<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>본 실험에 사용한 시료는 청원농산(경남, 김해)에서 cordy-cepin함량을 놂이기 위하여 단세포 교집법에 의하여 육종 개량된 cordycepin 고함유 Cordyceps militaris JLM \( 0636(\mathrm{CMa}) \) 과 일반 Cordyceps militaris (CM) 두 종류의 동충하초 시료를 제공받아 건조시킨 후 분말화 하여 사용하였다. 두 종류의 동충하초 분말은 모두 외관상 옅은 갈색을 띄었으며, cordycepin 고함유 C. militaris JLM0636보다 일반 C. militaris 가 조금 더 진한 갈색을 보였다.</p><h2>페놀성 화합물 함량 측정</h2><p>페놀성 화합물의 함량은 페놀성 물질이 phosphomolybdic acid와 반응하여 청색을 나타내는 원리를 이용한 Folin-Denis 법으로 측정하였다. 즉, \( 0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 시료 용액 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 에 Folin-ciocalteu's phenol reagent \( 2.5 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 잘 혼합하고 5 분간 실온에서 방치하였다. 정확히 5 분 반응시킨 후 \( 7.5 \% \) \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} 2 \mathrm{ml} \) 를 가하여 혼합하고 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 발색시킨 후 spectrophotometer (Hitachi U-2900, Hitachi High-Technologies Co., Tokyo, Japan) \( 760 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 이때 페놀성 화합물의 함량은 tannic acid를 0-500 \(\mu \mathrm{g}/\mathrm{ml} \) 농도로 하여 시료와 동일한 방법으로 측정한 표준곡선으로부터 계산하였다.</p><h2>Flavonoid 함량 측정</h2><p>Flavonoid 함량은 Jia 등의 방법에 따라 측정하였다. \( 0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 시료 용액 \( 0.25 \mathrm{ml} \) 에 \( 1.25 \mathrm{ml} \) 의 정제수와 \( 5 \% \) \( \mathrm{NaNO}_{2} \) 용액 \( 5 \mathrm{ml} \) 을 가하고, 5 분후 \( 10 \% \mathrm{AlCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.15 \mathrm{ml} \) 를 잘 혼합하고, 이 혼합 용액을 spectrophotometer (Hitachi U-2900, Hitachi High-Technologies Co., Tokyo, Japan)의 \( 510 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 플라보노이드 함량은 표준 물질로서 (+)-catechin hydrate을 20-200 \(\mu \mathrm{g} /\mathrm{ml} \) 농도로 시료와 동일한 방법으로 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.</p><h2>Mineral 함량 측정</h2><p>동충하초 분말의 미네랄 함량은 AOAC 분석 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 이들 시료 분말 \( 1 \mathrm{~g} \) 씩을 각 \( 550^{\circ} \mathrm{C} \) 회화로에서 3시간 회화 시킨 후 \( 6 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \) 에 용해시켜 완전히 산분해 시켜 수욕상에서 산을 완전히 제거하고, 이 건고물에 \( 3 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \) 를 가하여 Whatman No. 4 여과지로 1 차 여과하고 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) 필터로 여과시켜 원소 종류에 따라 각각 일정비율로 희석한 후 고주파 유도결합 플라즈마(ICP Optical Emission Spectrometor, Varian 720-ES, USA)를 이용하여 측정하였다.</p><h2>지방산 조성 분석</h2><p>동충하초 분말 \( 1 \mathrm{~g} \) 에 \( 15 \mathrm{ml} \) chloroform 및 \( 7.5 \mathrm{ml} \) methanol 혼합액(2:1)을 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 가온 추출한 후 chloro-form 및 methanol 혼합액(2:1)으로 \( 25 \mathrm{ml} \) 로 맞추어 여과 시켰다. 여과한 용액에 \( 4.5 \mathrm{ml} \) 의 증류수를 가하여 혼합시킨 후, \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 15 분간 원심분리 하여 상층액을 버리고 chloroform 층을 질소가스 하에서 농축하여 \( 5 \mathrm{ml} \) 의 석유에테르로 다시 용해하였다. 추출된 지질 용액에 methanol : \( \mathrm{HCl} \) \( (5: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v} \%) \) 용액을 가하여 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 시간 methylation 한 후 hexane으로 지방산 methylester를 추출하였다. 지방산 분석은 Omega was capillary column \( (30 \mathrm{~m} \times 0.25 \mu \mathrm{m} \), Supelco, USA)을 사용하여 Gas chromatography (GC-17A, Shimatsu, Koyto, Japan)로 분석하였다. 캐리어가스는 헬륨을 사용하였고, injection 온도는 \( 250^{\circ} \mathrm{C} \), oven 온도는 \( 180^{\circ} \mathrm{C} \) 및 detection 온도는 \( 260^{\circ} \mathrm{C} \) 로 하였다. 지방산 분석 결과는 총 지방산에 대한 비율(\%)로 나타내었다.</p><h2>Glutathione 함량 측정</h2><p>Owens와 Belcher 의 방법에 따라 \( 0.2 \mathrm{M} \) phosphate buf-fer (pH 7.1) \( 2.5 \mathrm{ml}, 1.0 \mathrm{mM} \) EDTA \( 0.8 \mathrm{ml}, 0.6 \mathrm{mM} \) DTNB \( 0.03 \mathrm{ml} \), glutathione reductase (5 unit)와 시료 \( 0.2 \mathrm{ml} \) 를 혼합한 후 \( 412 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하고 \( 0.2 \mathrm{mM} \mathrm{NADPH} \) 용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 방치한 후 \( 412 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. NADPH 용액 첨가 전후의 흡광도 차이를 구하여 작성된 표준곡선으로부터 glutathione 함량을 정량하였다.</p><h2>혈전용해 효소 활성 측정</h2><p>혈전용해 효소 활성은 fibrin plate 법을 변형하여 lysed zone으로 측정하였다. Fibrin plate는 \( 0.06 \% \) fibrinogen (Singma, St. Louis MO, USA)을 \( 0.2 \mathrm{M} \) borate buffer (pH 7.5) 에 용해시킨 후 petri dish에 \( 10 \mathrm{ml} \) 씩 분주하고 thrombin (5,000 unit, Sigma, St. Louis MO USA) 40 unit를 균일하게 섞이도록 가하면서 균일한 두께의 fibrin clot를 형성시킨 후 실온에서 30 분간 방치한 후 사용하였다. 시료를 증류수에 \( 1 \% \) 농도로 용출시킨 후 여과(Whatman No. 2)하여 fibrin plate 상에 \( 50 \mu 1 \) 씩 점적하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3시간 동안 반응시킨 후 생성된 투명환 부위의 직경을 측정하였다. 직경은 서로 수직인 두 개의 지름을 측정하였고, 투명대가 타원인 경우에근 가장 긴 지름과 가장 짧은 지름을 측정하여 투명대의 면적을 구하였다. 이때 대조구는 플라즈민을 시료와 동일한 농도로 용해시켜 사용하였다. 혈전용해 활성은 다음과 같은 식에 의해서 계산하였다.</p><ol>혈전용해활성 \( (\%)= \) 시료의 용해 영역/양성 대조구의 용해 영역 \( \times 100 \)</ol><h2>통계처리</h2><p>실험으로부터 얻어진 결과치는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차 \( (\operatorname{mean} \pm \) S.E. \( ) \) 로 표시하였다.</p>
두 종류의 동충하초 시료의 분말은 외관상 색깔이 다른가?
NO