<h1>서 론</h1><p>소포체 (endoplasmic reticulum; ER)는 세포분비물, 세포막, 골지체와 lysosome이 유기적으로 연관된 단백질의 합성과 폴딩 (folding)에 중요 세포내소기관이다. 소포체는 신생 단백질의 당화(glycosylation), 이화황화결합 (disulfide bond formation), 폴딩, 조립 (assembly), 분해와 같은 중요한 기능을 한다. 단백질은 소포체에서 적절한 입체 형태로 폴딩 및 posttranslational modification이 일어나야 한다. 폴딩이 안되거나 잘못 폴딩된 단백질은 골지체로 운반될 수 없다. 소포체내 비정상직인 단백질의 축적은 소포체기능을 방해하고, 세포생존을 위협할 수 있다. 이와 같은 소포체 기능에 직접적으로 관여하는 소포체 단백질무리를 소포체 분자샤페론 (ER molecular chaperone)이라고 한다. 지금까지 보고된 대표적인 것으로는 Bip, GRP94, Erp72, PDI, calnexin, calre-ticulin, Erp29 등이 있다.</p><p>소포체 막에는 3개의 소포체 스트레스를 감지하는 kinase 감지기 (Ire1, ATF6, PERK)가 있다. 스트레스가 없는 상태에서는 소포체 샤페론 BiP은 3개 감지기의 소포체 내강의 도메인에 결합되어 있다. 폴딩되지 않거나 잘못 폴딩된 단백질(unfoilded / misfolded protein)이 소포체 내에 축적되면, 소포체스트레스 감지기에서부터 BiP이 분리되어 비정상적인 단백질에 결합한다. BiP의 해리는 소포체스트레스 감지기의 활성화를 유도한다. Ire1과 PERK는 dimer형성에 의해 활성화된 후 자가인산화 (autophosphoylation)된다. 비활성형 ATF6 (p90ATF6)은 골지체로 운반된 후 Site-1 protease(S1P)와 Site-2 protease (S2P)에 의해 2단계 절단 (cleavage)에 의해 활성화되면서 활성형 ATF6 (p50 ATF6)으로 바뀐다. p50 ATF6 활성형은 핵 속으로 운반되어 ER stress 관련 유전자들의 전사 활성인자로서 작용한다.</p><p>소포체 스트레스 반응단계는 4가지로 나누어 설명한다. 첫 번째 단계는 활성화된 PERK가 eIF-2 \( \alpha \) ( \( \alpha \) subunit of eukaryotic initiation factor 2)의 인산화를 통해 단백질합성을 감소시켜서 전체적인 단백질 합성을 감소시키는 과정이다. 두 번째 단계는 소포에 내에 단백질 폴딩 활동을 증강시키기 위해 BiP와 같은 소포체 샤페론을 유도하는 것이다. 세번째 단계는 세포질 내 ubiquitin-proteasome system을 통한 소포체내 폴딩되지 않거나 잘못 폴딩된 단백진을 분해하는 과정이다. 이는 ER stress 관련 분해 (ER stress-associated degradation; ERAD)라고 불린다. 마지막으로 소포체 스트레스 유도성 스트레스가 너무 심하여 소포체 기능을 회복할 수 없을 때에는 세포사멸 (apoptosis) 경로가 활성화되어 손상된 세포를 제거한다. ER stress 상태에서는 이들 4가지 반응단계가 시간 의존적으로 이행된다.</p><p>본 연구의 주된 대상인 Ajuba는 세포질 LIM domain에 포함되는 단백질 family의 일원으로 세포의 표면부착과 밀접한 관계가 있다. Actin cytoskeleton의 표면 수용체로서의 기능을 맡게 된다. 세포와 세포 사이간의 접근되어 있는 상태에서 세포질 내에서의 퍼트려나가는 확산을 조절하는 가능을 가진 인자로써, 기능적 leucine이 풍부한 NES (nuclear export signal)와 세포표면으로부터 세포질에서 핵까지 순환을 한다. 또한 세포 간 응착을 제공하는 경로로써의 기능은 핵으로의 신호를 전달함으로 세포의 증식 및 분화를 결정하는 중요 조절의 인자이다.</p><p>본 실험에 사용되는 갑상선 배양세포인 FRTL-5 (Fisher rat thyroid cells)는 5\(\% \) 우혈청을 포함한 Coon's modified media에서 배양한다. 배양조건은 \(37 ^{\circ} \mathrm{C}\), \(5\%\) \(\mathrm{CO}_{2}\), \( 95\% \)이상의 적당한 습도를 유지한다. 신선한 배지를 2일 간격으로 교체하며 배양하였으며, 1주일에 한 번씩 계대 배양하였다. 실험에 쓰이는 세포는 \( 70 \sim 90 \%\)의 충실도를 보이는 세포를 사용하였고 전 처리 후 pre-warmed PBS (phosphate buffered saline)로 2회 세척한 후, ER stress 유도하는 시약 [DTT (3\( \mathrm{mM} / \mathrm{ml}) \), tunicamycin (20 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml})\), \(\mathrm{Ca}^{2+} \) ionopore A23187 (\( 1\mu l / \mathrm{ml})\), BFA \((1 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml}) \)]을 처리한다. Total RNA를 얻기 위하여 easy-BLUE \( { }^{\mathrm{TM}} \) Total RNA Extraction Kit를 사용한다. RT-PCR은 total RNA (3\(\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)에서 cDNA의 합성 후 \(94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 반응시켜 Reverse Transcriptase를 inactivation시킨 후 DEPC-\(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 로 최종 \(100 \mu \mathrm{l} \)를 만들었다. cDNA를 증폭하기 위해 mouse Ajuba (NM_010590) primer (20-mer sense primer 5'-AGTCTCCTGGTCCCTTCGTT-3', 20-mer antisense primer 5'-TCACCCTCACAATGTCCTCA-3')와 dNTP와 taq polymerase및 taq buffer가 혼합된 2 \(\times \) Dyemix (Biostream) 가하여 총 반응액이 20\(\mu \mathrm{l} \)가 되도록 하여 PCR을 시행하였다. Ajuba의 증폭조건은 처음 \(94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 predenaturation 시킨 후 \(94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초간 denaturation, \(57.5^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초간 anealing, \(72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 50초간 extension을 29회 반복한 후 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 final extension 시간을 가진 후 \(4^{\circ} \mathrm{C} \)를 유지하도록 하였다.</p>
단백질이 적절한 입체 형태로 폴딩되는 곳은 어디인가?
소포체