<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포배양 및 시험물질</h2><p>본 연구에서는 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 분양받은 KB 구강암세포주를 사용하였다. 이들 세포주의 세포배양액은 RPMI-1640 (Hyclone Laboratoris Inc, USA)에 \(5\%\) fetal bovine serum (Gibco), \(1\%\) streptomycin/penicillin (Gibco)를 첨가하여 사용하였다. 이들 KB 구강암세포주는 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 배양하였다. 시험물질은 Sigma (St Louis, MO, USA)사로부터 구입한 apigenin을 본 시험에 사용하였다.</p><h2>MTT assay</h2><p>KB 구강암세포주를 96 well plate에 \( 6 \times 10^{3} \) cells/well로 분주한 후, 24시간 동안 배양시킨 다음 세포주에 apigenin을 \( 6.25 \)\( \mu \mathrm{M}, 12.5 \mu \mathrm{M}, 25 \mu \mathrm{M}, 50 \mu \mathrm{M}, 100 \mu \mathrm{M} \) 의 농도로 처리하였다. 이 후 각각의 well에 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]용 액 (5 mg/ml, Sigma-Aldrich)을 \( 20 \mu 1 \) 첨가하여 2시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하고, 이후 상층액을 제거한 후 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich)를 \( 100 \mu \mathrm{l} / \mathrm{well} \) 로 첨가하여 shaker에서 5분간 흔들어 준 후 ELISA-reader (Bio-Rad Laboratories Inc, USA)로 \( 595 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>DAPI staining</h2><p>KB 구강암세포주를 12 well plate에 \( 4 \times 10^{4} \) cells/ml로 분주 한 후, 24시간 동안 배양시킨 다음 KB 구강암세포주에 apigenin을 \( 12.5 \mu \mathrm{M}, 25 \mu \mathrm{M} \) 의 농도로 처리하여 24시간 배양한 후 PBS로 조심스럽게 세척 한 후에 \( 4 \% \) paraformaldehyde를 1 \( \mathrm{ml} / \) well첨가하여 10-20분간 배양 하였다. PBS로 다시 세척 후 PBS로 10배 희석한 DAPI stain 용액을 \( 500 \mu \mathrm{l} / \) well 처치하 였다. 처치 후 암실에서 형광현미경으로 관찰하였다.</p><h2>실험동물</h2><p>6주령의 nude mice (nu/nu) 수컷은 (주)오리엔트에서 구입하였다. 모든 동물은 1주일간의 순화 기간을 거친 후 실험에 사용하였다. 마우스 15마리를 3개의 실험군으로 분류하여 실험 하였으며, 실험군은 그룹 당 5마리씩 설정하였다. Apigenin을 PBS에 suspension시켜 매일 정해진 시간에 21일간 경구로 투여하였으며, 물질의 용량은 대조군(PBS), 저용량( \( 25 \mathrm{mg} / \)\( \mathrm{kg}) \), 고용량 \( (50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg}) \)로 설정하여 투여하였다.</p><h2>사육환경</h2><p>입수된 동물은 케이지에 5마리씩 분류한 후 온도 \( 23 \pm 5^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도 \( 40 \pm 10 \% \), 조명시간 12시간(08:00 점등, 20:00 소등)으 로 제어된 환경 조건에서 사육되었다. 사육환경 모니터링을 위하여 온 - 습도는 주기적으로 측정하였으며 기타 환경은 정기적으로 점검하여 일정한 표준치를 유지하였다. 마우스는 폴리카보네이트제 케이지에서 케이지 당 5두씩 사육하였다. 동물의 개체식별은 문신법을 사용하였으며, tag 표시법에 의해서 사육 상자를 구분하였다. 사육 상자는 시험기간, 시험명, 시험책임자명을 기재한 label을 첨부하였다.</p><h2>Xenografts</h2><p>KB 구강암세포주 \( 5 \times 10^{5} \) cells/ \( 200 \mu 1 \)를 누드 마우스의 복강 피하에 접종하여 종양조직을 만든 후, 종양조직을 \( 1 \mathrm{~mm}^{3} \) 크기로 절편한 후 다시 누드 마우스의 복강피하에 이식하는 작업 을 두 번 반복한 후 물질을 투여하였다.</p><h2>종양사이즈 측정</h2><p>실험에 사용한 누드 마우스의 KB 구강암세포주 종양 사이즈가 군별로 일정하게 나오도록 군분류 한 후 apigenin을 3주동안 투여하고 투여기간 동안 종양사이즈와 누드 마우스의 일반적인 상태 및 체중을 측정하였다. 종양사이즈 측정은 주2회(화, 금), 3주 동안 vernier calipers (Mitutoyo, Japan)로 측정하였으며, 계산에 사용된 공식은 [(length+width) \( \times 0.5]^{3} \) 이다.</p><h2>동물부검</h2><p>Apigenin 투여 3주 후 모든 그룹의 마우스를 diethyl ether로 마취 후 경추탈골을 이용하여 안락사하고, 멸균된 수술용 가위와 핀셋을 이용하여 부검을 실시하였다. 부검은 종양조직을 채취하여 무게를 측정하였으며 그 후 개복하여 간과 비장 을 채취하여 \( 10 \% \) 중성 포르말린 용액에 1주일간 고정하였다.</p><h2>조직병리학적 검사</h2><p>적출한 장기는 \( 10 \% \) 중성 포르말린 용액에 1주일 동안 충분히 고정시킨 후 고정된 조직을 \( 85,95,100 \% \) ethanol, xylene을 단계별로 사용하여 탈수와 투명화 과정을 거쳤고 포매하여 \( 5 \mu \mathrm{m} \)의 절편을 만들어 hematoxylin & eosin 및 TUNEL 염색 후 광학현미경으로 관찰하였다.</p><h2>통계학적 처리</h2><p>모든 실험결과는 평균치와 표준오차를 사용하여 나타내고 각 군간 비교는 one-way ANOVA에 이은 t-test 분석을 실시하 였다. 대조군과 비교하여 P값이 \( 0.05 \) 미만일 때를 통계학적으로 유의성이 있다고 판정하였다.</p>
KB 구강암세포주에 apigenin을 어느 농도로 처리하였는가?
\( 6.25 \)\( \mu \mathrm{M}, 12.5 \mu \mathrm{M}, 25 \mu \mathrm{M}, 50 \mu \mathrm{M}, 100 \mu \mathrm{M} \)