<h1>재료 및 방법</h1>

<h2>Plasmid의 제조</h2>


<p>대장균에서 SOD1을 GST (glutathione S-transferase) fusion 단백질로 발현하기위해 선행연구에서 제작한 C-terminus에 FLAG epitope tag을 지닌 pGST-FLAG에 cloning을 하였다. Human SOD1 (GenBank accession number BT006676)은 human brain cDNA library를 주형으로 하여 5\(\prime\) SOD1 primer (5\(\prime\)-GCGCGAATTCATGGCGACGAAGGCCGTGTGC-3\(\prime\): bold체는 EcoR I restriction enzyme site), 3\(\prime\) SOD1 primer (5\(\prime\)-GCGCGGTACCTTGGGCGA TCCCAATTACACCA-3\(\prime\): bold체는 Kpn I restriction enzyme site), pfu DNA poly-merase (Stratagene, La Jolla, USA)를 이용하여 nucleotide 1~462까지를 PCR로 증폭하였다. 증폭한 full-length SOD1을 EcoR I과 Kpn I restriction enzyme으로 절단하여 동일한 restriction enzyme들로 절단한 pGST-FLAG에 삽입하여 pGST-SOD1-FLAG plasmid를 제작 하고, 이를 pGST-SOD1이라고 명명하였다. DNA 염기서열 분석법(ABI Prism BIgDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, Applied Biosystem)을 이용하여 cloning한 pGST-SOD1의 염기서열의 정확성을 확인하였다.</p>


<h2>Mutagenesis</h2>


<p>QuickChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene Inc.)을 이용하여 mutant SOD1 (G93A, 93번 glycine을 alanine으로 변경) construct를 제조하였다. pGST-SOD1 plasmid를 template로 하고 single point mutation (278번째 nucleotide G를 C로 변경)을 포함하는 primer 쌍을 이용해 PCR을 실시하였다. PCR로 증폭한 product에 DpnI (New England Biolabs) 효소를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 처리하여 wild type의 template를 제거한 후, 대장균에 transformation하였다. DNA 염기서열 분석을 통하여 G93A mutation을 포함하는 clone을 선별하여 pGST-G93A라고 명명하였다.</p>

<h2>GST-fusion 단백질의 발현과 정제</h2>

<p>GST-SODI과 GST-G93A의 발현과 정제는 선행연구의 방법에 따라서, 특정 단백질 분해 효소를 가지고 있지 않는 BL21 (F ompT hsdSB \(\left(\mathrm{r}^{-}_{\mathrm{B}} \mathrm{m}_{B}^{-}\right)  \) gal dcm) 균주에 삽입하여 단백질 발현에 이용하였다. Ampicillin \( (50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)을 포함하는 LB배지 \( 10 \mathrm{ml} \)에서 16시간 동안 배양한 후 \( 90 \mathrm{ml} \)의 LB 배지로 희석하여 90분 더 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 단백질의 발현을 유도하기 위해 \( 0.5 \mathrm{mM} \) IPTG (isopropyl-3-D-thiogalactopyr-anoside, Amresco)를 넣고 90분 더 키운 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 1,000 \times \mathrm{g} \)으로 20분간 원심 분리하여 대장균을 침전시켰다. 이렇게 모아진 대장균들은 \( 7 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{DTT}, 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) lysozyme, \( 10 \mu \mathrm{g} / \mu \ell \) aprotinin, \( 10 \mu \mathrm{g} / \mu \ell \) leupeptin을 포함하는 EBC buffer (50 \( \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}\), \(\mathrm{pH}  8.0 \), \( 120 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}, 0.5 \% \) Nonidet P-40)  \( 1 \mathrm{ml} \)에서 초음파로 용해시켰다. 초음파로 용해한 시료 중 \( 40 \mu \ell \)를 새로운 tube에 옮겨서 원심 분리하여 상층액의 수용성 세포 추출물을 제거하고 total insoluble precipitate을 얻었다. 원심 분리를 통해 세포 찌꺼기를 제거하고 얻은 상층액을 gluta-thione Sepharose 4B beads (Amersham) \( 50 \mu \ell \)에 넣고 상온에서 25분 동안 반응시킨 후, 원심 분리하여 glutathione bead에 결합되어 있는 단백질을 침전시켰다. 각 단계별로 얻은 단백질들은 \( 15\%\) SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동하여  Coomassie staining solution \( (0.1 \% \) Brilliant blue R (Sigma), \( 45 \% \) methanol and \( 10 \% \) acetic acid)에 20분간 염색시킨 후, destaining solution ( \( 10 \% \) methanol and \( 10 \% \) acetic acid)으로 씻어내어 단백질 밴드를 확인하였다. HtrA2 (aa 134-458)과 HtrA2 (S306A, aa 134-458)는 각각 GST-HtrA2와 GST-S306A 라고 명명하고 선행 연구와 동일한 방법으로 발현, 정제하여 사용하였다. 정제한 단백질들은 알고 있는 농도의 BSA (bovine serum albumin)와 비교 정량하여 단백질의 양을 결정하였다.</p>


<p>Recombinant SOD1 단백질을 정제하기 위하여, gluta-thione Sepharose 4B bead에 결합되어 있는 GST-SOD1을 5U의 human thrombin (Amersham Pharmacia Biotech.)을 첨가하여 상온에서 2시간동안 반응시켰다. 원심분리를 통하여 thrombin에 의해 절단된 SOD1 단백질은 bead에 결합되어 있는 GST로부터 정제하여 Th-SOD1이라 명명하였다.</p>
GST-SODI과 GST-G93A의 발현과 정제는 선행연구의 방법에 따라서 무엇에 이용했니?
단백질 발현