<h1>재료 및 방법</h1><h2>균주, 시약 및 배지</h2><p>새로운 B-agarase의 확보에 이용한 균주인 Agarivarans sp. JA-1은 제주도 해역에서 분리된 한천분해 세균이다. 대장균 세포(E. coli DH5\(\alpha\))를 유전자 클로닝을 위한 숙주로 사용하였고 LB 배지 \(1\%\) bacto tryptone, \(0.5\%\) yeast extract, \(0.5\%\)NaCl와 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)조건에서 배양하였다. 대장균 형질전환체의 선별을 위해서는 ampicillin을 최종농도 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)가 되게 첨가한 LB 한천배지를 사용하였다. 단백질의 발현을 위한 숙주로 E. coli BL21 (DE3)를 사용하였다. 제한효소, T4 polynucleotide kinase, DNA ligation kit ver. 2, Pyrobest DNA polymerase는 Takara Korea (Seoul, Korea)에서 구입하였다.</p><h2>유전자 확보 및 클로닝</h2><p>전반적인 클로닝실험은 Sambrook 등의 방법을 따라서 수행하였다. Agarivarans sp. JA-1의 총세포 DNA는 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 추출하였고, 플라스미드 DNA는 Sambrook 등의 알칼리분해법을 이용하였다. 새로운 B-agarase AgaJA3 유전자는 Agarivorans sp. JA-1의 총세포 DNA를 주형으로 Pyrobest DNA polymerase (Takara Bio Inc., Otsu, Japan)를 이용하여 증폭하였고, Vibrio sp. PO-303의 \( \beta \)-agarase D 유전자의 서열을 참고로 하여 제조한 프라이머인 A_sp-b-agaJA3-F (5'-ATGAAAGGATTCACTAAGCACCCACTAC-3')와 A_sp-b-agaJA3-R (5'-CTACTGGAATTTAAAACGTTGGTTGGTAC-3') 가 사용되었다. 증폭된 1.4-kb DNA를 pGEM-T easy vector (Promega)에 연결시켜 pGEMTe-A_sp-b-agaJA3을 제조하였고, (E. coli DH5\(\alpha\)) 세포를 형질전환시켰다. DNA의 염기서열 파악은 BioNex사(Seoul, Korea)에 의뢰하였고, 서열분석은 DS_Gene ver. 1.5 program (Accelrys Inc., SanDiego, CA, USA)을 이용하여 수행하였다.</p><h2>재조합 \( \beta \)-agarase AgaJA3의 발현과 정제</h2><p>\( \beta \)-Agarase AgaJA3 유전자를 대장균에서 발현시키기 위하여 신호서열(signal sequence)이 제거된 성숙체(mature form)를 암호화하는 유전자를 증폭하였다. pGEMTe-A_sp-b-agaJA3를 주형으로 Pyrobest DNA polymerase (Takara Bio Inc.,Otsu, Japan)를 이용하여 증폭하였고, A_sp-b-agaJA3E-F (5'-CATATGGACTGGGATAATATCCCAATTCC-3' (inserted a NdeI site is underlined))와 A_sp-b-agaJA3E-R (5'-CTCGAGCTGGAATTTAAAACGTTGGTTGG-3' (inserted a XhoI site is underlined))가 프라이머로 사용되었다. 증폭된 1.3-kb DNA를 pGEM-T easy vector (Promega)에 연결시켜 pGEMTe-A_sp-b-agaJA3E를 제조하였고, E. coli DH5\(\alpha\) 세포를 형질전환시켰다. DNA의 염기서열 파악은 BioNex사(Seoul, Korea)에 의뢰하였고, 서열분석은 DS_Gene ver. \( 1.5 \) program (Accelrys Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 수행하였다. pGEMTe-A_sp-b-agaJA3E를 제한효소 NdeI 과 XhoI으로 처리한 후 확보한 1.3-kb의 DNA 단편을 대장균 발현벡터인 pTXB1 (New England BioLabs Inc., Beverly, MA, USA)에 연결시켜 발현 플라스미드인 pTXB1-A_sp-b-agaJA3E를 제조하였고, E. coli DH5\(\alpha\) 세포를 형질전환시켰다. pTXB1-A_sp-b-agaJA3E를 제한효소 NdeI 과 XhoI으로 절단하여 1.3-kb의 \(\beta\)-Agarase AgaJA3 성숙체 유전자 단편을 확인하였다.</p><p>pTXB1-A_sp-b-agaJA3E로 발현숙주인 E. coli BL21 (DE3)세포를 형질전환시켰고, 획득한 재조합체를 ampicillin이 첨가된 \( 10 \mathrm{ml} \)의 LB 배지로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 배양하였다. 배양액을 ampicillin이 첨가된 \(1 \mathrm{l}\)의 LB 배지로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 배양한 후, IPTG를 최종농도 \( 0.3 \mathrm{mM} \)로 첨가하여 T7 promoter를 활성화시켰다. IPTG를 첨가한 후 추가로. \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3시간 배양하였고 원심분리 \( (5,000 \times g \), 5 분 \( ) \)로 세포를 수확하여 여기에 냉장한 \( 30 \mathrm{ml} \)의 칼럼(column) 완충용액(\( 20 \mathrm{mM}\) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 7.4\) ), \( 0.5 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}\), \(0.2\%\) Triton X-100, \( 2 \mathrm{mM} \) EDTA)을 첨가하였다. 초음파로 세포를 파괴한 후 원심분리(\(20,000 \times g \), 20분)를 행하여 상층액을 회수하였다. 이후 상층액을 미리 칼럼완충용액으로 처리한 Chitin beads (New England BioLabs Inc.) \( 20 \mathrm{ml} \)가 충진된 칼럼에 통과시키고 칼럼완충용액으로 세척한 후, 칼럼완충용액에 최종농도 \( 30 \mathrm{mM} \) DTT가 첨가된 분리(cleavage) 완충용액으로 \( 4^{\circ}\mathrm{C} \)에서 밤새 처리하였다. 칼럼완충용액 \( 50 \mathrm{ml} \)로 단백질을 용출시켰다. 단백질의 함량은 BSA (bovine serum albumin)을 표준으로 BCA protein assay 용액(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)을 이용하여 측정하였다.</p>
대장균 형질전환체의 선별을 위해 첨가한 배지는 무엇일까?
LB 한천배지