<h1>재료 및 방법</h1><h2>다목적 미생물의 탐색</h2><p>다목적 미생물의 탐색을 위하여 일차적으로 본 연구실에서 분리 및 동정되어 보존중인 각 세균을 대상으로 다양한 생리활성을 조사하였다. 동시에 경남 일원의 경작지에서 재배되고 있는 농작물의 근권 토양 및 양계장 부근 부엽토를 채취하여 다목적 미생물을 분리하였다. 근권 토양 채취를 위하여 각종 농작물의 뿌리를 수집한 후, 손으로 강하게 진탕하여 부착된 대부분의 토양을 제거하였다. 이 농작물의 뿌리를 멸균된 \( 0.75 \% \mathrm{NaCl} \) 용액에 첨가하여 \( 200 \mathrm{rpm} \) 에서 1 시간 동안 진탕하였다. 단계적으로 희석한 상둥액을 nutrient agar plate에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양함으로서 각 미생물을 순수분리한 후, 다양한 생리활성을 조사하였다.</p><h2>분리균주의 동정</h2><p>분리균주의 형태학적, 배양적 특성은 Manual of methods for general bacteriology에 준하여, 생화학적 특성은 API kit(Biomerieux, France)를 이용하여 검토하였으며, 도출된 결과를 Bergey's manual of determinative bacteriology를 참조하여 일차 동정하였다. 또한 분리균주의 16S rDNA의 염기서열을 Ausubel 등의 방법에 준하여 분석한 후, Blast network service를 이용하여 GenBank, EMBL, DDBJ에 등록된 다른 균주의 염기서열과 비교함으로써 최종 동정하였다.</p><h2>불용성 인산 가용능 조사</h2><p>불용성 인산 가용능은 NBRIP agar plate(glucose \( 1 \% \), \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4}\) \(0.01 \%, \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \( 0.025 \%\), \(\mathrm{MgCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) \( 0.5 \%\), \(\mathrm{KCl} ~0.02 \% \) 및 불용성 인산원으로 \( \mathrm{Ca}_{3}\left(\mathrm{PO}_{4}\right)_{2} 0.5 \%\), \(\mathrm{pH} 7.0\) )를 사용한 plate assay method로 확인하였다. 순수분리된 미생물을 NBRIP agar plate에 획선 도말한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 일정시간 배양하면서 콜로니 주위에 투명대를 생성하는 것을 불용성 인산 가용능이 있는 것으로 결정하였다. 투명대는 미생물에 의해 불용성 인산이 가용화되었음을 나타내는 지표이다. 또한 순수분리된 미생물을 NBRIP broth에 접종한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 200 \mathrm{rpm} \)에서 배양하면서 생성된 가용성 인산을 vanadomolybdophosphoric acid colorimetric method에 의하여 정량하였다. 균주를 접종하지 않은 배지를 대조구로 사용하였으며, 표준곡선은 \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \)를 이용하여 작성하였다.</p><h2>Indole-3-acetic acid (IAA) 생성능 조사</h2><p>대표적인 식물생장 호르몬인 IAA의 생성능은 Tang과 Bonner의 방법에 의하여 확인하였다. 순수분리 된 미생물을 King's B medium(proteose peptone No.3 \( 2 \%, \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \) \( 0.15 \%, \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.15 \% \), glycerol \( 1.5 \%\), \(\mathrm{pH} 7.0 \))에 접종 한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 200 \mathrm{rpm} \)에서 일정시간동안 배양하였다. 균체를 제거한 배양 상등액을 Salkowsky reagent와 혼합하여 30분간 반응시킨 후, 반응액의 색상이 분홍색으로 전환된 것을 IAA 생성능이 있는 것으로 결정하였다. 또한 순수분리된 미생물을 \( 0.02 \%\), \(0.1 \% \) 의 L-tryptophane이 각각 첨가된 King's B medium에 접종하여 배양하면서 생성된 IAA를 \( 530 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 균주를 접종하지 않은 배지를 대조구로 사용하였으며, 표준곡선은 IAA(Sigma)를 이용하여 작성하였다.</p><h2>항진균능 및 관련 생리활성 조사</h2><p>항진균능은 potato dextrose agar plate를 이용한 대치배양법으로 확인하였다. 각종 식물병원성 진균인 Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Phythium ultimum, Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum gloeosporioides 를 대상으로 potato dextrose agar plate에서 대치배양을 실시하여 생육저지대 생성 유무를 조사하였다. 순수분리된 미생물의 siderophore 생성능은 Chrome azurol S assay에 의하여, ammonification은 Dey 등의 방법에 의하여, 식물병원성 진균 세포성분 분해효소(chitinase, cellulase, pectinase, protease, amylase, lipase)의 활성은 표준방법에 의하여 정성분석하였다.</p>
순수분리된 미생물의 siderophore 생성능을 확인하기 위한 방법은 무엇인가?
Chrome azurol S assay