<h1>결과</h1><h2>봉독의 HIF-1\(\alpha\) 발현 억제 효과</h2><p>봉독이 HCT116 사람 대장암 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT 분석을 수행하였다. 봉독 \( 0.5 \sim 4 \mu g /\mathrm{ml} \)의 농도에서 HCT116세포 생존율을 확인한 결과, 봉독 2 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이하의 농도에는 세포 생존율에 영향을 미치지 않았으나, \( 4 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 에서 세포 생존율이 약 \( 80 \% \) 감소하였다(Fig. 1A). 이 결과를 기준으로 하여 이후의 실험은 시료가 세포에 독성을 끼치지 않은 \( 2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이하의 농도에서 실험을 수행하였다. 봉독이 신생혈관생성에 주요한 역할을 하는 HIF-1\(\alpha\)에 미치는 영향을 확인하기 위해 western blot 분석을 수행하여 HIF-1\(\alpha\) 단백질 발현을 확인하였다(Fig. 1B). HCT116세포에 저산소와 유사한 상태를 만들기 위해 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리한 결과 HIF-1\(\alpha\) 단백질 발현이 증가하였으며, 봉독을 같이 처리하였을 때 농도-의존적으로 감소하였다. 반면 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 와 봉독은 HIF-1\(\beta \)의 발현에는 영향을 끼치지 않았다(Fig. 2B). 위와 같은 결과로 세포독성이 없는 봉독 \( 2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이하의 농도에서 HIF-1\(\alpha\) 발현이 감소되었기 때문에 봉독의 HIF-1\(\alpha\) 발현 감소효과가 세포독성에 기인한 것이 아님을 확인하였다.</p><h2>봉독의 VEGF 전사 억제 효과</h2><p>HIF-1에 의해 조절되는 VEGF의 전사 활성에 봉독이 영향을 끼치는지 확인하기 위해 VEGF mRNA 수준을 조사하였다(Fig. 2). HCT116세포에 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리로 유도된 VEGF mRNA 수준이 봉독 \( 2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리 시 감소하였다(Fig. 2A). 또한 HIF-1 유전자가 결합하는 promoter 영역인 HRE promoter 활성을 측정한 결과 HCT116세포에 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리로 유도된 HRE promoter 활성이 봉독 농도-의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 2B). 따라서 봉독이 HIF-1\(\alpha\) 발현과 HRE promoter 활성의 억제를 통하여 VEGF 전사활성을 감소시키는 것을 알 수 있다.</p><h2>봉독이 MAP kinase에 미치는 영향</h2><p>위 실험으로 봉독이 HIF-1\(\alpha\)의 발현을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서, 봉독이 어떠한 신호전달을 조절하여 HIF-1\(\alpha\)의 발현을 억제하는지 확인하기 위하여 HIF-1\(\alpha\) 단백질의 상위 조절자로 알려진 AKT와 MAP kinase의 활성을 조사하였다. HCT116세포에 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리한 결과 AKT, JNK, ERK1/2의 인산화가 증가되었으며, 봉독을 같이 처리하였을 때 ERK1/2의 인산화가 봉독 농도-의존적으로 감소하였다. 그러나, AKT, JNK, p38은 봉독에 영향을 받지 않았다(Fig.3A)</p><p>이와 같은 결과, 봉독이 ERK1/2의 인산화를 효과적으로 조절함을 알 수 있었으므로 봉독의 HIF-1\(\alpha\)의 발현 저해 효과가 ERK1/2 인산화 억제에 의한 것인지 확인하기 위하여 ERK1/2, AKT, JNK, p38 단백질 저해제와 봉독을 각각 처리하여 HIF-1\(\alpha\) 단백질 발현을 조사하였다. HCT116세포에 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)처리로 유도된 HIF-1\(\alpha\) 발현이 PD98059 (ERK1/2 저해제)와 봉독처리에 의해 HIF-1\(\alpha\) 발현이 감소하였다. 그러나, SP600125 (JNK 저해제), Wortmannin (AKT 저해제) 처리에는 HIF-1\(\alpha\)의 발현이 변화가 없었다(Fig. 3B). 이 결과 HIF-1\(\alpha\) 단백질 발현 감소는 ERK1/2의 인산화 조절에 의한 것임을 확인 할 수 있었다.</p><h2>봉독의 주요 구성 성분이 신생혈관생성에 미치는 영향</h2><p>앞의 실험결과를 통하여 봉독이 HIF-1\(\alpha\)를 억제함으로 인해 신생혈관생성에 주요한 인자인 VEGF를 억제하는 것을 확인하였다. 따라서, 봉독의 생리활성물질 중 어떠한 물질이 신생혈관생성 억제 효과가 있는지 확인하기 위하여, 봉독의 대표적인 생리활성 물질로 알려진 멜리틴과 아파민을 사용하여 HIF-1\(\alpha\) 단백질 발현과 VEGF mRNA 수준을 조사하였다. HCT116세포에 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리로 유도된 HIF-1\(\alpha\) 발현이 아파민 농도-의존적으로 감소하였으며, VEGF mRNA 수준 또한 아파민 \( 2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 감소하였다(Fig. 4A). 반면 멜리틴 농도 \(2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 HIF-1\(\alpha\) 발현은 감소하였으나, VEGF mRNA 수준은 감소시키지 않았다(Fig. 4B). 이와 같은 결과로 봉독의 신생혈관억제 효과가 아파민에 기인하는 것으로 예상 할 수 있었다.</p>
봉독 농도가 어느 정도가 되면 세포 생존율을 감소시켜?
\( 4 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)