<h1>재료 및 방법</h1><h2>동물실험</h2><p>제주대학교 동물실험센터에서 \(12\)시간 간격으로 명암조절과 \( 23 \pm 2{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 의 온도 및 \( 50 \pm 5 \% \) 의 상대습도 조건 하에 \( \mathrm{C} 57 \mathrm{BL} / 6 \mathrm{J} \) model 의 암컷 쥐를 이용하였으며, 제주대학교 동물윤리위원회로부터 동물실험 승인을 받았다(JNU-IACUC\(2016-0042\)). 일주일간 순화 기간을 거쳐 총 \(16\)주 동안 일반사료 실험군(Control, CTL, \( \mathrm{n}=3 \))과 고지방사료 실험군(High fat diet-treated group, HF, \( \mathrm{n}=4) \) 으로 나누어 동물실험을 진행하였다. 일반사료 실험군은 일반사료로 주로 사용되는 AIN-\(93\)G (Protein \(18.8\%\), Carbohydrate \( 63.9 \% \), Fat \( 17.2 \% \mathrm{kcal}) \) 사료와 음수를 무한급이방법으로 섭취하였고, 고지방사료 실험군도 AIN-\(93\)G 기반으로 제조한 \( 45 \% \) 고지 방 사료(Protein \(19.0\%\), Carbohydrate \( 36.2 \% \), Fat \( 44.8 \% \) \( \mathrm{kcal}) \) 와 음수를 무한급여 하였다.</p><h2>샘플 설명 및 MiSeq 준비</h2><p>절식 직전 분변 \(7\)개 샘플 \( (\mathrm{CTL}=3, \mathrm{HF}=4) \) 과 절식 \(24\) 시간 이후 분변 \(7\) 개 샘플 \( (\mathrm{CTL}=3, \mathrm{HF}=4) \), 총 \(14\) 개의 분변샘플을 채취하여 DNA추출전까지 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하였다. PowerFecal DNA isolation Kit (MOBIO, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 각 분변샘플 약 \( 0.25 \mathrm{g} \) 으로부터 DNA 를 추출하였고, Illumina사에서 제공하는 Miseq library 제작 프로토콜에 따라 \( 16 \mathrm{S} \) rRNA gene 의 과변부위 중 V\(4\) region에 KAPA HiFi HotStart RaedyMix PCR kit (KAPABIOSYSTEMS, Boston, MA, USA)를 사용하여 initial denaturation \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(2\)분, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(20\) 초간 denaturation, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(15\)초간 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(1\)분간 extension을 \(25\) cycles 반복하였고, final extension은 \( 72{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(5\)분간 \(1\)차 PCR 과정이 수행되었다. PCR 산물은 AMPure XP (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA)를 이용하여 정제과정 후, Illumina index를 부착하기 위한 \(2\)차 PCR을 진행하였다. \(2\) 차 PCR산물은 위 정제과정과 동일하게 진행한 후, Qubit fluorometer (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 DNA 의 농도를 측정하였다. 모든 샘플의 PCR산물을 동일한 농도로 한 개의 \( 1.5 \mathrm{mL} \) 튜브에 모아 Macrogen Inc (Seoul, Korea)으로 보내졌으며 Illumina MiSeq을 통해 염기서열분석이 진행되었다.</p><h2>MiSeq 데이터 분석</h2><p>MiSeq을 통해 얻어진 염기서열은 MiSeq SOP 를 참고하여 Mothur software 으로 분석하였다. Paired-end assembly를 위해 make.contigs를 이용하였으며, align은 Silva database, Taxonomy assignment는 Greengene_\(13_5\) 를 reference 로 사용하였다. Assignment 과정 이후, Chloroplast, Mitochondria, Eukaryota, 계(Kingdom) 수준에서 분류되지 않는 염기서열들을 포함하여 비-미생물로 분류되는 모든 시퀀스들을 remove.lineage 를 이용하여 제거하였으며, Chimeric 시퀀스 또한 VSEARCH 를 이용하여 제거하였다. Non-metric multidimensional scaling (NMDS) 및 Tree dendrogram은 Mothur의 서브루틴을 이용하여 수행되었으며, Differential abundance test는 Linear discriminant analysis Effect Size (LEfSe) 를 이용하여 실시 하였다. R software 및 STAMP software 를 이용하여 데이터를 시각화 하였으며, 이에 사용한 모든 시퀀스데이터는 the Short Read Archives에 등록하였다.</p>
하루 중 쥐가 밝게 생활한 시간은?
\(12\)시간