<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>본 연구에 사용된 조직시료는 2개의 한우집단으로부터 채취하였다. Inducible cAMP Early Repressor (ICER)유전자의 ddRT-PCR 재현성실험을 위한 성장단계 등심시료는 농촌진홍청 축산과학원 한우시험장 보유축군 도축시 12개월령 및 27개월령 각 3두로부터 채취하였고, ICER 유전자의 근내지방도에 따른 유전자발현분석을 위한시료는 농촌진홍청 축산과학원에서 2002년 4월부터 2004년 4월까지 사양 실험한 한우 동기우 집단 90두로부터 마블링 성적 및 근육 내 조지방 함량에 따라 마블링 high- 및 low 군으로 각각 4두와 3두씩 선택하였다. 아울러, 조직별 ICER 유전자발현을 위한 7개 조직은 한우 동기우집단 90두 중 1마리의 도체로부터 조직을 확보 후, 액체질소에서 동결하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 실험에 이용하였다.</p><h2>Total RNA 추출</h2><p>한우 등심 및 7 개 조직으로부터 total RNA분리는 Trizol(Life Science, Ltd. Co)을 이용하여 추출하였다. 즉, \( 0.2 \mathrm{~g} \)을 막자 사발에 액체질소와 함께 잘 분쇄한다. 분쇄한 조직을 Trizol \( 1 \mathrm{ml} \)과 잘 혼합하여 \( 500 \mu \mathrm{l} \)씩을 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 마이크로 튜브에 분주한 후 chloroform \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 5분간 교반한다. 그 후 \( 12,000 \mathrm{~rpm} \)으로 10분간 원심분리 하여 생긴 상층액을 잘 분리하여 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 튜브에 옮겨 동량의 isopropanol을 첨가하여 잘 섞어준 후 다시 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리하여 pellet을 수집한다. 수집된 pellet을 \( 70 \% \) 에탄올을 첨가하여 잘 세척하여 건조시킨 후 DEPC\((0.1 \%) \)로 처리된 증류수 \( 50 \mu \mathrm{l} \)에 녹여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p><h2>Differential display RT-PCR을 통한 ICER 유전자 재현성 탐색</h2><p>ICER 유전자의 ddRT-PCR 재현성실험을 위하여 한우 성장단계(12, 27개월령) 각 3두의 등심조직 total RNA를 pooling하여 ddRT-PCR 분석을 재차 실시하였다. 1st cDNA 합성은 GeneFishing DEG kit (SeeGene, Korea)의 dT-ACP1 primer를 이용하여 합성하였으며, ICER 유전자 증폭을 위하여, GeneFishing DEG kit 의 arbitrary GP14 primer와 dT-ACP2 primer 및 GeneFishing DEG kit로부터 제공된 PCR Master mix를 이용하였다. PCR 증폭 반응은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 40초, 중합반응은 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 40 초, 그리고 합성반응은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 40초간 하였고, 전체 40 cycle을 수행하였다.</p><h2>ICER 유전자 클로닝 및 Real-time PCR 분석용 primer 제작</h2><p>ICER 유전자 클로닝을 위한 primer는 ACP-ddRT-PCR법으로 증폭된 3'-영역 \( 300 \mathrm{bp} \)의 염기서열을 한우 EST 클론과 BLAST 검색을 통하여 총 4개의 EST clone (HW_Loin_1_G03, HW_Loin_5_G02, HW_Loin_11_0520_E11, HW_Loin_13_0520_C10)의 cluster인 \( 1.6 \mathrm{~kb} \) 염기서열 이용하여 \( 1.5 \mathrm{~kb} \)를 증폭할 수 있도록 primer를 제작하였다. 아울러, Realtime PCR용 primer는 primer3 program (http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm)을 이용하여 PCR 증폭산물을 \( 150 \mathrm{bp} \)가 되도록 제작하였으며, 내부보정용 유전자로는 18S rRNA(GenBank acc No DQ222453)를 사용하였다. 본 연구에 사용 된 모든 primer는 primer3 program을 이용하여 제작하였으며, primer 서열은 Table 1 과 같다.</p><h2>ICER 유전자 re-sequencing</h2><p>ICER re-sequencing을 위하여 한우 등심조직에서 추출한 total RNA를 이용하여 1st cDNA를 합성하였다. 분리한 total RNA \( (5 \mu \mathrm{g}) \)를 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 열변성시킨 후 즉시 얼음에서 급속 냉각하여, \( 5 \times \) 완충용액 \( (10 \mathrm{mM} \) Tris-Cl, \( 50 \mathrm{~mM} \mathrm{~KCl}, 2.5 \) \( \left.\mathrm{mM} \mathrm{~MgCl}_{2}\right) 5 \mu \mathrm{l}, 6 \mu \mathrm{g} \) BSA, \( 10 \mathrm{mM} \) DTT, oligo-dT primer\( (10 \mu \mathrm{m} / \mu \mathrm{l}) 2 \mu \mathrm{l} \) 와 Superscript II Reverse Transcriptase \((100\mathrm{U} / \mu \mathrm{l}) 1 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가한 후, 전체의 양을 \( 25 \mu \mathrm{l} \) 로 맞추어 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간동안 반응시킨 후 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 역전사 효소를 불활성화 시켰다. PCR 수행은 PTC-225 (MJ Reseach, Inc)의 peltier thermal cycler를 이용하여, 최초 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 예비변성을 시킨 후, 변성반응은 \( 94^{\circ} \mathrm{C}\) 45초, 중합반응은 \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, 그리고 합성반응은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분간으로 35회 반복 수행한 후 최종적으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 10분간 반응시킨 후 종결하였다. PCR 증폭이 끝난 후 PCR 증폭산물들은 CONCERT \( { }^{\mathrm{TM}} \) Rapid PCR purification system (Life Technologies, USA)을 이용하여 정제하였다. ICER 유전자의 re-sequencing은 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems, Foster city, (A, USA)을 이용하여 반응을 실시하였고, 반응이 끝난 산물은 ABI 3730XL DNA Sequencer (Applied Biosystems, U.S.A)를 이용하여 염기서열을 결정하였다.</p>
ICER의 약자는 어떻게 되나?
Inducible cAMP Early Repressor