<h1>결과 및 고찰</h1><h2>Sesquiterpene cyclase promoter-C4H 유전자 클로닝</h2><p>Binary vector pIG121-Hm vector에 클로닝된 sesquiterpene cyclase promoter - C4H 를 HindIII, SacI \) 으로 잘라내어 각 promoter별 size를 확인할 수 있었다. C4H gene의 size가 약 \( 1.5 \mathrm{~kb} \) 이고 각 promoter 3(\(0.4 \mathrm{kb}\)), 4(\(0.3 \mathrm{~kb}\)), 6(\(0.3 \mathrm{~kb}\)) , cyc600 (\( 0.6 \mathrm{~kb} \)) 로 확인되었다.</p><p>Sesquiterpene cyclase promoter와 \(\beta\)-glucronidase (GUS)gene을 fusion한 결과 UV stress에 더 많은 GUS 발현 양을 보이며 스트레스에 반응하는 것으로 보아 이 promoter를 사용하여 스트레스가 주어겼을 때 더 많은 C4H gene ex-pression을 기대하였고 stress에 특이적으로 발현하는 pro-moter 부위 3, 4, 6과 스트레스에 아주 민감하게 반응하는 promoter cyc600 을 대조구로 사용하여, 형질전환 된 담배에 스트레스를 가하여 C4H 발현량을 조절하고자 하였다. 지금까지는 보통 CaMV 35S promoter를 이용하였고, 이는 과다한 발현으로 부작용을 가져오기도 하였다. 그렇기 때문에 본 연구에서는 stress 특이적으로 발현하는 promoter를 이용하여 stress방어 작용을 나타내는 것으로 알려진 C4H 유전자의 발현을 조절하고자 하였다.</p><h2>Agrobacterium 형질전환</h2><p>담배에서 Agrobacterium을 사용하여 leaf-disc방법으로 형질전환 실험을 하기 위하여, GUS를 report gene으 로 사용하는 pIG121-Hm vector를 사용하였다. 이 vector의 35S promotor와 GUS부위를 잘라내고 sesquiterpene cyclase promoter-C4H construct를 cloning하였다. 이렇게 재조합된 binary vector를 disarmed Agrobacterium EHA101에 freeze-thaw방법으로 도입한 뒤, 여러 transformant중에서 plasmid DNA를 분리하여 Southern blot 분석으로 형질전환 여부를 확인하였다.</p><h2>C4H 유전자 담배에서 발현</h2><p>본 실험에서는 defense 기능을 가진 C4H 유전자를 stress response sesquiterpene cyclase 유전자의 promoter부분과 fusion하여 담배에서 발현시켰다. 답배의 형질전환은 이미 오래 전에 그 기법이 개발되어 잘 확립되어 있는 방법이다. 그 중 leaf-disc 방법을 택하여 형질전환을 시도하였다. 담배잎과 Agrobacterium을 공조배양 시킨 후 이틀간 암 상태에서 callus를 유도하였으며, Agrobacterium 의 over-growth를 막기위해 5 회 이상 3 차 증류수에 세척하였다. 그 후 hygromycin \( 10 \mathrm{mg} /\mathrm{l} \) 이 첨가된 shoot유도 배지에서 3주 이상 배양하였다. 처음 공조배양 시킨 sample 중 약 \( 77 \% \) 의 leaf disc에서 callus가 유도되었으며, 그 중 \( 80 \% \) 이상이 shoot형성을 보였다. 마지막으로 kanamycin과 hygromycin저항성을 가진 최종 형질전환체를 각 promoter당 20 line-을 확보할 수 있었다. 이 때 형질전환의 효율은 각 promoter별로 약간의 차이는 보였으나, Table 1.에서 나타낸 바와 같이 평균 \( 16.4 \% \) (\(\text{leaf-disc} : \text{transgenic plants}=200: 33\))정도로, 이는 일반적인 답배의 형질전환에서 보이는 효율임을 알 수 있었다</p><h2>형질 전환된 담배의 GUS histochemical assay</h2><p>본 연구에서 얻게 된 최종 형질전환체의 분석을 위하여 sesquiterpene cyclase promoter-GUS constructs로 이루어진 gene을 가진 담배 형질전환체에 GUS histochemical 분석함으로써, sesquiterpene cyclase promoter의 작동 여부를 조사하였다.</p><p>Sesquiterpene cyclase promoter-GUS gene으로 형질전환된 담배의 callus와 잎, 뿌리를 X-glucuronide가 첨가된 시약으로 12시간 염색시킨 다음, fixation mix를 넣고 2시간동안 고정화 하였다. 따라서 GUS gene이 발현된 것을 알 수 있었다. Callus와 잎에서 GUS 분석을 하였을때 GUS gene 이 발현됨을 모임으로써 promoter가 정상적으로 작동함을 확인하였다.</p>
promoter별 크기를 어떻게 확인할 수 있는가?
Binary vector pIG121-Hm vector에 클로닝된 sesquiterpene cyclase promoter - C4H 를 HindIII, SacI \) 으로 잘라내어