<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료 및 시료의 조제</h2><p>실험에 사용한 산사자는 경북 안동에서 건조된 한국산 산사자를 구입하여 사용하였다. 수분함량은 \( 18 \%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \)이었으며, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 냉장보관하여 사용하였다. 산사자 메탄올 추출물의 조제는 시료 \( 200 \mathrm{~g} \)에 메탄올 1리터를 가하여 24시간 상온 추출하였으며, 3회 반복한 후 추출액은 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 감압 농축하여 분말로 제조하여 사용 전까지 저온 밀봉 보관하였다. 산사자 물 추출물 조제는 시료 \( 200 \mathrm{~g} \)에 증류수 1리터를 가하고, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 실온에서 24시간 추출하거나, \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 추출한 후, 추출액을 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 감압 농축하여 분말로 제조하였다. 메탄올 추출물의 경우에는 물에 현탁한 후, n-hexane, ethylacetate, butanol을 이용하여 순차적으로 분획하고, 물 잔류물을 회수하였다. 준비된 시료는 DMSO(dimethylsulfoxide)에 녹인 후 적당한 농도로 회석하여 thrombin time (TT) 측정, activated partial thromboplastin time (aPTT) 측정, 열 및 산 안정성 평가에 사용하였다. 혈장은 최근 1개월동안 약물투여를 받지 않은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 즉시 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 5,000 \mathrm{~g} \)로 5분 동안 원심 분리하여 혈장을 분리하고 냉동한 상태로 보관하였으며 (신선동결혈장), 필요시 상온에서 해동하여 사용하였다.</p><h2>항혈전 활성</h2><p>항혈전 활성은 시료의 TT 및 aPTT를 측정하여 평가하였다. 트롬빈 저해 활성은 기존의 보고한 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)를 이용하여 혈액 응고시간을 측정하여 평가하였다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 0.5 \mathrm{U} \) 트롬빈 (Sigma Co., USA) \( 50 \mu \mathrm{l} \) 와 \( 20 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{CaCl} \) \( 50 \mu \mathrm{l} \), 다양한 농도의 시료 추출액 \( 10 \mu \mathrm{l} \)를 coagulometer의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였으며, 시료 대조군으로는 아스피린(국산화학, Japan) 과 heparin (Sigma Co.)을, 용매 대조군으로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 평균 33.1초의 응고시간을 나타내었다. 열 안정성 평가의 경우에는 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 산사자 추출물의 부탄올 분획물을 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 일정시간 열처리한 후, \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 냉각하여 잔존활성을 측정하였다. 산 안정성 평가를 위해서는, \( 0.5 \mathrm{~N}\) \(\mathrm{HCl} \) 용액에 일정시간 동안 실온에서 반응시킨 후, \( 1 \mathrm{~N} \) \(\mathrm{NaOH} \) 용액으로 \( \mathrm{pH} 7 \)로 보정하여 잔존활성을 측정하였다. 트롬빈 저해 활성은 3회 이상 반복한 실험의 \( \pm\) 평균치표준오차 (mean \( \pm\) SD)로 나타내었다. 한편 aPTT측정의 경우에는, 혈장 \( 100 \mu\mathrm{l} \) 와 다양한 농도의 시료 추출액 \( 10 \mu\mathrm{l} \) 를 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)의 튜브에 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분간 가온한 후, \( 50 \mu \mathrm{l} \)의 aPTT reagent (Sigma, ALEXIN\( {}^{\mathrm{TM}} \) )를 첨가하고 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 반응하였다. 이후 \( 50 \mu\mathrm{l}\) \(\mathrm{CaCl}_{2}\)\((35 \mathrm{mM}) \) 을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조군으로는 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.2초의 응고시간을 나타내었다. aPTT 의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치\( \pm\)표준오차 (mean \( \pm\)SD)로 나타내었다.</p><h2>기타 분석</h2><p>총 flavonoid의 함량 측정은 Davis 방법에 따라 측정하였으며, 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고 여과한 추출검액 \( 400 \mu \mathrm{l} \) 에\( 90 \% \) diethylene glycol \( 4 \mathrm{~mL} \)를 첨가하고 다시 \( 1 \mathrm{~N}\) \(\mathrm{NaOH} 40 \mu \mathrm{l} \) 를 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 반응 후 \(420 \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 총 polyphenol 함량은 Singleton 등의 방법에 따라 추출검액 \( 400 \mu \mathrm{l} \) 에 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 의 Folin-ciocalteau, \( 100 \mu \mathrm{l} \) 의 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 \( 725 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. TLC의 경우에는, silica gel plate (Silica gel 60\(\mathrm{F}_{254} \), Merck, Darmstadt. Germany)를 사용하였으며, 클로로포름: 메탄올:물 (\( 52: 28: 8 \mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v} \)) 을 전개용매로 하여 전개 후, \( 10 \% \) 황산용액을 분무하여 확인하였다.</p>
열 안정성 평가를 위해서 산사자에서 분리한 부탄올 분획물을 몇도에서 열처리 하나요?
\( 100^{\circ} \mathrm{C} \)