<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>본 연구에서 사용한 황기(A. membranaceus) 및 지치 (L. erythrorhizon)는 충북 제천에서 재배된 것을 구매하여 사용하였다. 표본시료로서 황기(MPS\( 005087 \))와 지치(MPS\( 004961 \))는 국립원예특작과학원 인삼특작부에 보관되어 있다. 세포 배양에 사용한 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) \( 1640 \), fetal bovine serum (FBS), Streptomycin-penicillin은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였으며, LPS와 \( 3 \)-(\( 4,5 \)-Dimethylthiazol-\( 2 \)-yl)-\( 2,5 \)-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Western blot에 사용한 b-actin, proliferating cell nuclear antigen (PCNA)에 대한 \( 1 \)차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사에서 구입하였고, COX-\( 2 \)에 대한 \( 1 \)차 항체는 Abcam (Cambridge, UK) 사에서 구입하였고, iNOS에 대한 \( 1 \) 차 항체는 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA)사에서 구입하였고, p\( 65 \), p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-p\( 38 \), p\( 38 \)에 대한 \( 1 \)차 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며, anti-mouse, anti-rabbit의 \( 2 \)차 항체는 Millipore (Burlington, MA, USA)에서 구입하였다.</p><h2>황기, 지치 복합 추출물(ALM\( 16 \)) 제조</h2><p>황기, 지치 복합 추출물(ALM\( 16 \))의 제조는 이전 연구에서 보고된 방법으로 제조되었다. 간단하게, 황기 및 지치 건재 시료를 조분쇄한 후(직경 \( 0.5 \mathrm{~cm} \) 이하), 황기는 \( 50 \% \) 주정(시료 중량의 \( 15 \)배 용량), 지치는 \( 70 \% \) 주정(시료 중량의 \( 15 \)배 용량)을 이용하여 \( 80^{\circ} \mathrm{C}\), \( 4 \)시간 총 \( 2 \)회 환류추출을 하였다. 각 추출물은 \( 1 \mu \mathrm{m} \) 필터로 여과한 후 감압농축하여 얻어진 황기 추출물 \( (50 \pm 1 \)brix) 및 지치 추출물 \( \left(66 \pm 1\right. \) brix)은 \( 80-90^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 1 \)시간 살균한 후 건조하였다. 황기 추출분말(AM, yield 24%)과 지치 추출분말(LE, yield \( 42 \%) \)은 \( 7:3 \) \( (\mathrm{w} / \mathrm{w}) \)의 비율로 혼합하여 황기, 지치 복합 추출물(ALM\( 16 \))을 제조하였다.</p><h2>세포 배양</h2><p>본 실험에 사용한 RAW\( 264.7 \) 마우스 대식세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, 세포 배양을 위해 \( 10 \% \) FBS 및 \( 100 \) units\(/ \mathrm{mL} \) penicillin G, \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) streptomycin 및 \( 2 \mathrm{mM} \) L-glutamine을 함유한 RPMI \( 1640 \) 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건의 배양기에서 배양하였다.</p><h2>세포독성 측정</h2><p>RAW\( 264.7 \) 세포에 대한 ALM\( 16 \)의 세포독성(cytotoxicity)을 평가하기 위해 MTT assay를 수행하였다. \( 48 \) well plate에 \( 5 \times 10^{5} \)cells/well로 분주하고, \( 12\)시간 배양하였다. ALM \( 16 \)을 \(10, 25, 50,100,200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도로 \( 48 \)시간 동안 처리하였다. 배지를 제거한 후 \( \mathrm{MTT} \) 시약 \( (5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) \)을 첨가하여 \( 1 \)시간 동안 반응시켰다. 형성된 formazan은 \( 200 \mu \mathrm{L} \)의 DMSO를 첨가하여 녹인 후, ELISA microplate reader를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며, 아무것도 처리하지 않은 정상군(control)의 흡광도 값을 기준으로 상대적인 세포 생존율을 비교하였다.</p>
지치 복합 추출물(ALM\( 16 \))의 제조 시 어느 정도의 온도에서 제조를 하는 것이 적당한가?
\( 80^{\circ} \mathrm{C}\)