<h1>재료 및 방법</h1><h2>시약 및 기구</h2><p>Ethephon 잔류 안전성 시험을 위하여 사용한 분석용 표준품과 유도체 시약인(trimethylsilyl) diazomethane solution (\(2.0 \mathrm{M}\) in diethyl ether)과 Folin-Ciocalteu's phenol은 Sigma-aldrich Co. Ltd. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 전처리에 사용한 용매인 acetonitrile과 acetone은 Merck Co. (Darmstadt, German)에서 구입하였다. 또한, total flavonoid 와 total phenol 분석을 위하여 사용한 ethanol은 Fisher Scientific Co. (Hampton, VI, USA) 제품을 사용하였으며, aluminum chloride와 sodium acetate, sodium carbonate는 Shinyo Pure Chemicals Co. (Hyogo, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 시험포장에서 사용된 약제는 AgroTech Co. (Seoul, Republic of Korea)의 에테폰 액제(A.I. \(39\%\))를 시중에서 구매하여 사용하였다.</p><h2>Ethephon 경엽처리</h2><p>\(2016\)년 \(7\)월 경남 진주시 미천면 안간리 시험포장에서 본 연구를 실시하였다. Yuk 등(\(2016\))의 연구결과를 토대로 개화기 전 콩에 에테폰 액제 \(400 \)배 희석액을 \( 24 \mathrm{~h} \) 간격으로 각각 \(1 \)회와 \(2 \)회 살포하였으며, 약액 살포량은 \( 300 \mathrm{~mL}\) \(10 \mathrm{a}^{-1} \)이었다. 최종 살포 \( 2 \mathrm{~h} \) 후 부터 \( 72 \mathrm{~h} \) 경과 시까지 콩 잎 시료를 수확하여 수확된 콩 잎 중 ethephon 잔류변화를 평가하였다. 시험포장에서 수확된 콩 잎은 아이스 박스에 담아 실험실로 옮긴 후 수확 \( 1 \mathrm{~h} \) 내 드라이아이스와 함께 동결 분쇄하였고, \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 냉동 보관하며 잔류 분석에 사용하였다.</p><h2>Ethephon 관주처리</h2><p>\(2017\)년 \(7\)월 경남 진주시 경상대학교 부속농장에서 \(1/5000 \mathrm{a}\)와 그너포트를 사용하여 개화기 전 콩에 에테폰 액제 \(200 \)배와 \(400 \)배 희석액을 포트 당 \( 200 \mathrm{~mL} \)씩 \(1\)회 처리하고 약액 처리 \( 2 \mathrm{~h} \)후 부터 \( 36 \mathrm{~h} \) 경과시 까지 콩 잎 시료를 수확하였으며, \( 1 \mathrm{~h} \) 이내에 드라이아이스를 사용하여 동결 분쇄하고, \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 냉동 보관하며 잔류 분석에 사용하였다.</p><h2>Ethephon 잔류분석</h2><p>Ethephon 잔류분석은 Takenaka의 방법에 따라 gas chromatography-mass spectrometry (GC-MSD)을 사용하여 다음과 같이 분석하였다. 동결 분쇄된 콩 잎 시료 \( 1.0 \mathrm{~g} \)을 \( 15 \mathrm{~mL} \) conical tube에 \( 0.1 \mathrm{~M}\) \(\mathrm{HCl} \)이 포함된 acetonitrile \( 10.0 \mathrm{~mL} \)를 넣어 \(30 \)분 동안 \( 170 \mathrm{~rpm} \)에서 진탕 추출하였다. 추출 시료는 원심 분리(\(4000 \mathrm{~rpm}\), \(10 \mathrm{~min}\), \(4^{\circ} \mathrm{C}\)) 후 상등액 \( 1.0 \mathrm{~mL} \)를 취하고, \( 1.0 \mathrm{~mL} \) (trimethylsilyl) diazomethane solution으로 상온에서 \(30 \)분간 methylation 하였다. 유도체화 된 시료는 질소농축기를 이용하여 농축하였고, 농축된 시료를 acetone \( 1.0 \mathrm{~mL} \)로 재용해한 뒤 \( 0.22 ~\mu \mathrm{m} \) syringe filter로 여과 후 GC-MSD (Agilent Co., Santa Clara, CA, USA)로 분석하였다. 상세한 기기분석 조건은 Table \(1\)에 나타내었다.</p><h2>Ethephon 잔류분석법 검증</h2><p>Ethephon 표준물질은 acetone을 이용하여 \( 1,000 \mathrm{~mg} \mathrm{L}^{-1} \) stock solution을 제조한 후 \( 0.05\), \(0.1\), \(0.5\), \(1.0\), \(2.0\), \(5.0\), \(10.0 \mathrm{~mg} \mathrm{L}^{-1} \) 농도로 working solution을 제조하고 \( 1.0 \mathrm{~mL} \) working solution에 (trimethylsilyl)diazomethane solution \( 1.0 \mathrm{~mL} \)를 넣어 methylation 하였다. Methylation 된 표준용액은 질소 기류 하에서 농축 후 acetone \( 1.0 \mathrm{~mL} \)로 재용해 후 GC-MS로 분석하였으며, \(3 \)반복 시험 후 평균값을 사용하여 ethephon 표준검량선을 작성하였다. 표준검량선의 \( r^{2} \)는 \( 0.9998 \)로 나타났고, 콩 잎에서 ethephon 정량한계(limit of quantitation, LOQ)는 \( 0.05 \mathrm{~mg}~ \mathrm{kg}^{-1} \)이었다. 회수율 시험은 \( 1.0 \)과 \( 5.0 \mathrm{~mg}~ \mathrm{kg}^{-1} \) 두 수준에서 실시하여 \( 105.1 \% \)와 \( 104.5 \% \)로 확인되었고, 시험 분석간 상대표준편차는 \( 4.1 \% \)로 정량잔류분석에 적합하였다.</p><h2>건조 콩 잎 제조</h2><p>수확된 콩 잎은 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지되는 dry oven에서 펼친 상태로 \( 24 \mathrm{~h} \) 동안 건조하였으며, 건조된 콩 잎은 믹서기로 분쇄하여 분석에 사용하였다.</p><h2>Total phenol 분석</h2><p>Total phenol 분석은 Yuk 등(\(2016\))이 사용한 Folin-Denis법을 사용하였다. 건조 콩잎 \( 0.20 \mathrm{~g} \)을 \( 70 \% \) ethanol 수용액 \( 10.0 \mathrm{~mL} \)에 넣은 후 \( 24 \mathrm{~h} \) 동안 진탕 추출하였다. 이후 원심분리(\(4000 \mathrm{~rpm}\), \(10 \mathrm{~min}\), \(4^{\circ} \mathrm{C} \))하여 상등액 \( 0.1 \mathrm{~mL} \)를 test tube에 분취하고 Folin-Ciocateu's phenol \( 0.5 \mathrm{~mL} \)와 \( 1 \% \) sodium carbonate \( 1.0 \mathrm{~mL} \)를 첨가하여 \(1 \)분간 중탕 후 상온의 암조건에서 \(15 \)분간 식힌 뒤 \( 685 \mathrm{~nm} \)에서 흡광분석하였다. Total phenol 분석의 기준물질은 quercetin (Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다.</p><h2>통계 분석</h2><p>Total phenol 분석결과에 대한 신뢰성 분석은 총 \(9\)회 반복 시험 결과를 바탕으로 통계프로그램 R (ver. \(3.2.4\), R Foundation, Austria)을 사용하여 tukey test를 통해 유의수준 \( 0.01 \)에서 검정하였다.</p>
Ethephon 잔류 안전성 시험을 위하여 사용한 분석용 표준품과 유도체 시약 두가지는?
(trimethylsilyl) diazomethane solution (\(2.0 \mathrm{M}\) in diethyl ether)과 Folin-Ciocalteu's phenol