<h1>재료 및 방법</h1><h2>동물실험 및 사료조성</h2><p>한국화학연구소에서 구입한 Sprague Dawley계 랫트 (male, \( 160 \pm 10 \mathrm{~g} \) )를 구입하여 본 대학 동물사육실에서 2주동안 예비사육한 다음, 7마리씩 3군으로 나누어 실험용 기본사료(Control group)로써 사육하면서 뽕나무(mulberry :Morus alba L.)의 뽕잎 매탄을 추출물(mulberry leaf extract : MLE)을 각각 100 및 \( 300 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) BW가 되도록 사료에 첨가한 실험그룹(MLE-100 및 MLE-300 group)으로 하여 6주간 사육실험을 행하여 뇌조직의 활성산소의 생성 및 제거효소의 활성에 미치는 영향을 평가했다. 동물사육실은 항온항습 \( \left(22 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} , 65 \pm 2 \% \mathrm{RH}\right) \)하에서 12시간 싸이클(06:00~18 ; 00로 명암이 자동 조절된다.</p><h2>조제사료의 조성</h2><p>본 실험에 사용한 사료조성은 전보에 따라 탄수화물\( 57.8 \%(\alpha \)-corn starch: \( 44.5 \%+ \) sucrose \( 13.3 \%) \), 단백질 \( 16.0 \% \)(sodium-free casein), 지질 \( 18.0 \% \) (lard), 비타민과 무기질(AIN-76 mixture) 각각 \( 1.0 \% \) 및 \( 3.5 \% \), 그리고 섬유질 \( 3.0 \% \),DL-methionine \( 0.3 \% \), choline chloride \( 0.2 \% \)를 첨가하였으며, 여기에 cholesterol \( 0.5 \% \) 및 sodium chloride \( 0.2 \% \) 를 첨가하여 고콜레스테롤혈증을 유도하였다. 실험그룹의 사료조성은 뽕잎 메탄올 추출물(MLE)을 하루에 각각 100 및 \( 300 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) BW가 섭취되도록 \( 0.1 \% \) 및 \( 0.3 \% \)의 MLE를 첨가하는 대신 탄수화물을 각각 \( 0.1 \% \) 및 \( 0.3 \% \)씩 제외하고 조제하였다.</p><h3>뇌세포 획분의 분획</h3><p>뇌세포의 분획은 저자 등의 방법에 따라 균질 완충용액(1.15\% \( \mathrm{KCl} / 10 \mathrm{mM} \) phosphate buffer/ \(5 \mathrm{mM} \) EDTA \( \mathrm{pH} 7.4 \) )을 사용하여 mitochondria, microsome 및 cytosol획분을 분획하여 사용하였다. 이들 획분의 단벡질의 함량은 Lowry 등의 방법에 따라 정량하였다.</p><h3>활성산소의 생성량 측정</h3><ul><li>- 히드록시 라디칼 \( (-\mathrm{OH}) \) 의 함량</li></ul><p>Deoxyribose의 파괴 정도로 hydroxyl radical 생성 정도를 측정하는 방법으로서, 뇌획분의 반응성 산소대사물에 의해deoxyribose가 파괴되어 aldehyde가 생성되며, 이 aldehyde는 산성용액에서 thiobarbituric acid와 반응하여 발색 되는 것을 이용한 Halliwell 등의 방법에 따라 측정하였다.</p><ul><li>수퍼옥시드 라디칼의 측정</li></ul><p>뇌획분중의 수퍼옥시드 라디칼(superoxide radical : \( \mathrm{O}_{2} \) )의 생성량은 McCord와 Fridovch과 Chan과 Bielski의 방법에 따라 superoxide dismutase롤 억제할 수 있는 ferri-cytochrome \( \mathrm{C} \)의 환원속도롤 측정하였다. \( 0.1 \mathrm{mM} \) EDTA를 함유한 인산완충용액( \( \mathrm{pH} 7.8 \) ) \( 50 \mu \mathrm{l} \)에 cyanide의 농도가 \( 50 \mu \mathrm{M} \)이 되도록 \( 20 \mathrm{mM} \) cyanide 용액을 가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10 분간 가온하였다. 이 용액에 cytosol \( 300 \mu \mathrm{l} \)와 \( 0.1 \mathrm{mM} \) cytochrome C \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 넣어 분광광도계를 사용 \( 550 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 시간에 따라 측정하였다. 이때 cytochrome \( \mathrm{C} \)의 양은 분자흡광계수 \( 19,500 \mathrm{M}^{-1} \mathrm{~cm}^{-1} \)로 계산하였다.</p><h2>산화적 스트레스의 분석</h2><ul><li>과산화지질의 정량</li></ul><p>뇌조직중의 과산화지질의 함량은 저자 등이 사용한 방법에 따라 분광광도계를 사용하여 T'BA법으로 말론디알데히드(malondialdehyde : MDA)의 함량을 측정하여 과산화지질(lipid peroxide : LPO)의 함량으로 표시하였다.</p><ul><li>산화단백질의 정량</li></ul><p>뇌획분으로서 mitochondria와 microsome의 산화단백질(oxidized protein : OP)의 생성량은 Levine 등의 방법에 따라 carbonyl group \( (>\mathrm{C}=\mathrm{O}) \)의 생성량을 측정하였다.\( 0.1 \mathrm{ml} \)의 시료에 \( 30 \% \) TCA (trichloroacetic acid)를 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 혼합, \( 3000 \mathrm{rpm} \)에서 10 분간 원심분리한 후 상층액을 제거한 뒤 잔사에 \( 10 \mathrm{mM} \) DNPH (dinitrophenyl hydrazine) \( 0.5 \mathrm{ml} \) 첨가, 15분마다 혼합하며 1시간 동안 실온에 방치후 \( 3000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리하였다.</p><p>상층액을 제거한 후 잔사에 ethanol/ethyl acetate (1:1,\( \mathrm{v} / \mathrm{v}) 3.0 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 실온에서 10 분 방치한다. 다시 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10 분간 원심분리 후 잔사을 얻은 뒤, \( 6 \mathrm{M} \) guanidine ( \( 20 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer, \( \mathrm{pH} 2.3 \) )\( 1.0 \mathrm{ml} \) 첨가.혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 항온 수조에서 15 분간 가온한 후, \( 3,500 \mathrm{rpm} \)에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이때 carbonyl group의 양은 \( 360 \mathrm{~nm} \)와 \( 370 \mathrm{~nm} \)사이에 있는 흡광도의 파장에서 분자흡광계수 \( (E=22,000) \) 를 이용하여 계산하였다.</p>
Sprague Dawley계 랫트 (male, \( 160 \pm 10 \mathrm{~g} \) )를 구입하여 어디에서 예비사육했지?
본 대학 동물사육실