<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주 및 배지</h2><p>본 연구에 사용된 Paenibacillus sp. DG-22는 목재 저장소의 토양에서 분리된 호열성균으로 cellulase 활성이 없으며 세포외로 분비되는 내열성 xylanase와 세포내에 존재하는 \( \beta \)-xylosidase를 생산한다.</p><p>배지는 2x YT 배지 ( \(1.6 \% \) trypton, \( 1.0 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \) \( \mathrm{NaCl}, \mathrm{pH} ~ 7.0 \) )를 기본배지로 하여 필요에 따라 탄소원으로 여러 가지 당을 \( 1.0 \% \) 되게 첨가하여 사용하였다. 배양은 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 18 시간동안 \( 150 ~ \mathrm{rpm} \) 으로 진탕배양하였다.</p><h2>세포내 단백질의 추출</h2><p>세포내 단백질을 분리하기 위하여 균주를 액체배지에서 대수기 말까지 배양한 뒤 원심분리로 세포를 모아 멸균된 생리식염수로 세척한 후 \( 50 ~\mathrm{mM} \) sodium acetate 완충액 (\( \mathrm{pH} ~ 5.5 \))에 현탁시켰다. 초음파분쇄기 (Sonifier 450, Branson ultrasonics, U.S.A.)를 이용하여 세포를 파괴한 뒤 원심분리하여 얻은 상등액을 세포내 조효소액으로 사용하였다.</p><h2>효소의 활성측정 및 단백질 정량</h2><p>\( \beta \)-Xylosidase의 활성은 \( p \)-nitrophenyl-\( \beta \)-D-xylopyranoside (pNPX) 를 기질로 이용하여 효소반응 후 유리되는 \( p \)-nitrophenol의 양을 측정하여 결정하였다. \( 1 ~ \mathrm{mM} \) pNPX, \( 50 ~ \mathrm{mM} \) sodium acetate (\( \mathrm{pH} ~ 5.5 \))와 희석된 조효소로 구성된 \( 0.4 ~\mathrm{ml} \) 의 반응 혼합물을 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 수조에서 10 분간 반응시킨 후 \( 1 ~\mathrm{M} \) sodium carbonate \( \left(\mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3}\right) \) 용액 \( 0.8 ~ \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 효소반응을 중지시킨 뒤 \( 410 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. \( \beta \)-Xylosidase의 활성은 1 분 동안 \( 1 ~ \mu \mathrm{mol} \) 의 \( p \)-nitrophenol을 생성하는 효소량을 \( 1 \mathrm{unit} \)로 계산하였다.</p><p>단백질 함량은 Bio-Rad사 (Hercules, U.S.A)의 protein assay reagent를 사용하여 Bradford 방법에 따라 결정하였고 표준물질로서는 bovine serum albumin (Sigma, St. Louis, U.S.A.)을 사용하였다.</p><h2>탄소원에 따른 균주의 생장과 효소생산</h2><p>탄소원의 종류에 따른 효소 생산성을 알아보기 위해 기본 배지인 2x YT배지에 각 탄소원을 \( 1 \% ( \mathrm{w} / \mathrm{v} ) \) 가 되게 첨가하였다. 탄소원이 첨가되지 않은 2x YT배지에서 하룻밤 자란 배양액을 각각의 배지에 \( 1 \% \) 되게 접종한 후 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 18 시간 배양한 뒤 원심분리로 세포를 회수하여 세포내에 존재하는 효소의 활성을 측정하였다.</p><h2>배양시간에 따른 균주의 생장과 효소의 생산</h2><p>균주의 생장과 효소 생산성과의 관계를 조사하기 위하여 부가 탄소원으로 methyl \( \beta \)-D-xylopyranoside ( \( \beta \)MeXyl \) 를 \( 1.0 \% ( \mathrm{w} / \mathrm{v} ) \)되도록 첨가한 2x YT배지 \( 250 ~ \mathrm{ml} \) 을 포함한 1-liter 플라스크에 미리 2x YT배지에서 배양된 Paenibacillus sp. DG-22 배양액을 \( 1 \% \) 가 되도록 접종하여 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 진탕배양 하면서 매 2 시간마다 \( 10 ~ \mathrm{ml} \) 씩 배양액을 채취하여 균주의 생장과 효소 생산성을 조사하였다. 이때 균주의 생장은 분광광도계 (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech., Sweden)를 사용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 탁도 \( \left(\mathrm{OD}_{600}\right) \) 로 측정하였고, 효소 생산성은 세포 추출물에 존재하는 \( \beta \)-xylosidase의 활성을 측정하여 결정하였다.</p><h2>전기영동 및 활성염색 (zymogram)</h2><p>SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)는 \( 12 \% \) gel을 사용하여 Laemmli의 방법에 따라 수행하였으며 단 Xylosidase의 활성염색은 Rothe의 방법을 변형하여 수행하였다. 즉, 전기영동 후 gel을 \( 50 ~ \mathrm{mM} \) sodium acetate (\( \mathrm{pH} ~ 5.5 \)) 완충액으로 30 분간 2회 세척한 뒤 gel 위에 형광기질인 \( 1 ~ \mathrm{mM} \) 4-methylumbelliferyl-\( \beta \)-D-xylopyranoside ( \( \beta \)MUX )와 \( 50 ~ \mathrm{mM} \) sodium acetate (\( \mathrm{pH} ~ 5.5 \)) 가 포함된 \( 0.8 \% \) agarose gel 을 올려놓고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분간 반응시킨 후 자외선 램프 하에서 관찰하였다.</p>
본 연구에서 폴리아크릴아미드겔 전기영동을 수행하기 위해 사용한 방법은 무엇인가?
Laemmli의 방법