<h2>DNA cloning</h2><p>준비된 Halophage DNA와 pTZ 18R plasmid vector를 각각 Eco R I 와 Hind III로 digestion한 다음 T4 DNA ligase를 이용하여 ligation시켰다. 재조합된 plasmid는 Maniatis 등의 방법에 따라 E. coli DH5a에 대해 transformation 시켰는데 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicilline과 \( 1 \mathrm{mM} \) isopropyl-D-thiogalactopyranoside(IPTG), 그리고 \(2 \% \) 5bromo-4-chloro-3-indoylgalactoside(X-gal)이 포함되어 있는 LB 평판배지에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 16 \sim 24 \) 시간 배양하여 white colony를 형질전환체로 선별하였다. 다수의 재조합 플라스미드는 alkaline lysis 방법에 따라 분리하였으며, 삽입된 DNA 단편에 대해서는 Eco RI 와 Hind III로 digestion하여 \( 1 \% \) agarose gel상에서 확인하였다.</p><h2>DNA sequencing</h2><p>BigDye terminator cycle sequencing ready reaction과 ABI PRISM 377 automated sequencer(Perkin-Elmer)를 이용하여 halophage DNA 염기서열 분석을 실시하였다. 즉 \( 8 \mu \mathrm{l}\) terminator ready reaction mix, \( 1.5 \mu \mathrm{l} \) temperate DNA \( (0.2 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{l}) \) 및 3.2 pmole M13-20 universal primer를 최종 부피가 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 가 되도록 혼합한 시료를 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 초, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 분간 25 회 반복하여 증폭한 후 에탄올로 침전시켜 얻은 침전물을 loading용 완충액 (formamide to EDTA/blue dextran 5:1) \( 6 \mu \mathrm{l} \) 에 현탁하여 잘 혼합하고 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 분간 변성시켜 automated sequencer에 주입하여 염기서열을 결정하였다. DNA 염기서열의 분석은 FASTA database 프로그램을 사용하였으며, Gene bank/EMBL database에 저장된 유전자 염기서열들을 활용하여 유사성을 조사하였다.</p>
DNA 단편이 정상적으로 플라스미드에 삽입되었는지를 어떤 과정을 거쳐 확인하였어?
Eco RI 와 Hind III로 digestion하여 \( 1 \% \) agarose gel상에서 확인