<h1>고 찰</h1><p>식물 유전자의 기능에 대한 연구에서 과발현체 및 돌연변이체를 제조 또는 확보하는 것은 필수적이다. 본 연구에서는 식물, 특히 쌍자엽식물에서 유전자의 과발현에 사용할 수 있는 세 종류의 벡터와 대부분의 식물에서 유전자의 발현억제에 사용할 수 있는 RNAi 기본 벡터를 제조하고 그 유용성을 확인하였다. 특히 과발현용 벡터의 제조에 사용된 pPZP211은 bi-nary 벡터들 가운데 크기가 작고 박테리아 내에서 높은 copy수로 존재하여 본 연구에서 제조된 벡터들은 박테리아 내에서의 조작이 매우 용이하다.</p><p>먼저 쌍자엽식물에서 유전자의 과발현에 사용할 수 있는 pFGL571, pFGL846 그리고 pFGL847을 제조하였으며, 이들 벡터는 각각 modified CaMV 35S, UBQ3, UBQ10 프로모터를 포함하고 있다. 세 종류의 벡터 모두 MCS에 5개 또는 7개의 제한효소 부위를 가지고 있고, 벡터의 전체 염기서열이 제공되어 원하는 유전자를 쉽게 클로닝 할 수 있는 장점을 가지고 있다. GUS 유전자를 리포터 유전자로 사용하여 세 벡터의 유용성을 형질전환 식물체에서 확인한 결과, modified CaMV 35S, UBQ3, UBQ10의 세 프로모터 모두 애기 장대의 여러 발달단계 및 꽃 기관에서 발현됨을 확인하였고, modified CaMV 35S의 경우 이러한 결과를 sGFP를 리포터 유전자로 사용하여 재확인 하였으며, 전사체 수준에서도 재확인 하였다. 특히, modified CaMV 35S 프로모터의 경우 intact CaMV 35S::omega 프로모터와 비교했을 때 좀 더 높은 활성을 보였다. Intact CaMV 35S::omega 프로모터는 변형되지 않은 CaMV 35S 프로모터에 단백질 발현량을 높이는 것으로 보고된 omega 서열을 첨가한 것으로 CaMV 35S 프로모터 그 자체에 의한 것 보다 발현량을 더 높여주는 것으로 보고되어 있다. 따라서 본 연구의 결과는 pFGL571이 유전자 과발현에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다. 특히, CaMV 35S 프로모터는 대부분의 쌍자엽식물에서 유사한 발현 경향을 보이는 것으로 알려져 있기 때문에, 본 연구에서 제작한 pFGL571 벡터는 대부분의 쌍자엽식물에서 유전자의 과발현을 위해 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다. 한편, UBQ3 보다 UBQ10 프로모터의 활성이 더 이른 초기 발달단계에서 관찰되었기 때문에, 영양생장 초기 단계부터의 과발현에는 UBQ3 보다 UBQ10 프로모터가 더 유용할 것으로 여겨진다.</p><p>식물에서 특정 유전자의 발현 억제에 사용될 수 있는 RNAi 기본 벡터인 pFGL727 벡터를 제조하였다. RNAi 방법은 최근에 식물 및 동물 모두에서 특정 유전자의 발현을 억제하는데 매우 효율적인 방법으로 사용되고 있다. 일반적으로 RNAi 벡터는 hairpin 구조의 이중가닥 RNA를 합성할 수 있도록 spacer 서열을 사이에 두고 대상 유전자에 특이적인 역반복 서열이 필요하다. 대상 유전자의 암호화 부위의 일부에 대한 역반복 서열만으로도 효과적이어서, 역반복 서열을 만들기 위해 전체 암호화 부위를 사용할 필요가 없다. pFGL727 벡터의 경우 OsEMF1 유전자의 세 번째 인트론을 spacer로 사용하였고, spacer의 왼쪽 및 오른쪽으로 각각 5 개, 8 개의 제한효소 부위가 있어 역반복 서열의 클로닝이 매우 용이할 것으로 판단된다. RNAi 벡터를 제조하기 위해, 발현을 억제시키고자 하는 대상 유전자에 대해 동일한 유전자-특이적 부위를 spacer 양쪽에 역반복이 되도록 클로닝 하면 되는데, pFGL727의 경우 spacer 양쪽에 제한효소 부위가 많아 한 종류의 프라이머만으로도 역반복 서열의 클로닝이 가능하다. 즉, 유전자-특이적 부위를 증폭하기 위한 프라이머를 디자인 할 때 DNA의 양쪽에 클로닝에 사용할 제한효소 부위가 각각 2 개씩 합성되도록 하면 된다. 예를 들어 증폭된 DNA의 왼편에는 XhoI-BamHI 부위가, 오른편에는 EcoRI-HindIII 부위가 생길 수 있도록 한 종류의 정방향 및 역방향 프라이머를 합성한 후, 증폭된 DNA를 먼저 BamHI과 EcoRI으 로 처리하여 pFGL727에 클로닝 하고, 클로닝 된 벡터에 동일한 증폭 DNA를 XhoI과 HindIII로 처리하여 클로닝 하면 역반복 서열을 가진 RNAi 벡터를 만들 수 있다. pFGL727에 클로닝 된 역반복 서열 부위는 쌍자엽식물 또는 단자엽식물 과발현용 벡터에 옮겨 식물체로 형질전환할 수 있다. 쌍자엽식물에 형질전환할 경우 본 연구에서 제조된 pFGL571, pFGL846 또는 pFGL847을 과발현용 벡터로 이용할 수 있을 것이다. 실제로 벼의 OsDEG10 유전자를 대상으로 pFGL727 벡터를 이용하여 제조한 벼의 형질전환 식물체에서 발현 억제 효과를 조사한 결과, 5 개의 \( \mathrm{T}_{1} \) 식물체 중 3 개 라인에서 유전자 발현이 확연하게 감소함을 확인하였다. 이러한 결과는 pFGL727이 RNAi 라인 제조를 기본 벡터로 유용하게 이용될 수 있음을 의미한다.</p><p>본 연구 결과를 종합할 때, 본 연구에서 제조된 pFGL571, pFGL846 그리고 pFGL847은 쌍자엽식물에서 유전자 과발현에 유용하게 사용될 수 있고, pFGL727은 쌍자엽식물 및 단자엽식물에서 유전자의 발현 억제를 위한 효율적인 RNAi 기본 벡터로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.</p>
본 연구에서 어떤 것을 제조했어?
RNAi 기본 벡터