<h1>재료 및 방법</h1><h2>대상</h2><p>2010년 9월부터 2011년 3월까지 한양대학교에서 수술이 행해진 골관절염, 류마티스 관절염 환자들의 활막 조직을 채취하여 본 연구에 사용하였다. 환자의 동의와 한양대학교 및 병원 윤리위원회의 심의를 거쳐 실험이 진행되었으며, 채취한 활막 조직은 \( 10 \% \) 중성 포르말린으로 고정시킨 후 블록제작에 이용되었다. 본 연구는 골관절염 환자 8명과 류마티스 관절염 환자 5명의 활막조직을 사용하였다.</p><h2>H\(\&\)E 염색</h2><p>포르말린으로 고정한 활막 조직을 흐르는 물에 충분히 수세한 후 저농도에서 고농도의 에탄올로 탈수시킨다. 자일렌으로 투명화 과정을 거친 후 파라핀으로 포매하고 조직 절편기를 이용하여 \( 4 \mu \mathrm{m} \) 두께로 절편을 제작하였다. 이를 슬라이드에 부착한 후 자일렌과 에탄올을 이용하여 파라핀을 제거하였다. Hematoxylin으로 핵염색을 한 후 증류수 등을 이용하여 수세하였으며, eosin을 이용하여 세포질을 염색하였다. 이후 슬라이드를 봉입(mounting) 하여 광학현미경을 이용하여 \( 400 \times \) 배율에서 관찰하였다.</p><h2>면역조직화학염색(immunohistochemistry: IHC)</h2><p>CD68 (Abcam, USA), CD90 (Abcam, USA), PGP9.5 (Millipore, USA)의 마커에 대한 IHC는 UltraVision LP Large Volumn Detection System HRP Polymer 키트를 이용하였다 (Thermo scientific, USA). 절편 슬라이드를 자일렌으로 탈파라핀화 한 후 고농도에서 저농도 알코올 처리 과정을 통하여 활막조직을 수화시켰다. \(\mathrm{pH} 6.0\) citrate buffer에서 고온고압 과정을 통하여 항원노출(antigen retrieval)을 하였으며, 활막 조직내 존재하는 과산화효소 활성을 억제하기 위하여 \( 3 \% \) \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\)/methanol에 처리 하였다. 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 ultra V block reagent로 5분간 반응시켰으며 CD68 (1:50), CD90 (1:100), PGP9.5 (1:100) 항체를 희석하여 상온에서 1시간 30분동안 처리하였다. TBS-T 버퍼로 3회 충분하게 수세한 후 1차 항체 enhancer로 반응시켜 항원과 항체의 반응을 극대화 시켰다. HRP polymer (Thermo scientific, USA)로 2차 항체 반응의 효율성을 높였으며 DAB chromogenic sub-strate를 이용하여 발색 반응을 유도하였다.</p><h2>활막 조직 내 세포 및 활막층의 정량 분석</h2><p>H \(\&\) E 염색 후 광학현미경 관찰을 통하여 여러 군데의 이미지를 얻었다. 저장된 사진파일은 세포 수 측정 등을 위해서 포토샵의 흑백 반전 기능을 이용하였다. 흑백이미지에서 나타난 검은점 하나 하나는 세포로 간주하고, 활막 내막층과 활막 하층으로 나누어 세포의 수와 층을 계수하였다. 활막 내막층의 경우 분포하는 세포를 모두 계수하였으며 세포층의 분석은 서로 엇갈린 배열을 하고 있는 세포들을 하나의 층으로 간주하였다. 내막하층의 경우에는 이미지에서 보여지는 화면에 일정 단위 면적을 정한 뒤 5군데를 임의로 선정하여 계수하였다. 혈관의 수는 H\(\&\)E 이미지를 바탕으로 이미지내에 존재하는 혈관의 수를 계수하여 분석하였다.</p><h2>통계 유의성 검증</h2><p>복수의 실험자에 의한 블라인드 테스트로 세포 계수 등을 반복한 후 Graphpad prism5 프로그램을 이용하여 평균, 표준 편차를 얻었으며 통계적 유의성을 위해 t-test를 시행하였다.</p>
2차 항체반응의 효율성을 높이기위해 무엇을 사용했어?
HRP polymer