<h1>본 론</h1><h2>균질화된 완전장 cDNA 및 Agrobacterium library 작제법</h2><h3>고 순도 mRNA 정제 및 diol그룹의 biotin화</h3><p>Total RNA는 배추의 화아조직, 엽조직 및 경조직 등에서 분리하여 MAXS mRNA isolation kit (Miltenyi Biotec, USA) 및 PolyA-Quick (Stratagene, USA) kit를 사용하여 mRNA를 준비하였다. Biotin 반응은 cDNA 합성 전 및 후에 수행하였다. First-strand 합성 후, 시료에 \( 0.8 \mu \mathrm{l} \)의 \( 0.5 \mathrm{M} \) EDTA 및 \( 1.3 \mu \mathrm{l} \)의 \( 5 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \)을 첨가하였다. 시료를 phenol/chloroform 및 chloroform처리 후, ethanol 침전 시켜 \( 70 \% \) 및 \( 80 \% \) ethanol로 세척한 후, 멸균수에 현탁하였다. 연속하여 시료는 산화촉매제로서 \( 5 \mathrm{mM} \mathrm{~NaIO} \)가 포함된 \( 25 \mu \mathrm{l} \)의 \( 66 \mathrm{mM} \) sodium acetate용액 \( (\mathrm{pH} \) 4.5)에서 mRNA의 diol 그룹을 산화시켰다. 산화반응은 어두운 상태에서 45분간 얼음 위에서 수행하였다. 산화된 mRNA/cDNA hybrid는 연속하여 \( 2.5 \mu \mathrm{l} \) 의 \( 5 \mathrm{M} \mathrm{~LiCl}, 0.5 \mu \mathrm{l} \) 의 \( 10 \% \mathrm{~SDS} \) 및 동량의 isopropanol을 첨가하여 침전시키고, 또다시 mRNA/cDNA hybrid를 \( -20 \mathrm{C} \)에서 30분간 방치 후, \( 4 \mathrm{C}\), 15분간 \( 15,000 \mathrm{rpm} \) 원심하여 침전시켰다. 침전물은 \( 70 \% \) ethanol로 세척한 후 \( 25 \mathrm{ul} \) 의 멸균수로 현탁 하였다. 다음으로 \( 2.5 \mathrm{ul} \) 의 \( 1 \mathrm{M} \) sodium acetate \( (\mathrm{pH} \) 6.1), \( 2.5 \mathrm{ul} \) 의 \( 10 \% \) SDS 및 \( 75 \mathrm{ul} \) 의 \( 10 \mathrm{mM} \) biocytin hydrazide를 현탁액에 첨가하였다. RNA의 산화된 diol 그룹은 실온 \( \left(22-26^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에서 O/N 방치시킴으로써 biotin화시켰다. 마지막으로 핵산들은 \( 2.5 \mu \mathrm{l} \) 의 \( 5 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl}, 37.5 \mu\mathrm{l} \) 의 \( 1 \mathrm{M} \) sodium acetate \( (\mathrm{pH} 6.1\) ), 2.5배량의 ethanol을 첨가하여 침전시켜, 얼음 위에서 1시간 방치 후, biotin화된 시료를 \( 4 \mathrm{C}\), 15분간 원심에 의하여 침전시킨 후, 침전물을 \( 70 \% \) 및 \( 80 \% \) ethanol로 각 1회씩 세척 후, RNase-free 멸균수로 현탁하였다.</p>
핵산들은 ethanol을 첨가하여 침전시키고 얼음 위에서 1시간 방치한 다음에 어떻게 하였어?
biotin화된 시료를 \( 4 \mathrm{C}\), 15분간 원심에 의하여 침전시킨 후, 침전물을 \( 70 \% \) 및 \( 80 \% \) ethanol로 각 1회씩 세척 후, RNase-free 멸균수로 현탁