<h1>재료 및 방법</h1><h2>시료채취</h2><p>Greenland의 Thule 인근 두 지점 \((76^{\circ} 32^{\prime} 52.83^{\prime \prime} \mathrm{N}\), \(68^{\circ} 34^{\prime} 02^{\prime \prime} \mathrm{W})\), \((76^{\circ} 33^{\prime} 21.92^{\prime \prime} \mathrm{N}\), \(68^{\circ} 39^{\prime} 06.41^{\prime \prime} \mathrm{W}) \)에서 2010년 8월에 시료를 채취하였다. 첫 번째 지점의 토양시료는 표토에 식물 등이 거의 존재하지 않는 지역에서 채취하였으며 입자크기가 작은 sand의 형태였으며(Sand 지점으로 명명), 두 번째 지점의 토양에는 식생이 잘 발달하였고 토양입자가 silt 형태로 수분을 많이 포함하고 있었다(Silt 지점으로 명명).</p><h2>배지의 조성</h2><p>통상적인 Petri dish 배양방법과 FPMT에 사용된 배지는 100 분의 1로 희석된 Nutrient Broth 이었다. Agar를 Petri dish 방법에는 \( 1.5 \%\), FPMT방법에는 \( 0.7 \% \) 첨가하였다.</p><h2>Filter plate microbial trap (FPMT)의 제작</h2><p>FPMT는 토양시료 위에 설치되어 장치의 하부를 통해 미생물이 유입되도록 유도하는 구조를 가지고 있다. 96 well UNIFILTER filtration microplate (Whatman No 7700-1806, Germany)를 본체로 사용하였다(Fig. 1A). UNIFILTER filtration microplate는 가로 \( 12.4 \mathrm{~cm} \) 세로 \( 8.1 \mathrm{~cm} \) 높이 \( 3 \mathrm{~cm} \)의 polystyrene 소재이며, 96개 \( (8 \times 12) \)의 독립된 원통형 공간을 가지고 있으며 각 공간에 최대 약 \( 800 \mu \mathrm{l} \) 액체를 넣을 수 있다. 이 독립된 공간을 미생물을 배양하는 chamber로 사용하였다. 각각의 chamber는 윗부분은 개방되어 있고 바닥에는 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) pore size의 친수성(hydrophilic) Polyvinylidenefluoride (PVDF) 필터가 장착되어 있다. 필터 밑으로 각 chamber 당 지름 \( 1 \mathrm{~mm} \) 크기 한 개의 구멍이 있는 밑판이 부착되어 있어 토양시료가 필터에 과도하게 접촉되지 않도록 되어있다(Fig. 1B). FPMT의 제작을 위하여 UNIFILTER filtration microplate를 클린벤치 안에서 자외선에 2시간 노출시킨 후 멸균 된 배지(100분의 1 로 희석한 Nutrient Broth, \( 0.7 \% \mathrm{agar}) \)를 각 chamber 당 \( 500 \mu \mathrm{l} \)씩 넣어주었다. Negative control은 밑판구멍을 방수접착제(3M, USE)를 이용하여 막은 것을 사용하였다. FPMT의 상부에는 공기의 통과가 가능한 cover를 덮어 주어 상부로부터 오염을 막아주었다.</p><h2>균주의 배양 및 분리</h2><p>토양시료를 가로 \( 40 \mathrm{~cm} \), 세로 \( 30 \mathrm{~cm} \), 높이 \( 30 \mathrm{~cm} \) 크기의 밀폐용기 안에 \( 10 \mathrm{~cm} \) 깊이로 채운 후 그 위에 제작한 FPMT를 3주일 동안 설치하였다. 밀폐용기를 저온 배양기에 넣어 현장온도로 유지하였고 하루에 한번씩 멸균된 3차 증류수를 공급하여 토양시료의 습도를 유지하였다. 3주 후 FPMT를 꺼내 cover를 제거한 후 멸균된 loop를 이용하여 각 chamber의 배지를 상부로부터 약 \( 5 \mathrm{~mm} \) 깊이에서 채취하였다. 채취한 배지를 \( 3 \mathrm{ml} \) 멸균 증류수에 넣은 후 30분 동안 voltex하고, \( 100\mathrm{RCF}(\times \mathrm{g}) \) 속도에서 1분간 원심 분리하여 agar 조각을 침전 시켰다. 상등액을 채취하여 연속적으로 희석한 후 agar plate에 평판 도말하여 재배양하였다. 배양 후 형태와 크기가 다른 colony를 지점당 30개 선별하여 순수 분리하였다. FPMT와 결과 비교를 위하여 보통의 Petri dish 배양을 진행하였다. 채취한 토양시료 \( 1 \mathrm{~g} \)을 멸균 증류수 \( 10 \mathrm{ml} \)에 넣은 후 30분 동안 voltex하였다. 상등액을 채취하여 10배씩 연속적으로 희석한 후 \( 10^{2} \sim 10^{5} \)로 희석한 것을 nutrient agar 배지에 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 평판 도말하여 3주일간 배양하였다. 배양 후 형태와 크기가 다른 colony를 지점당 30개 선별하여 순수 분리하였다.</p><h2>분리된 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석</h2><p>분리한 균주를 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자의 염기 서열을 분석하였다. 균주의 colony를 colony direct PCR을 위한 template로 사용하였으며, 만약 colony direct PCR이 실패했을 경우 QIAGEN tissue kit (QIAGEN, Valencia, USA)를 이용하여 DNA를 추출한 후 다시 PCR과정을 진행하였다. 16S rRNA 유전자를 Universal primer (27F; 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3', 1492R; 5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT-T-3')를 이용하여 증폭하였으며 그 과정에서 Hot Start Taq system (QIAGEN, Valencia, USA)을 이용하였다. 증폭생성물은 MACROGEN Maryland, MD, USA)에 sequencing 분석을 의뢰하여 염기서열 분석을 하였으며 BLAST를 이용하여 databases에 수록된 염기서열들과의 유사도를 비교 분석하여 유전적 거리가 가장 가까운 균주(closest species)를 찾았다.</p><h2>분리한 균주의 다양성 분석</h2><p>각각의 배양방법에 따른 분리한 균주들의 다양성을 비교를 하기 위하여 환경 Shannon weaver diversity index, Shannon weaver evenness index, Simpson diversity index를 구하였다.</p>
Greenland의 Thule 인근 두 지점에서 시료는 언제 채취했는가?
2010년 8월