<h1>결과 및 고찰</h1><h2>Construction of plasmid DNA and purification of recombinant \( \beta-1,3 \)-glucanase of \( P \). furiosus</h2><p>PCR 반응으로써 \( 894 \mathrm{bp} \) 의 \( \beta-1,3 \)-glucanase ORF 유전자 증폭산물을 성공적으로 얻어 낼 수 있었으며, 이를 pET-22b (+) vector와 ligation 후 대량발현 host인 E. coli BL21 (DE3)에 transformation하였다. Plasmid 내 \( \beta-1,3 \)-glucanase ORF는 se-quencing을 통하여 삽입된 정확한 염기서열을 확인한 뒤, IPTG 를 이용한 유도발현을 수행하였다. Fig. 1에 나타낸 것처럼 host E. coli의 배양과정 중 IPTG를 이용한 대량유도 발현이 성공적임을 확인하였으며, 약 \( 33 \mathrm{kDa} \) 의 대량발현 된 재조합 \( \beta-1,3 \)-glucanase는 대부분 inclusion body의 형태로 cyto-plasm내에서 존재함을 확인하였다. 초음파로 처리하여 cell을 파쇄 후 inclusion body를 얻었으며, 6 M urea가 첨가된 \( 20 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{Tris-HCl}(\mathrm{pH} 8.0\) )을 이용해 denaturation 하였으며, \( 20 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{Tris-HCl}(\mathrm{pH}8.0 \) )로 하릇동안 투석하여 re-folding 시킨 뒤 Ni-NTA affinity column 정제 방법으로 his-tag이 부가된 순수한 재조합 \( \beta-1,3 \)-glucanase만을 정제 할 수 있었다.</p><h2>Analysis of \( \beta-1,3- \) glucanase activity</h2><p>정제한 재조합 \( \beta-1,3 \)-glucanase \( 5 \mu \mathrm{g} \) 을 laminarin이 \( 0.5 \% \) 첨가된 \( 50 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{Tris-HCl}(\mathrm{pH} 8.0) 1 \mathrm{ml} \) 에 넣어 반응시켰다. \( \beta \) \( -1,3 \)-glucanase와 laminarin의 반응 후 반응액을 TLC를 통하여 laminarin의 분해 및 분해된 환원당의 유무를 확인하였다. 전개용매를 따라 이동한 spot들의 위치를 분석한 결과, 정제한 \( \beta-1,3 \)-glucanase이 첨가되지 않고 liminarin만을 첨가한 con-trol 용액의 spot은 전개용매에 의한 이동이 거의 없었으나, . \( \beta \) \( -1,3 \)-glucanase 와 반응한 laminarin 용액은 다양한 종류의 저분자 올리고당 또는 단당의 형태로 분해됨을 알 수 있었으며 glucose의 Rf치와 동일한 spot도 존재하고 있었다. HPLC를 사용한 분석에서도 TLC의 결과와 마찬가지로 stand-ard 물질로 주입한 glucose와 retention time이 같은 peak가 존재하였으며, 다른 retention 시간에서 나타나는 peak들이 있는 것으로 보아 고분자의 laminarin이 glucose 및 glucose 이외의 올리고당으로 분해 되었음을 알 수 있었다.</p><p>이와 같은 결과는 해조류 다당인 laminarin을 분해할 수 있는 유용효소로 이용 할 수 있음을 보여 주었다.</p>
Plasmid 내 \( \beta-1,3 \)-glucanase ORF는 se-quencing을 통하여 삽입된 무엇을 정확히 확인할 수 있는가?
염기서열