<h1>결과 및 고찰</h1><h2>우수항균미생물 TBM 912의 선발동정</h2><p>강원도 일원에서 분리된 균주 중에서 항균활성이 시판중인 A사의 균주보다 우수한 균주로서 TBM 912임을 확인하여 이하의 실험에 선발하여 사용하였다. 이들의 항균활성을 A사 제품과 비교한 결과 잔디 및 식물병원균인 Rhizoctonia solani 와 Botrytis cinerea에 대하여 다소 우수한 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있었고(unpublished data), Fig. 1, 2에서와 같이 상당한 항균활성을 나타내어 우수균주로 선발하였다. 선발된 균주의 생리 ◦ 생화학적 특성을 조사한 결과를 Table 1에 나타내었으며, 이들의 그람양성, endospore 형성, catalase 양성 등의 성질에 기초하여 Bergey's manual에 따라 xmr성을 비교해 본 결과, 균주는 Bacillus 속인 것으로 추정되었다. 보다 정확한 동정을 위하여, 균주에서 염색체 DNA를 분리하여 PCR 방법으로 primer (5'-GAGTT TGATC CTG GC TC AG -3'[position 9 to 27 E.coli 165 rRNA]과 primer (5'-AGAA A GGAGG TGAT CAGCC-3'[position 1542 to 1525 E.coli \( 16 \mathrm{~S} \) rRNA])를 사용하여 16S 리보좀 DNA를 증폭시켰다. 그 결과 약 \( 1.5 \mathrm{~kb} \) 의 단편을 얻었으며 아가로스 전기영동으로 확인하였다. 이 단편을 pGEM-T easy 벡터에 서브클로닝하여, 5'-및 3'-말단의 부분적인 염기서열을 결정하였으며, data bank를 이용하여 상동성을 조사한 결과, 알려진 16S 리보좀DNA와 TBM 912 균주는 Bacillus subtilis와 \( 99 \% \) 의 상동성을 보였다. 따라서 분리 균주를 Bacillus subtilis 로 동정하였다.</p><h2>항균미생물 TBM 912의 세포벽 분해관련 효소의 분비</h2><p>분리균주의 길항작용 기작을 밝히기 위하여 항균미생물 TBM 912가 분비하는 세포벽 분해관련 효소의 생성유무가 육안으로 관찰되는 한천확산법 (agar diffusion method)으로 pectinase, cellulase, CMCase, xylanase, chitinase 및 protease 활성 유무를 확인한 결과, 분리균주 TBM 912 균주에서는 protease, CMCase, pectinase를 분비하였으며, 그 결과 중 pectinase 분비 결과만 Fig 4에 나타내었다. 이 결과에서 세포와 효소는 다수 분비됨이 확인되었으나 식물병원균 세포벽 분해관련 핵심적인 회소인 chitinase 등은 분비되지 않았다. 이 사실에서 분비 효소는 항균효과를 나타내는 주요인자는 아닌 것으로 판단된다.</p><h2>항균미생물 TBM 912의 항균물질</h2><p>산침전을 통해 methanol 추출에서 \( 530 \mathrm{mg} \)의 물질을 얻었다. 다시 알칼리성 물 \( 60 \mathrm{~m} / \)에 완전히 녹였고, Bradford 법으로 단백질량을 측정한 결과 \( 197 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)이였다. \( 60 ~\mathrm{ml} \)에 총 단백질성 물질은 \( 12 \mathrm{~mg} \)정도이다. 이들 정제 물질의 항균활성도 다시 조사하였다. 또한 TLC로 전개하여 발색시약(\(2\% \) ninhydrin in acetone)으로 발색 후 heating하였고, 발색시약 (ethanaol: sulfuric acd : \(5\% \) phenol (70:20:10))으로 발색 후 heating하여 물질을 확인하였다. Peptide 발색에서 1개가 Rf : 0.28, lipid 발색에서 7개가 Rf : 0.93,0.68,0.37,0.28 .0 .23, 0.20,0.18에서 관찰되었다. 이 중에서 Rf 가 0.28인 spot이 동시에 발색되었으며 이것은 lipopepetide로서 항균활성을 나타내는 균주의 항균활성의 주체로 판단된다. 한편 SDS-PAGE 법으로 대포적인 lipopeptide인 surfactin과 iturin을 시료와 동시에 흘려 비교한 결과, 사용 분리균주는 surfactin과 iturin을 동시에 생산하는 균주로 확인되었으며, surfactin을 iturin 보다 많이 생산함을 알 수 있었다. TLC에서 iturin이 극히 소량이므로 관찰되지 않았으며 SDS-PAGE 상에서도 신경을 써야 관찰할 수 있는 정도였다. 또한 이 분획을 HPLC를 이용, acetonitrile/water (60 : 40) 의 이동상으로 surfactin 표준물질과 비교, 분석한 결과를 Fig. 7에 나타내었다. 이로써 Bacillus sp. TBM 912가 생산하는 대표적인 항균물질의 주체가 surfactin계 물질로 추정되었다.</p><p>본 실험에 사용된 분리균주는 농업, 의학 및 공업의 다양한 영역에서 활용될 가능성이 높은 균주로서 지속적으로 그 가능성을 다양한 분야에서 검증하여 나갈 필요성이 있을 것으로 판단된다. 마지막으로 본 분리균주는 안정성 검사에서 정상적인 식물의 활동에는 영향이 전혀 없었고 익충(누에)에도 영향이 없다는 것이 검증되어 미생물농약소재로 사용될 수 있음이 확인되었다(unpublished data). 토착미생물을 여러 가지 용도로 개발함은 국가 기술의 핵심적인 요소로 특히 토착미생물을 농업적으로 활용함으로서 변화하는 소비자의 기호에 부응하고 나아가 수출을 위한 안전농산물생산으로 외화획득에도 이바지할 수 있을 것으로 기대된다.</p>
한천확산법을 사용해서 얻고자 하는 기본 원리는 무엇인가?
분리균주의 길항작용 기작