<h1>재료 및 방법</h1><h2>Macelignan과 한약재(CTH) 복합물의 준비</h2><p>본 연구에 사용된 인도네시아산 Myristica fragrans Houtt(macelignan)은 연세대 생명공학과 황재관교수 연구실에서 얻었으며, 부산대학교 한의학전문대학원의 조수인교수 연구실에서 Panax ginseng C.A.Meyer (인삼), Pueraria lobata (칡), Dioscorea batatas Decaisne (마), Rehmannia glutinosa (지황) ,Amomum cadamomum Linné (백두구), Poncirus fructus (지실), Evodia officinalis (오수유)을 구입 후 각 한약재를 \(1:1:1:1:1:1:1\)의 비율로 열수 추출하여 동결건조 후 분말화한 것 (CTH, \( 15 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) BW)을 macelignan (\(150 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) BW)과 함께 DMSO에 녹여 사용하였다. 본 연구에 사용된 약용식물들의 voucher specimens는 부산대학교 한의학전문대학원 본초학 연교실에 보관하였다.</p><h2>실험동물 및 사육</h2><p>28마리의 5주령 수컷 C57BL/KsJ-db/db (db/db) 마우스를 (주)오리엔트바이오를 통해 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. db/db 마우스는 2주간 고형식이로 적응시킨 후, 당뇨실험군으로 하여 난괴법에 의해 당뇨대조군(db/db-control), roiglitazone군(db/db-rosi), macelignan군(db/db-Mace), macelignan+CTH군(db/db-Mace+CTH)으로 나누어 3 주간 사육하였다. 사육 기간에는 식이와 물을 자유롭게 먹도록 하였으며 KGLP (비임상시험관리기준)에 근거하여 동물사육실의 환경은 항온 \( \left(20 \pm 2^{\circ} \mathrm{C}\right) \), 항습\( (50 \pm 4 \%) \), 12 시간 간격(08:00-20:00)의 광주기로 일정한 조건을 유지하고 동물들은 polycarbonate cage에 한 마리씩 분리하여 사육하였다. 본 실험에 사용한 기본식이는 AIN-76 semi-synthetic diet 의 식이조성으로 만들어진 고형식이를 (주)중앙실험동물에서 구입하여 사육기간에 냉장 보관하여 급여하였으며, 본 연구에 사용된 rosiglitazone, macelignan과 CTH는 각각 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) BW, \( 15 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) BW, 그리고 macelignan (\( 15 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) BW)과 CTH (\( 150 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) BW)를 같이 섞어 3주간 경구 투여한 후에 희생하였다. 본 연구는 부산대 동물실험윤리위원회의 감독하에 진행되었다.</p><h2>시료 채취</h2><p>사육이 끝난 실험동물은 희생 전 12 시간 동안 절식시킨 후 에테르를 흡입시켜 마취시킨 다음, 복부 하대정맥(inferior vena cava)으로부터 공복혈액을 채취하였다. 실험동물의 장기 조직은 혈액채취 후 즉시 적출하여 PBS (phosphate buffered saline) 용액으로 수차례 헹군 후 표면의 수분을 제거하여 칭량하였으며, 즉시 액체질소로 급냉시켜 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p><h2>공복혈당, 당화혈색소 \( (\mathrm{HbA1c}) \) 측정 및 혈장 분석</h2><p>실험기간에 6 일마다 1 회 12 시간 공복시킨 후에 그 혈당을 실험 동물의 꼬리를 자른 후 얻은 정맥혈을 이용하여 측정하였다. 이때, Glucometer (GlucoDr, Allmedicus, Anyang, Gyeonggi-do, Korea) 를 사용하였다. 당화혈색소( \( \mathrm{HbA1c}) \) 의 경우 희생 후 전혈을 이용하여 MicroMatTM II Hemoglobin \( \mathrm{A}_{1 c} \) Tes (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)로 측정하였다. 희생 후 전혈을 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 1,000 \times g \) 에서 15 분간 원심분리 후 혈장을 얻었으며, 분리된 혈장으로 insulin, glucagon, C-peptide (Mouse ELISA Kit, ALPCO Diagnostics, Salem, NH, USA)를 EILSA kit을 이용하여 측정하였다.</p><p>이 밖에도 혈장으로부터 total cholesterol, HDL-cholester-ol, triglyceride 함량을 아산제약(주)의 kit로 측정하였으며, free fatty acids 농도는 Wako Chemicals USA Inc. (Richmond, VA, USA)로부터 kit를 구입하여 측정하였다.</p><h2>내당능(intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT)) 검사 및 인슐린 민감도(intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT) 측정</h2><p>실험기간 중 희생 전에 실험동물을 대상으로 내당능 및 인슐린 민감도 검사를 실시하였다. 먼저, 내당능 검사는 실험동물을 12 시간 공복시킨 후 glucose \( (0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{kg} \) BW)를 복강주사하고 0,30,60,120분마다 실험동물의 꼬리 정맥혈을 이용하여 혈당을 측정하였다. 2일 후, 인슐린 민감도를 알아 보기 위해, 다시 12시간 공복시킨 후 insulin ( \( 2 \mathrm{unit} / \mathrm{kg} \) BW) 을 복강 주사 하여 0,30,60,90분 동안의 혈당 변화를 살펴 보았다.</p><h2>통계처리</h2><p>실험결과는 SPSS package 프로그램(SPSS Inc., Chicago, IL, USA, \( 11.5 \) version)을 이용하여 실험군당 평균 \( \pm \) 표준오차로 표시하였고, 각 군간 평균치의 통계적 유의성 검정은 one-way ANOVA를 실시하고 다군간의 차이는 \( \mathrm{p}<0.05 \) 수준에서 Duncan's multiple test로 사후 검정하였다.</p>
내당능 검사에서 실험동물의 복강에 어떤 물질을 주입하는 거야?
glucose