<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>본 실험에 사용된 양파(Turbo 품종)는 경상남도 창녕군에서 재배한 것을 구입하였다. 두 가지 건조방법, 즉 동결건조법과 저온 진공건조법을 이용하여 양파 분말을 제조하였다. 동결건조는 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) deep freezer (DC 400, Yamato, Japan)에서 24시간 냉동한 후 동결건조기를 이용하여 \( -45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20\( \mathrm{Pa} \) 의 압력으로 7일간 건조시켰다. 저온 진공건조는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 40 torr의 압력으로 3일간 건조시켰다. 두 가지 건조 방법에 따른 일반성분의 함량에는 거의 차이가 없었으며 동결건조와 저온 진공건조에 의한 건조 양파의 수분 함량은 각각 \( 17.1 \% \) 와 \( 16.5 \% \) 였고 생양파의 경우 수분 함량이 \( 93.1 \% \)이며 건조에 의해 조지방, 조단백질 및 조회분의 양은 농축되어 증가하였다.</p><h2>추출 및 분획</h2><p>건조된 양파 분말은 실험 사용 전까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 냉동 보관되었다가 유기용매 추출을 위하여 acetone:methylene chlor-ide를 1:1 비율로 혼합하여 양파분말이 충분히 잠기도록 하여 24시간 방치한 후 추출하였다. 이 과정을 2회 반복하여 얻은 여액은 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 수욕 상에서 rotary vacuum evaporator(EYELA, Japan)을 사용하여 농축하여 aceton/methylene chloride 추출물 \( (\mathrm{A}+\mathrm{M}) \) 을 얻었다. 남은 잔사에 동량의 meth-anol을 부어 위와 동일한 방법으로 2회 반복한 후 농축하여 methanol 추출물 \( (\mathrm{MeOH}) \) 을 얻었다. 두 추출물을 혼합한 추출물은 용매 극성에 따라 순차적으로 분획하여 hexane, \( 85 \% \)aq. \( \mathrm{MeOH} \), butanol \( (\mathrm{BuOH}) \), water 분획물을 얻었다. 실험에는 각각의 추출물들을 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 세포배지로 필요한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다. 세포배양에 사용된 DMSO의 최종농도는 \( 0.05 \% \) 이하가 되도록하였다.</p><h2>암세포 및 암세포 배양</h2><p>한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 인체 섬유육종세포(HT-1080)와 인체 결장암세포(HT-29)를 분양 받아 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. HT-1080과 HT-29 암세포를 \(100\mathrm{ units} / \mathrm{ml}\)의 penicillin-streptomycin과 \( 10 \% \) FBS가 함유된 RPMI 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. 배양 중인 세포를 일주일에 2번 새로운 배지로 바꿔주었다. 일주일 후 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 뒤 \( 0.05 \% \) trypsin- \( 0.02 \% \) EDTA (Gibco Co., USA)로 부착된 세포를 분리하여 원심분리 한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 \( 75 \mathrm{~mm}^{3} \) cell culture flask에 \( 10 \mathrm{ml} \) 씩 일정한 수로 분할하여 주입하고 계속 6~7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.</p><h2>MTT assay</h2><p>배양된 암세포는 96 well plate에 \( 5 \times 10^{4} \ mathrm{ cells} / \mathrm{ml}\)이 되도록 \( 100 \mu 1 \) 씩 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 배양한 후 배지는 제거한 뒤 각 시료를 RPMI 배지로 희석하여 각 well당 시료를 \( 100 \mu l \) 씩 첨가하고, 대조군에는 시료 대신 \( \mathrm{PBS} \) 를 \( 100 \mu l \) 씩 첨가하였다. 이 plate를 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \)incubator에서 24시간 배양하였다. 배양 후 MTT assay를 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bro-mide (MTT) 시약 \( 5 \mathrm{mg} \) 을 \( 1 \mathrm{ml}\) PBS로 녹인 후, \( 10 \% \) FBS가 함유된 RPMI배지 \( 9 \mathrm{ml} \) 와 희석하여 \( 100 \mu l \) 를 첨가하고 3~4시간 동안 더 배양하여 MTT가 환원되도록 한다. 배양종료 후 생성된 formazan 결정을 가라앉힌 후 각 well에 형성된 결정이 흐트러지지 않도록 주의하면서 MTT 시약처리 배지를 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 formazan 결정을 용해시키기 위하여 DMSO 를 \( 100 \mu \) 씩 분주하여서 5~10분간 반응시켜 96 well plate용 광도계(ELISA reader)로 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해서 환원된 양을 나타내며, 따라서 각 well에 존재하는 생존수와 비례한다.</p><h2>세포 내 활성산소종(reactive oxygen species) 측정</h2><p>HT-1080세포는 \( 100\mathrm{ units }\) /\(\mathrm{ml} \) 의 penicillin-streptomycin과 \( 10 \% \) FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 cell culture dish에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. 세포 내 활성산소종은DCFH-DA(dichlorodihydrofluorescin diacetate) assay로 측정하였다. DCFH-DA (Sigma, USA)는 세포 내 활성산소종과 반응하여 형광물질(dichlorofluorescein, DCF)을 만들어 내는 것으로 이 시약을 세포 속에 넣어 발생하는 형광을 측정함으로써 세포 내의 활성산소종을 측정할 수 있다. 세포를 96 well에 분주한 후 24시간 배양, PBS 완충액으로 씻은 후 \( 20 \mu \mathrm{M} \) DCFH-DA 을 각 well에 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 20분간 pre-incubation하였다. 각 well에 시료를 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 1시간 in-cubation한 후, DCFH-DA을 없애고 세포는 다시 PBS 완충액으로 씻은 후 \( 500 \mu \mathrm{M} \) \(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 처리하여 시간별로 DCF fluo-rescence를 excitation \( 488 \mathrm{~nm} \), emission \( 530 \mathrm{~nm} \) 에서 형광 분석기로 측정하였다. 대조군들(blank군과 control군)은 시료 대신 PBS를 처리하며, control군은 \( 500 \mu \mathrm{M} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 처리를 하고, blank군은 \( 500 \mu \mathrm{M} \mathrm{H} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 대신 PBS를 처리하여 측정하였다.</p><h2>통계 분석</h2><p>실험 결과는 Mean±SEM (Standard Error of Mean)으로 나타내었고 분석된 실험 데이터는 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 one-way ANOVA를 실시하여 유의성이 있을 경우에 post-hoc test로 Duncan's mutiple range test를 실시하여 \( \mathrm{p}<0.05 \) 수준에서 유의성을 검증하였다.</p>
\( -70^{\circ} \mathrm{C} \) deep freezer에서 24시간 냉동 후 \( -45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20\( \mathrm{Pa} \) 의 압력으로 7일간 건조시키는 방법은 뭐야?
동결건조