<h2>주름 억제</h2><p>시료의 주름억제 효능을 검증하기 위해 elastase 억제활성과 PIF 생성량 확인 및 collagen 분해를 통한 광노화 유도 인자인 MMPs에 대해 western blot을 실시하였다. 피부 주름은 진피에 존재하는 collagen과 elastin의 그물망 구조가 깨지면서 일어나는데, 이것은 자외선, 나이 그리고 스트레스 등으로 인해 과발현된 elastase에 의해서 이루어진다. 따라서 탁리산 용매 분획물로 elastase의 억제율을 측정하여 주름억제 활성을 검증하였으며 TW-H, TW-EA, TW-B, TW-W는 1,000 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 농도에서 각각 29, 49, 26, 32\( \% \)의 억제율을 나타냈고 TW-EA가 용매 분획물 중 가장 높은 저해활성을 보여주었다(Fig. 3A). 동일한 농도에서 선학초 EA는 약 53\( \% \)의 억제효과를 나타내었고, 오이풀 뿌리 분획물의 약리활성 연구에서는 70\( \% \)아세톤으로 추출한 오이풀 뿌리의 EA가 1,000\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 농도에서 약 21\( \% \)의 억제율을 보여주었다.</p><p>CCD-986sk cell에 elastase 억제활성 측정결과 가장 우수한 효능을 나타낸 TW-EA를 이용하여 procollagen의 합성양을 평가하기 위해 PIP EIA kit를 이용하여 free propeptide 생성양을 검출하였다. Collagens는 procollagens이라고 불리는 전구체로 합성되고 이것은 propeptides라고 불리는 펩타이드 서열을 포함하고 있다. 따라서 free propeptide의 양은 합성된 collagen 분자의 양을 말한다. TW-EA를 농도별로 처리하여 확인한 결과 최고 농도인 100\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 농도에서 각 각 89\( \% \)의 procollagen 합성율을 나타내었다(Fig. 3B).</p><p>주름관련 단백질 발현을 검증하기 위해 western blot을 실시하였으며, 주름이 생성되는 원인으로 교원질의 결핍을 들 수 있는데 이것은 진피의 주요 구성물질이며 특히 광노화된 피부에서 MMP-1, -2, -9, 13 등과 같은 효소의 작용으로 인해 주름을 형성하게 된다.</p><p>CCD-986sk cell에 TW-EA를 농도 별로 처리하여 MMP-1, -2,-9, 13의 활성을 확인하였으며 각 각 100\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 농도에서 79, 55, 64, 63\( \% \)의 저해활성을 보여주었다(Fig. 4).</p><h2>미백 활성</h2><p>시료의 미백 효과를 검증하기 위해 tyrosinase 저해활성과 western blot을 실시하였다. Tyrosinase는 melanin 생성에 중요한 역할을 하는 효소로 기질인 tyrosine이 tyrosinase에 의해 산화되어 생성되는 melanin의 흡광도를 측정함으로써 시료의 tyrosinase 억제 활성 효과를 검토하는 방법으로 미백 효과 연구에 사용되고 있다. 기존에 보고된 연구로는 구아바잎 70\( \% \) 메탄올 추출물의 EA이 1,000\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 에서 65\( \% \) 의 저해활성을 나타내었고, 섬초롱 80\( \% \) 에탄올 추출물의 EA는 동일한 농도에서 약 25\( \% \) 의 억제효과를 보여주었다. 반면 탁리산 용매 분획물은 TW-H, TW-EA, TW-B, -TW-W이 동일한 농도에서 각각 10, 69, 23, 7\(\%\)의 저해활성을 나타내었고, 그 중 TW-EA가 가장 우수한 효능을 나타내었다(Fig. 5).</p><p>미백 관련 단백질 발현을 확인하기 위해 western blot을 실시하였고, melanin은 기저층에 존재하는 melanocyte에서 생성되는데 주변의 각질형성세포, 섬유아세포 등에서 분비되는 인자의 영향을 받기도 한다. Melanocyte에는 melanin을 합성하는 효소를 가지고 있는 melanosome이 존재하고, 그 중 tyrosinase는 tyrosine을 DOPA, DOPA quinone으로 산화시키는 과정에 관여하여 melanin 생합성에 영향을 준다. 이에 세포에서 미백효능을 확인하기 위해 melanocyte의 한 종류인 HEM cell에 TW-EA와 positive control인 arbutin을 농도별로 처리하였고 MITF, tyrosinase,TRP-1, TRP-2의 발현을 검증하였다. MITF, tyrosinase, TRP-1,TRP-2 순서로 50\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 농도에서 62, 58, 34, 19\( \% \)의 저해활성을 나타내었고 positive control인 arbutin은 동일 농도에서 각 각 33, 48, 22, 8\( \% \)의 억제효과를 보여 TW-EA의 효능이 더 높게 나타났다(Fig. 6).</p><p>위 실험결과들을 통해 탁리산의 항산화, 주름 억제, 미백 효과를 확인함으로써 복합적인 한방처방의 다중 활성을 통한 피부개선효과를 증명 할 수 있었다. 이는 탁리산의 기능성 화장품 소재로의 개발 가능성을 보여준다고 사료된다.</p><h1>초 록</h1><p>본 연구에서는 탁리산 열수추출물을 용매 분획하여 항산화, 주름억제, 미백효과에 대한 활성을 검증하여 화장품 소재로서 이용가능성을 연구하였다. 용매 분획물로 DPPH radical scavenge, ABTS radical scavenge, elastase, tyrosinase 저해활성을 확인하였고 에틸아세테이트 분획물(TW-EA)이 가장 높은 저해활성을 나타내었다. 세포내에서의 주름억제, 미백효과를 확인하기 위해서 western blot을 실시하였고 비교 검증을 위해 사용한 positive contol보다 TW-EA의 억제효과가 뛰어난 것을 확인하였다. 이러한 결과로 탁리산의 화장품소재로서 적용 가능성을 검증하였다.</p>
탁리산 열수추출물이 주름억제에 유효한지 확인하기 위해 확인해야하는 생체 분자들은 무엇인가?
elastase 억제활성과 PIF 생성량 확인 및 collagen 분해를 통한 광노화 유도 인자인 MMPs