<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험동물 및 사육환경</h2><p>시험구역은 조선대학교 실험동물센터이며, 시험동물은 (주)대한실험동물센타에서 분양받은 특정병원체부재(SPF) 암수 ICR계 마우스를 온도 \( 23 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 55 \pm 5 \% \), 빼기 횟수는 시간당 \( 10 \sim 18 \)회이며, 형광등 명암 12 시간 cycle \(08:00 \sim 20:00\), 조도 \(300 \sim 500 \mathrm{Lux}\)의 사육환경에서 폴리카보네이트 사육상자 (\( 220 \mathrm{~W} \times 270 \mathrm{~L} \times 130 \mathrm{H} \mathrm{mm} \)) 케이지에 5마리씩 암, 수 각각 따로 넣어 사육하였다. 1주일간의 순화사육 기간동안에 임상관찰 등을 시행하여 정상적인 동물만 시험에 사용하였으며, 실험동물이 6주령이 될 때 시험을 실시하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(제일사료주식회사)를 자유 섭취시켰으며, 음수는 상수도수를 자유섭취시켰다.</p><h2>EPS생성 유산균주의 분리</h2><p>김치로부터 분리되어 유산균으로 확인된 김치유산균주를 sucrose(trypton \( 10 \mathrm{~g} \), yeast extract \( 5 \mathrm{~g} \), dipotassium phos-phate \( 5 \mathrm{~g} \), diammonium citrate \( 5 \mathrm{~g} \), sucrose \( 50 \mathrm{~g} / 1 \mathrm{~L}\), \(\mathrm{pH} 7.0\)) 고체배지에 도말하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양한 후, mu-coid colony를 나타내는 점질균을 선정하고, 다시 sucrose액체배지에서 점성물질을 분비하는 것을 확인하여 EPS생성균주로 선정하였다. 분리 균주는 MRS(Difco, France) 액체배지에 배양한 후 대수기에 있는 배양액에 glycerol이 \( 25 \% \) (\(\mathrm{v}/ \mathrm{v}\)) 가 되게 첨가하여 \( -7^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하였으며, 실험에 사용할 경우 \( 5 \mathrm{~mL} \) MRS 액체배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양한 후 MRS 액체배지에 1차 계대하고, 다시 sucrose 액체배지에 2차 계대하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양하여 사용하였다.</p><h2>시험물질</h2><p>김치에서 분리, 배양한 EPS생성 유산균 Leuconostoc kim-chii GJ2(Leu. kimchii GJ2, 이하 시료라 함)를 \(4,000 \mathrm{rpm}\)에서 15 분간 원심분리하여 배양액중의 균체를 회수하고 다시 phosphate-buffered saline(PBS)으로 3회 세척한 후 \( 50 \mathrm{~mL} \) PBS에 현탁시켰다. 현탁되어진 균을 초음파 분쇄기를 이용하여 25 분 간격으로 1시간 동안 균체를 파쇄한 후 \(5,000 \mathrm{rpm} \)에서 15분간 원심분리하여 상등액을 회수하였고 파쇄되지 않아 침전된 균체(cell debris)는 동일 조건하에서 초음파파쇄를 재실시하여 균체를 완전히 파쇄한 후 상등액을 회수하였다. Perchloric acid 처리로 핵산이 제거된 용액을 12시간 정도 동결 건조하여 최종적으로 실험에 사용할 시료를 powder 형태로 얻었다. 이를 주사용 증류수에 투여 용량을 고려하여 각 농도별로 용해하였다. 경구투여의 경우는 존데를 이용하여, 복강주사의 경우 복강내에 1회용 멸균주사기를 이용하여 1회 주사하였다. 주사용 증류수를 대조물질로 사용하였다.</p><h2>군 분리 및 투여용량의 설정</h2><p>순화기간 중 건강하다고 판정된 동물에 대하여 체중을 측정하고 평균체중 (\( 22 \pm 2 \mathrm{~g} \)) 에 가까운 개체를 선택하여 무작위법을 이용, 군 분리를 실시하였다.</p><p>투여용량의 설정에서, 복강급성독성시험의 경우 투여 용량은 시료의 용해도 및 예비실험결과를 토대로 최고 용량을 \( 2,500 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \)으로 하고, 등차를 200 으로 체중 \(\mathrm{kg} \)당 700, 900, 1,100, 1,300, 1,500, 1,700, 1,900, 2,100, 2,300 및 \(2,500 \mathrm{mg} \)의 10군을 설정하였다. 경구급성독성시험의 경우, 최고 용량을 \( 5,000 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \)으로 하고, 등비를 500 으로 하여 체중 \( \mathrm{kg} \) 당 \(625, 1,250, 2,500, 5,000 \mathrm{mg} \)으로 설정하였다. 투여 용량이 경구투여 시는 \( 10 \mathrm{~g} \) 당 \( 0.2 \mathrm{~mL} \)을, 복강내 투여시는 \( 0.1 \mathrm{~mL} \)이 넘지않게 일정한 역량으로 시험물질의 각 농도가 들어가게 조제하여 투여 액량을 결정하였다.</p><h2>임상증상 및 사망의 관찰</h2><p>Leu. kimchii GJ2를 복강 투여한 후 모든 동물에 대한 임상증상 및 사망례 과찰은 투여 당일은 투여 후 6시간까지 매 시간마다 일반상태를 관찰하였고, 투여 다음날부터 14일까지는 매일 1회씩 일반상태의 변화, 중독 증상 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. Leu. kimchii GJ2를 경구 투여한 후의 생존례와 임상증상 관찰은 복강급성독성시험법에 준하여 실시하였다.</p><h2>체중변화</h2><p>시험에 사용된 모든 동물에 대하여 복강 혹은 경구 투여직전과 투여 후 1일, 3일, 5일, 7일과 부검 직전인 14 일째에 각각 체중을 측정하였다.</p><h2>부검</h2><p>시험기간 중 사망동물에 대해서는 발견 즉시 부검을 실시하여 육안검사를 하였으며, 시료물질 복강 혹은 경구 투여 후 14 일째까지 생존한 동물은 시험 종료 후 동물을 \( \mathrm{CO}_{2} \)로 가볍게 마취시킨 다음 절박도살을 실시하고 후대동맥을 절단하여 방혈시킨 후에 외관 및 내부 장기의 이상 유무를 육안 소견으로 관찰하였다.</p><h2>자료의 통계학적 해석</h2><p>\(\mathrm{LD} _{50} \)산출은 Litchfield와 Wilcoxon 방법, 기타 본 실험에서 얻은 결과는 SPSS 12.0 P/C package를 이용하여 실험군당 평균과 표준오차를 계산하였고, 일원배치분산분석 (one way ANOVA)을 실시하였으며, 사후검정은 Tukey-test에 의하여 실행하였다. 본 연구에 이용된 통계적 유의성 검증은 \( p<0.05 \)수준에서 이루어졌다</p>
어디서 실험했어?
조선대학교 실험동물센터