<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험동물 및 식이 방법</h2><p>실험동물은 8주령 Sprague-Dawley (SD)계 암컷 흰쥐(rat)를 사용하였다. 모든 실험동물은 H대학 동물실험윤리위원회로부터 승인(HY-IACUC -10-026)을 받은 후 SPF된 실험동물실에서 사육되었다. 1주간의 적응기를 거친 후 난소절제 수술을 하였고, 2주간의 회복기를 거친 후 본 실험을 시작하였다. 실험 집단은 총 3집단으로 나누어 분류하였으며, 한 집단에 4마리씩 각각 다음과 같이 group을 배정하였다. (1) General diet group (C group), (2) High fat diet (H group) (3) High fat diet + Exercise group (H+EX group)으로 7주 동안 식이와 물은 자유롭게 섭취하였고, 고지방식이는 아래 Table 1과 같다.</p><h2>운동방법</h2><p>운동방법은 Melton 등[23]의 수영훈련방법을 인용하였으며, 운동군들은 수심 \( 70 \mathrm{~cm} \), 수온 31-33 \( { }^{\circ} \mathrm{C} \)의 실험동물용 수조에서 첫 1주 동안 5-40분까지 시간을 점진적으로 증가시켜 수영훈련 적응기를 거쳤다. 본 운동은 동시간대 (am 10:00) 규칙적으로 실시하였으며, 주당 5일 총 6주간 실시하였고, 4주까지는 60분씩, 5~6주는 유산소성 트레이닝 효과를 확실하게 수행하기 위하여 75분씩 실시하였다. 이러한 수영방법은 무부하상태에서 자유롭게 수영하도록 하였고, 이들 수영운동의 강도는 중등도(최대산소섭취량 \( 60 \% \) 해당)에 해당되는 것으로 알려져 있으며, 운동직후 실험동물의 체온감소를 예방하기 위해 마른수건과 헤어드라이기를 즉시 이용하여 물기를 제거한 후 사육실로 옮겨졌다.</p><h2>조직채취</h2><p>수영운동은 희생 24시간 전부터 중단하였고, 식이는 12시간 전부터 절식하였으며, 물만 공급하였다. 실험종료일에는 혼합마취액(Rumpun:Zoletil=1:1 비율로 혼합)으로 마취한 후 하복부의 피부를 박리한 후 서혜부(lingunal region)에 있는 모든 지방을 적출하여 미세저울(microsclae: OHAUS Corp,AR2140, USA)로 무게를 측정한 후 염색용과 지방세포분리용으로 구분하여 나누었다.</p><h2>지방세포분리 방법</h2><p>서혜부지방조직에서 지방세포를 분리하기 위해 Gómez-Ruiz 등의 방법을 인용하였다. 채취한 지방조직은 2분간 가위로 잘게 자른 후 준비된 \(3\%\) bovine serum albumin을 함유한 Krebs-Ringer bicarbonate (KRBA) buffer (Sigma-Aldrich, USA) \( 1 \mathrm{ml} \)와 collagenase type II ( \( 1.25 \mathrm{~g} / \mathrm{ml} \), Sigma-Aldrich, USA)를 함께 혼합한 용액 속에 작게 분쇄된 조직을 넣은 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에 넣고 60분간 수시로 흔들어 주면서 분해시켰다. 이후 \( 100 \mu \mathrm{m} \) 나일론 여과지(mesh filter, BD bioscience, USA)를 이용하여 불순물들을 제거하였고, 200x g에서 1분간 원심분리하여 지방세포 등을 모은 후 KRBA buffer \( 15 \mathrm{ml} \) 로 3회 세척한 후 다시 원심분리하여 상층액은 제거하였으며, 하부에 모아진 지방세포들은 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에서 사용할 때까지 보관하였다.</p><h2>RT-PCR</h2><p>분리된 지방세포에 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, USA)을 넣고 균질화하였다. 튜브 \( 1 \mathrm{ml} \) 당 \( 200 \mu\mathrm{l} \)의 chloroform을 첨가한 후 힘차게 흔들어 준 다음 실온에서 5분간 반응시킨 후 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 원심분리(12500x g)하고, RNA를 분리하였다. 각 군별 total RNA를 정량하기 위해 Smartspec \( { }^{\mathrm{TM}} \) Plus spectrophotometer (Bio RAD, USA)를 이용하여 측정하였다. RNA 역전사(reverse transcription)를 반응시키기 위해 total RNA \( 5 \mu \mathrm{g} \) 을 DEPC, 10mMdNTI, Oligo (dT)를 첨가하여 PCR 기계(T 3000 Thermocycler, Biometra; Germany)로 반응시켜 cDNA를 얻어내었다. 지방 세포에서 발현되는 유전자들의 염기서열과 반응조건은 Table 2와 같이 수행하였고, PCR 반응산물은 \( 2 \% \) agarose gel에서 \( 100 \mathrm{~V} \)로 전기 영동하여 UV transilluminator로 사진을 찍은 후 mRNA의 발현 정도를 Gel doc 2000 (Bio red; ITALY)을 이용하여 농도를 측정하였다.</p><h2>면역조직화학염색</h2><p>염색용 지방조직은 \( 4 \% \) paraformaldehyde, \( 0.1 \% \) glutaraldehyde와 0.1M phosphate buffer saline (PBS) 으로 혼합된 고정액으로 실온에서 12시간 고정하였으며, 이후 \( 30 \% \) sucrose에서 7일간 냉장 보관하였다. 냉동절편기(Leica, Germany)를 이용하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 지방조직을 \( 20 ~\mu \mathrm{m} \) 두께로 절편을 제작한 후 0.1M PBS로 세척하고 \( 10 \% \) normal donkey serum (NDS)으로 40분간 실온에서 반응시켰다. 이후 1차 항체인 Mitochondria Marker (Abcam, CB, UK)를 1:300으로 희석하여 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 반응시켰다. 이어서 0.1M PBS로 3회 5분간 세척한 후 \( 2 \% \) NDS로 15분간 실온에서 처리한 후 Cy3-conjugated affinipure donkey anti-IgG (1:200, Invitrogen, USA)를 사용하여 3시간 반응시킨 다음 0.1M PBS로 3회 5분간 다시 세척한 후 microscope slides (Fisher Scientific)에 mounting medium (Vectashield, Vector Lab, USA)과 커버슬라이드로 봉입하고 형광현미경(Leica TCS, Wetzlaar, Germany)으로 관찰하였다.</p><h2>자료처리방법</h2><p>이 연구에서 얻어진 모든 결과는 SPSS/PC 11.0 통계 프로그램을 이용하여, 각 변인에 대한 기술통계치(mean\(\pm\)SD)를 산출하고 집단 간 변인의 차이를 확인하기 위해 일원변량분석을 실시하였으며 집단 간 유의한 차이가 있을 경우 LSD (least significant difference)를 이용하여 사후검증을 실시하였다. 유의 기준은 \( a=0.05 \) 수준으로 설정하였다.</p>
본 실험에서 사용한 흰쥐의 조건은 무엇인가?
8주령 Sprague-Dawley (SD)계 암컷