<h1>2. 재료 및 방법</h1><h2>2.1 식종 슬러지 및 배지 조성</h2><p>본 실험에 사용된 식종 슬러지는 경남 창원시 봉암갯벌에서 채취하였다. 봉암갯벌은 산업단지 및 공장과 지리적으로 가까워 다양한 공업용 폐수에 노출되어 있으며, 다른 갯벌에 비해 철 \( (\mathrm{Fe}) \) 과 같은 금속 농도가 상대적으로 높은 것으로 알려져 있다. 채취된 슬러지는 사용 전까지 밀폐용기에 담아 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 냉장고에 보관하였다. 생물전기화학 배양을 위해 \( \operatorname{Im} \) 등이 제안한 무기염 영양배지를 사용하였다. 주요 배지성분은 \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}(1.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L})\), \(\mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}(2.9 \mathrm{~g} / \mathrm{L}) \), \( \mathrm{NaHCO}_{3}(2.0 \mathrm{~g} / \mathrm{L})\), \(\mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl}(0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L})\), \(\mathrm{MgCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}(0.09 \) \( \mathrm{g} / \mathrm{L}), \mathrm{CaCl}_{2} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}(0.0225 \mathrm{~g} / \mathrm{L}) \) 이며, Wolfe's mineral solution과 Wolfe's vitamin solution을 각각 \( 20 \mathrm{mL} / \mathrm{L} \) 씩 첨가하였다. 최종 배양배지는 HCl 용액으로 \( \mathrm{pH} \) 를 \(7\) 로 맞춘 후 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) 멤브레인으로 여과하여 사용하였다. \( \mathrm{N}_{2}: \mathrm{CO}_{2}: \mathrm{H}_{2}(72: 20: 8, \mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 혼합가스 상태의 혐기성 챔버(Vinyl anaerobic chamber type-B, Coylab, USA)에서 영양배지 \( 10 \mathrm{mL} \) 에 \( 5 \mathrm{g} \) 의 슬러지 시료를 충분히 혼합하였다. \(15\)분간 정치 후 상등액 \( 10 \mathrm{~mL} \) 을 \(1\)회용 멸균주사기로 생물전기화학반응기에 \( 0.02 \mathrm{OD} \) (Optical density) 수준으로 접종하였다.</p><h2>2.2 생물전기화학 반응기 및 배양조건</h2><p>본 연구에서는 두개의 \( 250 \mathrm{~mL} \) Pyrex 재질 유리 반응기로 구성된 H-형태 이실형 생물전기화학 반응시스템(H}-type two-chambered bioelectrochemical system)을 사용하였다. 두 반응기는 부착된 연결관을 통해 양이온교환막(Cation exchange membrane, CEM; \( 50 \mathrm{mm} \times 50 \)\( \mathrm{mm}\); FKS-PE T-\(130\), FuMA-Tech, Germany)과 고정 집게로 연결하였다. 환원전극은 graphite felt(높이 \( 50 \mathrm{~mm} \), 넓이 \( 50 \mathrm{~mm} \), 두께 \( 5 \mathrm{~mm}\) ;GF-\(20\)-\(5\)F, Nippon Carbon, Japan)를, 산화전극으로 carbon rod 길이 \( 50 \mathrm{~mm} \), 직경 5\( \mathrm{mm} \); JC4, Ceramaterials, USA)와 \( 50 \mathrm{~g} \) carbon granule (직경 \(2-5 \mathrm{mm}\))을 동시에 사용하였다. 전압인가를 위해 산화 및 환원 전극에 티타늄와이어 \( (90 \mathrm{~mm} \), 직경 \( 1.6 \mathrm{~mm} \); Ti R/B Gr\(2\), Seoul Titanium CO., Korea)를 전도성 접착제 (Silver paste, CANS, Japan)로 부착하였다. 기준 전극으로 \( 3 \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{NaCl} \) 이 포화된 \( \mathrm{Ag} / \mathrm{AgCl} \) 전극 \( (\mathrm{RE}-5 \mathrm{~B} \), BASI, USA)을 환원전극 반응기에 설치하였다.</p><p>산화전극 및 환원전극 반응기(각 \( 250 \mathrm{mL}) \) 의 작용부피 (Working vol.)는 \( 200 \mathrm{~mL} \) 로 동일하였고, 앞서 언급한 영양배지를 공급하였다. \( \mathrm{CO}_{2} \) 로부터 메탄을 생성하는 메탄생성균(Methanogenic bacteria)의 생성을 억제하기 위해 \(5 \mathrm{mM} \) 의 \(2\)-bromoethanesulfonate를 환원전극 반응기에 첨가하였다. 환원전극 반응기에는 무기탄소원 \( \mathrm{CO}_{2} \) 공급을 위해 \( \mathrm{CO}_{2}: \mathrm{N}_{2}(40: 60, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 조성의 혼합가스를 \(40 \mathrm{mL} / \mathrm{min} \) 으로 연속적으로 공급하였다. 미생물의 전기환원 활성을 저해할 수 있는 미량 산소를 제거하기 위해 혼합가스는 \( 300^{\circ} \mathrm{C} \) heating mantle(MS-EB, Misung Scientific co, Korea)에 설치한 구리입자(Copper granule, Junsei, Japan) 함유 유리관으로 통과시켰다. 산화전극 반응기에는 환원전극 반응기와 동일하게 \( 40 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) 으로 \( \mathrm{N}_{2} \) 가스 (\(99.9\%\))를 연속적으로 공급하였다.</p><p>전압은 전위기변기(Potentiostat; WMPG-1000, Wonatech, Korea)를 사용하여 \( -0.7 \sim-1.1 \mathrm{~V}(\mathrm{vs} . \mathrm{Ag} / \mathrm{AgCl} \) 전극 \( ) \) 범위로 조절하였다. 환원전극 반응기는 원활한 영양분 혼합을 위해 자석교반기(IKA color squid, IKA, Germany)와 마그네틱 바로 \( 200 \mathrm{rpm} \) 에서 교반하였다. 산화전극 반응기는 별도로 교반을 하지 않았다. 모든 생물전기화학 반응실험은 항온실 \( \left(28 \sim 30^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 에서 진행하였다.</p><h2>2.3 분석방법</h2><p>균체성장 및 \( \mathrm{CO}_{2} \) 전환 대사산물 분석을 위해 \( 1 \sim 3 \) 일 간격으로 환원전극 반응기의 샘플링 포트를 통해 시료를 \(1 \mathrm{mL} \) 일회용 멸균주사기로 채취하였다. 균체농도는 UV-Vis 분광광도계(UV-Vis spectrophotometer; Optizen \(3220\)UV, Mecasys, Korea)를 사용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도(Absorbance)로 측정하였다. 대사산물(유기산과 알코올)은 배양액을 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) 주사기필터(CA-CN, QingFeng Filter Equipment Co, China)로 여과한 후 DAD (Diode array detector)와 \( \mathrm{RID} \) (Refractive index detector)가 설치된 고성능 액체크로마토그래프(High-performance liquid chromatograph, HPLC; Agilent \(1100\), Agilent Inc, USA)로 분석하였다. 분석칼럼은 Aminex HPX - \(87 \)H ion exclusion column \( (300 \mathrm{~mm} \times 7.8 \mathrm{~mm}) \) 이었고, 이동상은 \( 2.5 \mathrm{mM} \) 황산용액을 사-용하였다. 칼럼온도 및 주입부피는 각각 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 10 \mu l \) 이었다.</p>
혼합가스 상태의 혐기성 챔버에서 영양배지 \( 10 \mathrm{mL} \) 에 얼만큼의 슬러지 시료를 첨가하였니?
\( 5 \mathrm{g} \)