<h2>In vitro cleavage test</h2><p>정제한 GST-SOD1 단백질이 HtrA2 단백질에 의해 절단되는 지 확인하기 위하여, cleavage buffer \( (50 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \), \( \mathrm{pH} 7.5\) , \( 20 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}, 1 \mathrm{mM} \) DTT)에 재부유한 GST-SOD1이나 GST-G93A 단백질 \( 2.5 \mu \mathrm{M} \)에 GST-HtrA2 이나 GST-S306A 단백질 \( 0.62 ~\mu \mathrm{M}\)을 각각 혼합하였다. 이를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16시간 반응한 후, 상층액과 bead층을 분리하여 각각을 \( 15 \% \) SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동 하였다. Coomassie stain-ing solution에 20분간 염색시킨 후, destaining solution으로 씻어내어 단백질 밴드를 확인하였다.</p><h2>Immunoblot analysis</h2><p>In vitro cleavage test에서 분리한 상층액과 bead층을 \( 15 \% \) SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동한 후 nitrocellulose membrane에 옮겨 immunoblotting을 시행하였다. Primary Ab는 SOD1 polyclonal Ab (Santa Cruz), FLAG monoclonal Ab (Sigma)로 반응시키고 secondary Ab로 antibody-antigen 반응을 시킨 후 ECL (Amersham Pharmacia Biotech.) 방법으로 밴드를 확인하였다.</p><h2>SOD1 wild-type (wt)과 ALS-linked mutant (G93A) 단백질의 발현과 정제</h2><p>Wild-type (wt) SOD1과 ALS 환자에서 발견되는 mutant SOD1 (G93A)의 생화학적 특성을 연구하기 위해서는 다량의 recombinant SOD1 단백질이 필요하다. SOD1을 대장균에서 발현시켜 순수한 단백질로 정제하고자 pGEX 시스템을 이용하였다. 일반적으로 이용되는 배양조건(ampicillin을 포함하는 LB 배양배지, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양, \( 0.1 \mathrm{mM} \) IPTG)하에서 GST-SOD1과 GST-G93A 단백질의 발현을 유도하여 단백질의 발현양상을 \( 15 \% \) SDS-polyacrylamid gel에서 분리하여 분석하였다. ExPASy Molecular Biology Server Program (http:// us.expasy.org/tools/pi_tool.html)을 이용하여 이론적으로 계산한 GST-SOD1 fusion 단백질의 분자량은 \(43,834\mathrm{Da}\)이다. IPTG로 단백질의 발현을 유도하기 전에는 GST-SOD1 fusion 단백질을 확인하기 어려웠으나, IPTG로 단백질의 발현을 유도하면 \( 45 \mathrm{kDa} \) 크기에서 많은 양의 단백질이 발현되는 것을 관찰할 수 있다. 수용성 세포 추출물에서 glutathione Sepharose 4B bead에 GST-fusion 단백질을 선택적으로 결합시켜 정제한 후 분석하면, 이 \(45\mathrm{kDa}\) 크기의 band가 GST- SOD1과 GST-G93A 단백질임을 보다 명확하게 확인할 수 있다. Ampicillin을 포함하는 LB배지 \(100 \mathrm{m\ell}\)에 대장균을 배양하고 glutathione Sepharose 4B bead를 이용하여 GST-SOD1은 약 \( 325 \mu \mathrm{g} \), GST-G93A는 \( 250 \mu \mathrm{g} \)의 양을 정제할 수 있었다. 이 시스템을 이용하여 전체 대장균 단백질로부터 순도 \( 90 \% \)의 GST-SOD1 fusion 단백질을 \( 15 \% \)의 yield로 정제할 수 있다.</p><p>ALS 환자에서 발견되는 mutant SOD1 (G93A, SOD1의 93번째 amino acid residue의 glycine을 alanine으로 치환)의 경우는 세포내에서 aggregate를 형성하고 mitochondria의 apoptosis 조절 단백질인 Bcl-2와 결합한다고 알려져 있다. 이러한 G93A mutation을 SOD1에 도입하여 대장균에서 발현하게 될 경우, mammalian cell에서 발견되는 것과 유사하게 G93A가 wt SOD 보다 더 잘 aggregate를 형성하는지 관찰하기 위해 total insoluble precipitate를 비교분석 하였다. Ampicillin을 포함하는 LB 배지 \( 100 \mathrm{m\ell} \)에 배양하면 GST-SOD1은 약 \( 75 \mu \mathrm{g} \), GST-G93A는 \( 150 \mu \mathrm{g} \)의 in-soluble 단백질이 확인되었다. 이러한 결과를 통해 대장균 시스템에서도 G93A가 wt SOD1 보다 더 insoluble 하다는 것을 알 수 있으며, 이는 mammalian cell에서 관찰된 결과와 유사한 것을 알 수 있다. 이 정제 시스템을 이용하면 1 liter 의 대장균 배양액으로부터 \( 90 \% \) 이상의 순도를 지니는 GST-SOD1, GST-G93A 단백질을 약 \(3 \mathrm{mg}\) 정도 회수할 수 있으므로, SOD1이 HtrA2의 기질인지를 여부를 확인하는 in vitro cleavage test와 같은 생화학적 연구를 용이하게 수행할 수 있다.</p>
Coomassie stain-ing solution에 20분간 염색시킨 후, destaining solution으로 씻어내어 무엇을 확인하는가?
단백질 밴드