<h1>결과 및 고찰</h1><h2>한국산 반하 칼럼분획물 제조</h2><p>국내산 반하의 타겟 유효성분 화합물을 분리하고 구조동정하기 위해 MPLC 기기에 YMC-Pack ODS-AQ-HG (10 mm, YMC)칼럼관과 UV 검출기 \( (230,280 \mathrm{~nm}) \) 장착한 후, 추출물 \( 4.0 \mathrm{~g} \) 을 로딩하여 증류수와 \( \mathrm{MeOH} \) 의 혼합 용매를 이동상으로 하여 \( \mathrm{MeOH} \) 농도를 점차적으로 증가시키면서 \( (50 \rightarrow 100 \%\), \(120 \mathrm{~min}) \)UPLC-PDA와 연계한 활성유도 분획법(bioactivity-guided fractionation)을 병행하며 역상 칼럼 크로마토그래피를 실시하였다. 그 결과, 총 17개의 분획물(KPT Fr.1-Fr.17)을 얻었다(Fig.1A).</p><h2>한국산 반하 칼럼분획물의 세포독성 및 melanin 저해활성 측정</h2><p>한국산 반하에서 분리된 칼럼분획물과 생리활성 사이의 유의적인 활성관계를 추적하기 위해 17개의 분획물들의 melanin 저해효과를 확인하고자 하였다. 생리활성 평가에 앞서 활성과 세포독성 사이의 상관관계를 MTT assay로 측정하였다. MTT assay는 대사가 왕성한 살아있는 세포 내에 존재하는 mitochondria의 탈 수소 효소작용에 의하여 수용성의 노란색인 MTT tetrazolium을 환원시켜 생성되는 자주색의 비수용성 formazan을 UV로 측정하는 방법으로 수행하였다. 반하 칼럼분획물들의 세포독성 결과, KPT Fr. 7, 10, 14, 17 분획물들을 제외한 칼럼분획물들이 \( 50.0 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다(Fig. 1B). 세포독성이 없으며 melanin 저해활성이 뛰어난 한국산 반하의 타겟 유효성분 화합물을 추적하기 위해 melanin 저해활성 역시 관찰하였다. B16F10 cell을 \( \alpha\)- MSH (\(200 \mathrm{nm}) \)로 활성화 시킨 후 칼럼분획물을 \( 50.0 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농도로 처리하여 48시간 후 생성되는 melanin의 함랑을 측정하였다. 17개의 칼럼분획물들 중 세포독성이 없으며 melanin 함량을 유의성 있게 저해하는 분획물은 retention time 4.45 분에 확인된 peak가 많이 함유된 KPT Fr. 9로 확인되었다(Fig. 1C).</p><h2>타겟 판별 화합물 분리 및 구조분석</h2><p>칼럼 유효분획물 중 타겟 유효성분 화합물의 양이 가장 많이 함유된 분획물 KPT Fr. 9를 농축하여 PLC 로 \( \mathrm{C}_{18} \) column (YMC-ODS-AQ)에 로딩 후, 증류수와 ACN의 혼합 용매를 이동상으로 하여 ACN농도를 점차적으로 증가시키면서 \( (60 \rightarrow 100 \) \( \%, 30 \mathrm{~min} \) ) 칼럼 크로마토그래피를 실시하였다. 1회 주입량을 \( 200 \mathrm{~mL} \) 로 하여 3회 반복 실험을 통해 1종의 활성 단일물질 \( 10.2 \mathrm{mg} \) 을 분리하였다. 분리된 타겟 판별 화합물을 \( \mathrm{MS} \) 를 이용하여 분석한 결과, retention time은 4.45분으로 확인되었으며, 해당 피크는 \( m / z=277.1813\) \(\left[\mathrm{M}-\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}+\mathrm{H}^{+}\right. \)(calcd for \( \mathrm{C}_{17} \mathrm{H}_{25} \mathrm{O}_{3} \), 277.1804, \(\lambda_{\max }\) (\(\mathrm{MeOH})\) 223,280 \(\mathrm{~nm} \) 를 가져 gingerol로 예상되었고, NMR을 이용하여 구조를 동정한 결과,[6]-gingerol임을 확인하였고(Fig. 2), 선행문헌의 \( { }^{1} \mathrm{H},{ }^{13} \mathrm{C}-\mathrm{NMR} \) 데이터와 비교하여 [6]-gingerol임을 확인하였다. 본 연구는 처음으로 반하로부터 [6]-gingerol을 분리하여 구조 동정하고 보고하는 것이다. 이를 통해 표준화된 반하 소재를 이용한 기능성 미백 소재로의 개발 가능성과 개발 제품의 유효성분 QC (quality control) 화합물로 [6]-gingerol의 활용 가능성을 확인하였다. 이전에 gingero에 대한 분석 연구는 생강에서 분리된 [6]-gingerol의 GC-MS를 이용한 구조 분석과 멜라닌 저해 활성이었다.</p>
무엇을 추적하기 위해 17개의 분획물들의 melanin 저해효과를 확인하고자 하였나요?
한국산 반하에서 분리된 칼럼분획물과 생리활성 사이의 유의적인 활성관계