<h1>결과 및 고찰</h1><h2>Fibroblast cell line MTT 측정</h2><p>GBE의 CCD986sk cell에 대한 독성을 확인하기 위해 MTTassay를 이용하여 세포 생존율을 측정한 결과 Fig. 1에서와 같다. GBE를 농도별 (\( 100\),\(200\),\(300\),\(400\),\(500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)로 처리하였을 때 농도가 증가하여도 세포 생존율이 \(98.09\)-\( 95.70\% \)로 \( 95 \% \)이상으로 나타났으며, \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 고농도로 처리하였을때 세포 생존율이 \( 95 \% \) 이상으로 확인되어 고농도의 GBE 처리 시 세포 생존율에 크게 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수있었다.</p><p>위의 결과에 따라 GBE가 CCD986sk cell에 대한 세포독성을 가지지 않음을 확인하여 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)을 최고 농도로 설정하여 추후 western blot 및 real-time PCR 측정 실험을 진행하였다.</p><h2>Western blot을 이용한 COL1A2 protein 발현량 측정</h2><p>인체 피부의 기능적인 특성은 피부에서 가장 풍부하게 존재하는 구조 단백질인 collagen의 상태와 관련이 깊으며, collagen은 피부에 강도와 장력을 부여하여 외부의 자극 등으로부터 피부를 보호하는 역할을 한다. Collagen의 감소는 피부의 노화 및 주름생성에 밀접하게 관여하는 성분으로 알려져 있다. 또한 인체 내의 collagen의 합성 및 분해과정은 적절하게 조절되며, 노화가 진행되면서 collagen의 양이 감소하고 피부가 자외선에 노출되면 기질 단백질 분해효소인 MMPs의 발현이 촉진된다. 지금까지 약 20종의 MMPs가 발견되었는데 MMP는 기저막과 세포외기질의 분해에 관여하는 아연을 포함하는 단백질분해 효소로서 구조 및 기능적 특성에 따라 collagenase, gelatinase,stromelysin, matrilysin 및 membrane type-MMP 등으로 구분된다. 피부에서의 collagen 합성은 고령화에 따른 내인성 노화 및 자외선 노출에 의한 광노화와 관련이 있다. GBE의 COL1A2 protein 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 UVB에 의해 자극된 CCD986sk cell에 GBE를 농도별(\(100\), \(300\), \(500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \))로 처리하여 발현량을 측정한 결과 Fig. 2에서와 같이 \(55.87\),\(65.40\),\(100.00 \% \))의 COL1A2 발현량을 나타내어 500 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 고농도에서 \( 100.00 \% \)로 UVB 자극을 주지 않은 normal(Nor)군의 상태와 같은 COL1A2 합성 효과를 확인하였다.</p><h2>Western blot을 이용한 MMP-1, MMP-9, TIMP-1 protein 발현량 측정</h2><p>피부의 노화가 진행됨에 따라 피부 내의 MMP-1의 활성이 증가하게 되고, 피부의 collagen 합성이 감소하여 피부 탄력 감소와 주름을 유발한다. MMP-9은 기저막을 형성하는 제4형 아교질섬유를 분해하는 효소로 알려져 있으며, 이러한 용해성 MMPs는 비활성형으로 분비되어 N-말단 전구영역이 분리된 다음 활성화되는데 여러 단백분해효소들이 이 전구효소의 활성화에 관여한다. 활성형 MMPs는 주로 TIMPs에 의해 억제된다. TIMPs는 지금까지 주로 4군이 알려져 있으며, TIMP-1은 MMP-9, TIMP-2는 MMP-2를 각각 대항함으로써 피부 세포 내에서 염증이나 주름 예후 인자들과 연관성을 보였다는 보고가 있다.</p><p>GBE의 MMP-1, MMP-9, TIMP-1 protein 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 UVB에 의해 자극된 CCD986sk cell에 GBE를 농도별(\( 100\),\(300\),\(500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \))로 처리하여 발현량을 측정한 결과 MMP-1의 경우에는 Fig.\( 3 \mathrm{A} \)에서와 같이 \( 99.08\), \(75.69\), \(73.36 \% \)의 발현량을 나타내었으며, \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 고농도에서 \( 26.64 \% \)의 억제 효과를 나타내었고, MMP-9의 경우에는 Fig. 3B에서와 같이 \( 60.77\), \(46.27\), \(32.98 \% \)의 발현량을 나타내었으며, \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 고농도에서 \( 67.02 \% \)의 억제 효과를 나타내었다. TIMP-1의 경우에는 Fig. 3 C에서와 같이 \(64.16\), \(60.80\), \(84.08 \% \)의 TIMP-1 발현량을 나타내었고, \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 고농도에서 \( 84.08 \% \) 로 UVB 자극만 처리한 control (Con)군의 \( 40.59 \% \) 에비해 우수한 TIMP-1 생성 효과를 확인하였다. UVB에 의해 자극된 MMP-1, MMP-9 protein 모두 농도 의존적으로 발현량이 감소하였으며, COL1A2, TIMP-1 protein의 경우 농도 의존적으로 발현량이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.</p><p>위의 결과에 따라 GBE가 MMP-1 protein을 억제하였으며,MMP-1의 활성억제에 의해 COL1A2의 합성량이 증가되는 것을 확인하였다. 따라서 GBE가 type Ⅰ collagenase group의MMP-1 억제와 이와 관련된 COL1A2 합성에 모두 관여한다고 판단되었다. 또한 gelatin 분해와 type Ⅵ collagenase로 알려진 MMP-9의 억제, MMPs의 tissue inhibitor로 알려진 glycoprotein인 TIMP-1의 생성에도 관여하는 것을 확인하였으며, 주름과 관련된 또 다른 유전자에도 영향을 미칠 것으로 예상되었다. 따라서 GBE의 경우와 같이 collagen 대사를 조절하는 소재의 탐색은 자외선으로부터 유도되는 피부 노화를 예방하고 치료하는데 효과적인 접근 방법으로 판단되고 있다.</p><h2>Real-time PCR을 이용한 photoaging-related factors (COL1A2, MMP-1, MMP-9, HAS2, TGF- \( \beta \), TIMP-1) 발현량 측정</h2><p>노화가 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 collagen, elastin,hyaluronic acid 등 구조 단백질을 생성하는 능력이 감소한다. 피부에 있어 collagen은 신체 곳곳에 존재하는 대표적인 섬유상 단백질로서 14개의 type이 존재하며 이 중 피부에는 type I collagen이 주로 존재한다. Type I collagen은 피부의 진피, 힘줄, 뼈, 그리고 치아 등에 존재하며 조직의 탄력을 유지하는데 중요한 역할을 한다. Collagen은 두 개의 \( \alpha \)1 사슬과 한 개의 \( \alpha \)2 사슬이 3중 나선 형태로 꼬여서 생성되며 이사슬들은 각각 COL1A1, COL1A2 유전자로부터 발현된다. 피부 노화는 진피섬유아세포의 작용이 특정 요인에 의해 이상이 생기는 것으로, 진피섬유아세포의 기능 이상은 collagen의 생성 저해와 collagen 분해 효소인 MMPs의 활성 증가로 이어지게 된다. MMPs는 진피층으로 분비되어 collagen의 분해를 촉진하여 주름 생성과 탄력의 감소를 유도한다. 섬유아세포에서 생성되는 MMP-1, MMP-9은 type Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ collagen을 분해하는 작용을 한다. MMPs의 활성을 조절하는 인자로 알려진 TIMPs는 MMPs와 비 공유적인 결합을 하여 MMPs의 기능을 억제하는 것으로 알려져 있고, TIMP-1은 MMP-9과,TIMP-2는 MMP-2와 각각 결합하여 세포 간 기질의 파괴와 재형성 간의 균형을 조절하는 역할을 한다. 세포생존, 세포분화, 세포외기질 합성 등 다양한 생리학적 기전에 관여하는 대표적인 다기능 사이토카인인 TGF-\( \beta \)는 UVB에 의하여 증가된 ROS에 의해 저해되며, TGF-\( \beta \)의 활성화는 MMPs와 type Ipro-collagen 발현에 관여하는 것으로 알려져 있다.</p><p>GBE의 photoaging-related factors (COL1A2, MMP-1, MMP-9, HAS2, TGF-\( \beta \), TIMP-1) 발현량을 확인하기 위해 UVB에 의해 자극된 CCD986sk cell에 GBE를 농도별(\(100\), \(300\), \(500\) \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \))로 처리하여 발현량을 측정한 결과 Fig. 4A에서와 같이 \(0.48\), \(0.62\), \(0.68\)의 COL1A2 발현량을 나타내어 (\(100\)-\(500\) \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \))의 모든 농도에서 UVB 자극만 처리한 Con군의 0.34에 비해높은 COL1A2 생성량을 나타내었다. MMP-1의 경우에는 Fig. 4B에서와 같이 0.84, 0.61, 0.59의 발현량을 나타내어 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 고농도에서 Con군과 비교하였을 때 MMP-1의 효과적인억제 효과를 확인할 수 있었으며, MMP-9의 경우에는 Fig. 4C에서와 같이 0.98, 0.94, 0.83의 발현량을 나타내어 \(500\) μg/mL의 고농도에서 Con군과 비교하였을 때 MMP-9의 억제 효과를확인하였다. HAS2의 경우에는 Fig. 4D에서와 같이 0.30, 0.37, 0.56의 발현량을 나타내어 농도의존적으로 유의적으로 상승하는결과를 나타내었다. TGF-\( \beta \)의 경우에는 Fig. 4E에서와 같이 0.44, 0.48, 0.63의 발현량을 나타내어 TGF-\( \beta \)가 농도의존적으로 발현량이 증가하는 결과를 나타내었다. TIMP-1의 경우에는 Fig. 4F에서와 같이 0.34, 0.47, 0.53의 발현량을 나타내어 우수한 MMPs 조절 효과를 나타내었다. 위의 결과에 따라 UVB에 의해 자극된 photoaging-related factors 모두 유의적으로 발현량이 감소하거나 증가하는 것을 확인하였으며, UVB 자극만 처리한 Con군의 발현량과 비교하였을 때 유의적으로 더 우수한 효과를나타내었다. 또한 GBE가 MMP-1, MMP-9을 효과적으로 억제하였으며, MMPs 와 type I pro-collagen 발현에 관여하는 조절인자인 TIMP-1과 TGF-\( \beta \)의 발현량이 증가함에 따라 COL1A2의 생성량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 피부를 구성하는 구조 단백질 중 하나인 hyaluronic acid 생성에 관여하는 HAS2의 발현량 증가를 확인하였다. 따라서 GBE가 주름생성에 영향을 미치는 인자와 주름개선에 영향을 미치는 인자 모두에 관여한다고 판단되었다.</p>
GBE를 높은 농도로 처리하게 되면 세포 생존율이 크게 감소하지?
NO