<p>자낭균류에 속하는 Aspergillus nidulans는 형태발생과정 중 2차 대사과정에 의하여 무성포자(conidia)에는 암록색소(dark green pigment), 유성포자(ascospore)에는 자주색소(violet pig-ment) 및 균사체 (mycilium)에는 멜라닌이 합성되는데, 이러한 색소는 대부분 세포벽에 침적된다. 세포벽에 존재하는 색소 중 멜라닌은 chitinase나 \( \beta \)-glucanse와 같은 효소들의 공격과 x-선, \(\gamma\)-선 및 자외선 조사 등으로부터 세포를 보호하는 기능을 한다고 알려져 있다. 한편 Podospora anserina에서는 유성분화에 결함이 생긴 돌연변이주 중 대부분이 phenol oxidase 기능이 저하되어서 멜라닌을 합성하지 못하는 돌연변이주임이 밝혀져 있으며, Schizophyllum commıne에서도 phenol oxidase가 basidiocarp 형성에 필수적인 효소임이 밝혀짐으로써, 균류에서의 색소를 단순히 세포벽 성분으로보다는 분화기작과 관련지어서 이해하려는 노력이 가중되어 왔다.</p><p>본 연구에 이용된 A. nidulans의 색소결핍 억제돌연변이주(suppressor mutant of null pigmentation, SU-NPG)는 무성포자(conidium) 및 유성포자(ascospore)가 야생형의 경우처럼 정상으로 보이나, 성장속도, 무성 및 유성분화의 속도는 야생형(FGSC4)에 비하여 4-5시간 정도가 지연되는데, 이는 균사의 분지속도가 지연되기 때문인 것으로 생각되었다.</p><p>균사 분지헝성을 위하여 견고한 세포벽에 가수분해효소가 작용하여 분해되어야하는데, 색소합성을 위하여 세포벽구조가 필요할 것이고, 이는 균사 분지형성 및 세포벽 재구성과 관련되어 있을 것이다. 따라서 SU-NPG도 색소합성 및 색소 침적은 정상적일지라도 세포벽 구조에 이상이 있을 것으로 생각된다. 또한, SU-NPG의 세포벽 구조 또는 세포벽 합성이 야생형과는 다르게 변화되었다고 생각되는데, 이는 SU-NPG 세포벽에 이상이 있음을 나타내는 특징 중의 하나로서 이들이 Novozyme에 의한 원형질체 형성속도가 FGSC4에 비하여 매우 빠르다는 점이다. 이는 FGSC4가 Novozyme에 대한 inhibitor를 형성하기 때문에 이들 돌연변이에 비하여 원형질체의 형성속도가 느리거나, 이들 돌연변이주들에 있어서 균사 정단의 세포벽에 이상이 생겨서 원형질체 생성이 잘 될 수 있는 구조를 지니기 때문으로 생각할 수 있다. 본 연구 에서는 A. nidulans의 색소결핍 억제돌연변이주(SU-NPG)를 이용하여 색소형성 및 분지형성에 미치는 세포벽의 미세구조에 대하여 조사하였다.</p><h2>재료 및 방법</h2><h3>균주</h3><p>본 연구에 사용된 A. nidulans 균주는 색소결핍 억제돌연변이주(SU-NPG)인 SU601 (Green npgA1; suA6npgA1)과 SU602(Chartreuse npgA1; pyroA4; nicB8; chaA1; suA6npgA1)를 사용하였다.</p><h3>배지 및 배양조건</h3><p>A. nidulans의 종균 및 포자수확을 위하여 Harsani등의 완전배지(complete medium, CM)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)로 3일 내지 6일간 배양하였고, 균사(hyphae) 배양을 위하여 CM에서 3일간 배양한 무성포자를 수확하여 \( 1 \times 10^{6} / \mathrm{ml} \)이 되게 하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 8시간 배양 후, 제한온도인 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 6시간 동안 배양하였다.</p><h3>분생포자, 자낭포자 및 균사체의 전자현미경 관찰</h3><p>수확한 분생포자, 자낭포자 및 균사체를 전고정을 위하여 \( 0.1 \mathrm{M} \) cacodylate buffer ( \( \mathrm{pH} 7.2\) )에 희석시켜 \( 4 \% \) glutarald-ehyde \( \left(\mathrm{pH}\right.7.2 \) )가 되게 준비된 용액에서 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)로 4시간 동안 처리하였다. 그 후, \( 0.1 \mathrm{M} \) cacodylate buffer ( \( \mathrm{pH}7.2 \) )로 3회 세척하였다. \( 0.1 \mathrm{M} \) cacodylate buffer \( (\mathrm{pH} 7.2) \)에 용해시켜 최종 농도가 \( 1 \% \)인 \( \mathrm{OsO}_{4} \) 용액으로 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), 4시간 동안 처리하여 후고정 후, 동일 buffer로 3회 세척하였다. Ethanol (Merck) 농도순으로 각 세포들을 각각 15분씩 처리한 다음 무수 ethanol에서 5분씩 2회 처리하여 탈수시켰다. 주사형 전자현미경(SEM) 관찰을 위하여 무수 ethanol로 탈수된 세포들에 isoamyl acetate와 에탄올 혼합액에 15분씩 처리하였다. 그 후, 무수 isoamylacetate에 15분씩 2회 처리하여 탈수시키고, 액체 이산화탄소를 이용하여 임계점 건조기(Ladd)를 이용하여 건조시켰다. 준비된 시료를 sputter coater (Ladd)로 gold coating 후 주사형 전자현미경(JSM-T330A, Jeol)으로 관찰하였다. 투과헝 전자현미경(TEM) 관찰을 위하여 무수 에탄올로 탈수된 세포를 propylene oxide에 15분씩 2회 처리하여 수분을 제거한 후 epon mixture를 침투시켰다. 그 후 epoxy resin으로 포매한 다음, \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(45^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 각각 12시간 동안 중합시켰다. 세포가 포함된 block을 초박절편기(LKB)로 diamond knife를 사용하여 \( 50-80 \mathrm{nm}\) 두께로 박절하였다.절편을 uranyl acetate와 lead citrate로 염색하여 투과형 전자현미경(TEM, JEM-1200EXII, Jeol)으로 관찰하였다.</p><p>세포의 화학적 미세구조를 관찰하기 위하여 세포가 포함된 block을 \( 50-60 \mathrm{nm}\)로 초박절한 절편을 gold grid에 모으고 탄수화물 염색을 하였다. Parafilm 위에 \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) periodic acid 수용액을 한 방울 멀어뜨리고 절편을 1시간 동안 산화시켰다. Grid를 증류수로 세척하고 \( 10 \% \) acetic acid \((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 물방울에서와 \( 20\% \) acetic acid 물방울에 각각 15분씩 담근 후, \(20\%\) acetic acid에 녹인 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) thiocarbohydrazide (Sigma) 수용액에서 24시간 동안 처리하였다. Grid를 \( 20\% \) acetic acid, \( 10\% \) acetic acid와 증류수에 각각 15분간 담근 후 증류수로 세척하였다. 사용 바로 전에 \( 1\%\) (\(\mathrm{w} / \mathrm{v}\), 수용액) mild silver protein (\( 20 %\) silver, Sigma)을 준비하여 \( 1.5 \) \( \mathrm{ml} \) 미세 원심관에 녛고 \( 10,000 \mathrm{~g} \)에서 2분간 원심분리하여 입자물질을 제거시킨 용액을 준비하였다. 사용직전에 준비된 \( 1 \% \) mild silver protein 용액으로 절편을 암소에서 2시간 동안 염색하였다. 신선한 증류수 방울에 5분씩 3회 옮겨서 담근 후, 증류수로 세척 후 투과형 전자현미경(JEM-1200-EXII, Jeol)으로 세포의 화학적 미세구조를 관찰하였다.</p>
색소결핍 억제돌연변이주(suppressor mutant of null pigmentation, SU-NPG)의 성장 속도, 무성 및 유성 분화의 속도는 야생형에 비해 왜 지연되는가?
균사의 분지속도가 지연되기 때문인 것으로 생각되었다.