<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료 및 유전자 준비</h2><p>E. coli에서 Ci-VSP phosphatase-like domain의 재조합 단백질 발현을 위해 GST-Ci-VSP(248-576)으로부터 phosphaase-like domain(248-576)을 PCR로 증폭한 후(forward primer: 5'-TAACATATGATATCACAGAACGCG-3', reverse primer: 5'-AATCTCGAGAATGTCTTCAGCATC-3') Nde I, Xho I 제한 효소를 이용하여 \( \mathrm{pET} 21 \mathrm{a}(+) \) vector (Novagen)의 동일 제한 효소 부위에 삽입하여 Ci-VSP(248-576)-His DNA를 제작하였다. 이외의 실험 재료는 Sigma-Aldrich로부터 실험실 수준의 것을 사용하였다.</p><h2>Transformation</h2><p>Micro tube에 Rosetta \( ^{\mathrm{TM}} \) (DE3) singles competent cell (Novagen) \( 50 \mu \mathrm{l} \) 와 Ci-VSP(248-576)-His DNA \( 1 \mathrm{ul} \) (\(100 \mathrm{ng}\))를 가지고 transformation 하였다. 이것을 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin과 \( 34 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) chloramphenicol을 항생제로 사용하여 선택하였다.</p><h2>IPTG induction</h2><p>Culture tube에 LB media \( 5 \mathrm{ml} \) 를 넣고 final 농도가 \( 50 \mu \)\( \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin과 \( 34 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) chloramphenicol을 넣어 주고 형질전환을 통해서 얻은 콜로니를 2~3개 정도를 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) shaking incubator에서 \( 300 \mathrm{rpm} \) 으로 12~16시간 동안 배양하였다. 2X YT media 1 I에 앞의 seed culture를 넣어 주고 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin과 \( 34 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) chloramphenicol을 넣어 주었다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) shaking incubator에서 \( 300 \mathrm{rpm} \) 으로 2시간 30분간 배양하였다. 이후 UV-Vis spectrophotometer (Beckman Coulter)로 O.D. \( (600 \mathrm{~nm}) \) 를 측정하여 O.D. 값이 0.2 이상 측정되면 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin과 \( 34 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)chloramphenicol 을 한번 더 넣어 주고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) shaking incubator에서 \( 300 \mathrm{rpm} \) 으로 1시간 배양하였다. 다시 O.D. 값을 측정하여 0.6 ~ 1.0 이 될 때 까지 배양하였다. 이후 20분 동안 ice에 두어 안정화를 시킨 뒤에 micro tube에 \( 500 \mu \mathrm{l} \) 정도 sampling 하고 \( 0.4 \mathrm{mM} \) 의 Isopropyl 3-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin과 \( 34 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) chloramphenicol을 추가로 넣어주고 shaking incubator에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), \(300 \mathrm{rpm} \) 조건으로 16시간 동안 배양하였다.</p>
사용한 ampicillin 는 어느 정도의 농도였나요?
\( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)