<h1>재료 및 방법</h1><h2>배지 및 시약</h2><p>본 연구에 사용한 일반 시약과 기질 및 미생물 배지는 Sigma-Aldrich (USA)와 Difco Laboratories (USA)에서 구입하여 사용하였다. 유전자 실험을 위한 제한효소 및 DNAligase 등은 New England Biolabs (UK)에서 구입하였으며, 각종 PCR 및 서열분석용 프라이머는 마크로젠(Korea)에서 합성하여 사용하였다.</p><h2>유전자와 발현벡터 및 형질전환 대장균 배양조건</h2><p>본 연구에서 사용된 cellobiose 2-epimerase (CE)의 유전자를 Bacillus coagulans (accession no. WP_046721782), Stenotrophomonas maltophilia (accession no. OBU71563),Dictyoglomus turgidum (accession no. WP_012583022), Spirochaeta thermophilia (accession no. AEJ60369), Ruminococcus albus (accession no. AB301953), Rhodothermus marinus (accession no. ACY49317), Caldicellulosiruptor saccharolyticus (accession no. ABP65941)에서 분리하여 사용하였다.</p><p>각 CE의 대장균 내 발현을 위한 플라스미드 벡터는 pET- 28a (\(+\)) (Novagen, Germany) 플라스미드를 사용하였으며, 유전자 클로닝 및 발현을 위한 숙주로는 E. coli BL21을 사용하였다. 재조합 E. coli BL21을 LBK (\(1\%\) bacto-tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 1 \% \mathrm{NaCl}\), \(30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) kanamycin) 액체 배지에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(250 \mathrm{rpm} \)에서 O.D \( \mathrm{D}_{600}=0.6 \) 까지 진탕 배양 후 \( 0.5 \mathrm{mM} \) IPTG (isopropyl- \( \beta \)-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 \( 16^{\circ} \mathrm{C}\), \(150 \mathrm{rpm} \)에서 16시간 동안 CE를 발현시켰다.</p><h2>Error-prone PCR에 의한 돌연변이 library 제조</h2><p>CsCE의 유전자 염기서열 중 ScaI과 EcoRI으로 절단되는 H4-12 \( \alpha \)-helix 구간에 대하여 돌연변이 library를 제작하기 위해 ScaI과 EcoRI 부위가 양말단에 삽입된 프라이머를 이용하여 GeneMorph Ⅱ Random mutagenesis Kit (Agilent Technologies, USA)를 이용하여 무작위 돌연변이를 유발하였다. 무작위 돌연변이에 사용된 프라이머 서열은 5'-AGT ACT ATG AAG CAT CCG GGG A-3' (ScaI-mut-F)와 5'CTC GAA TTC GTC AAC CCT TTT TAT TAT C-3' (EcoRI-mut-R)였으며, PCR 반응 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분의 주기로 30번을 반복하였다. PCR 후 얻어진 변형된 절편을 ScaI과 EcoRI으로 절단하고, 같은 제한효소로 절단한 주형의 pET28 a-CsCE에 절단된 PCR 절편을 삽입한 후 E. coli BL21에 형질전환하여 돌연변이 library를 제작하였다.</p>
본 실험에서 PCR과 sequencing을 위한 primer는 어디에서 합성해서 이용했는가?
마크로젠