<h2>ACE (angiotensin I-converting enzyme) 저해능 측정</h2><p>매생이 추출물의 ACE저해 활성은 Cushman 등의 방법에 따라 측정하였으며, 조효소액은 rabbit lung acetone powder (Sigma)를 \( 0.3 ~\mathrm{M} ~\mathrm{NaCl} \) 을 함유한 \( 0.1 ~\mathrm{M} \) sodium borate buffer ( \( \mathrm{pH} ~8.3)\)에 \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{ml}(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 의 농도로 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 추출한 후, \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C}, 4,000 \mathrm{rpm} \) 에서 40분간 원심 분리하여 상등액을 ACE 조효소액으로 사용하였다. 기질은 \( 0.3 ~\mathrm{M} ~\mathrm{NaCl} \) 이 함유된 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium borate buffer \( (\mathrm{pH} ~8.3)\)에 HHL (hippuryl-histidyl-leucine, Sigma)을 \( 5 ~\mathrm{mg} / \mathrm{ml}(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 의 농도로 녹인 후 기질로 사용하였다. ACE 저해활성은 시료 \( 50 ~\mu \mathrm{l} \)에 ACE 조효소액 \( 50 ~\mu 1 \) 을 가한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 예비 반응시킨 후, 기질 \( 50 ~\mu \mathrm{l} \)을 가하고 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 반응시켰다. \( 150 \mu \mathrm{l} \) 의 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \) 로 반응을 정지시키고 \( 750 ~\mu \mathrm{l} \)의 ethyl acetate를 가한 후, 1분간 교반하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 5,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리한 다음 \( 500 ~\mu \mathrm{l} \)의 상등액을 얻었다. 이 상등액을 \( 120^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 완전히 건조시켜 \( 2 ~\mathrm{ml} \) 의 메탄올을 넣은 후 spectrophotometer (Ultrospec 3000 pro UV/Visible, Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd., Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 \( 228 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로서는 추출물 대신 추출용매 \( 50 ~\mu \mathrm{l} \)을 가해실험을 하였고, positive control은 captopril을 사용하였으며, ACE 저해 활성효과는 다음 계산식을 이용하여 계산하였다.</p><p>ACE inhibition \( (\%)=\frac{C-S}{C-B} \times 100 \)</p><p>S: 시료 흡광도</p><p>C: 대조구 흡광도</p><p>B: 시료 무첨가구의 흡광도</p><h2>\(a \)-Glucosidase 활성억제 효과 측정</h2><p>\( a \)-Glucosidase 활성억제 효과 측정은 Tibbot 등의 방법에 따라 측정하였다. \( 50 ~\mathrm{mM} \) sodium succinate buffer \( (\mathrm{pH} ~4.2) \)에 \(p\)-nitrophenol-\(a\)-D-glucopyranoside (PNPG, Sigma)를 용해시켜 \( 1 ~\mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 기질을 만들고, 기질용액 \( 1 ~\mathrm{ml} \) 와 효소액(Sigma) \( 30 ~\mathrm{unit} / 0.1 ~\mathrm{ml} \) 를 혼합하고 대조구에는 증류수 \( 0.1 \mathrm{ml} \), 반응구에는 시료 \( 0.1 ~\mathrm{ml} \) 를 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 반응시킨 후 \( 1 \mathrm{N} \mathrm{~NaOH} ~0.1 \mathrm{~ml} \) 를 첨가하여 발색시켰다. Positive control로는 acarbose를 사용하여 실험하였다. 이때 생성된 \(p\)-nitrophenol (PNP)은 ELISA reader (VersaMax Microplate Reader)를 이용하여 \( 400 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 다음의 식으로 저해율을 구하였다.</p><p>저해율 \((\%)\)=[1-(반응구의 p-nitrophenol 생성량/대조구의 p-nitrophenol 생성량) \( ] \times 100 \)</p>
매생이 추출물의 ACE저해 활성은 어떤 방법에 따라 측정하였는가?
Cushman