<h1>재료 및 방법</h1><h2>Bacterial strains, culture conditions and vector</h2><p>Cloning host로써 Novagen에서 구입한 Escherichia coli DH5a와 BL21(DE3)을 Luria-Bertani (LB) broth (Difco, USA)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 로 배양하였으며, pET-22\(\mathrm{~b}(+) \) 를 cloning vector로 사용하였다. Yeast (Pichia angophorae CBS5830와 Saccharomyces cerevisiae)를 alcohol 발효 균주로써 \( 150 \mathrm{rpm} \), \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 조건 하에서 Horn 등의 방법을 사용하여 배양 하였으며, 에탄올 생산에 사용한 배지는 \( 0.02 \% \) urea와 \( 0.006 \% \)\( \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \) 를 basal medium으로 하였으며 배지의 \( \mathrm{pH} \) 는 Mcilvaine 의 방법에 따라 조정하였다. 그리고 각각의 균주는 glycerol을 이용하여 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보존하였다.</p><h2>Overexpression of \( \beta-1,3- \) glucanase of P. furiosus</h2><p>본 연구에서 template로 사용한 DNA는 Georgia대학 생화학과 Dr. M. Adams로 부터 받아 사용하였으며, endo-1,3- \( \beta \) -glucanase (accession number: AF013169)의 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. 모든 분자생물학적 실험방법은 Sambrook 등의 방법을 따랐다. Glucanase의 ORF 를 각각 Ndel 과 Xhd site가 존재하는 forward primer (5'-GGCCCATATGA AAAAAGAAGCCTTGTTGTTTC-3') 와 reverse primer (5'-G GCCCTCGAGACCACTAACGAATGAGTAAAC-3')를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭한 endo-1,3-ß-glucanase는 \( \mathrm{pET}-22 \mathrm{~b}(+) \) vector와 ligation 한 뒤 E. coli BL21 (DE3)에 trans-undefined side (IPTG)를 이용하여 대량발현을 유도 후 Ni-NTA affinity column을 이용하여 순수하게 정제 하였다. 정제한 목적 단백질의 유무와 정제도는 sodium dodecyl sulfate-poly-acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 수행 후 coo-massie brilliant blue로 염색하여 확인하였다.</p><h2>Analysis of \( \beta-1,3 \)-glucanase activity using laminarin</h2><p>정제한 \( \beta-1,3 \)-glucanase의 활성은 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCI\( (\mathrm{pH} 7.5) \) buffer에 laminarin을 첨가하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3hr 반응 하였다. 반응 후 생성된 유리환원당의 유무는 thin layer chromatog-raphy (TLC) 법과 high performance liquid chromatography (HPLC)를 이용하여 확인하였다. TLC는 Silica gel \( 60 \mathrm{~F}_{254} \) 를 사용하였다. 전개용매는 n-butanol: acetic acid: DW= 2:1:1 의 비율로 사용하였으며, 유리환원당의 유무는 \( 10 \% \) 황산 용액을 뿌린 뒤 \( 110^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응 후 spots의 생성을 관찰함으로써 확인하였다. HPLC를 이용하여 glucose의 유무를 동시에 확인하기 위하여 aqueous GPC columns \( (8.0 \mathrm{~mm} \) i.d. \( \times 300 \mathrm{~mm} \) ) (SUGAR KS-802; Shodex; Showa-Denko K.K.; Japan)을 사용하여 isocratic 으로 \( 100 \% \) water 를 유속 \( 0.5 \mathrm{~mL} \mathrm{~min}{ }^{-1} \) 로 re-fractive index detector (RI-102; Shodex; Showa-Denko K.K.; Japan)로 검색하였다.</p>
순수하게 정제하기 위해 E. coli BL21 에 trans-undefined side를 이용해 대량발현을 유도 후 사용한 것은 무엇인가요?
Ni-NTA affinity column