<h1>재료 및 방법</h1><h2>공시재료</h2><p>2001년에서 2003년까지 3년간 부산광역시의 5개 안과의원 및 종합병원에서 외래 또는 입원한 급성결막염 환자의 결막 분비물을 2001년 48건, 2002년에 324건, 2003년에는 303건을 각각 채취하여 바이러스 수송용배지(virus transport medium, Difco, U.S.A, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) )에 넣어 운반한 즉시 접종 및 배양하거나, \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 냉동 보관 후 사용하였다.</p><h2>시료의 전처리</h2><p>수송한 결막분비물은 vortexing하여서 면봉과 수송용배지를 분리하여 항생제(penicillin 5 units/ml, streptomycin \( 5 \mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{ml} \) 및 항균제 \( ( \) Amphotericin \( 25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 를 첨가한 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분 간격으로 1 시간동안 진탕 배양하였다. 그리고 원심분리 \( \left(500 \times g, 20\right. \) 분, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \),VS-15CFN, VISION) 하여 그 상등액을 접종 가검물로 사용하였다.</p><h2>세포주</h2><p>국립보건원으로부터 분양 받은 RD (Rhabdomyosarcoma), HEp-2 (Human epidermoid carcinoma), Vero (Africal green monkey kidney), BGM (Buffalo green monkey) 등의 세포주를 penicillin \( (0.05 \) units \( / \mathrm{ml}) \), streptomycin \( (0.05 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 및 \( 5 \% \) FBS (fetal bovine serum)가 첨가된 MEM (minimum essential medium, GibcoBRL)배지에 접종하였다. 이것을 37 \( { }^{\circ} \mathrm{C} \), 5-7% \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기(VS-9011C, VISION)에서 배양한 후 trypsin 처리하여 24 well flat bottom plate에 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 씩 분주 하여 1 일간 단층배양(monolayer)하였다.</p><h2>바이러스의 분리</h2><p>24 well plate에 각각 단층 배양된 RD, HEp-2, Vero 그리고 BGM 세포주의 배지 상층액을 제거하고 PBS (phospate buffered saline)로 1회 세척한 다음, 2 % FBS가 첨가된 MEM 을 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 씩 분주하고 전처리된 가검물을 \( 0.3 \mathrm{ml} \) 씩 접종하 여 \( 34^{\circ} \mathrm{C} \) 의 5-7% \(\mathrm{CO}_{2}\) 배양기에서 10 일간 배양하면서 세포 병변효과(cytopathic effect, CPE)를 매일 관찰하였다. 세포병 변효과를 나타내는 검체는 2~3희 연속 계대배양하여 역가를 증가시킨 후 바이러스 분리 및 동정에 이용하였다.</p><h2>전자현미경 관찰</h2><p>분리된 바이러스를 4% uranyl acetate에 약 1 분간 negative stain한 다음, 전자현미경(JEM 1200 EX2, JEOL, TEM)으로 \( 80 \mathrm{KV}(\times 120 \mathrm{~K}) \) 에서 관찰하였다.</p><h2>PCR (Polymerase chain reaction)</h2><p>세포병변 효과가 나타난 세포배양액으로부터 enteroviruses의 경우 Tri-reagent (Molecular research Center Inc. USA) 또는 viral RNA extraction kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 RNA를 추출하고 각 바이러스 유전자를 증폭하기 위해 특정 primer를 이용하여 cDNA를 합성한 다음 PCR을 수행하였다. Adenoviruses의 경우 Tri-reagent 또는 DNA QIAamp blood mini kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 DNA를 추출한 다음 PCR을 수행하였다. 각각의 PCR 반응 액(template, dNTP mixture, 양 방향의 primers, 10X PCR buffer, Taq polymerase)을 thermal cycler를 이용하여 증폭 한 후 PCR 산물은 0.1% ethidium bromide가 첨가 된 2% agarose gel에 전기영동한 후 특정 band를 관찰하였다. 그리 고 분리한 enteroviruses 및 adenoviruses의 혈청형 확인시험은 국립보건연구원에 의뢰하였다. Reverse transcription 및 nested PCR을 위해 사용된 primer sets는 enteroviruses의 경 우 ENTF와 ENTR를, adenoviruses의 경우는 AV3R과 AV5L 을 각각 사용하였다.</p>
항생제와 항균제를 첨가한 결막분비물은 몇 시간 동안 진탕 배양되었는가?
1 시간