<h1>고찰</h1><p>봉독은 동양에서 민간 요법 중 하나인 벌침이라는 침 요법으로 염증성 질병인 류마티스 질병에 주로 사용되며, 소염 진통에 효과적인 것으로 알려진 물질이다. 뿐만 아니라 봉독은 암세포 성장 억제 효과를 가진 것으로 알려져 있으며, in vivo에서 봉독이 VEGF receptors-2 (VEGFR-2)의 타이로신인산화를 억제 하여 암세포 신생혈관생성을 억제 한다고 보고 되어 있다. 그러나 봉독의 암세포 신생혈관생성 억제 효과에 대한 신호 전달 기전 연구는 보고된 바가 없다. 따라서, 본 연구에서 신생혈관생성에 주요한 인자인 HIF-1\(\alpha\)와 VEGF에 대한 봉독의 억제효과와 그의 신호전달기전 조절확인을 통해 암세포의 성장억제제와 암 치료제로 사용될 가능성을 연구하였다.</p><p>HIF-1\(\alpha\)는 세포의 산소 농도가 정상 상태일 경우 Pro-564와 Pro-402가 수산화됨에 따라 VHL에 결합하여 ubiquitination system으로 분해된다. 그러나 cobalt chloride, nickel chloride 처리 시 수산화반응을 억제하여 잔기들이 VHL와 결합하지 못하여 세포내에서 분해되지 않고 존재하게 된다. 분해되지 못한 HIF-1\(\alpha\)는 세포 핵내로 전이되어 HIF-1\(\beta \)와 heterodimer를 형성하여 전사인자로 활성화 된다. 특히, HIF-1은 VEGF promoter 영역의 hypoxia response element(HRE)에 결합하여 VEGF 유전자 발현을 활성화시킨다. 따라서 본 연구에서는 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 사용하여 HIF-1\(\alpha\)의 발현과 VEGF의 전사를 유도하여 실험을 수행하였다. HCT116세포에 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)처리하여 HIF-1\(\alpha\) 단백질과 VEGF mRNA를 확인한 결과 모두 증가하였으며, 봉독에 의해 HIF-1\(\alpha\)와 VEGF 모두 효과적으로 감소하였다(Fig. 1B and Fig. 2A). 봉독이 HIF-1\(\alpha\)와 VEGF의 억제효과가 있었으므로 HIF-1이 결합하는 HRE promoter 전사활성을 측정하였다. 실험 결과 HCT116세포에 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리로 유도된 HRE promoter 활성이 봉독 농도-의존적으로 감소하였다(Fig. 2B). 이 결과 봉독은 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)에 의해 유도된 VEGF 전사활성을 HIF-1\(\alpha\) 발현과 HRE promoter 활성 감소를 통하여 신생혈관생성을 억제 한다는 것을 알 수 있었다. 뿐만 아니라 앞서 보고된 봉독의 신생혈관생성 억제 효과는 HIF-1\(\alpha\)의 조절에 기인한 것임을 예상 할 수 있다.</p><p>많은 연구보고에 따르면 HIF-1\(\alpha\) 발현 조절은 여러 성장인자 자극 또는 미토콘드리아 스트레스 자극에 의해 조절이 되며 PI3K/AKT/mammalian target of rapamycin (mTOR) 신호전달 기전 활성과 MAP Kinase 신호전달기전 활성으로 조절된다고 보고되어 있다. 세포 성장과 분화에 주요한 역할을 하는 epidermal growth factor (EGF)와 epidermal growth factor receptor (EGFR) 활성이 HIF-1\(\alpha\) 발현조절에 관여 한다고 보고되어 있으며, 또한 세포내에서 산소가 정상 상태 또는 저산소 상태에서 세포내의 reactive oxygen species (ROS)가 MAP Kinase 신호전달기전 활성에 관여하여 HIF-1\(\alpha\) 발현 조절에 기인한다고 알려져 있다. 따라서 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)와 봉독에 의한 HIF-1\(\alpha\) 발현 조절에 AKT 및 MAP kinase 신호전달기전이 어떠한 영향을 끼치는지를 Western blot 분석으로 확인하였다(Fig. 3). 그 결과 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)는 ERK1/2와 JNK, AKT의 인산화를 유도하였으나, p38의 인산화는 변화가 없었다(Fig. 3A). 뿐만 아니라 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)에 의해 유도된 HIF-1\(\alpha\)의 발현은 ERK1/2 저해제인 PD98059에 의해 감소되었으나, JNK 와 AKT의 저해제인 SP600125와 Wortmannin는 영향을 끼치지 못하였다(Fig. 3B). 이와 같은 결과는 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)에 의한 HIF-1\(\alpha\)의 증가가 ERK1/2의 인산화에 의해 조절되며 p38, JNK 및 AKT는 관여하지 않음을 나타낸다. 따라서 봉독을 처리한 후 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)로 유도하여 ERK1/2의 인산화를 확인한 결과 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 3A). 이와 같은 봉독의 ERK 인산화 억제효과는 앞서 보고된 봉독의 암세포 성장억제, 세포자살, 전이억제 등의 결과와 동일한 것으로 나타났다. 또한 흥미롭게도 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)가 처리된 상태에서는 p38의 저해제인 SB203580 처리시 HIF-1\(\alpha\) 발현이 증가되었다(Fig. 3B). 이는 p38인산화 저해에 의해 세포생존을 위한 다른 신호전달 기전을 통하여 HIF-1\(\alpha\) 발현을 증가시킬 것이라고 예상되며 그에 따른 연구는 더욱 수행되어야 할 것으로 생각된다.</p><p>봉독은 여러 가지 폴리펩타이드로 이루어져 있으며, 그 중 멜리틴과 아파민의 주요생리활성 물질로 염증성 질병에 이용되어왔다. 현재 보고에 따르면 봉독의 멜리틴 성분은 세포자살을 유발하여 항암작용, 암세포 성장억제 등 여러 효과가 있으며. 아파민 또한 여러 항암작용과 한의학에서 약침용으로 사용하며 항염증 작용에 효과가 있다고 보고되고 있다. 앞선 실험 결과, 봉독이 ERK1/2 단백질 인산화를 조절하여 HIF-1\(\alpha\) 발현을 억제함을 확인하였으므로, 봉독의 주요 생리활성 성분인 멜리틴과 아파민을 각각 처리하여 어떠한 성분에 의한 효과인지 확인하였다(Fig. 4). 실험 결과 HCT116세포에서 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)로 유도된 HIF-1\(\alpha\) 발현이 아파민, 멜리틴에 의해 모두 감소하는 경향을 보였으며 특히 아파민이 더욱 효과적이었다(Fig. 4A and 4B). \( \mathrm{CoCl}_{2} \)로 유도된 VEGF mRNA 수준 또한 아파민에 의해 감소하였다(Fig. 4A). 그러나 멜리틴 처리에는 VEGF mRNA의 변화가 나타나지 않았다(Fig. 4B). 그러므로 봉독의 신생혈관생성 효과는 아파민에 기인한 것이라 생각된다.</p><p>결론적으로, 봉독은 ERK1/2 단백질 인산화를 억제함으로써 HIF-1\(\alpha\) 단백질 발현을 감소시켜 신생혈관생성 억제효과가 있는 것으로 나타냈으며(Fig. 5), 이러한 효과는 봉독의 주요 생리활성 성분인 아파민이 주요한 역할을 할 것이라 생각된다. 본 연구를 통하여, HIF-1\(\alpha\)의 발현 억제를 표적으로 하여 봉독이 암세포 증식억제와 치료제로서 사용 가능성이 있음을 새롭게 확인하였다.</p>
\( \mathrm{CoCl}_{2} \)에 의해 유도된 HIF-1\(\alpha\)의 발현에서 JNK 와 AKT의 저해제인 SP600125와 Wortmannin는 어떻게 됐지?
영향을 끼치지 못하였다