<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주, 플라스미드와 배양조건</h2><p>실험에 사용한 균주와 플라스미드는 Table 1에 나타내었다. Escherichia coli균은 플라스미드의 형질전환을 위한 donor로 사용되었다. B. bronchiseptica의 액체배양을 위해 Luria-Bertani(LB)배지를 사용하였고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 배양하였다. 고체배양은 LB 배지에 \( 1.5 \%\) \((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) agar를 함유하는 평판배지에서 수행하였다. B. bronchiseptica의 야생형의 alcaligin siderphore 생합성 정도를 확인하기 위해서는 Chrome Azurol S (CAS)배지를 사용하였다. 사용된 CAS배지는 Stainer-Scholte (SS) basal medium (sodium glutamate \( 10.72 \mathrm{~g} \), L-proline \( 0.24 \mathrm{~g} \),\( \mathrm{NaCl} 2.50 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 0.50 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{KCl} \) \(0.20 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{MgCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(0.10 \mathrm{g} \), \( \mathrm{CaCl}_{2} 0.02 \mathrm{~g} \), Tris \( \left.1.52 \mathrm{~g} / 1000 \mathrm{ml} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}\right) \) 와 SS vitamins (100배 농축 stock: L-cystine \( 0.4 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(0.1 \mathrm{~g} \), ascorbic acid \( 0.2 \mathrm{~g} \), nicotinamide \( 0.04 \mathrm{~g} \), glutathione \( 1.00 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{ml} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O} \) )을 첨가한 배지로서 자세한 제조법은 선행 연구에서 이용된 방법을 사용하였다. CAS 배지에 사용되는 모든 초자기구들은 \( 4 \mathrm{M} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 로 세척을 한 후 3차 증류수로 세척을 행하여 철 성분을 제거하였다.</p><p>Allelic exchange 방법에 의한 돌연변이주를 구축하기 위해서 \( 5 \% \) sucrose가 첨가된 LB agar 배지를 사용하였고, 실험의 단계에 따라 선택적으로 ampicillin (Ap), tetracycline (Tet), diaminopimelic acid (DAP)을 각각 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(15 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 씩 배지에 첨가하여 사용하였다.</p><h2>유전자 조작</h2><p>유전자 조작은 Sambrook et al.의 방법으로 실시하였다. E. coli로의 형질 전환은 calcium chloride 방법 또는 electroporation법으로 실시하였다. Nucleotide sequencing은 ABI 373 automatic sequencer (PE Applied Biosystems)에 의해 실시되었다.</p><p>B. bronchiseptica의 염색체 DNA를 template로 하여 AccuPower HL PCR premix (Bioneer) \( 20 \mu \mathrm{l} \) 에 첨가하여 PCR을 수행하였다. PCR은 Applied Biosystems (Gene Amp PCR System 2700)를 사용하였고, PCR조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 pre-denaturation시킨 후 denaturation은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분, annealing 은 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분, extension은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분으로 30 cycle을 수행하고 마지막 chain extension을 위해 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7분간 반응하였다. 얻어진 PCR 산물은 TAE \( (40 \mathrm{mM} \) Tris acetate, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \(\mathrm{pH} 8.0\)) buffer를 사용한 \(0.8\%\) agarose gel 상에서 전기영동을 통해 확인하였다. PCR에 사용된 oligonucleotide primers는 Bioneer Co. (Cheongwon, Korea)에서 주문 제작하였고, 사용된 oligonucleotide들의 염기서열은 Table 2에 나타내었다.</p><h2>pHS1과 pHS2의 구축</h2><p>Alcaligin 생합성에 관여하는 alc operon을 함유하고 있는 PCP1.11 플라스미드 DNA를 template로 하여 alcA 부위의 각종 DNA를 증폭시키기 위하여 각 부위에 특이적인 primer(Table 2)들을 제작하였다.</p><p>alcA 결손 돌연변이주를 구축하기 위하여 pCP1.11 플라스미드 DNA를 template로 하여 primer sF와 aR를 이용해서 alcA 의 5'-flanking DNA fragment를 PCR법으로 증폭하였고 얻어진 산물을 pGEM-T easy vector (Promega, USA)에 sub-cloning하고 이를 pHS1이라 명명하였다. 동일한 방법으로 pCP1.11 플라스미드 DNA를 template로 하여 primer s1F와 a1R를 이용해서 alcA의 3'-flanking DNA fragment를 PCR법으로 증폭하여 얻어진 산물을 pGEM-T easy vector (Promega, USA)에 subcloning한 후 제한효소 BamHI 과 SacI 를 처리하여 얻어진 3'-flanking DNA를 동일한 제한효소로 처리된 pHS1 플라스미드에 cloning하여 플라스미드 pHS2을 구축하였다.</p><h2>재조합 플라스미드 pDM1의 구축</h2><p>Allelic exchange 방법에 의한 alcA 유전자 결손 돌연변이 균주를 얻기 위하여 suicide vector인 pDMS197 plasmid를 사용하여 recombinant suicide vector plasmid pDM1을 구축하였다. 제한효소 KpnI과 SacI 으로 처리된 pDMS197 DNA vector에 pHS2를 KpnI / SacI 으로 처리하여 얻어진 5'- 및 3'-flanking을 포함하는 DNA fragment를 ligation한 후 E. coli \(\chi\) 7213으로 형질전환하여 recombinant suicide vector pDM1을 구축하였다.</p><h2>Allelic exchange에 의한 alcaligin siderophore을 생합성하는 유전자의 불활성화 돌연변이체 선발</h2><p>pDM1을 포함하는 E. coli \(\chi\)7213으로부터 수용체인 B. bronchiseptica로 접합에 의해 suicide plasmid를 도입하기 위해 다음과 같이 실시하였다. 분광 광도기를 이용하여 \( 660\mathrm{nm} \) 에서 흡광도 \(0.8\sim1.0\) 정도까지 배양한 후 donor:recipient 를 \(4:1\)의 비율로 하여 \( 12,000 \mathrm{rpm}\), \(4^{\circ} \mathrm{C}\), 5분간 원심분리한 후 pellet을 얻었다. 얻어진 pellet을 LB broth \( 1 \mathrm{ml} \) 에 완전히 resuspension 시킨 후, \( 12,000 \mathrm{rpm}\), \(4^{\circ} \mathrm{C}\), 5분간 원심분리하여 pellet을 얻는 과정을 3회 반복한 후 각각의 pellet을 LB broth \( 30 \mu \mathrm{l} \) 에 녹여 donor와 recipient를 잘 혼합하여 DAP을 함유하는 LB 고체 배지에 접종한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 18시간 배양하여 mating하였다. Single crossover가 이루어진 돌연변이 균주를 tetracycline을 함유하는 LB 액체배지에서 선택배양하여 \(5\%\) sucrose가 첨가된 LB 고체평판배지에 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 정도 도말한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 18 시간 배양하여 선별하였다. Counter-selection을 위해 \(5\%\) sucrose를 함유하는 LB 고체평판배지와 tetracycline을 함유하는 LB 고체평판배지에서 replica method로 균을 toothpicking하여 \(5\%\) sucrose를 함유하는 평판배지에서는 집락을 이루고 tetracycline 배지에서는 생육하지 않는 colony를 선별하였다. 선별된 균의 염색체 DNA를 추출해서 alcA mutant identification primer(Table2)들을 사용하여 PCR 증폭을 실시하였다. 대조군으로 B. bronchiseptica 야생형을 동일한 primer들을 사용하여 DNA의 크기를 비교함으로서 alcA 유전자의 결손여부를 확인하였다.</p><h2>CAS 활성에 의한 alcaligin siderophore의 검출</h2><p>alcA 유전자가 결손된 B. bronchiseptica H1로부터 alcaligin siderophore의 생합성을 검출하기 위해서 CAS agar 배지에 도말을 통한 실험을 실시하였다. CAS agar 배지에는 iron이 결핍된 최소배지 M9을 사용하였고, alcaligin siderophore의 활성도는 clear zone의 생성 여부를 육안으로 관찰하였다.</p><h2>alcA 유전자의 complementation assay</h2><p>pCP1.11 플라스미드 DNA가 가지고 있는 alcA 유전자로부터 complementation primer들인 primer-F와 primer-R를 이용해서 PCR을 실시하여 alcA promoter 부위가 포함된 부위부터 alcA를 완전히 포함하는 DNA fragment를 증폭하였고, 이 PCR 산물을 broad-host 영역 플라스미드인 pRK415 vector에 제한효소 BamHI와 HindⅢ를 처리하여 ligation을 실시하였다. 제작된 재조합 플라스미드의 complementation 능력을 확인하기 위하여 플라스미드를 alcA 결손 돌연변이주에 도입하였다. 플라스미드의 형질전환을 확인하기 위해 tetracycline이 첨가된 LB 고체평판배지에서 선별하였고, alcaligin siderphore의 형성 능력은 CAS 고체평판배지상에서 확인하였다.</p>
Alcalign 생합성에 관여하는 alc operon을 함유하고 있는 것은 무엇이야?
PCP1.11 플라스미드 DNA