<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포주와 재료</h2><p>정상세포주와 암세포주들은 각 조직별로 American Tissue Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA)에서 구입하였고, ATCC에서 권하는 방법대로 각 배지에 배양하였다. H-ras\( ^{V 12} \)-transformed Rat-2세포와 K-ras\( { }^{V 12} \)-transformed Rat-2세포 및 대조군 Rat-2 세포는 Dr. J.K Pai (Merck/Schering-Plough, Whitehouse Station, NJ)로부터 제공받았고, 이는 \( 10 \% \) fetal bovine serum이 포함된 DMEM 배지에서 유지하였다. Bromodeoxyuridine (BrdU)과 mouse anti-BrdU antibody는 GE Healthcare Life Science (Piscataway, NJ)의 제품을 사용하 였고, FITC-conjugated anti-rat IgG antibody는 Jackson Lab (Bar Harbor, ME)에서 제공받았다. 다른 모든 시약들은 Sigma-Aldrich (Germany)에서 구입하였다.</p><h2>에탄올에 의한 세포증식 효과 측정</h2><p>각 세포들은 여러 농도의 에탄올에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였고, 에탄올을 함유한 배지는 매일 교환하였다. 에탄올의 증발을 최소화하기 위해서 parafilm으로 밀봉하였고, 이러한 처리는 원래의 세포증식이나 세포 morphology를 방해하지 않았다. 에타올을 처리한 세포는 trypsin으로 분리하고, 세포수는 tryphan blue staining을 통해 세포 숫자를 계산하였다. 항산화제인 N-acetylcysteine \( (1 \mathrm{mM}) \), 4-methylpyrazole \( (1 \) \( \mathrm{mM}) \), vitamin E \((25 \mathrm{mM}) \), trolox \( (0.2 \mathrm{mM}) \)는 에탄올 처리 1시간 전에 처리하였고, 그 후에 에탄올 \( (100 \mathrm{mM}) \)을 처리하고 세포를 배양하였다. 에탄올에 의한 세포증식억제효과에 대한 항산화제의 효과를 알아보는 실험은 위와 같은 방법으로 진행하였다.</p><h2>세포미세주사 및 BrdU 면역형광법을 이용한 DNA 합성 실험</h2><p>세포미세주사법을 이용하여 발암원성 Ras에 의한 DNA 합성에 대한 에탄올의영향을 조사하기 위해 oncogenic H-Ras\( ^{V12} \)를 정상유방 세포주인 MCF-12A세포에 주사하여 DNA합성은 아래와 같이 측정하였다. 요약하면, MCF-12A세포를 coverslip 위에서 배양한 후, serum-free DMEM으로 배양하여 세포주기를 정지시켰다. 이 세포를 미세주사하기 에탄올(100 \( \mathrm{mM}) \)으로 4시간동안 처리하였다. 그 후에 발암원성 H-Ras\( ^{V12} \) protein \( (2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)를 rat IgG \( (4 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)과 함께 MCF-12A세포에 미세주사하였다. MCF-12A 세포를 키운 3개의 coverslip에 coverslip당 평균 200개의 세포에 미세주사하였고, 이를 두 번 반복하였다. 따라서 미세주사 결과는 평균 1,200개의 세포에서 나온 결과이다. 미세주사한 세포의 생존율은 \( 90 \% \)이상이 었다. 미세주사된 세포는 BrdU를 세포 배지에 투입하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 동안 배양하고, 이를 \( 90 \% \)에탄올로 세포를 고정하였다. 미세주사된 세포는 anti-BrdU antibody로 면역염색하고, 그 후에 TRITC-conjugated anti-mouse igG antibody로 처리되었다. 미세주사된 세포를 찾기위해 세포에 같이 주사된 rat IgG를 FITC-labeled anti-rat IgG antibody로 염색하였다. 미세주사된 세포는 세포질의 FITC 염색으로 확인되고, DNA 합성은 핵의 TRITC 염색으로 확인되며, 에탄올이 발암원성 Ras에 의한 DNA 합성 유도에 대한 영향을 형광현미경으로 그 결과를 조사하였다.</p><h2>세포내 활성산소의 측정</h2><p>세포내 활성산소양의 측정은 2,7-dichlorohydrofluerescence \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{DCFDA}\right) \)가 형광을 나타내는 2,7-dichlorofluorescein (DCF)로 산화되는 측정법에 의해 조사하였다 . \( 100 \% \) 에탄올에 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{DCFDA} \) stock 용액 \( (12.5 \mathrm{mM}) \) 을 만들어 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관 하였고, \( 25 \mu \mathrm{M} \)의 working 용액을 사용하였다. DCF의 형광광도는 형광마이크로 리더(Bio-Tek Instruments, Winooki, VT, USA)를 사용하여 excitation 파장은 \( 485 \mathrm{~nm} \), emission 파장은 \( 530 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>실험에서 얻어진 결과치는 ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차(means \( \pm \mathrm{SE}) \)로 표시하였으며, 각 실험군 간의 유의성 검정은 Fischer's Protected LSD post-hoc test로 하였다.</p>
이 실험을 위해 Dr. J.K Pai (Merck/Schering-Plough, Whitehouse Station, NJ)로부터 제공받은 세포는 뭐야?
H-ras\( ^{V 12} \)-transformed Rat-2세포와 K-ras\( { }^{V 12} \)-transformed Rat-2세포 및 대조군 Rat-2 세포