<h1>결과 및 고찰</h1><h2>EmeA의 hydropathy 패턴 분석</h2><p>클로닝된 emeA 유전자 \( 1,179 \mathrm{bp} \) 의 염기서열을 결정한 후, GENETIX-WIN (Ver. 5.0) software와 web-based 프로그램 SOSUI (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)를 이용하여 아미노산 서열을 추정하였다. EmeA는 393개의 아미노산으로 이루어져 있었으며, 추정된 아미노산 서열에 대한 hydro-pathy analysis를 실시한 결과, EmeA는 고도의 소수성 영역인 12개의 막관통 영역(transmembrane domains, TMD)을 가지고 있었으며, 친수성 영역인 아미노 말단 및 카르복시 말단은 세포막 안쪽으로 위치하고 있었다. 이는 EmeA가 속해있는 Major Facilitate Super (MFS) Family의 전형적인 특징과 일치하였다.</p><h2>EmeA의 homologues</h2><p>추정된 EmeA의 아미노산 서열을 바탕으로 NCBI-BLAST2 (http://www.ebi.ac.uk/blastall/)의 데이터 베이스상의 다른 단백질들의 서열과 비교 분석한 결과를 table 1에 나타내었다. EmeA는 장구균 중에서 genome project가 완성된 E. faecalis V583 균주의 EF1078 locus의 putative multi-drug efflux pump 단백질과 그 유사도가 가장 높았고 (\( 97\%\)), 젖산균 Lactococcus lactis의 Blt, 탄저균 Bacillus anthracis의 Bit, 고초균 Bacillus subtilis의 Bmr2와 Bmr1, 포도상구균 Staphylococcus aureus의 NorA와 각각 \( 89,65,66,64 \) 및\( 61\%\) 의 높은 유사도를 보였다. 그 외에도 Enterococcus hirae의 NapC와 \( 46 \% \), Salmonella typhi의 TetA와 \( 45 \% \), 그리고 Escherichia coli의 TetA와 \( 45 \% \) 의 유사도를 나타내었다. 이상 에서 알 수 있듯이, EmeA는 포도상구균, 고초균과 같은 그람양성균 유래의 다제 내성 폄프단백질 뿐만 아니라, 살모넬라나 대장균 등의 그람음성균 유래의 단일약제 펌프단백질과도 높은 유사도를 보였다. 특히 메치실린 내성 포도상구균 (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus; MRSA)과 같이 병원 내 감염 및 다제 내성으로 크게 문제가 되고 있는 병원성 균주나, 생물무기로도 사용되고 있는 B. anthracis와 같은 탄저균에도 EmeA와 같은 유사한 단백질이 존재하였다.</p><p>Table 1에 나타낸 EmeA의 유사 단백질들은 모두 EmeA와 같은 MFS family에 속하는 단백질들로 분류되어지며, 이들 서열 모두에 대해 multiple sequence analysis를 실시한 결과 12 개의 막관통 서열 부분에서 주로 일치하는 결과를 얻었으며, MFS family의 특징 중의 하나인 보존된 서열인 mo-tif A, B, C, D2 및 G가 잘 보존되어 있음을 확인하였다.</p><p>이들 유사 단백질들의 아미노산 서열과 EmeA의 아미노산 서열을 비교한 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 아미노산 서열들은 CLUSTAL W 프로그램과 GENETLX-WIN (Ver. 5.0) software를 사용하여 비교하였다. Jonas 등은 EmeA가 S. aureus의 NorA homologue라고 보고 하였다. 하지만 본 연구에서, Table 1의 상동성 수치와 Fig. 2의 dendrogram을 비교 분석하였을 때, EmeA는 E. fae-calis의 EF1078과 가장 유사하며, 다른 종에서는 L. lactis의 Blt와 가장 유사하다는 것을 알 수 있었다.</p><h2>Ethidium bromide와 acriflavine 약제의 세포 내 축적</h2><p>EmeA가 발현된 대장균 KAM32 균주는 대장균의 주요 다제배출 펌프단백질인 acrB와 ydhE유전자를 인위적으로 결손시켜, 각종 항생제와 수많은 약제에 대해 초감수성을 보이는 균주로서, 항생제 내성 유전자를 클로닝하는 목적에 매우 적합한 숙주이다. 한편, ethidium bromide (EtBr)와 acri-flavine은 다제배출 펌프단백질의 활성을 측정하는데 자주 사용되는 형광약제이다. EmeA가 발현된 대장균 KAM32 균주는 KAM32 균주 자체에 비해 약제감수성 측정결과 ethidium bromide에서 2배, acriflavine에서 4 배의 MIC 증가현 상을 나타내었다. 이 MIC 증가현상이 EmeA에 의한 약제의 배출에 의한 것임을 알아보기 위해 약제축적 측정실험을 실시하였다. EmeA가 이 약제들에 대한 배출활성을 가진 다면, 약제들을 첨가하였을 때 대조군 KAM32에 비해 세포 내 약제 축적량이 적을 것이다. EtBr과 acriflavine을 이용하여 약제축적 실험의 결과를 Fig. 3에 나타내었다. Ethidium bromide는 이중나선 DNA에 결합하면 형광의 증가를 나타낸다. 반면에, acriflavine은 DNA에 결합하면 형광의 감소 (quenching)를 나타낸다. 그 결과 Fig. 3A에서 보는 바와 같이, EmeA를 발현하는 균주는 KAM32 균주 자체에 비해 EtBr을 첨가하였을 때 형광의 정도가 적은 것을 알 수 있다. 이는 EmeA 발현균주는 EtBr을 지속적으로 배출하여 대조군에 비해 세포 내의 이중나선 DNA에 결합된 EtBr의 양이 적은 것을 나타낸다. 그 다음으로, proton conductor로CCCP를 첨가 하였을 때, ethidium bromide 형광의 급격한 종가가 관찰되었다. 반면에, KAM32 균주의 경우에는 CCCP첨가 후에 완만한 형광의 증가가 관찰되었다. Proton conductor인 CCCP는 EmeA가 에너지원으로 사용하는 세포막 내외의 수 소이온 농도구배(proton-gradient)를 없애는 역할을 하며, 이 는 EmeA의 탈에너지화를 의미한다. 그림에서 두 균주의 형광증가 곡선이 CCCP첨가 후에 시간의 경과에 따라 가까워지는 것은, 탈에너지 조건에서는 EmeA의 활성이 저해되어 두 균주의 세포내 ethidium bromide 축적 정도가 비슷해진다는 것을 의미한다. 여기서 CCCP를 첨가하기 전에는 KAM32/emeA 균주의 ethidium bromide 축적이 KAM32 균주 자체의 그것보다 훨씬 낮았다는 것에 주목하여야 한다. 이는 KAM32/emeA 균주가 수소이온 농도구배률 에너지로 사용하는 에너지 의존적인 ethidium bromide 배출 활성을 가지고 있다는 것을 의미한다.</p><p>Fig. 3B의 acriflavine의 경우에는 DNA에 결합할 경우 형광의 감소를 나타낸다. 세포현탁액에 acriflavine만 첨가하였을 경우에 EmeA 발현균주는 KAM32 균주에 비해 높은 형광강도를 보여 세포 내에 축적되는 acriflavine의 양이 낮음을 알 수 있다. CCCP 첨가에 의해 탈에너지화 된 후에는 두 실험군의 세포 내 acriflavine 축적양이 거의 같아지는 결과를 얻었다.</p><p>Fig. 3의 약제축적 실험결과는, EmeA가 세포막 내외의 수소이온 농도구배률 에너지원으로 사용하여 ethidium bro-mide와 acriflavine을 비롯한 약제들의 세포내 축적을 방지하는 역할을 한다는 것을 증명한다.</p>
NCBI-BLAST2의 데이터 베이스상의 단백질들의 순서와 비교를 탐구한 결과를 어디에 나타냈어?
table 1