<h1>결과 밎 고찰</h1><h2>저해제 생산 균주의 분리</h2><p>우리나라의 남해 연안에서 채집한 각 시료로 부터 약 1,000 균주를 분리하였다. 이 중, Bennet's 배지에서 paper disk 법으로 alkaline protease를 저해하는 9균주를 1차 선별하였다. 1차 선별된 각각의 균주들을 \( 250 \mathrm{ml} \) Erlenmeyer flask내의 Bennet's 액체배지에 접종한 후, 호기적인 조건에서 \( 27^{\circ} \mathrm{C}, 180 \mathrm{rpm} \)으로 4일간 진탕배양하였다. 배양액을 Whatman No. 1 paper로 여과하고, 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm{g}, 10 \) min)하여 얻은 상층액과 subtilisin 효소액을 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 20 \mathrm{~min} \)간 처리하였다. Gelatin이 함유된 test plate에 10 \( \mu \mathrm{l}\)씩을 loading한 paper disk롤 올려놓은 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 48 \mathrm{hr} \) 반응시켰다. 반응 후 clear zone 형성을 저해한 균주를 2차 선별하였다. 2차 선별된 균주 중 ninhydrin 방법을 통해 sub-tilisin에 대한 저해율이 가장 높게 나타난 균주 C12를 최종적으로 선별하였다. 최종 분리된 균주는 \( 20 \% \) (v/v) glycerol을 첨가하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 보관하며 본 실험에 사용하였다.</p><h2>형태학적 \(\cdot\) 배양적 특성</h2><p>분리 선별한 균주의 1차 동정은 형태학적, 배양적 및 생리학적 특성을 검토하고, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 제안되어 있는 International Streptomyces Project (ISP)에 의한 방법으로 분석하였다.</p><p>우선, alkaline protease inhibitor 생산 균주 C12의 형태학적 특성을 조사하기 위해 포자 형성 및 형태 확인용 배지를 이용하여 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4일 동안 배양한 후, 전자현미경으로 관찰하였다. 그 결과 Fig. 2(B)와 같이, C12 포자의 크기는 2.0\( \mu \mathrm{m} \)로 Streptomyces속의 일반적인 포자크기인 \( 0.3 \sim 0.8 \mu \mathrm{m} \)보다는 상당히 신장된 크기였으며, 외형은 원통형으로 편모가 없고 운동성은 없었다. 포자형태는 smooth하였으며, 분절형이었다.</p><p>분리균주는 ISP 9 배지를 제외한 대부분의 배지에서 잘 성장하였으며, 비확산성의 색소를 생산하지 않음을 확인하였다. 포자의 색깔은 ISP 2, starch-casein nitrate 배지에서 하얀색을, nutrient배지는 엷은 노란색을 띄었다. 그 외의 배지에서는 회색을 띄는 것으로 관찰되었다.</p><h2>생리생화학적 특성</h2><p>분리균주의 생리생화학적 특성을 조사한 결과, \( 15 \sim 50^{\circ} \mathrm{C} \) 사이에서 생장하였으며, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서는 전혀 생장하지 못했다. 또한 Gram 양성으로 나타났으며, citrate 음성, catalase 양성 및 melanin 색소를 생성하지 않았다. Starch, gelatin 및 casein을 가수분해하며, \( 9 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \mathrm{NaCl} \)이 포함된 배지에서도 잘 생장하였다. 분리 균주의 생장에 있어 당 이용성을 조사한 결과 glucose, galactose, maltose, lactose, fruc-tose 및 mannose 등은 잘 이용하였지만, sorbitol과 sucrose는 이용하지 못했다. 이상의 결과를 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 준하여 검토한 결과, 실험균주는 Streptomyces 속에 포함됨을 알 수 있었다.</p><h2>16S rDNA 염기서열 분석 및 계통 분류</h2><p>분리균주의 보다 정확한 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다. 분리균주의 genomic DNA를 추출하여 16S rDNA 유전자 primers를 이용하여 PCR을 수행하였다. 16S rDNA 부분 염기서열을 NCBI GenBank에 등록된 유사 균주와 비교분석하여 유전자간 상관성을 비교한 결과, 본 분리규주는 Streptomyces sp. EF-2 (AF112165), Streptomyces thermocarboxydus (AB098079)와 99\(\%\) 유사하였다. Neighbor-joining 방법을 사용하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성한 결과 Fig. 3에서 보는 바와 같이 분리균주 C12는 Streptomyces 속을 포함하는 계통학적 그룹에 속하며, 특히 Streptomyces thermocarboxydus (AB098079)와 높은 유연 관계를 나타내었다. 따라서 본 균주를 Streptomyces sp. C12로 명명하였다. 현재, alkaline protease inhibitor를 생산하는 Streptomyces 속으로 S. coelicolor A3 (2), Streptomyces sp. NCIM 5127, S. albogriseolus S-3253, S. virginiae 등이 알려져 있으며, alkaline protease inhibitor를 생산할 수 있는 해양 방선균에 대한 국내 보고는 본 논문이 처음이다. 본 논문에 사용된 균주는 한국농업미생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KACC 91318P를 부여받았다.</p>
C12 포자는 어떤 형태를 띄고있나요?
원통형