<h2>Affinity chromatography와 Preparative PAGE Cells 에 의한 LDH 동위효소들의 정제</h2><p>LDH 동위효소는 affinity chromatography와 Preparative PAGE Cells 에 의해 정제되었다. LDH 는 NADH 와 함께 oxamate-linked Sepharose gel에 가하면 결합된다. 따라서 시료를 가한 후 \( 0.2 \mathrm{mM} \) NADH가 함유된 buffer를 유입하면 LDH 이외의 단백질이 용출되고, \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer를 유입하면 LDH이외의 단백질이 용출되고, \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer를 유입하면 LDH-\( \mathrm{NAD}^{+} \)-피루브산 복합물을 형성하는 정도의 차이로 인해 oxamate에 대한 친화 정도가 다르므로 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소가 용출되었고, 이어 평형 buffer를 유입하면 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소가 용출되었다. 그리고 종에 따라 LDH 역학적 특성의 차이로 인해 정제 양상이 다르므로, 동위효소의 기능은 물론 진화상의 유연관계를 고찰할 수 있다.</p><p>LDH 동위효소들을 정제하기 위해서 골격근, 심장, 눈 및 뇌 조직을 합한 시료를 가한 후 affinity chromatography를 실시하여, 정제 그래프를 작성하였고, 전기영동을 실시하여 동위효소를 확인하였다. \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer를 유입한 후 107분획부터 용출되기 시작하여 108-112(56-64 \( \mathrm{ml}) \) 분획에서 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소가 용출되었고, 113- 121 분획에는 \( \mathrm{A}_{4} \), \( \mathrm{A}_{3} \mathrm{~B}, \mathrm{~A}_{2} \mathrm{~B}_{2} \) 가 함께 용출되었고, 132-138 분획은 LDH 활성은 낮지만 \( \mathrm{A}_{4}, \mathrm{~A}_{2} \mathrm{~B}_{2} \) 와 함께 \( \mathrm{C}_{4} \) 와 \( \mathrm{AC} \) hybrid가 용출되기 시작하여 동위효소가 섞여 용출되었고, 153 분획부터 \( \mathrm{AB}_{3} \) 와 \( \mathrm{C}_{4} \) 가 용출되었으며, 181-195분획에서는 \( \mathrm{B}_{4} \) 만 용출되어, \( \mathrm{A}_{4} \) 와 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소가 정제되었다. 그리고 LDH 동위효소들이 섞인 분획을 모아 농축한 후, Prep Cell을 실시하였다. PAGE하여 LDH를 확인하였으며, 9-15분획에서 eye-specific C \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소만 정제되었고, 22-48분획에서 \( \mathrm{A}_{4} \) 가 정제되고, 111-124 분획에서 \( \mathrm{A}_{3} \mathrm{~B}\), 139-158 분획에서 \( \mathrm{A}_{2} \mathrm{~B}_{2} \) 183-210 분획에서 \( \mathrm{AB}_{3}\), 220-272 분획에서 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소가 각각 정제되었다. 정제된 \( \mathrm{A}_{4} \) 에 \( \mathrm{A}_{4} \)-항혈청, \( \mathrm{B}_{4} \) 에 \( \mathrm{B}_{4} \)-항혈청, 및 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소에 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)-항혈청을 사용하여 Western blotting한 결과 각각 단일 밴드가 확인되어 정제되었음이 확인되었다. 그리고 affinity chromatography와 Prep Cell로 동위효소를 정제한 후 LDH 활성,단백질 정량 및 특이활성을 측정하였으며, affinitychromatography 결과 \( \mathrm{A}_{4}\) \( 732.75 \mathrm{units}\), \( \mathrm{B}_{4} \ 6.50 \mathrm{units}\)를 정제하였고 수득률이 \(81.5\%\)였다. Prep Cell 후 \( \mathrm{A}_{4} 1168.85 \mathrm{units}\), \( \mathrm{A}_{3} \mathrm{~B} \)\( 10.70 \mathrm{ units}\), \( \mathrm{A}_{2} \mathrm{~B}_{2} 14.30 \mathrm{ units}\), \( \mathrm{AB}_{3} 10.70 \mathrm{ units}\), \( \mathrm{C}_{4}\), \(10.80\mathrm{units}\) 가 각각 정제되었다. 그리고 affinity chromatography 과정에서 다른 종의 LDH 동위효소가 용출되는 양상을 보면 \( \mathrm{NAD}^{+} \) 유입 후 고등어 \( \mathrm{A}_{4} \) 는 \(40-56\mathrm{ml}\) , 풀망둑 \( \mathrm{A}_{4} \) 는 \(54-96\mathrm{ml}\)에서 용출되었고 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 도 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소에 인접하여 용출되었다. 꺽지 \( \mathrm{A}_{4} \) 는 \(68-120\mathrm{ml}\)에서 용출되었고, buffer 유입 후 고등어 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 는 \(20-45\mathrm{ml}\), 모래무지 \( \mathrm{A}_{4} \) 는 \( 44-52 \mathrm{ml} \), 칠성장어 LDH \( 46-76 \mathrm{ml} \), 소 \( \mathrm{B}_{4} \) 는 \(66-72\mathrm{ml}\)에서 용출된 것으로 보고되었다. 따라서 본 실험에서 가물치 \( \mathrm{A}_{4} \) 는 \( \mathrm{NAD}^{+} \)유입 후 \(56-64\mathrm{ml}\)l에서 정제되었고, 고등어 \( \mathrm{A}_{4} \) 와 꺽지 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소 사이에서 분리되어 풀망둑과 유사하였으며, buffer 유입 후 용출되는 모래무지 \( \mathrm{A}_{4} \) 와 칠성장어 LDH와는 차이를 나타냈다. Eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 는 \( \mathrm{A}_{4}\) 와 함께 용출되다 \( \mathrm{B}_{4}\)와 용출되므로 \( \mathrm{A}_{4} \) 에 역학적으로 더 유사하다고 볼 수 있으므로, 풀망둑과 유사하였다. 그러므로 면역침강반응 후 전기영동 결과 \( \mathrm{A}_{4} \) 와 \( \mathrm{C}_{4} \) 가 유사하고 \( \mathrm{C}_{4} \) 와 \( \mathrm{B}_{4} \) 가 유사하지 않다는 결과와 일치하였다.</p>
무엇으로 LDH 동위효소를 정제할까?
affinity chromatography와 Preparative PAGE Cells