<h2>Northern blot 및 Western analysis</h2><p>형질전환체의 ferritin 유전자의 발현량을 조사하기 위하여 개화 후, 30 일 된 미숙 종자의 배유로부터 Total RNA를 추출하였다. 각 시료로부터 \( 20 \mu \mathrm{g} \) 의 RNA를 \(1\%\) agarose gel에 전기영동한 후, nylon membrane에 고정시켰다. Probe의 준비와 hybridization, filter의 세척은 기본적으로 Southern blot 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.</p><p>Ferritin 단백질 정제 및 antibody의 작성은 cDNA Library로부터 full length ferritin 유전자를 expression vector에 삽입 후, E. coli. 균주에서 생산하는 단백질을 재정제하여 Takara 사(Japan)에 의뢰하여 monoclonal antibody를 작성하였다. Western blot analysis는 조직 및 생육시기별로 채취한 시료를 단백질 추출용액을 가하여 마쇄 후, 원심분리에 의해 단백질을 추출한 후, \( 10 \% \) acrylamide gel상에 SDS-PAGE를 수행하여 단백질 전용 나이론 membrane을 이용하여 blotting하였다. Ferritin 단백질의 분석은 Promega 사에서 시판되고 있는 항체와 본 실험에서 작성한 항체를 표식하여 밴드화하였다.</p><h2>형질전환계통의 bialaphos 저항성 검증</h2><p>Phosphinotricin이 포함된 배지에서 선발되어 재분화된 개체를 자식에 의하여 육성한 T1 세대의 식물체를 30 일간 육묘하여 \( 30 \times15 \mathrm{~cm} \) 간격으로 격리포장에 재배하여 등숙기에 pot에 이식한 후 시판되고 있는 비선택성 제초제인 바스타 (경농, 유효성분 \( 20 \% \) )를 \( 3 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 의 농도로 살포하여 bialaphos에 대한 저항성을 조사하였다.</p><h2>철분 함량의 측정</h2><p>벼 알의 종피를 제거하고 현미를 유발에서 곱게 분쇄한 후 품종 별로 \( 0.5 \mathrm{~g} \) 을 취하여 농황산 \( 5 \mathrm{ml} \) 을 첨가하고, 시료와 황산을 잘 혼합 후, 24 시간 실온에 방치하였다. 식물체의 분해시에는 분해를 촉진시키기 위하여 과산화수소를 조금씩 가하면서 시료가 맑고 투명하게 될 때까지 4~5시간 동안 분해하였다. 분해가 완료된 분해액을 Whatman No. 2 여과지를 이용하여 \( 100 \mathrm{ml} \) mass flask에 여과시킨 다음 \( 100 \mathrm{ml} \) 로 부피를 맞춘 후 무기성분 분석용액으로 이용하였다. \( \mathrm{Fe} \) 함량의 분석시 \( 0.45 \mu \mathrm{M} \) membrane filter를 통과시켜 ICP로 분석하였다.</p><h2>Ferritin 유전자 도입계통의 후대 육성 및 농업형질 조사</h2><p>Agrobacterium tumefaciens 방법을 이용하여 ferritin 유전자를 형질전환 시킨 후 재분화된 T0 식물체들을 인공환경조절실에서 생육시킨 후 수확기에 종자를 수확하였으며, T1 계통은 형질전환에 사용한 동진벼 및 화신벼와 함께 포장에 4월 26일에 파종하고 5 월 30일에 격리 포장에 이식하여 농촌진흥청 벼 표준재배법에 의하여 재배하였다. 모 품종인 동진벼와 화신벼를 대조 품종으로 하고 T1 형질전환 계통들의 초장, 간장, 수장, 분얼수 등을 조사하는 한편, 전체적인 초형을 비교하여 ferritin 유전자만 치환되고 다른 제반 특성들은 모 품종과 동일한 새로운 품종을 선발하는 지표로 활용하였다.</p>
본 연구에서 ferritin 유전자의 발현량을 조사하는 과정은 어떻게 되니?
개화 후, 30 일 된 미숙 종자의 배유로부터 Total RNA를 추출