<h3>RNA 분리 및 확인</h3><p>심장근으로 부터 RNA를 분리하기 위해 조직을 떼어 100 \( \mathrm{mg} \)으로 무게를 축정한 후 액화질소에 넣은 후 RNAzol B \( 500 \mu \mathrm{l} \)가 든 \( 35 \mathrm{mm} \) 접시에 조직을 넣어 잘게 분쇄시킨다. 그 다음 homozenizer에 RNAzol B \( 1.8 \mathrm{ml} \) 을 넣고 조직을 마쇄한 후 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 튜브에 \( 1 \mathrm{ml} \)씩 분주한다. 각 튜브에 \( 100 \mu l \) 의 chloroform을 넣고 잘 흔들어 주었다. 그리고 5분동안 얼음에 정치시켜 단백질을 제거하였다. 샘플을 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 15분 동안 원심 분리하여 RNA를 분리한 후 RNA가 포함된 층을 새 튜브에 옮겨 isopropanol를 첨가한 다음 얼음에서 15분 동안 정치시켰다. 침전된 RNA를 수집하기 위해 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), \( 15000 \mathrm{rpm} \) 에서 15분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 \( 75 \% \)에탄올로 침전된 RNA를 세척하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(10,000 \mathrm{rpm} \)에서 8분 동안 원심 분리하였다. 에탄올을 제거한 후 진공 상태에서 10분 동안 RNA를 건조시켰다. 분리된 RNA는 DEPC 처리된 물로 녹여서 각각 \( 260 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 측정을 위하여 정량하였다. 정량된 RNA을 확인하기 위하여 \( 0.5 \mu \mathrm{g} \)의 RNA를 \( 1 \% \)의 agarose gel에 전기영동한 후 18s와 28s의 rRNA 밴드를 확인하였다.</p><h3>역전사 효소반응</h3><p>분리된 RNA \( 1 \mu \mathrm{g} \)을 DEPC 처리된 증류수와 oligo(dT)primer를 첨가하여 RNA 혼합액으로 제조하였다. RNA 혼합액을 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분 동안 Poly-A annealing하였다. 증폭을 위한 주형으로 사용될 cDNA는 \( 1 \times \) first strand buffer[\(50 \mathrm{mM}\) Tris-\(\mathrm{HCL}\) (\(\mathrm{pH}8.3\)), \( 75 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}\), \(3 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_2 \) ), \( 10 \mathrm{mM} \) di-thiosphate dNTP)]와 Super Script Ⅱ RNaseH-Reverse Transcriptase \(200 \mathrm{units}\)를 넣어 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 50분 동안 합성하였고 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 동안 열처리하여 반응을 종결하였다. eNOS와 ET-1을 조사하기 위해 RT product와 함께 eNOS mRNA(5' primer : 669-688 base, 3' primer : 829-848 base, AJ 249546), ET-1 mRNA(5'primer : 224-243 base, 3' primer : 667-710 base, NM_ 01254)를 활용하였다. PCR 기계 (Flexigene, Techne, USA) 에서 28 cycles로 eNOS mRNA를 위해서는 \( 94^{\circ} \mathrm{C}\) 3분(predenaturation), \( 94^{\circ} \mathrm{C}\) 15초(denatura-tion), \( 53^{\circ} \mathrm{C}\) 15초(annealing), \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 30초(elongation), \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 7분(post- elongation) 간 합성하였다. ET-1 mRNA를 위해서는 \( 94^{\circ} \mathrm{C}\) 3분(predenaturation), \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 30초(denaturation), \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 15초(annealing), \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 45초(elongation), \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 7분(post-elongation)간 합성하였다. 동일한 양의 전체 RNA를 확인하기 위하여 B-actin primer(sense: 5'-GAA-GAT-CCT-GAC-CGA-GCG-TG-3'; anti-sense: 5'-CGT-ACT-CCT-GCT-TGC- TGA-TCC-3') 를 사용하였다.</p>
RNA를 무엇으로부터 분리하였나?
심장근