<h1>재료 및 방법</h1><h2>시료의 제조</h2><p>본 실험에서 사용한 대황(Rheum undulatum L.)은 서울 경동시장 내의 한약 건재상에서 구입하여 사용하였다. 건조된 대황을 분쇄하여 \( 70 \% \) 에탄올을 넣은 후 3시간씩 3회 환류추출하였다. 추출물을 여과하고 감압 농축한 다음 동결 건조하여 그 분말을 사용하였다.</p><h2>세포 및 시약</h2><p>신생아의 포피조직에서 분리한 사람 피부 섬유아세포는 Modern Tissue Technology사 (Korea)로부터 구입하였다. 구입한 사람 피부 섬유아세포를 DMEM/F12 (3:1) 배지에 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS), \( 1 \% \) penicillin-streptomycin을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양하고 trypsinization으로 계대 배양한 뒤 6-10 세대 세포를 실험에 이용하였다. MMP-1 정량을 위해 MMP-1 BiotrokTM ELISA system(Amersham, UK)을 구입하여 사용하였다. In vitro MMP-1활성 저해효과 측정을 위해 사용된 형광물질이 표지된 DQgelatin, DQ collagen, collagenase, 1, 10-phenanthroline은Molecular probe사(USA)로부터 구입하여 사용하였다. 그 외 실험에 사용된 모든 시약들은 일급 및 특급 시약을 구입하여 사용하였다.</p><h2>1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거효과 측정</h2><p>Free radical의 소거 작용은 Blois가 사용한 방법을 약간 변형하여 각 시료의 DPPH radical (Aldrich, USA)에 대한 소거효과를 측정하였다. \( 0.1 \mathrm{mM} \) DPPH methanol 용액에 동량의 시료를 가하여 vortex mixer로 잘 혼합한 후 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 이후 spectrophotometer를 이용하여 \( 565 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 비교하여 DPPH radical의 소거활성을 백분율로 나타내었다. 양성 대조그룹으로는 vitamin C를 사용하였으며, 농도별로 처리하여 DPPH radical을 \( 50 \% \) 소거하는 농도(SC50)를 구하여 시료와 활성을 비교하였다.</p><h2>초산화 음이온 라디칼(Superoxide anion radical) 소거효과 측정</h2><p>초산화 음이온 라디칼의 소거작용은 Furuno 등의 방법에 따라 각 시료의 xanthine-xanthine oxidase system에 의해 생성된 초산화 음이온 라디칼을 소거하는 효과를 측정하였다. 0.05 M Na2CO3 buffer에 3 mM xanthine, 3 mM EDTA,0.72 mM nitroblue tetrazolium (NBT), \( 0.15 \% \) bovine serumalbumin (BSA) 용액과 시료를 각각 첨가하여 혼합한 다음, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응하였다. 그 후 각 tube에 xanthine oxi-dase \( (0.25 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \) 용액을 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응한 후, \( 565 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 비교하여 초산화 음이온 라디칼 소거활성을 백분율로 나타내었다. 양성 대조그룹으로는 3-t-butyl-4-hydrox-yanisole (BHA)를 사용하였으며, 농도별로 처리하여 초산화음이온 라디칼을 \( 50 \% \) 소거하는 농도(SC50)를 구하여 시료와 활성을 비교하였다.</p><h2>세포 생존율 측정</h2><p>세포 독성은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenylte-trazolium bromide (MTT) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 Mosmann의 방법을 변형하여 실시하였다. HDF를 \( 2 \times 10^{4} \) cells/well 농도로 96-well plate에 접종한 후,각 well에 시료를 투여하여 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 24시간 배양하였다. MTT 용액 \( (5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)을 첨가하고 4시간 후 원심분리하여 상등액을 제거하고, 100 μl acid-isopropanol (0.04 N HClin isopropanol)을 첨가한 후 푸른색의 formazan이 용출되도록 하여 micro plate reader (BIO-TEK Instruments, USA)로 \( 565 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>자외선 A 조사 및 시료의 처리</h2><p>사람 피부 섬유아세포를 \( 1.5 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \)의 농도로 직경 \( 35 \mathrm{~mm} \) dish에 약 \( 80 \% \) 정도 자랄 때까지 배양하였다. 자외선 조사 전에 원배지를 제거한 후 PBS로 세척하여 배지 내 혈청성분을 제거한 다음, 자외선 조사장치(Sankyo Denki, Japan)로 자외선 A \( \left(6.3 \mathrm{~J} / \mathrm{cm}^{2}\right) \) 를 조사하였다. 자외선 A 조사 후 FBS를 첨가하지 않은 DMEM/F12 (3:1) 배지에 시료를 투여하여 24시간 배양하였다.</p><h2>MMP-1 합성 저해 효과 측정</h2><p>UVA 조사에 의해 유도되는 MMP-1 합성량 측정은 MMP-1 Biotrok \( ^{\mathrm{TM}} \) ELISA kit (UK)를 이용한 enzyme linked im-munosorbent assay 방법으로 실시하였다. 먼저 사람 피부 섬유아세포에 자외선 A를 조사 후 시료를 처리하여 24시간 배양한 배지를 MMP-1에 대한 단클론 항체(monoclonal an-ti-MMP-1)로 coating된 microplate의 각 well에 100 μl씩 분주한 후, 뚜껑을 덮어 실온\( (20-25)^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 보온하였다. 각 well의 내용물을 제거한 후 세척용 완충제(wash buffer)로 세척과정을 4회 반복하였다. 세척액을 완전히 제거한 다음 각 well에 MMP-1에 대한 다클론 항체(polyclonal anti-MMP-1) 100 μl씩 분주한 후, 뚜껑을 덮어 실온에서 2시간 동안 보온하였다. 각 well의 내용물을 제거한 후 세척용 완충제의 세척과정을 4회 반복하였으며, 세척액을 완전히 제거한 후 각 well에peroxidase conjugate 100 μl씩 분주한 후 실온에서 1시간 동안 보온하였다. 보온이 끝난 후 세척용 완충제의 세척과정을 4회 반복하였으며, 희석된 기질(substrate) 용액을 각 well에 100μl씩 분주한 후 실온에서 30분간 보온하였다. Stop 용액을 각 well에 100 μl씩 넣고 30분 내에 micro plate reader (USA)를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 표준에 대한 시료의 농도를 산출하였다.<p><h2>MMP-1 활성 저해 효과 측정</h2><p>시료의 MMP-1 활성 저해 효과 측정은 Wang 등이 사용한 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 즉, 반응완충액 100 μl에 DQ collagen \( (0.25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 20 μl, 시료 40 μl와 collagenase(0.5 unit) 40 μl를 첨가하였다. 암소, 실온에서 20분 경과 후형광분광광도계(PERKIN ELMER, USA)를 이용하여 흡수파장 \( 495 \mathrm{~nm} \), 방출파장 \( 515 \mathrm{~nm} \)로 형광값을 측정하였고, 대조그룹으로서 효소액 대신 반응 완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정하였다. 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 보정하였다. 양성 대조그룹으로는 1,10-PT를 사용하였으며, 농도별로 처리하여 MMP-1 활성을 \( 50 \% \) 소거하는 농도(IC50)를 구하여 시료와 비교하였다</p>
추출물을 여과하고 감압 농축한 다음 한 것은 뭐야?
동결 건조