<h1>재료 및 방법</h1><h2>균주 및 성장 배지</h2><p>N.crassa의 ars-1 유전자는 성장 배지에 존재하는 황의 농도에 따라서 발현도가 크게 달라지는 것으로 알려졌다. 이 실험에서는 ars-1 프로모터에 보고유전자가 연결된 구조 (이 후에는 Pars-lacZ 표기함)를 갖는 플라스미드를 N.crassa RLM 35-35, a his-3 inl 균주 (Stanford University의 Robert Metzenberg 교수님에 의해서 제공됨)에 형질전환 시킨 후에 사용하였다. 다른 황 농도를 갖는 배지에서 성장시킨 후에 \(\beta\)-galactosidase의 활성을 측정함으로서 ars-1 프로모터에 의한 발현도를 측정하였다. N.crassa는 액체, 고체배양 모두 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양되었으며, 액체 배양의 경우 \(150 \sim 200 \mathrm{rpm}\)의 진탕배양기를 사용하였다. Pars-lacZ의 발현율을 측정하기 위한 배지는 황을 제외한 Vogel 최소 배지를 기본으로 필요시에는 발현조건에 따른 화학물을 첨가하였다. 형질전환체 선택 배지로는 sorbose 배지를 사용하였다. 성장속도의 측정을 위해서는 race tube를 사용하였으며, 12시간 간격으로 균사의 성정을 측정하여 단위 시간 당 성장 속도를 \( \mathrm{mm} \)로 나타내었다. DNA 조작을 위한 균주는 E. coli DH5\(\alpha\) [F-, 80dlacZ M15, endA1, recA1, hsdR17, (rk\(-\), mk\(+\)), supE44, THI-1, gyrA96, relA1, (lacZYA-argF)U169]를 이용하였다. E. coi 성장 배지는 LB를 이용하였으며 필요시에 ampicillin \( (100 \mu \mathrm{g/ml}) \)을 첨가하였다.</p><h2>ars-lacZ fusion plasmid의 조립 및 형질전환</h2><p>Pars-lacZ 발현율을 측정하기 위한 벡터의 조립은, Ebbole가 조립한 pDE3를 BglⅡ와 SmaⅠ으로 절단한 후 Pars 프로모터 및 ars-1 유전자의 Kozak 서열과 시작 콘오돈 (ATG)를 PCR로 증폭한 후에 lacZ에 연결하였다. PCR을 위한 프라이머 서열은 5'-TTCAGATCTAAGGGGCAACTGGCTGTTAG-3' 및 5'-TTACCCGGGGCGCATTCTGAATGGGTTTTG-3'를 사용하였으며 cloning에 이용된 BglⅡ 및 Smal 인식 서열은 이탤릭체로 표시하였다. PCR 조건은 \( 1 \mu \mathrm{g} \) genomic DNA, 프라이머 \( 200 \mathrm{nM} \), dNTP 각 \( 200 \mu\mathrm{M} \) 및 1 unit Vent polymerase가 사용되었다. PCR의 조건은 먼저 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분을 반응시킨 뒤에, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분, 그리고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분을 30회 반복하고, 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분을 처리하여 증폭을 완료 하였다. PCR 결과로 얻어진 약 \( 1.5 \mathrm{kbp} \) 길이의 DNA를 전기영동을 통해 확인하였고 Pars-lacZ의 연결 부위는 서열분석을 통한 확인하였다. Pars-lacZ를 갖는 형질전환체의 분리는, pDE3 내에 존재하는 his-3 유전자가 N. crassa RLM 35-35 균주의 his-3 locus로의 교차에 의한 재조합 방식으로 삽입하면 his-3\(+\) 균주로 전환되는 것을 통해 확인할 수가 있다. Macroconidia 형성을 위해서는 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 12시간 간격으로 빛과 어둠을 반복하며 약 1주일간 배양하였다. 형질전환의 조건은 채집된 macroconidia \( 90\mu\mathrm{l}\)에 \( 10\mu\mathrm{l}\)의 circular DNA 첨가 후, \( 1.5 \mathrm{kV/mm}\), \( 600 \Omega \), \( 25 \mu \mathrm{F}\) 조건에서 Bio-Rad Gene Pulser를 이용한 전기천공법을 이용하였다. 형질전환 후에 포자들을 \( 0.7-0.8 \%\) top agar에 현탁한 후 sorbose 배지에 도말하여 2-3일 후에는 형질전환체를 확인할 수 있었다.</p><h2>ars-1 프로모터의 발현율 측정</h2><p>ars-1 promoter의 발현율은 다른 황 농도를 갖는 배지에서 성장시킨 균주로부터 \( \beta \)-galactosidase의 활성을 측정함으로서 측정하였다. N.crassa의 성장은 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수행 되었으며, 액체 배양의 경우 \( 150 \sim 200 \mathrm{rpm}\)의 진탕배양기를 사용하였다. Pars-lacZ의 발현율을 측정하기 위한 배지는 황을 제외한 Vogel 최소 배지를 기본으로 필요시에는 발현조건에 따른 화학물을 첨가하였다. \( \beta \)-galactosidase의 활성 측정을 위한 기질로는 o-nitrophenyl-\( \beta \)-D-galactoside (ONPG)를 사용하였으며, 단백질 농도는 BCA 시약을 사용하여 소의 혈장 알부민을 기준으로 분석하였다. \( \beta \)-galactosidase의 활성은 1 분당 단백질 1 milligram이 생성하는 o-nitrophenol의 생성이 nanomole을 단위로 계산되었으며, \( 213 \times \mathrm{A} 420 / \) (reaction volume, \( 0.1 \mathrm{ml} \) ) (\(\mathrm{mg}\) of protein/ \( \mathrm{ml} \) of extract) (reaction time, min.)의 공식을 이용하여 계산되어졌다.</p><h2>Homokaryon 균주 분리</h2><p>Homokaryon의 형성은 Pandit 등의 방법을 이용하였다. 이를 위해서는 먼저 흰색 셀로판 종이를 \( 1 \% \) \(\mathrm{KOH}\)에 5분간 끓인 후, 3차 멸균 증류수에 \(3 \sim 4\) 차례 세척한 후, 거즈에 싸서 멸균하여 \( 2 \% \) 증류수 고체배지에 깔았다. 이 때 주의할 점은 \( 2 \% \) 증류수 고체 배지를 말리지 않고 수분을 충분히 가진 상태로 유지한 상태에서 균주를 접종해야한다는 점이다. 접종 후, \(7 \sim 10\) 일간 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 12시간 빛/어둠 주기로 \(7 \sim 10\)일의 배양한 후, 셀로판 종이 위로 형성된 약간의 macroconidia를 \( 70 \% \) alcohol 거즈로 닦은 후, 셀로판 종이를 제거하고 \( 12 \sim 24\)시간 후, \( 1 \sim 2 \mathrm{~ml}\) 3차 멸균 증류수를 배지표면에 첨가 후, 멸균 면도날을 이용하여 microconidia를 수거하며, 이 과정을 \( 2\sim 3\) 차례정도 더 반복하였다. 수거된 microconidia는 광학현미경을 통하여, 균사의 오염정도를 관찰하였으며 심각한 오염을 발견할 수 없었다. 수거된 microconidia는 성장배지에 도말 후에 선별하였다.</p>
성장 배지의 황의 농도에 따라 발현도가 크게 달라지는 ars-1 유전자는 어느 생물에 존재하나요?
N.crassa