<h3>SDS-PAGE</h3><p>\( 8 \% \sim 10 \% \) separating gel\( (30 \% \) acrylamide: bisacrylamide, \( 1.5 \mathrm{M} \) tris \( \mathrm{pH} 8.8\), \(10 \% \) SDS, TEMED, 10\(\%\) ammonium persulfate)과 \( 5 \% \) stacking gel (30\(\%\) acrylamide: bisacryl amide, \(1. \mathrm{M}\) tris \( \mathrm{pH} 6.8\), \(10 \% \) SDS, TEMED, \( 10 \% \) ammonium persulfate)을 만들어 사용하였고, 원심분리 \( (15,000 \mathrm{rpm}, 20 \mathrm{~min}) \)한 상층액과 SDS loading buffer \( 60 \mathrm{mM} \) tris \( \mathrm{pH} 6.8\), \(25 \% \) glycerol, 2\(\%\) SDS, \(14.4 \mathrm{mM}\) 2-mercaptoethanol, \(0.1\%\) Bromophenol Blue)를 잘 혼합한 후 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 끓여 단백질을 변성시켰다. 이를 식힌 다음 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)으로 20분간 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 원심분리하고 standard marker(SDS-PAGE Molecular Weight Standards, BioRad)와 함께 각 샘플을 Mini-Protein Ⅱ dual-slab apparatus(Bio-Rad)에 분주된 stacking gel well에 같은 총 단백질량이 \( 200 \mu \mathrm{g} \)이 되도록 분주한후 \( 80 \mathrm{volt} \)에서 2시간 정도 샘플이 바닥에 닿을 때까지 전기 영동하였다.</p><h3>Western Blot and Image Analysis</h3><p>Transfer buffer (\( 190 \mathrm{mM} \) glycine, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-base, \( 0.05 \% \) SDS, 20\(\%\) methanol)에 적신 PVDF membrane Millipore), Whatman 3M paper, 전기영동한 젤, ECL membrane (Amersham), Whatman 3M paper, PVDF membrane (Millipore)을 차례로 겹쳐 Mini trans-blot module(Bio Rad)에 장치한 후 40 volt로 2시간 전사하였다. Membrane으로 증착이 끝나면 rocker platform위에서 1시간 동안 membrane을 3\(\%\) skim milk 용액(in TNT: \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-base \( \mathrm{pH}8.0 \) , \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{Nacl}\), \(0.05 \% \) Tween-20)으로 blocking시켰다. 1차 항체(rabbit polyclonal anti -eNOS, sc-653, Santacruz, Biotech, USA)를 5\(\%\) skim milk 용액으로 \(1:500\)으로 희석시켜 90분 동안 흔들어 주고 난 다음 TNT 용액으로 10분씩 3회 세척하였다. 그 후 2차 항체(horse-radish peroxidase-conjugated anti- rabbit antibody for eNOS)를 5\(\%\) skim milk 용액으로 \(1:1000\)으로 희석시켜 60분 동안 흔들어 준 후 TNT 용액으로 10분씩 3회 세척하였다. 마지막 단계로 ECL sub-strate 용액(Santacruz, Biotech, USA)에 membrane을 넣고 5분간 발색시켰다. 얻어진 membrane을 densitometer(Sharp jx-330)를 이용하여 스캔 후 이미지 분석 프로그램(Image Master ver.3.0, Biotech Pharmacia)을 통해 eNOS 단백질량을 산출하였다. 총 단백질량은 BSA (bovine serum albumin, \( 570 \mathrm{~nm} \))을 이용하여 Bradford의 방법으로 정량하였다.</p><h3>자료처리</h3><p>이 연구 결과 얻어진 자료를 SPSS/PC+Version 11.0 통계 프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술 통계치(mean,SD)를 산출하였다. 집단 간 차이를 알아보기 위해 일원변량분석(one-way ANOVA)를 이용하여 분석하였고 사후검증은 SNK(Student Newman-Keul)를 적용하였다. 가설의 수락 기중은 \( \alpha=.05 \) 로 설정하였다.</p>
본 논문의 실험에서 \( 5 \% \)를 만들어 단백질을 변성시키는 과정에서 사용한 재료는 뭐야?
stacking gel