<h2>타크린에 의한 간독성 확인</h2><p>굴 분획물 (\( \mathrm{O} \)) 및 효소별 굴 가수분해물 (\( \mathrm{N}\), \(\mathrm{F}\), \(\mathrm{P} \))의 간세포 독성 측정과 동일한 방법으로 예비 배양한 후 타크린에 의한 간독성을 확인하였다. 예비 배양된 배지를 제거한 후 타크린을 PBS에 녹여 농도(\( 0 \sim 1.8 \mathrm{mM}\)) 별로 처리한 후 2시간 배양한후, MTT assay를 실시하였다.</p><h2>타크린 유발 독성에 대한 간세포 보호활성 검색</h2><p>굴 분획물 (\( \mathrm{O} \)) 및 효소별 굴 가수분해물 (\( \mathrm{N}\), \(\mathrm{F}\), \( \mathrm{P} \))의 간세포 독성 측정과 동일한 방법으로 예비 배양한 후 타크린에 의한 간독성을 확인하였다. 예비 배양된 배지를 제거한 후 농도 별로 희석한 시료 용액인 \( \mathrm{O}\), \(\mathrm{N}\), \(\mathrm{F}\), \(\mathrm{P} \)을 첨가하여 24시간 배양한 다음, \( 1.2 \mathrm{mM} \) 타크린을 처리한 후 2시간 배양한 후, MTT assay를 실시하였다.</p><h2>MTT assay를 이용한 세포 독성 측정</h2><p>\( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)이 되도록 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe-nyltetrazolium bromide를 PBS에 용해한 MTT용액을 \( 10 \mu \mathrm{l}\)씩 가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}\), \(95 \% \mathrm{O}_{2} \)가 유지되는 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 4시간 동안 방치하고 상등액을 제거한 뒤 DMSO \(200 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 10분간 실온에서 방치하여 formazan을 용해시키고 ELISA plate reader (Spectra MAX 250, Molecular Devices, USA)를 사용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정한다. 양성 대조 약물은 silymarin을 사용하였다.</p><h2>세포 배양액 내 glutamic oxaloacetic transaminase(GOT) 활성도 측정</h2><p>간세포 손상 시 배양액으로 유리되어 나오는 GOT의 양을 측정함으로써 간세포 손상 여부를 확인할 수 있다. 이 측정법의 원리는 기질액인 L-aspartic acid 및 a- ketoglutaric acid가 GOT에 의하여 oxaloacetic acid로 변하여 정색시액인 2,4-dinitrophenyl hydrazine 과 반응하여 Hydrazone이 생성되며 \( 0.4 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \) 용액을 사용하여 적갈색으로 발색시킨 후 비색을 측정하였다. GOT 활성도 측정을 위해 간세포를 free serum DMEM에 \( 5 \times 10^{5} \mathrm{cells} /\mathrm{ml} \) 로 6 well에 \( 3 \mathrm{ml} \)씩 분주하여 24시간 예비 배양한 다음 굴 분획물 (\( \mathrm{O} \)) 및 효소별 굴 가수분해물 (\( \mathrm{N}\), \(\mathrm{F}\), \(\mathrm{P} \))을 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}\), \(95 \% \mathrm{O}_{2} \)가 유지되는\( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 타크린(최종농도 \( 1.2 \mathrm{mM} \) )을 첨가하고 이를 다시 5시간 동안 배양한 다음 각각의 세포 배양액을 \( 2 \mathrm{ml}\) EP tube에 회수하여 \( 1,200 \mathrm{rpm}\)에서 2분간 원심분리(Model SUPRA 21K, Hanil science Industrial, Co., Ltd, Korea)한 후 그 상등액을 취하였다. 회수한 상등액은 아산제약에서 구입한 GOT assay kit (ASAN parm, seoul, Korea)를 이용하여 GOT 활성을 측정하였다. GOT 측정용 기질액인 L-aspartic acid 및 \(\alpha\)- ketoglutaric acid \( 1 \mathrm{ml} \)을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 방치한 다음 배양액 \( 0.2 \mathrm{ml} \)과 잘 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60분간 방치한다. 정색시액인 2,4-dinitrophenyl hydrazine을 \( 1 \mathrm{ml} \) 첨가하여 실온에서 20분 방치한 다음, \( 0.4 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \) 용액 \( 10 \mathrm{ml} \)과 잘 혼합하여 실온에서 10 분간 방치한 다음 \( 505 \mathrm{~nm} \)에서 증류수를 대조로 UV/Vis spectrophotometer (Mecasys, Optizen 2120UV, Korea)를 사용하여 흡광도를 측정한다. 양성 대조 약물로는 현재 간 보호 작용이 있는 것으로 알려진 Silymarin을 사용하였다.</p>
간세포 손상 시 배양액으로 유리되어 나오는 글루타민산 옥살로초산 트란스아미나제의 양을 측정함으로써 무엇을 확인할 수 있어?
간세포 손상 여부