<h1>재료 및 방법</h1><h2>RT-PCR에 의한 Ferritin 유전자 분리</h2><p>RNA의 분리는 황금콩의 잎에서 Qiagen RNA mini Kit를 사용하여 RNA를 분리하였으며, Ferritin 유전자를 분리하기 위하여 콩 ferritin 유전자 염기서열 (Ragland et al. 1990)로부터 다음과 같은 primer (G-1: 5'-ATGGCTCTTGCTCCATCCAAAGTT-3', G-1R: 5'-TT GATCAAAGTGCCAAACACCGTG-3', G-2: 5'-GGCTATCAAGATT AAGCAG-3', G-2R: 5'-GGCTATTCAAGATTAAGCAG-3')를 합성하였다. RT-PCR (reverse transcription-PCR)은 mRNA를 역전사 반응시켜 cDNA로 만든 다음, 이 cDNA를 주형 DNA로 하여 RT-PCR 분석을 실시하였다. 즉, mRNA 를 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 미리 반응을 실시한 후 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 역전사 반응시켰다. \( 99^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 다른 효소의 활성을 제거하고, 합성한 cDNA를 template로 하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분간 hot step, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 denaturation, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 분간 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 분간 extension 과정을 45 cycle로 하여 PCR 반응을 실시하였고, \( 1.5 \% \) 아가로스 겔 상에서 증폭된 밴드를 클로닝하여 염기배열을 확인한 후 이 DNA 단편을 벼에 형질전환을 위한 재조합 유전자의 제작에 이용하였다.</p><h2>유전자 운반체 제작 및 형질전환</h2><p>Globulin, glutelin(Wu et al. 1998) 및 zein(Schernthaner et al. 1988) 유전자의 프로모터와 콩에서 분리한 ferritin 유전자를 sense(S)와 anti-sense(R)로 연결하고 기본 벡터는 marker 유전자로 bar gene이 연결되어 있는 pMJ21 벡터(Jang et al. 2003)를 사용하였다. Ferritin 유전자의 형질전환을 위해 재조합된 유전자는 pGBF-S12, pGBF-R4, pGTF-S12, pZ4F-S12, pZ4F-R4로 이름을 붙였다.</p><p>Ferritin 유전자의 형질전환을 위해 재조합된 유전자를 포함하는 Agrobacterium tumerfaciens strain LBA4404를 spectinomycin \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \), tetracycline \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 가 첨가된 AB 고체배지 \( (3 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\) \(\mathrm{K} 2 \mathrm{HPO} 4\), \(1 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) \( \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(1 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\) \(\mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl}\), \(0.3 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\) \(\mathrm{MgSO}{ }_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(0.15 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\) \(\mathrm{KCI}\), \(0.01 \mathrm{g} / \mathrm{L}\) \(\mathrm{CaCl}_{2}\), \(2.5 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\) \(\mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(5 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\) \(\mathrm{NaCl} 15 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) agar, \( \mathrm{pH} 7.2 \) )에 접종하고 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 일간 암배양하였다. 3일 후 AB 고체배지에서 증식한 Agrobacteruim 을 회수하여 acetosyringone(3,5-dimethoxy-4-hydroxy-acetophenone)이 \( 100 \mu \mathrm{M} \) 포함된 AAM 액체배지(Hiei et al. 1994)에 희석한 후 계대배양한 캘러스를 10 분 정도 침지시켰다. 접종된 캘러스는 멸균된 여과지로 여분의 수분을 제거한 후, 2N6-AS 배지에서 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 의 암조건에서 3일 간 배양하였다.</p><p>캘러스로부터 Agrobacterium 을 제거하기 위하여 \( 250 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 의 cefotaxime이 포함된 멸균수에 캘러스를 세척하고, \( 4 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 의 phosp-hinotricin이 첨가된 1 차 선발배지인 2N6-CP 배지로 계대배양 하였으며, \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 암상태에서 한 달간 배양하여 증식된 캘러스만을 선발하였다. 1 차 선발배지에서 살아남은 캘러스 중에서 새로 성장한 부분을 \( 250 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 의 cefotaxime과 \( 4 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 의 phosphinotricin이 첨가된 2 차 선발배지 N6-7-CP로 옮겨서 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \), 암상태에서 약 15 일간 배양하였다.</p><p>2차 선발배지에서 항생제 저항성을 나타내고, 왕성하게 자라는 캘러스를 선발하여 2~3등분해서 항생제가 포함된 MS-CP(Murashige and Skoog 1962) 재분화 배지로 옮겼다. 녹색체가 형성된 캘러스를 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS 배지에 옮겨 뿌리와 줄기의 분화를 유도하였다. 재분화를 위한 배양은 \( 27^{\circ} \mathrm{C}\), \(3000 \mathrm{lux}\)의 광조건 16 시간, 암조건 8 시간의 배양 조건에서 수행하였다. 재분화 배지에서 줄기와 뿌리가 정상적으로 분화한 개체만을 선발하여, 순화시킨 후 포트당 1 주씩 이식하여, 인공환경조절실에서 재배하여 종자를 수확하였다.</p>
실험에서는 황금콩의 이파리에서 어떻게 RNA를 추출하였는가?
Qiagen RNA mini Kit를 사용