<h2>Western blot 분석</h2><p>분화된 3T3-L1 지방세포를 \( \mathrm{PBS} \) 용액으로 2회 세척한 후, lysis buffer (인트론바이오, 경기도, 한국)를 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 용해시키고 \( 13,000 \mathrm{rpm}, 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분간 원심분리하여 상층액만 회수하여 단백질 양을 정량 하였다. Lysate \( 30 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{L} \) 를 취하여 SDS loading buffer (1 M Tris, \( 50 \% \) glycerol, \(10\%\) SDS, \(1\%\) bromophenol blue)에 혼합하여 \( 95{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 가열시킨 후, \( 10 \% \) SDS polyacrylamide gel에 \( 100-150 \mathrm{~V} \) 로 전기영동하고 nitrocellulose membrane (GE Healthcare Life Sciences)에 전이시켰다. \( 5 \% \) 무지분유가 첨가된 TBST (1 M Tris, \( 5 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \), tween 20) 용액으로 1시간 동안 blocking 시킨다. TBST 용액으로 3회 세척하고 일차항체(PPAR \( \gamma \) 1:250, GLUT4 1:250; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, p-IRS-1 1:1000, IRS-1 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 로 2시간 동안 반응시키고 다시 TBST 용액으로 3회 세척하였다. 그 다음에 peroxidase가 포함된 이차항체(goat anti mouse 1:2000, anti-rabbit 1:2000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)로 1시간 동안 반응시키고 chemiluminescent substrate 용액(인트론바이오, 경기, 한국)을 사용하여 목적 단백질을 확인하였다.</p><h2>실험동물 설계 및 사육</h2><p>본 실험에 사용된 5주령 수컷 C57BLKS/J Iar- \( d b / d b \) 마우스는 (주)중앙실험동물(서울, 한국)로부터 구입하여 목포대학교 동물 실험 가이드라인 을 준수하며 실험을 진행하였다. 일주일간 일반 실험동물용 사료로 적응시킨 후, AIN-93G diet를 기본으로하여 당뇨대조군, LMTN 투여군( \( 250 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 체중)으로 총 2개 그룹으로 나누었다. 실험동물은 실내온도 20-25 \( { }^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 40-\( 50 \%, 12 \mathrm{~h} \) light/darkness cycle에서 사육하였다. LMTN 추출물은 6주 동안 매일 오전 10-12시 사이에 경구투여 하였다. 실험동물은 희생되기 전 12시간 동안 절식시킨 후, 에틸에테르로 질식시켜 헤파린(중외제약, 서울, 한국)을 넣은 주사기로 심장으로부터 혈액을 채취하였다. 혈액은 \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 20 분간 원심분리하여 혈장을 수집한 다음에 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관한 후 분석에 사용하였다.</p><h2>식이와 물 섭취량, 공복혈당, 혈장 중성지방과 총콜레스테롤 함량 측정</h2><p>식이와 물 섭취량은 전날 공급분에서 남은 양을 빼는 방법으로 매주 3회씩 측정하였다. 실험동물의 혈당 변화 정도를 알아보기 위하여 매주 12 시간 절식 시킨 후, 꼬리 정맥에서 채혈 후 blood glucose test meter (Allmedicus, 경기, 한국)를 사용하여 측정하였다. 채취한 혈액에서 분리한 혈장의 중성지방과 총 콜레스테롤 함량은 아산제약(서울, 한국)의 키트를 사용하여 측정하였다.</p><h2>RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)</h2><p>근육과 지방조직 50-100 mg, \( 1 \mathrm{~mL} \) 의 TRI REAGENT (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA) 용액을 유리시험관에 함께 넣고 homogenation을 하였다. 그 다음 chloroform을 넣고 가볍게 섞어준 후, \( 12,000 \mathrm{~g}\left(4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 에서 15분 동안 원심분리하였다. 상층액에 \( 0.5 \mathrm{~mL} \) isopropanol을 넣어 vortex를 하고 상온에서 5-10분 정도 보관 후, \( 12,000 \mathrm{~g}\left(4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 에서 8분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 \( 75 \% \) ethanol (DEPC + ethanol anhydrous)을 \( 1 \mathrm{~mL} \) 넣고 vortex한 후, \( 12,000 \mathrm{~g}\left(4{ }^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 에서 5 분을 2 번 반복으로 washing을 하였다. Washing이 끝나면 \( 75 \% \) ethanol을 제거하고 3-5분 동안 air dry를 하고 DEPC (diethylpyro-carbonate) 30-50 \( \mu \mathrm{L} \) 를 넣고 실험에 사용할 때까지 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다. 보관중인 RNA는 nanodrop spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)의 260 과 \( 280 \mathrm{~nm} \) 의 파장에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 총 RNA \( 300 \mathrm{ng} \) 을 Diastar \( ^{\mathrm{TM}} 2 \mathrm{X} \) One Step RT-PCR Premix kit (솔젠트, 대전, 한국)를 사용 \( \mathrm{RAN} 3 \mu \mathrm{L} \), primer 각각 \( 1 \mu \mathrm{L} \) (총 \( 30 \mu \mathrm{L} \) )를 맞추고 기계에 넣고 역전사를 시켰다. 각 primer의 염기 배열은 다음과 같다. PPAR \( \gamma \) 의 주형사 서열은 5'-ACC ACT CGC ATT CCT TTG AC-3', 비주형사 서열은 5'-TCA GCG GGA AGG ACT TTA TG-3'; GLUT4의 주형사 서열은 5'-CCT GCC CGA AAG AGT CTA AAG C-3', 비주형사 서열은 5'-ACT AAG AGC ACC GAG ACC AAC G-3'; \( \beta \)-actin의 주형사 서열은 5'-TGC CCA TCT ATG AGG GTT ACG-3', 비주형사 서열은 5'-TAG AAG CAT TTG CGG TGC ACG-3'; 이다. PCR 조건은 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15분 반응을 시키고 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분 동안 변성시킨 후, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분 동안 붙이고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분 동안 확장하여 30 회를 수행하였다. PCR 산물은 ethidium bromide로 염색된 \( 1.5 \% \) agarose gel을 이용하여 전기 영동을 하였고, \( \beta \)-actin은 증폭된 유전자들의 대조군으로 사용하였다.</p><h2>통계 분석</h2><p>모든 실험결과는 평균 \( \pm \) 표준오차(standard error, SE)로 표현하였다. 각 군간의 차이는 SPSS의 ANOVA (analysis of variance)와 Duncan's multiple range test를 이용하여 \( p<0.05 \) 수준에서 유의성 있는 건으로 판정하였다.</p>
실험동물의 혈당 변화 정도를 알아보기 위해서 실험동물의 어떤 부분에서 채혈을 했어?
꼬리 정맥