<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료 및 조직 추출액의 준비</h2><p>농어목 망둑어과(Perciformes, Gobiidae) 풀망둑(Acanthogobius hasta)은 경기도 김포시 강화군 해안에서 2006년 11월 초에 \( 26 \pm 2 \mathrm{~cm}\), \(91 \pm 3 \mathrm{~g} \) 정도 크기를 채집하여 즉시 동결시켜 실험실로 운반하였다. 풀망둑의 골격근, 심장, 눈, 뇌 및 간 조직을 뗴어내어 증류수로 혈액을 충분히 제거한 다음, 시료 조직에 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 6.85\),\(4^{\circ} \mathrm{C}\)) 를 2-3 배 (\( \mathrm{v} / \mathrm{w} \)) 가하여 얼음에 채운 glass homoge-nizer로 파쇄 하였다. 조직 파쇄액은 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(20,000 \times g \)에서 1시간씩 2회 원심분리(Hitachi 20 PR-52D) 하였으며 상등액을 시료로 사용하였다.</p><h2>Lactate dehydrogenase와 citrate synthase의 활성 측정 및 단백질 정량</h2><p>LDH의 활성은 \( 1.50 \mathrm{mM} \) 피루브산과 \( 0.14 \mathrm{mM}\) NADH를 포함한 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 6.85\)) \( 3 \mathrm{ml} \) 에 시료를 가한 다음 NADH 로 부터 \( \mathrm{NAD}^{+} \)로 산화되는 정도를 분광광도계(Shimadzu UV-160A)를 사용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), \(340 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 활성의 단위(unit)는 1분 동안 \( 1 \mu \mathrm{M} \) 의 기질을 전환시키는데 필요한 효소의 양으로 millimolar ex-tinction coefficient 6.22를 사용하여 계산하였고 조직 \( 1 \mathrm{~g} \)에 대한 활성으로 계산하였다. CS의 활성은 \( 0.2 \mathrm{mM} \) acetyl-CoA, \(0.1 \mathrm{mM}\) DTNB [5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)], \( 0.5 \mathrm{mM} \) oxaloacetic acid를 포함한 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris- HC buffer (\( \mathrm{pH} 7.5\)) \(3 \mathrm{ml} \) 에 시료를 가한 후, DTNB가 전환되는 정도를 분광광도계를 사용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), \(412 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 활성의 단위(unit)는 1 분 동안 \( 1 \mu \mathrm{M} \) 의 기질을 전환시키는데 필요한 효소의 양으로 millimolar extinction coefficient 13.6을 사용하여 계산하였다. 단백질은 BSA (\( 100 \mu \mathrm{g} / 100 \mu \mathrm{l} \)) 를 표준단백질로 사용하여 분광광도계로 \( 595 \mathrm{~nm} \) 에서 정량하였고 LDH의 특이활성도는 단백질 양에 대한 효소의 활성 (unit/mg)으로 나타냈다.</p><h2>Native-polyacrylamide gel 전기영동 및 항원-항체반응</h2><p>풀망둑 조직의 동위효소를 확인하고 진화 정도를 확인하기 위하여 골격근, 심장, 눈, 뇌 및 간 조직액에 정제한 꺽지(Coreoperca herzi) \(\mathrm{LDH} ~\mathrm{A_4}\), 소(Bos prinigenius) \( \mathrm{B}_{4} \), 대구(Gadus macrocephalus) liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 및 조피볼낙(Sebastes schlegeli) eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소에 대한 항혈청을 각각 \( 1: 1 / 2,1: 1,1: 2,1: 3(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12시간 동안 항원-항체 반응을 시켰다. LDH 동위효소와 항체가 복합체를 형성하지 않고 상등액에 남아 있는 동위효소를 확인하기위해 반응액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(20,000 \times g \) 에서 원심분리한 후 상등액을 native polyacrylamide gel 전기영동 하였다. 각 조직의 LDH 활성이 동일하게 되도록 시료의 양을 조절하였고, 시료에는 \( 50 \% \) sucrose (\( 1: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v} \)) 와 \( 0.05 \% \) bromo-phenol blue 용액을 가하였다. 전기영동은 polyacrylamide vertical slab system (Hoefer SE250)으로 thermostatic circu-lator (EYELA CA-1100)를 사용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 로 유지시키면서 실시하였다. Slab gel은 \(7.5\%\) acrylamide separation gel 및 \(2.5\%\) acrylamide stacking gel로 만들었고, Tris-glycine buf-fer(\(\mathrm{pH} 8.3\))를 사용하여 \( 100 \mathrm{~V} \) 에서 20분간 전개시킨 후 \(200 \mathrm{V}\)에서 130분간 전기영동 하였다. LDH는 DL-lactate, NBT, PMS 그리고 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 포함한 용액으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 염색한 후, \( 15 \% \) 초산용액으로 고정하여 확인하였다. LDH 동위효소의 활성 정도는 gel을 image analyzer (Viber Lourmat)로 사진을 찍은 후 분석하였다.</p>
풀망둑의 어떤 조직들을 떼어낸 뒤 혈액을 증류수로 제거하였는가?
골격근, 심장, 눈, 뇌 및 간