<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료 및 시약</h2><p>사용된 효소는 subtilisin (Fluka, Switzerland)이었고, 저해제 반응에 사용된 발색시약은 ninhydirn (Lancaster, England)이었으며, 그 외 사용된 모든 시약은 특급 혹은 분석용 시약이었다.</p><h2>균주 분리 및 배양</h2><p>우리나라의 남해안 전역에서 채집(2005년 1월)한 해수, 해조류, 침전물 및 갯벌을 alkaline protease inhibitor를 생산하는 방선균의 분리시료로 사용하였다. 채집한 각종 시료들은 멸균된 해수에 희석하여 방선균 및 해양미생물 선택 평판배지(Table 1)에 도말하여 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4\(\sim\)6주 동안 배양하였다. 형성된 집락 중 방선균 단일 colony를 선별한 후, 반복 도말법으로 순수분리하였다. 순수분리된 각 균주를 기본배지에서 배양한 후, 회수된 배양 상층액 \( 10 \mu \mathrm{l} \)를 subtilisin 용액(0.1\( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) in \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \(\mathrm{pH} \) 7.5) \( 10 \mu \mathrm{l} \)와 흔합하여 paper disk법으로 gelatin이 함유된 기본평판배지에서 clear zone형성을 억제하는 균주를 선별하였다. 기본배지로는 인공해수(1 1 당 \( \mathrm{NaCl} 23.0 \mathrm{~g}, \mathrm{KCl} 0.7 \mathrm{~g}, \mathrm{MgCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 10.6 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{CaCl}_{2} 1.1 \mathrm{~g}, \mathrm{Na}_{2} \mathrm{SO}_{4} 3.9 \mathrm{~g}, \mathrm{NaHCO}_{3} 0.2 \mathrm{~g} \), \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} 1.0 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 0.01 \mathrm{~g} \), Trizma base \( 6.05 \mathrm{~g} \) )를 이용하여 조제된 Bennet's 배지(glucose \( 10.0 \mathrm{~g} \), peptone \( 1.0 \mathrm{~g} \), yeast extract\( 1.0 \mathrm{~g} \), beef extract \( 1.0 \mathrm{~g}, \mathrm{pH} \) 7.5)를 사용하였다. 전배양은 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 180 \mathrm{rpm} \)에서 3일 동안 진탕배양하였으며, 본배양은 전배양액 \( 1.0 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)를 접종하여 동일한 조건에서 4일 동안 진탕배양하였다.</p><h2>분리균주의 동정</h2><p>분리 선별한 균주의 1차 동정은 형태학적, 배양적 및 생화학적 특성을 조사하여 실시하였으며, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology의 분류 방법에 따라 분석하였다. 분리균주의 형태는 scanning electron microscope(HITACHI S-2400, Japan)을 이용하여 관찰하였다.</p><p>분리균주를 보다 정확하게 동정하기 위하여 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다. Wizard Genomic DNA Prep. kit(Promega)를 사용하여 분리균주의 chromosomal DNA를 분리하였으며, 분리한 DNA를 주형으로 polymerase chain re-action (PCR)을 수행하였다. 이때 사용된 primer는 forward primer (27F, 5\({}^{\prime}\)-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3\({}^{\prime}\) 및 re-verse primer (1492R; \( 5^{\prime} \)-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3\({}^{\prime}\)이었다. 각 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) primer, \( 200 \mu \mathrm{M} \) deoxynucleoside triphos-phate, \( 10 \times \) PCR buffer \( 10 \mu \mathrm{l} \), 그리고 \( 0.3 \mu \mathrm{l} \) EF-Taq polymer-ase (2.5 unit)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 30 cy-cles \( \left(95^{\circ} \mathrm{C}\right. \)에서 \( 20 \mathrm{sec}, 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 40 \mathrm{sec}, 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( \left.90 \mathrm{sec}\right) \) 동안 증폭하였으며, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 3 \mathrm{~min} \)동안 신장시켰다. PCR 산물을 Wizard SV Gel과 PCR clean-up system (Promega)을 사용하여 추출하였다. Big Dye Terminator Cycle Sequence kit (Applied Biosystems, USA)와 automatic DNA se-quencer (Applied Biosystems)를 사용하여 PCR product의 염기 서열 분석을 수행하였다.</p><h2>종족 계통적 분석</h2><p>16S rDNA의 염기서열 분석을 통하여 얻어진 분리균주의 부분 염기서열은 Blast network service를 이용하여 GenBank에 등록된 다른 균주의 염기서열과 비교함으로써 계통분류학적 유연관계를 분석하였다. 각 염기서열의 align-ment는 Clustal X software와 Mega 3 program을 사용하여 정렬하였으며, 계통도는 neighbor-joining 방법을 사용하여 작성하였다.</p><h2>효소 저해활성 측정</h2><p>Alkaline protease inhibitor 측정은 ninhydrin법을 변형시켜 사용하였다. 즉 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCI buffer \( 50 \mu \mathrm{l} \)에 \( 10 \mu \mathrm{l} \) subtilisin \( (0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)과 증류수에 3배 희석된 배양 상층액 \( 10 \mu \mathrm{l} \)를 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 20 \mathrm{~min} \)간 전처리한 후, \( 0.2 \% \)(w/v) gelatin (in \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer, \( \mathrm{pH} 7.5 \) )이 포함된 기질용액 \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 30 \mathrm{~min} \)간 반응시켰다. 효소 반응을 중지시키기 위해 \( 50 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) trichloroacetic acid (TCA) \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 첨가한 후, ninhydrin 용액 \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 혼합하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 10 \mathrm{~min} \)간 끓인 후, ice-water에서 냉각시켰다. 가수분해 되지 않은 단백질을 침전시키기 위해 \( 50 \% \) 1-propanol을 가하여 \( 15 \mathrm{~min} \)간 방치한 후, \( 10,000 \times \mathrm{g} \)에서 10\( \min \) 간 원심분리를 행하여 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 상층액의 흡광도를 측정하였다. 저해율 \( (\%) \)은 저해제를 첨가한 것의 반응 전 (A)과 반응 후(B)의 흡광도, 저해제를 첨가하지 않은 것의 반응 전(C)과 반응 후(D)의 흡광도로부터 다음과 같은 식으로 계산하였다.</p><p>Inhibition rate \( (\%)=\frac{(D-C)-(B-A)}{(D-C)} \times 100 \)</p>
방선균의 분리시료로 사용한 해수, 해조류, 침전물 및 갯벌은 어떤 방법으로 구하였는가?
우리나라의 남해안 전역에서 채집