<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료</h2><p>연구에 이용한 야생 멧토끼 시료는 한국유전자원은행에서 암수 판별기록이 있는 시료 중 암수 각각 2 개체씩을 분양받아 사용하였으며, 경상남도에서 암수 표현형 자료가 없는 멧토끼 사체 16 개체를 수집하여 이용하였다. 시료는 근육 또는 피부에서 DNA를 추출하였다. 근육과 피부에서의 DNA 추출은 sucrose-proteinase K lysis buffer를 이용하였으며, 추출 과정은 일부 변형하여 수행하였다. DNA 추출 후 RNase를 처리하였고, 이후 phenol 추출법과 ethanol 침전으로 다시 회수하여 TE buffer에 용해하여 PCR 증폭을 위한 주형으로 이용하였다.</p><h2>중합효소연쇄반응(PCR)</h2><p>멧토끼에서 분리한 DNA를 주형으로, \( 10 \times \ PCR \) 반응 완충액, \( 20 \mathrm{~mM} \) dnTP, 각각 \( 10 \mathrm{~pmol} \) primer, \( 2.0 \mathrm{~units} \) Taq DNA polymerase (TaKaRa, Japan)에 멸균한 탈이온수를 첨가하여 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 용량으로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 증폭용 primer들은 기존에 보고된 서열정보들을 토대로 직접 고안하였고, 서열의 정보는 Table 1에 제시하였다. ZFX-ZFY 유전자의 엑손 7과 10에서 고안한 hZFe7F와 hZFe10R을 멧토끼 인트론 7, 8, 9, 엑손 8과 9 전체, 엑손 7과 10의 일부가 포함된 서열의 결정을 위한 PCR 중폭에 이용하였다. 유전자 성판별을 위해, 성별 이형성을 보이는 인트론 7을 포함한 절편의 증폭은 hZFe7F와 hZFe8R을 이용하였고, 웅성 특이적 SRY 유전자의 증폭을 위한 haSRYF와 haSRYR 프라이머를 이용하였다. PCR 증폭은 상기된 반응액 조성에 따랐으며 각각의 프라이머 세트의 annealing 온도는 gradient PCR 분석을 통해 최적 온도를 결정하였고, PTC-200. (MJ Research, USA)을 이용하였다. 유전자 증폭은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 2분 열변성 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)-45초, annealing 온도-1 분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)-1 분 (ZFX-ZFY 인트론 7, SRY) 또는 2분 (ZFX-ZFY 엑손 7-10)으로 이어지는 증폭반응을 30회 반복한 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)-10 분 최종신장하고, 이후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하였다. 증폭 산물은 ethidium bromide가 함유된 \( 1.5 \% \) agarose 겔 상에서 전기영동한 후, UV 하에서 확인하고 사진촬영 하였다.</p><h2>유전자 클로닝과과 염기서열 분석</h2><p>유전자 증폭산물에 대한 염기서열 걸정을 위하여 DNA sequencing을 수행하였다. 정제된 SRY와 ZFX, ZFY에 대한 PCR 산물들은 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, USA)의 pCR2.0 vector에 연결한 후 대장균 OneShot Top10F' competent 세포에 형질전환하였고, 재조합 plasmid는 Wizard Plus SV Minipreps (Promega, USA)로 회수하였다. 추출한 plasmid DNA를 주형으로 dye-termination 반응을 수행하였고 MegaBase 500 (Amersham Pamacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 기존에 보고된 서열들을 기준으로 액손-인트론 경계를 확인하였고, 염기서열간 비교를 위한 다중정렬은 CLUSTAL W program을 이용하였다. 본 연구에서 새롭게 결정한 멧토끼 ZFX-ZFY 서열들은 database에 등록하였다 (GenBank Accession EF110883-EF110886). 또한 인트론 7 상에서 반복서열의 존재는 CENSOR web program (http://www.girinst.org/censor/)으로 확인하였다.</p>
경상남도에서는 어떤 것을 수집하여 이용하였는가?
암수 표현형 자료가 없는 멧토끼 사체 16 개체