<h2>SDS-polyacrylamide gel 전기영동</h2><p>\(\mathrm{LDH}~ \mathrm{A} 4 \) 동위효소의 정제 정도를 확인하고 분자량을 측정하기 위해 Laemmli의 방법에 따라 SDS-PAGE를 실시하였다. \( 10 \% \mathrm{~T}\), \(2.67 \% \mathrm{C} \) acrylamide separation gel과 \( 5 \% \mathrm{~T} \), \( 2.67 \% \mathrm{C} \) acrylamide stacking gel로 slab gel을 만들었다. 분자량 측정시 표준단백질로는 bovine albumin (MW 66,000), ovalbumin (MW 45,000), glyceraldehyde-3-phosphate de- hydrogenase (MW 36,000), carbonic anhydrase (MW 29,000) 및 trypsinogen (MW 24,000)을 사용하였고, 단백질은 co-massie brilliant blue R-250으로 염색하였다.</p><h2>Lactate dehydrogenase 동위효소의 정제: affinity chromatography</h2><p>LDH는 affinity chromatography (Bio-Rad Econo System)에 의해 정제되었고, oxamate gel의 준비는 O'Carra 의 방법을 변형하여 실시하였다. 풀망둑 골격근 조직액과 심장, 눈 및 뇌 조직을 합한 조직액에 각각 \( 0.5 \mathrm{M} \mathrm{KCl} \) 과 \( 0.2 \mathrm{mM} \)NADH 를 첨가한 시료를 \( 0.2 \mathrm{mM}\) NADH 를 함유한 \( 0.05 \mathrm{M}\) potassium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 6.85 \), 이하 buffer로 칭함)로 평형시킨 oxamate column (\( 25 \times 85 \mathrm{~mm} \))에 각각 가하였다. 단백질이 column으로부터 용출되지 않을 때까지 \( 0.2 \mathrm{mM}\) NADH 를 함유한 buffer로 씻어 준 후, \( 1.6 \mathrm{mM}\) NAD를 함유한 buffer와 buffer를 차례로 유입시키면서 용출액을 \( 1.6 \mathrm{ml} \) 씩 분획하였고, 각 분획은 LDH 동위효소의 활성을 측정하고, 단백질을 정량하여 정제 그래프를 그렸다. LDH 동위효소의 활성이 있는 분흭은 native polyacrylamide gel 전기영동을 실시하였고, 동위효소가 확인된 분획들만 모아 Amicon (PM-10)을 사용하여 농축한 후 SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 확인하고 정제 용액으로 사용하였다.</p><h2>Lactate dehydrogenase의 기질의존성 측정</h2><p>LDH 활성이 기질농도에 의해 저해되는 정도를 알아보기 위해 골격근, 심장, 눈 및 간 조직의 LDH와 정제한 \(\mathrm{LDH}~ \mathrm{A} 4 \) 및 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 의 피루브산에 대한 역학적 특성을 확인하였다. 피루브산 농도 0.1,0.3,0.5,1,1.5,2,5,7.5 및 \( 10 \mathrm{mM} \)에서 LDH 활성을 측정하였고, 최대 활성을 기준으로 상대 활성(%)을 계산하여 피루브산 농도에 따라 LDH가 저해되는 정도를 확인하였다. 또한 피루브산 10,20,30,40,50,60,100 , 300 및 \( 500 \mu \mathrm{M} \) 에서 LDH 활성을 측정한 후 Lineweaver-Burk plot에 의해 \( \mathrm{Km} \) 과 \( \mathrm{Vmax} \) 을 구하였다.</p><h2>Lactate dehydrogenase의 열에 대한 안정성 및 최적 \( \mathrm{pH} \)</h2><p>골격근, 심장 및 눈 조직액을 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5,10,15,20,25,30,40,50, 및 60 분 동안 열처리하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 방치시킨 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(20,000 \times g \) 에서 1시간 동안 원심분리 하여 상등액의 효소 활성을 측정한 후 대조군에 대한 상대 활성(%)을 구하였다. 골격근, 심장, 눈 조직을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate buffer (\( \mathrm{pH} 4.0,4.5,5.0\)), \(0.1 \mathrm{M} \) sodium citrate buffer (\( \mathrm{pH} 5.5\)), \(0.1\mathrm{M}\) potassium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 6.0,6.5,7.0\)), \(0.1 \mathrm{M}\) Tris- HCl buffer ( \( \mathrm{pH} 7.5,8.0,8.5\)), \(0.1 \mathrm{M} \) Tris-glycine buf-fer ( \( \mathrm{pH} 9.0\)) 및 \(0.1 \mathrm{M} \) sodium carbonate buffer \( \mathrm{pH} 9.5, 10.0, 10.5\) 에서 반응시킨 후 LDH 활성을 측정하였고 최대 활성을 기준으로 상대 활성(\(\%\))을 구하였으며, 최적 \( \mathrm{pH} \) 를 확인하였다.</p>
분자량 측정시 몰질량이가장 큰 표준단백질은 뭐야?
bovine albumin