<h2>DNA flow cytometry에 의한 sub-G1기 세포빈도의 분석</h2><p>EAHF 처리에 의하여 apoptosis가 유발된 세포들의 정량적 비교를 위하여 준비된 유방암세포들을 PBS로 두세 번 씻어내고, CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 고정 및 염색을 하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), 암실에서 30분 동안 반응을 시킨 다음 DNA flow cytometry(Becton Dickinson)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 분석하였다.</p><h2>DNA fragmentation의 분석</h2><p>특정 세포에 apoptosis가 유발되었을 때 관찰될 수 있는 DNA fragmentation의 분석을 위하여 정상 및 EAHF가 처리된 배지에서 48시간 동안 배양된 세포를 모아 lysis buffer [\(5 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 7.5)\), \( 5 \mathrm{mM} \) EDTA, \(0.5\%\) Triton X-100]를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 처리한 다음, 그 상층액에 proteinase K(Sigma)를 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리한 다음 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 반응시켰다. 그 후 phenol : chloroform : isoamyl alcohol 혼합 용액(25: \( 24: 1 \), Sigma)을 첨가하고 원심 분리하여 얻어진 상층액에 적정량의 isopropanol(Sigma)과 \( 5 \mathrm{M} \) \(\mathrm{NaCl} \)를 첨가한 다음 24시간 정도 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시켰다. 분리된 DNA pellet에 RNase A가 적당량 들어있는 TE buffer를 첨가하여 녹이고 gel loading dye(Bioneer, Daejeon, Korea)를 혼합한 후 \( 1.5 \% \) agarose gel을 이용하여 1시간 정도 \( 50 \mathrm{V} \)로 전기영동하여 ethidium bromide(EtBr, Sigma)로 염색하고 ultra vilolet(UV) 하에서 관찰하였다.</p><h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)에 의한 mRNA 발현의 분석</h2><p>준비된 암세포에 TRIzol reagent(Invitrogen Co., Carlsbad, CA)를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 처리하여 total RNA를 분리하여 정량한 후, 각각의 primer(Table 1), DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit(Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1x TAE buffer로 \(1\%\) agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 \( 100 \mathrm{V} \)에서 전기영동을 한 다음 EtBr을 이용하여 염색한 후 UV 하에서 발현의 변화 여부를 확인하였다. 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다.</p>
특정 세포에 세포자연사 현상이 발생되었을 때 관찰 할 수 있는 DNA 파편화의 분석은 어떤 과정들을 거쳐서 진행 되지?
정상 및 EAHF가 처리된 배지에서 48시간 동안 배양된 세포를 모아 lysis buffer [\(5 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 7.5)\), \( 5 \mathrm{mM} \) EDTA, \(0.5\%\) Triton X-100]를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 처리한 다음, 그 상층액에 proteinase K(Sigma)를 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리한 다음 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 반응시켰다. 그 후 phenol : chloroform : isoamyl alcohol 혼합 용액(25: \( 24: 1 \), Sigma)을 첨가하고 원심 분리하여 얻어진 상층액에 적정량의 isopropanol(Sigma)과 \( 5 \mathrm{M} \) \(\mathrm{NaCl} \)를 첨가한 다음 24시간 정도 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시켰다. 분리된 DNA pellet에 RNase A가 적당량 들어있는 TE buffer를 첨가하여 녹이고 gel loading dye(Bioneer, Daejeon, Korea)를 혼합한 후 \( 1.5 \% \) agarose gel을 이용하여 1시간 정도 \( 50 \mathrm{V} \)로 전기영동하여 ethidium bromide(EtBr, Sigma)로 염색하고 ultra vilolet(UV) 하에서 관찰하였다.