<h1>재료 및 방법</h1><h2>시약 및 재료</h2><p>CPT는 Aldrich사에서, Sephacryl S-400, phenylmethane-sulfonylfluoride (PMSF), Tris-HCl, formamide, dithioth-reitol과 proteinase K는 Sigma회사로부터, DEAE-TrisAcryl, bovine serum albumin은 Pharmacia LKB 사에서, \( \alpha{ }^{32} \mathrm{P}- \) dCTP, restriction enzyme, Hyperfilm-MP, Hybond N+와 Rediprime labeling kit는 Amersham사 제품을, agarose, fetal bovine serum, gentamicin과 RPMI 1640은 Gibco-BRL사에서 구입하였다. eukaryotic DNA와 plasmid DNA의 정재용 kit는 Promega에서, total RNA정제용 kit와 Taq DNA polymerase는 Bioneer (KOREA) 제품을, pUC19은 USB사에서, pHSR은 연세의대에서 제공받았다. HL-60세 포는 KCTC (KOREA)에서, K562 세포는 ATCC에서 분양 받았으며, 그 외의 일반적인 시약은 분석용을 구입하여 사용하였다.</p><h2>PUC-MYC I DNA의 제조</h2><p>pUC-MYC I DNA는 IL-60제포로부터 Eukaryotic DNA isolation kit를 사용하여 DNA를 정제하고 c-myc exon 1 sense primer (Table 1)와 polymerase chain reaction (PCR) premix-top (Bioneer 사)을 사용하여 PCR을 실시하였다. 반응온도는 1 단계는 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 변성시키고, \( 51^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 annealing한 후, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 1분간 중합시키고, 2 단계에서는 \( 95^{\circ} \mathrm{C}\) 1분, \( 51^{\circ} \mathrm{C}\) 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 1분씩 연속 60 회 반응시켰고 3단계는 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 51^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 10분간 실시하여 c-myc exon I이 포함된 \( 965 \mathrm{bp} \) 의 DNA 절편을 합성하였다. 이 DNA와 pUC19 DNA를 각각 EcoRI겨 HindIII를 처리한 후 DNA ligase로 pUC19 DNA에 합성한 DNA 절편을 삽입하여 만든 pUC-MYC I DNA를(Fig. 1) Sambrook등의 방법에 따라 HB101 세포에 넣어 증폭시켜 plasmid DNA 정제용 kit를 사용하여 정제한 후 다음 실험에 사용하였다.</p><h2>K-562 세포에서 Topo l의 정제</h2><p>\( 10 \% \) fetal bovine serum이 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하여 배양한 사람 만성 백혈병 K-562 (ATCC CCL243) 세포를 Minford등[12]의 방법으로 핵 추출물을 얻은 후 \( 40 \%-80 \% \) 의 ammonium sulfate를 사용하여 분별 침전시키고 하룻밤 dialysis하여 탈염과 함께 nucleus 완충핵으로 평형시킨 후 Sephacryl S-400 column chromatography와 DEAE- trisacryl column chromatography, glycerol gra-dient centrifugation하여 효소를 정제하였으며, Topo I의 이완(relaxation) 활성은 \( 30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 bovine serum albu-min이 포함된 반응 혼합액 (\(50 \mathrm{mM}\) Tris-HCl: \(\mathrm{pH}7.5\), \(100 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}\), \(10 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{MgCl}_{2}\), \(0.5 \mathrm{mM} \) dithiothreitol, \( 0.5 \mathrm{mM} \) EGTA) \( 20 \mu \) 에 \( 400 \mathrm{ng} \) 의 pUC19 DNA와 정제한 K-562 Topo I 용핵 (또는 효소 분흭)을 \( 2 \mu 1 \) 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 간 반응시켰다. 이 반응핵에 \( 5 \mu 1 \) 의 \( 5 \% \) SDS, \( 25 \% \) Ficoll 400 과 \( 0.25 \mathrm{mg} \) \(\text{bromophenol blue} / \mathrm{ml} \) 의 혼합액을 넣어 반응을 정지시켰으며, 반응생성물은 TBE buffer \( 90 \mathrm{mM} \) Tris borate, \( \mathrm{pH} 8.3\), \(2.5 \mathrm{mM} \) EDTA)를 전개용매로 하고 \( 0.8 \% \) agarose gel을 사용하여 \( 4 \mathrm{~V} / \mathrm{cm} \) 로 전기영동을 실시하여 분석하였다.</p>
Aldrich사에서는 어떤 재료를 구입했지?
CPT