<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료 및 시약</h2><p>본 실험에 사용한 H. pylori는 한국유전자은행 (KCTC 12083)에서 분양받아 계대 배양하여 사용하였다. 배지에 사용된 항생제는 H. pylori selective supplement (Oxoid, SR0147E, England), 그람염색에 사용된 시약은 crystal violet (Becton Dickinosn, USA), carbol fuchsin (Becton Dickinosn, USA)를 구입하였다.</p><p>H. pylori의 outer membrane protein (OMP) 분리에는 so-dium laurylsarcosine (Sigma L9150, USA), lipopolysaccharide (LPS) 분리는 LPS extraction kit (Intron biotechnology, Korea), 분리된 항원의 농도측정은 단백질정량 Kit (Sigma 690-A), 분자량 측정 maker는 SeeBlue \( { }^{\circledR} \) Plus2 Pre-stained standard (Invitrogen, LC5925, USA)를 구입하여 사용하였다.</p><p>항체 생산에 이용된 adjuvant는 Freund's complete ad-juvant (FCA, Sigma F-5506), Freund's incomplete adjuvant (FIA, Sigma F-5881)를 사용하였으며, 항체분석을 위하여 2 차 항체는 anti-mouse IgG (whole molecule) alkaline phos-phatase conjugate (Sigma A2418)와 anti-mouse IgA (whole molecule), alkaline phosphatase conjugate (Sigma A4937)를 이용하였고, 항체함량 측정을 위한 표준품으로 mouse IgG (Sigma I5381)를 사용하였다. 발색 기질용액은 \( 10 \% \) dieth-anolamine buffer, \( 1\% \) phosphatase substrate (Sigma N2765) 를 이용하였고, Western blotting에 사용된 시약은 NC mem-brane (Nitrocellulose, Gelman Sciences Co., USA)과 Lumi-Phos WB (PIERCE 34150, USA) substrate를 사용하였다. 기타 연구에 사용된 용매 및 시약은 특급으로 사용하였다.</p><h2>H. pylori 배양 및 균주확인</h2><p>한국유전자은행으로부터 분양받은 H. pylori는 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} \) 농도 \( 10 \% \) 환경에서 \( 5 \% \) fetal bovine serum (FBS)과 항생제 (H. pylori selective supplement)가 포함된 Brucella agar plate에서 2~3일 간격으로 계대배양 하였다. 계대배양으로 활성화된 균주는 Brucella broth에서 48~72시간동안 액체배양 하였다. 균주확인을 위한 Gram 염색법은 4단계 순서로 진행되는데 우선 crystal violet으로 1 분간 염색한 후 gram iodine으로 1 분간 염색한다. Ethanol에 1 분간 세척한 후 carbol fuchsin으로 10 분간 염색한다. 모든 과정이 끝난 후 건조하여 광학 현미경 \( (\times 1,000) \) 으로 morphology를 관찰하여 균주 및 오염상태를 확인하였다. Urease 활성검사는 urea broth \( (\mathrm{pH} \) 6.8, Yeast extract \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \), monop-otassium phosphate \( 9.1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \), dipotassium phosphate \( 9.5 \) \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \), urea \( 20 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \), phenol red \( 0.01 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) )를 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 Eppendorf-tube에 분주하여 냉장 보관하였고, tube에 H. pylori를 접종시켜 색이 붉게 변화는 것으로 균주를 확인하였다.</p>
분리된 항원의 농도측정은 무엇을 이용했어?
단백질정량 Kit