<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포배양</h2><p>경희대학교 의과대학 내분비 연구실에서 분양 받은 mouse calvaria osteoblast cell 인 MC3T3-E1 세포는 a-MEM 배지 (Gibco BRL, Grand islane, N. Y., USA)에 \( 10\% \) FBS (Gibco)와 \( 1 \% \) antibiotics (Gibco)를 첨가하면서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) in-cubator에서 2~3일 마다 배지를 교환하면서 실험에 사용하였다. 분화유도를 위해 \( 5 \mathrm{mM} \beta \)-glycerol phosphate (Sigma Chem. Co., St. Louis. Mo., USA)와 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 vitamin C (Sigma)를 첨가하여 분화유도 배지로 사용하였으며, 3일마다 배지를 교환하였다.</p><h2>추출물의 제조</h2><p>본 실험에 사용한 적송잎은 2008년 지리산에서 채취하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 열풍 건조한 후 믹서로 분말화시켜 열수 추출, 에탄올 추출과 헥산 추출을 행하였다. 열수 추출은 \( 700 \mathrm{~g} \) 에 물 \( 4,500 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간 추출한 후 여과한 액을 동결 건조하여 제조하였다. 에탄올 및 헥산 추출은 분말 200 \( \mathrm{g} \) 에 각각 \( 95 \% \) 에탄올 및 헥산 \( 1,500 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 상온에서 24 시간 침지하여 추출한 후 여과한 액을 동결 건조하여 제조 하였다. 동결 건조하여 얻은 적송잎 추출물 분말 각각 \( 1, 10, 50, 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 를 에탄올로 용해한 후, \( 0.2 \mu 1 \) membrane filter 로 여과한 후 사용하였다.</p><h2>세포증식 유도</h2><p>시료의 농도별 처리에 따른 조골세포의 세포 증식은 Green 등의 방법에 따라 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, sigma) 시약의 환원 정도를 측정하는 MTT assay 방법을 사용하여 측정하였다. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석은 탈수소 효소작용에 의해 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색의 formazan (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토큰드리아의 능력을 이용하는 검사법으로 이 검사법은 세포의 증식과 성장을 알아보는 대표적인 실험방법 중 하나로 살아있는 세포수에 비례해서 흡광도를 나타낸다. 배양한 MC3T3-E1 세포를 \( 0.4 \% \) trypan blue 염색법을 이용하여 세포수를 \( 1 \times 10^{5} \) cell/ml로 조정하여 96 well plate에 platting 한 후, 농도별로 준비된 적송잎 추출물을 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 48시간 배양하였다. 이때 대조군으로는 적송잎 추출물 대신 에탄올을 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 동일하게 배양하였다. 48시간 배양 후 MTT \( (5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 시약을 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 씩 각각의 well에 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 4 시간 더 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 DMSO (dimethyl sulf-oxide)를 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가하여 생성된 불용성의 formazan 결정을 용해시킨 뒤 ELASA reader로 \( 550 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 증식률은 적송잎의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.</p>
열수 추출은 분말화 시킨 적송잎을 얼마나 첨가하여 제조했지?
\( 700 \mathrm{~g} \)