<h2>Protein purification</h2><p>배양액을 원심 분리하여 pellet을 따로 모은 후, 여기에 \( 40\mathrm{ml} \)의 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl \(( \mathrm{pH}8.0 )\), \( 150 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}\), \(10 \mathrm{mM} \) imida-zole, \( 0.05 \% \) \( \beta \)-mercaptoethanol (BME), protease inhibitor(benzamidine \( 1 \mathrm{mM} \), PMSF \( 1 \mathrm{mM} \), protein inhibitor cocktail \( 1 \mu\mathrm{l} / \mathrm{ml}) \)로 구성된 lysis buffer를 넣어 잘 현탁시켰다. 이를 homogenizer를 이용하여 lysis 하였다. Lysis 된 현탁액을 원심분리기를 이용하여 \( 16,000 \times g\), \(30 \mathrm{~min} \)으로 원심분리하였다. 원심분리된 상층액을 nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA)resin \( 1 \mathrm{ml} \)이 담긴 튜브에 옮긴 뒤 약 1시간 45분간 섞어주었다. \( 5,000 \times g \)으로 10분 동안 원심분리를 하여 resin을 다운시키고 상층액을 버린 후 lysis buffer \( 12.5 \mathrm{ml} \)씩 넣어 주고 5분 동안 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 rocking을 해준 뒤에 \( 5,000 \times g\)에서 다시 원심 분리시켜 resin을 다운 시키는 방법으로 4회 washing을 행하였다. Resin을 micro tube로 옮겨 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}\) \((\mathrm{pH} 8.0)\), \( 25 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}\), \(100 \mathrm{mM} \) imidazole, \( 0.05 \% \) BME로 구성된 elution buffer \( 1 \mathrm{ml} \)를 넣어 주고 10분 동안 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 inverting을 해준 뒤에 \( 1,000 \times g \)에서 원심 분리를 행하였다. 이 방식대로 3회 시행해 주고 모아둔 상층액을 조심스럽게 centrifugal filter units에 넣은 뒤에 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl}\) \((\mathrm{pH} 8.0)\), \(25 \mathrm{NaCl} \), \( 5 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{DTT}\), \(0.05 \% \) BME의 filter buffer \( 6 \mathrm{ml} \) 넣고 \( 5,000 \times g \)에서 5 ~ 10분간 원심분리를 5번 시행하였다. 농축액을 얻은 다음 Bradford assay로 단백질 농도를 정량한 후에 부피의 \( 20 \% \)정도로 글리세롤을 첨가한 뒤 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p><h2>SDS-PAGE</h2><p>\( 5 \times \) SDS-PAGE loading buffer \(4 \mu \mathrm{l}\) 를 첨가한 모든 시료들을 \(95 \sim 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 처리한 후 \( 8,000 \times g \)에서 1분간 원심분리를 행하였다. 시료들을 약 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 씩을 준비된 gel에 loading 하였다. 이후 \( 150 \mathrm{~V}\), \(120 \mathrm{~mA} \)에서 100분간 전기영동을 행하였다. 전기 영동을 마치면 gel을 분리시켜 2시간 동안 Coomassie staining solution으로 염색을 한 후에 destaining solution으로 탈색하였다. 탈색이 다 되면 drying kit에서 건조시킨 후 단백질을 확인하였다.</p><h2>pNPP assay와 kinetic constant calculation</h2><p>총 assay량을 \(20 \mu \mathrm{l}\) 로 잡고 최종 농도가 \( 1 \times \mathrm{pNPP} \) assay buffer (\(100 \mathrm{mM}\) sodium acetate, \( 50 \mathrm{mM} \) Bis-Tris, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris), \( 50 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{pNPP} \)를 넣어 주고 준비된 단백질을 조건에 맞혀서 넣어 주었다. 조건은 상황에 맞게 온도와 반응 시간 또는 \( \mathrm{pH} \) 등을 바꿔서 측정하였다. 반응이 끝나면 \( 0.25 \mathrm{~N}\) \(\mathrm{NaOH}\) \(80 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여서 반응을 중지시켰다. 그 후에 \( 410 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 값을 측정하였다.</p><p>이렇게 측정된 흡광도에 흡광계수로 \( 17,800 \mathrm{~l} / \mathrm{mol} \cdot \mathrm{cm} \) 을 이용하여 반응한 농도를 계산하였다. 이를 통해 \( \mathrm{pNPP} \)에 대한 kinetic 상수 결정을 위해 참고 문헌 29번에 제시된 curve fitting 방법으로 계산하였다. 모든 실험은 독립적으로 3회 이상 반복적으로 이루어졌으며 각 실험에서 얻어진 결과는 평균 표준편차로 표시하였다.</p>
탈색이 다 된 시료를 어디서 건조시켜?
drying kit