<h1>재료 및 방법</h1><h2>Coffee 시료 및 커피 추출</h2><p>커피 생두 시료는 콜롬비아산 Coffea arabica var. tipica 품종을 구입하였다. 커피 로스팅 가공은 medium과 dark의 두 수준으로 진행하였다. Medium을 위해서 반열풍식 로스터(Taehwan, Bucheon, Korea)로 \( 210{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분, dark를 위해서 \( 210{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분 간 roasting하였다. 원두를 분쇄하기 위해 커피분쇄기(Melitta, Tokyo, Japan)로 갈아서 분말을 밀폐된 용기에 넣어 건조하고 공기가 잘 통하는 (\( 20\)-\(25^{\circ} \mathrm{C} \)) 암실에 저장하였다.</p></p>일정한 조건에서 커피음료를 추출하기 위해서는 분쇄된 \( 10 \mathrm{~g} \)의 커피를 beaker에 넣고 \( 95{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 증류수 \( 50 \mathrm{~mL} \) 를 가하여 2 분간 교반하면서 커피의 성분을 추출하였다. 추출이 끝나면 커피 고형분을 제거하기 위해 원심분리하여 상층액을 얻었다. 상층액은 액체 크로마토그래피 분석을 위해 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) membrane filter(Millipore, Merck, Darmstadt, Germany)를 통과시켜서 미세 고형물을 제거하였다.</p><h2>지방산의 산화 분석</h2><p>조지방의 추출 및 지방의 산가, 과산화물가 측정은 식품공전의 분석법을 따라 시행하였다.</p><h2>지방의 분석</h2><p>미세하게 간 커피분말 \( 10 \mathrm{~g} \) 을 정확히 달아 무게를 아는 용기에 담아 \(100\)-\( {105 }^{\circ} \mathrm{C} \) 의 건조기에서 1 시간 건조한 후 데시케이터에서 식히고 Soxhlet 추출장치에 diethyl ether 로 \( 60{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 8시간 추출하였다. 추출이 끝나면 ether를 \( 50{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 증발시키고 \( 100{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 약 1 시간 건조 후 용기의 무게를 달아 용기에 남아있는 조지방의 무게를 측정하였다.</p><p>조지방 \( (\%)=( \) 추출된 조지방 무게/시료무게 \( ) \times 100 \)</p><h2>지방 산가</h2><p>지질 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 중화하는데 필요한 \( \mathrm{KOH} \) 의 \( \mathrm{mg} \) 수 즉 시료 중의 유리지방산의 양을 구하기 위해 커피 분말에서 hexane으로 실온에서 추출하고 감압증류기에서 hexane을 분별증류로 제거한 후 얻은 지방시료 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 정밀히 달아 ethanol:ether \( (1: 2) \) 혼액 \( 10\mathrm{mL} \) 를 넣어 녹였다. 커피 지방시료의 암갈색 때문에 \( 1 \% \) 티몰프탈레인/ethanol 용액을 지시약으로 하여 청색이 30초 간 지속할 때까지 \( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{KOH} / \) ethanol 용액으로 적정했다. 적정에 사용된 \( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{KOH} / \mathrm{ethanol} \) 의 부피(a)에서 바탕적정에 사용된 \( 0.1 \mathrm{M} \) \( \mathrm{KOH} / \)ethanol의 부피(b)를 다음의 식을 통해 산가를 계산하였다.</p><p>산가 \( =5.611 \times(\mathrm{a}-\mathrm{b}) \)</p><h2>지방 과산화물가</h2><p>과산화물가, 즉, 유지 \( 1 \mathrm{~kg} \) 에 의하여 \( \mathrm{KI} \)에서 유리되는 I2의 밀리당량수 \( (\mathrm{meq} / \mathrm{kg}) \) 를 측정하기 위해 커피에서 추출한 지방 검체 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 달아 acetic acid:chloroform \( (3: 2)\) \(2.5 \mathrm{~mL} \) 에 약간 가온하여 녹이고 포화 \( \mathrm{KI} \) 용액 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 를 가볍게 흔들어 섞은 다음 어두운 곳에 10 분간 방치하고 물 \( 3 \mathrm{~mL} \) 를 가하여 세게 흔들어 섞은 다음 전분시액 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 를 지시약으로 하여 \( 0.01 \mathrm{M} \) sodium thiosulfate 액으로 적정했다. 적정에 사용된 \( 0.01 \mathrm{M} \) sodium thiosulfate액의 부피(a)에서 바탕적정에 사용된 \( 0.01 \mathrm{M} \) sodium thiosulfate액의 부피(b)로부터 다음의 식을 통해 과산화물가를 계산하였다.</p><p>과산화물가 \( (\mathrm{meq} / \mathrm{kg})=(\mathrm{a}-\mathrm{b}) \times 10 \)</p><h2>CGA의 정량</h2><p>위의 방법으로 분쇄된 커피원두에서 물로 추출한 커피에 추출된 CGA의 조성 및 CGA의 화학적 변화에 의해 형성되는 다른 다른 성분들을 분석하기 위해 전 처리를 수행하였다. 전 처리를 위해서 추출된 커피시료 \( 1 \mathrm{~mL} \) 에 \( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{HCl} \)/ methanol\( : \) chloroform (\( 1: 2)\) \( 2 \mathrm{~mL} \) 을 가하고 실온에서 30 분간 흔들어서 섞어주었다. Chloroform 층을 취하여 원심분리진공건조기에서 말리고 완전히 건조가 이루어지기 전에 시료를 \( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{HCl} / \) methanol \( 0.2 \mathrm{~mL} \) 에 녹였다. 액체크로마토그래피 분석을 위해 \( \mathrm{C} 18 \) column \( (4.6 \times 150 \mathrm{~mm}\), \(5 \mu \mathrm{m}) \) 이 연결된 Agilent 1200LC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)에 시료를 10\( \mu \mathrm{L} \) 주입하고 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 를 유지하면서 이동상으로 \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{HCl} \) : methanol \( (9:1) \)를 \( 1 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) 의 유속에서 분리되는 물질들을 \( 374 \mathrm{~nm} \) 의 파장에서의 흡광도로 측정하였다. CGA의 정량분석을 위해서 CGA 표준품(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{HCl} :\)methanol \( (9:1) \)에 녹여서 측정하여 CGA 의 retention time과 표준곡선을 얻었다.</p><h2>항산화활성의 측정</h2><p>DPPH radical 소거능 활성을 측정하기 위해 Kang 등의 방법과 Katsube 등의 방법을 시료 특성에 맞춰 실시하였다. 커피 추출물을 탈이온수로 연속 희석하여 각 희석농도에서 \( 50 \mu \mathrm{L} \) 씩을 취하여 96-well plate에 넣었다. 여기에 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) \( / 50 \% \) 에탄올 \( 200 \mu \mathrm{L} \) 를 넣고 30분간 실온에서 반응하였다. \( 550 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도 변화를 측정하기 위 해 Multilabel Counter (PerkinElmer, Inc., Wellesley, MA, USA)를 사용하였다. Radical 소거활성을 계산하기 위해 사용한 식이다. Radical 소거활성 \( (\%)=100 \times(\mathrm{A}-\mathrm{B}) / \mathrm{A} \), 여기서 \( \mathrm{A} \) 는 control(시료 없이 측정한 DPPH radicals의 흡광도) 그리고 \( \mathrm{B} \) 는 시료와 반응한 후 radicals의 흡광도이다. 각 시료의 항산화활성 결과는 3반복 실험결과의 평균 \( \pm \mathrm{SD} \) 로 표시하였다.</p><p>\( \mathrm{ABTS}^{+} \)radical 소거능 분석을 위해 먼저 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) 용액을 만들기 위해 \( 5 \mathrm{~mL}\) \( 7 \mathrm{mM} \) ABTS / \(\mathrm{dH}_{2} \mathrm{O} \) 과 \( 80 \mu \mathrm{L}\) \( 2.45 \mathrm{mM} \) potassium persulfate를 함께 넣고 빛을 차단한 상태로 실온에서 12시간 반응하여 ABTS radical cation \( \left(\mathrm{ABTS}^{+}\right) \)을 얻었다. 반응 후 용액의 \( 734 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도가 \( 0.7 \) 이 되도록 ethanol로 희석하였다. \( \mathrm{ABTS}^{+} 1 \mathrm{~mL} \) 를 \( 50 \mu \mathrm{L} \) 의 시료가 들어 있는 유리 튜브에 넣고 30초 간 vortex 하였다. 5분 더 반응 시킨 후 흡광도를 \( 734 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. Radical 소거능 활성도는 시료가 없는 상태에서 측정한 값과 비교하여 변화된 흡광도의 백분율로 계산하였다. 모든 실험에서 각 시료는 3 반복을 하여 측정하였다.</p><p>Antioxidant Response Element (ARE) 활성 분석을 위해 사람의 간세포주인 HepG2에 Antioxidant Response Element (ARE)-luciferase/pGL vector로 transfection하여 얻은 HepG2-ARE cell을 사용하여 luciferase reporter 분석을 진행하였다. 분석을 위하여 먼저 6-well plate에서 sub-confluent하게 된 HepG2-ARE 세포를 \( 0.5 \% \) FBS 조건에서 12시간 동안 serum starvation을 시킨 후 시료를 100 및 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 농도로 12시간 처리하였다. Luciferase activity를 측정하기 위해 Promega사의 luciferase assay kit을 사용하였으며 실험 방법은 kit의 설명서를 따랐다. 즉, 세포를 \( 3 \mathrm{~mL} \) ice cold PBS로 2회 세척한 후 lysis buffer로 세포를 녹여 세포 추출액을 얻고 이 추출액 \( 10 \mu \mathrm{L} \) 를 luciferase 기질용액과 석은 후 TD-20/20 luminometer(Turner Designs, Sunnyvale, CA, USA)로 활성을 측정하였다. 각 측정 값들은 bicinchoninic acid protein assay (Pierce Biotech., Waltham, MA, USA) 방법으로 측정된 단백질 농도를 기준으로 보정하였으며 보정된 값들은 다시 음성대조구로 사용된 vector control에서 얻은 값을 1로 하였을 때 몇 배 증가하였는지 배수로 계산하였으며 양성 대조군으로 \( 5 \mu \mathrm{M} \) Sulforaphane (Sigma-Aldrich)의 luciferase 활성값을 기준으로 다시 보정하였다. 각 결과는 시료당 3회 반복하여 측정한 값 \( \pm \mathrm{SD} \)로 표시하였다.</p><p>커피 추출물의 총 페놀 함량(total polyphenolic content, TPC)측정을 위해 각 커피 추출물의 총 페놀함량은 Folin-Ciocalteu 시약으로 측정하였다. 분석을 위해 \( 1: 10 \) 으로 희석된 시료 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 를 tube에 넣고 여기에 탈이온수에 1:5로 희석한 Folin-Ciocalteu 시약 \( 15 \mu \mathrm{L} \) 를 넣고 섞은 후 실온에서 5분 간 반응시켰다. 이어서 \( 50 \mu \mathrm{L} 10 \% \mathrm{w} / \mathrm{v} \) sodium bicarbonate 용액과 넣어주고 섞은 후 어두운 실온에서 5분 간 반응 후 반응물을 96-well 평판으로 흡광도의 변화를 microplate reader로 \( 593 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 바탕용액으로는 시료를 제외하고 위의 모든 용액이 들어간 것을 사용하였다. TPC의 정량을 위해 gallic acid를 이용한 표준곡선을 얻었으며 이 곡선에서 시료 \( \mathrm{mL} \)당 \( \mathrm{TPC} \) 의 양을 \( \mu \mathrm{g} \) gallic acid의 양으로 환산하였다.</p>
유지 1 kg 에 의하여 KI에서 유리되는 I2의 밀리당량수를 뭐라고 해?
과산화물가