<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포 배양 및 시약 처리</h2><p>본 연구에서 사용한 \( \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) 골격근 세포는 American Type of Culture Collection (ATCC, USA)으로부터 구입하였으며, \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS) (Hyclone, Logan, UT), 100 \( \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) 의 penicillin \( \mathrm{G} \), 그리고 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 의 streptomycin sul-fate (Welgene, KOREA)를 함유하고 있는 Dulbecco's modi-fied Eagle's medium (DMEM) (Welgene, KOREA) 으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 의 환경에서 배양하였다. 세포는 \( 35 \mathrm{~mm} \) plate에 \( 2.5 \times 10^{5} \) 개씩 분주하고 \( 90 \% \) 이상 자라면, 성장배지를 제거하고 2\% horse serum (HS) (Hyclone, Logan, UT)이 함유된 분화 배지로 교체한 뒤 96 시간 동안 분화를 유도하여 myotube를 형성시켰다. IGF-I 처리 농도 및 시간 경과에 따른 SOCS-3 유전자의 단백질 및 mRNA 발현의 변화를 알아보기 위하여 농도(10-100 ng/ml) 및 시간 \( (3,24,48,72 \) 시간)에 따라 IGF-I (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)을 처리하였다.</p><h2>Immunofluorescent staining</h2><p>\( \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) 세포를 PBS로 한번 씻어낸 뒤, plate에 고정시키기 위하여 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 \( 4 \% \) formaldehyde를 상온에서 20 분간 처리한 뒤 TBS로 2번 씻어내고, \( 0.2 \% \) triton X-100을 함유한 TBS \( (0.2 \% \) TBST)로 5 분간 상온에서 permeabilizing하였다. 그 다음 \( 0.1 \% \) TBST로 5 분간 3 번 씻어낸 후 5% BSA를 함유한 \( 0.1 \% \) TBST로 상온에서 1 시간 동안 blocking 하였다. 이후 TBS로 한번 씻어 낸 뒤 3% BSA를 함유한 TBS에 SOCS-3 polyclonal rabbit anti-body (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 1:500으로 회석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 시간 동안 반응시켰다. 그 후, \( 0.1 \% \) TBST로 5 분간 3번 씻어낸 뒤 alexa 488-conjugated goat an-ti-rabbit IgG secondary antibody (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)를 3% BSA에 1:250으로 회석하여 상온에서 20 분간 반응시킨 후 \( 0.1 \% \) TBST로 5 분간 3 번 씻어내었다. 사진은 digital imaging system이 갖춰진 Axiovert 200 fluorescence microscope (Carl Zeiss, Germany)를 사용하여 촬영하였다.</p>
C2C12 세포를 plate에 고정시키기 위하여 무엇을 상온에서 20분간 처리하였는가?
\( 1 \mathrm{ml} \) 의 \( 4 \% \) formaldehyde