<h1>재료 및 방법</h1><h2>산두근 메탄올 추출물(STME)의 제조</h2><p>본 실험에 사용한 산두근(Sophora tonkinensis Gapnep)은 삼흥건재약업사(서울)에서 구입한 후, 잘게 세절하여 분말화한 후, 산두근 \( 100 \mathrm{~g} \)에 메탄올 2\( \mathrm{l} \)를 첨가하여 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 3회 추출하였다. 추출액을 Whatman No.2 paper(Whatman international Ltd., England)로 여과하여 불순물을 제거하고 그 여액을 감압 농축기를 사용하여 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 감압, 농축하여 추출물 \( 19.2 \mathrm{~g} \)을 얻었으며 이를 STME (Sophora tankinensis Gapnep. MeOH extract)로 명명하고 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 초저온 냉동고에 보관하면서 사용하였다. 실험 시에는 이 추출물을 DMSO에 녹여 \( 500 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 만든 다음 이를 적정한 농도로 희석하여 사용하였다.</p><h2>3T3-L1 지방전구세포의 배양 및 성숙지방세포로의 분화 유도</h2><p>본 실험에 사용한 3T3-L1 (mouse embryonic fibroblast cell line) 지방전구세포는 미국세포은행(American Type Culture Collection: ATCC, USA)에서 분양 받아 사용하였다. 세포의 배양은 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 \( 10\% \) bovine calf serum (BCS, Gibco BRL)과 100 \( \mathrm{units}/ \mathrm{ml} \)의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL)을 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양하였다. 지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화는 몇 단계를 거치면서 진행되기 때문에 각 단계를 날짜 별로 표기하였다. 먼저 3T3-L1 세포가 cell dish에서 confluent 상태가 되었을 때를 Day 0이라고 하며 이때, 분화유도제로 사용되는 insulin, dex-amethasone 및 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)을 각각 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}, 0.25 \mu \mathrm{M}, 0.5 \mathrm{mM} \) 첨가하여 분화를 유도하고 2일간 배양하였다(Day 2). 또한 지방세포로의 분화를 촉진하기 위해 \( 10\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 insulin을 첨가하고 2일간 더 배양하였다(Day 4). 여기에 배지 교환과 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 insulin 첨가 후 2일간 더 배양 한 상태를 Day 6이라 하며 성숙지방세포의 실험을 행하였다.</p><h2>세포 내 지방입자의 염색 및 정량(Oil Red O 염색)</h2><p>3T3-L1 지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화 및 분화 억제는 Oil Red O 염색법을 이용하여 분화 시에 형성되는 지방구를 염색하여 확인하였다. STME는 Day 0, 2, 4,6의 단계마다 배지 교환 시 함께 처리하였으며 농도는 \( 10 \sim200 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \)범위로 처리하였다. 대조군으로 \( 0.5 \% \) DMSO만 처리하여 배양 한 3T3-L1 지방전구세포를 사용하였으며, 실험군과 대조군 모두 완전한 지방세포로의 분화가 이루어진 시점에 모든 plate의 배지를 제거하고 차가운 phosphate buffered saline (PBS)으로 세포를 세척한 뒤, \( 10 \% \) formalin을 처리하여 실온에서 1시간 고정시켰다. Formalin을 완전히 제거한 다음 \( 60 \% \) isopropanol로 세척한 뒤 Oil Red O working solution을 넣고 실온에서 10분간 염색을 하였다. 이 때 Oil Red O working solution은 Oil Red O powder \( 0.35 \mathrm{~g} \)을 \( 100 \mathrm{ml} \)의 isopropanol에 녹인 뒤 증류수에 6:4의 비율로 희석한 다음 여과하여 사용하였다. 세포를 염색한 뒤 Oil Red O working solution을 완전히 제거 한 다음 증류수로 4번 세척하고 위상차현미경으로 세포의 염색 상태를 관찰하였다. 또한 정량적 분석을 위하여 \( 100 \% \) isopropanol로 세포로부터 지방을 용출시켜 spectrophotometer를 이용하여 \( 500 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 중성지방의 축적량을 계산하였다.</p><h2>세포증식 속도 측정(Mitotic clonal expansion 저해 효능)</h2><p>지방세포의 분화과정에서 mitotic clonal expansion 과정은 필수적이며 분화유도제로 분화를 인위적으로 유도시킬 때 분화초기 2일안에 일어난다. 따라서 STME가 지방전구세포 3T3-L1의 분화과정 중 nitotic clonal expansion 과정에 미치는 영향을 조사하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포를 \( 60 \mathrm{~mm~} \)dish에 \( 1 \times 10^{5} \)cells/dish의 농도로 분주하여 배양 한 다음 day 0 때에 분화유도제와 STME를 농도별(\(10, 50, 100, 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)로 처리하여 배양하였다. Day 0, 1, 2의 세포를 각각 회수하고 trypan blue assay 법으로 염색하여 3T3-L1 지방전구세포의 증식속도를 측정하였다. 배양한 세포를 배지를 제거하고 \( 0.05 \% \) trysin-EDTA를 처리하여 세포를 부유시켜서 PBS를 적당량 첨가하여 세포를 모았다. 이것을 2,000 \( \mathrm{rpm} \)으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 다시 \( 1 \mathrm{ml} \)의 PBS와 \( 0.4 \% \) trypan blue solution (SIGMA)을 첨가하여 2분간 처리하여 살아 있는 세포수를 위상차현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 계수하였다.</p><h2>Flow cytometry 분석에 의한 세포주기 변화 측정</h2><p>3T3-L1 지방전구세포를 \( 60 \mathrm{~mm} \) dish에 \( 1 \times 10^{5} \) cells/dish의 농도로 분주하여 배양하여 confluent 상테가 된 day 0 때에 분화유도제와 STME를 농도별(\(10, 50, 100, 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)로 처리하였다. 그 후, 3T3-L1 지방전구세포의 doubling time인 14시간 후에 세포를 회수하여 PBS로 세척하고 \( 100 \% \) ethanol을 이용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 고정시켰다. 고정된 세포는 분석 전에 PBS로 세척하고 ribonuclease A를 최종농도 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)이 되도록 첨가한 다음 실온에서 30분간 반응시켰다. 세포주기 변화는 PI/RNase staining buffer (BD Pharmingen \( ^{\mathrm{TM}} \) )용액을 500 \( \mu\mathrm{l} \) 첨가한 후 유세포 분석기(FACS, Becton Dickinson, San Jose, CA)로 분석하였으며 결과는 Cell Quest program을 이용하여 분석하였다.</p><h2>Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석</h2><p>세포주기 변화 측정과 동일한 상태의 세포를 배양하여 회수하였다. 세포 내의 총 단백질 정량을 위한 전기영동을 실시하기 위하여 회수한 세포를 PBS로 한번 세척한 후 CSK 완충액 [\( 100 \mathrm{mM} \ Pipes (\mathrm{PH} 6.8), 100 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}, 1 \mathrm{mM} \mathrm{~MgCl}_{2}, 1 \mathrm{mM} \ EGTA, 1 \mathrm{mM~} dithiothreitol (DTT)\)]에 \( 0.1\% \) Triton X-100, \(1 \mathrm{mM~} ATP\)와 \( 1\% \) Protease inhibitor Cocktail (BD Pharmingen \( ^{\mathrm{TM}} \) )이 첨가된 용액으로 현탁하여 15분간 반응 시킨 후 초음파 파쇄기로 파쇄 하였다. 파쇄 한 세포는 \( 14,000\mathrm{rpm} \)에서 20분간 원심 분리하였으며, 상등액 내의 단백질량은 BCA법을 이용하여 정량한 후 동량의 단벡질 \( (25 \mathrm{ug}) \)을 sodium dodecyl sulfate (SDS) - polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동 하였다. 전기영동 후 gel 내의 단백질을 PVDF membrane에 전사시킨 후 blocking solution [\( 0.15 \mathrm{~M} \mathrm{~NaCl}, 1 \mathrm{~M~} Tris-HCI (\mathrm{pH} 7.5), 0.1 \% \ Triton X-100, \ 5\%\ BSA\)]을 사용하여 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 blocking 시켰다. 1차 항체는 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), 16시간 반응시켰으며, TBS buffer [\( 50\mathrm{mM}\ Tris-HCl \mathrm{~pH} 7.5\), \( 0.15\mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \), \( 0.1 \% \ Triton X-100\)]를 사용하여 membrane을 세척 한 다음 2차 항체를 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 16시간 반응시켰다. Membrane을 세척한 후 면역반응 단백질은 화학발광 시스템(Chemiluminescence system; Super Signal West Femto Maxium sensitivity Substrate, Pierce, USA)으로 검출하였다. Western blotting에 사용된 \( C/EBP \alpha \), \(C/EBP \beta \)의 1차 항체는 Cell signaling Technolgy (Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며 \( PPAR \gamma \), SREBP1c, p21, p27, CyclinE, Cdk2, Rb, Phospho-Rb, E2F-1 등의 1차 항체 및 anti-mouse IgG와 anti-rabbit IgG는 Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.</p>
산두근 추출액은 어떻게 추출하는가?
잘게 세절하여 분말화한 후, 산두근 \( 100 \mathrm{~g} \)에 메탄올 2\( \mathrm{l} \)를 첨가하여 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 3회 추출하였다.