<h2>효소의 Phenolic acid의 methyl esters에 대한 반응</h2><p>Pseudomonas sp. LG2를 탄소원인 HBSG I, HBSG Ⅱ, AFBSG 및 oat spelt xylan을 사용하여 일정기간 배양한 후 얻은 조효소 단백질을 phenolic acid의 methyl ester인 meth-yl ferulic acid(MFA), methyl sinapinic acid(MSA), methyl caffeic acid(MCA), methyl p-coumric acidMpCA), methyl vanillic acid(MVA), methyl gallic acid(MGA)를 사용하여 조효소의 esterase활성을 조사했다. Pseudomonas sp. LG2의 조효소는 methyl ferulic acid보다 methyl caffeic acid에 대해 더 높은 활성을 보였다. 그러나 같은 cinnamic acid의 유도체인 methyl sinapinic acid에 대해서는 효소활성 검출되지 않았다. 한편 vanillic acid는 lignocellulose를 구성하는 p-coumaric acid 및 ferulic acid에서 유도되지만 methyl vanillic acid의 methyl기 가수분해 활성이 없었으며, methyl gallic acid에 대해서도 esterase의 활성 역시 없는 것으로 조사되었다. Faulds 등의 보고에 의하면 Aspergillus niger를 이용하여 생산된 상업용 효소제에서 분리한 FAE-I, III는 효소의 종류에 따라 phenolic aicd 환의 \( \mathrm{C}_{5} \) 에 결합된 methoxy기는 효소반응을 저해하고, 다른 효소는 \( \mathrm{C}_{3} \) 의 methoxy기에 의해 반응이 활성화 되지만, \( \mathrm{C}_{3} \) 에 hydroxy기는 반응을 저해 한다고 했다. 또한 이들 효소의 기질은 cinnamic acid의 골격이 필요하고, \( \mathrm{C}=\mathrm{C} \) 2중 결합이 없으면 활성이 없다고 보고했다. 이러한 결과로 볼 때 본 실험에 사용된 탄소원에 의해 Pseudomonas sp. LG2가 생육 증식 동안에 유도되는 세포외 조효소에는 \( \mathrm{C}=\mathrm{C} \) 2중 결합이 없는 methyl vanillic acid 나 methyl gallic acid에 대해 효소활성이 없는 것으로 보아 이에 관련된 효소는 유도되지 않는 것으로 추측된다. 한편 Fauld 등은 S. olivochromogenes의 의해 생산된 FAE는 methyl caffeic acid에 대해서는 esterase의 활성이 없었다는 보고와는 차이가 있었다. 또한 Ferreira 등은 DSWB(de-starched wheat bran), SBP(sugar beet pulp), soluble fer-uloylated oligosaccharides(SFO)-DSWB 및 SFO-SBP 같은 탄소원을 사용하여 S. avermitilis가 생산한 세포외 효소를 이용하여 methyl esters phenolic acid를 기질로 ferulic acid의 분리 반응을 10 분에서 30 분 반응 시킨 결과 최저 \( 6 \% \) 에서 최고 \( 66 \% \) 의 ferulic acid가 생성되었으나, SBP를 탄소원으로 사용한 배지에서 얻은 효소는 \( 2 \% \) 에서 \( 16 \% \) 의 ferulic acid가 생성 되었다고 보고하였다. Pseudomonas sp. LG2의 세포외 조효소의 FAE 활성이 S. olivochromogenes 및 S. avermitilis에 의해 유도된 FAE의 methyl ferulic acid와 methyl caffeic acid에 대해 다르게 나타났는데, 이는 esterases의 유도에 사용된 기질의 차이 또는 유도되는 세포외 구성효소에 차이가 있는 것으로 생각되며 이에 관한 연구가 필요하다고 생각 된다.</p><h2>Gel상의 효소 활성 염색</h2><p>본 연구에서 Pseudomonas sp. LG2에 의해 유도 분비되는 세포외 단백질에 FAE 및 xylanase 효소 단백질의 존재 유무를 확인하기 위하여 zymogram을 실시하였다. Gel상의 효소활성을 조사하기 위하여 polyacrylamide gel 전기영동을 실시하여 앞의 실험 방법에 따라 FAE 및 xylanase의 활성을 umbelli-feryl trimethyl ammonium cinnamate chloride (MUTMAC)과 oat splet xylan을 기질로 각각 사용하여 조사한 결과를 Fig. 3에 나타냈다. 동결 건조한 Pseudomonas sp. LG2의 세포외 조단백질로 전기영동한 후 xylanase zymogram (A)을 실시한 결과반응 gel에 투명한 활성 band를 눈으로 확인되어 탄소원에 의해 Pseudomonas sp. LG2로부터 유도 생성된 세포외 단백질에 xylanase가 존재함을 알 수 있었다. FAE의 zymogram 분석 역시 동일한 방법으로 전기영동 한 후 \( 70 \mathrm{mM} \) phos-phate buffer \( (\mathrm{pH} 6)\)에 \( 0.05 \% \) 4-methyl umbelliferyl trimethyl ammonium cinnamate chloride(MUTMAC)를 함유한 용액에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응시키고 \( 312 \mathrm{~nm} \) 에서 활성 형광 band를 확인하였다. \( 312 \mathrm{~nm} \) 에서 조사한 결과 MUTMAC 를 가수 분해하여 생성된 형광 band를 확인 할 수 있었다. Ferreira 등이 여러 가지 탄소원을 이용하여 Streptomyces avermiti-lis CECT3339가 생산하는 FAE 의 전기영동 결과와 유사하였다. 그러나 Ferreira 등은 여러 가지 탄소원에 의해 몇 종의 cinnamic aicd esterases가 유도된다고 추정하였으나, 본 실험의 PAGE 단백질 분리 pattern을 조사한 결과로는 탄소원의 종류에 따라 다른 esterase가 유도되는지는 확인이 어려웠다.</p>
무엇을 사용하여 조효소의 esterase활성을 조사했는가?
phenolic acid의 methyl ester인 meth-yl ferulic acid(MFA), methyl sinapinic acid(MSA), methyl caffeic acid(MCA), methyl p-coumric acidMpCA), methyl vanillic acid(MVA), methyl gallic acid