<h2>Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석</h2><p>준비된 암세포를 모은 다음 적당량의 lysis buffer [\( 25 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{Cl}\) \((\mathrm{pH} 7.5)\), \( 250 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}, 5 \mathrm{mM} \) EDTA, \(1\%\) NP-40, \( 1 \mathrm{mM} \) phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), \( 5 \mathrm{mM} \) dithio-threitol (DTT)]를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후 상충액을 분리하고 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 정량하였다. 동량의 Laemmli sample buffer(Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들어 sodium dodecyl sulfate(SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane(Schleicher and Schuell, Keene, NH)으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, 1·2차 항체를 처리하고 PBS-T로 세척하여 Enhanced Chemiluminoesence(ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL)을 적용시킨 다음 암하에서 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다.</p><h2>In vitro caspase-3, caspase-8 및 caspase-9의 activity 측정</h2><p>Caspase-3, -8 및 -9의 in vitro 활성 측정을 위한 colorimetric assay kits는 R&D Systems (Minneapolis, MN)에서 구입하여 제시된 방법에 준하여 활성의 증감 여부를 조사하였다. 이를 위하여 정상 및 EAHF가 처리된 배지에서 48시간 배양된 암세포를 모은 뒤 단백질을 추출하고 정량하여 각각 \( 100 \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 fluorogenic peptide 기질 \( 100 \mu \mathrm{M} \)이 함유된 extraction buffer[\(40\mathrm{mM}\) HEPES (\(\mathrm{pH} 7.4\)), \(20\%\) glycerol \((\mathrm{v/v})\), \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \(0.2\%\) NP-40 및 \( 10 \mathrm{mM} \) DL-DTT] \( 50 \mu \mathrm{l}\)에 혼합하고, microtiter plate에 다시 extraction buffer에 희석하여 각 sample 당 총 부피가 \( 100 \mu \mathrm{l} \)가 되게 하였다. 준비된 plate를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 \( 405 \mathrm{nm} \)의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다. 실험에 사용되는 기질은 caspase-3의 경우에는 Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)-p-nitroaniline(pNA), caspase-8의 경우에는 Ile-Glu-Thr-Asp(IETD)-pNA이었으며, caspase-9는 Leu-Glu-His-Asp(LEHD)-pNA였다.</p>
단백질 정량을 위해 사용된 lysis buffer에 대해 옳은 것은 무엇인가?
lysis buffer [\( 25 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{Cl}\) \((\mathrm{pH} 7.5)\), \( 250 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}, 5 \mathrm{mM} \) EDTA, \(1\%\) NP-40, \( 1 \mathrm{mM} \) phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), \( 5 \mathrm{mM} \) dithio-threitol (DTT)]