<h2>QR 유도 활성 측정</h2><p>QR 생성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria의 방법 및 park의 방식을 참조하여 측정하였다. 즉 T-75 flask에서 배양중인 HepG2세포가 \( 80 \% \) 이상 증식하게 되면 24 well plate의 각 well에 \( 1 \times 10^4 \) \( \mathrm{cells/ml} \) 되도록 HepG2세포를 분주하여, \( 37^{\circ} \mathrm{C}\) \( 5 \%\) \( \mathrm{CO_2} \) incubator에 24 시간 동안 배양한 후 배풍등 추출물을 각각 DMSO에 녹여 40, 80, 120 및 \(160 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 첨가하고, 다시 24 시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 \( 250 \mu \mathrm{l} \)의 lysis buffer (\( 10 \mathrm{mM}\) Tris-\(\mathrm{Cl}\), \( \mathrm{pH} 8.0 \), \( 14 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NaCl}\), \( 15 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{MgCl_2} \), \( 0.5 \%\) NP-40)를 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \) \( \mathrm{CO_2} \) incubator에 10분간 두면서 cell을 lysis한 후 reaction mixture 즉, \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{Cl} \) (\(\mathrm{pH} 7.4\)), \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\) BSA, \( 0.008 \% \) tween-\( 20, 40 \mu \mathrm{M}\) FAD, \( 0.8 \mathrm{mM} \) glucose-6-phosphate, \( 2 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) glucose-6-phosphate dehydrogenase, \( 25 \mu \mathrm{M} \) NADP, \( 40 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) MTT 및 \( 1 \mathrm{mM} \) menadione을 혼합하여 well에 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 첨가하여 5 분 동안 반응시킨 후, 반응 정지용액인 \( 10.3 \mathrm{mM} \) dicumarol, \( 0.5 \% \) pyridine, \( 5 \mathrm{mM} \) potassium phosphate ( \( \mathrm{pH} 7.4\)) 혼합액을 \( 250 \mu \mathrm{l}\))씩 첨가하여 효소반응을 정지시키고 multi-detection micro-plate를 이용하여 \( 610 \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리고 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색방법으로 정량하였다. 24 well plate에 \( 1 \times 10^4 \) cells/well 농도로 분주하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \%\) \( \mathrm{CO_2} \) incubator에서 2시간 배양한 후 증류수로 2 분간 세척하였다. 각 well에 \( 0.5 \% \) SDS (in \( 50 \%\) EtOH) 용액을 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에 1시간 방치한 후 \( 610 \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. QR 활성 측정( \( \mathrm{nmol} / \mathrm{min} / \mathrm{mg}\) protein)은 다음과 같이 하였다.</p><p>\( ^\ast \text{QR activity} =\frac{\text { absorbance change of } \mathrm{MTT} / \mathrm{min}}{\text { absorbance of crystal violet }} \times 3345 \mathrm{nmol} / \mathrm{mg} \)</p><h2>통계처리</h2><p>본 실험에 대한 실험결과는 4 번 실험하여 평균치를 나타내었다.</p>
QR 생성 유도 효과는 Prochaska 과 무슨 방법을 참조하여 측정해?
Santamaria