<h1>재료 및 방법</h1><h2>토마토 표준 유전체 및 SRA data 수집</h2><p>토마토 표준 유전체(reference genome)는 SGN (ftp://ftp.solgenomics.net/)에서 수집한 Solanum lycopersicum Heinz 1706(ITAG2.4 버전)을 사용하였다(Bombarely et al. 2011). 최근ITAG4.0의 개선된 표준 유전체 정보가 공개되었으나 기존에 분석되어진 계통과 정확한 비교를 위해 동일한 ITAG2.4버전을 사용하였다. 표준 유전체는 12개 염색체(chromosome)와 12개 염색체 중 어느 하나의 염색체로 자리 잡지 못한scaffold 염기서열들을 묶은 1개의 기타 그룹으로 구성된 총13개의 염색체, 서열 총 길이 781,666,411 bp로 구성되었다.NCBI의 SRA (Sequence Read Archive) 데이터베이스에 축적된 약 800여개 토마토 SRA 정보를 수집하였으며 염기서열길이는 총 7.8 Tbp이다. 이 중 연구 및 분석에 사용 가능한 형태의 염기서열 데이터로 토마토 234개 계통의 염기서열 데이터를 선정하였다(Lin et al. 2014). 수집된 토마토 SRA 중 재배종으로 가장 많이 이용되고 있는 Solanum lycopersicum 126계통을 선택하였고, 현 재배종과 유사하다고 알려져 있는Solanum lycopersicum var. cerasiforme 68계통, 육종과정에서빈번이 활용되는 Solanum pimpinellifolium 33계통을 기본으로 하여 일부의 야생종 토마토 계통을 분석에 포함하였다(Table 1).</p><h2>Genome-wide SNP 분석</h2><p>수집한 토마토 234개 계통 별 유전체 염기서열 데이터의 품질을 측정하고, 기준 품질 이상의 염기서열만을 선발(qualityfiltering) 하는 가공 작업을 SolexaQA package (v. 1.13)를 이용하여 수행하였다(Cox et al. 2010). 품질 측정의 기준 값은phred score 20 이상, 최소길이 25bp 이상으로 적용하였다. 품질 기준을 통과한 토마토 염기서열들은 BWA (Burrows-Wheeler Aligner; v0.6.1-r104)를 이용하여 토마토 표준 유전체기준으로 정렬(alignment)을 수행하였다(Li and Durbin 2009).프로그램 수행을 위한 옵션값으로는 mismatch 최대 2개,seed length 27 bp 설정 외에 기본값(default)을 적용하였다. 토마토 각 계통의 표준 유전체로의 염기서열 정렬 결과를SAMtools (v0.1.16) 프로그램을 이용하여 유전체 전반적으로 발생한 대량의 SNP를 탐색하였다(Kim et al. 2014; Li et al.2009). SAMtools 프로그램의 옵션은 대부분 기본 값(default)을 적용하였고, 정확도 높은 SNP를 선발하기 위해 정렬 품질(alignment quality) 값을 기본 값인 25보다 높은 30으로 적용하고, 적어도 3개 이상의 원 서열(raw reads; 염기서열을 구성하는 짧은 단편서열)이 정렬된 위치에서 추출된 SNP만을선발하였다. 토마토 234개 계통의 각각의 SNP 발생 정보를통합하여 매트릭스(matrix) 형태로 염색체 번호, 위치 정보,표준유전체의 염기서열을 포함하여 SNP 정보를 정리하였다.</p><h2>토마토 유전자 haplotype 분석</h2><p>유전자 단위의 haplotype을 분석하기 위해 SNP 매트릭스가 제공하는 SNP position 정보와 토마토 표준 유전체의 physical position 정보를 이용해 유전자 내에 발생한 SNP를 분류하였 다. SNP 정제는 토마토 계통 간 같은 유형의 SNP 빈도(MAF) 가 \( 5 \% \) 이상, 원 서열 정렬 개수(read depth)가 5 개 이상, 염기서열이 결손 된 계통이 \( 30 \% \) 이하의 선발 기준을 만족하는 SNP 를 선발하였다. 정제된 SNP로 234계통의 SNP를 유전자별로 구분하여 multiple alignment와 phylogenetic tree 분석을 통하여 haplotype 분석을 진행하였다. Haplotype은 multiplealignment의 결과의 거리 차를 이용해 구분하였으며 표준유전체와 같은 그룹으로 묶인 경우를 'type 1'으로 분류하였다. 그룹 내 묶인 accession 수가 많은 순서로 이름을 명명하였다.</p><p>SNP를 다음 대상으로 선발하였다. 웹 데이터베이스를 구축 할 때 non-synonymous SNP가 미치는 아미노산의 변화 정보 를 제공하였다.</p><h2>토마토 계동 간 LD 분석</h2><p>토마토 계통 간 SNP matrix를 이용하여 염색체 별로 LD 분석 을 실시하였다. LD 분석에는 Broad Institute의 Barrett Jeffrey 팀에서 개발한 Haploview 프로그램을 도입하여 이용하였다 (Barrett 2009). 프로그램이 가지고 있는 사용가능한 마커 수 의 제한을 극복하기 위하여 Solamum lycopersicum 그룹과 Solamum pimpinellifolium 그룹 간 LD 분포 유형을 염색체 수 준에서 조사하되, LD 분석 시 MAF \( 20 \% \) 이상을 만족하는 SNP를 \( 1 \mathrm{~kb} \) 에서 \( 10 \mathrm{~kb} \) 의 window size 당 1 개 혹은 2 개를 선발하였다.</p><h2>Web database 구축</h2><p>SRA 234계통 유래의 SNP는 MySQL을 통해 데이터베이스로 구축하였고, web coding에는 php 언어를 활용하였다. 활용도 를 높이기 위해 기존에 구축하여 공개한 TGsol (http://tgsol. seeders.co.kr/) 웹 사이트와 연계하였다(Choe et al. 2018). 사이 트 내 SNP, haplotype 및 tag-SNP는genome browser에서 탐색 할 수 있도록 구현하였다. 필요에 따른 분석 대상 선택을 위 해 234계통은 선택 옵션을 두었고, 선택된 계통을 이용하여 multiple alignment 및 phylogenetic tree를 분석할 수 있게 구현하였다.</p>
토마토 계통의 SNP 발생 정보를 어떠한 형태로 정리하였는가?
매트릭스