<h2>RNA 추출 및 정량</h2><p>전체 RNA는 NIH3T3 세포와 NIH3T3 (Ras) 세포로부터 acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform (AGPC) 방법을 이용하여 분리하였다. 분리한 RNA는 \( \mathrm{A}_{260} \) 을 측정하여 정량하였다.</p><h2>RT-PCR</h2><p>\( 10 \mathrm{ug} \) 의 분리한 RNA를 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 반응 후, 50 unit의 moloney murine leukemia virus reverse transcriptase를 이용하여 reverse transcription을 수행하였고, dynamin-2와 Grb2 특이적인 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. Dynamin-2에 대한 forward primer로 \( 5^{\prime} \)-CCACTGGACAACCTC AAGAT-3', reverse primer로 5'-GGTGCTGAGAAGGAGGATGT-3'을 사용하였고 (dynamin-2 fragment, 725 bp), Grb2에 대한 forward primer로 \( 5^{\prime} \)-GAAGCCATCGCCAAATATGA-3', reverse primer로 5'-TTAGACGTTCCGGTTCACGG-\( 3^{\prime} \) 을 사용하였다 (Grb2 fragment, 651 bp) . PCR 반응은 시료들을 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 변성시킨 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C}\), 30초; \( 55^{\circ} \mathrm{C}\), 30초; \( 72^{\circ} \mathrm{C} \), 1 분 30 초의 과정을 35 회 반복하였고, 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 분간 처리하였다. PCR 결과물은 \( 1.5 \% \) agarose gel 에 전기영동과 EtBr 염색으로 확인하였다.</p><h2>Generation of the competitive PCR fragments (MIMICS)</h2><p>Dynamin-2화 Grb2 각각의 PCR fragment 보다 조금 작은 DNA competitor fragments 를 PCR MIMIC \( { }^{\text {TM }} \) construction kit (Clontech)은 이용하여 만들었다. Dynamin-2의 competitor들 만들기 위하여 verb B fragment (Clontech)를 template로 사용하였으며, forward primer로 5'-CCACTGGACAACCTCAAGATCAAGTTTCGTGAGAGCTGATTG-3' reverse primer로 5'GGTGCTGAGAAGGAGGATGTTTGAGTCCATGGGGAGCTTT-3'을 사유하여 476 bp의 competitor를 얻게 되었다. 동일한 방법으로 Grb2 특이적 primer를 이용하여 \( 595 \mathrm{bp} \) 의 Grb2 competitor를 얻었다. 얻어진 DNA는 gel purification 후 정량하여 1,000 attommole/ul로 만들어 보관하였다.</p><h2>Promoter analysis</h2><p>Mouse genome으로부터 dynamin-2의 promoter 부위 3,000bp를 cloning하여 pCAT-Basic vector에 옮겼으며 (pCAT2-3000), sequencing 하고 PCR 을 이용하여 여러 종류의 deletion mutants (pCAT2-2000, pCAT2-1000, pCAT2-500, pCAT2-400, pCAT2-300, pCAT2-200, pCAT2-100)를 제작하였다. Promoter activity를 측정하기 위해서 CAT assay를 수행하였다. CAT assay를 수행하기위한 cell extracts를 만들기 위해 각각의 deletion mutant로 transfection한 세포들을 150 ul의 \( 0.25 \mathrm{M} \) Tris \( / \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 7.9) \) 에 녹이고 3 번의 freeze-thaw cycle을 반복하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 원심분리한 후 상층액을 사용하였다. CAT activity를 측정하기 위해 \( 100 \mathrm{ul} \)의 cell extract를 acetyl-CoA,\( \left[{ }^{14} \mathrm{C}\right] \) chloramphenicol과 섞은 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2시간 반응 후 ethyl acetate로 extraction하고 vacuum desiccator로 말렸다. 준비된 시료를 \( 20 \mathrm{ul} \)의 ethyl acetate로 녹이고 TLC를 전개하여 acetylation된 chloramphenicol과 acetylation 되지 않은 chloramphenicol을 분리하였다. Chloramphenicol의 acetylation 정도는 PhosphoImager를 이용하여 정량하였다. 각 실험에서 transfection efficiency를 보정해 주기위해 pCMV- \( \beta \) gal vector를 함께 transfection하였으며, \( \beta \)-galactosidase activity를 측정하여 보정하였다. \( \beta \)-galac-tosidase activity는 \( 10 \mathrm{ul} \)의 cell extract를 \( 2.5 \mathrm{mM} \) 의 chlorophenol red- \( \beta \)-D-galactopyranoside (CPRG)와 \( 1.25 \mathrm{mM} \) 의 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 와 섞고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응 후 \( 574 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.</p>
50 unit의 moloney murine leukemia virus reverse transcriptase를 이용하여 reverse transcription을 수행시 \( 10 \mathrm{ug} \) 의 분리한 RNA를 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 몇 분간 반응시키는가?
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