<h1>재료 및 방법</h1><h2>유전자 클로닝</h2><p>고추에서 스트레스에 반응하는 sesquiterpene cyclase pro-moter를 답배에서 발현시키기 위하여 먼저 plant expression vector인 pIG121-Hm vector에 각 promoter부위와 C4H gene을 클로닝하였다. CaMV 35S promoter부위는 HindIII, Bam HI 으로 잘라내고 sesquiterpene cyclase promoter 3, 4, 6, cyc600을 클로닝하였으며, GUS coding 부위는 BamHI, SacI으로 잘라내고 C4H coding region을 클로닝하였다.</p><h2>담배 형질전환</h2><p>고추에서 얻은 sesquiterpene cyclase promoter-C4H 유전자를 heterologous organism인 담배에서 발현시켰다. 담배종자(Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi)를 50개 정도를 선택하여 멸균된 E-tube에 넣고 \( 2 \% \) \(\mathrm{NaOCl}\)(\(1 \mathrm{ml} \)) 을 첨가한 후 10분간 흔들면서 살균하였다. Clean bench에서 \( \mathrm{NaOCl} \) 을 버리고 멸균수로. 5화 이상 씻어서 \( \mathrm{NaOCl} \) 을 완전히 제거한 다음 이를 MS배지에 파종하였다. 파종 후 2~4주정도 키운 다음 식물이 양호한 어린 잎을 골라 시료로 사용하였다.</p><p>시료로 선택한 잎은 \( 1 \mathrm{~cm}^{2} \) 로 잘라 상처를 낸 후 binary vector pIG121-Hm으로 형질전환된 disarmed-agrobacterium EHA101 배양액에 넣고 10분간 흔들어주며 공조배양 하였다. 이를 callus induction media (\( 4.4 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) salt, \( 30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) sucrose, \( 2.0 \mathrm{mg} / \mathrm{L} ~\mathrm{BA}\), \(0.2 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) IAA) 위에서 이틀간 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \), 암 상태로 키웠다. Agrobacterium의 over-growth를 막기 위해 멸균수로 5회 이상 세척한 후 멸균된 여과지위에서 담배 잎을 말리고 물기가 완전히 제거된 담배 잎을 shoot induction media (\( 4.4 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) MS salt, \( 30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) sucrose, \( 2.0 \mathrm{mg} / \mathrm{L} ~\mathrm{BA}\), \(0.2 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) IAA, \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) Hygromycin, \( 300 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) Carbenicillin) 에 치상한 후, 3~5 주 동안 \( 28^{\circ} \mathrm{C}\), 24시간 연속 광(\(8,000 \mathrm{Lux}\))상태의 생장실 조건에서 배양하였다.</p><p>잎, 줄기가 형성된 완전한 식물체는 root induction media (\( 4.4 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) MS salt, \( 30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) sucrose, \( 300 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) Kanamycin, \( 10\mathrm{mg} / \mathrm{L} \) Hygromycin, \( 300 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) Carbenicillin)에 옮겼다. 그리고 완전히 뿌리가 형성되면 배양토(peatmoss:vermiculite= 1:1)로 옮겨 2일간 순화시킨 다음 생육시켰다.</p><h2>GUS histochemical assay</h2><p>GUS 분석을 위하여 자른 식물 조직을 staning mix ( \(50 \mathrm{mM} \) Sodium phosphate (\( \mathrm{pH} 7.0\)), \( 2 \mathrm{mM} \) X-glucuronide, \( 1 \% \) Triton X-100)에 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 overnight (12hr이상)처리하였다. 처리한 조직을 fixation mix (5\% absolute ethanol, \( 5 \% \) acetic acid, \( 10 \% \) formaldehyde)에 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), 2시간동안 처리하였다. Chlorophyllo을 완전히 제거하기 위하여 \( 70 \% \) ab-solute ethanol로 3회 이상 세척하였다. 세척된 조직을 배지위에 올려 실체 현미경으로 관찰하였다 (X64).</p><h2>PCR 반응 조건 및 PCR 산물의 cloning</h2><p>PCR 반응은 \(1 ~\mathrm{ul} ~ \mathrm{Taq} ( 5 \mathrm{U} / \mathrm{ul})\), \(1 ~\mathrm{ul}~ \mathrm{dNTP} (2.5 \mathrm{mM})\), \(5~ \mathrm{ul} ~ \mathrm{10X} ~\text{PCR buffer}\), \(1~ \mathrm{ul}~ \mathrm{primer} (0.05 \mathrm{uM})\), \(1~ \mathrm{ul}~ \text{template DNA} (\mathrm{ng}/\mathrm{ul})\), \( 41 \mathrm{ul} \) 초순수 물로 전체 volume이 \(50 \mathrm{ul}\)가 되도록 처리하였다. PCR 반응은 MJ research사의 minicycler를 사용하여, \( 94^{\circ} \mathrm{C} 3 \) 분간 pre-denaturation시킨 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} 1 \) 분간 denaturation, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분 20초간 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분간 polymerization으로 35 cycle 반응시킨 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7분간 post-elongation 시켜 PCR 산물을 얻었다.</p>
heterologous organism인 담배에서 발현시킨 고추에서 얻은 유전자는 무엇이니?
sesquiterpene cyclase promoter-C4H