<h2>In vitro SV40 DNA 복제계</h2><p>In vitro SV40 DNA 복제계를 이전에 기술된 방법으로 시행하였다. 반응혼합물 \( 40 \mu l \) 에는 \( 40 \mathrm{mM} \) creatine phosphate/di-Tris salt \( \left(\mathrm{pH}\right. \) 7.7), \( 1_{\mu \mathrm{g}} \) creatine kinase, \( 7 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{MgCl}_{2}, 0.5 \mathrm{mM} \) DTT, \( 4 \mathrm{mM} \) ATP, \( 200 \mu \mathrm{M} \) UTP, GOT, 그리고 CTP, \( 100 \mu \mathrm{M} \) dATP, dGTP, 그리고 dCTP, \( 25 \mu \mathrm{M} \) \( \left.{ }^{3} \mathrm{H}\right] \mathrm{dTTP} \) (specific activity \( 300 \mathrm{cpm} / \mathrm{pmol} \) ), \( 0.8 \mu \mathrm{g} \) SV40 Tag, \( 0.3 \mu \mathrm{g} \) SV40 origin-containing DNA, 그리고 적당량의 HeLa extract롤 포함한다. 반응혼합물을 \( 37 ^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 120분간 반응시키고 \( 20 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 1\% \) SDS, 그리고 E. coli-tRNA \( (0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 로 구성된 용액 \( 80 \mu \) 로 반응을 중지시켰다. 반응이 중지된 혼합물의 acid-insoluble radioactivity롤 측정하였다.</p><h2>DNA Pol \( \alpha \) 활성 측정</h2><p>DNA pol \( \alpha \) 활성을 이전에 기술된 방법으로 시행하였다. 반응혼합물 \( 30 \mu l \) 에는 \( 40 \mathrm{mM} \) creatine phosphate/di-Tris salt \( \left(\mathrm{pH}\right. \) 7.7), \( 1.0 \mu \mathrm{g} \) creatine kinase, \( 7 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{MgCl}_{2 \text {, }} \) \( 1.0 \mathrm{mM} \) DTT, \( 6 \mu \mathrm{g} \) BSA, \( 4 \mathrm{mM} \) ATP, \( 33 \mu \mathrm{M}\left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \mathrm{dTTP} \) \( (500 \mathrm{cpm} / \mathrm{pmol}) \), \( 0.1 \mu g(\mathrm{dA}) 4500 : oligo(\mathrm{dT})25 \), 그리고 DNA polymerase를 포함한다. 혼합물을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 다음 acid-soluble radioactivity롤 측정하였다.</p><p>Topoisomerase I relaxation 측정</p><p>Topoisomerase I 효소는 현재 항암 약물 개발에 있어서 아주 흥미롭고 새로운 대상으로 DNA의 복제나 수복시 중요한 역할을 담당하고 있다. 따라서 이 topoisomerase I 효소의 활성의 저해는 항암물질로서의 가능성을 제시해 줄 수 있는 하나의 지표가 될 수 있다.</p><p>Topoisomerase는 superhelical plasmid DNA의 relaxation에 의해 측정하였다. 반응액 (50mM Tris, \( \mathrm{pH} 7.5 \), \( 120 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{KCl} \), \( 10 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{MgCl}_{2} \), \( 0.5 \mathrm{mM} \) dithiothreitol, \( 0.5 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) bovine serum albumin, \( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) \( \mathrm{pSA} \) )에 \( 0.1 \mu_{\mathrm{g}} \)의 pBR322 plasmid DNA와 topoisomerase I, 각 시료 [RM10 \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \), RM60, RM60fr. 164-178, RM60fr. 179-202, RM100, DW, \( 0.1\% \) DMSO (vehicle)]를 농도별로 혼합한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 incubation하였다. 반응 후 \( 50 \% \) glycerol / \( 5\% \) SDS / \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) BPB를 넣어 반응을 종결시킨 후 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기영동을 실시했다. DNA를 ethidium bromide로 염색해서 UV transilluminator에서 관찰하여 topoisomerase I 에 의한 DNA relaxation에 미치는 시료들의 영향을 살펴보았다.</p>
반응을 중지시킬 때 사용한 용액에 몇 퍼센트 SDS가 사용되었나요?
\( 1\% \)