<h1>재료 및 방법</h1><h2>GABA 생산균주 분리</h2><p>균원시료는 2005년도 동해, 서해와 남해 수산시장에서 제조원이 다른 180 여종의 젓갈과 김치로부터 유산균을 분리하여 실험에 사용하였다. 유산균을 분리하기 위한 선택배지로 Bromocresol purple (BCP)을 함유한 BCP agar (Eiken Chemical Co., Japan) 배지를 사용하였으며, 준비된 시료를 마쇄한 후 평판희석 도말법을 이용하여 BCP agar배지에 도말하였다. 시료를 도말한 배지를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 37시간 배양하면서 균체 주변에 형광색환을 형성하는 균주를 1 차 선별하였다. 1차 선별된 균주들은 다시 MRS broth (Difco Co., U.S.A)에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간 배양하였다. 배양액을 TLC를 이용하여 GABA spot을 확인하였으며, 이들 균주중에서 GABA spot이 크고 진한 균주들을 GABA 생산균주로 최종 선발하였다.</p><h2>GABA 생산균주의 동정</h2><p>GABA 생산균주 AML15의 분류학적 위치를 규명하기 위하여 \( 16 \mathrm{~S} \) ribosomal DNA 영역의 부분염기서열 분석을 실시하였다. 먼저 염기서열분석에 이용할 염색체 DNA를 분리하기 위하여 Malt extract broth (Difco Laboratories, Detroit, U.S.A.)에 균주를 접종하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 일간 배양하였다. 배양된 균체를 수집하여 Yoon 등의 방법으로 DNA를 분리하고 small subunit rDNA 영역을 PCR로 증폭하였다. PCR 증폭에 이용한 primer는 9F [5'-GAGTTTGATCCTGGC TCAG ; positions 9-27 (Escherichia coli 16S rRNA number-ring)]와 1542R [5'-AFAAAFFAFFTFATFATCCAGCC ; 1542-1525]이었다[28]. PCR로 증폭한 단편들은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc., Germany)를 사용하여 정제한 후 ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit (PE Biosystems, U.S.A.)를 사용하여 sequencing 반응을 수행하였고, sequencing 반응에 이용한 primer는 536R [5'-GWA TTACCGCGGCKGCTG ; 536-519]이었으며, 반응결과 생산된 DNA 단편들은 ABI 310 DNA sequencing (Perkin Elmer, New Jersey, U.S.A.)를 이용하여 분석하였다.</p><h2>GABA 생산을 위한 최적 배양 조건 확립</h2><p>분리균주의 배양에는 Lactobacilli MRS broth (Difco Co.) 배지를 사용하였으며, 분리균주의 GABA생산을 위한 배양에는 MRS broth에 monosodium glutamic acid (MSG)를 \(5\%\)(w/v) 첨가하여 사용하였다. GABA 생산에 미치는 초기 \( \mathrm{pH} \)의 영향을 알아보기 위하여 MRS broth에 \(5\%\) (w/v) MSG를 첨가 후 배지의 초기 pH 를 4.0,5.0과 6.0으로 조정하여 실험하였다. 균주의 배양은 배지에 균주를 \( 1 \% \) 접종 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간 동안 정치배양 하였으며, 균주의 생육도는 경시변화에 따라 spectrophotometer를 이용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 O.D.로 촉정하였다. PLP 첨가 유무에 따른 GABA 생산증가 효과는 MRS broth에 MSG를 \(5\%\) (w/v) 첨가한 후 초기 \( \mathrm{pH} \) 를 5.0으로 조정한 다음 PLP를 0,10,50과 \( 100 \mu \mathrm{M} \) 농도로 각각 첨가하여 spectrophotometer를 이용하여 균주의 생육도와 \( \mathrm{pH} \), GABA 함량을 조사하였다.</p><h2>\( \gamma \)-Aminobutyric acid의 분석</h2><p>생성된 GABA 및 glutamic acid는 thin layer chromatography (TLC ; Silica gel \( 60 \mathrm{~F}_{254} \), Merck co.) 검정과 아미노산 분석을 실시하여 확인하였다. GABA 및 glutamic acid의 함량 변화는 배양액을 \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 15 분간 원심분리하여 상등액을 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) membrane (Milipore Co.)로 여과한 후, 상등액을 분석용 시료로 하였다. 배양액에 함유된 GABA의 TLC 검정에 사용한 전개용매는 n-butanol : acetic acid : water \( (5: 2: 2, \mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 를 사용하였고, 발색시약으로 \( 2 \% \) ninhy-drin을 분무하여 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 발색시켜 확인하였다. 아 미노산 분석은 아미노산 분석기를 사용하였다.</p>
시료를 도말한 배지를 어떻게 배양하였나?
\( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 37시간 배양