<h1>재료 및 방법</h1><h2>효소와 시약</h2><p>모든 시약은 순도가 높은 것(ultra pure)을 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다.</p><h2>박테리아 균주 및 풀라스미드</h2><p>대장균 균주 RB797 (F' laci" proL8/arg Nal' Rif recA sup lacproⅫⅠ)는 야생종 또는 돌연변이 trpA 유전자와 정상적인 trpB 유전자를 포함한 플라스미드를 갖고 있다. 야생종과 D56E, D56G 그리고 D56N 돌연변이 트립토판 중합효소 \( \alpha\)소단위체의 trpA gene은 암피실린에 저항성을 보이는 \( \beta \)-lactamase 유전자를 플라스미드에 가지고 있다. trpA 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 ptactrpA는 단백질의 대량발현 과정에 사용하였다. trpA 유전자는 D-젖당에 의해 대량발현이 유도되는 tac 전사조절인자를 가지고 있다.</p><h2>단백질의 과량 발현 및 분리</h2><p>야생형 및 돌연변이 단백질들은 대장균 RB797에서 발현하고 분리하였다. 야생형 및 잔기치환 단백질들을 과량 발현시키고 분리한 방법은 이미 보고된 방법에 따랐다. 황산암모늄\( \left(\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4}\right) \) 침전법과 이온크로마토그래피 HPLC로 분리 하였다. 정제된 단백질의 순도는 SDS-PAGE을 실시하여 Coomassie Brilliant Blue R로 염색하여 확인하였다. 순수 정제된 야생형의 \( \alpha \)소단위체의 농도는 \( \mathrm{E}^{1 \%}{ }^{278 \mathrm{~nm}}\)=\(4.4 \), \( \beta \)소단위체의 경우 \( \mathrm{E}^{1 \%}{ }^{17 \mathrm{nnm}}\)=\(6.5 \) 를 사용하여 결정하였다. 잔기치환 단백질의 경우에는 야생형을 표준으로 microbiuret 방법을 사용하였다.</p><h2>빠른 \( \beta \)반응 속도 측정</h2><p>단백질 용액 \( (10 \mu \mathrm{M}) \)을 \( 40 \mathrm{mM} \) 세린 또는 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 인돌린 용액을 stopped flow로 섞어주고 형광의 변화를 측정하였다. 사용된 용액은 모두 \( 50 \mathrm{mM} \) TEA buffer \( (\mathrm{pH} \7.8) \) 용액이었다. 일가 양이온의 영향은 \( 100 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}\), \(100 \mathrm{mM} \mathrm{~KCI}\) 또는 \(50 \mathrm{mM} \mathrm{~NH}{ }_{4} \mathrm{Cl} \) 을 양쪽 용액에 첨가하여 조사하였다.</p>
정제된 단백질의 순도는 어떻게 판명했어?
SDS-PAGE을 실시하여 Coomassie Brilliant Blue R로 염색하여