<h1>재료 및 방법</h1><h2>Plasmid 조합구성</h2><p>생쥐의 간 cDNA Library로부터 Polymerase 연속반응에 의해서 생쥐 CAR1과 CAR2 CDNA를 분리한 다음 염기서열 분석에 의해 CAR1과 CAR2단백질의 codon 염기서열임을 확인하였다. 포유동물 세포 내에서의 CAR의 발현을 위해서, pGEX2TK-mCAR1으로부터 BamH1과 EcoR1으로 분리된 CAR1 CDNA를 동일한 제한 효소들로 자른 pCDNA3(Invitrogen)에 결합시켜 pCDNA3-CAR1을 합성하였다. CAR-GFP의 발현을 위한 expression vector, pECARC1-GFP는 pCDNA3-CAR로부터 분리된 BamH1/EcoR1 제한 효소 조각을 pEGFP-C1 (BD Biosciences CLONTECH) vector의 BglII/EcoR1 site에 융합하여 합성하였다. 포유동물에서 발현할 수 있는 RXR (Retinoic Acid Receptor) plas-mid인 pCMX-RXR는 B. Kemper로부터 제공받았고, 보고 유전자 plasmid인 PBRU2C1-Luc와 2C1-Luc는 이전에보고된 방법을 이용하였다.</p><h2>박테리아 내에서의 CAR와 RXR 의 발현과 정제</h2><p>박태리아 세포 내에서 N-terminus에 His-tag이 융합된 CAR의 다량의 발현과 분리를 위해서 CAR2 CDNA를 BamH1과 EcoR1으로 자른 다음 pET28a+ vector (Novagen Corp)에 주입한 후 pETCAR2를 합성하였다. 박테리아 내에서 FLAG-tagged RXR을 발현하기 위하여 pf:RXR vector 를 사용하였다. 박테리아 내 단백질의 발현을 위하여, 1/20 volume의 overnight Escherichia coli BL21(DE3)pLysS 배양액을 \( 1 \mathrm{~L} \)의 LB broth에 접종시켜 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 약 1 시간 ( \( \mathrm{A}_{600}= \) \( 0.6 \) ) 동안 배양한 후 \( 1 \mathrm{mM} \) isopropyl- \( \beta \)-D-thioglucopyranoside (IPTG)에 의해 발현을 유도시키고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4시간 동안 배양하였다. 증식된 Bacteria를 원심분리에 의해 침전시킨 다음 CAR pellet에 대해서는 \( 20 \mathrm{ml} \) 의 Ni-NTA equilibrium buffer \((20\mathrm{mM}\) Tris-HCl, pH. 8.0; \( 500 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NaCl} ; 10 \mathrm{mM} \) Imidazole; \( 0.2 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride; \( 1 \mathrm{mM} \) DTT; \( 2 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) leupeptin, pepstatin, aprotinin; \( 10 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) benzamidine)에 다시 부유한 후 French Press에 의한 높은 압력으로 용해하였다. Inclusion body에 함유된 CAR 단백질을 \( 15,000 \times \mathrm{g} \)에서 15분 동안 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 원심분리에 의해 Collection한 다음 생성된 pellet을 \( 8 \mathrm{M} \) Urea에서 2번 wash하고 \( 6 \mathrm{M} \) guanidine- \( \mathrm{HCl} \) 와 \( 1 \% \) Nonidet \( \mathrm{P}-40 \)가 함유된 \( \mathrm{Ni} \)-NTA equilibrium buffer에서 다시 wash하였다. 남은 pellet은 \( 6 \mathrm{M} \) guanidine- \( \mathrm{HCl} \)와 \( 15 \mathrm{mM} \) beta-mercaptoe-thanol이 함유된 \( \mathrm{Ni}-\mathrm{NTA} \) equilibrium buffer에서 녹인 (solubilization) 후 Ni-NTA column에서 친화성 크로마토 그래피에 의해 CAR 단백질을 순수 정제분리 하였다. RXR pellet에 대해서는, \( 20 \mathrm{ml} \)의 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer pH7.9, \( 500 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{ NaCl}, 20 \% \) Glycerol, \( 0.2 \mathrm{mM} \) EDTA, \(0.1\%\) Nonidet P-40, \( 4 \mathrm{mM} \) DTT, protease inhibitors)에 부유시킨 다음 초음파 법에 의해 세포를 파괴시키고 22,000 \(\times\mathrm{g} \)에서 20분 동안 원심분리 하였다. RXR이 함유된 상등액을 M2 agarose (Sigma Chemical Co. U.S.A.) 친화성 resin과 섞은 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10시간 동안 incubation 하였다. \( 20 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer (pH. 7.9, \( 300 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}, 20 \% \) Glycerol, \( 0.2 \mathrm{mM} \) EDTA, protease inhibitors)에서 원심분리와 re-suspension으로 5번 wash 한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 0.3 \mathrm{ml} \)의 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \) elution buffer (pH.7.9; \( 100 \mathrm{mM} \cdot \mathrm{NaCl}, 20 \% \) Glycerol, \( 0.2 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.5 \mathrm{ug}/\mathrm{ml} \) FLAG-peptide)로 정제 분리하였다.</p>
생쥐의 간 cDNA Library을 CAR1과 CAR2 CDNA로 분리한 후 염기서열 분석에 의해 CAR1과 어떤 단백질의 codon 염기서열임을 확인하였니?
CAR2