<h1>결과 및 고찰</h1><h2>Ferritin 유전자 분리 및 형질전환용 벡터구축</h2><p>콩에서 ferritin 유전자를 분리하기 위해 RT-PCR 분석을 실시하여 3개의 증폭된 밴드를 얻었고, 이들 클론을 pUC119 벡터에 클로닝한 후 염기서열을 조사한 결과 \( 670 \mathrm{bp}\), \(1,070 \mathrm{bp}\), \(861 \mathrm{bp} \) 였으며, 이들 각각의 유전자간 상동성은 \( 97 \% \) 로 매우 높았다(data not shown).</p><p>이중 가장 큰 클론인 rF2 \( 1,070 \mathrm{bp} \) 의 염기서열을 분석한 결과 full-length의 ferritin 유전자를 얻을 수 있었다. 유전자의 발현이 시작되는 개시코돈(ATG)과 유전자 발현이 끝나는 종료코돈(TAG) 및 mRNA 뒤에 붙어서 유전자의 끝을 알리는 poly ( \( \mathrm{A}^{+} \)) tail로 구성되어 있어서 분리한 ferritin 유전자는 ferritin 단백질을 암호화하는 뉴 클레오티드 서열인 \( 750 \mathrm{bp} \) 의 ORF(Open Reading Frame)를 포함하는 완전한 유전자임을 확인할 수 있었다.</p><p>Globulin, glutelin, zein 단백질에서 분리된 \( 980 \mathrm{bp} \) 크기의 globulin 프로모터와 \( 1.3 \mathrm{~kb} \) 크기의 glutelin 프로모터(Wu et al. 1998), 그리고, \( 933 \mathrm{bp} \) 크기의 zein 프로모터 (Z4, Schernthaner et al. 1988)와 콩으로부터 분리한 ferritin 유전자를 sense(S) 또는 anti-sense(R)로 결합하고 pMJ21 벡터(Jang et al. 2003)에 삽입하여 pGBF-S12, pGBF-R4, pGTF-S12, pZ4F-S12, pZ4F-R4를 제작하였다.</p><p>형질전환용 재조합 유전자를 작성할 때에 벼가 아닌 콩 유래의 ferritin 유전자를 사용한 것은 형질전환 후대에 발생할 수 있는 유전자발현 저하의 문제(Finnegan et al. 1994)를 최소화하려는 것이고, 종자내에서 특이적으로 발현하는 프로모터를 운반체에 사용함으로써 ferritin 단백질을 종자 내에서 집중적으로 발현시킬 수 있는 종자 특이 프로모터의 기능을 사용하였다. 또한, MAR를 사용하여 염색체상의 도입부위에 관계없이, 혹은 도입 유전자의 수에 비례해서 유전자 발현을 안정적으로 유도(Van et al. 1996; Miynarova et al. 1996)하고자 하였다.</p><h2>Agrobacterium 을 이용한 Ferritin 유전자의 형질전환</h2><p>동안벼와 화신벼 종자를 치상하여 유기한 캘러스를 이용하여 종자유래의 globulin, glutelin 및 zein 프로모터와 ferritin 유전자를 삽입한 pGBF-S12, pGBF-R4, pGTF-S12, pZ4F-S12, pZ4F-R4 재조합 DNA를 Agrobacterium tumefaciens, LBA4404 균주를 이용하여 형질전환시킨 후 항생제를 함유한 배지에서 선발하였다. 형질전환된 캘러스를 phosphinotricin 이 포함된 MS 배지 상에 치상하여 배양 3주 후부터 embryogenic 캘러스의 왕성한 생장을 보였고, 5주 후부터 캘러스에 녹색의 반점이 보이기 시작하였으며, 이들 캘러스를 MS기본배지에 옮겨 재분화를 유도하여 ferritin 유전자가 도입된 형질전환 재분화 식물체를 획득하였다.</p><p>2차 선발배지에서 phosphinotricin 항생제에 저항성인 캘러스를 재분화 배지에 이식하였을 때의 식물체 재분화율은 Table 1 과 같다. Globulin 프로모터를 사용한 경우 ferritin 유전자를 sense로 삽입한 pGBF-S12에서는 동안벼에서 1차배지에 치상한 60 개의 종자 중 12 개의 캘러스에서 식물체가 재분화되어 \( 20.0 \% \) 의 재분화율을 보였으며 화신녀는 2 개의 식물체가 재분화되어 매우 낮은 재분화율을 보였다. Ferritin 유전자를 antisense로 삽입한 pGBF-R4에서는 동안벼에서 1차배지에 치상한 60개의 종자 중에서 11개가 식물체로 재분화하여 \( 18.3 \% \) 의 재분화율을 나타내었고 화신벼에서는 6개의 재분화 식물체를 얻을 수 있었다.</p><p>Glutelin 프로모터의 경우 동안벼와 화신벼에서 각각 9 개와 7 개의 재분화 식물체를 얻어 \( 15.0 \% \) 와 \( 11.7 \% \) 의 재분화율을 보였다.</p><p>Zein 프로모터를 사용한 경우 ferritin 유전자를 sense로 삽입한 pZ4F-S12에서는 동안벼, 화신벼에서 각각 9,3 개의 재분화 식물체를 얻어 \( 15.0 \%\), \(5.0 \% \) 의 재분화율을 나타내었다. Ferritin 유전자를 anti-sense로 삽입한 pZ4F-R4에서는 동안벼에서 60개의 종자 중에서 13개가 재분화하여 \( 21.7 \% \) 의 재분화율로서 가장 높은 비율을 보였다. 전체 프로모터 별로는 모는 운반체의 경우에 동안벼에서 54개체가 재분화되어 재분화율이 가장 높얐다.</p><p>형질전환 식물체와 wild type의 식물체를 pot에 이식한 후 시판되고 있는 비선택성 제초제인 바스타를 \( 3 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 의 농도로 살포하고 2주 후에 관찰한 걸과는 Fig. 2-II와 같다. Wild type의 화신벼의 잎은 살포 1주후부터 잎이 chlorosis가 일어나 고사하였으나, 형질전환 식물체는 외형적으로 아무런 피해를 받지 않고 정상적으로 생육이 가능하였다. 이러한 결과는 형질전환체에서 Bar 유전자가 정상적으로 발현되는 것을 보여주는 것이며 ferritin 유전자가 형질전환 벼에 도입되었음을 나타내고 있는 것이다.</p>
실험과정 중에서 RT-PCR 분석은 어디에서 ferritin 유전자를 뽑아내기 위해 수행한 과정인가?
콩