<h1>재료 및 방법</h1><h2>표준 바이러스의 배양 및 정량</h2><p>표준 바이러스는 poliovirus type Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 형을 혼합하여 제조한 생 폴리오바이러스 백신(동산제약)을 원숭이 신장세포(Vero)에 3일간 배양, 증폭하였다. Vero 세포는 Dulbecco's modified Eagl's medium(DMEM)에 \( 10 \% \) fetal bovine serum(FBS), \( 100 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \)의 페니실린 항생제와 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 스트렙토마이신이 혼합된 배지를 사용하여 배양하였다. 증폭되어진 바이러스는 얼림-녹임 과정을 3회 반복하여 얻어젔고 plaque assay틀 실사하여 바이러스의 수를 산출하였다.</p><h2>시료의 여과 및 농축</h2><p>\( 200 \mathrm{~L} \)의 증류수에 \( 1,000 \mathrm{~pfu} \)의 바이러스를 분주하여 잘 섞은 후 이를 1-MDS filter(Cuno사)를 이용, 흡착 여과를 실시하였다. 필터에 부착된 바이러스를 \( 1.5 \% \) beef extract/ \( 0.05 \mathrm{~M} \) glycine\( (\mathrm{pH} 9.4) \) \( 500 \mathrm{~ml} \)를 사용하여 5, 10, 15분 동안 시간별로 가압 용출을 실시하였다.</p><h2>시료의 재농축</h2><p>필터에서 용출된 시료를 다음의 세가지 방법을 사용하여 재농축을 실시하였다. 유기응집 농축법(organic flocculation)은 용출액에 \( 1 \mathrm{N} \mathrm{~HCl} \)을 천천히 떨어뜨려 \( \mathrm{pH} 3.5 \pm 0.1 \)로 만들고, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 천천히 교반하였다. 이 후 \( 4000\mathrm{~rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \), 15분간 원심 분리하여 침전물을 수거하였다. 침전물을 \( 0.15 \mathrm{~M} \) sodium phosphate\( (\mathrm{pH} \) 9.0-9.5) 혹은 PBS(phosphate buffered saline, \( (\mathrm{pH} \) 9.0-9.5) \( 10 \mathrm{~ml} \)에 녹인 후 \( 8000 \mathrm{~rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \), 10분간 원심 분리하여 상등액 만을 취하고 \( 1 \mathrm{N} \mathrm{~HCl} \)로 \( \mathrm{pH} 7.0-7.5 \)로 맞추었다.</p><p>초여과법(ultrafilteration)은 초여과장치(100,000 MWCO: Amicon사)를 이용하여 시료를 농축하였다. 질소압을 이용하여 여과장치에 \( 500 \mathrm{~ml} \)의 시료를 넣어 막을 통과시킴으로써 바이러스를 농축시켰다. 여과하는데 12시간 정도가 소요되었다. 초여과법을 통하여 얻어진 용출액은 \( 10 \mathrm{~ml} \) 정도로 농축되었다.</p><p>PEG 침전법(PEG precipitation) 용출액의 \( \mathrm{pH} \)를 7.2-7.4로 맞춘 후 \( 1 / 10 \) 부피의 \( 13 \% \) PEG(MW8,000)/\( 0.5\mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \)을 시료와 섞고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 6시간 이상 방치하였다. 침전된 바이러스를 \( 12,000 \mathrm{~rpm} \), 20분간 원심분리를 실시하여 수거하였고 이를 일정량의 PBS\( (\mathrm{pH} 7.4) \)로 현탁하였다.</p>
유기응집 농축법에서 용출액에 1N HCl를 떨어뜨려 섞은 후 다음에 할 일은 뭐야?
원심 분리하여 침전물을 수거