<h1>재료 및 방법</h1><h2>길항세균의 분리</h2><p>잎들깨 재배지로부터 병징을 나타내는 식물체와 정상 식물체, 그리고 토양을 채취하여 길항균분리의 시료로 사용하였다. 식물체 줄기와 잎의 절편과 토양을 멸균증류수로 \( 10^{-1} \) \( \sim 10^{-9} \) 까지 희석하는 material dilution agar methods로 Potato Dextrose Agar (PDA, Difco, USA)와 Nutrient Agar plate (NA, Difco, USA)에 배양 \( \left(30^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 하먼서 근접 미생물의 생육을 저해시키는 수종의 곰팡이와 세균을 1 차 분리하였다. 그 중 균핵균에 항균활성이 큰 균주를 AB02 균주로 명명하고 단일 colony가 얻어질 때까지 NA배지로 계대배양을 하면서 순수 분리하여 실험에 이용했다. 분리한 균주는 항균력 검정 및 동정을 위하여 계대배양과 냉동보존으로 유지◦보존하였다.</p><h2>길항세균의 항균 스펙트럼</h2><p>순수 분리한 AB02 균주를 이용해 잎들깨 재배에 피해를 많이 주는 주요병원균, 잿빛곰팡이 병원균인 B. cinerea, 균핵병원균인 S. sclerotiorum, 모잘록병원균인 Pythium ultimum, 줄기썩음병원균인 Rhizoctonia solani 및 시들음병원균인 Fusarium oxysporum 등에 대해 PDA plate 대치배양법으로 항균력을 조사하였다. 배지는 1/5 strength PDA로 각 병원균과 AB02 균주를 동시에 접종하여 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1-6일간 배양한 후 저해 정도를 측정하여 항균 스펙트럼을 조사하였다.</p><h2>길항세균의 생육 특성</h2><p>길항균의 생육곡선을 조사하기 위하여 AB02 균주를 BHI 배지(Brain Heart Infusion, Difco, USA)에서 24시간 동안 전 배양을 한 다음 NB배지에 본 배양을 하면서 \( 660 \mathrm{~nm} \) 에서 36시간 동안 흡광도를 측정했다. 초기 5시간은 매시간 측정을 하고, 그 이후에는 30 분마다 흡광도를 측정했다.</p><h2>병발생의 억제와 방제 효과</h2><p>병발생의 억제효과는 잎들깨의 식물체와 pot에 길항균을 먼저 처리하고, 균핵병원균은 주기적으로 처리하여 균핵병의 발생을 관찰하였다. 병발생은 잎과 입병에 병반의 형성과 식물체의 고사로서 판정하였고, 병발생의 억제와 방제효과는 김 등의 보고된 방법을 토대로 실시하였다. AB02 균주를 NB에 22 시간 진탕배양하여 \( 10^{6} \mathrm{cfu} / \mathrm{ml} \) 이 되도록 현탁액을 조제하여 6엽기의 잎들깨 \( 30 \mathrm{ml} / \mathrm{pot} \) 씩 처리를 하였다. 길항균을 먼저 처리하고, PDA에서 7일간 배양한 균핵병원균 S. sclerotiorum은 pot에 접종하여 병 발생의 여부로 억제효과를 검정했다. 방제효과는 S. sclerotiorum을 PDA에서 7일간 배양한 균사 절편을 잎들깨의 식물체에 먼저 접종하여 발병시킨 다음, 길항균 AB02 균주를 1일 간격으로 3 일 동안 처리하여 병 발생 방제효과를 검정하였다.</p><h2>길항세균의 들깨 생육 촉진 효과</h2><p>길항균 AB02 균주를 이용한 병 억제와 방제효과 검정실험에서 control보다 길항균만을 처리한 처리구에서 잎들깨의 생육이 촉진되는 현상이 나타남으로써, AB02 균주가 잎들깨 생육에 미치는 영향을 조사하였다. 잎들깨 종자를 발아를 시키고 유묘까지 생육이 일정한 것을 선택하여 검정 pot에 이식을 하고 10일 후에 길항균 AB02 균주를 \( 1 \times 10^{6} \mathrm{cfu} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 조절한 후 엽면살포의 방법으로 길항균을 처리하였으며, 생육은 growth chamber를 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 로 16 시간, \( 15^{\circ} \mathrm{C} \) 로 8시간의 주기로 온도와 광을 조절하며 식물체를 관리했다. 식물의 생육조사는 길항균의 엽면살포 25 일 후에 실시하였다.</p><h2>길항세균의 동정</h2><p>분리한 AB02를 동정하기 위하여 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology를 이용하여 생리, 생화학적인 특성을 조사하였고, 분자유전학적 분류를 위하여 genomic DNA를 추출하여 PCR을 수행하여 증폭시키고, 자동염기서열분석기(ABI 377, Perkin Elmer Biosystems Co., USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI의 등록 염기서열과 비교하여 분석하였다.</p>
잎들깨 재배에 피해를 많이 주는 주요병원균의 향균력을 조사하기 위해 사용한 방법은 무엇인가?
PDA plate 대치배양법