<h2>항산화 효능 실험</h2><p>HaCaT cell을 96 well plate에 \( 1.5 \times 10^{4} \mathrm{cells/well} \)로 분주한 후 incubator에서 \( 24 \mathrm{~h} \) 동안 배양하였다. PBS로 2회 세척하여 phenol red를 제거한 후 \( 20 \mu \mathrm{M} \) 의 DCFDA를 well마다 처리한 다음 \( 45 \mathrm{~min} \) 간 incubator에서 보관하였다. PBS로 다시 세척하고 \( 500 \mu \mathrm{M}~H_{2}O_{2} \) (hydrogen peroxide)와 \( 10, 20, 40 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)농도의 시료 추출물을 더한 후 \( 45 \mathrm{~min} \) 동안 다시 incubator에서 보관하였다. Microplate reader의 \( 485 / 528 \mathrm{~nm} \)에서 형광값을 구하여 대조군에 대한 시료 처리군들의 값을 계산하고 이를 백분율로 나타내었다.</p><p>Relative activity \( (\%)=(\mathrm{A} / \mathrm{B}) \times 100 \)</p><ul><li>\( A \): 시료 처리군의 형광값</li><li>\( B \): 시료 무처리된 DMSO 용매 대조군 형광값</li></ul><h2>멜라닌 합성 저해 효과 실험</h2><p>B16F10 cell을 6 well에 \( 1 \times 10^{5} \mathrm{cells/well} \)로 분주한 다음 incubator에서 \( 24 \mathrm{~h} \) 동안 배양하였다. 대조군 외의 시료 처리군들에 \( \alpha \)-MSH \( (100 \mathrm{nM}) \)를 용해한 DMEM (serum free)을 \( 30 \mathrm{min} \) 동안 처리하였다. 배지를 교체하지 않고 시료 처리군들에 시료를 \( 2X \)로 더한 후 incubator에서 \( 48 \mathrm{~h} \) 동안 배양하였다. 각 well의 배지를 제거하고 PBS로 세척한 다음 세포를 원심분리 \( \left({4}^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm}, 3 \mathrm{~min}\right) \)하였다. 상층액을 제거한 후 세포 pellet에 RIPA lysis buffer (Tris-HCl ( \( \mathrm{pH~} 7.5 \)) \( 50 \mathrm{mM} \), NP-\( 40~1 \% \),\( \mathrm{NaCl}~50\mathrm{mM} \), SDS \( 0.1 \% \), sodium deoxycholate \( 0.5 \% \), protease inhibitor cocktail (Roche, Basel, Switzerland))를 처리하고 ice box에서 \( 30 \mathrm{~min} \) 간 보관하였다. 이를 다시 원심분리 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}, 14,000 \mathrm{rpm}, 10 \mathrm{~min}\right) \)한 다음 상층액을 제거하여 pellet만 남겨 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) oven에서 건조시켰다. 건조된 pellet에 \( 20 \% \) DMSO와 \( 2 \)N \( \mathrm{NaOH}~200 \mu \mathrm{L} \)를 첨가하여 섞어주고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) oven에서 pellet을 용해시켰다. 용해물을 \( 96 \) well에 \( 100 \mu \mathrm{L} \)씩 담고 microplate reader의 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><p>Relative activity \( (\%)=(\mathrm{A} / \mathrm{B}) \times 100 \)</p><ul><li>A: 시료 처리군의 흡광도</li><li>B: 시료 무처리된 DMSO 용매 대조군 흡광도</li></ul><h2>항균 활성 실험</h2><p>액체 배지(LB 배지)를 시험관에 \( 5 \mathrm{~mL} \)씩 담고 Auto clave에서 멸균하였다. 균주들은 \( 24 \mathrm{~h} \) 동안 액체 배지에서 배양된 후 이를 고체 배지에 처리하여 \( 24 \mathrm{~h} \) 동안 다시 배양하고 그 중에서 single strain를 따서 액체 배지에서 \( 18 \mathrm{~h} \) 동안 배양하여 얻었다. 멸균 처리된 시험관 마다 배양된 균주들을 \( 5 \mu \mathrm{L} \)씩 처리하였다. 시료들은 \( 0.1,0.2,0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \)의 농도로 처리되었다. 처리된 균주와 시료를 고루 섞은 후 시험관의 배지를 \( 100 \mu \mathrm{L} \)씩 96 well에 담고 microplate reader의 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 \( 0 \mathrm{~h} \) 의 흡광도 값을 측정하였다. 시험관들은 shaking incubator에서 보관하고 접종한 균주가 성장하는 \( 6 \mathrm{~h} \) 부터 \( 3 \mathrm{~h} \) 간격으로 \( 24 \mathrm{~h} \) 동안 흡광도를 측정하였다. 항균 효과는 \( 0 \mathrm{~h} \)의 대조군 흡광도에 대한 각 시간대 별 시료 처리군들의 흡광도로 나타내어 농도와 시간대별에 대한 변화를 관찰할 수 있었다. 측정된 흡광도 값을 대조군 값에 대해 계산하되, 시료들의 색채값을 제한 값을 효과값으로 하였다.</p><p>Relative activity \( (\%)=\left(A_{1}-\left[A_{0}-B_{0}\right] / B_{0}\right) \times 100 \)</p><ul><li>\( A_{1} \) : 시료 처리군(균 접종 후 시간별 상태)의 흡광도</li><li>\( B_{0} \) : 시료 무처리된 DMSO 용매 대조군의 흡광도 \( (0 \mathrm{~h}) \)</li><li>\( A_{0} \) : 시료 처리군(균이 없는 상태)만의 흡광도 \( (0 \mathrm{~h}) \)</li></ul><h2>통계 분석</h2><p>본 실험들은 3회 이상 반복하여 실시하였다. 그래프는 각 실험들의 횟수에 따르는 평균(mean)과 표준편차(standard deviation)를 통해서 나타내었으며 유의성은 student's t-test로 검증하고 유의미한 판정 범위를 \( p<0.05\left({ }^{*}<0.05,{ }^{* *}<0.01,{ }^{* * *}<0.001\right) \) 으로 정하였다.</p>
항균 효과의 측정은 어떻게 이루어져?
항균 효과는 \( 0 \mathrm{~h} \)의 대조군 흡광도에 대한 각 시간대 별 시료 처리군들의 흡광도로 나타내어 농도와 시간대별에 대한 변화를 관찰할 수 있었다.