<h1>재료 및 방법</h1><h2>균주 분리 및 배지</h2><p>대전 일원의 과수원, 채소밭, 논 등 농약으로 오염된 12 곳의 토양 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 각각 멸균 생리식염수 \( 100 \mathrm{ml} \)이 들어 있는 \( 250 \mathrm{ml} \) 삼각 플라스크에 넣고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 진탕한 후, 이 현탁액 \( 100 \mu l \) 를 \( 750 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 파라치온이 단일 탄소원으로 첨가된 Bushnell-Hass ( \( 2 \% \mathrm{MgSO}_{4}, 0.2 \% \mathrm{CaCl}_{2}, 10 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( \left.10 \%\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 10 \% \mathrm{KNO}_{3}, 0.5 \% \mathrm{FeCl}_{3}\right) \) 최소평 판배지에 접종하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2-3일 배양한 다음, 단일 콜로니를 분리 하였다. 분리된 세균은 \( 750 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 파라치온, \( 0.48 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( 0.12 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.1 \% \mathrm{NH}_{4} \mathrm{NO}_{3}, 0.02 \% \mathrm{MgSO}_{4}, 0.004 \% \mathrm{CaNO}_{4} \), \( 0.0001 \% \mathrm{FeSO}_{4} \) 의 성분으로 구성된 최소배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하며 파라치온 분자내에 내포된 p-nitrophenol이 유리되어 노란색의 집락이 형성되는 균을 1차 선별하였고, 1차 선별 균주중 최소배지에서의 성장능과 파라치온 hydrolase 능력이 가장 우수한 한 균주를 최종 선별하여 본 실험에 사용하였다.</p><h2>최종 선별 균주의 생리, 생화학적 특성 조사</h2><p>최종 선별된 균주는 Bergey's manual of systematic bacte-riology 및 Biochemical tests for identification of medical bacteria에 의거 형태, 생리 및 생화학적 특성을 조사하고, 당 이용능, 중금속, 항생제 내성 등의 균주 특성도 조사하였다.</p><h2>16S rRNA 엽기 서열 조사</h2>최종 선별 균주의 정확한 동정을 위해 최종 선별균주의 genomic DNA를 CTAB 방법으로 추출하고, 이 DNA를 주형으로 중합연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하여 16S rRNA 유전자 염기 서열을 조사하였다. 이때 선별 균주의 16S rRNA 를 증폭하기 위해 forward primer 5 -AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'(27F) 와 reverse primer 5 -GGT TAC CTT TGT TAC GAC TT-3'(1492R)를 사용하고(BIONEX), 염기서열은 ABI model 310 (version 3.0) 을 사용하여 분석하였다. 이렇게 분석된 rDNA 염기서열은 BLAST search (www.ncbi.nih.gov/BLA-ST/) 를 사용하여 비교, 분석하였다.</p><h2>파라치온 분해능 측정</h2><p>\( 150 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 파라치온이 포함된 Bushnell-Hass 최소배지에 최종선별된 균을 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 로 조정된 배양기에서 배양하면서 시간별로 일정량을 취하여 상온에서 \( 10,000 \times \mathrm{g} \) 로 5 분 간 원심분리한 후 상등액을 취하여 spectrophotometer에서 \( 350 \mathrm{~nm} \)에서 \( 450 \mathrm{~nm} \)까지 scanning하여 파라치온 분해를 측정하였으며, 이때 균을 접종하지 않은 것을 대조구로 사용하였다. 또, p-nitrophenol의 분해능도 같은 방법으로 측정하였다.</p><h2>효소 할성 측정</h2><p>파라치온은 파라치온 hydrolase에 의해 p-nitrophenol과 diethylthiophosphoric acid (DETP) 로 분해된다. 이 때 생성 되는 p-nitrophenol은 노란색을 나타내고, 이 색소는 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 검출된다. 파라치온 hydrolase 활성은 Walter의 방법으로 측정하였다. 파라치온 \( 10 \mathrm{mg} \) 을 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 methanol에 녹이고, \( 0.1 \% \) Triton X-100이 첨가된 \( 50 \mathrm{~mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 8.5) \) 완충액에 첨가하여 파라치온의 최종 농도를 \( 172 \mu \mathrm{M} \) 이 되도록 조정하여 기질용액으로 사용하였다. 효소의 활성은 시료 \( 0.2 \mathrm{ml} \) 에 위의 기질 용액 \( 2.8 \mathrm{ml} \) 을 참가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 반응시킨 후, 분광광도계를 이용하여 \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 이때 시료를 첨가하지 않은 용액을 대조구로 사용하였다. 효소활성은 파라치온을 1 분동안 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 p-nitrophenl (pNP) 를 생산하는데 관여하는 효소의 양을 1 unit으로 환산 하였으며, \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 pNP ( \( \mathrm{pH} 8.5) \) 의 molar extinction coefficient는 \( 16500 \mathrm{M}^{-1} \mathrm{~cm}^{-1} \) 이다.</p><h2>선별 균주의 생장 조건</h2><p>분리균주의 배양 특성을 조사하기 위하여 온도와 \( \mathrm{pH} \)에 따른 파라치온의 분해능과 생장을 조사하였다.</p>
본 실험에 사용된 토양은 무엇에 오염되었는가?
농약