<h1>결과 및 고찰</h1><h2>파라치온 분해균주의 분리. 동정 및 생리 · 생화학적 특성</h2><p>대전 근교의 농약으로 오염된 12곳의 토양에서 파라치온을 단일 탄소원으로 이용할 수 있는 81 균주를 순수 분리하였고, 분리된 균주 중 균체생육 및 분해능이 우수한 12 균주를 1차 선별하였으며 그 중 파라치온 분해능이 가장 우수한 1 균주를 최종 선별하여 본 실험에 이용하였다.<p>최종선별된 균주는 그람 음성 간균의 운동성이 없는 호기성 세균으로 oxidase에만 양성반응을 나타냈을 뿐, catalase를 비롯한 methyl red, Voges-Proskauer, urease, nitrate 환원성에 음성반응을 나타냈고, starch와 esculine 가수분해, gelatin액화, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{~S} \) 와 indole의 생성, 그리고 citrate의 이용성도 음성을 나타내었다. 또 당 이용능을 조사한 결과 선별된 균주는 glucose와 rhamnose, 그리고 maltose를 잘 이용하였으나, arabinose, ructose, ribose, cellobiose는 약하게 이용하였고, sorbose는 전혀 이용하지 못하는 것으로 확인되었다. 항생제에 관한 내성은 ampicillin은 \( 80 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)까지, spectinomycin은 \( 25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), 그리고 mitomycin C는 \( 2 \mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{ml} \) 까지 내성을 나타냈으나 chloramphenicol과 kanamycin에 대한 내성은 없는 것으로 확인되었다. 중금속에 대한 내성 시험 결과, \( \mathrm{BaCl}_{2}, \mathrm{LiCl}, \mathrm{MnSO}_{4} \) 그리고 \( \mathrm{RbNO}_{3} \) 은 각각 \( 11.83 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}, 6.4 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}, 11 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}, 1.6 \) \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)까지의 높은 농도에서도 선별균주의 생장이 가능하였고, \( \mathrm{Pb}\left(\mathrm{NO}_{3}\right)_{2} 800 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}, \mathrm{CuSO}_{4} 250 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}, \mathrm{NiCl}_{2} 200 \mu \mathrm{g} \) \( / \mathrm{ml}, \mathrm{CoCl}_{2} 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml}, \mathrm{ZnSO}_{4} 60 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}, \mathrm{CdCl}_{2} 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), \( \mathrm{HgCl}_{2} 3 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 까지 내성을 나타내, 조사된 모든 중금속에 대해 내성을 나타내어 토양에서 분리된 제초제 3-chlorobenzoic acid를 분해하는 미생물과 같이 농약으로 오염된 지역에서 분리된 미생물들이 비교적 높은 중금속 내성이 있음을 알 수 있었다.</p><p>선별균주의 정확한 동정을 위해 16SrDNA 염기서열 분석 을 실시한 결과 Pseudomonas rhodesiae와 \( 98 \% \) 일치하고, 생리, 생화학적인 조사결과를 종합한 결과로도 이 종과 일치해, 최종 선별된 균주를 P. rhodsiae H5로 명명하였다.</p><p>파라치온과 그 관련 화합물의 분해에 여러 종류의 미생물이 관련된다는 것은 이미 여러 논문을 통해서 보고되었다. 그중 Flavobacterium sp. strain ATCC 27551 와 Pseu-domonas diminuta MG 등은 파라치온을 단일 탄소원으로 이용하여 성장할 수 있고, 또 Bacillus, Ar-throbacter, Pseudomonas, Burkholderia, Moraxella 등은 p-nitrophenol을 단일 탄소원 및 에너지원으로 이용할 수 있는 대표적인 미생물로 보고 되었다. 본 실험에서 분리된 균주 P. rhodesiae H5도 파라치온과 p-nitrophrnol를 유일한 탄소원 및 에너지원으로 이용할 수 있었으며, 이는 Munnecke 에서 밝혀진 파라치온 대사 경로와 일치한 결과로, 본 실험에서 최종선별된 P. rhodesiae H5도 이 대사 경로를 이용하는 것으로 추정된다.</p><h2>파라치온 hydrolase 활성 및 파라치온 분해능</h2><p>P. rhodesiae H5의 파라치온 hydrolase 활성을 영양 복합배지에서 균체 생육과 함께 주기적으로 측정해본 결과, 파라치온 hydorlase는 intracellular 효소이며, 이 효소는 정지기인 배양 24시간에서 최대 효소 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.</p><p>Pseudomonas rhodesiae H5를 \( 150 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 파라치온이 포함 되어 있는 최소 배지에서 배양하면서 일정시간 간격으로 배양 상등액을 추출하여 spectrophotometer 상에서 \( 350 \mathrm{~nm} \)에서 \( 450 \mathrm{~nm} \)까지 scanning하며 파라치온의 분해능을 측정한 결과, p-nitrophenol 량은 접종후 30 분 후에 최대 값을 나타 냈다가 다시 감소하여 배양 6시간 이후에는 극히 일부의 p-nitrophenol 만 검출되었다. 이는 파라치온이 유일한 탄소원으로 주어졌을 때 P. rhodesiae H5에 의해 파라치온이 분해 되어 생성된 p-nitrophenol과 배양액을 \( 2.5 \mathrm{N} \mathrm{~NaOH} \)로 처리해 파라치온이 간접적으로 가수분해 되어 p-nitrophenol가 유리된 것이 합쳐져 배양 30 분후에 일시적으로 p-nitrophenol 량이 증가 되었다가, Figure 1 의 대사 경로를 이용해 p-nitrophenol은 ortho-ring cleavage를 거쳐 중심대사로 들어가므로, 분리된 균주에서 p-nitrophenol은 생성과 분해가 같이 진행됨을 추측할 수 있었다. 그리고 p-nitrophenol\( (12.5 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml}) \) 를 유일한 단일 탄소원으로 주어졌을 때는 3시간 후에 완전히 분해되어 Pseudomonas sp. 가 \( 12.5 \)\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 \( \rho \)-nitrophenol을 18시간만에 분해하는 것보다 6 배나 빠른 분해 속도를 나타내, 본 실험에서 분리, 선별된 P.rhodesiae H5의 p-nitrophenol 분해능이 매우 우수한 균주임을 알수 있었다.</p><h2>선별 균주의 최적 온도와 \( \mathrm{pH} \)</h2><p>Pseudomonas rhodesiae H5 의 생장과 분해활성에 대한 온도의 영향을 알아보기 위해서 단일 탄소원으로 파라치온이 150 \( \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)이 함유된 Bushnell-Hass 최소배지와 영양배지에 일정량의 균을 접종한 후, \( 20^{\circ} \mathrm{C}, 30^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 각각 배양하면서 균체량, 파라치온 분해능과 파라치온 hydrolase 활성을 측정하였다. 고 결과 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서는 생장을 하지 못하였고 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)의 균체 생육은 거의 비슷한 양상으로 나타났으나, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서의 파라치온 hydrolase 최대활성은 배양 24시간 후였지만 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)의 경우에는 그보다 늦은 30시간에서 최대활성을 나타냈다(data not shown).</p><p>또 파라치온의 분해능을 spectrophotometer로 측정한 결과 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양한 경우 파라치온이 p-nitrophenol까지 분해되는데 걸리는 시간이 6시간이었지만, \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)의 경우에는 8시간이 소요됨을 확인하였다.</p><p>또한 \( \mathrm{pH} \) 가 파라치온 분해에 미치는 영향을 조사하기 위하여 단일 탄소원으로 파라치온 \( 150 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)이 첨가된 Bushnell-Hass 최소배지의 초기 \( \mathrm{pH} \) 를 \( \mathrm{pH} ~5, \mathrm{pH} ~6, \mathrm{pH} ~7, \mathrm{pH} ~8, \mathrm{pH} ~9\) 및 \( \mathrm{pH} ~10 \)으로 각각 조정한 후 균을 접종하여 균체량을 조사한 결과, \( \mathrm{pH} ~7 \)에서 배양 12시간 이후에 균체량이 \( 10^{8} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 까지 나타났고, \( \mathrm{pH} ~6\)과 \( \mathrm{pH} ~ 8 \) 은 배양 12시간 이후에 약 \( 10^{7} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \)까지의 균체량을 그리고 \( \mathrm{pH} ~5 \) 와 \( \mathrm{pH} ~9 \)과 \( \mathrm{pH} ~10 \) 에서는 초기 접종량 보다 배양 후에 균체량이 적어 성장하지 못함을 확인하였다. 따라서 본 실험에서 분리한 P. rhodesiae H5의 최대 성장 온도와 \( \mathrm{pH} \) 는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( \mathrm{pH} \) 임을 확 인하였다.</p><p>본 연구는 농약에 오염되어 있는 토양으로부터 파라치온을 분해하는 균주를 선별하여 특성을 조사한 결과이며 이 균주에서 파라치온 hydrolase 유전자를 탐색하고 재조합하여 과발현되는 균주개량이 진행되어야 할 것이다.</p>
최종선별된 균주가 양성반응을 보인 것은 뭐야?
oxidase