<h2>Elastase 저해활성 측정</h2><p>Elastase 저해활성은 Cannell 등의 방법에 따라 측정하였다. 동일 농도의 시료를 조제하여 40 \( \mu \mathrm{L} \)씩 96 well plate에 분주하고, 50 \( \mathrm{mM} \) tris-HCl buffer (\( \mathrm{pH} \) 8.6)에 녹인 2.5 \( \mathrm{U} / \mathrm{mL} \) porcine pancreas elastase 용액을 40 \( \mu \mathrm{L} \) 가한 후 기질로 50 \( \mathrm{mM} \) tris-HCl buffer (\( \mathrm{pH} \) 8.6)에 녹인 n-succinyl-(L-Ala)3-pnitroanilide(0.5 \( \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) \))을 첨가하여 30분 간 반응시킨 후 445 \( \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율(\( \% \))로 나타내었다.</p><h2>Procollagen type-Ⅰ 생합성 측정</h2><p>CCD-986sk cell \( 1 \times 10^{4} \) cells/well 을 96 well plate에 접종한 후 24시간 동안 배양하였다. 그 후 UV-B (20 \( \mathrm{~mJ} / \mathrm{cm}^{2} \)) 를 조사하고 TNF-\( \alpha \) 를 10\( \mathrm{ng} / \mathrm{mL} \) 의 농도로 처리한 후 각 well에 시료를 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 이렇게 배양한 세포의 배양액을 채취하여 procollagen type-C peptide (PIP) EIA kit (Takara Bio)를 사용하여 propeptide의 양을 측정하였다.</p><h2>Tyrosinase 저해활성 측정</h2><p>Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 0.175\( \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.8) 500\( \mu \mathrm{L} \) 에 10\( \mathrm{mM} \) L-DOPA를 녹인 기질액 200\( \mu \mathrm{L} \) 및 시료 100\( \mu \mathrm{L} \) 의 혼합액에 mushroom tyrosinase 110\( ( \mathrm{U} / \mathrm{mL})\) 200\(\mu \mathrm{L} \)을 첨가하여 25\( ^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 492\( \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율\(\%\)로 나타내었다.</p><h2>Western blot을 통한 주름 및 미백 관련 단백질의 발현 측정</h2><p>CCD-986sk cell을 6 well plate에 \( 1 \times 10^{5} \) cells/well이 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후 PBS로 교환하여 UV-B(20 \(\mathrm{~mJ} / \mathrm{cm}^{2}\)) 를 조사하고 다시 배지교환 후, TNF-\( \alpha \) 를 10\( \mathrm{ng} / \) \( \mathrm{mL} \) 의 농도로 첨가하고 시료를 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 후 차가운 PBS로 세척하였다. HEM cell은 6 well plate에 \( 3 \times 10^{5} \) cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였고, 그 후 DMEM 배지로 교환하고 forskolin ( 1\( \mathrm{nM}) \) 과 시료를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 세포는 lysis buffer를 well 당 30\( \mu \mathrm{L} \) 를 첨가하여 세포를 용해시키고 원심분리하여 ( 12,000 \(\mathrm{rpm} \), 4\( ^{\circ} \mathrm{C}\), 20\( \mathrm{~min} \)) 단백질을 추출하였다. 원심분리하여 얻은 단백질은 bradford assay로 정량하였으며, 동일양의 단백질을 10\( \% \) 의 SDS-PAGE를 이용하여 전기영동한 후, PVDF membrane에 transfer하였다. PVDF membrane을 \(1 \times \)TBST에 녹인 5\(\%\) BSA에 1시간 동안 반응시켜 background를 제거하고 TBST로 3회 washing 한 후 primary antibody( \(1: 500)\) 를 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 secondary antibody(\(1: 500\)) 를 2.5시간 동안 반응시키고 TBST로 3회 washing 한 후 Immobilon chemiluminescent reagents로 측정하였다. Band density는 ImageQuant LAS-4000(GE life sciences, Taipei, Taiwan)으로 확인하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>통계처리는 SPSS 10.0을 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(ANOVA: analysis of variance) 프로그램을 이용하여 \( t \)-test를 통해 통계적 유의수준 \( p<0.05 \) 에서 검증하였다.</p>
96 well plate에 접종한 후 몇시간 동안 배양했어?
24시간 동안