<h1>Agarase의 분리 정제</h1><p>효소의 특성을 파악하기 위한 비활성(specific activity) 측정 및 agarase 유전자의 확보를 위한 아미노산 서열의 파악을 위해서는 효소의 분리 정제가 필수적이다. 현재까지 보고된 agarase의 분자량은 \( 18 \mathrm{kDa} \)에서 \( 109.5 \mathrm{kDa} \)까지로 다양하며, 황산암모늄이나 과황산암모늄 등을 이용한 단백질 염침전, 겔여과(gel filtration)법, 이온교환 크로마토그래피(ion-ex-change chromatography), 한외여과(ultrafiltration)법, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 등을 이용한 분리 정제법이 병용되고 있다.</p><p>상기의 모든 방법이 적용된 예를 보면 Rhee 등은 세포 배양액에 황산암모늄을 \( 20 \% \)까지 첨가한 후 원심분리(\(20,000 \)\(\mathrm{rpm}\), 20분)로 침전된 불순물을 제거하고 다시 황산암모늄을 \( 70 \% \)까지 첨가하였고 이후 원심분리(\(20,000 \)\(\mathrm{rpm}\), 20분)로 침전물을 회수하였다. 이후 \(20 \mathrm{mM}\) 인산완충용액(\(\mathrm{pH} \mathrm{8}\)) \(50\mathrm{ml} \)로 침전물을 용해시킨 후 인산완충용액(\(20\mathrm{mM}\), \(\mathrm{pH}8.0\))으로 하룻밤 투석하였다. 투석된 \( 70 \mathrm{ml}\)의 시료를 음이온교환수지에 부착시킨 후 \( 300 \mathrm{ml} \)의 인산완충용액 (\(20 \mathrm{mM}\), \(\mathrm{pH} 8.0\))으로 세척하고 \( 0 \sim 1 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \)이 첨가된 인산완충용액 (\(\mathrm{pH} 7.0\),\(20 \mathrm{mM}\))을 통과시켜 분획을 획득하였다. Agarase 활성이 있는 분획을 \( 10 \mathrm{kDa} \) pore size의 한외여과 장치로 농축한 후 인산완충용액(\(\mathrm{pH} 7.0\),\(20 \mathrm{mM}\))으로 처리된 Fast protein liquid chromatography (FPLC) 컬럼에 다시 부착시키고 \( 0.18 \sim 0.27\) \(\mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl} \)의 농도구배로 용출시킨 후 Bradford 법으로 단백질을 정량하여 agarase를 순수분리하였다.</p><p>음이온교환수지와 겔여과 만으로 agarase를 분리한 보고, 과황산암모늄을 이용한 단백질 침전과 음이온교환수지를 적용한 후 \( 0 \sim 0.5 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl}\)의 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris-HCl 완충용액 (\(\mathrm{pH} \) 8.0)으로 용출시켜 정제하여 배양액보다 비활성으로 45배인 agarase를 정제한 보고, 단백질 침전과 음이온교환수지 크로마토그래피 그리고 겔여과법으로 배양액의 129배로 agarase를 농축한 보고, 암모늄퍼설페이트 침전과 음이 온교환수지(Sephadex G-100)를 이용한 크로마토그래피로 배양액보다 비활성으로 670배인 agarase를 정제한 보고 등이 있었다.</p><p>이종 숙주에서의 단백질 생산의 경우에는 His-tag와 \( \mathrm{Ni} \) 컬럼을 이용한 정제와 단백질 분해효소의 활성이 저하된 분비형 숙주인 Bacillus subtilis DB104를 이용하여 agarase를 생산한 후 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 상등액을 한외여과한 후 SDS-PAGE상에서 agarase의 단일 밴드를 확인한 보고도 있다.</p>
효소의 특징을 파악하기 위한 비활성(specific activity) 측정 및 agarase 유전자의 증대를 위한 아미노산 서열을 이해하려면 어떻게 해야해?
효소의 분리 정제