<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>본 실험에서 사용한 한국산 반하(5종)와 중국산 반하 (8종)는 2015년 국내 유통 도매시장에서 구매하여 확보하였고, 한국생명공학연구원 한국식물추출물은행에서 동정하고 보관하였다. 수집된 반하에 대한 자세한 정보는 Table 1에 나타내었다.</p><h2>시약 및 기기</h2><p>실험에 사용한 세포주인 B16F10 cell은 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며 세포배양을 위해 \( 1 \% \) antibiotic과 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS), phosphate buffered saline, Dulbeccos's Modified Eagle's Medium (DMEM)은 Gibco (Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 세포 독성과 melanin 생합성 저해 활성 평가를 위해 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하였고, 3-(4,5-dimethylthiaxo-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), \( \alpha \)-melanocyte stimulating hormone ( \( \alpha-\)MSH), dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Melanin 생합성 저해 활성은 SpectraMax M5(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다. Ethanol \( (\mathrm{EtOH}) \) 용매(SK chemical, KR)는 추출물 제조를 위해 사용하였으며, 타겟 화합물 분석과 분리를 위해 high performance liquid chromatography (HPLC) methanol(\( \mathrm{MeOH}\),Honeywell, Moris Plains, NJ, USA)과 acetonitrile (ACN, Honeywell, Moris Plains, NJ, USA), formic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), leucine enkephalin (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하여 UPLC-QTof-MS (Waters, Milford, MA, USA), PDA (Waters, Milford, MA, USA), MPLC (Gilson, Middleton, WI, USA), preparative-HPLC (PLC, Gilson, Middleton, WI, USA) 기기를 이용하여 진행하였다. 구조분석을 위해 Bruker AM400 (\(^\mathrm{I} \mathrm{H} \) nuclear magnetic resonance (NMR) at \( 400 \mathrm{MHz}\),\(^{13} \mathrm{C} \) NMR at \( 100 \mathrm{MHz} \), Billerica, MA, USA)에 chloroform- \( d \) (Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA, \( \mathrm{USA}) \) 를 사용하여 분석하였다.</p><h2>한국산 반하를 이용한 칼럼분획물 제조</h2><p>음건한 한국산 반하 \( 6 \mathrm{~kg} \) 을 tube mill (IKA, Staufen, Germany)을 이용하여 잘게 분쇄하고 \( 94 \% \) ethanol \( (94 \% \mathrm{EtOH}, 10 \) \( \mathrm{L} \times 3 \) )을 가하여 실온에서 24 시간 3 회 반복 추출한 후 여과하였다. 얻어진 여액을 감압 농축하여 \( 94 \% \mathrm{EtOH} \) 추출물(24.2 g,수율 \( 0.40 \% \) )을 얻었다. MPLC 기기에 \( 250 \times 20 \mathrm{~mm} \) 의 YMC-Pack ODS-AQ-HG (\(10 \mathrm{mm}\), YMC, Kyoto, Japan) 칼럼관과 ultraviolet (UV) 검출기 \( (230,280 \mathrm{~nm}) \) 장착한 후, 추출물 \( 4.0 \mathrm{~g} \)을 로딩하였고, 증류수와 \( \mathrm{MeOH} \) 의 혼합 용매를 이동상으로 하여 \( \mathrm{MeOH} \) 농도를 점차적으로 증가시키면서 \( (50 \rightarrow 100 \%\) , \( 120\mathrm{min} \) ) 칼럼분획물을 제조하였다. 칼럼분획물을 제조한 후, 각 분획물에 대하여 UPLC-PDA와 연계하여 활성유도 분획법을 통하여 유효성분을 분리하고자 하였다.</p>
본 실험에서 사용한 한국산 반하(5종)와 중국산 반하 (8종)는 어디에서 구매하여 확보하였나요?
국내 유통 도매시장