<h2>궤양성 대장염 평가</h2><p>정상군, 대조균, sulfasalazine 투여군, SCB복합물 투여군을 \( 8 \) 일째에 희생하여 맹장에서부터 대장의 말단까지 분리하였다. 분리한 대장은 광학 디지털 카메라(DSC-HX\( 50 \)V, Sony, Tokyo, Japan)른 이용하여 촬영한 뒤 무게와 길이를 측정하였다. 전신성 염증반응에서 나타나는 비장비대에 대한 약효를 평가하기 위하여 비장 또한 적출하여 무게를 측정하였다. 비장의 무게는 마우스의 체중으로 나누어 계산하였다.</p><h2>혈청의 산화적 스트레스 바이오마커 측정</h2><p>실험동물은 희생시키기 전 \( 24 \) 시간 동안 절식시킨 후 심장에서 채혈을 하였다. 채혈한 혈액을 \( 4,000 \mathrm{rpm} \) 로 \( 10 \) 분간 원심 분리하여 혈청을 얻었고 혈청은 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관한 후 분석에 사용하였다. 혈청 내의 Reactive oxygen species (ROS)를 측정하기 위하여 \( 25 \mathrm{mM} \mathrm{DCFH}-\mathrm{DA} \) 를 혼합한 후, 형광 광도계를 이용하여 \( 0 \) 분부터 매 \( 5 \) 분씩 emission wavelength of \( 530 \mathrm{~nm} \) 와 excitation wavelength of \( 485 \mathrm{~nm} \) 를 이용하여 \( 30 \) 분간 측정한 산출값을 계산하였다. 또한 \( \mathrm{ONOO}^{-} \)를 측정하기 위하여, Kooy등의 방법을 시행하여 측정하였다. 각 샘플을 \( \mathrm{pH} \mathrm{7.4} \) 의 rodamine buffer와 \( 5 \mathrm{mM} \) DHR\( 123 \)과 섞은 후 \( 5 \)분간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 흔들어 준 후 \( 5 \) 분씩 \( 30 \) 분간 emission 파장 \( 535 \mathrm{~nm} \) 와 excitation 파장 \( 480 \mathrm{~nm} \) 를 이용하여 \( 30 \) 분간 측정한 산출 값을 계산하였다.</p><h2>Western Blot Analysis</h2><p>대장의 세포질단백질을 얻기 위해 \( 100 \mathrm{mM} \) Tris-HCl \( (\mathrm{pH} \) 7.4), \( 5 \mathrm{mM} \) Tris-HCl \( (\mathrm{pH} 7.5)\), \(2 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl} 2\) ,\(15 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl} \) 에 \( 1.5 \)M sucrose, \( 0.1 \mathrm{M} \) DTT protease inhibitor cocktail을 첨가한 buffer A를 넣고 tissue grinder로 분쇄한 후 \( 10 \% \) NP-\( 40 \) 용액을 첨가하였다. 아이스 위에서 \( 30 \) 분간 정치시킨 후 \( 12,000 \mathrm{rm} \)으로 \( 2 \)분간 원심분리 하여 세포질단백질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다. 핵단백질을 얻기 위해 \( 10 \% \mathrm{NP}-40 \)가 더해진 buffer \( \mathrm{A} \) 에 두 번 행구고 \( 150 \mathrm{~mL} \) 의 buffer C (50 mM HEPES,) (\( 50 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}\), \(0.3 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\),\( 0.1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{mM} \) DTT, \( 0.1\mathrm{mM} \) PMSF and \( 10 \% \) glycerol)를 첨가해 재부유 시킨 뒤 \( 10 \)분마다 vortex를 \( 3 \)번 하였다. \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 으로 \( 10 \) 분간 원심분리한 후 핵단백질을 포함하고 있는 상층액을 얻어 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 각각 냉동 보관하였다. 간 조직의 세포질단백질의 \( \mathrm{TNF}-\alpha \), IL-\( 6 \), IL-\( 1 \beta\) , MCP-\( 1 \), Bax, Cytochrome C, Caspase\( 3 \), \( \beta \)-actin의 발현을 측정하기 위해 \( 9 \mathrm{mg} \)의 단백질을 \( 8-15\%\) SDS- polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 준비된 membrane에 각각의 \( 1 \)차 antibody를 처리하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 overnight 시킨 다음 PBST로 \( 6 \)분마다 \( 8 \)회 세척하고, 각각 처리된 \( 1 \)차 항체에 사용되는 \( 2 \)차 항체(PBST로 \( 1:3000 \)로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 \( 1 \)시간 반응시킨 후, PBST로 \( 6 \)분마다\( 5 \)회 세척하였다. 그리고 enhanced chemiluminescence (ECL, GE Healthcare, Arlington Heights, IL, USA) 용액을 부어준 뒤, Sensi-Q\( 2000 \)Chemidoc (Lugen Sci Co., Ltd., Seoul, Korea)에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 band를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan)프로그램을 사용하여 정량하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>모든 수치는 평균 \( \pm \) 표준오차(Mean \( \pm \mathrm{SEM}) \) 로 표시하였으며, SPSS (22.0 for Windows program)를 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA)로 유의수준 \( p \)-value \(<0.05 \) 에서 검정하였다.</p>
핵단백질을 포함하고 있는 상층액은 냉장 보관했어?
NO