<p>따라서 토양과 같은 자연 환경으로부터 기존의 protease인 subtilisin과 같은 유용 유전자의 분리에 대한 보고가 많기 때문에 본 연구에서는 산업적, 의학적으로 유용한 효소 자원인 새로운 혈전용해효소를 전통식품에서 분리하는 것과 달리 지금까지 배양되지 않은 다양한 미생물의 유전자를 포함하고 있는 자연 환경인 토양으로부터 혈전용해효소를 탐색하고자 metagenomics 기법을 적용하여 soil metagenome library를 제작하고, activity-based screening과 sequence-based screening을 각각 실시하였다.</p><p>토양으로부터 total genomic DNA를 분리하기 위하여 2003년 12월에 금정산에서 각각 다른 장소의 인적이 드문 큰 바위 밑, 오래된 나무뿌리 근처 등 지표에서 \( 30 \sim 50 \mathrm{~cm} \) 아래로부터 2개의 토양시료를 채취하였고, 2004년 3월에는 금정산의 4곳의 다른 장소에서 동일한 방법으로 토양시료를 채취하여 그늘지고 통풍이 잘 되는 곳에서 하루 건조시킨 후, 거즈로 작은 돌과 나무뿌리, 나뭇잎 등의 이물질을 제거하여 사용하였다.</p><p>\( 5 \mathrm{~g} \)의 토양시료를 DNA extraction buffer(\( 100 \mathrm{~mM} \) Tris-HCl \( [\mathrm{pH} 8.0] \), \( 1.5 \mathrm{~M}\)\( \mathrm{~NaCl}\), \( 100 \mathrm{~mM} \) sodium EDTA \( [\mathrm{pH} 8.0] \), \( 1 \% \) CTAB, \( 100 \mathrm{~mM} \) sodium phosphate \( [\mathrm{pH} 8.0] \)) \( 13.5 \mathrm{ml} \)와 \( 50 \mu \mathrm{l} \) proteinase \( \mathrm{K}(20 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml}) \)로 현탁한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 교반하여 혼합해 주고, \( 10 \% \) SDS \( 3 \mathrm{~ml} \)을 첨가하여 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 반응시킨 다음, 원심분리(\( 4,000 \mathrm{~rpm} \), \(10 \mathrm{~min} \), \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)) 하였다. 계속해서 humic acid를 제거하기 위해 \( 30 \% \) PEG 8,000을 포함한 \( 1.6 \mathrm{~M}\)\( \mathrm{~NaCl}\) 용액을 전체 부피의 \( 1 / 2 \) 만큼 넣고 상온에서 2시간 반응시켜 원심분리 하였으며, 침전물을 TE buffer(\( 10 \mathrm{~mM} \) Tris-HCl, \( 1 \mathrm{~mM} \) EDTA\([\mathrm{pH} 8.0] \)) \( 1 \mathrm{~ml} \)로 재현탁하고 \( 3 \mathrm{M} \) potassium acetate 200\( \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 얼음에서 5분 동안 정치시켰다. 원심분리 후, 동량의 phenol/chloroform/ isoamylalcohol(25/24/1)를 넣고 vortex 한 뒤, 원심분리하여 상등액 0.6배의 isopropanol을 넣고 2시간 동안 상온에서 침전시켰다. 원심분리 후, 침전물을 증류수 500\( \mu \mathrm{l} \)에 녹이고 DNA의 농도를 측정하였다.</p>
토양으로부터 total genomic DNA를 분리하기 위해서 어디서 토양시료를 취했어?
금정산