<h2>CPT를 투여한 HL-60 세포의 핵 추출물에서 ATP에 의한 Topo I 활성의 변화</h2><p>세포에서 CPT가 Topo I 활성에 미치는 효과를 관찰하기 위하여 HL-60세포에 CPT를 세군 (\( 0, 0.05 \mu \mathrm{M}, 0.4 \mu \mathrm{M} \))으로 나누어 투여하고 48시간 후에 앞의 방법에 따라 핵 추출물을 얻어 ATP 첨가군과 첨가하지 않은 군에서 Topo I 활성을 측정하였다. 또한 세포에 들어간 약물의 유무를 확인하기 위하여 각 군의 핵 추출물을 \( 370 \mathrm{~nm} \) 의 excitation 파장으로 고정하고 emission파장에서 scan하였다.</p><h2>RT-PCR법에 의한 c-myc과 Topo I의 mRNA 정량</h2><p>total RNA purification kit를 사용하여 CPT를 투여한 HL-60세포로부터 RNA를 겅제하고 MLV reverse tran-scriptase를 사용하여 cDNA를 합성한 후 Wong등의 primer-dropping 방법을 이영하여 CDNA와 c-myc exon 2 또는 Topo I primer 1조 (Table 1 참조)를 첨가하여 PCR을 7 cycle 진행한 후 \( \beta \)-actin primer 1 조 (Table 1 참조)를 추가하여 17 cycle 진행시켰다. PCR 반응온도는 1 단계는 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 분간 변성시키고, \( 57^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분간 annealing한 후, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 1분간 중합시키고, 2 단계에서는 95 1 분, \( 57^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 72{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 1분 씩 c-myc과 Topo I은 23 cycle, \( \beta \)-actin은 17 cycle씩 반응시킨 후 \( 1.2 \% \) agarose gel상에 \( 4 \mathrm{~V} / \mathrm{cm} \) 로 전기 영동하여 c-myc과 Topo I의 mRNA양을 비교 분석하였다.</p><h2>Northern blot hybridization에 의한 Topo I 유전자 발현 분석</h2><p>HL-60세포에서 CPT 투여에 의해 Topo I과 c-myc 유전자의 발현이 조절되는지 확인하기 위하여 세포로부터 정제한 총 RNA \( 20 \mu \mathrm{g} \) 을 \( 1 \% \) formaldehyde-agarose gel상에 \(4 \mathrm{V} / \mathrm{cmas}\) 전기영동하고 TransVac (Hoefer Co.)에서 20 X SSC 용액을 시용하여 nylon membrane (Hybond \( \mathrm{N}+ \) )에 이동시켰으며, nylon membrane을 실온에서 충분히 말린 후 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 고정하여 hybridization을 실시하였다. hy-bridization에 필요한 probe는 Topo I primer 또는 c-mycexon 2 primer 1조(Table 1 참조)를 사용하여 각각 HL-60세포에서 정제한 DNA와 pHSRI DNA를 기질로 하여 Topo I과 c-myc 유전자 절편을 PCR법으로 합성하였다. 반응온도는 1 단계는 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 변성시키고, \( 57^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분 간 annealing한 후, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 1분간 중합시키고, 2 단계에서는 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 57^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 1분 씩 연속 30회 반응시켰고 3 단계는 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 57 ^{\circ}\mathrm{C} \) 1분, \( 72 ^{\circ}\mathrm{C} \) 10분간 실시하여 증폭한 후 전기영동하여 PCR 산물올 전기용출 방법으로 분리하였고 \( \alpha-{ }^{32} \mathrm{P} \)-dCTP를 Rediprime labeling kit (Amersham Co.)로 표지시켜 probe로 사용하였다. hybridization은 \(42 { }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 hybridization 용액 \( 50 \% \) formamide, \( 0.5 \% \) SDS, 6xSSC, 0.05xBLOTTO)으로 prehybridization한 후 probe를 포함한 hybridization 용액에 넣어 24시간 동안 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 hybridize하였고 Hyperfilm MP (Amersham)를 사용하여 autoradiography하였다.</p>
CPT를 투여한 HL-60세포로부터 RNA를 정제하기 위해 total RNA purification kit를 사용했어?
YES