<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>본 실험에 사용한 넙치(Paralichtys olivaceus, 70마리, 체장 \( 25 \sim 30 \mathrm{cm} \))는 부산 인근 양어장에서 구입하였다. 살아있는 상태의 넙치로부터 내장을 제외한 육질을 액체질소로 급속 동결시켜 실험에 사용하기 전까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다.</p><h2>추출 및 부분정제 과정</h2><p>추출 및 부분정제 과정은 이전에 기술된 방법을 약간 변형하여 시행하였다. 동결 보관된 넙치 육질 \( (8 \mathrm{~kg}) \)을 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 증류수로 10~15분간 가열하고 냉각시킨 후, \( 5 \% \) 초산을 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3시간 동안 교반하였다. 표반된 시료는 분쇄기 (PT3100, Polytron Co., U.S.A)를 사용하여 10분 동안 \( 10,000 \mathrm{rpm} \) 으로 분쇄하고, 분쇄된 시료는 30분 동안 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 8,000 \mathrm{rpm} \)으로 원심분리를 하였다(Supra 21K, Hanil Co., Korea). 상층액을 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 진공 농축시킨 다음, cthanol을 첨가하여 하루 동안 \( 4 \mathrm{C} \)에서 보관하였다. 그리고 불순물을 제거하기 위해 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 10,000 \mathrm{rpm} \)으로 30분 동안 원심분리를 시행한 후, 상층액에 \( \mathrm{NaCl} \)을 시료 부피 당 \( 12 \mathrm{~g} \) 의 비율로 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하루동안 보관하였다. 시료를 다시 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)으로 30분 동안 원심분리한 후, 상층액 에 최종 농도가 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \) 이 되도록 \( \mathrm{HCl} \) 을 첨가하여, 50분 동안 \( 15,000 \mathrm{rpm} \) 으로 다시 원심분리하여 상층액을 얻었다. 물질을 분자 크기별로 분리하기 위하여 미러 \( 100 \% \) methanol로 활성화시키고 증류수로 충분히 세정한 Sep-Pak \( C_{18} \) cartridge (Supelco Co., U.S.A. 20ml)에 얻어진 상층액을 주입하여 \( 0\% \)(D.W), \( 10\% \) methanol (RM10), \( 60\% \) methanol (RM60) 및 \( 100\% \) methanol (RM100)로 물질들을 각각 용출시켜 동결건조를 하고, 무게를 축정하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다. 이중에서 RM60 (1.2\(\mathrm{g} \)) 분획물은 부분정제를 수행하기 위해 \( 5 \% \) 초산에 녹여서 동일 용매로 평형화된 Sephadex G-25 \( (2.6 \times 110 \mathrm{cm}) \) column에 주입하고, 홉광도 \( 254 \mathrm{nm} \)에서 \( 90 \mathrm{m} / \mathrm{h} \) 속도로 fraction당 \( 15 \mathrm{m \ell} \) 씩 분취하였다. 분춰된 fraction 중 유용활성이 있는 fraction 164~202을 두 개의 group으로 묶어 각각 RM60(fr.164-178)과 RM60(fr.179-202)로 명명하여 동결건조 후, \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다. 본 실험에 사용한 시료는 RM10\( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{m \ell}) \), RM60, RM60fr. 164-178, RM60fr. 179-202, RM100, 증류수 용출액(DW) 등이며 \( 0.1\% \) DMSO를 vehicle로 사용하였다.</p><h2>단백질, 세포추출액 및 DNA 시료</h2><p>SV40 origin을 함유한 circular duplex DNA \( (pUC-ori \left.{ }^{+}\right) \), SV40 T-Ag, topo I, human DNA pol \( \alpha \)-primase, RPA 및 HeLa 추출액은 이전에 기술된 방법으로 준비하였다.</p>
동결 보관된 넙치 육질 \( (8 \mathrm{~kg}) \)를 3시간 동안 어떻게 교반하였어?
\( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 증류수로 10~15분간 가열하고 냉각시킨 후, \( 5 \% \) 초산을 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서