<h2>순도 확인 및 단백질 정량</h2><p>앞 실험에서 얻어진 trypsin inhibitor의 순도확인을 위해 Davis 등의 방법에 따라 \( 12 \% \) polyacrylamide gel elec-trophoresis를 시행하였다. 이 때 흘려 준 전류는 \( 10 \mathrm{mV} \) 였고, 약 3 시간 동안 전기영동한 후 \( 0.1 \% \) Coomassie Brilliant Blue R-250 용액으로 염색하였다. 단백질은 bovine serum albumin을 표준물질로 하여 Lowry 등의 방법으로 정량하였다.</p><h2>분자량 측정</h2><p>Gel filtration; 정제된 trypsin inhibitor의 분자량은 Se-phadex G-150 column \( (1.6 \times 88 \mathrm{~cm}) \) 을 사용하여 Andrews[1] 방법으로 측정하였다. 표준 단백질로는 aldolase (153,000), bovine serum albumin(66,000), carbonic anhydrase (29,000), cytochrome C(12,400) 등을 사용하였다.</p><p>SDS PAGE; subunit수와 그 분자량을 알기 위하여 Laemmli방법에 따라 전기영동하여 측정하였다. Separating gel의 polyacrylamide 농도는 \( 12 \% \) 였으며 standard protein은 hen egg white conalbumin(76,000), bovine serum al-bumin(66,000), hen egg white albumin(45,000), glyceral-dehyde-3-phosphate dehydrogenase(36,000), trypsinogen (25,000) , soybean trypsin inhibitor(20,500) 등을 사용하였다.</p><h2>ARTI의 온도에 따른 안정성</h2><p>앞에서 설명한 저해 활성 측정법에 따라 ARTI를 \( 5^{\circ} \mathrm{C}, 25 \) \( { }^{\circ} \mathrm{C}, 37^{\circ} \mathrm{C}, 60^{\circ} \mathrm{C}, 80^{\circ} \mathrm{C}, 100^{\circ} \mathrm{C} \)등의 다양한 온도에서 10분간 반응시킨 후 trypsin에 대한 저해 활성을 측정하였고 inhibitor가 들어있지 않은 대조군과 비교하였다.</p><h2>ARTI의 농도변화에 따른 trypsin의 저해능</h2><p>ARTI의 여러 가지 농도에 따르는 trypsin의 저해능을 알아보고 또한 상품화된 대두의 Kunitz trypsin inhibitor와의 저해능을 비교해 보기 위하여 ARTI 및 soybean trypsin inhibitor의 용액 농도가 \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)되게 한 용액을 \( 5 \mu \ell, 10 \mu l \), \( 20 \mu l, 30 \mu l, 40 \mu l, 50 \mu l \) 씩 각 반응용액 중에 첨가하여 앞에서 설명한 저해 활성 측정법에 따라 시행하였다.</p><h2>ARTl의 trypsin에 대한 저해형 결정</h2><p>ARTI가 trypsin에 대하여 어떤 형태의 저해반응을 일으키는지 알아보기 위하여 기질인 BAPNA의 농도 및 inhibitor의 농도를 변화시켜 효소의 활성을 측정하여 알아보았다. 먼저 trypsin의 BAPNA에 대한 가수분해 반응속도를 측정하였다. 즉 기질(BAPNA)의 농도를 여러 가지로 변화시켜서 앞에서 설명한 저해 활성 실험을 시행한 후 그 반응속도(10분 동안 반응용액에서 생성된 p-nitroaniline(PNA)의 \( \mu \) mole수)를 측정하여 Lineweaver-Birk방법으로 도시하여 trypsin의 BAPNA에 대한 \( \mathrm{V}_{\max } \) 와 \( \mathrm{K}_{\mathrm{m}} \) 값을 결정하였다. ARTI의 저해형을 결정하기 위하여 정제된 ARTI 일정량을 위의 각 반응용액에 함께 첨가하여 그 때의 반응속도를 측정한 후 마찬가지 방법으로 \( \mathrm{V}_{\max } \)와 \( \mathrm{K}_{\mathrm{m}} \) 값을 구하여 결정하였다.</p>
Davis 등의 방법으로 시행시 전기영동은 몇시간 했어?
3 시간