<h1>재료 및 방법</h1><h2>대상균주의 분리</h2><p>2002년 5월에서 7월까지 부산과 대천 해수욕장 일대의 해수 및 해조류를 포함한 해산물과 해저질을 채취하여 멸균된 증균용 배지 \(3\%의 \)식염이 첨가된 펩톤수)에 일정량을 넣고\( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 18 \sim 24 \) 시간 배양하였다. 상기 배양액으로부터 일정량을 취하여 TCBS (Difco. USA) 배지에 도말하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 18 24시간 배양 후 sucrose 비분해성으로 판단되는 직경 \( 0.1 \sim 1 \mathrm{~mm} \) 이내의 녹색집락을 분리하였다. 분리된 집락은 Brain Heart Infusion (BHI) (Difco. USA) 한천 평판 배지에 옮겨 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하면서 다음 실험에 사용하였다.</p><h2>API \( 20 E \) kit에 의한 동정</h2><p>BHI 한천 배지에서 얻어진 클로니를 생리식염수에 적정 농도로 현탁한 후 API 20E kit (Bio Merieux 20E, France)의 well에 각각 \( 200 \mu \) 씩 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에 서 24 시간 배양 후 API \( 20 \mathrm{E} \) kit manual에 따라 결과를 확인하였다.</p><h2>\( 16 S \) rDNA analysis</h2><p>\( 1.5 \% \mathrm{NaCl} \) 이 첨가된 \( \mathrm{BHI} \) broth \( 5 \mathrm{ml} \) 에 분리균주를 접종하여 \( 26^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 200 \mathrm{rpm} \) 으로 24 시간 배양한 후 배양액을 \( 1.5 \) \( \mathrm{ml} \) microcentrifuge tube로 옮겨 \( 15000 \mathrm{rpm} \) 에서 1분간 원심 분리하였다. 상등액을 제거하고 bacteria pellet을 수집하여 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA)을 사용하여 genomic DNA를 분리하여 template DNA로 사용하였고 DNA의 농도는 \( 260 \mathrm{nM} \) 의 홉광도로 측정하였다. PCR primer는 procaryotic 165 rDNA universal primer인 27f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) 와 \( 1522 \mathrm{r} \) (5'-AAGG-AGGTGATCCARCCGCA)을 사용하였다. PCR 반응은 bacterial genomic DNA \( 1 \mu \mathrm{g} \) 을 주형으로 하여 \( 100 \mathrm{pmole} / \mu l \) 농도의 primer를 각각 \( 1 \mu \) 씩 첨가하고 \( 10\mathrm{mM} \) dNTPs \( 1 \mu \) 와 \( 10 \mathrm{X} \) PCR buffer, 5 Unit Taq polymerase (TAKARA, Japan) 흔합액에 멸균된 증륚수를 첨가하여 최종부피를 \( 50 \mu \) 로 맞추어 증폭하였다. 증폭 과정은 predenaturation \( 94^{\circ} \mathrm{C} 5 \) 분, denaturation \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, annealing \( 54^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, extension \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 1분의 반응을 30 회 실시하였고, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 extension을 실시하였다. 증폭된 PCR 반응 산물은 GeneRuler 100 bp DNA ladder (Fermentas, USA)를 maker로 사용하여 \( 1.7 \% \) agarose gel 전기영동으로 크기를 확인하였다. 분리된 PCR 반응산물은\( \mathrm{TOPO}^{\mathrm{TM}} \mathrm{TA} \) Cloning kit (Invitrogen, USA)를 이용하여 클로닝을 실시하였다. 분리된 DNA와 vector를 혼합한 후 5 분간 반응시키고 One \( \operatorname{Shot}^{\mathrm{TM}} \) Competent cell과 혼합하여 얼음에 20 분간 처리하였다. \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초간 반응시킨 후 \( \mathrm{SOC} \) 액체 배지 \( 250 \mu \ell \) 을 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 30 \) 분간 진탕 배양하였다. X-gal 40 \( \mu \ell \) 을 첨가한 LB 고체배지(Luria Bartani, \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \ell \) ampicillin) 에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} 24 \) 시간 배양 후 횐색 콜로니를 분리하여 LB 액체배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 12 \) 시간 배양하였다. 배양액을 \( 1.5 \mathrm{ml} \) microcetrifuge tube에 옮겨 \( 16,000 \times \mathrm{g} \) 에서 1 분간 원심분리하여 bacteria cell을 모은 후 AccuPrep \( ^{\mathrm{TM}} \) plasmid extraction kit (Bioneer) 을 이용하여 Plasmid DNA를 분리하였다. 분리된 plasmid를 (주)마크로젠에 의뢰하여 염기서열을 결정하였고 결정된 염기서열은 NCBI의 Blast search를 통하여 동정을 실시하였다. 또한 분리균주들의 16S rDNA sequence와 참조균주 및 관련 Vibrio속의 rDNA sequence를 Clustal \( \mathrm{W} \) 로 multiple alignment 를 수행하였고 Neighbor-Joining법을 이용하여 phylogenetic tree를 작성하였다.</p>
TCBS 배지에서 배양한 후 배지로 부터 무엇을 분리하였는가?
녹색집락