<h1>결과 및 고찰</h1><h2>식물체 분화에 미치는 glutamine의 영향</h2><p>식물체 분회에 미치는 glutamine의 영향을 알아보기 위하여, 금산과 완주 수집종 돌나물의 마디배양으로부터 부징아를 발달시킨 다음, 생장조절제를 첨가하지 않은 MS배지로 옮겨 30일간 상장시켜 어린 잎으로부터 캔러스를 얻었다 (Fig. 1A, B). 균일하게 자란 어린 잎 우래 캘러스를 선별하여 glutamine을 첨가한 재분화 배지에 옮긴 후 30일과 50일째에, 식물체 분화율과 캘러스당 식물체수를 조사한 결과, 금산 수집종은 식물체 분화가 빠르게 진행되어, 30일 경에 다수의 식물체를 관찰 할 수 있었다 (Fig. 1C). Glutamine 첨가농도에 따른 식물체 분화율은 \( 66 \sim 96 \% \)로 \( 350 \mathrm{~mg} / \mathrm{L} \) 첨가배지에서 가장 높았으며, \( 250 \mathrm{~mg} / \mathrm{L} \) 이상의 농도에서는 처리간에 유의한 차이를 보이지 않았다 (Table 1). 30일째에는 glutamine의 첨가량이 증가할수록 캘러스당 식물체수가 증가하는 경향을 보였으며, \( 350 \mathrm{~mg} / \mathrm{L} \)에서 캘러스당 식물체수가 11.4개로 가장 많아 대조구보다 유의한 증가를 보였다. 50일째에는 모든 캘러스에서 식물체가 분화되었으며, \( 250 \mathrm{~mg} / \mathrm{L} \) 이상의 glutamine 첨가배지에서 유의한 증가를 보였고, \( 350 \mathrm{~mg} / \mathrm{L} \)에서 캘러스당 식물체수가 17.6개로 가장 많았다. 반면 완주 수집종에서는 50일째까지도 식물체가 전혀 분화되지 않았으며, 대조구와 마찬가지로 glutamine 첨가에 관계없이 식물체 분화가 이루어지지 않았는데 (data not shown), 이는 유전자형의 차이로 생각되었다. 질소원으로서 glutamine은 약배양이나 체세포 배 발생에 많이 이용된다. 식물체 분화에 미치는 glutamine의 효과는 같은 식물종 내에서도 다른 반응을 보이는데, 보리 약배양에서는 glutamine의 첨가가 식물체 분화를 촉진하기도 하지만 (Olsen 1987), 품종에 따라 억제시키는 경우도 있다 (Jahne et al. 1994; Xu and Sunderland 1981). 왕원추리와 각시원추리의 약배양에서도 \(0.8-1.0 \mathrm{~mg/L}\) glutamine 첨가시 캘러스 형성율은 무첨가 배지보다 약 2배 증가하고, \( 4.0-5.8 \% \)의 식물체 분화를 보이지만, 무첨가 배지에서는 식물체 분화가 전혀 되지 않는 경우도 있다 (Ahn et al. 2002). 시호의 체세포 배양에서 glutamine은 체세포 배의 성숙을 촉진하며 (Lee et al. 1988), 제라늄의 자엽배양에서도 배발생을 촉진시킨다 (Murthy et al. 1996). 이와 같이 glutamine은 식물에 따라 배양효율을 크게 개선시킬 수 있는 질소원의 하나이다.</p><h2>식물체 분화에 미치는 \( \mathrm{AgNO}_{3} \)의 영향</h2><p>돌나물의 식물체 분화에 미치는 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 영향을 계대배양 50일째에 조사한 결과 (Table 2), 금산 수집종의 식물체 분화율은 공시한 캘러스에서 식물체가 \( 100 \% \) 분화되어 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 처리간에 차이가 없었다. \(10-30~ \mu \mathrm{M}~ \mathrm{AgNO} 3 \) 첨가배지에서 캘러스당 식물체수는 대조구보다 유의한 증가를 보였다. 금산 수집종의 캘러스당 식물체 분화수는 \( 15 ~\mu \mathrm{M} ~\mathrm{AgNO} 3 \) 첨가배지에서 16.1개로 가장 높았다. 그러나 완주 수집종은 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 첨가에도 불구하고 식물체 분화가 잘 되지 않았는데, \( 5-25 ~\mu \mathrm{M} ~\mathrm{AgNO}_{3} \) 첨가배지에서 소수의 식물체만이 분화되었다. 따라서 돌나물의 식물체 재분화는 유전자형 간에 차이가 있는 것으로 생각되었다. Larue와 Gamborg (1971)가 에틸렌이 기내 배양체의 생육에 영향을 끼친다는 것을 처음으로 보고한 이래, 식물의 기내배양에서 \( \mathrm{AgNO}_{3} \)와 같은 에틸렌 억제제를 배지에 첨가할 경우, 배형성이나 식물체 분화율이 증가하였다는 보고가 많다 (Chi and Pua 1989; Chraibi et al. 1991; Hyde and Phillips 1996; Lentini et al. 1988; Marton and Browse 1991). Beyer (1976)는 \( \mathrm{Ag}^{+} \) 이온이 식물체에서 발생되는 에틸렌의 활성억제에 가장 효과적이라고 하였으며, Yang (1985)은 \( \mathrm{Ag}^{+} \) 이온이 에틸렌 결합을 위한 수용능력을 감소시키는 작용을 하므로 에틸렌 발생을 억제시킨다고 하였다. Triticum aestivum 과 Nicotiana plumbaginifolia의 캘러스 배양에서 \( \mathrm{AgNO}_{3} \), norbornadiene, \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 등의 첨가는 shoot의 분화를 촉진시킨다 (Purnhauser et al. 1987). 애기장대에서도 \( \mathrm{AgNO}_{3} \)를 처리할 경우, 신초의 분화율이 10배 이상 증가된다 (Marton and Browse 1991). 또한 배추 (Chi and Pua 1989; Lentini et al. 1988), 해바라기 (Chraibi et al. 1991), 오이 (Hyde and Phillips 1996) 등 여러 식물에서 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 첨가가 기관분화를 증가시킨다는 보고가 있다. 그러나 커피와 완두의 캘러스 배양에서는 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 효과가 없는 것으로 보고되어 식물종에 따라 다르다는 것을 알 수 있다(Hatanaka et al. 1995; Taylor et al. 1994). 본 연구에서도 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 무첨가 배지보다 \( 10 \sim 30 ~\mu \mathrm{M}~ \mathrm{AgNO}_{3} \) 첨가배지에서 금산 수집종의 식물체 분화수가 유의하게 증가하였고, 식물체 분화가 잘 안되는 완주 수집종에서도 소수의 식물체 분화가 이루어지는 것으로 보아 \( \mathrm{AgNO}_{3} \)의 효과를 인정할 수 있었다. 따라서 돌나물 식물체 분화효율을 증대시키기 위한 적정 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 첨가량은 캘러스당 16.1개의 식물체가 분화된 \( 15 ~\mu \mathrm{M}~ \mathrm{AgNO}_{3} \) 첨가가 가장 적합하였다.</p><h2>분화 식물체의 순화 및 이식</h2><p>재분화 식물체는 생장조절제를 첨가하지 않은 MS배지로 옮겨 shoot 생장과 발근을 유도하였다 (Fig. 1D). 30일간 자란 재분화 식물체는 인공 배양토를 채운 72구 트레이로 이식하여 20일 째의 생존율과 강모래와 밭흙 \( (1: 1) \)의 혼합토를 넣은 삽목상자에 정식하여 30일째의 초장을 조사하였다 (Table 3). 이식후 20째의 생존율은 perlite 단독처리구를 제외한 vermiculite 단독처리구와 perlite와의 혼합구에서 \( 98 \% \) 이상의 높은 생존율을 보였다. Perlite 단독처리에서는 처리구중 유의하게 낮은 \( 88 \% \)의 생존율을 보였는데, 이는 재분화 돌나물의 뿌리가 아주 가늘어 perlite 입자공극 사이에서 순화 초기에 수분흡수가 잘 이루어지지 않았던 것으로 보인다. 돌나물의 재분화 식물체들은 vermiculite 단독 또는 혼합토양에서 순화 후 생존율이 대체로 높았는데, 이는 같은 캘러스 유래의 식물체를 개체별로 분리시키지 않고, 하나의 캘러스로부터 재분화된 식물체를 모듬으로 이식하였기 때문으로 보인다 (Fig. 1E). 순화시킨 재분화 식물체들은 강모래와 밭흙 \( (1: 1) \)의 혼합토에 정식한 뒤에도 초장 생육은 생존율과 비례하여 양호하였는데, vermiculite 단독 처리구에서 가장 컸고, perlite 단독 처리구에서 유읙하게 적었는데, 이는 활착이 빠를수록 초장생육도 빨라지기 때문으로 보인다. 또한 토양 활착후 재분화 식물체들은 모식물과 형태적 차이를 보이지 않았다 (Fig. 1F). 이와 같이 재분화 식물체의 토양이식에 따른 생존율은 초본식물의 경우 충분한 순화과정을 거치면 비교적 높게 나타나는데, 털머위에서도 perlite에서는 \(75\%\), vermiculite에서는 \( 95 \% \)의 생존율을 보여 (Lee et al. 2001), 본 연구 결과와 유사하였다. 돌나물의 줄기는 마디마디에 뿌리가 잘 내리기 때문에 순화 전에 별도의 발근배지가 필요하지 않고, 긴조에도 강하기 때문에 기내배양 유식물의 포장이식은 비교적 용이한 것으로 보인다. 이러한 결과는 돌나물의 형질전환 연구와 유전자원의 기내 및 초저온 보존을 위한 유용한 특성으로 생각되었다.</p>
식물체 분화율과 캘러스당 식물체수를 조사한 결과 어디 수집종에서 분화가 빠르게 진행되었니?
금산 수집종