<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포배양</h2><p>NIH3T3 와 Ras oncogene이 과발현되도록 transfection하여 제작한 NIH3T3 (Ras) 세포를 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, \(10\%\) FBS, penicillin G, streptomycin sulfate, amphotericin B, 2-mercaptoethanol)을 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\) \(\mathrm{5 \%} \) \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 키웠다.</p><h2>Western blot analysis</h2><p>Dynamin-2와 Grb2 단백질의 발현을 확인하기 위해, NIH3T3 와 NIH3T3(Ras) 세포를 사용하였다. NIH3T3 와 NIH3T3 (Ras) 세포를 \( 10 \mathrm{~cm} \) dish에 분주하여 배양하고 scrapper를 이용하여 모은 뒤 lysis buffer \( (50 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \( \mathrm{pH} 7.5\) , \( 0.15 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl}\), \(1 \% \) Triton X-100, \(2 \mathrm{mM} \) dithiothreitol, \( 1 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride, \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) aprotinin, 1 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) leupeptin)와 섞은 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간동안 용해시켰다. 용해된 세포을 원심분리 \( (13,000 \mathrm{rpm} \), Eppendorf centrifuge, \( 20 \mathrm{~min} \) ) 한 후 상층액을 취하였다. SDS-polyacrylamide gels에 전기영동 하여 nitrocellulose filters (Amersham)로 transfer하였다. Membrane은 \(\mathrm{5 \%} \) skim milk (PBST)로 incubation 한 후, 1 차 항체로 dynamin-2 (Upstate Biotechnology Inc)와 Grb2 (Upstate Biotechnology Inc.)른 이용하였고, 2차 항체로는 HRP-conjugated antibody (Upstate Biotechnology Inc.)를 사용하여 ECL kit (Amersham)로 단백질의 발현을 확인하였다.</p><h2>공초점레이저현미경분석</h2><p>6 well에 cover slip을 넣고 \( 5 \times 10^{4} \) 개의 NIH3T3, NIH3T3 (Ras) 세포를 분주하여 24시간 배양하였다. 배양된 세포를 \( 4 \% \) paraformaldehyde \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}\right. \), phosphate buffer, \( \left.\mathrm{pH} 7.2\right) \) 에 10분간 고정하였다. 고정된 세포를 \( 0.1 \% \) Triton X-100으로 5분간 처리한 후, 비특이적 항체의 반응을 억제하기 위하여 \( 10 \% \) BSA (PBS)로 10분간 처리하였다. Anti-mouse dynamin-2로 일차항체로 처리한 후 anti-mouse FITC-conjugated IgG로 2차 항체를 1 시간 반응시켰다. 반응을 마친 세포는 cold PBS로 수세한 후 Fluorescent Mounting Medium (DAKO)을 사용하여 포매 하였다. 준비된 시료는 confocal laser scanning microscope (TCS400, LEICA, Inc.)를 사용하여, 각 세포내 dynamin-2 단백질의 위치를 확인 관찰하고, SCANware 5.0 (LEICA, Inc.) program을 사용하여 사진을 얻은 후, Adobe Photoshop software (Adobe Photosystems, Inc.)로 분석하였다.</p>
NIH3T3 세포를 Dulbecco's modified Eagle medium 을 이용하여 몇 \( ^{\circ} \mathrm{C}\) \(\mathrm{5 \%} \) \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 키웠는가?
\( 37^{\circ} \mathrm{C}\) \(\mathrm{5 \%} \) \( \mathrm{CO}_{2} \)