<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료</h2><p>본 연구에서 사용된 홍삼은 경기도 여주에서 재배된 \(6\)년근 수삼을 \(2013\)년 \(10\)월, 직접 수매하여 사용하였다.</p><h2>시약</h2><p>홍삼 발효를 위해 미생물의 배양에 사용된 시약은 모두 Difco (Difco Laboratory, Detroit, MI, USA) 제품을 사용하였으며, 전처리에 사용된 효소혼합액은 한국 화학 연구원 융합 화학 연구팀에서 제공한 Cellulclast, HTec2, Amyloglucosidase 등의 \(1:1:1\) 혼합액을 사용하였다. 발효 균주는 F\(1\): Leuconostoc mesenteroides, F\(2\): Lactobacillus sp. MEI \(823\), F\(3\): Saccharomyces cerevisiae, F\(4\): Lactobacillus paracasei를 사용하였다. \(1\),\(1\)-diphenyl\(2\)-picrylhydrazyl (DPPH)와 \(2\),\(2^{\prime}\)-azinobis-\(3\)-ethyl-benzothiazoline\(6\)-sulfonic acid (ABTS)는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare (Little. Chalfont, UK)에서 구입하였다. Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), superoxide dismutase \(1\) (SOD-\(1\)), catalase, glutathione peroxidase (GPx), nuclear factorkappa B (NF-\(\kappa\)B p\(65\)), nuclear factor-erythroid \(2\)-related factor \(2\) (Nrf\(2\)), heme oxygenase-\(1\) (HO-\(1\)), inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-\(2\) (COX-\(2\)), tumor necrosis factor alpha (TNF-\( \alpha \)), interleukin-\(6\) (IL-\(6\)), Histone, \( \beta \)-actin과 \(2\)차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였으며, protease inhibitor mixture, dimethyl sulfoxide, ethylenediaminetetraacetic acid는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka. Japan)에서 구입하였다. cis-Diammineplatinum (Ⅱ) dichloride는 Sigma-Aldrich에서, blood urea nitrogen (BUN)과 creatinine assay kit는 아산제약주식회사 (Hwaseong, Korea)에서 구입하였다. 또한, \(2\),\(7\)-Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)는 Molecular Probes (Eugene, OR, USA)에서 enhanced chemiluminescence (ECL) Western Blotting Detection Reagents는 GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit는 Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다. 미생물의 배양에 사용된 시약은 모두 Difco (Difco Laboratory, Detroit, MI, USA) 제품을 사용하였다.</p><h2>시료 제조</h2><p>수삼을 세척한 후 인삼(RG\(0\))은 건조기에서 건조 하였고, 홍삼은 증숙 시간을 \( 2\), \(4\), \(6\), \(8 \)시간으로 구분하여 증숙한 후 건조기에서 건조하였다(Fig. \(1\); Table \(1\)). 건조는 밀폐 제습식 건조기 (ACE Machinery, Seoul, Korea)를 사용하여 수분함량 \( 15 \% \) 미만으로 건조하였고, 증숙은 무압식 스팀증숙기(ACE Machinery)를 사용하여 증숙온도 \(90 \)에서 증숙하였다. 홍삼의 발효에 사용된 균주는 구하기 쉬우며 안전성이 보장된 대표적인 균주인 Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus sp. MEI \(823\), Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus paracasei를 사용하여 발효하였다(Table \(2\)). 홍삼과 발효홍삼간의 항산화 지표와 유효 성분을 비교하기 위해 액상발효를 하였다. 홍삼을 각각 \( 5 \mathrm{~g} \)씩 칭량하여 넣고, \( 45 \mathrm{~mL} \)의 멸균 증류수를 첨가하여 현탁하였다( \( 10 \% \mathrm{w} / \mathrm{v} \)). 시료가 포함된 용기마다 미리 혼합된 복합 효소액 \( 0.5 \mathrm{~mL} \)를 첨가하고 하룻밤 반응시켰다. 시료에 따라 정해진 균주 현탁액을 \( 0.5 \mathrm{~mL} \)씩 접종하여 섭씨 \(35\) 인큐베이터에서 정치 배양하였다. 접종 시 균주의 농도는 생육에 따라 가감하여 \(107\)-\(108 \mathrm{~cells} / \mathrm{mL} \) 정도로 하였다. 샘플에 따라 간헐적으로 흔들어 주었고, 매일 같은 시간에 발효상태(\( \mathrm{pH} \))를 확인하고 발효의 지속여부를 결정 하였다. 신손상 예방 효능을 알아보기 위해 실시한 동물실험에 필요한 시료는 고형발효를 하였다. 사각 투명 밀폐용기에 각각 라벨을 붙이고, 시료를 샘플 하나당 \(2 \)개씩 각각 \( 50 \mathrm{~g} \) 씩(총 \(100 \mathrm{g}\)) 칭량하여 넣었다. \( 250 \mathrm{~mL} \)의 멸균 증류수를 첨가하여 현탁한 다음 (\( 20 \% \mathrm{w} / \mathrm{v} \)), 시료가 포함된 용기마다 미리 혼합된 복합 효소액 \( 2 \mathrm{~mL} \)를 첨가하고 하룻밤 반응시켰다. 그 후, 시료에 따라 터에서 정치 배양하였다. 배양액은 \(107\)-\(108 \mathrm{~cells}/ \mathrm{mL} \)의 균주 농도에 맞추어 접종하였다. 샘플에 따라 간헐적으로 흔들어 주었었으며, 매일 같은 시간 발효상태(\( \mathrm{pH} \))를 확인하고 \( 35^{\circ} \mathrm{C}\), \(6 \)일 간 발효하였다. 위의 시료들을 분쇄기로 분쇄 한 다음 시료 \( 5 \mathrm{~g} \)에 Distilled water \( 50 \mathrm{~mL} \)를 넣고, \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(3\)시간씩 \(2\)회 반복 추출하였다. Kimble-filtering flask에 funnel을 장착하고 여과지(Whatman No. \(2\), GE healthcare, Arlington Heights, IL, USA)를 사용하여 추출물을 여과한 뒤 여과액을 미리 항량된 용기에 넣어 \(45\)-\(50^{\circ} \mathrm{C} \)의 수온에서 rotary vacuum evaporator (JP/N-\(1000\)X\), EYELA)를 사용하여 감압농축 후 \( -30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(120 \)분, \( -15^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(120 \)분, \( 0^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(240 \)분, \( 15^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(120 \)분, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(120 \)분의 조건으로 동결건조 하였다.</p>
nuclear factorkappa B (NF-\(\kappa\)B p\(65\))는 어느 회사에서 구매하였는가?
Santa Cruz Biotechnology