBI의 ORF Finder 프로그램을 통하여 추정하였다. Fig.2 에서 보는바와 같이, ICER 유전자의 단백질 코딩영역은 약 \( 800 \mathrm{bp} \)로 추정되었으며, 255개의 아미노산을 코딩하고 있었다. 다른 유전자서열과는 달리, ICER 유전자서열에는 8 개의 아미노산 개시코돈인 ATG 서열이 존재하였다.</p><p>한우 비육초기 및 후기 사이에서 차등유전자 발현패턴을 보인 ICER유전자를 8개 조직에 대해서 유전자발현양상을 분석하였다. ICER유전자는 한우의 소장조직에서 가장 많이 발현하였고, 등심 및 폐 조직에서 역시 다른 조직보다 상대적으로 많은 유전자발현양상을 보였다. 소장조직은 음식물로부터 섭취된 유리 지방산들이 간이나 다른 조직으로 들어가는 통로로서 Zhou 등 이 보고한 대로, ICER 유전자가 유리지방산에 의해서 발현이 증가한다는 결과를 반영하는 결과로 사료된다. 특히, 같은 근육타입인 등심 및 우둔 조직을 비교하였을 때, ICER 유전자는 등심조직에서 1.5배 이상 많은 유전자발현양상을 보인 반면, 등지방 조직에서 아주 낮은 발현양상을 보였다. 이러한 결과는 Hocquette 등이 보고한 결과와 같이, 포도당을 에너지원으로 빠르게 전환하는 해당과정(glycolytic pathway)이 상대적으로 늦은 등심(longissimus dorsi) 조직에서 해당과정 (glycolytic pathway)이 빠른 우둔(Semitendinosus)에서 보다 높기 때문인 것으로 사료되며, ICER 유전자발현이 등지방에서 적은 이유는, in vitro lipogenesis에 있어서, 근내지방세포 (intramuscular adipose tissue)는 \(50-75\%\)의 포도당을 사용하는 반면, 등지방(subcutaneous adipose tissue)는 \( 10 \% \) 내외의 포도당을 이용하기 때문인 것으로 사료된다. 이러한 연구결과에 의해, ICER 유전자 발현은 근내지방이 상대적으로 많은 등심조직에서 높게 나타나는 것으로 판단된다.</p><p>아울러, Lee 등의 결과에 따르면, ICER 유전자발현은 한우 12개월령의 등심조직에서보다 상대적으로 근내지방이 많이 축적된 27개월령의 등심조직에서 그 발현이 6배 이상 증가하는 양상을 보였으며, 아울러 한우 근내지방으로부터 분리한 지방전구세포의 분화가 진행됨에 따라서, ICER 유전자의 발현이 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는 근내지방이 왕성하게 축적된 비육후기에서 ICER 유전자의 발현이 급격하게 증가한다는 것을 보여주는 결과이다.</p><p>Zhou 등은 ICER 유전자는 고농도의 포도당 및 지방산에 의해서 그의 발현이 증가한다고 보고 하였고, Hussain 등은 ICER 유전자의 발현은 in vitro 상태에서 인슐린 유전자의 발현을 억제한다고 보고하였다. 특히, 인슐린은 포도당의 지방세포의 유입을 촉진하여 지방생합성을 촉진하나, ICER 유전자에 의한 인슐린 유전자의 발현 억제는 지방세포내의 지방합성유전자들의 발현을 억제하는 효과를 나타낸다. 따라서, ICER 유전자는 근육조직 내 지방이 충분히 축적되면 그 발현이 증가되어 인슐린 유전자 억제경로를 거쳐 지방생합성 유전자의 발현을 억제함으로 지방축적을 조절하는 것으로 사료된다. 아울러, 근육 내 지방축적과 인슐린 유전자 억제에 의한 지방합성유전자의 발현억제와 관련된 연구 및 해당(glycolytic) 및 산화적인산화(oxidative pathway)과정을 대표하는 근육조직에서 ICER 유전자의 단백질 발현 등의 연구가 추후 수행되어야 할 것으로 사료된다.</p><h2>마블링 수준에 따른 ICER 유전자 발현 분석</h2><p>마블링 수준에 따른 ICER 유전자의 발현양상을 분석하기 위하여, 근육내 조지방함량및 근내지방도 육종가를 근거로 마블링 high 그룹 4두, 마블링 low 그룹 3두를 각각 선발하여 등심조직으로부터 RNA를 추출하여 각 개체별 3반복씩 유전자발현양상을 분석하였다. 선발된 7두의 한우개체는 마블링수준 외에, TDN 함량에 따른 처리효과 및 각기 다른 도축일령이 존재하였다. 따라서, 이들 처리효과를 일반선형모형의 고정효과로 그리고 도축일령을 공변이로 설정하여, 분</p><p>산분석을 통해 ICER 유전자발현량에 대한 각 요인 효과의 유의성을 검정하였다. 그 결과, 마블링수준 \( (P=0.010) \) 및 도축일령 \( (P=0.00005) \)은 ICER 유전자 발현량에 큰 영향을 주는 요소임을 확인하였다. 따라서, ICER 유전자는 한우 마블링수준에 따라 그 발현에 영향을 받음을 알 수 있었고, 근육내 조지방함량 두 그룹(high 및 low) 간 유전자 발현량 차이의 유의성을 검정하기 위해 두 그룹의 최소제곱평균(least square mean)에 대해 t-검정을 실시하였다. Table 3에서 보는 바와 같이, high 그룹과 low 그룹의 ICER 유전자의 \( \triangle \mathrm{Ct} \) 값은 각각 \( 1.03 \pm 0.27\left(2^{-\Delta \mathrm{Ct}} ; 0.4897\right) \) 및 \( 3.12 \pm 0.32\left(2^{-\Delta \mathrm{Ct}} ; 0.1150\right) \)으로 두 그룹의 유전자발현량의 차이는 통계적 유의하였다\( (p<0.05, t=5.35) \). 결론적으로, ICER 유전자는 마블링수준에 따라 그 발현이 영향을 받으며, 특히 근육 내 조지방함량 high 그룹에서 약 4배 이상 발현됨을 알 수 있었다.</p><h2>ICER 유전자 realtime PCR 데이터의 통계적 분석에 대한 고찰</h2><p>최근 마이크로어레이 및 realtime PCR을 이용한 유전자 발현양상 분석이 대중화되어 많은 결과들이 발표되고 있으며, 특히 가축을 이용한 유전자 발현양상 분석에서 접하는 문제점은 동물 집단이 가지고 있는 변이요인(variation source)을 적절하게 고려하지 않아 개체별 유전자 발현양상이 매우 편의(biased)되어 나타나는 것을 보게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 최근 편의(biased)된 결과를 ANOVA 및 혼합모형(mixed model)을 이용하여 고정효과(fixed effects) 및 임의효과(random effects)에 대한 최적선형불편추정(best linear unbiased estimation, BLUE) 및 최적선형불편예측(best linear unbiased prediction, BLUP)을 통한 유전자 발현량 추정 결과들이 보고되고 있다. 특히, Park 등은 시계열(time-course) 마이크로어레이 데이터의 차등발현유전자를 탐색하기 위하여 분산분석(ANOVA) 모델을 이용하였고, Moser 등은 Actinobacillus pleuro-pneumoniae 저항성 및 민감성 그룹 사이에 차등발현유전자 및 geneximmunological 상호작용을 임의효과로 BLUP 추정을 하였다. 최근에는 처리효과에 대한 realtime PCR 결과를 다중회귀모형(multiple regression model)에 적용하여 genextreatment 효과에 대한 차등발현유전자를 탐색한 연구 논문이 보고 되었다. 따라서, 본 연구에서 수행한 마블링 high 및 low 두 그룹 간 ICER 유전자에 대한 realtime PCR 결과의 일반선형모형 분석은 다양한 구조적 및 생물학적 변이요인(variation source)에 의해 영향을 받는 유전자발현 데이터에서 편의(bias)를 제거한 결과를 얻는데 유용한 통계적기법인 것으로 사료된다.</p><p>결론적으로, inducible cAMP early repressor (ICER) 유전자는 근내지방이 왕성하게 축적되는 비육후기 및 high mar-bled 등심조직에서 그의 발현이 증가하였다. 따라서, ICER 유전자는 근내지방 관련 유용 후보유전자임이 판단된다.</p>
한우에서 ICER 유전자를 클로닝하기 위해 무엇을 결정하였는가?
비육 전◦후기 한우 등심조직의 ddRT-PCR 산물 \( 300 \mathrm{bp} \)를 염기서열