<h1>재료 및 방법</h1><h2>균의 분리</h2><p>전국 각지의 토양 시료를 채취하여 Suzuki, 권 등이 사용한 방선균 분리 방법을 사용하여 방선균 1,000 여주를 순수분리하였다.</p><h2>Tyrosinase 저해제의 생산균주 1,2 차 선별</h2><p>Tyrosinase 저해제 생산 균주의 선별을 위하여 \( 100 \mathrm{ml} \) 삼각 flask에 Table 1 의 기본배지(액체배지)를 \( 20 \mathrm{ml} \)씩 분주하고 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 가압 멸균한 후 순수 분리된 균주를 1백금이 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4일간 \( 180 \mathrm{rpm} \)에서 진탕배양하였다. 배양 후 배양액을 거름종이(Whatman No. 2)로 거른 후 tyrosinase에 대한 저해활성을 측정하여 상대저해활성이 \( 50 \% \) 이상인 균주 10주를 1차 선별하였다. 1 차 선별된 균주 중 고유 형질이 안정한 균주를 얻기 위하여 단세포주(mono-colony)를 분리하였다. 선별된 균주를 Table 1 의 균 선별용 평판배지로 3분 도말법을 이용하여 단일 콜로니를 분리한 후 각각의 콜로니를 다시 선별용 액체배지를 사용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4일간 진탕배양하였다. 배양 후 배양액을 거름종이로 거른 후 tyrosinase에 대한 저해활성을 측정하였다. 각 단세포주들의 tyrosinase에 대한 저해활성이 정규 분포를 이룰 때 까지 natural selection을 하여 저해활성이 가장 높은 균주 F-97을 최종 선별하였다.</p><h2>선별 균주의 포자 현탁액 제조 및 보존</h2><p>순계분리된 선별균주를 Table 1의 선별용 사면배지\( (\theta 15 \) \( \mathrm{mm} \) test tube)에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), 7일간 배양한 후 \( 1 \% \) glycerol이 첨가된 살균수 \( 3 \mathrm{~ml} \)을 넣고 백금이로 포자를 현탁한 후 약 10분간 초음파에서 처리하였다. 제조된 포자현탁액은 \( -60^{\circ} \mathrm{C} \) deep freezer(SamWon Co.)에서 보관하였고, 이 후 실험의 접종원으로 사용하였다.</p><h2>Mushroom tyrosinase에 대한 저해활성의 측정</h2><p>Tyrosinase에 대한 저해활성은 검체 \( 15 \mu \mathrm{l} \)를 micro-plate(96 well)에 넣고, 0.1 M phosphate buffer(\(\mathrm{pH} 6.5)\)\( 150 \mu \mathrm{l} \)와 \( 3 \mathrm{~mM}\) L-tyrosine 용액 \( 25 \mu \mathrm{l}\) 를 넣은 후, \( 2100 \mathrm{~unit} / \mathrm{ml} \) mushroom tyrosinase(Sigma, \(0.05 \mathrm{M}\) phosphate buffer, \( \mathrm{pH} \)6.5) \( 7 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후 micro-plate reader(Molecular Devices, Emax)를 사용하여 \( 490 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. Tyrosinase에 대한 저해율(\(\%\))은 다음 식에 의하여 계산하였다.</p><p>저해율 \[ (\%)=\frac{(D-C)-(B-A)}{(D-C)} \times 100 \] \( \mathrm{A} \) : 저해제를 넣은 것의 반응 전의 홉광도 \( \mathrm{B} \) : 저해제를 넣은 것의 반응 후의 흡광도 \( \mathrm{C} \) : 저해제를 넣지 않은 것의 반응 전의 흡광도 \( \mathrm{D} \) : 저해제를 넣지 않은 것의 반응 후의 흡광도</p>
삼각 flask에 Table 1 의 기본배지(액체배지)를 \( 20 \mathrm{ml} \)씩 분주하고 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 가압 멸균한 후 순수 분리된 균주를 1백금이 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4일간 \( 180 \mathrm{rpm} \)에서 진탕배양은 왜 하였는가?
Tyrosinase 저해제 생산 균주의 선별을 위하여