<h2>단백질의 농도결정</h2><p>단백질 추출물의 단백질 농도는 microbiuret 방법을 사용하여 결정하였다. 순수 정제된 야생형의 \( \alpha \) 소단위체와 \( \beta_{2} \) 소단위체의 농도는 흡광계수를 사용하여 결정하였다. 이때 \( \alpha \) 소단위체의 경우에는 \( E^{1 \%}{ }_{278 \mathrm{~nm}}=4.4 \) 를, \( \beta_{2} \) 소단위체의 경우에는 \( \mathrm{E}^{1 \%}{ }_{278 \mathrm{~nm}}=6.5 \) 를 사용하였다. 잔기가 치환된 돌연변이 단백질의 경우에는 야생형과 비교하여 microb-iuret 방법을 사용하여 결정하였다.</p><h2>효소 활성도 측정</h2><p>트립토판 \( \alpha_{2} \beta_{2} \) 중합효소의 \( \beta_{2} \) 소단위체 특이 반응( \( \beta \) 반응)은 \( \alpha \) 소단위체를 몰비로 \( \beta \) 에 비해 5 배 이상 첨가한 조건으로 Kirschner 등의 방법으로 측정하였다.</p><h2>Fluorescence Spectroscopy</h2><p>형광은 Hitachi사의 모델 F-4500 fluorescence spectropho-tometer를 사용 \( 295 \mathrm{~nm} \) 에서 여기시키고 \( 300 \mathrm{~nm} \) 에서 \( 410 \mathrm{~nm} \) 파장대의 형광 방출을 측정하였다.</p><h1>결과 및 고찰</h1><h2>P96L/F139W. P96L/F258W 및 P96L/F139W/F258W 치환체의 효소 활성도</h2><p>대장균의 트립토판 중합효소 \( \alpha \) 소단위체에서 96번 프롤린을 류신으로 치환시킨 P96L은 생체 내에서 응집체로 발현된다. 139번 자리와 258번 자리의 페닐알라닌을 각각 트립토판으로 치환한 F139W와 F258W를 이중 치환 혹은 삼중 치환시킨 P96L/F139W, P96L/F258W와 P96L/F139W/F258W 각각은 생체 내에서 용해성 단백질로 발현된다(Fig. 1).</p><p>트립토판 중합효소의 각 소단위체의 효소반응 \( (\alpha \) 반응과 \( \beta \) 반응)은 두 소단위체가 결합하였을 때 야기되는 구조적인 변화로 인하여 각각의 활성도가 훨씬 증가된다. Table 1 은 야생형과 잔기가 치환된 \( \alpha \) 소단위체들을 정제한 후 \( \beta_{2} \) 소단위체와 결합시켜 \( \beta \) 반응을 측정한 것이다. F139W와 F258W 는 이미 보고된 바와 같이 야생형과 비숫한 효소 활성도를 보여주고 있다. P96L/F139W와 P96L/F258W는 \( \beta \) 반응의 활성도가 야생형과 같고, \( \mathrm{P} 96 \mathrm{~L} / \mathrm{F} 139 \mathrm{~W} / \mathrm{F} 258 \mathrm{~W} \) 의 경우 야생형에 비해 약 \( 40 \% \) 낮게 나타났다. P96L의 경우 매우 낮은 활성도를 가지는 것으로 보고되었다. 그러나 139 번과 258 번 잔기의 추가 치환으로 그 활성도가 증가한 것으로 보아 139 번과 258 번 자리의 치환이 구조적인 변화를 유발한 것으로 보인다. 139 번과 258 번을 동시에 치환시킨<p>경우 활성이 감소하였는데 이것은 동시에 두 잔기가 치환된 경우는 알파 소단위체의 전체구조를 많이 변형시킨 것으로 생각된다.</p>
microbiuret 방법을 사용하여 결정한것은 어떤 단백질 농도인가?
단백질 추출물