<h2>HtrA2의 serine protease activity에 의한 GST-SOD1와 GST-G93A의 절단 양상 확인</h2><p>최근 HtrA2는 세포사멸 경로뿐만 아니라 세포내의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다는 결과들이 발표되고 있다. 이러한 HtrA2가 세포내 ROS를 조절하는 SOD1과 ALS의 원인 단백질인 SOD1 G93A와 어떤 상관관계가 있는 지를 조사하기 위해 SOD1이 HtrA2의 serine pro-tease의 기질로 작용하는 지 여부를 in vitro cleavage test로 확인하였다. Serine protease 활성부위를 포함하는 약 \(65 \mathrm{kDa}\) GST-HtrA2와 active site의 serine을 alanine으로 point mutation시켜 serine protease 활성을 제거한 GST-S306A도 GST-SOD1 발현 유도와 동일한 방법으로 정제하여 in vitro cleavage test에 이용하였다. 절단된 SOD1 fragment를 보다 신속하게 확인하기 위해 GST-HtrA2 단백질과 GST-SOD1단백질이 glutathione bead에 결합되어 있는 상태로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 반응하였다. HtrA2에 의해 절단되어 bead로부터 해리되어 나오는 SOD1 fragment들의 존재를 확인하기 위하여 반응 상층액을 GST 단백질 부분과 결합되어 있는 상태의 bead층과 분리하여 \(15\%\) SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동 하여 분석하였다. HtrA2에 의하여 절단된 상태에서 glutathione bead에 결합되어 있는 GST-SOD1 fragment들은 bead을 precipitate 시킨 후 전기영동을 통해 절단 양상을 비교 분석하였다. GST-HtrA2나 GST-SOD1만을 반응시켰을 때는 나타나지 않던 밴드들이 GST-SOD1과 serine protease 효소활성을 지닌 GST-HtrA2를 함께 반응시켰을 경우 약 \(14\sim21 \mathrm{kDa}\) 사이에서 4개정도의 단백질 fragment들이 상층액에서 확인되었다. 이와는 대조적으로 GST-S306A와 GST-SOD1을 반응시키면 wt HtrA2와의 반응에서 관찰되는 단백질 fragment들이 전혀 확인 되지 않았다. 이는 GST-HtrA2의 serine protease activity에 의해 GST-SOD1의 특정부위가 절단된 것임을 알 수 있다. GST-G93A에서도 wt SOD1과 유사한 절단양상을 관찰할 수 있는데, 이는 GST-HtrA2의 serine protease activity에 의해서 GST-G93A도 절단된다는 것을 보여준다.</p><p>HtrA2에 의해 새롭게 생성되는 단백질의 fragment들이 GST 단백질과 SOD1 단백질 중 어느 부위로부터 유래한 것인지를 동정하기 위해 GST-SOD1을 thrombin으로 절단한 후 전기영동으로 단백질의 크기를 분석하였다. Thrombin으로 절단 시 생성되는 SOD1 fragment에는 SOD1의 1번 methionine (M) 앞쪽으로 6개의 amino acid가 더 존재하며, FLAG tagging에 의해 C-terminus 뒤에 restriction enzyme site를 포함해서 10개의 amino acid가 더 존재한다. 이를 ExPASy Molecular Biology Server Program을 이용하여 이론적으로 계산하면 \(17,705 \mathrm{Da}\) 이지만, 실제로 \( 15 \% \) SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동 후 size marker들의 relative mobility에 따라 분자량을 계산하면 약 \(23,000 \mathrm{Da}\)이다. 정제한 GST와 Th-SOD1 단백질을 size standard로 하여 HtrA2에 의해 절단된 SOD1 fragment들과 비교 분석해 보았다. Th-SOD1 보다 size가 작은 \(14 \sim 21 \mathrm{kDa}\) fragment들은 상층액에서만 확인할 수 있었고, \(27 \mathrm{kDa}\) 크기의 GST 단백질 보다 큰 size인 \(28 \sim 31 \mathrm{kDa}\)의 단백질 fragment들은 PPt에서 확인할 수 있었다. 이들 fragment들의 size를 기준으로 하여 이론적으로 추론해 보면 HtrA2의 serine protease 활성에 의해 SOD1의 N-terminal 부분이 절단된다는 것을 알 수 있다. 생성된 4개의 fragment 중에 \(21 \mathrm{kDa}\) fragment가 가장 많은 양이 확인되는데, 이는 HtrA2가 SOD1을 절단할 때 주로 인식하는 부위를 포함한다고 생각할 수 있다.</p><h2>Immunoblot assay로 HtrA2에 의해 절단되는 SOD1 fragment들의 검증</h2><p>In vitro cleavage test에서 확인한 fragment들이 HtrA2에 의한 SOD1의 절단에 의한 것임을 재확인하기 위해 im-munoblot 분석법을 실시하였다. Cleavage test의 상층액을 전기영동하여 단백질을 membrane에 옮긴 후 membrane을 FLAG 항체와 반응한 결과, Coomassie staining에서 관찰되었던 \(\mathrm{kDa}\) 크기의 band 중 \(19 \mathrm{kDa}\)과 \(21 \mathrm{kDa}\) 두 개의 밴드만을 확인할 수 있었다. SOD1 항체로 면역반응을 실시한 결과에서도 FLAG항체 실험과 동일하게 이 두 fragment들 만이 SOD1항체와 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 SOD1의 N-terminal amino acid의 일부만이 HtrA2에 의해 절단되고 C-terminal 부분을 포함하는 SOD1의 거의 대부분이 남아 있는 상태임을 알 수 있다.</p>
약 \(65 \mathrm{kDa}\) GST-HtrA2는 어떤 활성 부위를 포함하는가?
Serine protease