<h2>Melanin 정량</h2><p>멜라닌 양은 Hosoi 등의 방법을 변형하여 사용하였다. B16F10 melanoma cell을 6 well에 \(5\times 10^{4}\) cell이 되도록 접종하여 배양하고, 24간 뒤 각 well에 도인승기탕 추출물(10, 50, 100 \(\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml})\) 와 arbutin \((100\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml})\)을 48시간 동안 처리하였다. 처리 후 phosphate buffered saline (PBS)로 2회 세척한 후 원심 분리하여 세포 침전물을 만들었다. \(10 \%\) dimethyl sulfoxide DMSO가 첨가된 \(1 \mathrm{N}\) \(\mathrm{NaOH}\) 용액을 \( 150 \mathrm{\mu l}\) 첨가하고 \(60^{\circ}\mathrm{C}\)에서 1시간 용해하였으며 \(405\mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정한 후 실험 군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하여 나타내었다.</p><h2>Tyrosinase 활성 측정</h2><p>Tyrosinase 활성 측정은 Choi 등의 방법을 변형하여 측정하였다. B16F10 melanoma cell을 6 well에 \(5\times 10^{4} \) cell이 되도록 접종하여 배양하고, 24시간 뒤 각 well에 도인승기탕 추출물 (10, 50, 100\(\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml})\) 과 arbutin \((100\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml})\)을 48시간 동안 처리한다. 처리 후 PBS로 2회 세척한 후 각 well의 세포에 lysis buffer (\(1\%\) triton X-100, \(0.1 \mathrm{M}\) Sodium phosphate buffer, \(50\mathrm{mM}\) PMSF, \(\mathrm{pH}6.8\))를 가하였다. 얼음 위에서 세포를 파괴시키고 원심 분리한 후 상층액만 따로 모아 효소용액으로 사용하였다. L-DOPA를 \(2\mathrm{mg}/\mathrm{ml}\) 농도로 \(0.1\mathrm{M}\) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.8\))에 녹여 기질을 준비하고 기질 \( 160 \mathrm{\mu l}\)에 효소용액 \(40\mathrm{\mu l}\)를 가하고 \(37^{\circ}\mathrm{C}\)에서 1시간 가온하고 생성된 DOPA chrome의 양을 \(490\mathrm{~nm}\)에서 측정한 후 (\(1-\)시료의 흡광도/대조구의 흡광도 \(\times100\)에 의하여 억제율을 계산하였다.</p><h2>Western blot을 통한 미백 관련 단백질의 발현 측정</h2><p>B16F10 melanoma celle를 6 well에 \(1\times10^{5}\) cells/well에 되도 록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 각 cell에 도인승기탕 추출물 (10, 50, 100 \(\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml})\)과 arbutin \((100\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml})\)을 48시간 동안 처리 후 PBS로 세척하였다. Lysis buffer \(100\mathrm{\mu l}\)를 첨가하여 세포를 용해시키고 원심분리 하여 \((12,000\mathrm{rpm}\), \(4^{\circ}\mathrm{C}\), \(20\mathrm{~min})\) 세포막 성분들을 제거하였다. 원심분리하여 얻은 단백질은 BCA (bicinchoninic acid) kit assay로 정량하였으며, \(60\mathrm{\mu l}\)의 단백질을 \(10\%\)의 SDS-PAGE를 이용하여 전기 영동 한 후, 항체의 비특이적 결합을 억제시키기 위해 PVDF membrane에 옮긴 다음 \(400 \mathrm{mV}\)에서 2시간 transfer하였다. Transfer가 끝난 membrane은 \(5\%\) skim milk로 1시간 동안 blocking을 한 뒤 1차 antibody tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF는 \(3\%\) skim milk로 \(1:1000\)희석하여 사용하고 overnight 한다. Tris-buffered salin and tween 20 (TBST)로 3번 세척한 뒤 2차 antibody anti-goat, anti-mouse, anti-rabbit은 \(3\%\) skim milk로 \(1:1,000\) 희석하여 1시간 동안 붙이고 TBST로 3번 세척한 뒤 enhanced chemiluminescense (ECL) kit (Milipore, Germany)를 이용하여 발현 양상을 측정하였다. Band density는 gel doc (Amersham Pharmacia, England)을 이용하여 확인하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>결과 통계처리는 SPSS 10.0을 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(ANOVA: analysis of variance)을 한 후 \(\alpha=0.05\) 수준에서 Tukey's HSD test에 의해 유의성을 분석하였다.</p>
본 실험에서 멜라닌 양을 어떤 방법을 통해 사용하였는가?
Hosoi 등의 방법