<h2>HPLC와 mass analysis를 통한 tolaasin 펩티드 분석</h2><p>각 균주들의 배양액을 농축하여 얻은 분획들을 HPLC를 이용하여 분석하였다. Pt\( \alpha \) 와 Pt\( \gamma \) 소그룹에 속한 균주에서는 용혈활성을 가진 band A 분획을 분석하였고, 용혈활성이 없는 Pt\( \beta \) 소그룹 균주에서는 Pt\( \alpha \) 소그룹에서 용혈활성을 보인 분획과 같은 번호의 분획을 분석하였다(Fig. \( 3 \)). Pt\( \alpha \) 소그룹인 P. tolaasii \( 6264 \) 와 HK\( 1 \) 균주의 펩티드 분획에서는 각각 \( 10.5 \) 분과 \( 17.8 \) 분의 지연시간(retention time)에서 크고 작은 peak가 각각 나타났고, Pt\( \gamma \) 소그룹인 P. tolaasii HK \( 23 \) 균주의 분획에서도 유사하게 \( 11.0 \)분과 \( 17.8 \)분의 지연시간을 보이는 peak가 관측되었다. Pt\( \beta \) 소그룹인 P. tolaasii HK\( 19 \) 균주의 분획에서는 \( 10.2 \)-\( 10.8 \)분과 \( 17.8 \)분의 지연시간을 갖는 매우 작은 peak들이 얻어졌다.</p><p>이러한 HPLC chromatogram을 가진 각 균주들의 분획에 포함된 펩티드의 분자량을 MALDI-TOF mass spectrometry를 이용하여 분석하였다. 먼저 각 균주들의 mass spectrum을 비교하기 위하여, 전체 측정 범위 \( (\mathrm{m} / \mathrm{z} 300 \text{-} 3,500) \)의 spectrum을 비교하였다(Fig. \( 4 \)). Pt\( \alpha \) 소그룹 균주인 P. tolaasii \( 6264 \) 균주에서는 band A와 B 모두에서 약 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} 2,000 \) 부근에서 높은 intensity를 보였고, 그 외 Pt\( \beta \)와 Pt\( \gamma \) 소그룹 균주인 P. tolaasii HK\( 19 \) 와 HK\( 23 \) 균주는 band A에서 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} 2,000 \) 부근의 peak를 확인할 수 없었다. 이를 tolaasin 펩티드 유사체만을 확인할 수 있는 범위로 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} 1,900 \text{-} 2,100 \)으로 좁혀 확인하였다(Fig. \( 5 \)). Pt \( \alpha \) 소그룹 균주인 P. tolaasii \( 6264 \)는 tolaasin Ⅰ (\( 1,987 \mathrm{Da} \)) 및 tolaasin Ⅱ (\( 1,943 \mathrm{Da} \)) 의 tolaasin 유사체들을 분비하였다(Fig. \( 5 \)A and \( 5 \)B). 놀랍게도 band A에서 분석된 펩티드들은 모두 band B와 동일하게 얻어졌으며, 이는 band A가 tolaasin 펩티드들의 다중체형태임을 보여준다. Tolaasin 분자가 다중체를 형성하여 세포막에 pore를 형성하는 것은 이미 보고한 바 있다. 그에 반해, P. tolaasii HK \( 19 \)와 P. tolaasii HK\( 23 \) 균주에서는 tolaasin 및 그 유사체를 확인할 수 없었으며, 주로 \( 1,100 \text{-} 1,200 \mathrm{Da} \) 사이의 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} \) 범위에서 펩티드 성분들을 확인할 수 있었다(Fig. \( 5 \)C and \( 5 \)D). 질량 분석에 의해 얻어진 균주별 모든 펩티드들은 Table \( 1 \) 에 나타냈으며, Pt\( \beta \) 와 Pt \( \gamma \) 소그룹 균주는 Pt\( \alpha \) 소그룹 균주와 펩티드 종류가 뚜렷이 다름을 확인할 수 있었다.</p>
각 균주의 분획에 존재하는 펩티드의 분자량은 무엇으로 분석했어?
MALDI-TOF mass spectrometry