<h1>결과 및 고찰</h1><p>본 연구에서는 과피와 과육에서 안토시아닌의 축적이 뚜렷하게 다른 포도를 모델로 이용하여, ufgt 유전자의 발현이 증가하거나 감소하였을 때 안토시아닌 함량이 변하는지를 실험하고자 하였다. 이를 위해 우선 개화 이후 13주가 지난 거봉 포도(Vitis vinifera L. X Vitis labrusca L. cV Kyhoho)의 과피로부터 total RNA를 추출하고 이로부터 RT-PCR을 수행하여 ufgt cDNA를 얻었다. RT-PCR을 위해, 기존에 보고된 포도 ufgt 유전자의 염기서열을 분석하여, open reading frame의 시작 및 끝 부위로부터 PCR 프라이머를 구상하여 제조하였다. 거봉 포도로부터 분리한 ufgt cDNA의 염기서열은 기존에 보고된 포도(Vitis vinifera L.)의 ufgt 유전자(AB047099)와 비교하여 \( 99.2 \% \) 동일하였다(data not shown). 분리한 거봉 포도 ufgt 유전자를 sense 및 antisense 방향으로 벡터에 넣어 야생형 담배를 형질 전환시켰다. 유전자가 도입된 담배 형질 전환체를 선발한 다음, 각각의 형질전환체 내에서 ufgt 유전자의 발현 양을 RT-PCR로 분석하였다. 이를 위해 거봉 포도 ufgt cDNA의 염기서열을 바탕으로 프라이머를 제작하였다. RT-PCR 분석 결과, 형질전환체에서 ufgt 유전자의 발현양이 야생형 담배에 비해 눈에 띄게 달라졌다. 먼저 포도 ufgt 유전자가 sense 방향으로 들어간 sense 형질전환체(TWUS)에서는 전체적으로 ufgt 발현 양이 많았는데 비해, antisense 방향으로 들어간 antisense 형질전환체(TWUA)에서는 ufgt 발현이 거의 검출되지 않았다. 야생형 담배에서도 ufgt 유전자가 약하게 증폭되었으나, sense 형질전환체에 비하면 ufgt유전자의 발현이 월등히 적었다. 그러나 담배 형질전환체 및 야생형 담배를 분석하기 위해 사용한 프라이머가 담배 ufgt 유전자에 특이적인 것이 아니기 때문에, RT-PCR 실험으로 야생형 담배 내 ufgt 유전자의 발현을 정확히 측정했다고는 볼 수 없다. 즉 실험에 사용된 프라이머로 증폭되지 않은 ufgt 전사체가 존재할 가능성도 충분히 있다고 사료된다. 한편 ufgt 유전자의 발현 양에 따른 형질전환체의 표현형을 비교하였다. 식물 생장 속도 및 잎, 줄기 등의 색깔이나 크기는 야생형 담배와 비교하여 거의 차이가 없었다(data not shown). 그리고 안토시아닌의 축적 여부를 확인하기 위해 꽃 색깔을 비교하였다. Sense construct가 들어간 형질전환체 중에서도, 특히 TWUS2003과 TWUS2005에서 야생형 담배에 비해 꽃 색깔이 조금 더 진한 분홍색을 띠었다. 그러나 antisense construct가 들어간 형질전환체에서는 야생형 담배와 비교하여 꽃 색깔이 거의 차이가 없었다. 이러한 결과는 RT-PCR 실험에서 ufgt 유전자의 발현 양이 야생형 담배와 antisense 형질전환체에서 확연하게 차이 나는 것과는 대조적이다.</p><p>꽃의 안토시아닌 함량에 변화가 없는지 확인하기 위해, 각각의 형질전환체와 야생형 담배의 꽃에서 안토시아닌 함량을 측정하였다. 실험 결과, sense 형질전환체(TWUS)에서 안토시아닌 함량이 야생 담배에 비해 \( 30 \sim 44 \% \) 정도 증가하였 다. 반면, antisense 형질전환체(TWUA) 내 안토시아닌 함량은 야생형 담배에 비해 \( 88 \% \) 정도 감소하였다. TWUS 형질전환체에서는 RT-PCR, 안토시아닌 분석, 그리고 꽃 색깔 관찰 등을 통해 외부에서 도입된 포도의 ufgt 유전자가 담배의 안토시아닌 축적에 관여하여 꽃 색깔을 더 짙게 만들었을 것으로 추정 된다. 결론적으로, 담배 형질전환체에서 ufgt 유전자의 발현 양을 조절함으로써 안토시아닌 축적을 변화시킬 수 있음을 확인하였다. 하지만, TWUA 형질전환체에서는 RT-PCR 결과 와 안토시아닌 함량의 결과가 일치하는데 반해, 꽃 색깔은 예상과 다르게 나왔다. 즉, ufgt 발현 양과 안토시아닌 함량이 매우 적은 것에 비해 꽃 색깔은 거의 변화가 없었다. 이러한 결과가 나온 이유로는 다음과 같은 두 가지를 생각해 볼 수 있다. 첫째, 본 연구에서 RT-PCR 실험에 사용된 프라이머의 특이성을 들 수 있다. 담배에는 EST fragment를 포함하여 총 11 개의 putative ufgt 유전자(AM784928, EH621643, FS406409, EB694038, AM780771, FG167598, AB072918, TC52675, TC58274, TC47227, TC50160)가 보고되어 있다. 이들 ufgt 유전자 중에서 해당 부위의 염기서열이 알려진 6개(AB072918, TC52675, TC58274, TC47227, TC50160)만을 골라, 본 연구에서 사용된 프라이머와 비교하였을 때, 유사성이 forward 프라이머는 최대 \( 75 \% \), reverse 프라이머는 최대 \( 60 \% \)에 불과하였다(data not shown). 즉, 실험에서 사용된 프라이머가 담배의 모든 ufgt 유전자를 증폭하지는 못했을 가능성이 있다. 또한 담배와 거봉 포도의 ufgt 유전자의 염기서열 상 차이는 도입된 포도의 antisense ufgt cDNA가 담배가 가지고 있는 본래의 ufgt유전자의 발현을 완전히 제어하지 못했음을 의미하며, 이에 따라 담배의 꽃 색깔에도 큰 영향을 주지 않았을 것으로 추정된다. 둘째, 안토시아닌 뿐만 아니라, 비배당체인 안토시아니딘이 색깔을 나타냈을 가능성이다. 즉 ufgt 유전자가 암호화하는 UFGT 효소는 안토시아니딘을 배당체인 안토시아닌으로 변환시키는 기능을 가지는데, ufgt 유전자가 발현되지 않더라도 축적된 안 토시아니딘이 여전히 색깔을 가질 가능성이 있다는 것이다. Arabidopsis에서 ufgt 유전자 중의 하나인 UGT78D2에 돌연변이가 일어나도 표현형에는 큰 변화를 주지 않았다는 보고가 있다. 이 논문에 의하면 개화기 때, 야생형 Arabidopsis에 비해 줄기의 아래 부분에서만 약간 색이 옅어졌을 뿐이며, 이러한 결과가 나온 이유로 안토시아닌 뿐만 아니라 안토시아니딘도 색깔을 나타내기 때문이라고 설명되었다. 또 다른 논문에 의하면, cyanidin에서 cyanidin-3-glucoside 변환 단계에 UFGT가 관여하는데, cyanidin을 epicatechin으로 변환하는 anthocyanidin reductase (ANR) 유전자를 overexpression 시켰을 때 담배의 꽃 색깔이 옅어졌다. 이와 유사하게 본 실험의 TWUA 형질전환체에서도 도입된 포도의 antisense ufgt cDNA가 담배의 모든 ufgt 유전자의 발현을 억제하였음에도 불구하고 안토시아닌으로 변환되지 않은 안토시아니딘에 의해 색깔이 그대로 표현되었을 가능성이 있다. 이러한 추정들은 앞으로 추가적인 연구를 통해 보다 명확히 밝혀질 것으로 사료된다.</p>
본 연구에서 ufgt 유전자의 발현이 증가하거나 감소하였을 때 안토시아닌 함량의 변화를 연구하기 위해 개화 13주가 지난 거봉 포도의 과피로부터 추출하여 얻은 것은?
ufgt cDNA