<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>본 실험에 사용된 esculetin은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. mRNA 분석을 위하여 Bioneer(Taejeon, Korea)에서 구입한 primer는 Table 1에 나타내었고, immunoblotting을 위하여 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 CalBiochem(San Diego, CA, USA)에서 구입하였으며, 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다.</p><h2>세포의 배양</h2><p>실험에 사용한 인체 혈구암 U937 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며 \( 90 \% \)의 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS), \( 2 \mathrm{mM} \) glutamine, \( 100 \mathrm{~U} / \mathrm{ml} \) penicillin 및 \( 100 ~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) streptomycin (Gibco BRL)이 포함된 성장배지를 사용하여 \( 5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2}\), \(37^{\circ} \mathrm{C} \)의 조건하에서 배양하였다.</p><h2>MTT assay에 의한 세포 성장억제 조사</h2><p>\( 30 ~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 esculetin을 일정시간 동안 처리하여 배양한 다음 배지를 제거하고 \( 0.5 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 농도의 tetrazolium bromide salt (MTT, Amresco, Solon, OH, USA)를 분주하였다. 2시간 동안 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 배양시킨 다음 DMSO로 생성된 formazin을 모두 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.</p><h2>Flow cytometry 분석</h2><p>일정시간 동안 esculetin을 처리한 세포를 모은 다음 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 고정 및 염색을 하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), 암실에서 30분 동안 반응을 시켰다. 반응시킨 세포를 \( 35- \mathrm{mm} \) mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACSCalibur(Becton Dickinson)를 이용하여 형광반응에 따른 세포 내 DNA 함량을 CellQuest software 및 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램을 이용하여 분석하였다.</p><h2>위상차 현미경을 이용한 세포의 성장과 형태의 관찰</h2><p>세포 배양용 \( 100 \mathrm{~mm} \) petri dishes에 세포를 \( 1 \times 10^{5} \text{개} / \mathrm{ml} \) 정도로 분주하고 esculetin을 처리하여 일정시간 동안 배양한 후, 위상차 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 200배의 배율로 형태 변화를 관찰하였다.</p><h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)에 의한 mRNA의 분석</h2><p>상기와 동일한 조건에서 준비된 U937 세포에 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, 각각의 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭한 후, \( 1 \% \) agarose gel을 이용하여 \( 100 \mathrm{~V} \)에서 전기영동을 하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide (EtBr)를 이용하여 염색한 후 관찰하였다.</p><h2>Immunoprecipitation, gel electrophoresis 및 Western blot analysis</h2><p>준비된 암세포에 lysis buffer [ \( 25 \mathrm{~mM} \) Tris-\( \mathrm{Cl} \) (\( \mathrm{pH} ~ 7.5 \)), \( 250\mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}\), \(5 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 1 \% \) NP-40, \( 1 \mathrm{mM} \) phenymethylsulfonyl fluoride, \( 5 \mathrm{mM} \) dithiothreitol]를 첨가하여 단백질을 분리한 다음 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 정량하였다. 면역침전을 위해서 해당 항체가 들어있는 extraction buffer를 준비된 단백질 에 첨가한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 반응시켜 만들어진 면역복합체를 protein G/A-Sepharose bead를 이용하여 모았다. 면역침전 및 총 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)- polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 다음 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시켰다. 준비된 membrane을 관찰대상 단백질에 해당되는 1차 및 2차 항체에 반응시킨 다음 enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 처리하여 암실에서 X-ray 필름에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다.</p>
어디에서 특정단백질의 양을 분석하였어?
암실