<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물재료 및 시료제조</h2><p>실험에 사용된 생약은 시중에서 구입하여 동국대학교 한의과대학 본초학교실에서 감별, 확인하였으며 분말로 만들어 사용하였다. 분말로 된 재료 각 \( 100 \mathrm{~g} \)을 methanol \( 300 \mathrm{ml} \)로 가온하에 2시간 추출하고 농축한 다음, 동결건조기로 완전 건조시킨 것을 \( 50 \mathrm{mM} \) Txis-citrate 완충용액에 현탁하여 실험에 사용하였다. 성분분획은 위의 methanol 추출물에 물을 가하고 n-hexane 및 ethylacetate로 각각 순차추출 한 다음, 농축하여 사용하였다. 실험에 사용한 생약의 종류 및 복합제제의 조성은 다음과 같다.</p><p>단일약제 : 향부자(Cyperus rotundus), 석창포(Acorus gramineus), 용안육(Euphoria lomgoli), 백자인(Thuja orientalis), 합환피(Albizzta julibrissin)</p><p>복합약재 : Composite Ⅰ (향부자와 석창포), Composite Ⅱ (백자인과 용안육), Composite Ⅲ (백자인과 합환피)</p><h2>기기 및 시약</h2><p>원심분리기는 Beckman제품을, Harvester는 Brandel M-24R을, 그리고 Liquid Scintillation Counter는 Beckman LS 5801을 사용하여 측정하였다. 방사성 동위원소는 Dupont NEN (Boston, MA, USA)사 제품을, diazepam 및 Ro14-7437은 Roche사 제품을 사용하였다. GABA를 비롯한 기타 시약은 Sigma (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하였으며 Scintiliation cocktail은 Packard사 제품 (Aquasol-2)를 사용하였다. 제작한 각종 조직표본의 단백질 정량을 위하여 bicinchoninic acid 정량 kit을 Pierce사로부터 구입하여 사용하였다.</p><h2>수용체 표본제작</h2><p>Benzodiazepine 수용체 표본제작을 위하여 흰쥐 (웅성, \( 250-300 \mathrm {g} \), Sprague-Dawley계)는 단두 후 희생시켜, 즉시 대뇌 피질조직을 분리하였다. 대뇌 피질조직은 무게를 잰 후 50배 부피의 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-citrate 완충용액 ( \( \mathrm{pH}7.4 \) )에서 균질화하였다. 균질화한 조직은 원심분리기 \( (20,000 \times g\), \(4^{\circ} \mathrm{C}\), Beckman, USA)를 사용하여 20분간 원심분리시킨 후 그 결과 생겨나는 침전물은 다시 50배 부피의 Tris-citrate 완충용액에 재분배시켰다. 이와같은 과정을 3-5번 반복한 후 최종적인 조직침전물을 완충용액에 재분배시키고 사용 전까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p><h2>수용체 결합반응</h2><p>Benzodiazepine 수용체 결합반응을 위한 [ \( \left.{ }^{3} \mathrm{H}\right] \) Ro15-1788 (specific activity=87.0 Ci/mmol) 및 flunitrazepam (specific activity \( =82.0 \mathrm{Ci} / \mathrm{mmol} \) ) 결합반응에서는 각 시험관 당 \( 50 \mu \mathrm{l} \)의 대뇌 피질 조직 (약 \( 0.16 \mathrm{mg} \) 단백에 해당), \( 50 \mu \mathrm{l} \)의 방사성 동위원소와 \( 50 \mu \mathrm{l} \)의 각종 약물 (생약추출물 포함)을 사용하였으며, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-citrate 완충용액을 첨가하여 총 부피를 \( 500 \mu \mathrm{l} \)가 되게 하였다. 모든 assay는 duplicate 혹은 triplicate로 하여 적어도 한 실험을 6회 이상 반복하였다. \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \) Ro15- 1788 결합 반응을 위해서는 혼합물이 든 시험관들을 실온에, \( \left[^{3} \mathrm{H}\right] \) flumitrazepam 결합반응을 위해서는 \( 0-4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 각각 한 시간 방치시킨 후, GF/B 여과지 (Whatman) 상에서 Brandel M-24R을 사용하여 결합분획과 비결합분획을 신속히 분리하였다. 여과지상의 결합분획이 내는 방사성 활성도는 liquid scintillation counter를 사용하여 측정하였다. 제작한 대뇌피질 조직의 단백질 함량은 bicinchoninic acid법을 사용하여 측정하였다.</p><p>Benzodiazepine 수용체에 대한 선택적 길항제인 \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \) Ro15-1788의 결합 반응에서 생약 추출물에 함유되어 있는 benzodiazepine 수용체에 대한 억제성 물질의 총량의 측정은 동일한 조건하에서 이루어진 이미 알고 있는 용량의 diazepam을 사용하여 반응 검사 결과 얻어진 competition 곡선을 비교, 분석하여 계산하였다. Benzodiazepine 수용체를 활성화시키는 생약의 활성도의 총량은 'diazepam equivalent' ( \( \mu \mathrm{g} \) diazepam/ \(\mathrm{g} \) of weight)로 표시하였다.</p><h2>통계분석</h2><p>수용체 결합실험에서 얻어진 결과는 비선형회귀 (nonlinear regression, Graphpad Prism, Graphpad Software,Sandiago, CA, USA)시켜 분석하였으며, 각 군간의 성적변화의 통계학적 유의성 검정은 ANOVA로 분석후 NeumanKeul's multiple comparison test를 사용하거나 Student's t-test를 사용하였다.</p>
실험에 필요한 분말을 어떻게 만들었어?
각 \( 100 \mathrm{~g} \)을 methanol \( 300 \mathrm{ml} \)로 가온하에 2시간 추출하고 농축한 다음, 동결건조기로 완전 건조시킨 것을 \( 50 \mathrm{mM} \) Txis-citrate 완충용액에 현탁