<h1>결과 및 고찰</h1><h2>단백질 발현과 정제</h2><p>GST-Ci-VSP로부터 Ci-VSP(248-576) 단편을 증폭하고 \( \mathrm{pET} 21 \mathrm{a}(+) \) 벡터의 NdsI 과 XhcI 의 자리에 삽입한 뒤 그 서열을 IPTG에 의해 Ci-VSP(248-576)-His가 발현 유도됨을 확인하였다. 그 결과 Gene Bank AB183035.1의 서열 중 우리가 원했던 Ci-VSP PD의 서열과 일치함을 확인하였다. 이 결과에 따르면 우리가 클로닝한 Ci-VSP(248-576)-His의 단백질 분자량은 대략적으로 \(38 \mathrm{kDa}\)에 상당하는 것으로 판단되었다. 이렇게 만들어진 DNA를 Rosetta \( { }^{\mathrm{TM}}(\mathrm{DE} 3) \) singles competent cell에 transformation한 후에 그 발현 여부를 확인하였다. \( 0.4 \mathrm{mM} \) IPTG 에 의해 Ci-VSP(248-576)-His가 발현 유도됨을 확인하였다. 이어서 이렇게 유도된 E. Coli를 가지고 Ni-NTA resin을 이용하여 단백질을 정제하였다. 이 과정에서 우리는 몇 가지의 Ci-VSP-His 정제 조건의 특이성을 몇 가지 발견하였다. 이를 서술하면 일반적인 his-tag 정제 조건에서는 salt농도가 약 \( 300 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl} \) 정도를 요구하나 이 조건으로 Ci-VSP-His를 정제하면 대부분의 단백질이 침전되는 현상이 발견되어 이에 대한 보완책으로 단백질 정제 용액의 salt의 농도를 낮추어 진행하는 것이 필요하다는 점을 발견하였다. 그리고 Ci-VSP-His를 Ni-NTA resin에서 용출하는데 필요한 용액의 조성에서도 그 salt의 농도가 \( 25 \mathrm{mM} \) 정도가 적당하며 imidazole의 농도 또한 \( 100 \mathrm{mM} \) 정도가 적당하다는 점을 발견하였다. 이러한 실험을 통해 Ci-VSP-His의 Ni-NTA 정제 조건을 최적화하여 보고하게 되었다. 이러한 최적화된 정제의 조건을 통해 E cali 세포 1 의 배양을 통해 분자량 \(38 \mathrm{kDa}\) 정도에 해당하는 Ci-VSP-His를 순도 \( 90 \% \) 이상으로 대략 \( 1-2\mathrm{mg} \) 정도를 얻을 수 있게 되었다.</p><h2>Steady state kinetics 조건 최적화</h2><p>앞의 정제를 통해 얻은 Ci-VSP-His를 가지고 그 탈인산화 활성에 대한 확인과 pNPP에 대한 탈인산화 특성을 확인하고자 pNPP에 대한 kinetics의 steady state 조건 확립을 위한 최적화 실험을 수행하였다. 이를 위해 정제된 단백질을 이용하여 pNPP 반응의 온도, \( \mathrm{pH} \), 반응 시간, 단백질 양에 대한 그 경향성을 확인하였다. 먼저 Ci-VSP-His의 pNPP에 대한 탈인산화의 반응 시간에 대한 경향성을 5분 간격으로 하여 50분까지 살펴보았는데, 약 30분까지는 그 반응이 steady state에 있음을 확인하였다. 한편 반응 온도의 경우에는\( 25^{\circ} \mathrm{C}\), \(30^{\circ} \mathrm{C}\), \(37^{\circ} \mathrm{C}\), \(42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 측정한 결과 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 그 활성이 최대값을 가짐을 확인하였다. 그리고 반응 \( \mathrm{pH} \)의 경우에는 4.5에서 8.5까지 0.5 간격으로 측정한 결과, 약 5.0 내지 5.5에서 최대값을 나타냄을 확인하였다. 한편 pNPP 탈인산화에 대한 단백질 양의 경향성은 \( 3 \mu \mathrm{g} \) 까지 \( 0.5 \mu \mathrm{g} \) 간격으로 측정한 결과 약 \( 2 \mu \mathrm{g} \) 까지 그 반응이 steady state에 있음을 확인하였다. 한편 실험 결과들의 표준 편차가 약 \( 10 \% \) 이내인 점으로 보아 각 측정 결과들이 유의한 범위에서 얻어졌다고 판단하였다. 이러한 최적화 실험을 통해 얻어진 Ci-VSP-His 단백질의 pNPP 탈인산화에 대한 steady-state kinetic 측정 조건은 온도 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(\mathrm{pH} 5.0 \) 내지 5.5, 반응 시간 30분 이내, 반응 단백질 양 \( 2.0 \mu \mathrm{g} \) 이내가 적합하다는 점을 알게 되었다.</p>
Ci-VSP-His를 Ni-NTA resin에서 떼어내는데 필요한 물질은 무엇입니까?
imidazole