<h2>Dps 단백질의 과발현, 정제 및 Dps 특이적인 다클론성 항체의 생산</h2><p>Dps 단백질의 Salmonella내에서의 역할 규명 및 유전자 발현 조절에 대한 이후의 연구를 위하여 Dps 특이적인 다클론성 항체를 생산하기로 하였다. 항체를 생산하기 위해서 항원인 Dps 단백질을 대량 생산하였으며, 정제한 Dps 단백질을 토끼에 주사하였다. 토끼로부터 얻은 혈액으로부터 혈청을 분리하고 immunoblotting을 통해 Dps 단백질에 대한 다클론성 항체가 생성되었는지를 확인하였다. 항체 생산을 위한 항원인 6개의 histidine (\( \mathrm{His}_{6} \)) 잔기들로 표지되어진 Dps 단백질을 대량 생산하기 위해서 대장균을 활용한 인위적인 단백질 과발현 체계를 이용하였다. 단백질 발현을 위한 완전한 dps 유전자를 가지는 dps 과발현 플라스미드 pBP131을 구축하였다 (Fig. 3A). pBP131을 가지는 E. coli BL21 (DE3)을 \( 1 \mathrm{~mM} \)의 IPTG가 들어있는 배양 조건에서 배양하였을 경우 전체 단백질의 \( 5\% \)보다 많은 양을 차지하는 \( \mathrm{His}_{6} \mathrm{x} \)-Dps 단백질이 발현되는 것을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다 (Fig. 3B). 다양한 생화학적인 과정을 통해서 과량 생성된 \( \mathrm{His}_{6} \mathrm{x} \)-Dps 단백질이 세포질 부분에 일부 존재하고, 대부분의 Dps 단백질은 불용성의 inclusion body를 형성하고 이들이 쉽게 가라앉는 것을 볼 수 있었다 (data not shown). \(8 \mathrm{M}\) urea를 통해 불용성의 Dps를 가용화하였으며, \( \mathrm{His}_{6} \)-Dps 단백질은 \( \mathrm{Ni}^{2+} \)-sepharose를 이용한 친화성 정제 크로마토그래피를 통해 정제하였다. SDS-PAGE를 통해 확인한 결과 정제한 시료에는 Dps 단백질 이외에 소량의 다른 단백질이 포함되어 있었으므로 이들을 제거한 Dps 단백질을 확보하기 위해 Dps 단백질이 포함된 polyacrylamide gel 부분을 잘라내어 electroelution법으로 Dps 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질 용액에 포함된 SDS를 제거하기 위해 4 회의 투석을 진행하였다. 정제한 단백질의 순도는 SDS-polyacrylamide gel 상의 단일 단백질 밴드로 확인할 수 있었으며, bovine serum albumin (BSA, Sigma)를 표준 단백질로 하여 정량한 단백질의 농도는 \( 2 \mathrm{\mu g} / \mathrm{\mu l} \) 였다 (Fig. 3B).</p><p>Dps 특이적인 다클론성 항체의 생산에는 New Zealand White (NZW) 토끼를 이용하였다. 1차 항원 주입을 하기 전에 토끼로부터 혈액을 얻었으며 이것은 이후 음성 대조구로 사용하였다 (data not shown). 약 \( 500 \mathrm{~\mu g} \)에 해당하는 정제 Dps 단백질을 동량 \((v:v)\)의 complete Freund’s adjuvant(Sigma)와 잘 혼합하고 여과하여 1차 면역의 항원으로 사용하였다. 준비한 항원은 NZW 토끼 몸의 각기 다른 부위에 3 ~ 4회로 나누어 피하 주사하였다. 1차 면역 후 3주가 지난 후에 토끼 귀의 정맥으로부터 혈액을 얻었으며, 동시에 1차 면역 때와 같은 양의 항원을 incomplete Freund’s adjuvant(Sigma)와 혼합하여 같은 방법으로 피하 주사하였다. 토끼로 부터 얻은 혈액을 \( 2000 \mathrm{~rpm} \)에서 5 분 동안 원심분리하여 혈구 성분을 제거하고, Dps 특이적인 항체가 포함되어 있는 상등액인 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청은 항체 생성을 확인하기 위한 immunoblotting의 1차 항체로 사용되었다. Immunoblotting 결과, 한 번의 Dps 단백질 주입만으로도 매우 많은 양의 항체가 생성되었음을 확인하였으며, 이는 Dps 단백질이 매우 높은 항원성을 가지고 있다는 것을 의미한다(data not shown). 충분한 양의 항체가 생성되었음을 확인한 후, 토끼를 해부하여 다량의 혈액을 확보하였다. Dps 특이적인 항체의 대략적인 농도를 알기 위해서 각각 다른 비율로 희석한 1차 항체 (토끼로부터 얻은 최종 혈액으로부터 분리한 혈청)를 같은 양의 Dps 단백질에 같은 조건으로 처리하여 immunoblotting을 수행한 결과, 혈청을 \(1:1000\) \((v:v)\)으로 희석한 경우에도 검출이 가능한 면역 활성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 4).</p>
Dps 단백질을 통해 다클론성 항체를 얻으려는 이유가 뭐야?
Salmonella내에서의 역할 규명 및 유전자 발현 조절에 대한 이후의 연구를 위하여