<h2>항혈청 (Antisera)</h2><p>CAR에 대한 항혈청 (rabbit anti-mCAR2 immunme serum)은 B. Kemper로부터 제공받았고, RXR에 대한 항혈청 (rabbit anti-human RXR\(\alpha \) immune serum)과 GFP에 대한 항혈청 (mouse anti-GFP immune serum)은 Santa Cruz Biotechnology (CA. U.S.A.)에서 구입하였다.</p><h2>Western Blot에 의한 단백질 발현 조사</h2><p>배양된 Hep G2 혹은 COS 세포 내에서 transfection을 하지 않은 control 상태와 transfection을 한 후의 CAR와 RXR 단백질의 발현여부를 알아보기 위하여 각각 \( 0.5 \mathrm{ug} \) 의 pEmCAR1GFP vector 또는 pCMX-RXR vector를 LipofectAMINE 방법에 의해 \( 95 \% \)의 confluency에 도달한 배양세포에 transfection을 하였다. 먼저 transfection하고자 하는 DNA를 OPTI-MEM에 mix한 다음 \( 1 \mathrm{ug} \)의 DNA에 대하여 5 ul의 LipofectAMINE과 혼합한 다음 15분간 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 Incubation 하였다. Transfection 하기직전, 배양액을 Serum-free DMEM으로 교체한 다음 DNA/ LipofectAMINE/OPTI-MEM 혼합액을 drop-wise로 배양액에 떨어뜨리고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \mathrm{CO}_{2}(5 \%) \) incubator에서 6시간 동안 배양하였다. 그 후 \( 10 \% \) Fetal Bovine Serum이 함유된 DMEM에서 다시 36시간동안 배양하였다. 세포 내 발현된 단백질을 추출하기 위하여 배양세포를 PBS로 wash한 다음 hypotonic buffer에서 vortex하여 원형질막을 파괴하고 추출된 세포전체 단백질 sample을 \(8.5\%\) SDS-Polyacryl-amide에서 전기영동 하였다. 분리된 단백질을 Nitrocel-lulose membrane에 transfer한 다음 rabbit anti-CAR serum (1:1000), mouse anti-GFP Ab (1:5000), 혹은 rabbit anti-RXR IgG (1:2000)을 30분간 상온에서 incubation하고, horse radish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (CAR와 RXR) 또는 HRP-rabbit anti-mouse IgG (GFP)와 20분간 상온에서 incubation 하여 ECL (Enhanced Chemil-uminescence) detection System (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, U.S.A.)에 의해 immuno-fluorescent 영상을 실시하였다.</p><h2>세포배양 및 Transfection</h2><p>Human HepG2 혹은 COS 세포를 \( 10 \% \) charcoal-dextran-stripped fetal calf serum, 100 units/ml penicillin 과 \( 0.01 \% \) streptomycin을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 배양하였다. Transfection을 위해서, 24-well의 세포배양 plate에 \( 90 \% \)의 Confluency로 각각의 세포를 접종한 다음 항생제가 없는 DMEM에서 18시간동안 배양하였다. LipofectAMINE 방법을 이용하여 \( 1 \mathrm{ug}/\)well의 CYP2B1 PBRU cis-acting element를 minimum promotor인 CYP2C1 Promoter와 firefly luciferase 보고유전자에 융합한 보고 유전자 Plasmid (PBRU2C1Luc), \( 10 \mathrm{ng}/\)well의 SV40 promoter와 Renilla luciferase 유전자를 함유한 pRL-SV40 plasmid, 그리고 다양한 양의 CAR 발현유전자 pCDNA3CAR1을 각각의 well에 첨가시켰다. PBRU를 제외한 \( 1 \mathrm{ug}/\)well의 2C1Luciferase 보고유전자를 대조 군으로 사용하였다. Transfection 후 각각의 세포를 36시간동안 incubation한 다음 dual luciferase 보고유전자 분석 방법(Promega Biotech)에 의해 luciferase의 활성을 측정하였다. Transfection 효율성의 차이에 의해 발생될 수 있는 변이를 최소화하기 위해 각각의 Sample에 대한 firefly luciferase의 활성을 동등한 Renilla luciferase의 활성과 비교하여 표준화시켰다.</p>
Santa Cruz Biotechnology (CA. U.S.A.)에서 구입한게 GFP에 대한 항혈청 (mouse anti-GFP immune serum) 이야 ?
YES