<h2>세포 내 cAMP 및 PKA 농도 측정</h2><p>세포 내 cAMP 농도는 Cayman사의 cAMP immunoassay kit (Ann Arbor, MI, USA)를 사용하여 측정하였다. \( 5 \times 10^{4} \) 개의 B16F10 세포를 0.1 \( \mathrm{M} \) \( \mathrm{HCl} \)에 용해하여 phosphodiesterase 활성을 억제하였다. 상층액을 모아서 중화 시키고 희석하여 고정된 cAMP conjugate를 이용하여 면역반응 시켰으며, cell lysate를 이용하여 PKA conjugate와 면역반응 시켰다. 각각의 면역반응 반응 후 substrate solution을 넣어 결합한 효소의 활성 정도를 450 \( \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Western blot을 이용한 멜라닌 생성 관련 단백질의 발현 측정</h2><p>멜라닌 생성 관련 인자 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF 발현 에 미치는 영향을 보기 위하여 B16F10 세포를 6-well에 \( 1 \times 10^{5} \) cells/well이 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 \( \alpha \)-MSH (10 \( \mathrm{nM} \)) 를 처리한 뒤 각 well에 어리연꽃 추출물을 48시간 동안 처리한 뒤 cold PBS로 2번 세척해주었다. RIPA buffer를 이용하여 B16F10 세포를 용해시키고, 4\( { }^{\circ} \mathrm{C} \) 12,000 \( \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심 분리 하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 BCA assay로 정량하여 25 \( \mu \mathrm{g} \) 의 단백질을 10 \( \% \) 의 SDS-PAGE gel에서 전기영동 하여 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1 시간 blocking buffer (5 \(\%\) skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. 각각의 1 차 항체를 \(1: 1000\)으로 희석하여 4\( { }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 over night한 다음, 다시 10 분 간격으로 TBST로 3회 washing하고 mouse anti-rabbit IgG HRP의 각각의 2차 항체를 \(1: 1,000\) 으로 희석하여 실온에서 1 시간 동안 붙이고, 3회 세척 후 LAS 4000 image analyzer (Fugifilm life science, Tokyo, Japan)기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량 하였다.</p><h2>RT-PCR을 이용한 멜라닌 생성 관련 mRNA 발현 측정</h2><p>어리연꽃 추출물의 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF 유전자 발현에 미치는 영향을 보기 위하여 B16F10 세포를 6-well에 \( 1 \times 10^{5} \) cells/well이 되도록 분주하고 24 시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 시료를 농도별로 처리한 배지로 교환하고 48 시간 동안 처리한 뒤 cold PBS로 세척해주었다. Total RNA는 PBS로 3번 세척하고 세포를 포집한 다음 trizol reagent (Biosesang, Seongnam, Korea)를 이용하여 분리하였다. Total RNA 0.8 \( \mu \mathrm{g} \) 과 PCR primer oligonucleotide를 RT-PCR mixer 와 혼합하고 PT-PCR을 시행하였다. Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF의 염기서열은 Table 1 과 같다. PCR 조건은 94 에서 30초(denaturation), \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45 초(annealing), 72\( ^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 90 초(extension)의 반응을 30-35회 반복하는 것을 기본으로 target cDNA 종류에 따라 최적의 조건으로 조절하였다. 증폭된 cDNA 는 1.5 \( \% \) agarose gel을 사용한 전기영동으로 분리하고 LAS 4000 image analyzer으로 확인하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>본 실험의 통계처리는 SPSS 12.0을 사용하였다. 각 실험군의 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 각 실험군의 간의 결과는 t-test를 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다. 실험군 간의 차이는 95\( \% \) 수준 \( (* p<0.01, ** p<0.001) \) 에서 유의성 있는 것으로 하였다.</p>
세포 내 cAMP 농도는 Cayman사의 cAMP immunoassay kit를 사용하여 측정하였다
YES