<h1>재료 및 방법</h1><h2>톨라신의 순수분리</h2><p>\( 25{ }^{\circ} \mathrm{C} \)의 Pseudomonas agar F (Bacto-tryptone \( 10 \mathrm{~g} \), Bacto-peptone \( 10 \mathrm{~g},~ \mathrm{MgSO}_{4}~ 1.5 \mathrm{~g}, \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}~ 1.5 \mathrm{~g} \), Glycerol \( 10 \mathrm{~mL} \), Agar \( 15 \mathrm{~g} / 1 \mathrm{~L} \) 증류수) 액체 배지에 P. tolaasii 균주를 접종한 후, 정체기에 도달하도록 \(18\)시간 이상 진탕배양하였다. 배양액을 Type \(16\) rotor (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 \( 8,000 \mathrm{rpm} \)에서 \(30\)분간 원심분리하여 균체를 제거한 배양상징액을 얻었다(Cho 등, \(2000\)). 톨라신을 포함한 배양상징액을 용혈활성 측정에 사용하였으며, 필요에 따라 톨라신 분자를 순수분리하여 특성을 조사하였다. 순수분리과정은 간략히 배양상징액에 ammonium sulfate를 처리한 후 초고속원심분리기를 이용하여 톨라신의 침전을 얻었다. 침전을 용해하여 Gel permeation chromatography과정으로 순수분리하여 분액을 만들어 초저온냉동고 \( \left(-70{ }^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에 보관하며 사용하였다.</p><h2>톨라신에 의한 용혈활성 측정</h2><p>톨라신의 용혈활성 측정은 Cho 등 \( (2000) \)의 방법에 따라 쥐의 적혈구를 이용하여 수행하였다. 용혈활성을 측정하는데 사용한 적혈구는 사용하기 바로 직전에 HBS 완충액으로 \(10\)배 희석한 후 최종반응용액에 \( 10 \% \)가 되도록 처리하였다. 톨라신을 1 HU처리하여 \(30\)분간 배양하면서 UV/Vis 분광광도계를 이용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 감소를 측정하여 적혈구 세포의 파괴 활성을 평가하였다.</p><h2>TIF의 효과 및 안정성 측정</h2><p>TIF는 Sakamoto Yakuhin Kogyo (Osaka, Japan)와 Mitsubishi-Kagaku Foods Corporation (Tokyo, Japan)의 제품을 남영상사를 통해 공급받았다. TIF \(10\)과 TIF \(16\)은 polyglycerol fatty acid ester이며, TIF \(12\)는 sucrose fatty acid ester 화합물이다 (Yun 등, \(2017\)). TIF의 활성 변화는 각 TIF를 HBS 완충액 \( (\mathrm{pH} \) \(7.4\))에 희석한 후, 적혈구와 톨라신을 포함하는 최종 반응용액의 \( 10 \% \)가 되도록 처리하여 톨라신의 활성 저해를 측정하였다. 실험 시작일을 기준일로 하여 ' 0 day'로 설정하였으며, 각 TIF가 공통적으로 톨라신 억제 효과를 보인 \( 10 \mu \mathrm{M} \)의 농도에서 TIF의 경시적 활성 변화를 측정하였다. TIF의 안정성 증대를 위해 TIF 용액에 항산화제인 Ascorbic acid \( 0.1 \mathrm{mM} \), Dithiothreitol \( 0.1 \mathrm{mM} \)의 농도로 첨가한 후, 2주간 상온에 보관하며 2일마다 TIF의 활성 변화를 측정하였다.</p>
정체기에 도달하도록 몇시간 이상 진탕배양하였는가?
\(18\)