<h1>결 과</h1><p>\( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리할 때에 신경세포(PC12)가 hypoxia 상태가 되는 것을 확인하기 위하여 HIF1 alpha의 발현을 관찰하였다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리하였을 때에 control에 비교하여 약 1.5배 HIF1 alpha가 증가하는 것이 관찰되었다(Fig. 1). \( \mathrm{CoCl}_{2} \)가 apopto-sis를 유도하는지를 확인하고, apoptosis를 유도하는 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)의 농도와 처리시간을 결정하기 위하여 DNA fragmentation 실험을 하였다. 아무것도 처리하지 않은 control의 genomic DNA는 fragmentation이 나타나지 않았다. 또 다른 positive control로 chemical hypoxia inducible drug인 DFA와 ER stress in-ducible drug인 tunicamycin을 처리한 경우는 모두 처리 2일째에 DNA fragmentation이 나타났다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)의 경우는 \( 0.5 \times \) \( (0.05 \mathrm{mM}), 1 \times(0.1 \mathrm{mM}), 2 \times(0.2 \mathrm{mM}) \)의 농도로 처리한 1일째는 관찰되지 않지만 처리 2일째는 모두 DNA fragmentation이 관찰되었다. 이후의 실험은 \( 0.5 \times, 1 \times \) 농도로 2일 동안 처리하였다(Fig. 2). 위와 같이 적정한 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)을 처리하였을 때에 apop-tosis 현상에서 나타나는 또 다른 전형적인 현상인 apoptoticbody를 Hoechst 33342로 염색하여 형광현미경에서 관찰하였다. Fig. 3에서 화살표가 나타내는 것과 같이 정상세포 핵과는 다르게 핵의 응축이 일어나 apoptotic body를 형성하려는 세포가 관찰되었다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)의 처리에 따른 ER lumenal chaper-one의 발현을 알기 위하여 가장 대표적으로 잘 연구되어 있는 Bip의 발현을 관찰하였다(Fig. 4A). 당쇄형성저해에 의한 ERstress 유도제인 tunicamycin보다는 약하지만 분명하게 상승된 Bip 유전자의 발현이 \( 1 \times \)에서 관찰되었다. 그리고 ER mem-branous chaperone인 calnexin의 유전자 발현 역시 1.5배 정도 control에 비하여 강한 발현이 확인되었다(Fig. 4B). ER lumen에서 단백질의 redoxin chaperone으로 작용하는 ERp72,ERp29, PDI는 의미 있는 변화가 없거나 오히려 내려가는 경향을 보였다(Fig. 4D). ER membrane을 구성하는 단백질로서 proteasome의 ubiquitin-like domain에 결합하는 RibophorinI (Rpn1)의 발현은 control에 비해서 증가하였다(Fig. 4C). ERstress signal에 관여하는 ER membrane kinase인 IRE1, PERK,ATF6의 발현을 조사하였다. ATF6은 미미한 상승발현의 변화가 관찰되었고 PERK는 1.5배 강한 발현을 보였다. 그러나 IRE1의 경우는 \( 1 \times \)에서 약 2.5배 정도 증가한 발현을 보였다(Fig. 5). ATF6의 mRNA 발현이 아닌 ATF6 단백질의 발현변화를 Western blotting으로 관찰하였다. ATF6 단백질의 발현 역시 아주 약한 상승 발현만이 관찰되었다(Fig. 6). IRE1의 하부 정보단계인 XBP1 mRNA splicing을 실험하였다. Tunicamycin을 처리한 세포에서는 아주 강한 XBP1 mRNAsplicing이 관찰되었으나 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리한 세포군에서 전혀 관찰되지 않았다(Fig. 7). PERK 단백질 자체의 발현변화를 Western blotting으로 관찰하였다. Control에 비하여 높은 발현을 보였다(Fig. 8). 한편 eIF2 \( \alpha \)의 인산화 정도를 관찰한 결과 eIF2 \( \alpha \) 인산화형이 PERK 단백질 자체의 발현 변화보다 훨씬 강한 발현을 보였다(Fig. 9). IRE1과 결합하여 하부 신호를 조절하는 TRAF2의 발현을 Western blotting으로 관찰하였다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리한 세포군에서 유일하게 강한 발현이 관찰되었다(Fig. 10). CHOP의 발현은 아주 약한 발현양상을 보였다.</p>
이 실험은 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)가 세포사멸을 유도하는지 확인하기 위한거야?
NO