<h2>세포 생존율</h2><p>세포 생존율 실험은 다음과 같다. \( \mathrm{HaCaT} \) cell과 \( \mathrm{B} 16 \mathrm{~F} 10 \) cell을 각각 \(96\) well plate에 \( 1.5 \times 10^{4} \) cells/well로 분주하고 incubator \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \) 에서 \( 24 \mathrm{~h} \) 동안 배양하였다. 분획된 추출물을 \( \mathrm{DMSO} \) 에 용해하고 이를 \( 10,20,40 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 농도로 세포에 처리한 후 incubator에서 \( 24 \mathrm{~h} \) 동안 배양하였다. 배지가 있는 상태로 MTS시약을 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 씩 첨가한 후 \( 3 \mathrm{~h} \) 동안 incubator에 보관하였다. formazan의 상태를 관찰한 다음 microplate reader의 흡광도 \( 495 \mathrm{~nm} \) 모드에서 값을 구하였다. Cell viability 값은 대조군에 대한 시료 처리군들의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.</p><p>Cell viability \( (\%)=(\mathrm{A} / \mathrm{B}) \times 100 \) \( \mathrm{A} \) : 시료 처리군의 흡광도 \( \mathrm{B} \) : 시료 무처리된 \( \mathrm{DMSO} \) 용매 대조군 흡광도</p><h2>항산화 효과</h2><p>세포 실험 중 항산화 효능 실험은 다음과 같은 방식으로 시행하였다. \( \mathrm{HaCaT} \) cell을 \( 96 \) well plate에 \( 1.5 \times 10^{4} \) cells/well로 분주하고 incubator에서 \( 24 \mathrm{~h} \) 동안 배양하였다. 세포 배양 well 마다 PBS로 \( 2 \)회 세척하여 phenol red를 제거하였다. 각각의 well 에 \( 20 \mu \mathrm{M} \) 의 DCFDA를 처리한 다음 \( 45 \mathrm{~min} \) 동안 incubator에서 보관하였다. 이후 PBS로 다시 세척하고 대조군을 제외한 well 마다 \( 500 \mu \mathrm{M} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) (hydrogen peroxide)와 \( 10,20,40 \) \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도의 시료 추출물을 더한 다음 \( 45 \mathrm{~min} \) 동안 다시 incubator에서 보관하였다. Microplate reader의 \( 485 / 528 \mathrm{~nm} \) 에서 형광값을 얻어 대조군에 대한 시료 처리군들의 값을 계산한 후 이를 백분율로 나타내었다.</p><p>Relative activity \( (\%)=(\mathrm{A} / \mathrm{B}) \times 100 \) \( \mathrm{A} \) : 시료 처리군의 형광값 \( \mathrm{B} \) : 시료 무처리된 \( \mathrm{DMSO} \) 용매 대조군 형광값</p><h2>미백 효과</h2><p>미백 실험의 진행은 다음과 같다. \( \mathrm{B}16\mathrm{F}10\) cell을 6 well에 \( 1 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \) 로 분주하여 incubator에서 \( 24 \mathrm{~h} \) 동안 배양하였다. 대조군 외의 시료 처리군들에 \( \alpha-\mathrm{MSH}(100 \mathrm{nM}) \) 를 용해한 DMEM (serum free)을 \( 30 \mathrm{~min} \) 간 적용하였다. 배지를 교체없이 시료 처리군들에 시료를 \( 2 \) 배로 첨가한 후 incubator에서 \( 48 \mathrm{~h} \) 동안 배양하였다. 이후 각 well을PBS로 세척한 다음 세포를 수거하여 원심분리 \( \left(4{ }^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm}, 3 \mathrm{~min}\right) \) 하였다. 상층액을 제거하고 세포 pellet에 RIPA lysis buffer (Tris-Cl ( \( \mathrm{pH} 7.5\)) \(50\) \( \mathrm{mM}, \mathrm{NP}-401 \%, \mathrm{NaCl} 50 \mathrm{mM} \), SDS \( 0.1 \% \), sodium deoxycholate \( 0.5 \% \), protease inhibitor cocktail (Roche, Switzerland))를 처리한 다음 ice box에서 \( 30 \mathrm{~min} \) 동안 보관하였다. 이를 다시 원심분리 \( \left(4{ }^{\circ} \mathrm{C}, 14,000 \mathrm{rpm}, 10 \mathrm{~min}\right) \) 하고 상층액을 제거하여 pellet만 남긴 다음 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) oven에서 건조하였다. 건조된 pellet에 \( 2 \mathrm{~N} \) \( \mathrm{NaOH} 200 \mu \mathrm{L} \) 와 \( 20 \% \mathrm{DMSO} \) 를 첨가, 혼합한 후 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) oven 에서 용해하였다. \(96\) well에 용해물을 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 씩 담고 microplate reader의 \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><p>Relative activity \( (\%)=(\mathrm{A} / \mathrm{B}) \times 100 \) \( \mathrm{A} \) : 시료 처리군의 흡광도 \( \mathrm{B} \) : 시료 무처리된 \( \mathrm{DMSO} \) 용매 대조군 흡광도</p><h2>통계 분석</h2><p>본 연구는 실험을 \(3\) 회 이상 반복하여 시행한 후 결과를 도출하였다. 그래프의 결과값은 시행한 실험 횟수들의 평균(mean, M) 과 표준편차(standard deviation, SD)로 나타냈다.</p>
이 논문에서는 실험을 한 번만 진행하였는가?
NO