<h1>고 찰</h1><p>Topo는 그 촉매 방법에 따라 type I Topo와 type II Topo로 크게 두 그룹으로 나눈다. 전자는 helix DNA의 한가닥을 절단하고 상대편 DNA 가닥을 통과시키고 절단부분을 다시 연결하여 한 개의 DNA linking number를 변화시킨다. 후자의 경우는 supercoiling DNA의 두 가닥을 동시에 끊어 DNA의 다른 부분을 절단된 곳으로 통과시키고 절단부위를 봉합한다. 이 때 ATP를 필요로 하며 2개의 linking number가 변화된다. 현재까지 발견된 항암 활성을 나타내는 Topo의 저해제중 Topo II에 대한 저해제는 많이 있으나 Topo I의 저해제로는 Camptotheca actminata에서 추출한 CPT만이 알려져 있으며 그외의 저해제를 발견하기 위하여 많은 연구가 이루어지고 있다. 본 연구에서는 HL-60 사람 백혈병 세포에서 CPT가 Topo I의 발현과 cleavable complex에 미치는 영향을 구명하기 위하여 Topo I 효소를 K-562세포에서 정제한 후 Topo I에 의한 이완 활성과 선형 pUC-MYC I DNA의 절단에 CPT가 미치는 영향을 nuclease S1 처리와 ethidium bromide를 사용하여 실행하였는데 \( 100 \mu \mathrm{M}-1000 \mu \mathrm{M} \) 첨가시 DNA cleavable complex를 안정화시키는 것을 확인하였으며(Fig. 3B) Yaashita등의 실험 결과와 같은 양상을 보여주었다. 그리고 \( \gamma \) -\( { }^{32} \mathrm{P} \) 로 DNA 절편의 5' 말단을 표지하여 CPT에 의헤 cleavable complex를 안정화하는 것을 확인한 연구 보고가 있는 데 본 실험에서는 동위원소의 사용을 배제하고 sense primer만 사용한 PCR 기법으로 cleavage site 를 확인 할 수 있었다(Fig. 4). CPT를 처리한 HL-60세포에서 분리한 핵 추출물에서 Topo I의 효소 활성을 측정하였을 때 정상군에 비해 현저히 억제되어 있었고 반응액에 ATP를 첨가하지 않은 군이 첨가하였을 경우보다 현저한 억제 현상을 나타내었다(Fig. 5). 또한 핵 추출물을 형광 spectrophotometer로 분석한 결과 CPT 처리군에서 상당량 검출되는 것으로 보아(Fig. 6) 검출된 약물에 의해 Topo I의 활성이 억제된 것으로 추정되며, 1999년 Pu 등이 melphalan (alkylator)을 HL-60세포에 투여하여 내성을 가진 세포주에서 Topo II \( \alpha \) 의 활성은 증가한다고 하였으나 Topo II \( \beta \) 와. Topo I의 활성에는 아무 변화가 없는 것을 확인한 바 있는데 CPT의 경우에는 Topo II에는 영향을 미치지 않음을 간접적으로 확인할 수 있었다. RT-PCR기법에 의한 mRNA 분석기법은 1989년 이후부터 여러 편 소개된 바 있는데 본 실험에서도 competitive RT-PCR법과 Northern blot을 기초로한 정량적 분석법으로 Topo I과 c-myc 유전자의 발현을 확인하였다. HL60 세포에서 Topo I 유전자의 발현은 RT-PCR 그리고Northern blot후 hybridization 방법 모두 약물의 농도와는 상관없이 같은 양상을 나타내었는데(Fig. 7, 8), Perego 등이 여러 type의 사람 세포주에서 CPT에 의한 Topo 1 유전자 발현을 조사한 결과와 같았다. 앞의 핵 추출물의 Topo I 활성 실험에서 활성이 약물에 의해 억제되는 점으로 미루어 볼 때 CPT가 Topo I의 기능에는 영향을 나타내지만 효소 발현의 조절에는 아무 영향을 주지 못하는 것으로 여겨진다. 반면 CPT를 처리한 군에서 c-myc 유전자 발현이 억제되었는데 Northern blot 분석에서도 비슷한 양상을 나타내었다. 이와 같은 결과는 Jain등이 MCF-7 사람 유방암 세포에서 c-myc 유전자 발현을 억제한다고 한 것과 일치하였다. 이와 같은 결과로 볼 때 Topo I은 CPT 세포독성의 표적은 되지만 Topo I의 발현은 조절하지 않으며, CPT가 c-myc DNA의 cleavable complex를 유도하여 c-myc 유전자 발현을 억제하는 것으로 여겨지며 Topo I은 특히 선택적 약물에만 작용하여 독특한 특이성을 가지교 cleavable complex를 유도하는 것으로 보이나 이에 대해서는 앞으로 구명하여야 할 과제로 사료된다.</p>
DNA linking number를 변화 시기기 위해서는 한가닥의 helix DNA를 절단하고 상대편 DNA 가닥을 통과시켜 무엇을 다시 연결하는 거야?
절단부분