<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주, 플라스미드 및 사용 배지, 균주 배양 조건</h2><p>본 연구에서 사용된 균주와 플라스미드들을 Table 1에 열거하였다. Salmonella typhimurium 와 Escherichia coli는 Luria-Bertani (LB) 액체배지 또는 \( 1.5 \% \) agar를 첨가한 고체배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 항생제는 필요한 경우 각각의 배양 조건에 다음과 같은 농도로 첨가하였다: ampicillin, \( 100 \mu \mathrm{g/ml} \); streptomycin, \( 50 \mu \mathrm{g/ml} \).</p><h2>일반적인 DNA 조작</h2><p>본 연구에서 이루어진 대부분의 DNA 조작은 Sambrook 등에 의해 기술된 방법에 준하여 수행하였다. Rubidium chloride 용액에 의해 제조된 E. coli competent 세포들은 heat-shock 방법으로 형질전환 시켰다. 유전자 클로닝에 사용하기 위한 DNA 단편을 얻기 위해서 PCR 증폭기법을 사용하였고, 이는 염색체상의 돌연변이를 확인하는데도 사용하였다.</p><h2>Salmonella 세포 성분의 분획</h2><p>생육 단계의 정지기까지 배양한 S. typhimurium 세포들을 \(17,000 \times g\)에서 5분간 원심분리하여 수거하였다. 수거한 세포들을 \( 10 \mathrm{~mM} \) Tris-HCl buffer (\( \mathrm{pH} 8.0\))에 현탁한 후 French Pressure (Thermo Electron Cooperation)를 사용하여 \( 18,000 \mathrm{~psi} \)에서 파쇄하였다. 파쇄된 세포물질을 \(27,000 \times g\)에서 한 시간 동안의 원심분리로 단백질을 포함하는 용해성 부분과 세포의 envelop 부분에 해당하는 비용해성 부분으로 분획하였다.</p><h2>SDS-PAGE</h2><p>단백질 시료들을 \( 2 \times \text{digestion buffer}\) [\(20 \% (v/v)\) glycerol, \( 4 \%(w / v) \) SDS, \( 0.2 \%(w / v) \) bromophenol blue, \( 200 \mathrm{mM}\) \(\beta \)- mercaptoethanol, \( 100 \mathrm{~mM} \) Tris-HCl buffer, \( \mathrm{pH} 6.8\)]에 용해하였다. 용해된 단백질 시료들을 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 동안 가열한 후, 비연속적 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 의해 분리하였다. 분리된 단백질들을 Coomassie brilliant blue G-250 (Sigma)을 통한 염색과 2 시간 동안의 탈색 과정을 통해 밴드로서 확인하였다.</p><h2>Matrix-assisted laser desorption ionization timeof-flight (MALDI-TOF) assay 및 데이터베이스 분석</h2><p>SDS-PAGE와 염색, 탈색 과정을 통해 목적 단백질을 확인한 후, 그 단백질을 동정하기 위해 목적 단백질이 포함된 polyacrylamide gel 부분을 잘라내어 MALDI-TOF assay system (The Applied Biosystems, Voyager-DESTR, USA)을 통해 분석하였다 (경상대학교 공동실습관). MALDI-TOF assay에서 얻어진 각 펩타이드들에 관한 정보들은 MS-FIT 프로그램의 통해 최근의 NCBI Salmonella 데이터베이스로부터 정보를 탐색하는데 사용되었으며, 이러한 분석을 통해 목적 단백질을 동정하였다.</p><h2>Dps 단백질의 과발현을 위한 재조합 플라스미드의 구축</h2><p>6개의 histidine (\( \mathrm{His}_{6} \)) 잔기들로 표지되어진 Dps 단백질을 대량 생산하기 위해서 대장균을 활용한 인위적인 단백질 과 발현 체계를 이용하였다. 단백질 발현을 위한 완전한 dps 유전자는 S. typhimurium X3339 염색체 DNA를 주형으로 하여 DN(BamHI)과 WC(HindⅢ) primer 쌍을 사용한 PCR을 통해 \( 0.5 \mathrm{~kb} \)의 DNA를 증폭한 후, 그 DNA를 pGEM-T vector(Promega)에 클로닝하여 pBP128 재조합 플라스미드를 구축하였다. pBP128로부터 얻은 \( 0.5 \mathrm{~kb} \) BamHI-HindⅢ DNA 단편을 단백질의 발현에 사용되는 발현 vector인 \( \mathrm{pP}_{\mathrm{RO}} \mathrm{EX}^{\mathrm{TM}} \mathrm{HTb} \)(Invitrogen)에 삽입하여 재조합 플라스미드 pBP131을 구축하였다. pBP131을 가지는 E. coli BL21 (DE3)을 \( 1 \mathrm{~mM} \)의 IPTG가 들어있는 배양 조건에서 배양하였을 경우, 과량의 Dps 단백질이 발현되는 것을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다</p><h2>Immunoblotting</h2><p>SDS-PAGE를 통해 단백질 시료를 분리한 후, transfer 장치 (BioRad)와 Towbin’s Buffer (TB) [\( 25 \mathrm{~mM} \) tris, \( 192 \mathrm{~mM} \) glycine, \( 20 \% \) \((v/v)\) methanol, \(\mathrm{pH} 8.3\)]를 사용하여 polyacryamide gel 내의 단백질들을 nitrocellulose membrane(Schleicher & Schuell)으로 이동시켰다. Towbin 등에 의해 기술된 바와 같이 \( 5 \% \) skim milk를 함유하는 Towbin’s Saline Buffer (TBS) [\( 0.9 \% \) \( \mathrm{NaCl} \), \( 10 \mathrm{~mM} \) Tris, \(\mathrm{pH} 7.4\)]에서 3 시간 동안 membrane을 blocking시킨 후, 100배 희석한 Dps 특이적인 다클론성 1차 항체와 함께 2 시간 반응시켰다. TBS로 수 회 세척한 membrane에 2차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-rabbit Ig(Amersham)를 \( 5 \% \) skim milk/TBS에 \(1:1000\)의 비율로 희석하여 2 시간 동안 반응시켰다. TBS로 수 회 세척한 membrane의 Dps 단백질 밴드를 \( \mathrm{H_{2}O_{2}} \) (Sigma)와 4-chloro-1-naphthol (Sigma)이 포함된 용액에서 자주색의 침착물이 생성되는 것으로 확인하였다. 반응은 다량의 증류수 세척을 통해 중지시켰다.</p>
생육 단계의 정지기까지 배양한 S. typhimurium 세포들을 어떤 방식으로 수거 하였는가?
원심분리하여 수거하였다.