<h2>오일 에멀션 양의 영향</h2><p>혼합 용액을 sonication 함으로써 형광의 변화는 안정되었지만 2 unit의 비교적 낮은 lipase 활성에서도 30 분 동안의 형광 변화가 직선으로 나타나지 않고 시간이 지나면서 변화 속도가 점점 느려지는 것을 볼 수 있다. 이와 같이 시간에 따른 형광의 변화가 직선으로 나타나지 않은 이유로는 기질의 소모, 생성물에 의한 효소 활성 억제, 효소의 불안정성, \( \mathrm{pH} \) 변화에 의한 assay 조건의 변화 등을 들 수 있다. 그러나 이 실험에 사용한 C. rugosa lipase는 \( \mathrm{pH} \) 6-7의 범위에서 활성에 큰 영향을 받지 않는 효소로 알려져 있다. 따라서 우리는 반응용액에서 기질로 사용된 올리브 오일의 농도만 \( 0.4 \% \) 와 \( 1 \% \) 로 각각 증가시키고 10 unit의 li-pase를 더하여 시간에 따른 형광 변화를 측정하였다. 그 결과 \( 1 \% \) 의 올리브 오일 농도에서 30 분간 형광 변화가 직선으로 유지되는 것을 관찰할 수 있었다. 반면에 \( 0.4 \% \) 에서는 약 15 분 이후부터 형광 변화폭이 점점 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 이후 실험에서는 올리브 오일의 농도를 \( 1 \% \) 로 하여 표준 활성 측정 방법을 정하였다.</p><h2>반응 용액 \( \mathrm{pH} \) 의 영향</h2><p>다음으로 표준 방법에 의해 서로 다른 \( \mathrm{pH} \) 에서 lipase 활성을 측정할 수 있는지 확인하기 위해 \( \mathrm{pH} \) 만 6.0과 7.0 그리고 8.0으로 다르게 조정한 세 종류의 혼합 용액을 만들었다. 그리고 각 \( \mathrm{pH} \) 마다 lipase를 0,2,4,6,8,10 unit 씩 더한 여섯 종류의 반응 용액을 만들어 시간에 따른 주파수 변화를 관찰하였다. 그 결과 \( \mathrm{pH} \) 6.0과 7.0에서는 모든 lipase 농도에 서 직선의 형광 변화가 관찰되었으며 직선의 기울기는 효소의 양에 비례하여 증가하였다. 반면에 \( \mathrm{pH} 8.0 \) 에 서는 효소의 양이 2unit으로 낮은 반응 용액의 형광 변화가 효소를 포함하지 않는 blank 보다 더 낮게 나타났다.</p><p>그 이유는 분명하게 알 수 없지만 염기성 \( \mathrm{pH} \) 에서는 염기에 의한 TAG의 가수분해 속도가 빨라지는 반면 lipase 활성은 약간 낮아지기 때문에 이러한 역전현상이 나타날 수 있을 것으로 추측된다. C. rugosa lipase 가운데 활성이 높은 Lip3 isoenzyme의 경우 \( \mathrm{pH} 8.0\)에서 활성이 약 \( 20 \% \) 정도 감소하는 것으로 알려져 있다, 특히 이거한 역전현상은 기질의 농도가 높고 효소의 농도가 낮을 경우 더 심해질 수 있다. 왜냐하면 효소에 비해 기질의 농도가 훨씬 높은 상황에서는 효소가 이미 포화되어 기질의 농도가 더 높아져도 효소에 의한 반응속도에는 차이가 없는 반면 염기에 의한 가수분해 속도는 증가하기 때문이다.</p><p>따라서 \( \mathrm{pH} 8.0 \) 의 조건에서 기질 인 올리브 오일의 농도를 \( 0.25 \%, 0.4 \%, 0.5 \%, 0.75 \% \) 로 변화시킨 반응 용액을 만들어 형광변화를 관찰하였다. 그 결과 \( 0.4 \% \) 까지 낮아졌을 때 형광의 세기가 효소의 농도에 비레하여 변하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 기질의 농도가 이와 같이 낮아진 조건에서는 시간에 따른 형광 변화 그래프가 30 분까지 직선을 유지하지 못하기 때문에 10 분까지의 측정 데이터로 기울기를 구하였다.</p>
이후 실험에서 \( 1 \% \)의 올리브 오일은 어떤 방법의 기준이 되었나?
표준 활성 측정 방법