<h1>2. 연구 방법</h1><h2>2.1 세포 배양액 보관을 위한 펠티어 냉장고</h2><p>세포 배양액은 심근세포의 성장에 필요한 양분 및 \( \mathrm{pH} 7.4\) 유지를 위한 완충용액으로 이루어지며 장기간 보관을 위해 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)를 유지해야한다. \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관된 세포 배양액은 교체 시 발생하는 온도 shock 방지를 위해 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) bath에서 pre-warming을 진행한다. 장시간 상온에 노출된 배양액의 \( \mathrm{pH} \) 는 7.7 ~ 7.8로 증가하고 배양액 교체 후 \( 5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) 인큐베이터에 보관하면 48시간 이후 \( \mathrm{pH} 7.4\)로 다시 감소 및 유지된다. 외부환경 온도에 따라 변화하는 배양액의 \( \mathrm{pH} \) 변화를 최소화 하기위해 펠티어 소자를 이용한 온도 유지장치를 제작하였다. 펠티어 소자는 세라믹기판과 납 그리고 pellet를 이루는 N, P 형 소자이다. 열전소자를 이용한 냉각, 가열 원리는 서로 다른 2개의 N형, P형 열전반도체 소자로 구성된 열전회로에 전류가 흐를 때 한 접합면은 냉각되고 다른 부위는 가열되는 현상이 일어난다. 2종의 금속 대신 전기전도 방식이 다른 비스무트(\( \mathrm{Bi}\)), 텔루트(\( \mathrm{Te}\)) 등 반도체를 사용하면, 효율성이 높은 흡열, 발열 작용을 하는 펠티어 소자를 얻을 수 있다. 이를 이용하여 세포 배양액 온도 및 \( \mathrm{pH} \) 유지를 위한 펠티어 냉장고를 제작하였다.</p><h2>2.2 세포 배양액의 시간에 따른 \( \mathrm{pH} \) 변화</h2><p>Fig. 1은 제작된 펠티어 냉장고, 스텝 모터 펌프 및 stage-top 인큐베이터로 이루어진 세포 배양액 자동 교체 시스템을 나타낸다. 펠티어 냉장고는 발열부 방열판, 냉기 방열판, 쿨링팬, 단열제 및 아크릴 케이스로 구성되었고 \( 5 \sim 8^{\circ} \mathrm{C} \) 의 온도를 유지하며 배양액의 \( \mathrm{pH} \)는 \( 7.39 \pm 0.15 \)의 값을 측정하였다(Table 1). 심근세포는 온도 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(\mathrm{CO}_{2}\) \(5 \% \) 및 상대습도 \( 100 \% \)가 유지되는 인큐베이터에서 배양되며 자동 배양액 교체와 수동 배양액 교체 심근세포 대조군으로 배양하였다. 펠티어 냉장고에서 스텝 모터 펌프 및 인큐베이터까지 세포 배양액은 \( \mathrm{pH} 7.4\)를 유지하였다.</p><h2>2.3 세포 배양액 교체 및 공급을 위한 펌프 제작</h2><p>지속적인 세포 배양액 교체 및 공급을 위해 롤러의 RPM 조절하여 유량 제어가 가능한 스텝 모터 기반 연동 펌프 제작하였다. 연동 펌프는 미세 유량에 대한 정밀 제어가 가능하고 사용되는 튜브 이외에 세포 배양액과의 접촉이 없어 오염 가능성이 낮은 장점이 있다. 3D 프린터를 이용하여 튜브를 고정하는 하우징을 최소 1포인트 이상 밀착되는 구조로 제작하였다. 펌프의 구동을 위해 스텝 모터를 사용하였고 아두이노 프로그램으로 제어하였다. 스텝 모터는 펄스(pulse)가 입력될 때마다 일정한 각도로 모터가 회전하도록 제어된다. 이 때 회전각은 스텝각이라 부른다. 스텝 모터를 사용하는데 가장 이점이 되는 부분은 스텝 각을 작게 하였을 때 모터의 속도를 조절함으로써 정밀도를 향상시킬 수 있다. 스텝 모터 드라이버는 스텝 모터를 제어하는 역할을 하면 스텝 모터의 최소 스텝 각을 잘게 나누어 마이크로 스텝 각으로 회전하게 만드는 역할을 한다. 스텝 모터의 한스텝에 0.05625도의 회전을 제어 가능하고 펄스 간 간격을 조정하여 회전속도에 따른 미세 유량을 측정하였다.</p><h2>2.4 세포배양 및 생물학적 성숙도 평가</h2><p>배양액이 지속적으로 교체 및 공급되는 심근세포와 2일 주기로 교체되는 대조군 심근세포의 생물학적 성숙도 평가를 위해 세포배양 2일 후부터 배양액 교체를 진행하였으며 배양 10일 후 형광 염색을 진행하였다. 배양된 심근세포는 paraformaldehyde (\(3.7\%\), Sigma-Aldrich)와 Triton X (\(0.1\%\), Sigma-Aldrich)를 이용하여 실온에서 10분간 permeabilize 한다. Phosphate-buffered saline (PBS, Takara)를 이용하여 3회 permeabilization 용액을 washout하였다. \( 1 \% \) Bovine Serum Albumin (BSA, Sigma-Aldrich)로 실온에서 nonspecific binding을 30분간 진행하였다. 이후 Primary anti-body (monoclonal anti actin ( \( \alpha \)-sarcomere and connexin 43))를 \(1\%\)의 BSA와 \(1:200\) 비율로 혼합 후 120분 동안 실온에서 반응하였다. 다시 secondary antibody (Alexa-Flour 488, 568 goat anti-mouse IgG conjugate)를 \(1\%\) BSA와 \(1:200\) 비율로 혼합하여 90분 동안 실온에서 반응하였다. 마지막으로 핵염색 을 위한 DAPI solution (\(4'\), \(6\)-Diamidino-2-phenylindole)을 추가하여 15분동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응하였다.</p>
4도에서 보관된 세포 배양액은 37도 bath에서 prewarming을 진행하는 데 이는 무엇을 위한 것인가?
교체 시 발생하는 온도 shock 방지를 위해