<h2>단백질 분석방법 (Western blotting)</h2><p>골격근 GLUT-4와 VAMP-2 단백질 발현량을 측정하기 위하여 가자미근 조직을 \( 137 \mathrm{~mM} \) \( \mathrm{NaCl} \), \( 2.7 \mathrm{~mM} \) \( \mathrm{KCl} \), \( 10 \mathrm{~mM} \) \( \mathrm{Na2PO4} \), \( 2 \mathrm{~mM} \) \( \mathrm{KH2PO4} \) (\( \mathrm{pH~} 7.4 \))가 함유된 PBS 로 씻은 후 \( 50-200 \mu \mathrm{l} \) 의 triton lysis buffer ( \( 20 \mathrm{mM} \) Tris, \( \mathrm{pH~} 7.4 \), \( 137 \mathrm{~mM} \) \( \mathrm{NaCl} \), \( 25 \mathrm{~mM} \) \( \beta \)-blycerophosphate, \( \mathrm{pH~} 7.14 \), \( 2 \mathrm{~mM} \) sodium pyrophosphate, \( 2 \mathrm{~mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{~mM} \) \( \mathrm{Na3VO4} \), \( 1\% \) Triron X-100, \( 10 \% \) glycerol, \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) leupeptin, \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) aprotinin, \( 3 \mathrm{~uM} \) benzamidine, \( 0.5 \mathrm{~mM} \) DTT, \( 1 \mathrm{~mM} \) PMSF)에 담그어 초음파 분해하였다. 그 후 각 sample에 대한 단백질을 정량 하였으며, 그 중 \( 10 \mu \mathrm{g} \) 의 단백질을 western analysis에 사용 하였다. 단백질의 발현은 anti-GLUT4 antibody(400064, Calbiochem, U.S.A)와 anti-VAMP2 (SantaCruz, Cat. No: sc-13992, U.S.A)를 이용하여 확인 하였다. Membrane proteins 을 \( 12\% \) SDS-PAGE(\( 1.5 \mathrm{M} \) Trizma base, \( 10 \% \) Sodium Dodecyl Sulfate, \( 30 \% \) Acrylamide, \( 10 \% \) Ammonium Sulfate, TEMED) 상에서 전기영동 시킨 후 PVDF membrane(Pall Corporation, U.S.A)에 전기이동 시켰다. membrane을 TBS 시약으로 10분씩 3차례 washing한 후 blocking buffer(TBS \( 34 \mathrm{~ml} \), BSA \( 1.05 \mathrm{~g} \) )에서 1시간동안 shaking시킨 후, 각각의 polyclonal antibody를 Blocking buffer에 \( 1 : 1000 \) 의 비율로 희석하여 상온에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 그 후 membrane을 씻어내고 anti-rabbit IgG(Santa Cruz, U.S.A)가 결합되어 있는 horseradish peroxidase를 1대 1000의 비율로 희석하여 상온에서 30분 동안 처리 하고 다시 한 번 씻어내었다. 마지막으로 Membrane에 부착 된 단백질을 Western blotting detection system을 이용하여 측정하였으며 densitymeter(Sharp jx-330)를 이용하여 스캔한 후, 단백질의 정량분석은 이미지 분석 프로그램(Image Master ver. 3.0, Biotech pharmacia)을 이용하여 산출하였다.</p><h2>인슐린 및 렙틴 분석</h2><p>마지막 운동종료 24 시간 후 실험동물을 Chloroform으로 호흡기를 통해 마취시킨 후 개복을 하지 않은 상태에서 \( 10 \mathrm{~ml}(21 \mathrm{gage}) \) 주사기로 심장의 좌심실에 첨자 하여 약 \( 5 \mathrm{~ml} \) 의 혈액을 채혈하였다. 채혈된 혈액은 즉시 혈청 튜브에 넣어 \( 3000 \mathrm{rpm} \) 에서 3 분간 원심 분리하여 혈청을 분리하여 \( -70 \) 이하에서 냉동하여 분석 전까지 보관하였다. 혈청 인슐린 농도은 효소면역 측정법(enzyme immunoassay)인으로 방사 면역 측정법(RIA, radio immunoassay)으로 분석하였고 혈청 렙틴 농도는 Linco leptin assay Kit(Linco research immunoassay, St. Charles, MO)를 이용하여 방사선 면역능으로 분석되었다.</p><h2>자료처리</h2><p>본 연구의 자료 처리는 SPSS 통계프로그램을 이용하여 각 항목별 평균(mean)과 표준편차(standard error mean, SEM) 를 구하였고, 항목별 집단간 차이 검정은 일원변량 분산분석 (one-way ANOVA)를 이용하였다. 유의차가 나타난 항목에 대한 사후검증은 Duncan의 방법을 이용하였다. 통계적 유의 수준은 \( \mathrm{p}<.05 \) 로 정하였다.</p>
얼마동안 TBS 시약으로 washing 과정을 마친 membrane을 blocking buffer(TBS \( 34 \mathrm{~ml} \), BSA \( 1.05 \mathrm{~g} \) )에서 shaking을 해야 Blocking buffer에 \( 1 : 1000 \) 의 비율로 각각의 polyclonal antibody를 희석시킬 수 있을까?
1시간동안