<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료 및 시약</h2><p>실험에 사용한 택사(Alismatis Rhizoma)는 부산 중앙동 한방 재료 시장에서 구입하여 사용하였다. 시약으로 dimethy-lsulfoxide, tris-(hydroxymethyl)-aminomethane, \( \mathrm{N}_{\alpha} \)-benzoyl-dl-arginine p-nitroanilide(BAPNA), trypsin(from porcine pancreas), trypsin inhibitor(from soybean), bovine serum albumin, DEAE-cellulose, Sephadex G-150, Gel-filtration molecular weight marker 등은 Sigma Chemical Co.(St. louis, USA)와 Bio-Rad Laboratories (Richmond, USA) 제품을 사용하였고 기타 다른 시약은 특급제품을 사용하였다.</p><h2>AR trypsin inhibitor의 분리 및 정제</h2><p>분말로 만든 택사 \( 50 \mathrm{~g} \) 에 \( 25 \mathrm{~mM} \) tris-\( \mathrm{HCl} \) 완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 7.4) \( 500 \mathrm{ml} \) 를 가한 다음 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하룻 동안 저어 주면서 방치한 후 Potter-Elvehjem homogeniger로 균질화하였다. 균질화된 용액을 20,000\( \times \mathrm{g} \) 에서 30분간 원심분리하여 상층액 을 추출물로 하였다. 이 추출물에 고체 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 를 천천히 교반하면서 가하여 \( 80 \% \) 포화시켰다. 30분간 방치한 후 20,000 \( \times \mathrm{g} \) 에서 10 분간 원심분리하여 \( 80 \% \) 포화침전물을 얻어 \( \mathrm{SO}_{4}{ }^{2-} \) 이온이 검출되지 않을 때까지 \( 25 \mathrm{~mM} \) tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 7.4)으로 투석하였다. 투석이 완료된 추출물을 \( 25 \mathrm{mM} \) tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 7.4)으로 미리 평형시켜 둔 DEAE-cellulose column (\( 3 \times 41 \mathrm{~cm}) \) 에 주입하여 같은 완충용액으로 용출시켜 파장 \( 280 \mathrm{~nm} \) 에서 용출액의 흡광도가 완충용액과 같아질 때까지 씻어 주었다. 이 column을 \( 0\sim~1 \mathrm{~MNaCl} \)의 염농도 linear gradient하여 용출시켜 trypsin 저해활성이 있는 분획들을 모아 농축시켰다. 위의 농축액을 25 \( \mathrm{mM} \) tris-\(\mathrm{HCl} \) 완충용액 (\( \mathrm{pH} \) 7.4)으로 미리 평형시켜 둔 Sephadex G-150 column \((2.2 \times 83 \mathrm{~cm}) \) 에 주입한 후 같은 완충용액으로 용출시켜 활성이 있는 분획을 모아 농축하였다. 위의 Sephadex G-150 column chromatography는 한 번 더 시행하여 활성분흭을 모아 농축시켜 ARTI(Alismatis Rizoma trypsin inhibitor)라 하였다. 이상의 모든 실험 조작은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 행하였다. 농축액은 Bio-Gel P-6 column \( (1.6\times 60 \mathrm{~cm}) \)에서 탈염한 다음 각종 실험에 사용하였다.</p>
상층액에 고체 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 를 천천히 뒤섞어 주면 몇\( \% \)를 포화시키는가?
\( 80 \% \)