<h1>재료 및 방법</h1><h2>시약 및 기기.</h2><p>본 연구에 사용된 사이퍼메트린(cypermethrin) 시약은 중국 Beijing Luckystar사로부터 제공받아 사용하였다. 분석에 사용된 high performance liquid chromatography (HPLC)는 Waters (Micromass UK Ltd., UK)의 제품으로 \(1525\) binarypump, \(2489\) UV/Visible detector와 \(2707\) autosampler로 구성되 어있다. HPLC용 acetonitrile과 water는 Burdick & Jackson (Honeywell International Inc., USA)으로부터 구매하여 사용하였다. 기타 미생물 배양에 필요한 모든 시약들은 특급시약을 사용하였다.</p><h2>사이퍼메트린(cypermethrin)의 생물학적 분해용 미생물 분리.</h2><p>부산 인근의 경작지 토양 또는 연안 퇴적물로부터 토양 샘플\( (0.5 \mathrm{~g}) \) 을 채취하여 \(250\) 삼각 플라스크로 옮긴 다음, 피레스로이드(pyrethroid) 계열 살충제인 사이퍼메트린(cypermethrin)을 최종 농도 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 이 되게 멸균된 mineral salt medium(MSM) 배지 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 6 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 3 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl} 1 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{NaCl} 0.5 \mathrm{g} / \mathrm{L}\) \(\mathrm{MgSO}_{4} 0.24 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\), \( \left.\mathrm{CaCl}_{2} 0.011 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\right) \)과 함께 첨가한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 180 \mathrm{rpm} \) 에서 \(5\) 일 동안 배양 헸다. \(5\) 일 후 배양액 \(1\) \( \mathrm{mL} \) 을 취하여 다시 사이퍼메트린(cypermethrin)을 최종 농도 \(100\) \( \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)이 되게 멸균된 MSM배지 \( 50 \mathrm{~mL} \) 과 함께 첨가한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C}\) ,\( 180 \mathrm{rpm} \) 에서 \( 5 \) 일 동안 배양 헸다. 순차적으로 사이퍼메트린(cypermethrin)의 농도를 높여 \( 200,300 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 까지 수행한 다음, MSM 고체 배지에 콜로니를 도출했다. 도출된 콜로니들은 각각 사이퍼메트린(cypermethrin)을 최종 농도 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 이 되게 멸균된 \( \mathrm{MSM} \) 배지 \( 50 \mathrm{~mL} \) 과 함께 첨가한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 180 \) \( \mathrm{rpm} \) 에서 \( 5 \) 일 동안 배양한 다음 배양액에 존재하는 잔류 사이퍼메트린(cypermethrin)을 추출한 다음 HPLC를 이용하여 분리 미생물에 의한 사이퍼메트린(cypermethrin)의 분해 정도를 측정했다.</p><h2>16s rDNA 서열에 의한 분리 균주의 동정.</h2><p>두 개의 oligonucleotide 프라이머 \( 5'\)-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-\( 3'\) (position \(9 \)to \( (27\) E coli \( 16 \)S rDNA), \( 5 \)'-AGAAAGGAGGTGAT CCAGCC-\( 3 \)' (position \(1542\) to \(1525\) E. coli \( 16 \mathrm{SDNA} \) )를 이용하여 분리 균주의 \( 16 \mathrm{~S} \mathrm{rDNA} \) 영역의 증폭을 수행했다. 초기 변성 단계는 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) \(1\)분을 시작으로 \( 95^{\circ} \mathrm{C}\) \( 30 \) 초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) \(30 \) 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) \( 1 \)분을 \( 30 \) cycle 수행하고 최종 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에 \(10\) 분간 신장 단계를 수행한다. 이렇게 얻어진 PCR 산물은 pGEM T-easy vector (promega Co., Fitchburg, WI, USA)속에 재조합한다. 선별균주의 \( 16 \mathrm{S} \) rDNA 유전자의 염기서열을 결정한 다음 GenBank Database에서 상동성을 비교하며, 유사종들과의 유전학적인 유연관계를 알아보기 위하여 Clustal Ⅸ program을 이용하여 phylogenetic tree를 제작하였다.<h2>배양액에서 사이퍼메트린(cypermethrin)의 추출 및 분석.</h2><p>배양상등액 \( 10 \mathrm{~mL} \) 에 아세톤/석유에테르 혼합액 \( (1: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v}\)) \(20 \mathrm{~mL} \)을 혼합한 다음 ultrasonic bath에서 \( 20 \) 분에 한 번씩 섞어 주면서 \(1\)시간 동안 추출을 수행하였다. 분리된 \(2\) 개의 층들 중에서 상층액을 새 tube로 옮긴 다음 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에서 중탕하며 질소 가스 \( \left(\mathrm{N}_{2}\right. \) gas)를 이용하여 완전히 휘발시켰다. Acetonitrile \( 1 \mathrm{~mL} \) 을 첨가하여 시료를 완전히 녹인 다음 \( 0.22 \mu \mathrm{m} \) polytetra-fluoroethylene 멤브레인 필터를 이용하여 여과한 다음, \( \mathrm{HPLC} \) 를 이용하여 분석하였다. 분석은 Waters의 HPLC를 이용하였으며 XBridge \( ^{\mathrm{TM}} \mathrm{C} 18\) \( (5 \mu \mathrm{m} \), \( 4.6^{*} 150 \mathrm{~mm} \) 컬럼, Waters \( ) \) 을 사용하였 고, acetonitrile:water \( (0.85: 0.15, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 용매를 분당 \( 1 \mathrm{~mL} \) 씩 흘리며 UV \( 235 \mathrm{~nm} \) 에서 사이퍼메트린(cypermethrin)을 검출하였다.</p>
상층액을 새 tube로 옮긴 다음 중탕하면서 무엇을 이용하여 완전히 휘발시켰나요?
질소 가스 \( \left(\mathrm{N}_{2}\right. \) gas)