<h1>결과 및 고찰</h1><h2>세포 생존 능력 측정 결과</h2><p>도인승기탕 추출물의 B16F10 melanoma cell증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 도인승기탕 \(70\%\) 에탄올 추출물 및 물 추출물을 10, 25, 50, 75, 100, 250 \(\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)의 농도로 처리하고 48시간 후에 MTT방법으로 세포의 증식을 관찰한 결과 대조군의 세포 증식율을 \(100\%\)로 하였을 때 \(250 \mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\) 이하 농도에서는 독성이 관찰되지 않았다.</p><h2>멜라닌 합성 억제 효과</h2><p>피부 흑화는 피부에 존재하는 melanocyte가 UV 노출 등의 외부적 환경에 대응하여 melanin의 생성이 증가한다. 멜라닌 생합성으로 인한 색소 침착을 치유하기 위해 멜라닌 생성을 억제하는 hydroquinone, resorcinol 등의 페놀 유도체나, L-ascorbic acid와 그 유도체 및 kojic acid, arbutin, lactic acid, glucosamine, tunicamycin 등이 개발되었으나, 피부 저자극성이나 안정성에 문제가 있어 극히 제한된 양만 사용되고 있다. 도인승기탕 추출물의 멜라닌 합성을 확인한 결과, arbutin의 경우 \(100\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)으로 처리하였을 때 멜라닌 합성을 \(58\%\) 저해하였다. 멜라닌 합성 억제는 물 추출물보다 \(70\%\) 에탄올 추출물을 처리하였을때 우수하였으며 특히 \(70\%\) 에탄올 추출물을 \(100\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)로 처리하였을 때 \(55\%\)의 멜라닌 합성 억제 효과를 관찰하였다.</p><h2>Tyrosinase 활성 측정 결과</h2><p>Tyrosinase의 활성은 melanosome에서 멜라닌이 생성되게하는 효소로써 피부노화 촉진 및 색소 침착 등의 문제를 야기시킬 수 있다. 도인승기탕 추출물 첨가에 따른 tyrosinase 활성 측정 결과 시료의 처리 농도가 높아질수록 tyrosinase 활성이 억제 됨을 확인 할 수 있었다. 도인승기탕 \(70\%\)에탄올 추출물 \(100\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)에서 \(51\%\)의 활성 억제가 관찰 되었고 물 추출물은 \(100\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)에서 \(28\%\)의 억제효과가 나타났다. Kim 등의 연구 결과에 따르면 정공피 추출물 \(100\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)에서 \(6.3\%\) 억제한 것을 보았을 때 도인승기탕 \(70\%\) 에탄올 추출물의 tyrosinase 활성 억제능이 우수함을 알 수 있다.</p><h2>Western blot을 이용한 단백질 발현의 측정 결과</h2><p>B16F10 melanoma cell은 melanocyte의 세포막에 존재하는 melanocortin 1 receptor (Mc1R)을 통해 멜라닌 합성의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이 과정에서 microphthalmia transcription factor (MITF)는 핵으로 이동하여 DNA의 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 promotor에 결합하여 각각의 유전자 발현을 증가시켜 melanogenesis를 유도하는 것으로 알려져 있다. 이 중 TRP-1과 TRP-2는 tyrosinase related protein 으로 알려져 있는 단백질로서 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA)를 흑갈색을 나타내는 indole-5,6-quinone-2-carboxylic acid로 산화하는 효소이며 TRP-2는 DCT라고도 하며 DOPA chrome을 DHICA로 이성화하는 효소로써, 이러한 MITF의 억제는 tyrosinase 및 TRP-1, TRP-2의 발현억제를 통하여 melanin 색소 생성을 억제할 수 있다.</p><p>도인승기탕 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과를 분석하기위해 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 유전자 발현 양상을 관찰하였다(Fig. 4). Tyrosianse에 관한 도인승기탕 추출물은 물 추출물 및 \(70 \%\) 에탄올 추출물 \(100\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)에서 각각 \(17\%\), \(24\%\)를 저해하였고 arbutin은 \(2\%\) 저해하였다. TRP- 1은 물 추출물과 \(70\%\) 에탄올 추출물 \(100\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)에서 각각 \(23 \%\), \(31 \% \) 저해하였으며 arbutin은 \(100\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)에서 \(7\%\) 저해율을 관찰할 수 있었다. TRP-2의 발현 양상 역시 TRP-1과 마찬가지로 도인승기탕 \(70\%\) 에탄올 추출물이 물 추출물과 arbutin보다 저해율이 우수하였다. 그리고 도인승기탕 추출물의 MTTF 발현에 미치는 효과를 관찰한 결과 물 추출물과 \(70\%\) 에탄올 추출물 \( 100\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)에서 각각 \(23\%\), \(35\% \) 저해되었고 arbutin은 \(100\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)에서 \(22\%\) 저해되는 것을 관찰 할 수 있었다. 이는 도인승기탕 추출물이 세포신호전달 경로 중 지속적인 ERK 활성화를 저해함으로써 MITF에 영향을 미쳐 멜라닌 생합성에 직접적으로 관여하는 효소인 tyrosinase와 TRP-1, TRP-2의 발현을 저해 하는 것으로 생각된다.</p><p>Ye 등의 San-bai-tang (백출, 토복령, 작약 \(1:1:1\) 혼합추출물)이 미백관련 단백질 발현 정도를 보면 본 연구 결과와 같은 양상으로 MITF와 tyrosinase의 발현양의 감소 시킴으로써 TRP-1과 TRP-2도 농도의존적으로 감소하는 것을 관찰하였다. 김 등의 연구결과에 따르면 이러한 MITF의 억제는 tyrosinase의 발현 억제를 통하여 melanin 색소 생성을 억제할 수 있으며 MITF의 발현이 억제되면 색소생성이 억제될 수 있다고 보고하였다.</p><p>본 연구에서는 멜라닌 생합성에 관여하는 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현을 측정한 결과와 멜라닌 생합성을 확인한 실험 결과와 연관성이 있는 것으로 확인할 수 있었다.</p><p>이와 같은 연구결과를 바탕으로 향후 도인승기탕 추출물이 천연 미백 소재로 활용할 수 있을 것으로 생각된다.</p><h1>초록</h1><p>본 연구는 B16F10 melanoma 세포를 사용하여 도인승기탕의 \( 70 \% \) EtOH와 물 추출물의 멜라닌 생합성, tyrosinase 할성, western blotting으로 측정하였다. 도인승기탕 추출물은 농도 의존적으로 멜라닌 생합성과 tyrosinase활성을 저해하였다. 그 결과 도인승기탕 \( 70 \% \) 에탄올 추출물이 멜라닌 합성을 \( 40 \% \), tyrosinase는 \( 51 \% \) 저해효과를 나타내었다. Western blot을 이용하여 B16F10 melanoma 세포 내에 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF의 발현을 억제하는 효과를 관찰하였다. 이상의 결과에 따라 도인승기탕의 \( 70 \% \) 에탄올 추출물은 미백 소재로서 가능성을 가지는 것으로 나타났다.</p>
피부 흑화는 어떻게 발생하는가?
melanocyte가 UV 노출 등의 외부적 환경에 대응하여 melanin의 생성이 증가