<h1>실험재료 및 방법</h1><h2>실험계획 및 실험동물의 사육</h2><p>실험동물을 이유직후 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐(체중 \( 65 \pm 5.0 \mathrm{~g}) \) 를 대한동물실험센터로부터 구입하여 처음 1주일간은 플라스틱 사육상자에 4마리씩 넣어 chow로 예비사육하였다. 적응기간 후 체중에 따라 난괴법(completely randomized design)으로 각 군 당 10 마리씩 세 군(마가린 식이군, 버터 식이군, 옥수수유 식이군)으로 나누어 한 마리씩 사육용 철망 상자 속에 넣고 8주간 해당 식이와 물을 자유급식(ad libitum feeding method)하면서 사육하였다. 사육기간 동안 식수로는 지하수를 공급하였으며, 사육실의 온도는 \( 20 \sim 25 \) \(^{\circ} \mathrm{C} \) 로 실온을 유지하였고, 명암은 12시간 간격으로 점등 및 소등하였다. 흰쥐의 식이 섭취량은 격일로 측정하였고, 체중을 일주일마다 측정하였다.</p><h2>식이 조성</h2><p>본 실험에서는 HP-23(cis/trans FAME) column을 장착한 GC/MS(Autospec, Micromass, U. K.)를 이용하여 trans지방산 조성을 분석하여 trans 지방산의 함량이 \( 25 \% \) 인 식물성 마가린, \( 8.5 \% \) 의 버터, 그리고 대조군으로 trans 지방산이 없는 옥수수유를 식이지방으로 선택하였으며, 그 지방산 조성은 Table 1과 같다. 흰쥐의 체내 지방합성 반응을 촉진시키기 위해 사료 \( 100 \mathrm{~g} \) 에 대해 설탕을 \( 30 \mathrm{~g} \), cho-lesterol을 \( 0.5 \mathrm{~g} \) 씩 식이에 첨가한 각군의 식이 조성은 Table 2 와 같고 식이는 냉동보관하면서 실험동물에게 급여하였다. 마가린은 청정원, 버터는 서울우유, 옥수수유는 동방유지 제품을 사용하였다. 마가린의 표시성분을 고려하여 동일한 식이 조성이 되도록 버터와 옥수수유 섭취군에는 비타민A와 \( \mathrm{NaCl} \) 을 보충하였으며, 에너지 수준이 동일하게 식이(semipurified diet)를 조성하였다. Mineral mixture, vitamin mixture, cellulose, 그리고 DL-methionine은 ICN (Biomedical. Inc, Ohio. USA)제품을 사용하였고, 카제인은 친일상사, 옥수수 전분은 두산, 설탕은 삼양설탕(정제당)을 사용하였다. 콜레스테롤, choline bitartrate, Vitamin A, \( \mathrm{NaCl} \) 은 Sigma(Sigma chemical company, ST. Louis. USA) 제품을 사용하였다.</p><h2>시료수집 및 실험동물의 처리</h2><p>8주간 사육한 실험동물을 희생하기 전 16시간 가량 절식시켜 드라이 아이스를 이용한 호흡기 마취법으로 희생시켰다. 희생 후 개복하여 혈액은 EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid) 처리된 \( 10 \mathrm{cc} \) 주사기를 이용하여 심장과 대동맥궁에서 채혈하였다. 간은 적출하여 \( 0.9 \% \) 생리식염수로 씻은 다음 여과지로 물기를 제거하고 무게를 측정하여 액체 질소에 담근 후, \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하며 실험에 이용하였다. 분변은 희생하기 전 이틀 동안의 분변을 모아 건조하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다가 분석 시에 사용하였다.</p><h2>혈장과 지단백 획분의 분리 및 지질 조성</h2><p>혈액은 \( 3000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리한 후, 상등액은 혈장 총콜레스테롤 및 중성지방의 농도결정을 위하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다. 혈장 지단백 획분은 밀도의 차이를 이용한 sequential floatation ultracentrifugation로 VLDL (\( \mathrm{d}<1.006 \mathrm{~g} / \mathrm{ml}\)), LDL\((\mathrm{d}=1.006-1.063 \mathrm{~g} / \mathrm{ml}) \) 그리고 HDL \((\mathrm{d}= 1.063-1.210\mathrm{g}/\mathrm{ml})\)로 분리하였다.</p><h2>간의 지질 정량</h2><p>간지질 추출은 Folch등의 방법으로 지질을 추출하고 클로로포름으로 \( 25 \mathrm{~mL} \) 이 되도록 정용하여 실험에 사용하였다. 간지질 추출액 중의 콜레스테롤과 중성지방 함량은 혈장중의 분석과 동일한 효소법을 이용하되 탁도에 의한 오차를 줄이기 위해 Sale 등의 방법을 도입하였다. trans 지방산 함량은 methylation 과정을 거치지 않는 Adams 등의 방법을 사용하였다. 즉 추출한 지방을 attenuated total reflection infrared spectroscopy(Bruker IFS 66/FRA 106, Germany)를 사용하여 \( 991 \sim 941 \mathrm{~cm}^{-1} \) 에서 흡광도를 측정하고 면적을 \(\% \)trans 지방산값으로 계산하였다. ATR cell(Ge crystal cell, 수직형)에 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 의 시료를 취하여 분석하였으며, 이때 표준물질로는 triolein에 trielaidin \( 0.5 \sim 50 \% \) 를 첨가하여 검량선을 만들었다.</p><h2>미크로솜 HMG-CoA 환원효소 활성의 측정</h2><p>간 조직에서 미크로솜 획분을 분리하여 콜레스테롤 합성 율속 효소인 HMG-CoA reductase 활성에 미치는 영향을 Shapiro 등과 Hulcher와 Oleson의 방법으로 측정하였다. 간세포는 teflon pestle이 달린 Potter-Elvehjem homogenizer를 이용하여 균질화하고 미크로솜은 차별원심분리법으로 분리하였다. 간으로부터 조제한 미크로솜은 효소활성 측정 직전 가용화하여 \( 1 \mathrm{mM} \) HMG-CoA와 \( 2 \mathrm{mM} \) NADPH 와 혼합하고 \( 350 \mathrm{~nm} \) 에서 시간에 따른 흡광도의 감소를 측정하고 효소의 활성을 \(\mathrm{nmole}/ \mathrm{min}/ \mathrm{mg}\) micro-somal protein으로 표시하였다.</p><h2>분변의 지질 분석</h2><p>건조하여 분말화한 분변을 \( 300 \mathrm{mg} \) 취하고 에테르 \( 60 \mathrm{mL} \) 을 가하여 Soxhlet법으로 지질을 추출한 후, \( 50 \mathrm{~mL} \) 로 적용하여 분석시료로 사용하였다. 분변 중의 중성지방, 콜레스테롤 및 trans 지방산 함량은 간에서와 동일한 방법으로 측정하였다.</p><h2>간 세포막 유동성 측정</h2><p>간의 세포막은 Jorgensen의 방법으로 분리하였으며 세포막의 표지효소(marker enzyme)인 \( \mathrm{Na}^{+}, \mathrm{K}^{+} \)-ATPase활성을 측정하여 분리된 세포막의 타당성을 확인하였다. 세포막의 유동성은 ESR spin labeling 법을 이용하여 측정하였고, spin labeling agent로는 5-doxyl stearic acid(Sigma) 를 \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 에타놀의 농도로 희석하여 사용하였다. \( 100 \mu \mathrm{l} \) 의 5-doxyl stearic acid를 취하여 시험관에 넣고 \( \mathrm{N}_{2} \) gas하에서 얇은 필름으로 만들고 \( 1 \mathrm{~mL} \) 의 세포막 획분을 넣어 흔든 후 \( (37^{\circ} \mathrm{C} \), \(10 \mathrm{min} \)). 분석 전까지 spin reduction을 막기 위해 냉장고에 보관하면서 60분 이내에 측정하였다. ESR은 EMX 300 EPR spectrometer(Bruker,Germany)를 사용하였으며, modulation frequency를 \( 100\mathrm{kHz} \), microwave power는 \( 2 \mathrm{~mW} \), sweep time은 \( 167.77 \mathrm{sec} \), modulation amplitude는 \( 1.0 \mathrm{G} \) 로 하여 측정하였다. 5-doxyl stearic acid의 order parameter value(S)는 outer( \( 2 \mathrm{~T}^{\prime}_{\parallel} \))와 inner \( \left(2 T^{\prime}_{\perp}\right) \)간의 거리를 측정하여 Gaffney의 식에 의해 구하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>실험결과는 평균 \( \pm \) 표준편차로 표시하였으며, 각 군간의 유의성은 one-way ANOVA 로 조사하여 유의성이 발견된 경우, \( \mathrm{p}<0.05 \) 수준에서 Duncan's multiple range test로 사후 검정하였다.</p>
흰쥐의 체중은 언제 측정되는가?
일주일마다