<h1>재료 및 방법</h1><h2>추출물의 제조</h2><p>본 연구의 실험에 사용된 허브 소재는 (주)제주 우다(제주도, 서귀포시)에서 재배하였고, 추출 방법은 \( 70 \% \) 에탄올을 사용하여 \(3\)회 추출 하였으며 \(1\)일 동안 추출한 내용물을 여과지에 여과한 다음 evaporator (EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 \(40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 증발 시킨 다음 동결 건조기(HY Science, Incheon, Korea)에서 동결 건조하여 추출물을 제공 받았다. 동결 건조 된 추출물은 dimethyl sulfoxide에 \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \)로 용해 한 후 \( 0.20 ~\mu \mathrm{m} \) syringe filter로 여과하여 농도에 맞게 희석하여 사용하였다.</p><h2>세포 배양</h2><p>HacaT cell 한국 세포 주 은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받았으며, \( 1 \% \) penicillin-streptomycin과 \( 10 \%\) FBS를 포함하는 DMEM (Welgen, Seoul, Korea)배지를 사용하였다. 세포는 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \)의 환경에서 배양하였다.</p><h2>Cell viability 측정</h2><p>세포 생존율 측정은 MTT assay를 사용하여 측정하였다. \(96 \) well plate에 \( 1 \times 10^{4} \) cells/well의 HacaT 세포를 분주하고 \(24 \)시간 이상 안정화 단계를 거쳤다. 세포 안정화가 끝난 다음 성장 배지를 제거하고 혈청이 제거된 배지에 시료를 농도 별 (\( 0\), \(10\), \(20 \), \( 50\), \(100\), \(200\), \(500\), \(1000 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)로 희석하여 \(18\)시간 동안 처리 한 다음 각 well당 \( 10 ~\mu \mathrm{L} \)의 MTT solution을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 \(30 \)분에서 최대 \(2 \)시간 동안 반응시킨 후, microplate reader를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 시료를 처리하지 않은 well에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시 하였다.</p><h2>RT-PCR</h2><p>HacaT cell에 시료를 농도별 처리하고 \(24\)시간 배양한 후에 DPBS로 \(3\)회 이상 세척 하였다. UVB \( 20 \mathrm{~mJ} / \mathrm{cm}^{2} \)를 조사하고 시험 농도로 희석된 시료와 함께 \(24\) 시간을 배양하였다. 세포를 회수한 후 RNA-bee (AMS Biotechnology (Europe) Limited. Abingdon, UK)로 RNA를 분리하였다. RNA \( 5 ~\mu \mathrm{g} \) 정량하여 일반적인 cDNA 합성 방법에 따라 합성하였다. PCR-pre mix kit (Bioneer, Daejeon Korea)을 사용하여 제조사의 권고에 따라 RT-PCR 실험을 수행 하였다.</p><h2>Western blot</h2><p>RT-PCR 시험 방법과 동일한 조건에서 세포를 배양 및 시료를 처리 하였다. 세포를 회수한 후 RIPA buffer에(Biosesang, Seongnam-si, Korea) 균질화하고 얼음에 \(30 \)분간 두었다가 \( 1.5 \mathrm{~mL} \) tube에 담아 \( 15,000 \mathrm{~rpm} \)), \(4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(20 \)분간 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 이 상층액에서 단백질을 정량하기 위해 Bradford Reagent (Biosesang, Seongnam-si, Korea)를 사용하였는데 BSA를 표준으로 하여 제조사가 권장하는 방법으로 실시하여 \( 650 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정해 각 sample들의 단백질 농도를 구하였다. 이후 각 sample당 \( 40 ~\mu \mathrm{g} \)의 단백질을 취해 \( 10 \% \) SDS-PAGE로 \( 100 \mathrm{~V} \)에서 전기 영동을 실시하고 분리된 단백질들을 \( 300 \mathrm{~mA} \)에서 \(2 \)시간 동안 nitrocellulose membrane (BioRad Laboratories, CA, USA)에 옮겼다. 이후 membrane을 \( 5 \% \) 탈지분유와 \( 0.05 \% \) Tween-\(20\)을 포함하는 TBT-T 용액에 실온에서 \(1 \)시간 blocking한 후 \(1\)차 antibody (MMP-\(1\), ERK\(1/2 \), p\(38\), JNK, IKK, NFkb-\(65\), GAPDH) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 처리하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight 시켰다. 이후 TBS-T로 세척 후 anti-rabbit, anti-goat \(2\)차 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 \(1:1000\)으로 희석하여 실온에서 \(2\)시간 동안 membrane과 반응시키고 세척 후 ECL chemiluminescence reagents (Amersham Pharmacia biotech, Bensalem, PA, USA) 로 \(1\)분간 반응시킨 후 Chemiluminesence (Vilber, Eberhardzell, Germany) 사용하여 단백질 발현양을 측정하였다.</p><h2>MMP-\(1\) 단백질의 정량적 평가(ELISA)</h2><p>단백질 발현 및 유전자 발현 분석과 동일한 전처리 과정을 통해 HacaT cell을 \(6\)-well에 \( 1 \times 10^{6} \mathrm{~cell} / \mathrm{well} \)로 분주하고, 시료를 농도 별로 처리 하였다. \(72 \)시간 배양한 후에 상층액을 \( 1.5 \mathrm{~mL} \) tube에 담아 \( 15,000 \mathrm{~rpm}\), \(4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(20 \)분간 원심분리하여 얻었다. 이후 MMP-\(1\) (R\(\&\)D system, Minneapolis, MN, USA) ELISA kit을 이용하여 제조사의 권장 시험 방법에 따라 시료에 대한 MMP-\(1 \)의 정량적 평가를 수행하였다.</p>
본 연구의 실험에 사용된 허브는 어디에서 재배한 것인가?
제주도, 서귀포시