<h1>재료 및 방법</h1><h2>시료 추출</h2><p>도인승기탕 제조에 필요한 구성약재는 휴먼허브(경북 경산시)에서 구입하여 사용하였다. 시료는 대황 \(30\mathrm{~g}\), 계지 \(20\mathrm{~g}\), 도인 \(100\mathrm{~g}\), 망초 \(20\mathrm{~g}\), 감초 \(100\mathrm{~g}\)을 혼합하여 열수 추출은 시료에 증류수를 1 배의 양을 가하여 \(85^{\circ}\mathrm{C}\)에서 3시간 환류 냉각 추출한 뒤 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였다. 에탄올 추출물은 시료에 10배 양의 \(70\%\) 에탄올을 첨가하여 실온에서 24시간 동안 침지 추출한 후 상등액과 침전물을 분리하는 방법으로 3회 반복 추출하였다. 그리고 Whatman No. 1 여과지로 여과하고 농축하여 동결건조 후 냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.</p><h2>시약 및 기기</h2><p>세포배양을 위한 Dulbeco's modified eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin penicillin, trypsin 250은 Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, USA)로부터 구입하여 사용하였고, 3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5- di-phenyl-tetrazoliumbromide (MTT), arbutin, L-3,4-dihydrox-yphenylalanine (L-DOPA)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다. 1차 항체 인 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2와 2차 항체는 santa cruz (CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 기기는 ELISA reader (Tecan, Mönnedorf, Switzerland), rotary vacuum evaporator (Rikakikai Co., Tokyo, Japan), freeze drier (Ilsin, Gyonggi-do, Korea), centrifuge (Eppendorf, AG, Germany), microscope (Nikon, Tokyo, Japan), \(\mathrm{CO}_{2}\) incubator (Hanbaek, Gyeonggi-do, Korea), haemacytometer (Marienfeld, Germany)를 사용하였다.</p><h2>세포 배양</h2><p>B16F10 melanoma cello ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양 받아 사용하였으며, Michikaw 등의 방법에 따라 배양하였다. 세포에 \(0.25\%\) trypsin 용액을 희석 처리한 후 세포를 분리한 다음 DMEM배지에 \(10\%\) FBS와 \(1\%\) penicillin/streptomycin \((100 \mathrm{U}/\mathrm{ml})\)을 첨가하여 \(37^{\circ}\mathrm{C}\), \(5\%\mathrm{CO}_{2}\) incubator에 적응시켜 배양하였다.</p><h2>MTT assay에 의한 세포 생존능력 측정</h2><p>세포 생존률 측정은 Carmichael 등의 방법에 따라 측정하였다. 세포를 96 well plate에 \(0.6\sim0.8\times 10^{3}\) cells/well이 되게 \(180\mathrm{\mu l}\) 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 \(20\mathrm{\mu l}\) 첨가한 후 \(37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5\%\mathrm{CO}_{2}\) incubator에서 48시간 배양하였다. 배양 후 5\(\mathrm{mg}/\mathrm{ml}\) 농도로 제조한 MTT 용액 \(20\mathrm{\mu l}\)를 첨가하여 3시간 배양 한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO \(200\mathrm{\mu l}\)를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 \(550\mathrm{~nm}\)에서 흡광도를 측정한 후 \( (1- \) 시료의 흡광도/대조구의 흡광도)\(\times 100 \)에 의하여 생존율을 계산하였다.</p>
본 연구는 휴먼허브에서 무엇을 샀는가?
구성약재