<h1>서 론</h1><p>당뇨병 환자의 약 \( 95 \% \) 이상을 차치하고 있는 2형 당뇨병은 부적절한 식생활습관, 비만 인구의 증가, 운동부족으로 인해 현재도 급격히 증가하고 있다. 이러한 2형 당뇨병의 원인은 아직까지 명확하게 밝혀지지 않았으나 대표적인 원인은 인슐린 저항성이다. 인슐린 저항성은 간, 근육, 지방세포의 인슐린 수용체에 인슐린이 결합한 후 insulin receptor substrate (IRS) \( 1 \cdot 2 \) tyrosine 잔기의 인산화가 증가되고, 하위신호전달인 phosphoinositide3-kinases (PI3K)/protein kinase B (AKT)의 활성화를 통하여 당 수송체 단백질인 glucose transporter type (GLUT) 4가 세포 내 원형질에서 세포막으로 이동하여 포도당을 유입하는 과정이 감소된다는 것을 의미한다. 또 다른 원인은 췌장의 베타세포 기능 저하와 관련된 인슐린 분비능의 저하가 주된 원인으로 알려져 있다. 이러한 2형 당뇨병의 치료약물로는 경구용 혈당강하제나 인슐린 저항성을 개선하는 metformin과 peroxisome proliferator-activated receptor \( \operatorname{(PPAR)} \gamma \) 작용제로 알 려진 thia-zolidinedione계의 약물이 있다. 그러나 \( \operatorname{PPAR} \gamma \) 작용제의 심부전증을 포함한 심혈관질환에 대한 안전성 뿐만 아니라, 이러한 약물로 인해 방광암 유발, 유산증, 설사, 구토, 비만 유도 등의 위험성을 오히려 증가시키는 여러 가지 부작용을 가지고 있어 큰 논란이 되고 있다. 따라서 당뇨의 예방 및 치료를 위한 약물개발이나 건강기능식품과 관련된 많은 연구가 진행되고 있고, 당뇨병의 성공적인 치료를 위하여 부작용의 위험성이 적으며 적절한 인슐린 분비 촉진 및 근육이나 지방조직의 인슐린 저항성을 개선시킬 수 있는 천연소재 개발이 요구되고 있다.</p><p>삼색싸리(Lespedeza maximowiczii var. tricolor)는 콩과(Leguminusae) 싸리속(Genus Lespedeza Michx.)에 속하는 여러해살이풀로서 중국, 일본 및 우리나라 남해안 지역에 자생하고 있는 식물이다. 예로부터 한의약학에서는 싸리속 식물을 이용하여 백반증, 요통, 당뇨병과 이로 인한 합병증으로 발병하는 콩팥병 치료 등의 치료에 쓰였다고 기록되어 있고, 민간에서는 가축 사료로 활용되었다. 현재까지 보고된 삼색싸리의 생리활성은 tyrosinase 활성 억제효과이고, isoflavone 계열의 daidzein, hydroxygenistein, genistein, uncinanone \( \mathrm{B} \), desmodianone \( \mathrm{H} \), uncinanone \( \mathrm{B} \) 성분이 이러한 작용기전에 밀접하게 관련되어 있다고 보고된 바 있다. 이 밖의 싸리속 식물의 생리활성과 유효성분으로는 xanthine oxidase 저해활성, tyrosinase 저해활성, \( \mathrm{SOD} \) 유사활성, 아질산염 소거능, 항산화와 항균효과 및 혈당조절효과 등이 있으며, flavonoids, phenolics, sterols, phenylpropanoids, lignans, phenyldilactones 계열의 화합물이 함유되어 있다고 알려져 있다. 그러나 삼색싸리의 인슐린 민감성 또는 당대사와 관련된 연구결과는 보고된 바 없다.</p><p>본 연구에서는 신장병과 당느에 활용되었다는 전통지식에도 불구하고 아직까지 과학적으로는 확인된 바가 없는 삼색싸리를 이용하여 2형 당뇨병의 예방과 치료에 효과가 있는지를 알아보기 위해 3T3-Ll 지방세포와 2 형 당노모델인 C57BLKS/J Iar-\( d b / d b \) 마우스를 이용하여 생리활성을 평가하였다.</p><h1>재료 및 방법</h1><h2>추출물 제조</h2><p>삼색싸리(Lespedeza maximowiczii var. tricolor Nakai; LMTN)는 해남 달마산에서 채집하였다. 건조된 LMTN \( 391 \mathrm{~g} \) 은 상온에서 \( 80 \% \) 메탄올로 24 시간 침출하는 과정을 총 6 회 반복하여 추출하였다. LMTN 메탄올 추출용액은 여과한 후 회전감압 농축기로 농축한 후 동결 건조하여 실험에 사용하였다. LMTN 추출물의 수율은 \( 4.02 \%(16 \mathrm{~g}) \) 로 나타났다.</p><h2>3T3-L1 지방전구세포의 배양 및 분화유도</h2><p>3T3-L1 지방전구세포는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)으로부터 분양 받아 사용하였다. 3T3-L1 지방전구세포는 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 배양기에서 100 Units \( / \mathrm{mL} \) penicillin, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) streptomycin, \( 10 \% \) fetal calf serum(GE Healthcare Life Sciences)가 함유된 dulbecco's modified eagle medium (DMEM) 배지 조건에서 배양되었다. 이러한 3T3-L1 지방전구세포는 2일마다 신선한 배지로 보충하면서 계대배양하여 실험에 사용하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 분화시키기 위하여 96- 또는 6-well plate에 \( 1 \times 10^{5} \) cells/ well로 분주한 후 \( 100 \% \) confluent 상태가 되면 분화유도 물질 [5 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) insulin, \( 1 \mu \mathrm{M} \) dexamethasone, \( 0.5 \mathrm{mM} \) 1-methyl-3-isobutylxanthine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)]과 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS; GE Healthcare Life Sciences)가 함유된 DMEM 배지로 교환하여 분화유도를 시작하였다. 2 일 후 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) insulin과 \( 10 \% \mathrm{FBS} \) 가 함유된 \( \mathrm{DMEM} \) 배지로 교환하였다. 이로부터 2 일에 한번씩 \( \mathrm{DMEM}(10 \% \mathrm{FBS}) \) 배지로 보충하면서 4일 후 실험에 이용하였다.</p><h2>세포독성</h2><p>3T3-L1 지방전구세포를 96-well plate에 \( 1 \times 10^{3} \) cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양시킨 후 LMTN 추출물을 첨가하였다. 24시간 배양시킨 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium-12-bromide (MTT, \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \); Sigma-Aldrich) 용액을 각각의 well에 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. MTT 용액을 제거하고 DMSO (Sigma-Aldrich)을 넣고 15 분 후에 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 control 값에 대한 비율로 계산하였다.</p><h2>Oil Red O 염색 및 정량</h2><p>6-well plate에 분주된 3T3-L1 지방전구세포를 시료와 함께 8 일간 분화유도를 끝낸 후 PBS로 세척하였다. \( 10 \% \) formalin 용액으로 30 분간 고정하고 증류수로 1회 세척하였다. \( 0.3 \% \) Oil Red \( \mathrm{O} \) (Sigma-Aldrich)용액으로 1시간 처리한 후, \( 60 \% \) isopropanol로 1회 세척하고 광학현미경으로 지방생성 정도를 관찰하였다. 관찰을 마친 세포의 축적된 지방을 정량화하기 위하여 \( 100 \% \) isopropanol을 가하여 지방을 염색시킨 Oil Red O 염색시약을 추출한 후에 ELISA reader (Immuno Mini NJ-2300, Biotec, Tokyo, Japan)로 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. Troglitazone과 pinitol (Sigma-Aldrich)은 양성대조물질로 사용하였다.</p><h2>Glucose uptake</h2><p>3T3-L1 지방전구세포를 분화시킨 6일째에 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \mathrm{LMTN} \) 추출물과 양성대조물질인 \( 2 \mu \mathrm{M} \) troglitazone, \( 0.5 \mathrm{mM} \) pinitol 성분을 첨가하여 24 시간 동안 배양하였다. 7일째에 배지를 제거한 후, \( 40 \mu \mathrm{M} \) 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl), amino)-2-deoxyglucose (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 용액을 첨가하고 30 분 동안 반응시켰다. 그런 다음, \( \mathrm{PBS} \) 로 세척을 하고 Victor Ⅲ (perkinelmer, Waltham, MA, USA)에서 여기파장 \( 465 \mathrm{~nm} \), 방출파장 \( 540 \mathrm{~nm} \) 범위에서 형광값을 측정하였다.</p>
Oil Red \( \mathrm{O} \) (Sigma-Aldrich)용액은 지방을 염색시켜?
YES