<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료 추출 및 분획</h2><p>실험 재료로 사용한 우산고로쇠(A. okamotoanum)는 국립수목원에서 제공받아 사용하였다. 우산고로쇠를 음건하고 분쇄한 후 환류 냉각 장치가 부착된 추출 장치를 이용하여 \( \mathrm{MeOH} \) 로 3회 추출하여 \( \mathrm{MeOH} \) 추출물을 조제하였다. 추출 후 얻은 우산고로쇠 \( \mathrm{MeOH} \) 추출물은 물에 현탁하여 극성별 유기용매인 \( n-\mathrm{BuOH} \) ( \( \mathrm{BuOH} \)), ethyl acetate ( \( \mathrm{EtOAc} \)), methylene chloride MC 및 \( n \)-hexane \( (\mathrm{Hx}) \) 으로 다시 표준 분획물을 조제하였다.</p><h2>시약</h2><p>In vitro 라디칼 소거능 측정에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)사에서, itrotetrazolium blue chloride (NBT), nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), phenezine methosulfate (PMS)는 Bio Basic (Toronto, Canada) 사의 제품을 구입하여 사용하였다. 총 페놀 및 플라보노이드 함량 측정에 사용한 phenol reagent, tannic acid, quercetin, sodium carbonate \( \left(\mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3}\right) \), sodium nitrite \( \left(\mathrm{NaNO}_{2}\right) \), sodium hydroxide \( (\mathrm{NaOH}) \) 는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)사에서 aluminium chloride (\(\mathrm{AlCl}_{3}\)) 는 Tokyo Chemical (Tokyo, Japan) 에서 구입하여 사용하였다.</p><h2>1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 소거능 측정</h2><p>최종 농도가 5,25,50,100 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 가 되도록 ethanol에 녹인 각 농도 별 주출물과 4가지 유기용매 추출 분획물 100 \( \mu \mathrm{L} \) 와 60 \( \mu \mathrm{M} \) DPPH 용엑 100 \( \mu \mathrm{L} \) 를 96-well plate에 혼합하여 실온에 30분간 방치시킨 후 540 \( \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 측정하였으며, 시료를 첨가하지 않은 대조군과 시료를 첨가한 군을 비교하여 free radical 소거 효과를 백분율(\(\%\))과 \( \mathrm{EC}_{50} \) (DPPH radical을 50 \( \% \) 소거하는데 필요한 시료의 농도)로 나타내었다.</p><p>DPPH radical scavenging activity \( (\%)=\left[\left(\mathrm{A}_{0}-\mathrm{A}_{1}\right) / \mathrm{A}_{0}\right] \times 100 \)</p><p>( \( \mathrm{A}_{0} \) : 대조군의 흡광도 값, \( \mathrm{A}_{1} \) : 시료 처리군의 흡광도 값)</p><h2>Superoxide \( \left(\mathrm{O}_{2}^{-}\right) \)소거능 측정</h2><p>\( \mathrm{O}_{2}^{-} \)소거능 실험은 Nishikimi 등의 방법으로 진행하였다. 최종 농도가 5, 25, 50, 100 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)가 되도록 농도 별로 희석한 0.3 \( \mathrm{~mL} \)의 시료와 0.75 \( \mathrm{~mL} \)의 300 \( \mu \mathrm{M} \) NBT, 936 \( \mu \mathrm{M} \) NADH를 혼합한 후, 100 \( \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer \( (\mathrm{pH} \) 7.4)를 첨가하였다. 다음으로 120 \( \mu \mathrm{M} \) PMS를 0.75 \( \mathrm{~mL} \) 첨가하여 5분간 NBT의 소거를 유도한 후 흡광도 560 \( \mathrm{~nm} \) 에서 소거능을 측정하였다. \( \mathrm{O}_{2}{ }^{-} \)소거능은 시료를 첨가하지 않은 대조군과 시료를 첨가한 군을 비교하여 free radical 소거 효과를 백분율(\(\%\)) 로 나타내었다.</p><p>\( \mathrm{O}_{2}^{-} \)radical scavenging activity \( (\%)=\left[\left(\mathrm{A}_{0}-\mathrm{A}_{1}\right) / \mathrm{A}_{0}\right] \times 100 \)</p><p>( \( \mathrm{A}_{0} \) : 대조군의 흡광도 값, \( \mathrm{A}_{1} \) : 시료 처리군의 흡광도 값)</p>
In vitro 라디칼 소거능 측정에 사용하기 위하여 구매한 시약중에 국내(대한민국)시약제조사가 제작한 시약이 포함되어 있다.
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