<h1>결과 및 고찰</h1><h2>누룩 내 미생물의 수와 순수 분리된 종의 동정</h2><p>(유)금정산성토산주의 누룩에서 일반세균은 \( 2.7 \times 10^{9} \mathrm{CFU} / \mathrm{g} \), 진균은 \( 3.5 \times 10^{8} \mathrm{CFU} / \mathrm{g} \)으로 나타났다(Fig. 1). 세균 수는 진균보다 약 10배 높게 나타났다. 김과 고의 보고에 따르면 전국에서 수집한 35종의 전통누룩에서 진균의 수는 \( 6.4 \times 10^{5} \sim \) \( 4.5 \times 10^{7} \mathrm{CFU} / \mathrm{g} \) 수준으로 나타났으며 본 결과에서 진균의 수가 다소 높게 나타났다. 배양된 plate에서 대표 종과 PCR-DGGE profile에서 우점종과의 비교를 위해 상기 계수된 plate로부터 colony의 형태적인 차이에 의해 대표성을 갖는 세균 4종과 진균 8종을 순수분리하였다. 분리균을 대상으로 16S및 28S rRNA gene염기서열을 결정하였으며 NCBI의 Gnenbank에 등록된 미생물과의 BLAST search를 통하여 가장 높은 유사성을 나타낸 종을 대상으로 동정한 결과는 Table 1에 나타내었다. 4종의 분리세균은 Actinobacteria인 Kocuria rhizophila, K. halotolerans, Proteobacteria인 Pantoea agglomerans 그리고 유산균인 Pediococcus pentosaceus로 동정되었다. 8종의 분리된 진균은 조상균인 Lichtheimia corymbifera, Mucor racemosus, Rhizopus microspores (2종), 자낭균류인 Aspergillus oryzae, Cladosporium cladosporioides, 그리고 효모성 진균인 Trichomonascus farinosus, Pichia kudriavzevii 로 동정되었다.</p><h2>DGGE를 이용한 세균의 다양성 분석</h2><p>누룩으로부터 얻어진 total genomic DNA로부터 16S rRNA gene을 이용한 nested-PCR을 수행하였으며 세균의 다양성을 알아보기 위해 DGGE를 수행 하여 Fig. 2A에 나타내었다. DGGE분석 결과 16개의 구분되는 band를 확인하였으며 그 중 3개의 band가 다른 band들에 비하여 밀도가 높게 나타나 주된 우점군으로 판단되었다. 각 band의 DNA를 회수하여 염기서열을 결정한 후 NCBI의 BLAST search를 통하여 유사성이 높은 종을 대상으로 동정한 결과를 Fig. 2B에 나타내었다. 그 결과 Lactobacillus속(2종), Pediococcous속, Weissella속 (2종), Staphylococcus속, Pantoea속(2종)으로 나타났으며 그 외 uncultured bacterium, endophytic bacterium, uncultured Cyanobacteria와 Actinobacteria로 총 9속을 확인할 수 있었다. 또한 누룩 내 세균들 중에서 유산균이 많은 비율을 차지하였다. DGGE profile에서 band의 밀도를 비교하였을 때 주된 우점세균은 Pediococcous pentosaceus (B2와 B7) 그리고 비배양균인 Cyanobacteria (B11)로 판단된다. DGGE profile과 비교하여 PCA배지로부터 분리된 세균(Table 1)은 P. pentosaceus와 Pantoea agglomerans 였으며 그 외는 일치하지 않았다. 특히 배양에서 분리된 Actinobacteria인 Kocuria rhizophila와 K. hal-otolerans는 DGGE profile에서 동일 종은 검출되지 않았으나 uncultured actinobacterium이 검출되었다. 또한 DGGE방법은 PCR방법에 의존하기 때문에 검출한계인 \( 10^{4} \) cells 이하의 낮은 개체수로 인하여 검출되지 않은 것으로 사료된다. 국내에서 보고된 누룩 세균은 Bacillus, Micrococcus, Mycoplana, Erwinia, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerobacter, Pseudomonas, Bacillus, Enterococcu으로 총 11개의 속이며 기존에 보고된 2개의 속 외에 본 연구에서 새로 7속을 확인할 수 있었다.</p><p>국내 누룩에서 분리된 세균으로는 1945년 이전 국내 누룩 세균에 대한 고찰에서 Bacillus속(3종), Micrococcus속(4종), Mycoplana속(1종), Erwinia속(2종)이 동정되었다고 보고하였다. 신과 조는 Lactobacillus casei, Leuconostoc mesenter-oides, Aerobacter속, Pseudomonas 속 등의 세균을 보고하였다. 양과 이는 산성누룩에서 Micrococcus varians, Bacillus subtilis를, 그리고 조와 하는 국내 누룩 유산균으로 L. medsen-teroides, Pediococcus acifilactici, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus murinus, Enterococcu faecium을 보고하였다. DGGE 분석결과와 비교할 때 L. plantarum을 제외한 대부분의 세균은 누룩에서 처음으로 보고된 종으로 판단된다.</p><p>누룩에서 순수분리된 균주와 비교하였을 때 DGGE 분석결과는 누룩 세균군집의 다양성을 보다 효율적으로 확인할 수 있었을 뿐만 아니라 종간의 풍부성(richness)의 상대적인 비교를 간접적으로 확인할 수 있었다(Table 1; Fig. 2).</p><h2>DGGE를 이용한 진균의 다양성 분석</h2><p>누룩으로부터 얻어진 total genomic DNA로부터 28S rRNA gene을 이용한 nested-PCR을 수행하였으며 누룩 진균의 다양성을 알아보기 위해 DGGE를 수행 하여 Fig. 3A에 나타내었다. 그 결과 DGGE profile에서 총 8개의 구분되는 band를 확인하였으며 2개의 band가(E7과 E8) 상대적으로 밀도가 높아 우점군으로 판단된다.</p><p>각 band로부터 DNA를 회수하여 염기서열을 결정한 후 NCBI BLAST search를 통하여 유사성이 높은 종을 대상으로 동정한 결과 Fig. 3B에 나타내었다. 그 결과 누룩 진균은 Pichia 속, Torulaspora 속, Wickerhamomyces 속, Sacharomycopsis 속, Aspergillus 속으로 5개의 속이었다. 이는 기존에 보고된 누룩 진균의 속인 Aspersillus, Mucor, Rhizopus, Absidia, Penicillum, Monascus, Amyolmyces, Saccharomyeces, Endomyces, Pichia, Hansenulas, Torulopsis, Candida 와 비교하여 (유)금정산성토산주에서 생산되는 누룩의 DGGE 결과에서 사상성 진균인 Aspergillus oryzae를 제외한 종은 검출되지 않았으나 효모성 진균인 Saccharomycopsis fibuligera, Torulaspora delbrueckii, Wickerhamomyces anomalus, Trichosporon asahii는 누룩진균으로 처음 확인할 수 있었다. 또한 DGGE 분석에서 높은 밀도를 보인 E7은 Pichia kudriavzevii 그리고 E8은 A. or-yzae로 동정되어 (유)금정산성토산주의 누룩에서 주된 진균으로 나타났다.</p><p>누룩으로부터 분리된 진균은 종 8종으로 효모성 진균이 2종 그리고 조상균이 4종 그리고 자낭균이 2종으로(Table 1) DGGE 분석결과와 비교하였을 때 P. kudriavzevii 와 A. oryzae인 2종만이 일치하였다. 이러한 종간의 불일치는 성장배지에서 분리된 진균들의 경우 성장된 군체의 형태적인 특성에 기초하여 분리하였기 때문으로 사료된다. 누룩에 존재하는 세균, 효모 및 사상성 진균의 세포(포자를 포함)로부터 total ge-nomic DNA를 추출하기 위해 세포파쇄는 액체질소 균질화 방법을 적용하였다. 일반적으로 성장세포보다는 포자의 파괴 효율이 다소 낮을 수는 있지만 Fig. 3에서 A. oryzae가 주된 우점종 중의 한 종으로 검출되어 사상성 진균의 세포 또는 포자 파쇄에 문제점은 낮은 것으로 판단된다. 시료에 존재하는 미생물의 검출효율에 있어 PCR-DGGE 기술은 시료 내에 종의 개체수가 \( 10^{4} \) cells 이하일 경우 검출되지 않는 한계성을 갖고 있어, 배양방법에 의해 분리된 사상성 진균은 낮은 개체수로 인하여 검출되지 않은 것으로 판단된다.</p><p>본 연구로부터 PCR-DGGE를 이용한 분자학적 기법은 누룩에서 세균, 효모 및 진균의 다양성을 설명하는 데 유의한 분석 방법임을 확인하였다. 세균의 경우 배양 가능한 8종과 비배양균인 4종의 존재를 확인하였다. 또한 진균의 경우 다양한 효모와 사상성 진균의 존재를 확인하였다. 반면 PCR-DGGE방법의 종의 검출한계성으로 낮은 개체수의 종까지 설명하는 데는 한계성이 있음을 확인하였다. 그러나 PCR-DGGE기술은 누룩 내 존재하는 종의 다양성을 효율적으로 설명하고 있어 누룩 내 존재하는 유용한 미생물자원의 확보 그리고 누룩의 기능, 품질평가 및 개량누룩의 개발 등을 연구하는 데 유용한 방법으로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.</p>
본문에서 말하는 4종의 분리 세균에 해당되는 것은 무엇인가?
Pediococcus pentosaceus