<h1>결과 및 고찰</h1><p>Hep G2와 COS 세포의 CAR 단백질 Western blot Transfection을 하지 않은 Control 상태의 Hep G2와 COS 배양세포에서는 CAR antibody를 사용하여 immunoblot을 시행하였을 때 CAR 단백질의 발현이 거의 나타나지 않았다 (Fig. 1A). 이러한 결과는 콩팥에서는 CAR mRNA의 발현이 일어나지 않는다는 이전의 보고와 일치를 보여주었다. Hep G2 세포에서의 CAR 발현이 뚜렷하지 않는 현상은 주어진 조건 하에서 발현 level이 낮거나 antibody의 sensitivity에 기인되는 것으로 추정된다. mCAR1-GFP (0.5ug)를 transfection하였을 때는 Hep G2 세포에서는 발현이 비교적 약하게 나타났지만, COS 세포에서는 강한 mCAR1-GFP 단백질의 발현을 보였다 (Fig. 1A). GFP antibody를 이용하여 immunoblot을 시행하였을 경우에는 transfection된 COS 세포에서 강한 mCAR1-GFP 단백질의 발현을 나타내었을 뿐만 아니라 transfection된 Hep G2 세포에서도 뚜렷한 단백질의 발현을 관찰할 수 있었다 (Fig. 1B). 따라서 transfection된 CAR plasmid가 주어진 포유동물 배양세포 조건에서 정상적인 단백질의 발현을 할 수 있음을 확인하였다.</p><h2>Hep G2와 COS 세포의 R\(\times\)R 단백질 Western blot</h2><p>CAR 단백질은 세포 핵 내에서 PBRU의 NR과 결합하여 유전자의 발현을 조절하기 위해서는 RXR과 이량체를 형성해야 하기 때문에 RXR의 발현이 일어나야 한다. 따라서 Hep G2와 COS 세포에서 transfection 전후의 RXR 단백질의 발현을 western immunoblot에 의해 조사하였다. Fig. 2에서 보는바와 같이 Hep G2 (Fig. 2A)와 COS (Fig. 2B) 세포 모두에서 endogenous RXR의 발현이 일어남을 알 수 있었을 뿐만 아니라 RXR expression plasmid를 transfection 시켰을 때 두 세포 모두에서 단백질의 발현이 현저하게 증가되었다 (Fig. 2A, B).</p><h2>Dual luciferase Assay - Hep G2와 COS 세포에 대한 CAR의 PBRU Transactivation 비교</h2><p>Constitutive Androstane Receptor (CAR)에 의한 CYP2B의 PBRU 활성효과를 다르게 분화된 세포에서 차이가 일어나는지를 비교하기 위하여 CAR에 의해 매개되는 PBRU 의 transactivation효과를 Hep G2와 COS 세포에서 조사 하였다. 각각의 세포를 CAR expression vector와 단일 copy의 CYP2B1PBRU가 minimal CYP2C1 promotor/ firefly luciferase 보고유전자와 fusion된 reporter plasmid로 cotransfection을 하였다. 이전에 보고된 결과와 일치하게 Hep G2 세포에서는 transfection된 CAR의 발현에 의해 firefly luciferase 보고단백질의 활성이 약 12배 증가하였다 (Fig. 3). CAR 발현유전자 \( 15 \mathrm{ng} \)을 transfection하였을 때 주어진 보고유전자의 양에 대하여 최대반응을 나타내었고 \( 90 \mathrm{ng} \)의 CAR에 대해서도 더 이상 luciferase의 발현이 증가되지 않았다. CYP2B1PBRU enhancer가 제거된 CYP2C1 promotor/firefly luciferase를 보고유전자로 사용하였을 때는 CAR에 의한 luciferase의 활성이 나타나지 않았다. 이러한 결과는 CAR에 의한 transactivation은 PBRU의 염가 sequence에 의존함을 나타낸다고 할 수 있다. RXR expression plasmid를 동시에 transfection시켜도 luciferase 보고유전자의 발현을 더욱 더 증가시키지는 못 하였다 (Data not shown). Hep G2와는 달리, COS 세포에서는 transfection된 CAR의 발현이 firefly luciferase보고단백질의 활성에 영향을 주지 못하였다 (Fig. 3). CAR expression plasmid를 \( 2.5 \mathrm{ng} \sim 90 \mathrm{ng} \)까지 COS 세포에 transfection시켰을 때 control 보고유전자 CYP2C1promotor/firefly luciferase의 활성과 별다른 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 Phenobarbital에 의해 촉진되는 CYP2B 유전자의 발현은 간 조직세포에 대한 특이성을 나타낸다는 이전의 보고와 일치한다. PBRU 염기서열을 포함하는 5'-flanking sequence를 rat CYP2B2에 연결한 다음 transgenic mouse에서 유전자의 발현을 조사한 결과 간세포에서는 Phenobarbital에 의한 발현촉진이 나타났으나 콩팥세포에서는 나타나지 않았다. 또한 콩팥으로부터 추출한 핵단백질이 함유된 in vitro transcription system에서도 CYP2B2 Promotor Construct의 전사활성이 Phenobarbital에 의해 유도되지 못했다. 이러한 결과들은 분화된 세포의 종류에 따라서 constitutive androstane receptor (CAR)의 CYP2BPBRU의 활성효과가 다르게 나타날 수 있음을 제시 할 뿐만 아니라, 간세포에서는 Phenobarbital에 의한 PBRU의 활성유도를 매개하는 endogenous 인자들 중 CAR와 RXR과는 다른 전사조절 인자들이 필요로 하며 이러한 인자들의 발현이 콩팥 세포에서는 다르게 존재함을 시사한다.</p>
CAR antibody를 사용하여 immunoblot을 시행하였을 때 무엇이 거의 나타나지 않았나?
CAR 단백질의 발현