<h1>재료 및 방법</h1><h2>균주분리 및 동정</h2><p>1999년 3월부터 7월까지 부산대학교 병원에서 세균검사를 위해 의뢰된 포도상구균 213 검체에서 분리배양한 MRSA 79주를 대상으로 실험하였다.</p><h2>사용배지 및 약재</h2><h3>사용 배지</h3><p>균의 분리 및 증균용 배지로는 영양액체배지를 사용하였으며 항생제 검사에는 Mueller Hinton broth와 Mueller Hinton agar(Difco Lab., Detroit, MI., USA)를 사용하였다.</p><h3>항생 물질</h3><p>항생제 감수성 실험을 위한 paper disc법을 위한 항생제로 aminoglycoside계 3종, 즉 kanamycin (KM), gentamicin(GM), streptomycin(SM)과 \(\beta\)-lactam계로서 penicillin(Pc)과 cephalosporin계 2종, 즉 cefoperazone(Cpz), cephalothin(Cpt)과 nitrobenzene계인 hloramphenicol(CM), macrolide계인 erythromycin(E) 및 그외 기타 항생제로서 tetracycline (TC), clindamycin(CC), oxacillin(OX), vancomycin(VA) 등 도합 12종류를 사용하였으며, 이 항생제 disc는 BBL 회사 (Becton Dickinson Microbiology Systems Cockeysville, MD., USA)제품을 사용하였다.</p><h2>항생제 감수성 검사</h2><p>항생제 감수성 검사는 paper disc법을 이용하였다. Mueller Hinton broth에서 24시간 배양한 균액을 표준 백금이를 이용하여 일정량을 Mueller Hinton agar 표면에 균동하게 도말한 후, 화염 멸균된 감자를 이용하여 paper disc들을 Mueller Hinton agar 표면에 기포가 생기지 않도록 밀착시켰다. 배양시에 항생제가 평판 배지에 효과적으로 확산시키기 위해 실온에서 약 \(2\sim 3\)시간 방치한 후에 \(37^{\circ}\mathrm{C}\)에서 24시간 배양하여 paper disc 주변의 균 발육저지대를 측정하였다(Table 1).</p><h2>Coagulase 검사</h2><p>시험관 법을 이용하여 멸균된 시험관에 사람 혈장 \(1.5\mathrm{m\ell}\)를 분주한 다음, 18시간 배양한 균액을 2-3 방울 가하여 혼합한 후, \(37^{\circ}\mathrm{C}\) 항온 수조에서 24-48 시간 반응시킨 후 응고여부를 관찰하였다.</p><h2>Template DNA의 준비</h2><p>Tryptic soy broth(TSB)로 \(37^{\circ}\mathrm{C}\)에서 24시간 배양한 다음, 배양액 \(1\mathrm{m \ell}\)을 취하여 원심분리하고, Tris EDTA 완충액(TEbuffer; \(10\mathrm{mM}\) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \(1\mathrm{mM}\) EDTA, \(\mathrm{pH} 8.0\))으로 재부유시켜 세척하였다. 다시 원심분리하고 TE완충액으로 재부유시킨 다음, lysozyme을 최종농도 \(100\mu\ell/m\ell\) 되게 첨가하여, \(37^{\circ}\mathrm{C}\)에서 30분 동안 반응시켰다. \(1\%\) SDS와 \(20\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\)의 proteinase K를 첨가하여 \(37^{\circ}\mathrm{C}\)에서 2 시간 반응시켰다. 위의 lysate를 phenol : chloroform : isoamylalcohol \((25: 24 :1)\)로 2회 추출하고 마지막 1회는 chloroform : isoamy-alcohol \((24:1)\)로 처리하여 DNA가 녹아있는 수용액층을 단백질 성분과 분리하였다. 위의 수용핵층에 \(3\mathrm{M}\)의 sodium acetate 0.1 volume와 absolute ethanol (3 volume)을 첨가하여 \(-20^{\circ}\mathrm{C}\)에서 DNA를 침전시켰다. 원심분리하여 생긴 침전물을 \(70\%\) ethanol로 세척하고 공기 중에서 건조시켜서 증류수에 용해시킨 다음, UV spectrophotometer (UV-1201, Shimadzu Co., Japan)로 \(260\mathrm{~nm}\)에서 흡광도를 측정하여 각각 DNA농도를 정랑하였다.</p><h2>Oligonucleotide의 준비</h2><p>유전자 증폭을 위한 PCR에 사용한 primer는 Expedite Nucleic Acid System으로 합성하였다. mecA의 sense primer로는 5' AAAATCGAGGTAAAGGTTGGC 3', antisense primer는 5' AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC 3'으로 target으로 하는 DNA의 크기는 533bp이었다. mecR1의 sense primer로는 5' AAGCACCGTTACTATCTGCACA 3', anti-sense primer는 5' GAGTAAATTTTGGTCGAATGCC 3'으로 target으로 하는 DNA의 크기는 235bp이었다. mecI의 sense primer로는 5' CTGCAGAATGGGAAGTTATG 3', antisense primer는 5' ACAAGTGAATTGAAACCGCC 3'으로 target으로 하는 DNA의 크기는 268bp이었다. femA의 sense primer는 5' CATGATGGCGAGATTACAGG 3', antisense primer는 5' CGCTAAAGGTACTAACACACGG 3'으로 target으로 하는 DNA의 크기는 372bp이었다. 이들 primer는 (주)바이오니아 (Bioneer, Taejeon, Korea)에서 주문하여 사용하였으며, purification은 Sep-Pak Catridge (Waters Co., USA)로 하였다.</p><h2>PCR condition</h2><p>mecA, mecR1, mecI 및 femA 유전자의 amplification은 \(45\mu\ell\)의 PCR master mixture-\(2.5 \mathrm{unit}\) Taq polymerase : \(10\times \) PCR buffer \((0.1\mathrm{M}\) Tris-\(\mathrm{HCl}\) \((\mathrm{pH}8.0\)), \(0.5\mathrm{M}\mathrm{KCl}\), \(0.015\mathrm{M} \mathrm{MgCl}_{2}\)), \(200\mathrm{\mu l}\) dNTP's, \(0 25\mu\mathrm{M}\)의 각 primer (Takara Shuzo Kyoto. Japan)에 \(5\mu\ell\)의 DNA template를 넣고 반응 중 수분이 증발되지 않도록 하기 위해서 \(50\mu\ell\) mineral oil로 중층하여 Delta Cycler I TM system, Easy Cycler series (Ericomp, Inc., San Diego, USA)를 사용하여 denaturation은 \(94^{\circ}\mathrm{C}\)에서 30초, annealing은 \(55^{\circ}\mathrm{C}\)에서 30초, extension은 \(72^{\circ}\mathrm{C}\)에서 1분의 cycling parameter로 automated program을 이용하여 40 cycles의 PCR을 실시하고 final extension은 \(72^{\circ}\mathrm{C}\)에서 5분간 실시하였다.</p><h2>다제내성 항생제 종류와 내성 관련 유전자관의 분포 상관 관계</h2><p>다제내성 항생제 종류와 내성관련 유전자간의 분포 자료를 전산 입력하여 SPSS for windows 9.0으로 통계 처리하였다.</p>
MRSA 79주를 분리배양한 검체는 뭐야?
포도상구균 213