<h2>지질과산화 측정</h2><h3>흰쥐 간 microsome 분획의 조제</h3><p>흰쥐의 간을 \( 0.15 \mathrm{M} \mathrm{KCl} \) 로 perfusion한 후 적출하여 잘게 자른 후 미리 냉각시킨 4 배 용량의 완충 용액(\( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \(\mathrm{pH} 7.4\))을 넣고 균질기를 이용하여 조직을 균일화하였다. 이것을 \( 8,000 \times \mathrm{g} \) 로 15 분간 원심 분리한 후 상징액을 다시 \( 10,000 \times \mathrm{g} \) 로 20 분간 원심분리하여 절편을 제거하였다. 1 시간 원심 분리한 후 침강한 pellet울 균질화 용액에 현탁 시키고 \( 100,000 \times \mathrm{g} \) 로 다시 한번 원심 분리하여 침강한 pellet을 microsome 분획으로 분취하였다. 조제한 이들 분획의 단백질을 정량하고 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 냉동 보관하여 사용하였다.</p><h3>\( \mathrm{Fe} \) /ascorbate system 반응액의 조제</h3><p>시료를 \( \mathrm{MeOH}\) \(1 \mathrm{~mL} \) 에 용해하여 사용하였다. \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer( \( \mathrm{pH} 7.5\)) \( 1.6 \mathrm{~mL} \) 에 시료용액 \( 0.1 \mathrm{~mL} \), 간 microsome 분획 (\( 1 \mathrm{~mL} \) 중 \( 1 \mathrm{mg} \) 의 단백질 함유) \( 0.1 \mathrm{~mL}\), \(0.1 \mathrm{mM} \) ascorbate \( 0.1 \mathrm{~mL}\), \(5 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{FeSO}\) \(40.1 \mathrm{~mL} \) 를 차례로 가 하여 반응액을 조제하였다.</p><h3>생체내에서 항산화 작용에 미치는 영향</h3><p>사염화 탄소 (\( \mathrm{CCl}_{4} \)) 에 외한 지질과산화 유발 : 흰쥐 1 군을 7 마리로 하여 두 군은 2주간 시료를 \( 200 \mathrm{mg} / \mathrm{kg}\), \(500 \mathrm{mg} / \)\( \mathrm{kg} \) 씩 saline에 녹여서 경구 투여하였고, 두 군은 검액 대신 saline을 투여하였다. 투여 마지막 날 미리 6시간 절식 시키고 corn oil에 용해시켜 \( \mathrm{CCl}_{4}\) \(0.4 \mathrm{~mL} / \mathrm{kg} \) 씩 경구 투여하였다. 검액은 투여하지 않고 \( \mathrm{CCl}_{4} \) 만 투여하여 양성 대조군으로 하였고, \( \mathrm{CCl}_{4} \) 및 검액을 투여하지 않고 corn oil만 투여하여 정상 대조군으로 하였다.</p><h3>Catalase 활성 측정</h3><p>\( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 기질로 하여 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 소모하는 속도를 측정하여 간 microsome의 catalase activity를 측정하였다. \( 30 \% \) hydrogen peroxide \( 30 \mu \mathrm{L} \) 를 \( 0.05 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( 5 \mathrm{~mL}(\mathrm{pH} 7.0\))에 녹여서 기질로 사용하였고, 효소로 간 microsome 분흭을 100 배 농도로 희석하여 사용하였다. \( 0.05 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.0)\) \(570 \mu \mathrm{L} \), 기질 \( 330 \mu \mathrm{L} \) 와 효소원으로 간 균질화물 희석액 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 를 넣고 혼합한 후 \( 240 \mathrm{~nm} \) 에서 10 초 간격으로 40 초간 흡광도를 측정하였다.</p><h3>글루타치온 퍼옥시다아제의 활성</h3><p>간장의 cytosol 획분에서 글루타치온 퍼옥시다아제(glu-tathione peroxidase : GSHPx)의 활성의 측정하였다. 시험관에 cytosol에 인산완충용액(\(0.3 \mathrm{M}\) phosphate buffer with \( 4.0 \mathrm{mM} \) EDTA, \(\mathrm{pH}\) 7.2) \( 0.1 \mathrm{~mL} \), 증류수 \( 1,295 \mathrm{~mL} \), \( 26.56 \mathrm{mM} \) sodium azide 용액 \( 0.5 \mathrm{~mL}\), \(294.37 \mathrm{mM}\) GSH 용액 \( 60 \mathrm{uL}\), \(8.4 \mathrm{mM} \) NADPH (\(35.0 \mathrm{mg}\) NADPH/\(5.0 \mathrm{mL}\) of \( 0.3 \mathrm{M} \) phosphate buffer with \( 4.0 \mathrm{mM} \) EDTA) \( 110 \mathrm{uL} \), glutathione reductase \( 5 \mathrm{~mL}\), \(1 \mathrm{mM} \) hydroperoxide \( 320 \mathrm{uL} \)를 첨가하여 5 초간 잘 혼합한 후, 분광광도계를 사용하여 \( 340 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 15 초 간격으로 2분간 측정하여 표준 검량선에 의해 GSHPx (\(\mathrm{IU}/\mathrm{g}\) protein)의 활성을 계산하였다.</p><h3>Lipid peroxide 함량 측정</h3><p>상기의 간 microsome 분획의 균질액에 \( 10 \% \) sodium dodecyl sulfate 용액을 첨가하고 실온에서 30 분간 방치한 다음 \( 0.1 \mathrm{M} \) HCl과 \( 0.37 \% \) thiobarbituric acid 용액을 가한 후 혼합액을 끓는 물에서 45 분간 반응시킨 후, 냉각하여 부칠 알코을를 가해 혼합하고 \( 1,000 \times \mathrm{g} \) 에서 원심분리한 후 상층의 부칠 알코올 층을 \( 532 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였고, tetramethoxypropane을 표준액으로 사용하여 MDA량을 정량하였다.</p><h3>통계처리</h3><p>본 실험에서의 결과치의 유의성은 Student's t-test 법으로 검정하였다.</p>
흰쥐의 간을 어떤것으로 perfusion한 후 적출하여 잘게 잘랐니?
\( 0.15 \mathrm{M} \mathrm{KCl} \)