<p>단백질 추출은 마찬가지로 형질전환 48시간 경과 후 RiPA buffer (50\( \mathrm{mM} \) Tris-HCl of \( \mathrm{pH} \) 8.1, 150\( \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \), 1\( \% \mathrm{v} / \mathrm{v} \) NP-40, 0.5\( \% \) \(\mathrm{w} / \mathrm{v} \) sodium deoxycholate, 0.1\( \% \mathrm{w} / \mathrm{v} \) sodium dodecyl sulphate and protease inhibitor)를 가하여 4\( ^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 방치한 후 scraper로 세포를 걷었다. 용해된 세포를 초음파 분해한 후 원심 분리하여 단백질을 분리하였다. Bicinchoninic acid assay를 통해 단백질을 정량하고 SDS-polyacrylamide gels 에서 크기 별로 분리하여 polyvinylidene difluoride membrane 에 옮긴 다음 일차 항체를 4\( ^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( \mathrm{O} / \mathrm{N} \) (overnight)으로 반응시켰다. TBS-Tween 용액으로 세척 후 이차항체와 상온에서 1시간 반응시킨 후 앞과 동일한 방법으로 1시간 동안 세척하였다. ECL detection kit (Biosesang, Seongnam, Korea) 용액과 반응시켜 필름에 감광하여 결과를 확인하었다.</p><p>HBx 는 바이러스 감염 초기 단계에서 유전자 복제에 중요한 역할을 할 분만 아니라 B 형 간염 바이러스와 관련된 질병과 hepatocellular carcinoma 발병에 핵심적인 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 B 형 간염 바이러스에서 발현되는 HBx 단백질이 간섬유화 발병에 어떤 역할을 하는지 알아보기 위허여 HBx 를 발현하조록 세포를 형질 전환하여 실험을 수행하였다. 먼저 vector 10\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 를 형질 진환한 대조군(vector) 과 HBx 10\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 를 형질 전환한 실험군 HBx 에서 RNA 를 추출하여 RT-PCR을 통해 HBx mRNA 발현을 확인하였다. 실험 결과 대조군에서는 HBx mRNA가 발현되지 않았고 실혐군에서 발현된 것을 통해 형질진환이 정상적으로 이루어졌음을 확인하였다(Fig. 1A). B형 간염 바이러스에 감염되어 간섬유화가 진행된 환자에게서 fibrotic marker인 vimentin과 fibronectin이 증가된 것을 관찰할 수 있다. 이 현상이 HBV의 HBx 에 의한 것인지를 알아보기 위해 HBx 를 형질진환시킨 후 vimentin과 fibronectin의 mRNA 및 단백질 발현을 확인하였다 (Fig. 1B, C). Vimentin은 type intermediate filament 단백질로 세포이동(cell migration), 부착(adhesion) 등을 유도하며 간섬유화에서 HSC 가 활성화가 되어 있는 동안 발현된다고 알려져 있다. Fibronectin은 간섬유화 과정에서 중요한 세포외기질 중 하나이다. 실험 결과, HBx 를 형질전환시킨 실험군에서 대조군과 비교하여 vimentin의 mRNA와 단백질 모두 증가된 것을 관찰할 수 있었으며, fibronectin 또한 증가된 단백질 발현양을 관찰할 수 있었다. 이 결과를 동해 HBx 가 형질전환된 Huh7 세포에서 간섬유화가 진행되는 것을 확인할 수 있었다.</p><p>HBx 에 의한 섬유화가 어떠한 과정을 거쳐 이루어지는지를 알아보기 위한 실험을 수행하였다. 상피-간엽전환(Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)은 상피 세포(epithelial cell)가 침윤능력과 전이능력을 가지는 세포로 바뀌는 과정이다. EMT 가 간조직에서 발생이 될 때는 간에 손상이나 염증이 발생하였을 경우이다. 간세포가 EMT를 동해 간엽세포로 분화된 후 다시 간엽상피 진환을 거치면서 재생이 일어나 손상이 회복된다. 그러나 그 손상이나 염증이 과도한 경우 기질 재형성이 유발되어 간섬유화가 발생하게 된다. 따라서 간섬유화의 원인이 되는 EMT의 핵심조절자인 진사인자 snail (snai1)과 slug (snai2)의 mRNA와 단백질 발현을 확인하였다(Fig. 2). 그 결과 slug는 mRNA와 단백질 모두 대조군에 비해 유의적으로 증가한 것을 관찰할 수 있었으며 snail은 mRNA 수준에서는 실험군에서 유의적 차이가 있게 증가하였지만 단백질 수준에서는 유의적 차이 없이 미세한 증가를 보였다. Slug에 의한 vimentin 의 조절은 여러 논문 의해 보고 되어왔다. 따라서 HBx 에 의한 vimentin의 증가는 snail보다는 slug를 통해 조절된 것이라 사료된다.</p><p>최근 들어 ROS가 세포 증식, 분화, 이동과 같은 다양한 세포 과정에 관여한다는 내용의 논문이 많이 발표되고 있다. ROS 가 섬유화와 암에서의 어떠한 역할을 하는지는 잘 알려져 있으며, EMT와 관련이 있다는 사실 또한 계속해서 밝혀지고 있다. NOX는 다양한 자극에 의해 ROS를 발생하는 효소로, 간 내에서 NOX system에 의해 발생되는 산화스트레스는 여러 가지 간질환과 간섬유화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. NOX4는 ROS 를 생성하고 근섬유아세포(myofibroblast)의 활성화를 조절하여 폐와 신장의 섬유화에 중요한 역할을 한다. 이에 snail과 slug의 증가가 ROS와 관련되어 있는지를 알아보기 위해 NAPDH oxidase의 발현을 확인하였다. 그 결과 HBx 가 형질전환된 실험군에서 NOX4 가 mRNA 와 단백질 수준 모두에서 대조군에 비해 증가된 것을 확인할 수 있었고 또 다른 NADPH oxidase인 NOX2 는 NOX4 와는 달리 HBx 에 의한 증가를 보이지 않았다(Fig. 3).</p>
단백질 추출은 RiPA buffer 를 가한후 몇분간 방치해야 해?
30 분간