<h2>연골세포의 배양</h2><p>연골세포의 매양은 trypan blue를 이용하여 생체염색을 실시하고 살아있는 세포수를 hemocytometer로 측정하여 \( \mathrm{cm}^{2} \) 당 대략 3000 개의 세포가 되도록 조절하여 Ham F12 Medium내에는 \(10\%\) Fetal calf serum, Pericillin \( (100 \mathrm{U} / \mathrm{m} \ell \))-Streptomycin\( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \ell, \mathrm{Gibco} \) BRL), Ascorbic acid (50\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \ell \) (Sigma, St. Louis, MO, USA), Gentamycin, Kanamycin을 첨가하여 제조한 배양액을 25\( \mathrm{cm}^{2} \) 배양용기에 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 배양을 실시하였다. 배양 6일째 배양 용기에 세포가 가득차면 \( 0.05 \% \) Trypsin-\( 0.53 \mathrm{mM} \) EDTA(Gibco BRL)로 처리하여 배양용기에서 세포를 분리한 후 hemocytometer로 세포수를 측정한 다음 \( \mathrm{cm}^{2} \) 당 약 3000개의 세포를 \(35\mathrm{mm}\) petridish에 분주하고 2일마다 성장배지를 교환하였다.</p><p>Type Ⅱ와 Ⅳ collagen (\( 1 \mathrm{mg} / \) 배양액 \( \mathrm{m\ell} \)당)을 배지에 첨가하였을 때 배양 상태를 알아보기 위하여 연골세포수가 가장 많이 증가한 상태의 세포를 분리하여 저밀도(300 세포 \(/35\mathrm{mm}\) petridish)로 collagen 첨가배지에서 배양하였다.</p><h2>연골세포의 동결보존 후 해동</h2><p>연골세포의 동결보존시 형태학적인 변형을 알아보기 위하여 엑체질소 탱크 내에서 30 일간 보관한 후 해동하여 배양하였다. 동결보존은 완전 포화기 직전인 배양 18 일째 연골세포를 택하여 트립신으로 분리한 세포를 원심분리하여 트립신을 제거한다. 세포의 개수를 5000 개\(/ \mathrm{m} \ell \)가 되도록 부유액을 만들고 DMSO (dimethylsulfoxide)를 \(15\%\)가 되도록 온수에 녹여 얼음 속에서 미리 차갑게 해두었다가 \( 15 \% \)DMSO와 세포부유액을 동랑 혼합하고 얼음속에다 10분-15분간 두어 온도를 내렸다. 세포동결튜브에 \( 1 \mathrm{~m} \)씩 4개의 튜브에 분주한 다음 스티로폼상자에 세포동결튜브를 놓고 영하 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) Deep Freezer에서 하룻밤(최소 3시간이상) 보존한 후 세포동결튜브는 액체질소 탱크에 30일간 보관하였다. 동결세포의 해동(급속해동)은 세포동결튜브를 액체질소 속에서 꺼낸 후 즉시 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 물 속에서 녹였다. 1\( \mathrm{m} \ell \) 당 \(10 \mathrm{m} \ell \)의 배양배지를 넣어 희석시켜 2-3회 원심분리한 후 상등액은 버린다. 세포표본은 \(0.9 \mathrm{m} \ell \)의 PBS에 부유시키고 trypan blue용액 \(0.1 \mathrm{m} \ell \)를 가하여 염색한 후 세포의 생존율을 검사하였다. 가라앉은 침전세포를 배양배지에 부어서 배양하였다.</p>
배양을 실시한 환경은 어떻게 돼?
\( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) 배양기