<h2>Total RNA 추출</h2><p>수확한 마우스 전지방 세포주로부터 Trizol reagent(Invitrogen, USA)를 이용하여 Total RNA를 추출하였다. 그 후 과정은 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. Total RNA추출 후 RNeasy mini kit (Qiagen, USA)을 이용하여 RNA cleanup을 수행하였다. 최종적으로 정제된 total RNA는 NanoQuant Plate\( ^{\mathrm{TM}} \)를 이용하여 정량한 후, oligo DNA 마이크로어레이 실험과 RT-PCR, real-time PCR에 사용하였다.</p><h2>Oligo DNA 마이크로어레이 실험</h2><p>Oligo DNA 마이크로어레이 실험과 데이터 분석은 지노믹트리사(Daejeon, Korea)에 위탁하여 수행하였고, 마이크로어레이 chip은 미국 Microarrays사의 Agilent Mouse whole ge-nome 4 X 44K arrays (Agilent Techonlogies, Palo Alto, USA)를 사용하였다.</p><h2>Polymerase chain reaction (PCR)과 정량적인 real-time PCR</h2><p>합성된 cDNA를 주형으로 하여 유전자 특이적인 oligo primer를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction) 과정을 수행하였다. PCR에 사용된 primer의 종류와 서열은 Table 1과같다. GAPDH 유전자는 internal control로서 사용하였다. RT-PCR은 PrimeScript\( ^{\mathrm{TM}} \) RT-PCR Kit (TaKaRa, Japan)을 이용하였으며, 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 정량적인 real-time PCR은 ABI Prism 7500 cycler (Applied Biosystem,USA)를 이용하여 수행하였다. Primer는 Table 1과 같고, 각각의 Tm 값은 Primer express 1.5 software program (AppliedBiosystems, USA)을 이용하여 확인하였다. 주형으로 사용하는 cDNA는 RT-PCR시 수행한 과정과 같은 방법으로 합성하고, 합성된 cDNA에 RNase-free water \(60 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 희석한 후 사용하였다. 반응 조건은 첫 번째 단계로 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시키고, 두 번째 단계로 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15초, \( 54^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 33초의 cycle을 40번 반복하여 수행하였다. 결과는 ABI Prism 7500 SDS software program(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 분석, 정량 하였으며 분석법으로는 comparative Ct (threshold cycle) method를 이용하였다. Relative quantification (RQ) 값은 control에 대한 sample의 상대적 유전자 발현 값으로 나타내었다.</p><h2>Sirtuin-1 siRNA transfection</h2><p>Sirtuin-1 small interfering RNA (siRNA) construct은 Bioneer사(Daejeon, Korea)에서 제공해주는 프로그램으로 디자인 한 것을 구입하였다. 전지방 세포를 분화하기 전에 Lipofectamine\( ^{\mathrm{TM}} \) 2000 (Invitrogen, USA)을 이용하여 sirtuin-1siRNA 혹은 negative control siRNA construct을 transfection하였다. Transfection과정은 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였으며, 24시간 동안 transfection시킨 후 DMSO 혹은 \( 50 \mu \mathrm{M} \)의 genistein을 처리하여 다시 24시간 동안 배양시킨 후분화를 유도하거나, total RNA를 추출하였다.</p>
RNA cleanup 수행에 사용된 것은 뭐야?
RNeasy mini kit