<h1>재료 및 방법</h1><h2>파지의 분리</h2><p>파지는 선행연구에서 청주시 생활하수 하천과 버섯 재배 농가에서 배출하는 침출액에서 agar 이중층 방법으로 플라크를 생성시켜 파지를 분리하였다. Agar 이중층은 숙주균과 하천 샘플을 \( 1:1 \)의 비율로 soft agar 배지에 각각 접종한 후 hard agar 배지에 부어 만들었다. 접종을 완료한 agar 이중층 배지는 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 15 \) 시간 동안 배양하였다. 파지의 순수분리와 증폭은 멸균한 바늘로 한 개의 파지 플라크를 채취한 후 Pseudomonas agar F (\( \mathrm{MgSO}_{4} 1.5 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 1.5 \mathrm{~g} \), Bacto-peptone \( 10 \mathrm{~g} \), Bactotryptone \( 10 \mathrm{~g} \), agar \( 15 \mathrm{~g} \), glycerol \( 10 \mathrm{~mL} \) per liter) 액체배지 \( 5 \mathrm{~mL} \)에 현탁시키고 각 파지 숙주균을 가하여 \( 24 \) 시간 배양하여 이루어졌다.</p><p>파지 입자의 분리는 Chibani-Chennoufi 등의 방법에 따라 숙주균과 함께 배양한 파지 용균액에 \( \mathrm{NaCl} \)을 용균액의 \( 10 \% \)가 되도록 첨가하고, \( 0^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 1 \)시간 동안 배양하여 \( 8,000 \mathrm{rpm} \)에서 \( 10 \)분간 원심분리하였다. 원심분리를 통해 얻은 상징액에 \( 10 \% \) polyethyleneglycol (PEG) \( 6000 \)을 처리하고 \( 0^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 1 \)시간 동안 배양한 후 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)에서 \( 10 \) 분간 원심분리하여 파지를 침전시켰다. PEG \( 6000 \)에 의해 침전된 파지는 파지완충액 (\( 50 \mathrm{mM} \mathrm{~Tris-HCl}\), \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(20 \mathrm{mM} \mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl} \), \(10 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2} \), \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl} 2\), \( \mathrm{pH}7.3 \))에 재현탁하여 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p><h2>다클론항체의 생산, 계수 측정 및 교차반응</h2><p>다클론항체(polyclonal antibody)의 제작은 \( 70 \)일령의 암컷 New Zealand White rabbit을 사용하여 이루어졌다. 항원 물질은 항체 생산을 위하여 농축한 파지 \( \left(10^{11}-10^{12} \mathrm{pfu} / \mathrm{mL}\right) \)와 항원보조제(Freund's adjuvant)를 \( 1: 1(\mathrm{v} / \mathrm{v})= \)의 비율로 혼합하여 토끼의 목뒤와 뒷다리의 근육에 주사하였다. 첫 면역화 반응은 \( 1 \)차 주사에서 파지와 Freund's complete adjuvant를 혼합하여 유도하고, \( 2 \)차와 \( 3 \)차 boost injection을 통한 면역화에서는 파지와 Freund's incomplete adjuvant를 혼합하여 유도하였다. 생성된 항체의 측정은 항원을 주사하고 \( 7 \)일 후에 토끼의 귀 정맥에서 혈액을 채취하여 이루어 졌다.</p><p>항체의 계수(titer) 측정은 파지용균액을 희석하여 배지당 \( 300 \) plaques 정도를 형성하도록 희석 배수를 결정한 후 이루어졌다. 항원-항체 반응은 다클론항체를 포함한 혈청과 희석된 파지를 서로 혼합하고 상온에서 정치하여 유도하였다. 항원과 항체가 반응한 혼합액을 숙주균에 처리하고, \( 15 \)시간 배양 후 반응하지 않은 파지의 수를 측정하여 항체에 의해 감소한 파지의 수를 결정하여 항체의 titer로 하였다. \( 3 \)차 면역화에서 \( 2 \)주 경과 후에 다클론항체는 토끼의 심장에서 채혈하여 최종 수확하고 항혈청 중 항체의 계수를 측정하였다. 항체를 포함한 혈청은 \( -80{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하며 사용하였다.</p><p>다양한 파지와 다클론항체를 교차반응시키기 위하여 파지액은 식염수에 희석하여 이중층 방법으로 도말하여 계수를 측정하였다. 적절한 희석 배수가 선정된 파지는 희석한 다클론항체와 각각 혼합하고, 파지-항체 혼합액은 상온에서 \( 2 \)시간 동안 정치하여 충분히 항원-항체 반응을 일으켜 결합하게 하였다. 이중층 방법으로 파지-항체 혼합액을 도말하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 15 \)시간동안 배양하여 pfu를 측정하였다.</p><h2>버섯조직함몰검정법(Pitting test)</h2><p>버섯조직함몰검정법은 양송이버섯을 이용하여 수행하였다. 양송이버섯의 갓 부분과 자루 부분을 절단하여 수평을 이루게 하고 갓 부분의 절단면에 배지(control), 균주 배양액 \( \left(10^{8}-10^{9} \mathrm{cfu} / \mathrm{mL}\right) \), 균주배양액 \( + \) 파지, 균주배양액 \( + \) 파지액 \( + \) 항체, 균주배양액 \( + \) 항체를 각각 \( 10 \mu \mathrm{L} \)씩 점적하여 흡수시켰다. 각 용액을 점적한 버섯은 \(12 \)- \( 24 \)시간 동안 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 배양 중 증류수로 적신여과지를 넣고 밀봉하여 수분 증발을 방지하였다. 반응에 대한 평가는 점적부위의 변색과 함몰 정도를 관찰하여 이루어졌다.</p>
본문에서 항체의 측정을 위해 토끼 어느 부위에서 채취한 혈액을 사용하였니?
귀 정맥