<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>본 실험을 위하여 담배(Nicotiana tabacum L. Wisconsin) 종자를 살균 처리하여 사용하였으며, 질산염으로서는 \( \mathrm{KNO}_{3} \) 를 사용하였다.</p><h2>배양 및 생장 측정</h2><p>담배 종자를 MS 배지에서 무균적으로 발아시킨 후, 줄기를 \( 1 \mathrm{cm} \)의 동일한 크기로 절단하여 \( 0.2 \mathrm{mM} \mathrm{CdCl}_{2} \cdot 2.5 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)와 20, 40, 60, 80, 100 \(\mathrm{mM} \)의 질산염이 각각 함유된 배지에 치상하여 배양하였다. 16시간의 광(photo flux density 800\( \mu \mathrm{mol} \mathrm{m}\) \(\mathrm{m}^{-2} \cdot \mathrm{s}^{-1} \) )과 8시간의 암 상태, 및 \( 26 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도를 유지하여, 7주 후 \(\mathrm{Cd}\)과 각 농도의 질산염에 따른 생장을 비교하였다. 또한 이때의 잎을 채취하여, 이를 엽록소 함량, rubisco와 rubisco activase의 함량과 활성 측정 및 전기영동에 사용하였다.</p><h2>엽록소 함량의 측정</h2><p>Inskeep과 Bloom의 방법에 의해 엽록소 함량을 측정하였다. 담배 잎을 \( 80 \% \) DMF 용액에 넣어 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하루 동안 둔 후, \( 8,000 \times \mathrm{g} \)에서 5분간 원심분리를 하여 상등액을 얻은 다음, \( 664.5 \mathrm{~nm} \)와 \( 647 \mathrm{~nm} \)에서 이들의 흡광도를 측정하였다. 아래의 식을 이용하여 엽록소 a와 b의 함량을 계산하였다.</p><p>Chlorophyll a \( (\mathrm{mg} / \mathrm{g} \) fr. wt.)=12.70 \( \mathrm{A}_{664.5}-2.79 \quad \mathrm{~A}_{647} \)<p>Chlorophyll b \( (\mathrm{mg} / \mathrm{g} \) fr. wt.)=20.70 \( \mathrm{A}_{647}-4.62 \quad \mathrm{~A}_{664.5} \)</p><h2>Rubisco와 rubisco activase의 분리</h2><p>Wang 등의 방법을 이용하여 rubisco와 rubisco activase가 함유된 용액을 분리하였다. 액체 질소를 사용하여 마쇄한 잎 분말에 \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{NaHCO}_{3}\), \(10 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2}\), \(1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.5 \mathrm{mM} \) ATP, \( 10 \mathrm{mM} \) DTT, \( 1 \mathrm{mM} \) PMSF, \( 1 \mathrm{mM} \) benzamidine, \( 10 \mu \mathrm{M} \) Leupeptin, \( 1.5 \% \) PVPP 및 \( 3 \mathrm{mM}\) MBT가 함유된 50\( \mathrm{mM} \) BTP buffer \( (\mathrm{pH} 7.0) \)를 첨가하여 하루 동안 교반한 후, 4겹의 거즈와 1겹의 miracloth로 여과하고 이를 \( 16,000 \mathrm{rpm} \)에서 40분간 원심분리 하였다. 상등액에 분말 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \)를 \( 35 \% \)의 포화 농도가 될 때까지 천천히 가하여 30분간 교반한 후, \( 8,000 \mathrm{rpm} \)에서 8분간 원심분리하여 침전물과 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 분말 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \)를 \( 55 \% \)의 포화 농도가 될 때까지 천천히 가하여 30분간 교반한 다음, \( 8,000 \mathrm{rpm} \) 에서 8분간 원심분리하여 얻어진 침전물에 DBR [\(50 \mathrm{mM}\) Tricine \(( \mathrm{pH} 8.0\)), \(10 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2}\), \(10 \mathrm{mM} \mathrm{NaHCO}_{3}\), \(10 \mathrm{mM}\) DTT, \(2 \mathrm{mM}\) MBT]을 가하고, 여기에 최종 농도가 \( 18 \% \) 가 되게 \( 50 \% \)\( (\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) PEG-10 K을 첨가하여 5분간 교반하였다. \( 8,000 \mathrm{rpm} \)에서 8분간 원심분리하여 얻어진 침전물을 DBR로 다시 현탁한 후, \( 8,000 \mathrm{rpm} \) 에서 8분간 원심분리하였다. 원심분리로 얻어진 상등액을 \( 20 \mathrm{mM}\) BTP \( (\mathrm{pH} 7.2) \), \( 1 \mathrm{M} \mathrm{MgCl}_{2}, 10 \mathrm{mM} \mathrm{NaHCO}_{3} \)로 평형화시킨 Q-Sepharose column상에서 \( 0.15-0.6 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}\) gradient 용액으로 분당 \( 2.5 \mathrm{ml} \) 의 유속으로 \( 6 \mathrm{ml} \) 씩 분획하였다. 가장 높은 rubisco 활성을 가지는 분획을 함량과 활성 측정을 위해 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 저장하였다.</p><p>Rubisco activase는 앞의 \( 35 \%\)\(\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 처리 후, \( 8,000 \mathrm{rpm} \)에서 8분간 원심분리하여 얻어진 침전물에 DBA [20\( \mathrm{mM}\) BTP \( (\mathrm{pH} 7.2) \), 0.2\( \mathrm{mM}\) ATP, 10\(\mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2} \) \(2 \mathrm{mM}\)로 현탁하고, 최종농도가 \( 18 \% \) 가 되게 \( 50 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})\) PEG-10K를 첨가하여 5분간 교반하였다. 교반 후 \( 8,000 \mathrm{rpm} \) 에서 8분간 원심분리하여 얻어진 침전물을 DBA로 현탁하고 \( 10,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리하여 얻어진 상등액과 그 침전물을 다시 DBA로 현탁하고, \( 10,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리후 얻어진 상등액을 합하여 rubisco activase를 분리하기 위한 용액으로 사용하였다. 이를 Q-Sepharose column상에서 \( 0-0.4 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \) gradient 용액으로 분당 \( 1 \mathrm{ml} \)의 유속으로 \( 3 \mathrm{ml} \)씩 분획하였다. 가장 높은 rubisco activase 활성을 가지는 분획을 함량과 활성 측정을 위해 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 저장하였다.</p><p>이 모든 분리 과정은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 수행하였다.</p>
rubisco와 rubisco activase가 함유된 용액을 분리할 때, 액체 질소를 사용하여 마쇄한 잎 분말에 사용되지 않은것은?
0.2\( \mathrm{mM}\) ATP