<p>한편, 새로운 혈전용해효소 유전자를 탐색하기 위해 기존의 nattokinase와 유사한 serine protease(subtilisin)를 생산하는 것으로 알려진 Bacillus subtilis, B. subtilis sp. natto, Brevibacillus laterosporus, Geobacillus stearothermophilus의 protease를 encoding하는 sequence를 alignment하여 conserved 된 부분을 확인한 후, Pro 44F1(5'-CGC-WGC-CGG-AAA-CGA-AGG-TTC-3')와 Pro 419R1(5'-ACG-TGA-GGA-GTC-GCC-ATK-GAC-G-3'), Pro 771F2 (5'-CGT-TAA-TCT-TTA-CGA-TGG-CGT-TC-3')와 Pro 998R2(5'-CCG-CTG-TCG-ATA-ACM- GCT-AC-3') 등 2종류의 primer set를 제작하였다. PCR 반응을 위하여 총 20\( \mu \mathrm{l} \)의 reaction mixture를 준비 하였으며, 이 반응액은 약 \( 100 \mathrm{~ng} \)의 KSL cell suspension, \( 20 \mathrm{~nM} \) primer, \( 2.5 \mathrm{~mM} \) dNTPs, \( 1 \mathrm{U} \) Taq polymerase(Solgent, Daejeon, Korea), 그리고 \( 10 \mathrm{X} \) Taq polymerase reaction buffer를 포함하고 있다. 증폭반응은 thermocycler(PTC-100, MJ Research)를 이용하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초의 조건으로 \( 50 \mathrm{~cycle} \) 동안 실시하였다.</p><p>혈전용해효소와 관련된 유전자에 대한 PCR을 수행하여 각 PCR products를 \(2 \% \) agarose gel에서 전기영동 한 결과, 136개의 KSL 중에서 pro 44F1와 pro 419R1 primer set에 의한 products\( (376 \mathrm{~bp}) \)는 14개, pro 771F2와 pro 998R2 primer set에 의한 products\( (228 \mathrm{~bp}) \)는 6개, 그려기 pro 44F1와 pro 998R2 primer set에 의한 products\( (955 \mathrm{~bp}) \)는 13개를 보인 PCR product의 특이성으로 보아 새로운 유전자의 가능성을 제시하고 있다. 이 중 가장 많은 수를 확보한 \( 376 \mathrm{~bp} \) 크기의 product는 \( 2 \% \) agarose gel 전기영동을 실시하여 분리된 각 bands를 정제하였다. 정제된 각 PCR products( \( 50 \mathrm{~ng} / \mu \mathrm{l}) \)는 pGEM-T vector( \( 50 \mathrm{~ng} / \mu \mathrm{l} \), Promega, WI, USA)와 \( 3: 1 \)의 비율 \( (v / v) \)로 혼합한 후, 상온에서 1시간 동안 ligation하였다. 재조합 plasmid는 E. coli DH5\( \alpha \) competent cell에 heat shock \( (42^{\circ} \mathrm{C}, 45 \mathrm{~sec}) \)을 이용한 형질전환 법으로 ampicillin\( (50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \), X-gal\( (40 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 그리고 IPTG\( (20 \mu \mathrm{M}) \)를 함유하고 있는 LB plate에 도말하여 재조합 colony를 선별하였다. 선별된 형질전환주는 다시 ampicillin \( (50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)이 포함되어 있는 LB broth에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 150 \mathrm{~rpm} \)의 조건으로 18시간 동안 액체배양 하였고 이를 DNA mini prep kit (BioproGen)을 이용하여 재조합 plasmid DNA를 최종 분리하였다. PCR products의 삽입여부는 pGEM-T vector의 specific restriction enzyme sites인 Pst I 과 Sph I 을 이용하여 절단한 다음 \( 0.8 \% \) agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 PCR products가 삽입된 것으로 확인된 재조합 plasmid를 선별하였다. 분리된 재조합 plasmid를 기존에 보고된 혈전용해효소 유전자와 비교하기 위하여 pGEM-T vector에서 유래된 T7을 이용하여 DNA 염기서열 분석하였으며, 확보된 염기서열에 대해 clustal W (NCBI, USA) 등의 analytic tools를 이용하여 GenBank database(NCBI, USA)에 등재되어 있는 혈전용해 효소의 DNA 염기서열과 비교◦분석하였다. 그 결과, 형질전환주 KSL 3, 10, 16, 18, 39, 47, 48, 50, 79, 97, 140, 141, 142의 염기서열은 기존에 보고된 Bacillus subtilis var. natto 유전자의 염기서열과 \( 99 \% \) 이상 유사한 것으로 확인되었다.</p>
선별된 형질전환주는 다시. 선별된 형질전환주는 다시 (50μg/ml)이 포함되어 있는 LB broth에서 37∘C, 150 rpm의 조건으로 몇시간 동안 액체배양 하였나?
18시간