<h1>결과 및 고찰</h1><p>율무 열매 수확 후 남겨진 부산물(부리, 줄기, 잎, 껍질, 미강)의 에탄올 추출물에 대하여 기질인 L-tyrosine과 멜라닌 생성에 중요한 역할을 하는 효소인 mushroom tyrosinase에 의해 산화되어 생성되는 멜라닌의 양을 흡광도로 측정하여 tyrosinase 억제 활성을 측정하는 미백 효능 평가를 3 반복하여 진행하였다. Positive control로 기존에 알려진 미백제인 arbutin을 양성대조군으로 이용하여 각각의 조건별로 준비된 분획물을 평가한 결과 율무근의 활성 억제 농도 \( \mathrm{IC}_{50} \) 결과가 159.3\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 로 양성 대조군인 arbutin \( \left(\mathrm{IC}_{50}=165.3 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}\right) \) 과 비교시 가장 좋은 활성을 나타내었다(Table 1). Tyrosinase 억제 활성이 우수한 건조 율무근에 대하여 70\( \% \) 에탄올 용매로 추출 농축한 추출물의 용매 분획물 \( \left(n\right. \)-hexane, \( \mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2} \), EtoAc, \( n \) - \( \mathrm{BuOH} \) 그리고 물 가용부)의 tyrosinase 저해 활성을 검색한 결과 \( \mathrm{EtOAc} \) 가용부 활성이 가장 우수함을 확인하였다 \( \left(\mathrm{IC}_{50}=86.9 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}\right. \), Table 1). 이에 \( \mathrm{EtOAc} \) 가용 분획물에 대하여 컬럼 크로마토그래피와 preparative HPLC 등을 반복 실시하여 2종의 neolignan (1과 2), 2종의 단순 phenolic (3과 4), 1종의 acetamide (5) 그리고 benzoxazolinone (6) 계열 화합물을 분리, 정제하였다. 분리한 화합물은 1D, 2D NMR 및 MS등의 기기분석 및 문헌과의 비교를 통하여 각각 (+)-icariol \( \mathrm{A}_{2} \) (1) , zhepiresionol (2) , 4-hydroxybenzaldehyde (3) , trans- \( \rho \)-coumaric acid (4), N-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-2-hydroxyacetamide (5), 그리고 coixol (6)로 구조 규명하였으며(Figs. 1, 3), tyrosinase 저해 활성을 통해 화합물 각각의 미백활성을 측정하였다. 이 중에서 화합물 1은 이 식물에서 처음으로 분리되었으며, 화합물 5는 자연계로부터 처음으로 분리된 화합물로 확인되었고, 이에 대해 고찰하고자 한다.</p><p>화합물 1 은 흰색 분말로 얻어졌으며, UV spectrum에서는 207 과 354\( \mathrm{~nm} \) 에서 강한 흡수대를 나타내었다. 분자량은 positive mode ESI-MS에서 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} 459[\mathrm{M}+\mathrm{Na}]^{+} \)와 negative mode ESI-\( \mathrm{MS} \) 에서 \( m / z 435[\mathrm{M}-\mathrm{H}] \) 에서 관측되어 436으로 결정하였다. \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR} \) spectrum의 \( \delta_{\mathrm{H}} 6.65(4 \mathrm{H}, \mathrm{s}) \) 에서 2 set의 1,3,4,5-tetrasubstituted benzene proton peak로 추정되는 signal이 확인되었고, 2개의 methines, 2개의 oxymethylenes, 2개의 oxymethines 과 4개의 methoxy groups 이 관찰되었다. \( { }^{13} \mathrm{C} \)-NMR spectrum에서는 methoxy group에 기인하는 peak \( \left(\delta_{\mathrm{C}} 56.4\right) \) 를 포함하여 8개의 signal을 확인하였다. \( { }^{1} \mathrm{H}-{ }^{1} \mathrm{H} \) \( \mathrm{COSY} \) 로 spectrum으로부터 \( \mathrm{OCHCHCH}_{2} \mathrm{OH} \) 에 기인하는 부분 구조를 결정하였다(Fig. 2). 분자량 \( m / z \) 436과 1D 및 2D NMR 로부터 화합물 1은 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzenepropanol 2 분자가 7-O-7' 및 8-8'이 결합하고 있는 2,5-diaryltetrahydrofuran 골격의 lignan 화합물로 추정되었으며, 비선광도 (측정치 \( [\alpha]_{D}^{25} \) \( +23.9^{\circ} \), 문헌치 \( [\alpha]_{\mathrm{D}}^{25}+23.5^{\circ} \) ) 결과 및 문헌상의 data와 비교하여 \( (+) \)-icariol \( \mathrm{A}_{2} \) 로 확인동정하였다. (+)-Icariol \( \mathrm{A}_{2} \) (1)는 이 식물로부터 처음으로 분리된 것으로 확인하였다.</p><p>화합물 5는 흰색 분말로 얻어졌으며, UV spectrum에서는 242 와 \( 282 \mathrm{~nm} \) 에서 강한 흡수대를 나타내었다. 분자식은 positive ion mode HRESI-MS data로부터 \( \mathrm{C}_{9} \mathrm{H}_{11} \mathrm{NO}_{4} \) 로 결정하였다 \( (\mathrm{m} / \mathrm{z} \) 198.07608 \( [\mathrm{M}+\mathrm{H}]^{+} \), calcd for \( \mathrm{C}_{9} \mathrm{H}_{12} \mathrm{NO}_{4} \), 198.07592). 1D \( \left({ }^{1} \mathrm{H},{ }^{13} \mathrm{C}\right. \) 및 DEPT)와 \( 2 \mathrm{D} \) (COSY, HSQC, HMBC, NMR spectra 로부터 1,2,4-trisubstituted benzene ring 과 \( 6.36(1 \mathrm{H} \), \( \mathrm{dd}, J=9.1,2.8 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-5)] \) 에 기인하는 signal을 확인하였고, acetamide moiety에 기인하는 시그널을 확인하였다. HMBC spectrum으로부터 \( \delta_{\mathrm{H}} 3.67(3 \mathrm{H}, \mathrm{s}) \) 과 \( \delta_{\mathrm{C}} 156.3 \) 과의 correlation으로 methoxy group은 C-4 위치에 결합하고 있음을 확인하였고, acetamide의 amine proton과 \( \delta_{\mathrm{C}} 120.1\) (C-1), 148.3 (C-2), 120.7 (C-6), 170.1 (C-8)과의 correlation으로 acetamide group은 C-1 위치에 결합하고 있음을 결정하였다(Fig. 2). 이상의 결과로부터 화합물 5 는 \( N \)-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-2-hydroxyacetamide (HMPHAA) 로 확인하였다. 화합물 5 는 곡류 이종감응물질(cereal allelochemical)인 6-methoxybenzoxazolin-2-one 이 토양내 미생물의 biotrans-formation에 의해 생성된다는 보고가 있지만, 자연계로부터 처음으로 분리된 것으로 확인하였다. 율무근으로부터 분리한 6 종의 화합물에 대하여 tyrosinase 저해 활성을 측정하였으며, 이들 화합물 중 단순 phenolic 계열의 화합물인 4-hydroxybenzaldehyde (3), trans- \( \rho \)-coumaric acid (4)와 benzo-xazolinone 계열의 coixol (6)은 각각 707.4, 6.5, \( 62.4 \mu \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값을 나타내어 대조군으로 사용한 arbutin \( \left(\mathrm{IC}_{50}=618.7\right. \) \( \mu \mathrm{M}) \) 과 유사하거나 우수한 활성을 확인하였다(Table 2). Tyrosinase 억제 활성을 나타낸 trans- \( \rho \)-coumaric acid (4)는 \( \alpha- \) \( \mathrm{MSH} \) 에 의해 멜라닌 생성이 촉진된 \( \mathrm{B} 16 / \mathrm{F} 10 \) 흑색종 세포에서 미백효과가 있다고 보고되어 있다.</p>
이 실험에서 멜라닌 생성 효소에 의해 산화되어 만들어지는 멜라닌의 양을 흡광도로 측정하여 tyrosinase의 억제 활성은 측정한다는 것은 옳아?
YES