<h1>결과 밎 고찰</h1><h2>EpH4 세포에서 TGF-\(\beta \)에 의한 세포사멸 과정동안 Gadd45b의 발현 변화</h2><p>TGF-\(\beta \)는 여러 종류의 세포에서 세포사멸을 유도한다고 알려져 있다. EpH4 세포는 쥐의 유선 상피세포로서 전형적인 상피세포의 모습을 갖추고 있으며, TGF-\(\beta \)에 의해 세포사멸이 유도된다는 것이 알려져 있다. Gadd45b는 쥐의 간 세포에서 TGF-\(\beta \)에 의해 발현이 증가되며, p38 kinase를 activation시켜 TGF-\(\beta \)에 의한 세포사멸을 유도한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 TGF-\(\beta \)에 의해 세포사멸이 유도된다고 알려져 있는 EpH4 세포에서 TGF-\(\beta \)에 의해 유도되는 세포사멸 과정동안 Gadd45b 유전자의 발현 변화를 관찰하였다. EpH4 세포에 TGF-\(\beta \)를 처리하였을 때 이전의 보고와 마찬가지로 약 8시간 정도부터 세포사멸을 관찰할 수 있었으며, 24시간 후에는 거의 모든 세포가 사멸됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 1A and 1B). TGF-\(\beta \)에 의해 세포사멸이 일어나는 동안 Gadd45b 유전자의 발현을 Northern blot analysis로 관찰한 결과 TGF-\(\beta \) 처리 후 30분부터 그 발현이 증가하여 1시간 후에는 최고점에 이르고 그 이후에는 점차 감소함을 알 수 있었다(Fig. 1C).</p><h2>Gadd45 유전자의 promoter study</h2><p>TGF-\(\beta \)에 의해 유도되는 Gadd45b 유전자의 발현 증가가 RNA polymerase에 의한 transcription의 증가로부터 유래하는지 확인하기 위해, 이전의 연구에서 Gadd45b 유전자의 promoter 부분을 promoter가 없는 luciferase reporter 유전자의 upstream에 cloning한 construct를 이용하여 그 activity를 확인하였다. EpH4 세포에서 Gadd45b의 promoter activity는 TGF-\(\beta \)에 의해 약 6배 증가함을 알 수 있었다(Fig. 2A). TGF-\(\beta \)에 의한 Gadd45b 유전자의 promoter activity 증가에 필수적인 promoter sequence를 알아보고자 여러 가지 5'-deletion mutants를 제조하였으며, 각각의 mutants들의 promoter activity를 확인하였다. 여러 가지 5'-deletion mu­tants 가운데 Gadd45b 유전자의 transcription start site로부터 220 base upstream을 포함하는 mutants들은 모두 TGF-\(\beta \)에 의해 promoter activity가 증가하였지만, 100 base upstream까지 deletion 시켰을 경우 그 activity가 증가하지 않음을 확인할 수 있었다(Fig. 2A). 이러한 결과는 \(-220\) base부터 \(-100\) base 사이의 서열에 TGF-\(\beta \)에 의한 Gadd45b pro­moter activity의 증가에 필수적인 transcription factor가 binding함을 의미하는 것이다.</p><p>TGF-\(\beta \)의 신호전달 과정에는 여러 가지 신호전달 단백질들이 관여하지만 특히 Smad 단백질들이 중요한 기능을 담당한다는 것이 잘 알려져 있다. TGF-\(\beta \)에 의한 Gadd45b promoter activity의 증가에 TGF-\(\beta \)의 신호 전달에 중요한 역할을 담당하는 Smad 단백질들이 관여하는지 확인하기 위해, Smad 단백질들을 발현시키고 TGF-\(\beta \)에 의한 Gadd45b 유전자의 promoter activity를 측정하였다. TGF-\(\beta \)에 의해 activity가 증가하는 가장 작은 promoter 부위를 포함하는 \(-220\)/\(+235\) mutants를 Smad2, 3, 4를 발현하는 vector와 함께 각각 transfection 시키면 TGF-\(\beta \)를 처리하지 않아도 그 promoter activity가 약 3배정도 증가함을 관찰할 수 있었으며, TGF-\(\beta \)는 이들의 activity를 더욱 향상시키는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2B). 또한 Smad 단백질의 활성화에 필수적인 TGF-\(\beta \)의 type Ⅰ kinase에 의해 인산화 되는 부위인 C-terminal domain이 제거된 dominant negative form의 Smad2와 Smad3를 발현하는 vector Smad2 \(\Delta\) C와 Smad3 \(\Delta\) C를 이용하여 Smad2와 Smad3의 기능을 억제하였을 때 TGF-\(\beta \)에 의한 Gadd45b의 promoter activity가 증가하지 않음을 관찰하였다(Fig. 2B). 이러한 결과는 Smad2와 Smad3가 TGF-\(\beta \)에 의한 Gadd45b의 promoter activity의 증가에 필수적인 역할을 한다는 것을 의미하는 것이다.</p><p>Gadd45b 유전자의 promoter sequence를 분석해본 결과 Gadd45b 유전자의 transcription start site를 \(+1\)로 하였을 때, \(+12\)에서 \(+16\)과 \(+25\)에서 \(+31\)사이의 sequence에 Smad 단백질이 binding할 수 있는 서열이 존재함을 알 수 있었다(Fig. 3A). 이런 서열에 Smad 단백질이 binding하는지 확인하기 위해 \(+5\) 에서 \(+35\) 사이의 sequence를 probe로 하여 elec­trophoresis mobility shift assay (EMSA)를 수행한 결과, Smad 단백질이 TGF-\(\beta \)를 처리하였을 때 이 서열에 binding 함을 확인할 수 있었다(Fig. 3B). 하지만 앞의 실험에서 Gadd45b의 promoter activity에 중요할 것으로 예측되었던 \(-220\) base부터 \(-100\) base 사이의 sequence에는 Smad 단백질이 binding 할 수 있는 서열이 존재하지 않았으며, 실제로 이 부분의 서열을 probe로 하여 EMSA를 수행하였으나 TGF-\(\beta \)에 의한 새로운 단백질의 binding은 관찰할 수 없었다(data not shown). Smad 단백질은 transcription factor로서 그 자체로 유전자의 발현을 조절하기도 하지만, 많은 보고에서 Sp1이나 AP-1과 같은 다른 transcription factor들과 함께 유전자의 발현을 조절한다고 알려져 있다. 이와 같은 결과를 종합하여 볼 때, EpH4 세포에서 TGF-\(\beta \)에 의해 유도되는 세포사멸 과정 동안 Gadd45b 유전자가 발현되기 위해서는 TGF-\(\beta \)에 의해 활성화된 Smad 단백질이 Gadd45b promoter의 \(-220\) base와 \(-100\) base 사이에 binding 되어 있는 다른 transcription factor와 함께 작용할 가능성이 높다고 생각된다. 실제로 Gadd45b promoter의 \(-220\) base와 \(-100\) base 사이의 서열에는 Sp1이 binding할 수 있는 GC box가 존재하는데 (Fig, 3A), Sp1과 Smad 단백질 간의 interaction이나 이 서열의 중요성에 관한 실험이 추가로 수행되어야 할 것이다.</p><h2>Ras에 의해 transformation된 세포에서 Gadd45b의 발현 변화</h2><p>EpRas 세포는 EpH4 세포에 ras 유전자를 도입시켜 암세포화된 세포로서, TGF-\(\beta \)에 의한 세포사멸이 유도되지 않는다고 알려져 있는 세포이다. EpRas 세포의 경우 ras 유전자의 발현에 의해 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway가 활성화 되며, PI3K의 활성화가 TGF-\(\beta \)에 의한 세포사멸을 억제하는데 중요하다는 것이 알려져 있다. 이 세포에서 TGF-\(\beta \)에 의한 Gadd45b 유전자의 발현을 확인한 결과 EpH4 세포에 비해 TGF-\(\beta \)에 의한 발현 증가가 현저히 감소하였음을 확인하였다(Fig. 4A). 또한 EpRas 세포에서 TGF-\(\beta \)에 의한 Gadd45b 유전자의 promoter activity도 EpH4 세포에 비해 현저히 감소함을 확인하였다(Fig. 4B). 이러한 결과는 Ras의 발현에 의해 TGF-\(\beta \)에 의한 Gadd45b의 유전자의 발현이 억제되어 EpRas 세포에서 TGF-\(\beta \)에 의한 세포사멸이 억제되었을 가능성을 시사하는 것이다. 향후에는 어떠한 기작으로 ras 유전자가 Gadd45b 유전자의 발현에 영향을 미치는지 확인하는 연구가 수행되어야 할 것이다.</p>
많은 세포에서 TGF-\(\beta \)는 무엇을 유도해?
세포사멸