<h1>재료 및 방법</h1><h2>Cell culture</h2><p>실험에 사용된 인간 연골암 세포주 HTB-94 cell (AmericanType Culture Collection, Manassas, VA, U.S.A.)는 \( 10 \% \) 의 FBS (fetal bovine serum), \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 streptomycin,\( 50 \mathrm{units}\)/ \( \mathrm{ml} \) 의 penicillin이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, U.S.A.)에 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 배양하였다. 계대배양은 배양접시에 \( 1 \times 10^{6} \) cells/dish의 밀도로 배양하였다. 배지는 2~3일마다 교환하였으며 배양접시의 세포밀도가 거의 \( 80 \% \) 가 되었을 때 본 연구에 사용된 시약을 처리하였다.</p><h2>Western Blot Analysis</h2><p>단백질의 정량분석을 위하여 세포를 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \mathrm{pH} \) 7.4, \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 1 \% \) Nonidet P-40, 0.1\% SDS가 함유된 celllysis buffer에 단백질 분해효소 억제제[ \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) leupeptin, \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) pepstatin A, \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) aprotinin, \( 1 \mathrm{mM} \)4-(2-aminoethyl) benzensulfonyl fluoride]를 첨가하여 세포 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 SDS-polyacrylamide gel에 전기영동하여 단백질을 크기 별로 분리한 후 nitro-cellulose (NC) 막으로 이동시켰다. 단백질 발현분석을 위해 1 차 항체인 p53, pro-caspase 3, actin (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, U.S.A.)을 2 시간 동안 단백질이 부착된 NC 와 반응시킨 후, 2차 항체를 1시간 동안 반응시켜 chemiluminescence 시스템을 이용하여 분석하였다.</p><h2>MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) assay</h2><p>인간 연골암 세포주 HTB-94 cell를 96 well plate에 세포를 \( 2.5 \times 10^{4} \) cells/well로 \( 200 \mathrm{\mu l} / \) well 분주하여 incubator에 배양한다. 세포밀도가 \( 80 \% \) 이상 되었을 때 시약을 처리하였으며 시약을 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다. 배양한 후 MTT reagent I 을 최종 농도 \( 10 \% \) 로 첨가하고 4 시간 동안 배양한 후, 다시 solubilization sulution인 MTT reagent I (10% SDS in \( 0.01 \) M HCL, DMSO) 를 최종 부피의 2 배 첨가하여 formazan 결정을 12시간 동안 용해한 후 ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) reader를 사용하여 흡광도 \( (595 \mathrm{~nm}) \) 값을 측정한다.</p>
시약처리한 후 몇 시간 동안 배양했어?
24 시간