<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>본 연구에 사용된 귤나무속과 근연 속의 재료는 2010년부터 2011년에 걸쳐 우리나라의 각지에서 총 7종을 채집하여 실험에 사용하였다.</p><p>광귤나무(Citrus aurantium L.)와 귤나무(Citrus unshiu S.Marcov.)는 경기도 포천시 소흘읍에서 채집하였으며, 유자나무(Citrus junas Tanaka), 당귤(Citrus sinensis (L.) Osbeck), 금감(Fortunella japonica Swingle var. margarita (Swingle) Makino)는 제주시 애월읍 봉성리에서 채집하였으며, 레몬 (Citrus limonia Osbeck)과 탱자나무(Poncirus trifoliat (L.) Rafinesque)은 경상남도 진주시 이반성면 대천리에서 채집하였다.</p><h2>genomic DNA 추출</h2><p>각 식물체로부터 DNA를 추출하기 위하여 Plant DNA Zol Reagent (Life Technologies Inc., Grand Island, New York, USA를 사용하였다 추출방법은 \( 0.3 \mathrm{~g} \) 의 신선한 잎을 액체질소로 마쇄한 다음 사용자의 지침서에 의거하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 에탄올 등 여액의 제거를 위해 진공 흡입기로 5 분간 건조시킨 후 \( \mathrm{TE} 100 \mathrm{ul} \) 에 용해하여 3일간 냉장보관하였다. 용해된 시료는 DyNA 200 fluorometer (Amersham Pharmacia Biotech, USA)를 이용하여 DNA 정량을 체크하였고 TE로 DNA 농도가 균질하게 조정하여 본 분석을 위해 사용하거나 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 보관하였다.</p><h2>분석</h2><p>엽록체의 trnL intron과 trnL-trnF spacer 부위는 Taberlet et al 이 고안한 시발체(primer)로 PCR (polymerase chain reaction)을 이용하여 증폭시켰다.</p><p>PCR 반응을 위하여 추출한 각 분류군의 게놈 DNA \( 50 \mathrm{ng} \), 각 dNTP \( 100 \mathrm{uM} \), 시발체 각 \( 0.2 \mathrm{uM}, 1 x \) enzyme buffer, Taq polymerase 2 unit를 넣고 증류수로 전체 \( 50 \mathrm{ul} \) volume이 되도록 추가하였다. 증폭반응은 초기 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 90 \mathrm{sec} \) 간 변성한 후, 28 사이클로 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 30 \mathrm{sec}, 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 60 \mathrm{sec}, 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 60 \mathrm{sec} \) 간 실시하였고, 추가로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 연장하였다.</p><p>PCR 산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel에서 분리하였는데 이때 절편들의 상대적 크기를 비교하기 위해 \( 100 \mathrm{bp} \) ladder DNA marker를 같이 loading시켰다. 전기영동 후 젤은 ethidium bromide로 염색하여 밴드를 현상하였다. 현상된 젤은 Alpha Image TM (Alpha Innotech Co, San Leandro, CA, USA)을사용하여 밴드 양상을 조사하였다. 이후 젤에서 DNA를 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)로 추출하였다. 증폭된 단편들은 bluescript (Pharmatech)로 클론하였고, ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)로 서열화하였다. 각각의 종에서 최소 10 개 클론들을 분석하였다.</p><h2>통계 분석</h2><p>분류군간 유전적 거리 \( (I) \) 와 유전적 동질성 \( (D) \) 은 분류군간 염기쌍의 비교로 산출하였다[12]. PAUP에서 분류군간 핵산 차이에 의한 유의성 검증, 염기 빈도, 서열쌍 거리, uncorrected "\(p\)"에 의한 측정된 거리 등을 산출하였다. 염기자리 당 서열 간 염기 조성 차이, 불일치 계수를 검증하였다.</p><p>핵산치환 모델 분석은 최적 치환 패턴에 대한 최소 Bayesian Information Criterion (BIC)값을 고려하였다. 각 모델에 대해 Akaike Information Criterion, corrected (AICc)값, Maximum Likelihood value (InL), 척도의 수는 Nei와 Kumar의 식에 의거하였다. 염기 자리 간 진화율에 대한 비균등성은 진화적으로 비변이 부분 \( (+I) \) 을 가진 Gamma 분포 \( (+G) \) 로 나타낸 모델을 사용하였다. 염기치환의 전이/전형의 비율에 대한 평가 \( (R) \) 역시 이 모델에 근거하여 산출하였다.</p><p>서열간 코돈의 중립성 검증은 갭과 결손 서열을 제외하고 500 회 반복으로 MEGA5로 실시하였다[22]. 타지마의 여러 통계치( \( \mathrm{M}= \) number of sites, \( \mathrm{S}=\mathrm{Number} \) of segregating sites, \( \mathrm{ps}=\mathrm{S} / \mathrm{M} \), and \( \pi= \) nucleotide diversity. \( \mathrm{D}= \) Taiima test statistic)를 산출하였다.</p><h2>유연관계 분석</h2><p>각 식물종 trnL intron과 trnL-trnF spacer 부위에서 얻은 크로마토그램(chromatogram)은 소프트웨어 Sequence Navigator 1.0.1 (Applied Biosystems Inc.)로 편집하였다. trnL intron과 trnL-trnF spacer 부위 서열에서 결손부위를 포함한 서열 배당은 MEGA5와 Clustal X program으로 분석하였다. 배당된 서열에서 gap의 부위는 missing data로 처리하였다. 그러나 계통학적으로 정보적인 인델은 이진법 처리로 데이터에 삽입하였다.</p><p>최절약법에 의한 tree (maximum parsimonious tree, MP)는 heuristic search, branch-swapping options, tree bi-section-reconnection에 따랐다[18]. 최우법(maximum like-lihood tree, ML), N-J법(neighbor-ioining tree, NJ)으로 tree 작성을 실시하여 비교하였다. 계통분석의 분지는 PHYLIP version 3.57의 NEIGHBOR, neighbor-ioining (NJ) 방법에 의해 구성하였다. 분류군의 가지에 대한 Bootstrap 분석은 500회 반복법으로 실시하였다.</p>
실험에 사용하기 위해 귤나무속과 근연 속 재료를 채집한 기간은 언제야?
2010년부터 2011년