<h1>실험 및 방법</h1><h2>항균활성 우수 미생물의 분리</h2><p>각종 토양으로부터 부식토를 채취하여 먼저 집적배양하였으며, 희석평판법으로 각종배지에 도말하여 생성된 콜로니를 1차 선별하였다. 이들을 대상으로 식물병원성 진균의 생육을 저해하는 효과에 기초하여 균주를 선발하였다. 선발된 균주는 단일 콜로니가 생성되도록 수차례 계대배양을 실시하여, 잔디 및 식물 병원성 진균류인 Rhizoctonia solani AG2-2 와 Botrytis cineria에 대한 항진균 활성이 뛰어난 미생물을 분리하였다.</p><h2>분리 균주의 동정 및 특성 조사</h2><p>균주 동정을 위해 분리균주의 생리생화학적 성질을 상법에 의거 조사하였으며, 또한 배양온도 및 배양배지의 초기 \( \mathrm{pH} \) 차이에 따른 균주의 생육 특성을 조사하였다.</p><h2>16S 리보좀DNA 염기 서열 결정</h2><p>보다 정확한 균주동정을 위하여, 각 균주에서 염색체 DNA를 분리하여 primer 1 (5'-GAGTT TGATC CTGGC TCAG-3' [position 9 to 27 E.coli 16S rRNA]과 pri- mer 2 (5'-AGAAA GGAGG TGAT CAGCC-3'[position 1542 to 1525 E.coli 16S rRNA])를 사용하여 PCR 방법으로 16S 리보좀 DNA를 증폭시켜 염기서열을 결정하였다. 이들의 상동성과 진화학적 거리에 기초하여 균주를 동정하였다.</p><h2>항균할성 균주의 세포벽 분해관련 효소 분비 조사</h2><p>길항균의 길항기작 중의 하나는 병원성 진균의 세포벽을 이루고있는 물질의 분해나 생성 저해를 통하여 일어난다는 기작이 알려져 있다. 따라서 분리된 균주의 길항작용 기작을 밝히기 위한 기초 실험으로 세포벽 분해관련 효소의 생성유무가 육안으로 관찰되는 한천확산법(agar diffusion method)으로 pectinase, cellulase, CMCase, xylanase, chitin-ase 및 protease 활성 유무를 확인하였다.</p><h2>항균물질의 분리 및 활성확인</h2><p>분리균주의 배양액을 원심분리한 배양여액에 \( \mathrm{pH}~2.0 \)이 될 때까지 농염산을 가하였다. 이 반응액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수시간 반응시켜 침전시킨 후, 원심분리하였다. 생성된 참 전물을 10배의 methanol로 진탕하여 추출한 뒤, 감압 농축하여 암갈색의 조추출물을 얻었다. 건조된 조추출물은 녹여서 병원균의 길항능력을 확인하기 위한 inhibition zone 시험에 사용하였다. 추출된 항균물질의 병원균 생육저해 활성을 disc 활성 inhi-bition zone으로 조사하였다. 이후 분리된 조추출물을 소량의 methanol에 녹여 silica gel column을 사용하여 methanol로서 용출시켜서 \( 4 \mathrm{ml} \)의 분획을 분취하였으며, 받은 각 분획의 활성을 측정하였다. 그리고 Thin layer chromatography (TLC)에 의하여 chloroform/methanol/water (65: 25: 4)의 전개용매를 사용하여 분리, UV 존재하에서 관찰하였고, nin-hydrin 염색액과 지질 발색 시야으로 발색조사하였으며, 대표적인 lipopeptide인 surfactin (Sigma, Co.)을 High Perfor-mance Liquid Chromatography (HPLC), SDS-PAGE로 동시에 흘려 항균물질을 결정하였다. HPLC를 통한 surfactin분석에는 Hypersil BDS C18 역상칼럼이 이용되었고, acetonitrile/ water의 적정비율 (60: 40)을 이동상으로 분당 \( 0.5~ \mathrm{ml} \) 의 flow rate 조건에서 수행되었다.</p>
초기 \( \mathrm{pH} \) 차이에 따른 균주의 생육 특성을 조사를 한 것은 무엇인가?
배양온도 및 배양배지