<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료 및 조직 추출액의 준비</h2><p>경골어류 농어목 가물치과 가물치(Perciformes Channidae Channa argus) 는 판매상에서 구입하여 얼음에 채워 실험실로 운반하였다. 골격근, 심장, 신장, 눈, 뇌 및 간 조직을 때어내어 혈액을 충분히 제거한 다음, \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( \left(\mathrm{pH} 6.85,4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 를 2 배 \( (\mathrm{v} / \mathrm{w}) \) 가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 를 유지시키면서 glass homogenizer로 파쇄하였다. 조직 파쇄액은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), \(20,000\times g \) 에서 1시간씩 2회 원심분리(Mega 17R, Hanil)하였으며 상등액을 시료로 사용하였다.</p><h2>LDH 와 CS의 활성 측정 및 단백질 정량</h2><p>LDH의 활성은 \( 1.50 \mathrm{mM} \) 피루브산과 \( 0.14 \mathrm{mM}\) NADH 를 포함한 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.85) \( 3 \mathrm{ml} \) 에 시료를 가한 다음 NAD 로 부터 \( \mathrm{NAD}^{+} \)로 산화되는 정도를 분광광도계(Shimadzu UV- \( 160 \mathrm{~A}) \) 를 사용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 340 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 활성의 단위(\(unit\))는 1 분 동안 기질 \( 1 \mu \mathrm{M} \) 을 전환시키는 효소의 양으로, millimolar extinction coefficient\( 6.22 \) 를 사용하였다. CS의 활성은 \( 0.2 \mathrm{mM} \) acetyl-CoA, \( 0.1 \)\( \mathrm{mM} \) DTNB[5,5'-dithiobis(2 -nitrobenzoic acid)], \( 0.5 \mathrm{mM} \) oxaloacetic acid를 포함한 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris- HCl buffer ( \( \mathrm{pH} 7.5) 3 \mathrm{ml} \) 에 시료를 가한 후, DTNB가 전환되는 정도를 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 412 \mathrm{~nm} \) 에서 분광광도계에서 측정하였다. 활성의 단위(\(unit\))는 1 분 동안 기질 \( 1 \mu \mathrm{M} \) 을 전환시키는 효소의 양으로 millimolar extinction coefficient 13.6을 사용하여 계산하였다. 단백질은 BSA를 표준단백질로 사용하여 분광광도계로 \( 595 \mathrm{~nm} \) 에서 Bradford 의 방법에 따라 정량하였고, LDH 의 특이활성도는 단백질 양에 대한 효소의 활성(\(units/mg\))으로 나타냈다.</p><h2>Native-polyacrylamide gel 전기영동: Western blotting 및 면역침강반응</h2><p>가물치 조직의 LDH 동위효소를 확인하고, Western blotting 및 면역침강반응 후 동위효소를 확인하기 위하여 native-polyacrylamide gel 전기영동(native-PAGE)을 실시하였다. Native- PAGE는 polyacrylamide vertical slab system (SE 250, Hoefer)으로 thermostatic circ- ulator (CA-1100, EYELA) 를 사용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 로 유지시키면서 실시하였다. Slab gel은 6.5\% acrylamide separation gel 및 2.5\% acrylamide stacking gel을 만들었고, 시료에는 sucrose와 bromophenol blue 용액을 1:1\((\mathrm{v/v}\))로 가한 후 \( 5 \mathrm{mM} \) Tris-glycine buffer ( \( \mathrm{pH} \) 8.3)를 사용하여 \( 100 \mathrm{~V} \) 에서 20 분간, \( 200 \mathrm{~V} \) 에서 4 시간 전기영동하였다. LDH 는 DL-lactate, NBT, PMS 및 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 혼합한 용액으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 염색한 후, \( 15 \% \) 초산용액에서 고정하였다.</p><p>조직액 및 정제 후 동위효소는 native-PAGE 후 semi-dry transfer system (Trans-blot SD, Bio-Rad)에서 \( 0.015 \mathrm{M} \) Tris-glycine buffer (pH 8.3)를 사용하여 \( 25 \mathrm{~V} \) 에서 30분간 nitrocellulose 막에 전이시켰다. 5\% nonfat skim milk/Tris buffered saline (0.01 M TBS, pH 7.5) 용액에 막을 넣고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응시킨 후, \( 0.05 \% \) tween 20/TBS 용액으로 10 분씩 3회 세척하였다. \( 0.8 \% \) nonfat skim milk/TBS로 희석한 꺽지 \( \mathrm{A}_{4} \) (1: 1,000) , 소 \( B_{4}\) (1: 800), 및 조피볼락 eye-specific \( C_{4}\) (1: 800) 에 대한 항혈청에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 1 \) 시간 반응시킨 후 TBS 용액으로 10 분씩 2회 세척하였다. \( 0.8 \% \) nonfat skim milk/TBS로 희석시킨 토끼 \(\mathrm{IgG}\) 항체 용액 (1: 1,000) 에서 1시간 반응시키고 TBS 용액으로 10 분씩 3회 세척한 후 chloronaphtol과 \(\mathrm{H}_{2}\mathrm{O}_{2}\) 의 혼합액으로 반응시키고 증류수로 세척한 후 확인하였다.</p><p>골격근, 심장, 눈, 뇌 및 간 조직액에 LDH \(\mathrm{A}_{4}\), LDH \(\mathrm{B}_{4}\), 및 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 에 대한 항혈청을 각각 1:0.5, \( 1: 1,1: 2(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 가하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 시간 면역침강반응 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 15,000 \times g \) 에서 원심분리하였으며, 상등액을 native-PAGE하여 항원-항체 복합체를 이루지 않은 동위효소를 확인하였다.</p>
어떤 가물치를 판매상에서 구입하였는가?
경골어류 농어목 가물치과 가물치