<h1>High Resolution Melting (HRM) curve 패턴 비교 분석을 이용한 당귀속 식물의 혼재 여부 확인</h1><p>HRM curve 패턴 분석기술은 온도에 따라 DNA가 보유하고 있는 고유의 녹는점(melting temperature, Tm)을 이용하여 온도에 따른 meting curve 패턴을 상호 비교하여 판별하는 기술로 post-PCR melting curve 분석 기술이라고도 한다. 판별하고자 하는 종의 특정 유전자 단편 내 단일염기다형성을 확인한 다음 가장 많은 단일염기다형성을 포함하도록 하여 약 \( 200 \mathrm{bp} \)가 증폭될 수 있는 범용 프라이머를 제작하여 분석하고자 하는 계통들의 염색체 DNA를 주형으로 하여 먼저 목표 DNA를 증폭한다. 이때 PCR 반응용액에 형광염색물질(C Green PLUS, Eva green, SYT09, ResoLight 등)을 넣고 초당 \( 0.01 \sim 0.2^{\circ} \mathrm{C} \) 씩 서서히 온도를 올리면서 나타나는 발색 정도를 조사한 melting curve 패턴을 상호 비교하면 단 하나의 단일염기다형성을 갖고 있는 DNA 단편의 판별도 가능하다.</p><p>HRM curve 패턴 분석기술을 이용하여 하수오(Polygonum multiflorum), 백수오(Cynanchum wilfordii), 이엽우피소(Cynanchum auriculatum)의 엽록체 유전자인 TrnL-F와 핵내 ITS 영역의 SNP를 파악하여 범용 프라이머를 제작한 다음 melting curve 패턴을 조사하여 상호 비교한 결과 이들을 손쉽게 구분이 가능하였다. 또한, 국내의 지역별 및 중국에서 수집된 구지뽕, 엉겅퀴를 대상으로 수행한 경우에도 동일한 결과를 확인하였다.</p><p>이러한 선행연구 경험을 이용하여 이 등은 국내외에서 수집한 당귀 계통에 대하여 역시 ITS 영역의 단일염기다형성을 확인한 후 이를 포함하는 약 \( 200 \mathrm{bp} \) 단편을 대상으로 HRM curve 패턴을 비교한 결과 국내 자생종을 포함하여 중국당귀, 일당귀 및 구당귀의 판별이 가능하였다. 특히 국내 자생종인 참당귀와 세발 당귀는 단 하나의 단일염기다형성을 포함하였으나 확연하게 다른 패턴을 나타내어 동 기술의 민감도와 정확도를 확인할 수 있었다. 나아가 수집된 각각의 시료들로부터 분리한 DNA를 대상으로 농도별로 HRM curve 패턴을 비교 조사한 결과 미지의 시료에 대한 농도를 예측할 수 있는 표준곡선의 개발이 가능한 것으로 조사되었다. 뿐만 아니라, 참당귀의 DNA에 중국당귀, 일당귀, 구당귀 등의 DNA를 동일한 비율로 혼합한 시료와 일정 농도의 다른 당귀 계통을 혼합한 시료를 대상으로 조사한 결과, melting curve 패턴이 참당귀의 단일 DNA를 사용한 경우에 비하여 상대적으로 낮아지는 현상도 확인하였다. 이러한 패턴을 참당귀의 농도별 표준곡선과 비교하면 다른 계통의 혼재 여부와 혼입 농도의 확인도 가능할 것으로 조사되었다.</p><p>이상의 연구 결과들을 종합하여 보면 당귀 속에 속하는 참당귀(A. gigas), 중국당귀(A. sinenesis), 일당귀(A. acutiloba), 구당귀(L, officinale) 등은 종 또는 속명이 다르므로 ITS 유전자 단편 내에 다양한 SNP들이 확인되었으며, 이들을 이용한 기존의 DNA barcoding 기술로 쉽게 판별할 수 있었다. 그러나, 국내에서 자생하는 토종인 세발당귀(A. gigas Jiri)는 참당귀와 비교하였을 때 단 하나의 SNP가 확인되어 ARMS-PCR 기술의 적용이 필요한 것으로 조사되었다. 따라서 종내(inter-species)의 변종 또는 아종의 판별과 종간(intraspecies)에 있어서도 근연관계가 아주 가까워 목표로 하는 DNA 단편 내에 충분한 SNP가 없는 경우에는 ARMS-PCR 기술을 도입하면 가능한 것으로 조사되었다. 한편, HRM curve 패턴 분석기술은 당귀 속 계통들의 혼재 여부를 신속하게 확인할 수 있을 뿐만 아니라 혼입 비율 등의 판별도 가능한 것으로 확인되어 향후 유통 현장에 실용화를 위한 추가 연구가 필요한 것으로 조사되었다.</p>
국재 자생종을 HRM curve 패턴으로 비교한 결과 확인 할 수 있는 점은 무엇인가?
동 기술의 민감도와 정확도