<h2>16S rDNA 염기서열 증폭 및 분석</h2><p>염기서열 결정을 위하여, DNA 증폭 및 염기서열 결정은 Yeon 등의 방법을 이용하였다. 16S rDNA의 염기서열의 결정은 341f (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3') primer와 926r (5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3') primer를 사용하여 ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA를 사용하여 부분 염기서열을 결정하였다. 16S rDNA 염기서열의 상동성 검색은 GenBank database에 등록된 정보를 대상으로 Blast 검색에 의해 실행하였다.</p><h2>색소의 추출 및 특성</h2><p>분리된 균주를 MB (marine broth media) \( 200 \mathrm{~ml} \)이 담긴 \( 500 \mathrm{~ml} \) 플라스크에 접종하고, \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{~rpm} \)으로 30 시간 진탕 배양하였다. 배양액은 \(6,000 \mathrm{~rpm}\)에서 15 분간 원심분리하여 균체와 상등액을 분리하였고 여기에 물, ethanol, methanol, methanol:acetone \( (7: 2, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)을 각각 첨가하여 3회 반복 추출하였다. 추출한 색소는 스펙트로포토미터(Spectronic Genesys 5, Miltonroy, USA)를 이용하여 \(350-900 \mathrm{nm}\) 파장에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>색소의 최적 생성 조건</h2><h3>온도, \( \mathrm{pH}, \mathrm{NaCl} \)</h3><p>온도와 \( \mathrm{pH} \)에 따른 균주별 색소의 최적 생성 조건을 규명하기 위하여, MB 배지에 배양액을 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여, 측정하고자 하는 온도, \( \mathrm{pH} \) 조건에서 48 시간 동안 진탕배양하면서 4시간 간격으로 스펙트로포토미터를 이용하여 균체량과 색소량을 측정하였다. 온도에 따른 색소의 최적 생성 조건을 알아보기 위하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 30^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였고 \( \mathrm{pH} \)의 영향을 알아보기 위하여 \( \mathrm{KOH} \)와 \( \mathrm{HCl} \)를 사용하여 각각 \( \mathrm{pH} ~5, \mathrm{pH}~ 6,\mathrm{pH} ~7, \mathrm{pH} ~ 8\)과 \( \mathrm{pH} ~9\)로 조정된 배지를 이용하였으며, \( \mathrm{NaCl} \) 농도에 따른 색소의 최적 생성 조건을 알아보기 위하여 균주의 최적 생장 \( \mathrm{NaCl} \) 농도를 조사하기 위한 배지와 동일한 배지를 사용하여 \( 0 \%, 1 \%, 2 \%, 3 \%, 4 \%, 5 \%, 6 \% \)와 \( 7 \% \)까지 \( \mathrm{NaCl} \) 농도가 조정된 배지에 균을 접종하고 배양하면서 측정하였다. 각 조건별 균체량은 \( 660 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였으며, 색소량은 각 균주의 최대 흡수 파장인 \( 537 \mathrm{~nm}, 378 \mathrm{~nm}, 387 \mathrm{~nm} \)에서 각각 측정하였다.</p><h3>탄소원과 질소원</h3><p>균주별 탄소원과 질소원이 색소 생성 조건에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Kim 등의 방법을 변형하여 사용하였다. 즉, \( 0.75 \% \) casamino acid, \( 1.0 \% \) yeast extract, \( 0.3 \% \) sodium citrate, \( 0.2 \% \) potassium chloride, \( 2.0 \% \) magnesium sulphate, \( 0.0023 \% \) ferric sulfate \( (\mathrm{pH} ~7.4\))에 \( \mathrm{NaCl} \) 농도를 \( 2 \% \)로 한 배지에 최종 농도 \( 1 \% \)가 되도록 각각 탄소원과 질소원을 첨가하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간 동안 진탕배양하면서 스펙트로포토미터를 사용하여 각 균주의 최대 흡수파장에서 흡광도를 측정하였다. 탄소원은 glucose, lactose, maltose, galactose, arabinose, su-crose, mannitol, sorbitol, glycerol를 첨가하여 확인하였고, 질소원으로는 yeast extract, malt extract, beef extract, tryptone과 peptone의 유기질소원과 potassium nitrate, ammonium nitrate와 sodium nitrate의 무기질소원을 사용하였다.</p>
DNA 증폭 및 염기서열 결정을 위해 이용한 방법이 어떻게 돼?
Yeon 등의 방법