<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>두충잎 분말은 그린내츄럴(Jindo, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Folin-Ciocalteu reagent, gallic acid, \(2\),\(2\)-diphenyl-\(1\)-picryl-hydrazyl (DPPH), ferric ferricyanide, \( \alpha \)-tocopherol 및 indole-\(3\)-carbinol은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 인체 비소세포폐암세포(human non-small cell lung cancer cell, A549), 결장암세포(human colon cancer cell, SNU-C4), 자궁경부암세포(human cervical cancer cell, HeLa) 및 인체 배아 폐 상피세포(human embryonic lung epithelial cell, L132)는 American Type Culture Collection (Manassa, VA, USA)의 세포주를 배양하여 사용하였다. RPMI-1640, fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin 및 trypsin-EDTA는 HyClone (Logan, UT, USA)의 제품을, Cell Counting Kit-8 (CCK-8)은 Dojindo (Kumamoto, Japan)의 제품을 사용하였다.</p><h2>아세톤 추출물 제조</h2><p>두충잎 분말은 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(4\)시간 건조한 후 재분쇄하여 \(100\)-\(300\)\( \mu \mathrm{m} \) 크기의 입자만을 시료로 사용하였다. 두충잎 분말에 \(10\)배 \( (\mathrm{w} / \mathrm{w}) \)의 아세톤을 넣고 항온진탕조(Jeio Tech, Daejeon, Korea)를 사용하여 상온에서 \(2\)시간 동안 추출하였다. 상온에서 원심 분리 \( (2,000 \times g,~ 5 \) 분 \( ) \)하여 상징액을 얻고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 아세톤을 증발시켜 두충잎 아세톤 추출물을 제조하였다.</p><h2>총 페놀성 화합물 함량</h2><p>두충잎 아세톤 추출물의 총 페놀성 화합물 함량은 Folin-Ciocalteu reagent를 사용하여 측정하였다. 두충잎 추출물에 Folin-Ciocalteu 시약을 부가하여 상온에서 \(3\)분간 반응시키고, \( 10 \% ~\mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 용액을 넣고 상온에서 \(1\)시간 정치시킨 후 \( 725 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 \( \mathrm{mg} \) gallic acid equivalent (GAE)/\(\mathrm{g}\)-추출물로 나타내었다.</p><h2>In vitro 항암 활성</h2><p>두충잎 아세톤 추출물의 암세포 증식억제 활성은 CCK-8을 이용하여 측정하였다. 두충잎 추출물을 에탄올에 용해한 뒤 배지에 희석하여 사용하였고, 이때 에탄올의 최종 농도가 \( 0.1 \% \)\( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)이 초과되지 않도록 하였다. 암세포(A549, SNU-C4, HeLa) 와 정상세포(L132)는 \( 5 \% \) FBS와 penicillin-streptomycin이 포함된 RPMI- 1640 배지에서 \( 5 \%\ ~\mathrm{CO}_{2}, ~37^{\circ} \mathrm{C} \)의 조건으로 \(24\)시간 배양하였다. 이후 배양액을 신선한 배지로 교체한 뒤 희석한 두 충잎 추출물을 농도별로 처리하고 동일 조건에서 배양하였다. 양성대조군인 indol-3-carbinol을 농도별로 처리하여 암세포 증식억제 활성을 비교하였다. \(24\)시간 후 실험군과 대조군의 배양액을 제거한 후 각각 CCK-8 용액과 serum-free RPMI-1640을 첨가하여 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, \( \mathrm{CA}, \mathrm{USA}) \)로 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 암세포 증식억제 활성(\(\%\))은 (대조군의 흡광도-실험군의 흡광도)/대조군의 흡광도 \( \times 100 \)으로 계산하였다.</p><h2>In vitro 항산화 활성</h2><p>두충잎 아세톤 추출물의 유리라디칼 소거활성은 DPPH를 사용하여 측정하였다. 농도별로 희석한 두충잎 추출물에 \( 0.15 \) \( \mathrm{mM}\) DPPH 용액을 첨가하고 상온에서 \(30\)분 반응시킨 후 \(525\)\( \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 유리라디칼 소거활성\( (\%) \)은 \( ( \) 무첨가군의 흡광도 - 첨가군의 흡광도 \( ) \)/무첨가군의 흡광도 \( \times 100 \)으로 계산하였고, 양성대조군으로 \( \alpha \)-tocopherol을 사용하였다.</p><p>두충잎 아세톤 추출물의 환원력은 ferric ferricyanide를 사용하여 측정하였다. 농도별로 희석한 두충잎 추출물에 \( 1 \% \) \( \mathrm{K}_{3} \mathrm{Fe}(\mathrm{CN})_{6} \)과 \( 0.2 \mathrm{M} \) 인산 완충용액 \( \left(\mathrm{pH}\right. \) 6.6)을 첨가하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(20\) 분간 반응시킨 후 \( 10 \% \) trichloroacetic acid 용액을 가하고 \( 2,000 \times \mathrm{g} \)에서 \(5\)분간 원심분리하였다. 상징액을 얻어 \( 0.1 \% \) \( \mathrm{FeCl}_{3} \) 용액을 가한 후 \( 700 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 환원력은 흡광도 값으로 나타내었고, 양성대조군으로 \( \alpha \)-tocopherol을 사용하였다.</p><p>두충잎 아세톤 추출물의 지질과산화 억제활성은 linoleic acid의 산화에 의해 생성되는 과산화물의 측정법으로 확인하였다. 농도별로 희석한 두충잎 추출물에 \( 2.52 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) linoleic acid와 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산 완충액\( (\mathrm{pH} 7.0) 4.0 \mathrm{~mL} \)을 혼합하여 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 동안 반응시켰다. 시료를 채취하여 \( 30 \% \) ammonium thiocyanate와 함께 \( 75 \% \) ethanol 용액에 혼합한 후 실온에서 5분간 정치시키고 \( 20 \mathrm{mM} \) ferrous chloride를 첨가하여 \( 500\mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 지질과산화 정도는 흡광도 값으로 나타내었고, 양성대조군으로 \( \alpha \)-tocopherol을 사용하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>두충잎 아세톤 추룰물을 처리한 시료에 대해 t-test를 실시하여 유의성을 검증하였다. 세 번의 반복실험을 통해 얻어진 결과를 평균 \( \pm \)표준편차로 나타내었고, \( p<0.05 \)인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.</p>
두충잎 분말을 구매한 곳은 어디인가요?
그린내츄럴