<h2>Cell viability 측정</h2><p>세포가 \( 80 \% \) 이상 confluence 상태가 되면 96-well plate에 \( 3 \times 10^{4} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \) 농도로 seeding하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 동안 배양한 다음 세포가 잘 부착되면, 농도별로 희석한 시료를 (5,10,25,50,100 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)) 각 well에 처리하여 1시간 배양한 뒤, 산화적 스트레스를 유발하기 위해 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}(400 \mu \mathrm{M}) \) 를 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 각 well의 배지를 제거하고 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 의 MTT solution \( 200 \mu \mathrm{L} \) 씩 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4시간 동안 재배양하였다. 4시간 뒤, MTT solution을 제거하고 생성된 formazan 결정을 빛이 차단된 상태에서 DMSO에 30분간 녹여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Reactive oxygen species ROS 측정</h2><p>세포가 \( 80 \% \) 이상 confluence되면 \( 3 \times 10^{4} \mathrm{cell} / \mathrm{mL} \) 로 96-well black plate에 seeding하여 4시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하였다. 배양 후 세포가 부착되면 농도별로 희석한 시료를 (5, 10, 25, 50, 100 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) ) 각 well에 처리하고 1시간 재배양한 후 산화적 스트레스 유발을 위한 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}(400 \mu \mathrm{M}) \) 를 첨가하여 24시간 배양하였다. 24시간 뒤, \( 80 \mu \mathrm{M} \) DCF-DA 용액을 각 well에 처리하고 30분간 배양 후 FLUO star OPTIMA (BMG labtech, Ortenberg, Germany) excitation- \( 480 \mathrm{~nm} \), emission- \( 535 \mathrm{~nm} \) 로 측정하였다.</p><h2>Western blot analysis</h2><p>염증 관련 단백질 발현을 확인하기 위하여 배양한 세포에 RIPA buffer를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 30분간 원심분리하고 상층액의 단백질을 분리하였다. 단백질 정량은 Bio-Rad protein assay kit (Hercules, CA, USA)를 이용하였고, sample buffer (Bio-Rad)와 혼합하여 sample을 제조하여 실험에 사용하였다. 각각의 시료를 10 또는 \( 13 \% \) sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, nitrocellulose membrane에 transfer하였다. \( 5 \%\) skim milk로 상온에서 50분 동안 blocking 하여 1차 항체인 inducible nitric oxide synthase (iNOS, Calbiochem, Darmstedt, Germany)와 cyclooxygenase-2 (COX-2, Merk, Darmstedt, Germany)를 PBS-T와 각각 \( 1: 2000, 1: 1000 \) 의 비율로 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 overnight 반응시킨 후, 2차 항체인 anti-rabbit IgG HRP-linked antibody (Cell signaling, Bevely, MA, USA)를 \( 1:1000 \) 의 비율로 PBS-T와 희석하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 이후 PBS-T로 15분간 4번 세척 후 enhanced chemiluminescence solution과 반응시킨 후 Chemi imaging system Q6 (Davinch-Chemi\({}^\mathrm{TM} \), Seoul, Korea)을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.</p><h2>통계분석</h2><p>대조군과 각 시료들로부터 얻은 실험 결과들은 평균 \( \pm \) 표준편차로 나타내었고, 결과 분석은 SPSS 20 (IBM, Armonk, NY, USA) 프로그램을 이용하여 각 실험 결과로부터 ANOVA(analysis of variance)를 구한 후 Duncan's multiple test \( (p<0.05) \) 를 이용하여 각 군의 평균 간의 유의성 검정을 하여 결과를 분석하였다.</p>
세포의 생존률을 측정하기 위해 사용한 용액은 뭐야?
MTT solution