<h1>재료 및 방법</h1><h2>광감작제 및 광원</h2><p>광감작제로 사용한 photofrin (Axcan Pharma Inc., Canada) 은 멸균된 증류수에 녹여서 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 용액으로 제조한 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 의 냉동실에서 보관하였다. 광원은 광감작제가 최대 광독성능을 나타내는 \( 630 \mathrm{~nm} \) diode laser (Biolitec, Germany)를 사용하였다. \( 1 \mathrm{~cm} \) cylindrical diffuser fiber을 메탈박스 안에 설치하여 단위면적 당 에너지 세기를 \( 0.83 \mathrm{~mW} / \mathrm{cm}^{2} \) 이 되도록 조절하여 15분간 총 \( 7.47 \mathrm{~J} / \mathrm{cm}^{2} \) 의 에너지를 조사하였다.</p><h2>세포 배양</h2><p>실험에 사용한 인체 두경부 암세포 주(Human Head and Neck Cell Line)인 AMC-HN3은 서울 아산 병원에서 분양 받았으며, RPMI-1640 (Hyclone, USA)배지에 \(10\%\) fetal bovine serum (Hyclone)과 \( 100 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \) 의 penicillin 및 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 streptomycin (Hyclone)이 포함된 성장배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 가 유지되는 배양기(Thermo Forma, USA)에서 배양하였다.</p><h2>세포 독성능</h2><p>인체 두경부 암세포주에서 genistein과 광역학 치료와의 병행처리에 의한 세포 독성능을 확인하기 위해 MTT assay 를 수행하였다. 지수 성장시기의 세포를 \( 10^{4} \) \( \mathrm{cells} / \mathrm{well} \)이 되게 96 well plate에 분주하고 24 시간 동안 배양한 후 genistein을 \( 25,50,100,200 \mu \mathrm{M} \) 의 농도로 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 이에 광감작제 \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) 100 \mu 1 \) 첨가한 후 2배 희석법으로 처리하여 6시간 동안 배양기에서 배양하고 새로운 배지로 교환 후 \( 630 \mathrm{~nm} \) diode laser로 조사하였다. 24시간 배양 후 \( \mathrm{pH} \ 7.3 \) 의 DPBS에 녹인 MTT (Sigma Chemical Co., USA)용액 \( (2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 을 첨가하고 4 시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 dimethylsulfoxide (DMSO, Japan)를 첨가하여 formazan을 잘 용해시키고 microplate reader (Bio-Rad 550, Bio-Rad, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Hoechst 33342 및 PI 염색</h2><p>핵의 형태학적 변화로 세포사멸을 관찰하기 위해서 고사 세포와 정상세포의 핵을 파랗게 염색하는 Hoechst 33342 (Sigma Chemical Co.)와 괴사세포의 핵을 붉게 염색하는 Propidium Iodide (PI, Sigma Chemical Co.)를 사용하였다. 광역학 치료 후 Hoechst \( 33342(1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 를 첨가하여 30분 동안 반응시킨 후, 배지를 교환하여 PI \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 를 첨가하여 10분 동안 배양한 후 confocal microscopy (Carl Zeiss, Germany)를 이용해 관찰 하였다.</p><h2>General reactive oxygen species 측정</h2><p>\( \mathrm{H}_{2} \mathrm{DCF}-\mathrm{DA} \) (Molecular Probes Inc., USA)형광시약을 사용하여 세포 내에 존재하는 general reactive oxygen species (G-ROS)를 확인하였다. \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{DCF}-\mathrm{DA} \) 는 acetylation에 의해 변한 DCF 자체로는 형광이 없지만 세포내의 ROS와 만나게 되면 형광을 가지는 특성을 가지고 있다. 광역학 치료 후 두경부 암세포를 DPBS로 두세 번 씻어내고, \( 10 \mu \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{DCF}-\mathrm{DA} \) 를 첨가하여 30분 동안 배양 후 flow cytometer BD Biosciences, USA)로 측정하였다.</p>
광감작제로 사용한 photofrin 수용액의 농도는 얼마야?
\( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)