<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료</h2><p>본 실험에 사용한 홍화씨는 경남 함양지역에서 재배한 것으로 홍화씨를 동결 건조한 후 homogenizer를 사용하여 \( 20 \mathrm{mesh} \)로 마쇄하여 분석시료로 사용하였다.</p><h2>지질추출 및 TLC 분획</h2><p>홍화씨로부터 총 지질은 Folch 등의 방법으로 추출하였다. 분리된 지질에 \( 1 \mathrm{~N}\)-\( \mathrm{KOH}\)(\(\mathrm{EtOH}\))를 가하여 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) waterbath 상에서 1시간 환류시킨 후, 불검화물을 분리하였다. 분리된 불검화물은 thin layer chromatography (TLC) plate (Kiesegel 60G, Merck, \( 20 \times 20 \mathrm{~cm} \) )에 loading한 후 전개 용매(n-hexane \( : \) diethyl ether \( =7 : 3\) , \( \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 전개시켜 건조한 다음 Rhodamin-6G로 발색하여 UV lamp 하에서 관찰하고 분리하였다.</p><h2>Sterol 분석</h2><p>TLC에 의해 분리된 분획물은 Gas Chromatography-MASS Spectrometer (GC/MS JMS-700, Jeol, Japan), DB-5capillary column \( (0.32 \mu \mathrm{m} \times 60 \mathrm{~m}, 0.25 \mu \mathrm{m}) \)으로 분석하였다. 얻어진 spectrum은 Wiley MS spectrum library를 사용하여 동정하였다. GC/MS 분석조건은 ionizing energy (\( 70 \mathrm{~eV}\)), ionozing current \( (300 \mu \mathrm{A}) \), chamber temp \( \left(250^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 및 ionizing mode (EI mode)를 사용하여 분석하였다.</p><h2>홍화씨의 ethanol 추출</h2><p>홍화씨 \( 200 \mathrm{~g} \)에 ethanol \( 1500 \mathrm{ml} \)를 가하여 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5시간 2회 반복 추출한 후 glass filter로 여과하였다. 여액은 evaporator로 감압 농축하여 phytoestrogen 활성측정을 위한 시료로 사용하였다</p><h2>Phytoestrogen 분석을 위한 세포주 배양</h2><p>MCF7/pDS-CAT-ERE119-Ad2MLP 세포주는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) w/o phenol red (Bio Whittaker, USA), \( 10 \% \) charcoal stripped fetal bovine serum (FBS, Life Technologies, USA) 배지를 이용하여 \(37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. 세포주는 일주일에 2~3회 정도 새로운 배지로 교환하였고, 배양된 세포주는 배지를 제거하여 phosphate buffered saline (PBS, Bio Whittaker, USA)로 2번 세척하고 Trypsin-Versene (EDTA) mixture (Bio Whittaker, USA) 처리하여 5분 배양 후, DMEM w/o phenol red, \( 10 \% \) charcoal stripped FBS 배지로 세포주를 골고루 분산되도록 희석하여 \( 5 \mathrm{ml} \)의 배지에서 계대 배양하였다.</p><h2>Phytoestrogen 분석을 위한 시료처리</h2><p>MCF7/pDS-CAT-ERE119-Ad2MLP 세포주는 DMEM w/o Phenol red, \(10\%\) charcoal stripped FBS 배지 \(5 \mathrm{ml}\)에 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\) \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 2-3 일간 배양한 후 각 시료 당 각각 3개의 dishes에 \( 5 \mathrm{ml}\)씩 처리하여 48시간 배양하고 세포를 회수하여 반응성을 측정하였다. 홍화씨 추출물의 최종농도는 \( 500 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}, 50 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 및 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\)를 사용하였으며 표준물질로 이용된 \( 17 \beta \)-estradiol은 에탄올에 녹여 최종농도를 \( \left(10^{-8} \sim 10^{-10} \mathrm{M}\right)\)로 조절하여 사용하였다.</p><h2>CAT(Chloramphenicol Acetyltransferase) 활성 측정</h2><p>Phytoestrogen 활성측정은 Chambon 등의 방법에 따라 수행하였다. 홍화씨 추출물을 첨가하여 48 시간 배양한 MCF7/pDS-CAT-ERE119-Ad2MLP 세포는 배지를 제거하고 PBS \(2 \mathrm{ml}\)로 2번 세척한 후 PBS \( 1 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 집균하였다. 집균한 세포를 \(1.5 \mathrm{ml}\) centrifuge tube에 옮겨 \( 6,000 \mathrm{rpm} \)에서 2분 동안 원심분리 하여 상등액을 제거하고 TEN buffer [\(40 \mathrm{mM}\) Tris ( \( \mathrm{pH} \) 7.5), \( 150 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}, 1 \mathrm{mM} \) EDTA] \(1 \mathrm{ml}\)를 첨가하여 혼합 세정하고 원심분리 한 후, 상등액을 제거하였다 (2회 반복). 여기에 \( 250 \mathrm{mM} \) Tris-buffer를 \( 250 \mu \mathrm{l} \) 첨가하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분 동안 처리하는 방법을 4회 반복하여 세포를 lysis 한 다음 \(14,000 \mathrm{rpm} \) 에서 5분 동안 원심분리하여 상등액 중 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 를 취하여 CAT 활성을 측정하였다. CAT 활성은 CAT-ELISA Kit (Boehringer Mannheim, USA)를 사용하여 manual에 따라 수행하였다. MTP-modules에 각각의 cell extract를 \( 200 \mu \mathrm{l} / \mathrm{well} \) 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 1시간 배양한 후 washing buffer \( 250 \mu \mathrm{l} \) 로 각각 30초간 5회 반복 세척하였다. 여기에 anti-CAT-DIG working solution \( 200 \mu \mathrm{l}\)를 첨가하여 \(37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 1시간동안 배양한 후 다시 washing buffer \( 250 \mu\mathrm{l} \)로 각각 30초간 5회 반복 세척하였다. 여기에 anti-CAT-POD working solution \( 200 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 1시간 동안 배양한 후, 다시 washing buffer \( 250 \mu \mathrm{l} \)로 각각 30초간 5회 반복 세척하였다. 여기에 POD-substrate \( 200 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 green color로 변할 때까지 \(37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에 배양한 후 microplate reader (Molecular Dynamics, USA)를 이용하여 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정 하였다. CAT 활성은 해당 세포 추출액의 단백질량으로 정량하였다.</p>
여과한 홍화씨는 무엇을 측정하기 위해 시료로 사용한 거야?
phytoestrogen 활성측정