<h2>Rubisco와 rubisco activase의 함량 측정</h2><p>ELISA에 의해, rubisco와 rubisco activase의 함량을 측정하였다. Microplate well에 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium carbonate-bicarbonate buffer ( \( \mathrm{pH} 9.5 \))용액으로 희석된 효소 용액을 넣은 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하루 밤 동안 반응시키고, \( 0.05 \% \) Tween 20이 함유된 \( 0.01 M \) PBS ( \( \mathrm{pH} \) 7.4) 용액으로 세척하였다. \(0.01 \mathrm{M} \) PBS (\(\mathrm{pH} 7.4) \)로 만든 \( 0.1 \% \) BSA용액을 사용하여 blocking하고, 1 차 항체로서 토끼 항 rubisco와 항 rubisco activase 항혈청을 각각 가하고, 2차 항체로서는 \( 0.1 \% \) BSA가 들어있는 \( 0.01 \mathrm{M}\) PBS (\(\mathrm{pH} 7.4) \)로 \(1:20,000\) 희석시킨 peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG 용액을 가하였다. Peroxidase의 기질로서 \( 30 \% \) \(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)가 함유된 \( 0.05 \mathrm{M} \) citrate/\( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 5.0\) )로 만든 OPD tablet 용액을 가하여 암상태의 실온에서 20분간 반응시킨 후, \( 1 \mathrm{~N}\) \(\mathrm{HCI}\)로 반응을 정지시켰다. ELISA microplate reader (Bio-Rad model 3550-UV)를 사용하여 \( 492 \mathrm{~nm} \) 에서 이들의 흡광도를 측정하여 함량을 계산하였다.</p><h2>Rubisco의 활성 측정</h2><p>Racker의 방법으로 rubisco의 활성을 측정하였다. \( 1 \mathrm{M} \) Tris (\(\mathrm{pH} 7.8) \), \( 0.006 \mathrm{M} \) NADH, \(0.1 \mathrm{M}\) GSH, \(0.5 \mathrm{M} \) \( \mathrm{KHCO}_{3} \), \( 0.5 \% \) glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, \( 0.025 \% \) 3-phosphateglycerate kinase, \( 0.05\%\) a-glycerophosphate dehydrogenase-triose phosphate isomerase, \( 0.025 \mathrm{M} \) ribulose bisphosphate, \( 0.2 \mathrm{M} \) ATP 및 \( 0.5 \mathrm{M} \mathrm{MgCl}_{2} \)의 용액에 분획된 rubisco 용액을 가하였다. 주입 즉시 UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 RuBP가 PGA를 형성하고 이것이 GAP를 형성할 때 산화하는 NADH 양을 \( 340 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 1분에 \( 1 \mu \mathrm{M} \) 의 ribulose bisphosphate를 분해하는 효소의 양을 1\( \mathrm{unit}\)로 나타내었다.</p><h2>Rubisco activase의 활성 측정</h2><p>Robinson과 Portis의 방법으로 rubisco activase의 활성을 측정하였다. \( 50 \mathrm{mM} \) Tricine \( ( \mathrm{pH} 8.0\)), \(20 \mathrm{mM}\) KCI, \(5 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{MgCl}_{2}\), \(2.5 \mathrm{mM} \) ATP, \( 1 \mathrm{mM} \) PEP, \( 0.3 \mathrm{mM} \) NADH, \( 40 \mathrm{units}/\mathrm{ml}\) pyruvate kinase 및 \( 40 \mathrm{units}/\mathrm{ml}\) lactic dehydrogenase로 구성된 reaction mixture에 분획된 rubisco activase 용액을 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분간 반응시킨 후, UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 이들의 흡광도를 측정하였다. 활성은 NADH oxidation 율로부터 ATP 가수분해율을 계산하여 나타내었다.</p><h2>SDS-PAGE</h2><p>Laemmli의 방법에 따라 \( 20 \% \) polyacrylamide gel을 사용하여, 분리된 rubisco를 SDS-PAGE하였다. \( 110 \mathrm{~V} \) 에서 11시간 30분의 전기영동이 끝난 후, coomassie blue R-250 용액으로 염색하고, \( 7.5 \% \) acetic acid를 사용하여 탈색하였다.</p>
Robinson과 Portis의 방법으로 reaction mixture에 rubisco activase 용액을 첨가해서 어떤 과정으로 흡광도를 측정해?
\( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분간 반응시킨 후, UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 이들의 흡광도를 측정