<h2>DNA fragmentation</h2><p>배양된 HTB-94는 1X PBS로 2회 세척 후 lysis buffer (100 \( \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}, \mathrm{pH} \7.4,0.5 \mathrm{mM} \) EDTA, \(0.2\%\) SDS, \( 200 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaCl}) \) 를 사용하여 세포를 용해시켰다. 용해된 세포액은 \( 13,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 수집하였으며, 이 상등액에 \( 20 \mu \mathrm{g} \) RNase A (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.)를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2시간 동안 반응하였으며, 이후 \( 0.01\mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 proteinase K (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.)를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2시간 반응시켰다. 반응이 끝난 용액에 PCI [Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol=25:24:1]를 사용하여 DNA를 정제하였으며, \( 3 \mathrm{M} \) sodium acetate와 에탄올을 사용하여 DNA를 침전하였다. 침전된 DNA는 \( 70 \% \) 에탄올로 세척하여 상온에서 건조 후 멸균된 3차 증류수를 사용하여 DNA를 녹였다. 용해된 DNA는 \(2\%\) agarose gel에 전기영동하여 DNA 절편을 분리하였다.</p><h2>Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS)</h2><p>1X PBS로 세척 후 Trypsin-EDTA를 사용하여 부착된 세포를 부유시켜 상등액을 \( 1,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분 동안 모아 \( 70 \% \) 에탄올로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 고정시켰다. Propidium Iodide (BD bioscience, San Diego, CA, U.S.A.) 염색을 위해 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) Propidium Iodide, \( 0.1 \% \) Nonident P-40, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) RNase A 1X PBS에 녹여 20분 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 암반응을 시켰다. 염색한 시료는 Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS)를 이용하여 nylon mesh filter를 통해 부유하는 것의 세포주기를 측정하였고 data 분석은 Cellquest anlalysis program (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA)을 이용하였다.</p><h2>Immunofluorescence staining</h2><p>연골암 세포주 HTB-94에서 SFN에 의한 핵과 세포골격의 변화를 관찰하기 위하여 immunofluorescence를 수행하였다. 배양된 HTB-94는 \(3.5\%\) paraformaldehyde로 10분 동안 상온에서 고정시켰으며, \( 0.1 \% \) Triton X-100을 이용하여 세포막 투과성을 높여주었다. 고정된 세포는 DAPI [4',6-dia-midino-2-phenylindole dihydrochloride]와 phalloidin을 사용하여 염색하였으며, 형광현미경으로 관찰하였다.</p><h2>Statistics analysis</h2><p>본 실험의 결과는 여러 차례의 실험 중 평균적인 결과를 사용하였다. 통계적 검증은 student-t test를 사용하였고, 신뢰 구간은 \( 5 \% \) 로 하여 \( p \) 값이 \( 0.05 \) 보다 낮은 경우를 유의하다 판단 하였다.</p>
immunofluorescence에서 사용한 고정액은 뭐야?
paraformaldehyde