<h1>서 론</h1><p>세포 내의 인산화와 탈인산화 과정은 다양한 생명현상에 있어 중요한 역할을 수행함이 수 많은 연구를 통해 알려져있다. 특히 단백질 탈인산화 효소들에 대한 연구는 암이나 염증 발생 기작, 박테리아의 병리학적 기작 등의 다양한 생물학적 현상에 대한 이해의 단초를 제공한다. 한편 탈인산화 효소 중에 지질 탈인산화 효소 또한 여러 가지 생물학적 현상에 있어 중요한 역할을 하는 것이 잘 알려져 있다. 이러한 지질 탈인산화 효소 중에 phosphatase and tensin homo-logue (PTEN)가 phosphatidyl inositol phosphate (PIP)들 중에 phosphatidylinositol-3, 4, 5-triphosphate \( \left(\mathrm{PI}(3,4,5) \mathrm{P}_{3}\right) \) 에 대해 탈인산화 활성을 보임이 여러 연구를 통해 밝혀져 있다. \( \mathrm{PTEN} \) 은 종양 억제 유전자이며, \( \mathrm{PI}(3,4,5) \mathrm{P}_{3} \) 를 탈인산화시켜서 세포의 증식과 세포 자연사 등의 신호 전달 과정에 관여되어 있음이 알려져 있다. 이러한 PTEN의 탈인산화 활성이 암발생 조절이나 줄기세포의 분화 등의 다양한 생리 과정에 관여하고 있다. 이러한 연구 결과를 토대로 최근 PTEN 이외의 지질 탈인산화 효소들에 대한 연구가 광범위하게 이루어지고 있다.<p>2005년에 일본의 국립자연과학연구소 신경분화연구부문의 연구팀에 의해 Ciona intestinalis voltage-sensor-containing phosphatase (Ci-VSP)라고 명명되는 새로운 막 단백질이 발견되었다. Ci-VSP는 voltage 의존성 phosphatidylinositol 인산 가수분해 효소로써, 아미노 말단부터 239번쩨 아미노산 까지는 칼륨 선택형 전위차 유도 이온 채널의 voltage-sensing domain (VSD)와 비슷하다. 그리고 그 이후부터 카르복실 말단까지는 PTEN으로 알려져 있는 종양 억제 효소와 높은 상동성을 공유하는 phosphatase-like domain (PD)을 가지고 있다. 이 Ci-VSP의 PD은 protein tyrosinephosphatase와 phosphoinositide (PI) phosphatase의 효소 활성에 필수적인 HCXXGXXR signature motif를 가지고 있다. Ci-VSP는 VSD를 통해 채널 유도 전류의 변화를 유도하고 이 변화는 Ci-VSP의 phosphatase-like domain을 통한 PIP들의 탈인산화를 유도하게 된다. 전위차 유도 이온 채널은 일반적으로 2개 부분으로 이루어져 있다. 카르복실 말단 쪽이 이온 투과성의 세공으로 작용하는 동안 아미노 말단 쪽은 전압 감지기로 작용한다. Ci-VSP의 막전위 영역은 지금까지 알려진 전위차 유도 이온채널의 VSD에서 중요한 서열의 상동성을 보여 주고 있다. 그러나 Ci-VSP는 이온 채널에 존재하는 세공 도메인을 포함하지 않는다. 4번째 막 통과 부분에서 주기적으로 간격을 둔 염기성 아미노산은 전위차 유도 이온 채널에 있는 막 전위에 변화를 감지하기 위해 필수적인 것으로 알려졌다. 이런 염기성 아미노산의 패턴은 또한 Ci-VSP의 S4에서도 보존되어 있다.</p><p>Ci-VSP는 VSD를 통해서 전위차 유도 이온 채널의 변화를 일으켜서 phosphatase domain을 통한 phospholinositides의 탈인산화를 하게 된다. 이것을 실험적으로 확인을 하는 방법으로 형광 현미경 방법을 이용하여 세포 내 PIP들의 변화를 확인하였다. Ci-VSP는 PTEN기질인 \( \mathrm{PI}(3,4,5) \mathrm{P}_{3} \) 뿐만 아니라 phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate \( \left(\mathrm{PI}(4,5) \mathrm{P}_{2}\right) \) 도 탈인산화 한다고 알려져 있다. 결국 Ci-VSP는 \( \mathrm{PI}(3,4,5) \mathrm{P}_{3} \) 를 탈인산화하는 것으로 보아 PTEN과 같은 기질 특이성을 공유한다고 보고되었다. 한편 현재까지 나온 실험 결과를 보면 Ci-VSP는 탈분극 상태에서 phosphoinositide가 5-phosphate에서 활성을 보여 \( \mathrm{PI}(4,5) \mathrm{P}_{2} \) 에서 phosphatidylinositol 4-phosphate \( (\mathrm{PI}(4) \mathrm{P}) \) 로 변하거나 \( \mathrm{PI}(3,4,5)\mathrm{P}_{3} \) 에서 phosphatidylinositol-3, 4-bisphosphate \( \left(\mathrm{PI}(3,4) \mathrm{P}_{2}\right) \) 로 변한다는 결과도 있다. 이러한 Ci-VSP에 의한 PIP 탈인산화은 세포의 신호체계에 대한 변화를 준다. Ci-VSP 는 PIP의 탈인산화로 인하여 만들어지는 PIP의 농도 변화에 따라 세포막에 존재하는 여러 단백질들에게 영향을 끼쳐 그 단백질의 활성에 변화를 주는 것으로 알려져 있다. 다시 말해 PIP들에 대한 Ci-VSP의 탈인산화 활성은 세포막에 존재하는 PIP들의 조성 변화를 발생시켜 세포막에 존재하는 각종 단백질의 활성화를 유도하게 된다. 그런데 이와 같은 세포 내의 신호 체계 변화에 대한 Ci-VSP의 영향은 어느 정도 알려져 있으나 어느 PIP의 농도 변화에 기인하는 지에 대한 연구는 Ci-VSP의 PIP들에 대한 기질 특이성이 명확하게 설명되고 있지는 않은 상황이다. 한편 앞서 언급한 바와 같이 Ci-VSP의 PD와 PTEN의 PD는 높은 서열 상동성을 보이는데, 특히 이 단백질들의 활성자리에는 거의 동일한 sequence가 존재한다. 그러니 Ci-VSP의 365 번째 아미노산으로 glycine이 존재하는데 PTEN에는 glycine 대신에 alanine이 있다. 이러한 차이 때문에 PTEN과 다르게 Ci-VSP는 \( \mathrm{PI}(4,5) \mathrm{P}_{2} \) 를 dephosphorylation 하는 것으로 생각되고 있다. 두 단백질의 서열 정렬을 해보면 VSD와 Ci-VSP의 PD 사이에 위치한 16-아미노산 영역은 서열의 상이함을 볼 수 있으며 두 단백질의 카르복실 말단의 서열도 다르다는 점을 발견할 수 있다.</p><p>Ci-VSP의 human 유사 단백질인 것으로 예상되는 Transmembrane Phosphatase with TEnsin homology (TPTE)가 spermatocyte에 많이 발현되어 있음이 알려져 있다. 이런 human testis specific 유전자로써 TPTE and PTEN homologous inositol lipid phosphatase (TPIP)도 있다. 이 둘은 PTEN과도 매우 유사한 부분을 가지고 있으며 Ci-VSP와도 단벡질 서열상 매우 유사하다. 이러한 testis specific 유전자 단백질인 TPTE와 TPIP도 phosphatase domain, voltage sensing domain을 가지고 있다. 그리고 TPTE와 TPIP가 testis specific 유전자로 알려져 있는 것과 유사하게 Ci-VSP는 Ciona의 정자 꼬리 세포막에 많이 발현되어 있으며, 이는 이 단백질들이 정자의 운동과 관련된 생리적인 기능을 하지 않나 생각되고 있다. TPTE와 TPIP의 생리학적 기능으로 정자의 운동성은 VSD의 전압 감지 활성과 관련되어 있다고 생각되고 있다. 이러한 실험상의 증거들은 이 단백질들에 대한 생화학적인 연구가 향후 남성 불임에 대한 치료제 개발의 기반을 제공할 것으로 예상된다.</p><p>현재까지의 연구에 의하면 Ci-VSP의 phosphoinositides(PIs)에 대한 활성이 있음이 개괄적으로 알려져 있으나 그 구체적인 기질 특이성 연구는 부족한 상태이다. Ci-VSP는 최근에 새롭게 알려진 단백질로써 몇 가지의 중요한 사실들이 알려지기 시작하였으나, 기존 연구 방법의 제한성과 막 단백질로서의 접근 어려움에 기인한 몇 가지의 문제점 극복이 요구되고 있으며 그 해결책이 절실한 형편이다. 그 문제점을 정리해 보면, Ci-VSP는 \( \mathrm{PI}(3,4,5) \mathrm{P}_{3} \) 와 \( \mathrm{PI}(4,5) \mathrm{P}_{2} \) 에 대해 활성이 있는 것으로 세포 내 실험을 통해 관찰되었으나 기 보고된 활성 측정 조건에 몇 가지의 문제점을 내포하므로 정확한 기질 특이성(substrate specificity)을 관찰할 수 없다. 한편 일반적으로 Ci-VSP의 활성에 의한 \( \mathrm{PI}(4,5) \mathrm{P}_{2} \) 의 세포막에서 농도 변화가 이온 채널 등의 활성 변화에 미치는 영향에 대해 많이 알려져있는 편이다. 그러므로 적정 조건하에서 Ci-VSP의 기질 특이성에 대한 연구가 PI phosphatase로써 다른 막 단백질에 대한 조절 기작을 밝히는데 기여할 것이다. 기 보고된 논문에는 Ci-VSP의 활성도를 보기 위하여 phosphatase-like domain 만을 GST 융합된 형태로 발현시켜 PIP들을 기질로 하여 그 탈인산화 활성을 관찰하였다. 그런데 이때 GST 융합된 Ci-VSP의 PD는 그 탈인산화 활성이 p-nitrophenyl phosphate(pNPP)를 기질로 이용한 경우에 전혀 활성이 없는 것으로 보고되었다. 이는 GST의 강한 dimerization 경향 때문에 Ci-VSP 본연의 활성을 저해하여 그러한 결과를 얻은 것으로 판단된다. 그러므로 이 저해 효과를 극복하기 위한 새로운 접근 방법이 필요하다.</p><p>이 논문에서는 Ci-VSP의 기질 특이성과 그 활성화 기작에 대한 연구를 수행하기 위해 Ci-VSP에 존재하는 Phosphatase-like domain을 6x his-tagged 융합 재조합 단백질로 발현시킨 후 그 정제 과정을 최적화 하였고, SDS-PAGE를 통해 단백질의 순도를 확인하였고 pNPP 를 기질로 이용하여 그 활성에 대해 동력학적으로 최적 조건을 탐색하였다. 이러한 연구 결과는 향후 그 PIP들에 대한 활성 확인과 세포막에서의 활성화 과정에 대한 기초적인 연구 자료로 활용할 수 있으며 현재 이 his-tagged Ci-VSP 단백질의 구조 결정 연구를 진행하고 있는 중이다.</p>
PTEN은 무슨 역할을 하는가?
\( \mathrm{PI}(3,4,5) \mathrm{P}_{3} \) 를 탈인산화시켜서 세포의 증식과 세포 자연사 등의 신호 전달 과정에 관여