<h1>재료 및 방법</h1><h2>연구 재료</h2><p>2007년 4월부터 10월까지 부산시내 거주하면서 성병에 관한 건강진단을 받아야 할 직업군(주로 유흥업소)에 종사하는 여성이 보건소에 검진 차 내원하였을 때, 본인의 검체사용 동의 후 자궁내 도찰물을 검체로 사용하였다. 총 660 건의 검체는 면봉 채취 후 즉시 VTM (viral transport medium)에 넣어 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 유지하여 실험에 사용하였다. 검체의 DNA는 MyHPV Chip Kit\( {}^{\circledR} \) 에서 제공하는 프로토콜에 의거 DNA추출, 유전자 증폭시험 및 DNA chip hybridization을 실시하여 유전자형을 확인하였다. 그 결과 총 364건의 HPV DNA가 검출되었으며 그 중 HPV-16 형은 전체 양성건수의 \( 15.9 \% \) 차지하였고 이중 HPV-16형 E6/E7 유전자 증폭산물의 염기서열을 분석하여 재현성이 확인된 19 건을 intratypic variation 분석에 사용되었다.</p><h2>HPV-16형 E6/E7 PCR</h2><p>HPV-16형 E6/E7 유전자(nt 34-880)의 intratypic variation 을 조사하기 위한 검체는 Quiagen DNA isolation kit를 사용하여 genomic DNA를 추출하고 Qubit (Invitrogen Co., USA)으로 정량하여 DNA농도가 \( 20 ~ \mathrm{ng} / \mu \mathrm{l} \) 이상일 경우에만 주형으로 사용하였다. PCR은 주형 DNA \( 100 ~ \mathrm{ng} / \mu \mathrm{l} \), \( 10 \times \) buffer \( 5 ~ \mu \mathrm{l} \), \( 25 ~ \mathrm{mM} \) \( \mathrm{Mg} \mathrm{Cl}_{2} \) \( 5 ~ \mu \mathrm{l} \), \( 10 ~ \mathrm{mM} \) dNTPs \( 2.0 ~\mu \mathrm{l} \), Taq polymerase \( 5 ~ \mathrm{IU} / \mu \mathrm{l} \) (Takara Co., Japan), HPV-16 E6/E7 primer [HPV16 E6-13N (5'-AACCGAAATCGGTTGAACCG-3'), HPV16 E7-13C (5'-TGCAGGATCAGCCATGGTAGAT-3') ] 각 \( 20 ~ \mathrm{pmol} \) 을 넣고 증류수로 총 \( 50.0 ~ \mu \mathrm{l} \) 되게 하였다. PCR 수행은 PTC-200 (MJ Research Inc., USA)을 이용하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분간 초기 변성 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초, \( 57^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분의 조건에서 30 회 반복 수행 후 최종적으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 신장 후 종결하였다. 유전자 증폭이 끝난 후 \( 1.5 \% \) agarose gel에서 전기영동하여 \( 847 ~ \mathrm{bp} \) 크기의 증폭산물을 확인하였다.</p><h2>DNA 염기서열 분석</h2><p>PCR 산물의 염기서열 분석은 솔젠트사(SolGent Co., Korea)에 의뢰하였다. BigDye\( { }^{\circledR} \) terminator V3.1 cycle sequencing kit (Perkin Elmer, USA)을 사용하여 sequencing 반응을 하였고, Millipore-Montage dye removal kit로 sequencing 산물을 정제하였으며 ABI 3730XL capillary DNA analyzer (Applied Biosystems, USA)로 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI BLAST search program을 사용하여 기존의 보고된 바이러스와 염기서열 상동성을 비교하여 유전자형을 결정하였다. HPV-16형 E6/E7 유전자의 계통분석 및 intratypic variation 조사는 MegAlign program (DNAStar Inc., USA)을 이용하였다.</p>
sequencing 반응을 보기 위해 사용한 것은 뭐야?
BigDye\( { }^{\circledR} \) terminator V3.1 cycle sequencing kit