<h2>DEAE-sephadex A-50 ion exchange column chro-matography</h2><p>DEAE-sephadex A-50 를 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) (\( \mathrm{pH} 7.5\) )로 충분히 평형화 시킨 후 투석한 저해물질을 column (\(2~ \mathrm{by}~ 20 \mathrm{cm} \) )에 흡착시키고 \( 0-0.5 \mathrm{~M} \mathrm{~NaCl} \) 농도구배로 흡착된 저해물질을 용출시켰다. 본 과정에서는 용출시 \( 36 \mathrm{ml} / \mathrm{hr} \)의 속도로 한 시험관 당 \( 4 \mathrm{ml} \)씩 분획하였다.</p><h2>Sephadex G-200 gel filtration column chromatography</h2><p>\( 0.2 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl} \) 이 함유된 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}\) (\(\mathrm{pH} 7.5\) )로 충분히 평형화시키고 DEAE sephadex A-50과정에서 나온 활성부위만을 sephadex G-200 column (\(1.6~ \mathrm{by}~ 89 \mathrm{~cm} \))에 첨가하여 gel 여과를 행하였다. 전개 액으로는 \( 0.2 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl} \) 이 함유된 Tris- \( \mathrm{HCl}\) (\(\mathrm{pH} 7.5\))완충액을 사용하였으며 용출시 속도는 \( 6 \mathrm{ml} / \mathrm{hr} \)로 한 시험관 당 \( 2 \mathrm{ml} \)씩 분획하였다.</p><h2>Sephadex G-50 gel filtration column chromatography</h2><p>\( 0.2 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl} \)이 함유된 \( 10 \mathrm{mM} \) phosphate 완충액 (\( \mathrm{pH} 7.5 \))으로 충분히 평형화 시키고 Sephadex G-200 과정에서 활성 부위만을 Sephadex G-50 column (\(1.6 ~\mathrm{by}~ 89 \mathrm{~cm} \) )에 첨가하여 gel 여과를 행하였다. 전개 액으로는 \( 0.2 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl} \) 이 함유된 Tris- \( \mathrm{HCl}\) \((\mathrm{pH} 7.5\) )완충액을 사용하였으며 용출시 속도는 \(6 \mathrm{ml} / \mathrm{hr} \) 로 한 시험관 당 \( 2 \mathrm{ml} \) 씩 분획하였다.</p><h2>SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis</h2><p>전기영동은 Leammli 등의 방법에 따라 각기 \( 0.1 \%\) SDS 가 포함된 \( 12 \% \) polyacrylamide (Sigma Co.)농도의 separat-ing gel과 \(5\%\) polyacrylamide 농도의 stacking gel을 사용하여 행하였다. 전기영동 후 \( 1 \% \) coomassie brilliant blue gel 염색에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분 정도 염색하고 다시 탈색 액으로 gel을 탈색시켰다. 이 과정을 통하여 나온 band의 분자량을 logarithmic graph에 의한 Rf값으로 계산하여 측정하였다. 이때 marker로는 mid-range perfect protein marker ( \( 150\mathrm{kDa}\), \(100 \mathrm{kDa}\), \(75 \mathrm{kDa}\), \(50 \mathrm{kDa}\), \(35 \mathrm{kDa}\), \(25 \mathrm{kDa}\), \(15 \mathrm{kDa} \) : Novagen)를 사용하였다.</p>
Sephadex G-200 gel filtration column chromatography의 구체적인 방법이 뭐야?
\( 0.2 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl} \) 이 함유된 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}\) (\(\mathrm{pH} 7.5\) )로 충분히 평형화시키고 DEAE sephadex A-50과정에서 나온 활성부위만을 sephadex G-200 column (\(1.6~ \mathrm{by}~ 89 \mathrm{~cm} \))에 첨가하여 gel 여과를 행하였다. 전개 액으로는 \( 0.2 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl} \) 이 함유된 Tris- \( \mathrm{HCl}\) (\(\mathrm{pH} 7.5\))완충액을 사용하였으며 용출시 속도는 \( 6 \mathrm{ml} / \mathrm{hr} \)로 한 시험관 당 \( 2 \mathrm{ml} \)씩 분획하였다.