<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>국내산 당귀, 천궁, 작약, 건지황은 경남생약농협(Sancheong, Korea)에서 구입하였고, human neuroblastoma SK-N-SH 세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham'F-12 nutrient mixture (DMEM/F-12),fetal bovine serum (FBS), penicillin \( (10,000 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) / \) streptomycin \( (10,000 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{l}) \), phosphate buffer saline (PBS), 0.25\% trypsin-EDTA는 Gibco-BRL (Carlsbad, CA)에서 구입하여 사용하였으며 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT)은 Amresco (Solon, OH)에서 구입하였다. Dimethyl sulfoxide (DMSO), propidium iodide (PI), RNase,Hoechst33258, \( \beta \)-actin, gallic-acid, 2,2-diphenyl-1- picrylhy-drazyl (DPPH), Folin-Ciocalter's phenol 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다. Cell culture dish는 Nunc (New York)에서 구입하였고, protein extraction buffer (Pro-Prep)은 iNtRON Biotechnology inc. (Seoul, Korea)에서 구입하였으며, enhanced chem-iluminescence (ECL)용액은 Elpis-Biotech (Daejeon, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Caspase-3 antibody는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)에서 구입하였고, goat anti-rabbit, goat anti-mouse antibody는 Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, CA)에서 구입하였다. Gel transfer kit (iblot), transfer stack PVDF membrane은 Invitrogen (Carlsbad, CA)에서 구입하여 사용하였다. 그 외 사용된 시약은 reagent grade 이상이었다.</p><h2>추출물 시료조제</h2><p>한약재 시료는 실온에서 음건하여 분쇄하였다. 에탄올추출 및 열수추출은 시료 \( 4 \mathrm{~g} \) 을 각각 에탄올 \( (600 \mathrm{ml}) \) 및 증류수 \( (600 \) \( \mathrm{ml} \) 에 침지하여 5 시간 환류냉각하여 추출하였다. 증숙추출은 분쇄한 시료 \( 30 \mathrm{~g} \) 을 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 120^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 90 분간 증숙처리 후 건조 \( \left(45 \pm 3^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 한 것을 환류냉각하여 5 시간 열수추출하였다. 이들 추출물을 감압 농축한 다음 동결 건조하여 정량하고 시료로 사용하였다.</p><h2>세포배양 및 시료처리</h2><p>SK-N-SH 세포는 \( 10 \% \) FBS와 penicillin/streptomycin이 함유된 DMEM/F-12 배지에서 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 가 공급되는 배양기(3 \( \left.7^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 로 배양하였다. 세포가 \( 80 \% \) 정도 자라면 \( 0.25 \% \) tryp-sin -EDTA 용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 5 분간 처리하고 원심분리(1,500 rpm, 5 분)하여 pellet을 분리하였다. 이 pellet을 DMEM/F-12 배지로 희석하여 실험에 사용하였다. 시료의 세포독성 분석은 24 well plate \( \left(1.5 \times 10^{5}\right. \) cell \( / 0.5 \mathrm{ml} / \) well \( ) \), apoptotic sub-G1기 분석 및 caspase- 3 분석은 \( 10 \mathrm{~cm} \) culture dish \( \left(5 \times 10^{5}\right. \) cell/dish), 핵의 형태학적 변화 분석은 \( 3 \mathrm{~cm} \) culture dish \( \left(5 \times 10^{5}\right. \) cell/dish)에서 24시간 배양하였다. 이들로부터 배지를 제거하고 PBS 로 세척(3 회)후 serum free media (SFM)를 가하고 시료를 농도별 \( (0,0.5,1,2,4 \mathrm{\mu g} / \mathrm{\mu l} \mathrm{SFM}) \) 로 2 시간 처리하였다. 다시 배지를 제거한 후 PBS 로 세척(3 회)하고 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} 250 \mu \mathrm{M} \) 을 2 시간 처리하였다.</p>
human neuroblastoma SK-N-SH 세포는 어디에서 구입하였어?
한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)