<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주 및 배양</h2><p>본 연구에서 사용된 균주는 해산어의 장에서 V. anguillarum NCMB1의 생육에 억제력을 나타내는 균인 Bacillus amyloliquefaciens H41을 분리하게 되어 이를 사용하였다. V. anguillarum NCMB1균의 배양에는 peptone 한천배지에 \( 3 \% \)의 \( \mathrm{NaCl} \)을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하였고 Bacillus amyloliquefaciens H41균은 앞선 과정에서 밝혀진 저해물질 생성의 최적 조건인 peptone \( 1 \% \), yeast extract \( 1.5 \%\), \(\mathrm{NaCl} \) \( 1 \% \), sucrose \( 1 \%\), \(\mathrm{MgSO}_{4}\) \(7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(0.05 \% \)을 사용하였으며, 배양 최적 온도는 \( 35^{\circ} \mathrm{C}\), \(\mathrm{pH} 7.5 \), 배양 시간은 20시간이며 진탕 배양하였다. 배양을 행한 후 활성을 나타내는 배양 상등액을 회수 (\( 3,000 \times g\), 10분, \( 4^{\circ} \mathrm{C}\))하여 전체의 정제 과정에 사용하였다.</p><h2>균 생육도와 저해물질 정량 및 활성 측정</h2><p>모든 과정에서의 액체배양의 균 생육도는 \( 660 \mathrm{~nm} \)에서 분광광도기(Shimadzu UV-160A, Japan)로 흡광도를 측정하였고 생균수 측정으로 \(\text{CFU (colony forming unit)} / \mathrm{ml} \)을 사용하였고 정제과정에서의 저해물질의 정량은 분광 광도계를 사용하여 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하는 방법과 Lowry법에 의하여 Folin-phenol시약에 의한 유혈청 알부민의 표준 곡선을 작성한 다음 시료의 흡광도를 \( 500 \mathrm{~nm} \)에서 표준곡선에 의거하여 단백질 량을 산출하였다. 저해물질의 활성은 V. anguillarum NCMB1 균주를 24시간 배양한 후 B. amyloliquefaciens H41 균주의 각 정제과정의 분획물을 투여하여 반응 시킨 후 \(\text{CFU}/ \mathrm{ml} \)로 나타내었다. \(1 \mathrm{unit}\)의 결정은 CFU \(50 \% \)로 결정하였다.</p><h2>조 효소액 제조 및 황산암모늄 분획</h2><p>저해물질 생산 최적 배지에서 대량 배양한 후 이 배양액을 원심 분리하여 상등액만을 따로 취해 조 효소액으로 다음의 정제 과정에 사용하였다. 배양 상등액에 황산암모늄을 \( 70 \% \)로 포화시켜 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하루 동안 반응시킨 다음 20분간 저온 원심 분리하여 침전물만 회수하였다. 이 회수된 침전물을 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}\) (\(\mathrm{pH} 7.5\) )으로 녹이고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 투석(Spectrum, molecularporous membrane tubing)시켰다.</p>
저해물질의 활성을 알기 위해 V.anguillarum NCMB1 균주를 몇 시간 길렀는가?
24시간