<h2>Western blotting 분석</h2><p>단백질 발현 분석을 위하여 준비된 세포들을 lysis buffer[\(25\mathrm{mM}\) Tris-Cl (\(\mathrm{pH} 7.5\)), \(250\mathrm{mM} ~\mathrm{NaCl}, 5\mathrm{mM}\) EDTA, \(1\%\) NP-40, \(1\mathrm{mM}\) phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), \(5\mathrm{mM}\) dithiothreitol (DTT)]로 용해한 후, 정량하고 동량의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH)으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, 특정 단백질에 대한 항체와 그에 따른 이차 항체 반응을 실시한 후 enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL)을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA) 및 Calbiochem(Cambridge, MA)에서 구입하였으며, 2차 항체로 사용된 per-oxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science에서 구입하였다.</p><h2>In vitro caspase 활성의 측정</h2><p>준비된 세포들로부터 단백질을 추출하고 정량하여 각각 \( 150 \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 fluorogenic peptide 기질 \( 100 \mu \mathrm{M} \)이 함유된 extraction buffer [\(40\mathrm{mM}\) HEPES (\(\mathrm{pH} 7.4\)), \( 20 \% \) glycerol(v/v), 1\(\mathrm{mM}\) EDTA, \(0.2\%\) NP-40 and \(10\mathrm{mM}\) DL-DTT] \(50 \mu \mathrm{l}\)에 혼합하였으며, microtiter plate에 다시 extraction buffer에 희석하여 각 sample 당 총 volume이 \( 100 \mu \mathrm{l}\)가 되게 하였다. 실험에 사용된 기질은 caspase-3의 경우에는 Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA)이었고, caspase-8의 경우에는 Ile-Glu-Thr-Asp (IETD)-pNA이었으며, caspase-9은 Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA였다. 준비된 plate를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 incubation 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 \( 405 \mathrm{nm} \)의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다.</p>
무슨 분석을 위해 세포들이 준비됐어?
단백질 발현 분석