<h1>재료 및 방법</h1><h2>Tolaasin의 분리</h2><p>다양한 P. tolaasii 균주들을 PAF (Pseudomonas agar \( \mathrm{F}, \mathrm{Mg} \mathrm{SO}_{4} \) \( 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 1.5 \mathrm{~g}, \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 1.5 \mathrm{~g} \), Bacto-peptone \( 10 \mathrm{~g} \), Bacto-tryptone \( 10 \mathrm{~g} \), glycerol \( 10 \mathrm{~mL} \) per liter) 액체 배지에 접종하여 배양한 후, 균체가 제거된 배양상징액에 \( 30 \% \) 의 ammonium sulfate를 가하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 정치한 후 초원심분리하여 crude tolaasin을 얻었고, 이를 순수분리에 사용하였다. Tolaasin의 순수분리는 Cho 등의 방법에 따라 수행하였으며, gel permeation chromatography와 high-performance liquid chromatography (HPLC)를 이용하여 분석하였다. 간략히, Sephadex G- \( 75 \) 로 충전된 column \((1.7 \times 45 \mathrm{~cm}) \) 에 crude tolaasin을 가한 후, \( 1 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) 의 유속으로 용출하여 각 분획에서 펩티드 물질의 함유 여부를 UV/Vis spectrophotometer (U- \( 2000 \), Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 \( 220 \mathrm{~nm} \) 의 파장에서 확인하였다. Gel permeation chromatography로부터 얻은 tolaasin 활성을 갖는 분획들의 펩티드 분석은 Protein-Pak \( 60 \) column으로 구성된 HPLC (YL \( 9100 \) Series HPLC, Younglin Co. Ltd., Anyang, Korea)를 이용하였으며, 이동상은 \( 10 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.0 \) )이며, \( 0.5 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) 유속의 조건에서 분석하였다.</p><h2>P. tolaasii 균주들의 현색침강선형성검정(white line test)</h2><p>현색침강선형성검정법은 Pseudomonas reactans ATCC \( 51314 \) 균주 배양액을 PAF 고체 배지 중간에 일직선으로 점종한 후, 이와 약 \( 5 \mathrm{~mm} \) 의 간격을 두고 P. tolaasii 균주 배양액 \( 3 \mu \mathrm{L} \) 를 점직하여 이루어졌다. 점종을 완료한 agar plate는 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 24 \text{-} 48 \)시간 동안 배양하며, 두 균주 사이에 흰색 침전 형성 여부를 확인하였다.</p><h2>Tolaasin 및 유사 펩티드의 분자량 분석</h2><p>Gel permeation chromatography로부터 얻은 각 균주들의 분획들은 질량분석기로 분석하였다. 분획에 포함된 tolaasin 및 유사체는 원활한 측정을 위해 ziptip (Millipore ziptips, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)을 이용하여 농축액 내의 염을 제거하였다. Matrix는 \( 50 \% \) ACN/\( 0.1 \% \) TFA \( 1 \mathrm{~mL} \) 에 \( \alpha \)-cyano-\( 4 \)-hydroxycinnamic acid를 포화 수준으로 용해시컸다. 측정 직전에 염류를 제거한 시료를 matrix와 \( 1 \mu \mathrm{L} \) 씩 취하여 혼합하고, 이 혼합액을 stainless steel target plate (\( 384 \)-well plate, Shimadzu, Tokyo, Japan)에 점적한 후 건조시켰다. Tolaasin의 분자량 측정은 MALDI-TOF/TOF mass spectrometry (ultrafleXtremeⅢ, Bruker Daltonics, Bremen, Germany)를 이용하였다. Mass spectrum은 \( 20 \mathrm{kV} \) 의 가속 전압으로 양이온 모드에서 기록되었으며, 레이저로 \( 500 \) 번 조사하여 얻은 수치의 평균치로 나타내었다. 측정한 모든 시료의 mass to charge \( (\mathrm{m} / \mathrm{z}) \) 범위는 \( 300 \) 에서 \( 20,000 \mathrm{~m} / \mathrm{z} \) 까지 측정하였다. Tolaasin의 분자량을 측정하기 전, external calibration은 bradykinin, angiotensin, bombesin, renin, somatostatin 등의 다양한 standard peptide mixture로 수행하였다.</p>
다양한 P. tolaasii 균주들을 PAF 액체 배지에 접종하였는가?
YES