<h2>\( \mathrm{pH} \)와 온도에 따른 효소활성과 안정성</h2><p>각 \( \mathrm{pH} \)에서의 \( \beta \)-agarase agaJA3의 활성을 Fig. 3에 나타냈다. 사용한 \( \mathrm{pH} \) 중에서 \( \mathrm{pH} 5.0 \)에서 최고활성이 나타났다. 또한, \( 50 \mathrm{mM} \) GTA-\(\mathrm{HCl}\) 완충용액으로 활성을 측정하였을 때 \( \mathrm{pH} \) 5.0과 6.0의 범위에서 한천분해 상대활성이 \( 99 \% \)이상 유지되어 좁은 범위의 \( \mathrm{pH} \)에서 활성이 유지되는 것으로 파악되었고, \( \mathrm{pH} 7.0 \)에서는 \(78\%\) 정도의 상대활성을 나타냈으므로 중성과 약산성 범위에서 높은 활성을 보였다. 따라서 \( \mathrm{pH} 5.0 \)이 최적\( \mathrm{pH} \)로 판단되었다. 동일한 균주인 Agarivorans sp. JA-1에서 파악한 다른 한천분해효소의 최적 \( \mathrm{pH} \)는 GH-50 \(\beta \)-agarase 효소가 \( \mathrm{pH} 8.0\)이었고, GH-118 \(\beta \)-agarase 효소는 \( \mathrm{pH} 7.0\) 이었다. 그리고 \( \beta \)-agarase agaJA3와 아미노산 서열의 유사도가 높은 Vibrio sp. PO-303의 \( \beta \)-agarase AgaD의 최적 \( \mathrm{pH} \)는 7.5였으며, Pseudoalteromonas sp. CY24의 \( \beta \)-agarase AgaA는 \( \mathrm{pH} 6.5\) 에서 최대활성을 보였다.</p><p>최적 \(\mathrm{pH} \)인 \( \mathrm{pH} 5.0 \)의 \( 50 \mathrm{mM} \) GTA-\(\mathrm{HCl}\) 완충용액을 사용하여 파악한 각 온도에서의 \( \beta \)-agarase agaJA3의 활성을 Fig. 4A에 나타냈다. 최고의 활성을 나타낸 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)의 반응온도에서 나타난 효소활성인 \( 67.6 \mathrm{U} / \mathrm{mg} \)을 \( 100 \% \)로 하였을 때, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 92 \%\), \(50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 62 \%\), \(60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 38 \% \)의 상대활성을 나타내는 것으로 파악되었다. 이러한 결과로 \( \beta \)-agarase agaJA3는 한천분해효소는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 활성이 높은 효소라는 것을 알 수 있었다. 동일한 균주인 Agarivorans sp. JA-1에서 파악한 다른 한천분해효소의 최적 온도는 GH-50 \(\mathrm{\beta} \)-agarase 효소가 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)였고, GH-118 \( \beta \)-agarase 효소는 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)였다. 그리고 \( \beta \)-agarase agaJA3와 아미노산 서열의 유사도가 높은 Vibriosp. PO-303의 \( \beta \)-agarase AgaD와 Pseudaalteromanas sp. CY24의 B-agarase AgaA 모두 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최대활성을 보여 \( \beta \)-agarase agaJA3와 동일하였다.</p><p>Agarivorans sp. JA-1 유래의 B-agarase agaJA3의 열안정성을 Fig. 4B에 나타내었다. \(40^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 1, 1.5, 2 시간 정도의 열처리를 하여도 열처리하지 않은 효소가 나타내는 활성의 \( 99 \% \)이상을 유지하여 열안정성을 보였지만, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 30분간 열 처리를 행했을 때 열처리하지 않은 효소 활성의 \( 81 \% \)를 보였고 2시간이 지나면서 \( 60 \% \)수준으로 저하되어 열안정성을 보이지 않았다. 따라서 \( \beta \)-agarase agaJA3는 내열성은 높지 않은 것으로 판단되었다.</p><p>고체상태인 한천이나 아가로스를 가열하여 녹인 용액은 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)이하의 온도에서는 고체가 되는데, Agarivorans sp. JA-1 유래의 \( \beta \)-agarase agaJA3는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)이상의 온도에서도 높은 활성을 나타내므로 기질이 액체상태의 반응조건에서 한천올리고당을 생산하는 반응을 수행할 수 있어 효율적인 한천올리고당 생산공정의 개발이 가능할 것으로 기대된다.</p><h2>효소분해산물의 TLC 분석</h2><p>재조합 발현 후 정제된 Agarivorans sp. JA-1 유래의 \( \beta \)-agarase agaJA3 효소액에 아가로스를 기질로 첨가하여 시간별로 반응시킨 후 TLC로 분석한 결과를 Fig. 5 에 표시하였다. \(\alpha\)-agarase는 기질인 한천이나 아가로스에서 agaropentose 혹은 agarotriose를 생성할 수 있지만 \( \beta \)-agarase는 neoagarohexaose (NA6), neoagarotetraose (NA4) 그리고 neoagarobiose (NA2)를 생성할 수 있다. \( \beta \)-agarase agaJA3의 반응초기에 다양한 크기의 한천올리고당이 형성되어 무작위적으로 기질을 endo-type 형식으로 분해하는 것으로 파악되었다. 0시간에는 아가로스가 분해되지 않아 TLC에서 이동하지 않은 것을 알 수 있으며 반응 24시간에는 아가로스가 거의 분해되어 NA6 \(24.8\%\)와 NA4 \(15.7\%\)가 주로 생산되었다. 48시간도 24시간과 유사하였다. 따라서 Agarivorans sp. JA-1 유래의 \( \beta \)-agarase agaJA3가 \( \beta \)-agarase임을 확인할 수 있었다. \( \beta \)-agarase agaJA3와 아미노산 서열의 유사도가 높은 Pseudoalteromonas sp. CY24의 \( \beta \)-agarase AgaA은 아가로스 기질에서 최종적으로 NA4와 NA6를 주산물로 형성하였으며 Vibrio sp. PO-303의 \( \beta \)-agarase AgaD는 NA4를 주산물로 NA6와 NA2가 일부 형성되었다.</p><p>본 연구에서 분리하고 재조합 발현시킨 Agarivorans sp. JA-1 유래의 \( \beta \)-agarase agaJA3는 보습과 미백기능을 나타내는 NA4 등의 한천올리고당의 소재물질의 생산에 유용하게 이용할 수 있을 것이다.</p>
여러 \( \mathrm{pH} \)에서 한천분해 상대 활성도를 측정하였을때 \(78\%\) 정도의 상대활성를 나타내는 \( \mathrm{pH} \)는 몇인가?
\( \mathrm{pH} 7.0 \)