<h1>재료 및 방법</h1><h2>정유 추출</h2><p>본 식물체는 수증기증류 추출법(steam distillation extraction)을 사용하였으며, 먼저 산해박 뿌리를 증류수로 세척한 후, 음건하여 분쇄기를 이용하여 마쇄하였다. \( 3,000 \mathrm{~mL} \) 의 둥근 플라스크에 마쇄한 산해박 뿌리 \( 200 \mathrm{~g} \) 과 증류수 \( 2,000 \mathrm{~mL} \) 을 혼합하여 교반한 후에 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 열을 가하였다. 다른 한쪽에는 둥근바닥플라스크에 hexane \( 300 \mathrm{~mL} \)를 넣고 냉동 순환수조(VTRC-640, JEIO TECH, Seoul, Korea) 를 이용하여 정유 성분이 포함된 기체를 hexane이 담긴 플라스크에 포집 될 수 있도록 5시간동안 연속 추출하였다. 추출 후 hexane층만 분획여두로 분리하여 hexane층에 남은 소량의 수분을 무수황산마그네숩 (\( \mathrm{MgSO}_{4} \))을 이용하여 제거하였다. 이를 회전식 감압농축기(rotary vacuum evaporator, Model: N-3NM, EYELA, Tokyo, Japan)로 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 감압농축 후에 순수한 정유성분을 얻었으며 실험을 위해 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 냉장 보관하였다.</p><h2>시험약제</h2><p>Acetophenone, 2',4'-dihydroxyacetophenone, 2', 5'-dihydroxyaceto- phenone, 2',4'-dimethoxyacetophenone, 2', 2'-dimethoxyacetophenone, 2'-hydroxyacetophenone, 4'-hydroxyacetophenone, 2'-hydroxy- 4'-methoxyacetophenone, 2'-hydroxy-5'-methoxyacetophenone, 4'-hydroxy-3'-methoxyacetophenone, \( \quad \) 2'-methoxyacetophenone, 4'-methoxyacetophenone, myristic acid 및 palmitic acid를 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)사 및 Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.</p><h2>사용균주</h2><p>산해박 뿌리의 수증기 증류 추출법을 통해 얻어진 정유 및 그 구성성분의 생육억제 활성을 평가하기 위해 3종 장내 유익균으로 Bifidobacterium bifidum KACC 20601, Bifidobacterium longum KCCM 11953 및 Lactobacillus casei KACC 12413을 선발하였고, 2종 장내 유해균으로는 Clostridium pefringens KCCM 12098 및 Escherichia coli KCCM 12199을 선발하여 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms,KCCM ) 및 농촌진홍청 국립농업과학원(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 분양 받아 사용하였다. 장내 미 생물에 알맞은 생육조건 배지인 BHI 및 MRS broth를 사용하여 혐기성 배양기(HIRAYMA, Tokyo, Japan)로 \( 80 \% \mathrm{~N}_{2}+15 \% \) \( \mathrm{CO}_{2}+5 \% \mathrm{H}_{2} \) 의 조건에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), 48 시간 배양하여 실험에 사용하였다.</p><h2>항균활성 검정</h2><p>산해박 정유성분의 장내미생물에 대한 항균활성 검정은 Lim 등의 생물검정법에 따라 디스크확산법(disc diffusion method)으로 검정하였다. BHI 및 MRS broth에 2일간 혐기 배양한 각각의 장내 미생물 배양액을 멸균된 EG aga plate에 \( 100 \mu \mathrm{L} \)를 도말하였다. 그 후, 산해박 정유 추출물 및 시험약제를 \( 20-10 \mathrm{mg} \) 식 취해 메탄올 \( 200 \mu \mathrm{L} \)에 용해한 후, paper disc에 분주하였다. Paper disc를 각각의 균이 도말된 EG agar 배지 표면에 올려놓고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간 협기 배양한 후, 생육저지환(inhibition zone)의 크기를 측정하여 항균활성을 평가하였다.</p><h2>최소저해농도(minimum inhibitory concentration; MIC)</h2><p>장내 미생물 균주에 대한 최소저해농도는 Mann과 Markham의 방법에 따라 broth-dilution method를 응용하여 수행되었다. 멸균된 액체배지에 균 희석액 \( 1 \mathrm{~mL} \) 과 시료 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \)를 초기농도로 순차적으로 희석하여 첨가한 후 4시간 마다 UV-spectrophotometer를 이용하여 흡광도 (\( 600 \mathrm{~nm} \)) 를 측정하면서 48시간동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 혐기 배양하였다. 상기 실험을 통하여 생육저해 농도곡선 상에서 균의 생장이 검출되지 않은 최소농도를 MIC로 설정하였다.</p><h2>진드기 채집</h2><p>본 연구에서 사용한 작은소피참진드기는 2018년 5월부터 10월까지 전라북도 완주군에 위치한 상관 저수지 및 전라북도 전주시 전주천 인근 풀숲에서 채집하였다. 진드기 채집방법으로는 천(\(\text{가로} 150 \mathrm{~cm} \times \mathrm{세로} 100 \mathrm{~cm} \)) 으로 조사지역의 수풀을 쓸어내리는 flag method를 사용하여 채집하였다. 채집한 진드기는 실체 현미경을 통해 Yamaguti 등에서 제시한 방법에 따라 분류 동정하여 실험에 사용하였다.</p>
BHI 및 MRS broth에 장내 미생물을 몇일동안 혐기 배양을 했을까요?
2일