<h1>결 과</h1><h2>Immunofluorescent staining</h2><p>Fig. 1은 대조군과 trichostatin A를 3일간 처리한 C2C12 myoblast 세포를 smooth muscle \( \alpha\)-actin(녹색)과 DAPI(푸른색) 항체로 이중 염색한 후 형광 현미경으로 찍은 사진이다. 본 연구에서는 HDAC 억제제인 trichostatin A \( 31.3 \mathrm{nM} \)을 C2C12 myoblast 세포에 3일간 처리한 결과 형태학적으로 C2C12 myoblast 세포가 smooth muscle로 분화함을 보였다. 또한 이들 세포에서는 핵의 증가가 대조군 세포에 비해 많이 억제되었음을 보여주었다. 그 반면 대조군 세포에서는 smooth muscle \( \alpha \)-actin으로 염색된 세포를 전혀 찾아 볼 수 없었으며, 세포가 3일간 매우 활발히 증식하였음을 DAPI 염색을 통해 알 수 있었다. 이러한 결과는 trichostatin A가 세포 증식과 분화에 관련된 중요한 유전자들의 발현을 조절한 것으로 사료된다.</p><h2>Smooth muscle marker 유전자의 발현 변화</h2><p>Smooth muscle \( \alpha \)-actin과 transgelin(smooth muscle 22 protein) 유전자는 smooth muscle에만 특징적으로 발현되는 유전자로서 smooth muscle의 지표로서 가장 널리 쓰이고 있다. 본 연구에서 real-time PCR을 이용하여 trichostatin A을 처리한 C2C12 myoblast 세포에서 이들 유전자의 mRNA 변화를 살펴보았다.</p><p>C2C12 myoblast 세포를 plate에 분주를 한 후 24시간이 경과한 후 여러 농도의 trichostatin A(\(0, 8, 16, 31.3, 62.5 ,125 \mathrm{nM} \))를 3일간 처리한 결과 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA의 발현이 농도 의존적으로 증가하였으며, 본 연구에서 사용한 가장 높은 농도인 \( 125 \mathrm{nM} \) 의 trichostatin A를 처리한 세포에서는 대조군에 비해 약 6배가량 유의하게 증가하였다. Fig. 3은 trichostatin A 처리 시간의 경과에 따른 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA의 변화를 보여주는데, \( 62.5 \mathrm{nM} \)의 tri-chostatin A 처리 후 24, 48시간 경과 후 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA의 증가는 유의하지만 그 증하폭은 크지 않았다. 하지만 72시간 경과 후 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA의 발현은 대조군 세포에 비해 약 4배 이상 유의하게 증가하였다(\(p<.05\)).</p><p>여러 농도의 trichostatin A (\(0,8,16,31.3,62.5,125 \mathrm{nM}) \)를 3일간 처리한 결과 또 하나의 주요 smooth muscle marker인 trangelin mRNA의 발현이 농도 의존적으로 증가하여 최대 13배 이상 증가치를 보였다.</p><p>처리 시간에 따른 trangelin mRNA 발현 변화를 보기 위해 C2C12 myoblast 세포에 \( 62.5 \mathrm{nM} \)의 trichostatin \( \mathrm{A} \)를 24, 48, 72시간동안 각각 처리한 결과, 24시간 경과 후 trangelin mRNA의 발현이 25배 이상 급격히 증가하였으며, 48시간 이후부터는 대조군에 비해 여전히 증가된 발현을 보였지만 24시간에 비해 많이 감소하였다.</p><h2>세포주기 조절 유전자 p21과 cyclin D1 발현 변화</h2><p>본 연구에서는 HDAC 억제제인 trichostatin A가 C2C12 myoblast 세포의 분화를 촉진시켰는데, 이러한 결과는 세포주기 조절인자 유전자의 변화에 의해 세포의 증식이 억제되는 동시에 분화가 촉진되었음을 시사한다. 이를 검증하기 위하여 trichostatin A가 C2C12 myoblast 세포의 세포주기 조절인자인 p21과 cyclin D1 유전자의 발현 변화를 알아보았다. Fig. 6에서 보는 바와 같이 p21 mRNA의 발현은 시간이 경과할수록 농도가 높아질수록 대체적으로 증가하는 경향을 보였다. 72시간 trichostatin A를 처리하였을 때 p21 mRNA는 해당 농도에서 가장 높은 증가치를 나타내었으며 본 연구에서 사용한 가장 높은 농도의 trichostatin A(\(125 \mathrm{nM} \))를 72시간동안 처리하였을 때 p21 mRNA는 약 15배 이상 유의하게 증가함을 보였다(\(p<.05\)).</p><p>Trichostatin A 처리시간에 따른 cyclin D1 mRNA의 발현 변화는 Fig. 7에 나타난 바와 같다. \( 62.5 \mathrm{nM} \)의 trichostatin A를 C2C12 myoblast 세포에 처리한 후 24시간이 경과하자 cyclin D1 mRNA가 \( 50 \% \) 이상 감소하였으며, 48시간 이후에는 급격히 감소되었던 cyclin D1 mRNA가 대조군 수준으로 회복되었으며, 72시간 경과 후에도 큰 변화가 없이 대조군 수준으로 발현이 유지되었다.</p>
trichostatin A \( 31.3 \mathrm{nM} \)을 C2C12 myoblast 세포에 3일간 처리하면 C2C12 myoblast 세포가 smooth muscle로 분화하나요?
YES