<h1>고 찰</h1><p>셀레늄은 우리 몸에 필수적인 미량원소로, 단백질을 구성하고 여러 생화학적 기능을 하며, 생체내에서 주로 유기 형태인 셀레노메티오닌(selenomethionin, Sem) 및 셀레노시스테인(selenocysteine, Sec), 항산화효소와 셀레노시스테인을 포함하는 셀레노 단백질로 존재한다. 셀레늄은 항산화 작용 및 면역기능 강화, 항암효과를 가지고 있다는 연구가 보고되었다. 셀레늄은 산화적 스트레스를 받았을 때 glutathione perox-idase와 같은 항산화효소를 생성해 내어 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 여러 암세포종에서 세포성장을 억제하며, 전사인자의 활성을 조절하여 암세포의 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다.</p><p>Akt는 대장암을 비롯한 여러 암종에서 과발현 되어 있다고 보고 되었으며 물질대사, 세포 성장, 생합성, 분화 그리고 apoptosis의 억제와 같은 세포내 활동에 다양한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. Akt는 anti-apoptotic protein인 cy-clic- AMP response element-binding protein (CREB) 등을 활성화 시키며 IκB를 인산화 시키는 IκB kinase (IKK)를 활성화하여 IκB를 분해하고, NF-κB가 핵 내로 이동시킴으로써 여러 발암유전자들의 발현을 촉진시키는 것으로 보고되었다. 뿐만 아니라 Wnt 신호경로의 주요 조절자인 GSK3β의 인산화를 촉진시킴으로써 Wnt 신호경로의 전사인자인 β-catenin의 핵 내 이동을 촉진하는 것으로 보고되었다. Akt가 암세포의 증식과 성장에 관여하는 신호 경로들에서 중요분자로서 작용하고 있다는 보고에 따라, 본 연구에서는 HT-29 세포에 셀레늄을 처리하였을 때 세포증식억제 효과를 알아보았고, Akt의 활성억제에 따른 세포증식억제의 시너지 효과를 알아보고자 하였다. 이를 위하여 먼저 셀레늄을 농도별과 시간별로 처리하여 HT-29 세포의 생존율을 측정하였다. Fig. 1A, B에서 보이는 바와 같이 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비하여 셀레늄을 농도별로 처리하였을 때, 셀레늄의 농도가 높아짐에 따라 HT-29 세포의 생존율이 감소하였고, Fig. 2에서와 같이 이러한 암세포의 생존율 감소가 apoptosis에 의한 것임을 확인하였다. 선행연구들에서 HT-29 세포 및 Hep3B 간암세포에 셀레늄을 처리하였을 때 세포의 증식이 억제되고 apoptosis가 일어난다고 보고되었으며, 선행연구 및 본 실험에서 수행한 연구결과를 통하여 셀레늄이 암세포의 증식을 억제하고 apoptosis 유도효과가 있음을 확인 할 수 있었다.</p><p>셀레늄의 세포증식억제 효과에 있어서 세포증식에 관여하는 Akt 및 COX-2 신호분자의 활성을 Western blotting을 통해 관찰한 결과, Fig. 3에서와 같이 셀레늄을 농도별로 처리하였을 때 Akt의 활성형인 p-Akt의 발현은 감소하였고, COX-2의 발현 역시 감소하였다. 최근 연구에서 ER-negative, HER2-positive한 유방암에서 COX-2의 과 발현은 Akt 신호경로의 활성을 통하여 일어난다고 보고되었다. 따라서 Akt가 세포내에서 COX-2와 결합하여 신호전달을 촉진하는지 알아보기 위하여 immunofluorescence를 실시한 결과, Fig. 4에서 나타난 바와 같이 셀레늄에 의하여 p-Akt와 COX-2의 발현은 감소되지만 p-Akt는 세포질에서 발현이 조절되며, COX-2는 핵내에서 발현이 조절되어 둘이 결합하여 작용하는 것은 아님을 확인할 수 있었다. Akt와 COX-2가 HT-29 대장암세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Akt의 저해제인 LY294002와 COX-2의 저해제인 celecoxib를 처리하여 세포 생존률을 측정한 결과, Fig. 5에 나타난 바와 같이 LY294002와 celecoxib를 처리하였을 때 세포의 증식이 억제됨을 확인하였고, 이들 저해제를 셀레늄과 병행 처리하였을 때 셀레늄의 세포증식 억제효과가 더 높게 나타남을 확인하였다. 최근 연구들에서 셀레늄이 PI3K/Akt 신호경로를 저해한다고 보고되었으며, 혈관내피세포에서 셀레늄을 처리하였을 때 COX-2의 발현이 저해된다고 보고되었다. 또한 간세포의 간암형성에 있어서 Akt와 COX-2 신호경로의 활성이 매우 중요한 역할을 하고 있다고 보고되었고, COX-2의 upstream으로 Akt와 ERK가 작용할 수 있다고 보고되었다. 이러한 선행연구 및 본 실험에서 수행한 연구결과를 비교해 보았을 때, 셀레늄을 처리하였을 때 일어나는 HT-29 세포의 증식억제에 p-Akt 및 COX-2의 발현저해가 중요한 역할을 하는 것으로 보여진다.</p><p>Akt siRNA를 이용하여 gene knockdown을 시켰을 때 HT-29 세포의 증식 및 COX-2 신호분자의 발현 조절을 알아보기 위하여 MTT assay 및 Western blotting을 실시하였다. 그 결과 Fig. 6에 나타난 바와 같이 셀레늄을 처리하였을 때 con-trol군에 비하여 Akt siRNA transfection 군에서 더 강하게 세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다. 선행연구들을 통해 Akt가 COX-2의 upstream으로 작용할 수 있다는 보고에 따라 본 연구에서 Akt siRNA transfection을 통하여 COX-2의 조절 양상을 확인한 결과, Fig. 7에 나타난 바와 같이 Akt siRNA transfection군에서 non-transfection군에 비하여 아무것도 처리하지 않은 none의 COX-2 발현이 더 감소되었을 확인하였으며 Akt siRNA transfection군에 셀레늄 \( 0.5 \mathrm{mM} \)을 처리하였을때 COX-2의 발현이 저해되는 것을 확인하였다. 따라서 앞선 선행연구 및 본 연구결과를 통하여 HT-29 대장암세포의 증식억제효과는 Akt와 COX-2 신호분자의 조절을 통해 일어나며, Akt의 활성억제가 COX-2의 발현 조절에도 영향을 미칠 수있음을 확인할 수 있었다. 최근 연구들에서 HT-29 대장암 세포주에 커큐민을 처리하였을 때 AMP-activated protein kinase(AMPK)가 COX-2를 저해한다는 것이 보고되었으며, 셀레늄을 처리하였을 때 Akt의 저해는 AMPK에 의존적인 경로와 비의존적인 경로 모두를 통하여 일어날 수 있다고 보고되었다. 따라서, 셀레늄에 의한 COX-2의 저해는 Akt의 활성억제를 통해 일어나는 것뿐만 아니라 AMPK와 같은 다른 신호경로들의 조절을 통하여 일어날 수도 있다고 생각된다.</p><p>결론적으로, 본 연구를 통하여 셀레늄이 HT-29 세포의 증식 억제와 apoptosis를 유도하는 것이 밝혀졌으며, 이는 Akt와 COX-2 신호분자의 활성을 저해하는 것을 통해 일어나는 것으로 보인다. 또한 셀레늄에 의한 세포증식 억제효과에 있어서 Akt의 조절이 매우 중요한 역할을 하는 것으로 나타났으며, Akt 신호분자의 저해가 셀레늄에 의한 세포증식 억제 시너지효과를 나타냄을 확인하였다. 그러나 본 연구결과를 통하여 Akt siRNA를 통한 Akt gene의 부재에도 COX-2의 발현이 나타났으며, 이러한 조건에서 셀레늄이 COX-2의 발현을 억제하는 것으로 보아 Akt가 존재하지 않을 때 COX-2의 조절에 있어 어떠한 신호분자들이 작용하는지 향후 진행될 연구과제로 여겨진다.</p>
어떤 경우에 있어서 셀레늄은 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있는가?
산화적 스트레스