<h1>재료 및 방법</h1><h2>시료의 여과 및 농축</h2><p>지표수 \( 200 \mathrm{L} \)를 1-MDS filter (Cuno사, USA)를 이용하여 흡착 여과를 실시하였다. 필터에 부착된 바이러스를 \( 500 \mathrm{ml} \)의 \( 1.5 \% \) beef extract \( / 0.05 \mathrm{M}\) glycine (\( \mathrm{pH} \) 9 4) 용출액으로 약 10분 동안 가압 용출을 실시하였다.</p><h2>시료의 재농축</h2><p>앞서 용출된 시료를 유기 응집법(organic flocculation)을 사용하여 재농축을 실시하였다. 용출액에 \( 1 \mathrm{N} \) \( \mathrm{HCl} \)을 천천히 떨어뜨려 \( \mathrm{pH} 3.5 \pm 0.1 \)로 만들고, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 천천히 교반하였다. 이 후 \( 4000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \), 15분간 원심 분리하여 침전물을 수거하였다. 침전물을 \( 0.15 \mathrm{M} \) sodium phosphate ( \( \mathrm{pH} \) 9.0-9.5) 혹은 PBS (phosphate buffered saline, \( \mathrm{pH} \) 9.0-9.5) \( 10 \mathrm{~ml} \)에 녹인 후 \( 8000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C}, \) 10분간 원심 분리하여 상등액만을 취하고 \( 1 \mathrm{N}\) \(\mathrm{HCl} \) 로 \( \mathrm{pH} \) 7.0-7.5로 맞추었다. 농축된 시료에 바이러스 검출을 저해하는 물질들이 포함되어 있을 수 있으므로 이를 제거하기 위하여 농축된 시료를 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) membrane filter로 여과하거나 동량의 chloroform을 처리하여 박테리아, 불순물 등을 제거하였다.</p><h2>세포배양</h2><p>바이러스 감염 24시간 전에 원숭이 신장세포(BGM cell)를 \( 5 \times 10^{5} \mathrm{cells} / 60 \mathrm{~mm} \) dish이 되도록 분주하여 \( 10 \% \) FBS/DMEM 배지로 배양하였다. 최종 농축액의 일정량 \( (400 \mu \ell / 60 \mathrm{~mm} \))을 세포에 감염시켰다. 1시간 동안 감염시킨 뒤, \( 10 \% \) FBS/DMEM 배지를 첨가하여 바이러스 감염효과 (Cytopathic effect, CPE)가 나타날 때까지 5-7일간 배양하였다(1차 배양). 1차 배양액을 수거하여, 2차 및 3차 감염을 통하여 세포 병변 현상을 관찰하여 감염성이 있는 바이러스 존재 유무를 진단하였다.</p><h2>RT-PCR</h2><p>바이러스 검출을 위한 프라이머는 polioviruses 및 coxac-kieviruses 등의 장바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 5' UTR 부분의 염기서열을 사용하였다. \( 200\mu \ell \)의 최종 농축시료와 1, 2, 3차 세포배양액 각각 \( 200\mu \ell \)씩을 \( 500\mu \ell \)의 GT (\( 5\mathrm{M}\) guanidium thiocyanate, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \( 25 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 8\%\) 2-mercaptoethanol)와 섞은 후, phenol/ chloroform법으로 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 \(70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 가열하여 변성시키고, 미리 준비한 cDNA 합성혼합물(5x 반응 완충액, \( 3 \mathrm{~mM} \) dNTP, \( 150 \mathrm{~pmol} \) reverse primer (PEN-R), \( 250 \mathrm{U}\) M-MLV 역전사효소(Promega사)를 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간동안 합성하였다. \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 열을 가하여 반응을 종결시킨 다음 PCR을 위한 주형으로 사용하였다. PCR 반응액은 총 \( 100 \mu \ell \) [CDNA, 10x 반응 완충액, \( 1.5 \mathrm{~mM} ~ \mathrm{MgCl}_{2} \), PEN-F, PEN-R 각각 \( 50 \mathrm{pmol} / \mu \ell \), \( 5 \mathrm{U} / \mu \ell \) Taq polymerase (Takara사), \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)] 이 되도록 하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 56^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초 동안 40번을 반복시켜 PCR 산물을 얻었다. PCR 반응 결과 생겨난 산물을 \( 1.2 \% \) agarose gel에 전기영동하여 \( 394 \mathrm{~bp} \)의 PCR 산물의 형성 유무를 확인하였다.</p><h2>바이러스의 동정</h2><p>위에서 얻은 PCR 산물을 pT7-blue T Vector (Takara)사에 클로닝하고 plasmid DNA를 추출하여 DNA autose-quencer ABI PRISM 3700 DNA Analyzer를 이용하여 염기 서열을 결정하였다. 염기서열의 분석은 GenBank에 의뢰하여 기존에 알려진 바이러스들의 염기서열과 유사성을 비교하였다.</p>
용출액에 \( 1 \mathrm{N} \) \( \mathrm{HCl} \)을 천천히 떨어뜨린 후 다음 과정은 뭐야?
\( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 천천히 교반