<h2>Alkaline phosphatase (ALP) 활성</h2><p>배양된 MC3T3-E1 세포를 \( 1 \times 10^{5} \) cell/ml로 조정하여 96 well plate에 platting 한 후, 농도별로 준비된 적송잎 추출물을 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5\% \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator 에서 48 시간 배양하였다. 48시간 배양 후 PBS로 3회 세척하고 \( 0.1 \% \) Triton \( \mathrm{X}-100 \) 을 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 넣은 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 30 분간 lysis 하였다. Lysis 된 cell의 상등액 \( 5 \mu \mathrm{l} \)는 단백질 정량에 사용하였고, 나머지 상등액에 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 의 \( 0.1 \mathrm{~N} \) glycine 과 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 의 \( 100 \mathrm{mM} \) p-nitrophenylphosphate (p-NPP)를 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 30 분간 반응시켰다. 반응 후 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \) 로 반응을 정지하고 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 를 취해 \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 ALP 효소에 의해 p-nitrophenol로 전환된 양을 산출하였다. 세포수의 차이가 ALP 활성도에 영향을 미칠 수 있으므로 총 단백질 양을 측정하여 나누어 줌으로써 단위 세포수에 대한 ALP 활성도를 계산하였다.</p><h2>콜라겐 측정 방법</h2><p>배양한 MC3T3-E1 세포를 \( 1 \times 10^{5} \) cell/ml로 조정하여 plate에 배양한 후 PBS로 2회 세척하고 세포층은 cell scraper를 이용하여 모은 후 이를 \( 0.05 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer로 한번 더 현탁 시킨 후 ultrasonicator로 sonication 시켰다. 이후 \( 5 \% \) TCA를 첨가한 후 원심분리하여 상등액을 제거한 뒤 침전물에 \( 5 \% \) TCA 를 첨가한 후 이 과정을 2회 반복하였다. 상등액 제거 후 침전물에 \( 6 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \) 을 가하여 20 시간 동안 \( 110^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 가수분해 하고, 가수분해물을 여과 농축하여 \( \mathrm{pH} \) 를 중성으로 조절한 후 실험에 사용하였다. 시료 용액중의 hydroxyproline의 측정은 woessner 법을 이용하였고, 얻어진 hydroxyproline량으로부터 콜라겐량을 환산하였다. 콜라겐 중에 hydroxyproline 이 약 \( 10 \% \) 포함되어 있으므로, hydroxyproline \( (\mathrm{mg} / 100 \mathrm{ml}) \times 100 / 11= \) 콜라겐으로 산출하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>연구결과 얻어진 자료를 SPSS 통계 프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술 통계치(mean, SD)를 산출하였다. 사후 검증은 Tukey를 적용하였고 \( p<0.05 \) 수준에서 유의수준을 검증 하였다.</p>
배양된 MC3T3-E1 세포를 이용해 단위 세포수에 대한 ALP 활성도를 계산하는 방법이 뭐야?
배양된 MC3T3-E1 세포를 \( 1 \times 10^{5} \) cell/ml로 조정하여 96 well plate에 platting 한 후, 농도별로 준비된 적송잎 추출물을 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5\% \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator 에서 48 시간 배양하였다. 48시간 배양 후 PBS로 3회 세척하고 \( 0.1 \% \) Triton \( \mathrm{X}-100 \) 을 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 넣은 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 30 분간 lysis 하였다. Lysis 된 cell의 상등액 \( 5 \mu \mathrm{l} \)는 단백질 정량에 사용하였고, 나머지 상등액에 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 의 \( 0.1 \mathrm{~N} \) glycine 과 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 의 \( 100 \mathrm{mM} \) p-nitrophenylphosphate (p-NPP)를 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 30 분간 반응시켰다. 반응 후 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \) 로 반응을 정지하고 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 를 취해 \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 ALP 효소에 의해 p-nitrophenol로 전환된 양을 산출하였다. 세포수의 차이가 ALP 활성도에 영향을 미칠 수 있으므로 총 단백질 양을 측정하여 나누어 줌으로써 단위 세포수에 대한 ALP 활성도를 계산하였다.