<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주 및 배양</h2><p>본 실험에 사용한 느티만가닥 버섯 Lyophyllum ulmar-ium (Bull: Fr) Kuhn.의 균사체 및 원형질체를 얻기 위한 최적의 배양조건을 얻기 위해 배지의 조성을 바꾸어 실험하였다. 실험에 사용한 배지의 종류 및 각 성분은 Table 1이 요약하였다. 또한 모든 배지는 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \), \( 1 \mathrm{~kg} / \mathrm{cm}^{2} \), 15min 동안 고압증기멸균하였다. 원형질체 재생용 배지로는 완전 배지에 각종 삼투압 안정제를 \( 0.6 \mathrm{M} \) 되게 첨가하였다. 그리고 한천은 기층의 경우 \( 2 \% \), 위층은 \( 0.75 \% \) 농도로 첨가하여 사용하였다.</p><h2>원형질체의 생성 방법</h2><p>완전 평판배지에 셀로판을 깔고 그 위에 cork borer를 사용하여 직경이 약 \( 0.5 \mathrm{~cm} \) 되게 일정 크기로 떼어낸 균사를 접종시켜 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4~5 일간 배양시켰다. 성장한 균사를 따로 수득하여 삼투압 안정제가 첨가된 세포벽 분해 효소 용액 \( (5 \sim 15 \mathrm{mg/ml}) \)을 가한 뒤 부드럽게 진탕시키면서 (120 strokes) \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 일정시간 반응시켰다. 균사 잔여물을 sintered glass filter (porosity No. 1)를 사용하여 원형질체만을 순수 분리하였다. 분리한 원형질체에 삼투압 안정제를 가하고 \( 1000 \mathrm{rpm} \)에서 5 분간 원심분리하여 효소액을 제거한 후 한번 더 삼투압 안정제로 세척하고 삼투압 안정제로 현탁시켜 원형질체 수가 \( 10^{6} \sim 10^{7} \)로 되게 하였다. 그리고 생성된 원형질체를 hemacytometer를 이용하여 광학현미경으로 (400배) 확인하였다.</p><h2>세포벽 분해 효소의 영향 비교</h2><p>세포벽 분해 효소에 의한 원형질체 생성 농도를 조사하기 위하여 다음의 효소 Novozym 234 (Sigma Chem. Co., USA), cellulase-Onozuka R-10 (Yakurt Honsha, Japan), B-glucuronidase (Sigma Chem. Co., USA)를 \( 0.6 \mathrm{M}\) \(\mathrm{MgSO}_{4} \) 용액에 녹여 여과시킨 후 사용하였다.</p><h2>삼투압 안정제의 영향 비교</h2><p>삼투압 안정제에 의한 원형질체의 생성율을 조사하기위하여 \( \mathrm{MgSO}_{4} \), \( \mathrm{KCl}\) , \( \mathrm{NaCl} \), sucrose, mannitol, sorbitol을 각각 \( 0.6 \mathrm{M} \) 농도로 만든 용액에 세포벽 분해 효소를 용해시켜 균사체와 반응시킨 뒤 생성되는 원형질체 수를 비교하였다.</p><h2>pH의 영향 비교</h2><p>원형질체를 얻기 위한 최적의 \(\mathrm{pH}\) 조건을 찾기 위하여 \( \mathrm{pH} 4, 5,6,7 \)에서 형성된 원형질체의 수를 조사하였다.</p><h2>균사 성장 일수에 따른 영향 비교</h2><p>균사의 성장정도에 따른 원형질체의 생성율을 조사하기 위하여 3~7일간 각각 성장시킨 균사의 원형질체의 수를 비교하여 최적 성장일수를 결정하였다.</p><h2>균사체 염색</h2><p>Slide glass를 올려 놓은 완전 평판배지에 균사를 접종한 후 균사체가 자란 slide glass를 평판배지로 부터 옮긴 다음 DAPI (46-diamidine-2-phenylindole dihydrochloride ; \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)로 30분간 염색하였다. 염색한 후 fluorescence microscope로 검경하였다.</p><h2>원형질체의 재생 방법</h2><p>분리한 원형질체를 \( 0.6 \mathrm{M} \) 농도의 삼투압 안정제로 현탁시켜 \( 10^{6} \sim 10^{7} \) protoplast/\(\mathrm{ml} \) 되게 희석한 다음 삼투압 안정제가 첨가된 완전 평판배지에 \( 0.5 \mathrm{ml} \)씩 분주하고 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)로 식힌 \( 0.75 \% \) top agar 배지 \( 5 \mathrm{ml} \)를 넣고 잘 흔들어 혼화한 후 굳혀서 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 원형질체의 재생율은 배양하여 생성된 균사체 수를 접종한 원형질체의 수와 비교하였다.</p><p>원형질체의 재생율 \( (\%)=\frac{\text { 생성된 균사의 수 }}{\text { 접종한 원형질체의 수 }} \times 100 \)</p>
본 연구에서 고압증기멸균의 조건은 뭐야?
\( 121^{\circ} \mathrm{C} \), \( 1 \mathrm{~kg} / \mathrm{cm}^{2} \), 15min