<h2>UOS 동정을 위한 Internal Transcribed Spacer (ITS) 분석과 형태학적 특성 파악</h2><p>UOS의 ITS region을 확보하기 위해, Genomic DNA를 추출하였다. UOS를 PDA 배지상에 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 14 일간 배양하여 형성된 포자를 소량 걷어내어 breaking buffer \( 100 \mu \mathrm{L}\) (\(2 \% \) Triton X-100, \(1 \% \) SDS, \( 100 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}\), \(1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \(\mathrm{pH} 8\))가 포함된 glass beads에 넣고 30 초간 혼합하였다. \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에서 30 분간 heating 하였으며, 매 10 분마다 30 초간 vortex한 뒤, phenol/chloroform/isoamyl alcohol (\( 25: 24: 1 \)) 을 100 \( \mu \mathrm{L} \) 첨가하여 5분 동안 vortex하였다. \( 13,000 \mathrm{rpm} \) 에서 5 분간 원심분리를 하고, 상등액 \( 80 \mu \mathrm{L} \)을 TE buffer (\( 10 \mathrm{mM} \) Tris- \(\mathrm{HCl}\) \(\mathrm{pH} 7.5\), 1 mM EDTA) \(720 \mu \mathrm{L} \)가 포함된 마이크로 튜브에 옮겨 gDNA를 확보하였다.</p><p>추출한 DNA는 PCR (Polymerase chain reaction : 중합효소 연쇄반응)을 위한 주형 DNA로 사용되었으며, ITS region 증폭을 위해 ITS1_Forwad primer (\(5^{\prime}\)-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-\(3^{\prime}\))과 IT-4_Reverse primer (\(5^{\prime}\)-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-\(3^{\prime}\)) 및 pcr mixture (MG 2X Taq PreMix)가 혼합되어 수행되었다. PCR 혼합물을 5 분간 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)로 이루어진 initial denaturation 단계, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분 annealing 단계, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분 extension 단계로 35 번 반복하였고, 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3 분 final extension단계를 수행하였다.</p><p>증폭된 PCR산물은 Labopass \( { }^\mathrm{TM} \) PCR Purification Kit (CosmoGen, Korea)를 사용하여 정제하였다. 정제된 생성물은 TA 클로닝 (rapid cloning)을 위해 pTOP TA V2 vector(Macrogen Co., Seoul, Korea)에 ligation 하였다. Ligation된 vector를 Escherichia coli DH5\(\alpha\) (Macrogen Co., Seoul, Korea)로 형질전환 시켜, ampicillin (\( 100 \mu \mathrm{g}\ \mathrm{mL}^{-1} \)), kanamycin (\( 50 \mu \mathrm{g}\ \mathrm{mL}^{-1} \)), isopropyl- \( \beta \)-D-thio-galactoside (\( 0.2 \mathrm{mM}\)), X-gal (\( 50 \mu \mathrm{g}\ \mathrm{mL}^{-1} \))가 함유된 Luria Agar 플레이트에 도말 하였다. 형질전환된 백색 콜로니만 선발하여, plasmid prep을 수행 하였고, EcoRⅠ 제한 효소 분해에 의해 확인된 band는 sequencing 되었다.</p><p>UOS의 ITS 서열을 분석하기 위해 DNA star software program (DNAstar Inc. WI., U.S.A)으로 분석하여 염기서열의 정렬을 수행하였다. 비교 표준 균주의 염기서열은 미국국립 생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)에서 BLAST 네트워크 서비스를 이용하여 Gen Bank 데이터베이스에 등록된 균주의 정보를 이용하여 UOS의 ITS 유전자 서열의 계통 발생학적 분석을 계통 유연성 분석 (Phylogenetic Tree Analysis) 프로그램인 Mega software version 6.0과 neighbor-joining 방법(Kimura's two-parameter algorithm)에 따라 유연관계도(phylogenetic tree)를 분석하였다. 계통 견고성을 확인하기 위해서 1000회 반복으로 bootstrapping을 수행하였다.</p><h2>Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)를 이용한 UOS가 생산하는 Volatile Organic Compound (VOC) 분석</h2><p>UOS가 생산하는 Volatile Organic Compound (VOC) 분석을 위해 Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)를 이용하여 D3을 동정·확인 하였다.</p><p>VOC를 효과적으로 생산하기 위해, UOS를 PDA 배지 상에 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 14 일간 배양하였다. 배양된 균주를 agar block 형태로 PDB \( 100\mathrm{~mL} \)이 포함된 flask로 옮겨 7일간 \( 28^{\circ} \mathrm{C}\), \(200 \mathrm{rpm} \)으로 진탕배양 하였다. 배양기간 동안 flask는 실리콘마개와 파라필름으로 밀봉하였다. VOC 분석을 위해, 배양된 flask의 실리콘마개 사이로 \( 10 \mathrm{~mL} \) 주사기를 사용하여 기체를 10 회 포집하여 헥산에 녹여 sample을 획득하였다. Control sample은 PDA agar block을 사용하였으며 상기 방법과 동일하게 하였다. GC-MS (6890N GC/5975C MSD)분석에는 DB-5MS 컬럼을 사용하였고 분석조건은 다음과 같다. Sample injection: \( 5 \mu \mathrm{L} \), solvent wash: \( 1 \mu \mathrm{L} \), sample wash: \( 5 \mu \mathrm{L} \), Mode: splitless, Scan parameters: 10 ~ 550 , Flow rate: \( 1 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \), Post run temperature: \( 250^{\circ} \mathrm{C} \)로 설정되었고, Oven 설정은 초기에 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분 머물고, \( 10^{\circ} \mathrm{C} / \mathrm{min} \) 속도로 \( 180^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 승온 시키고 10분간 머물고, 다시 \( 40^{\circ} \mathrm{C} / \mathrm{min} \) 속도로 \( 200^{\circ} \mathrm{C} \)까지 승온 시키고 2 분간 머물러 총 30.5 분으로 설정 되었다.</p>
UOS를 PDA 배지상에 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 14 일간 배양하여 형성된 포자를 소량 걷어내어 breaking buffer \( 100 \mu \mathrm{L}\) (\(2 \% \) Triton X-100, \(1 \% \) SDS, \( 100 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}\), \(1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \(\mathrm{pH} 8\))가 포함된 glass beads에 넣고 20 초간 혼합하였는가?
NO