<h1>재료 및 방법</h1><h2>시약 및 세포주</h2><p>Fetal bovine serum, antibiotic, 세포배양 plate는 BioClone,Sigma, Falcon사로부터 각각 구입하였다. PCR primer는 Cosmo사로부터 제작하여 사용하였으며, EGCG는 Sigma-Aldrich사로부터 구입하여 사용하였다.</p><h2>세포 배양 및 EGCG 처리</h2><p>Mouse C2C12 myoblast 세포는 \( 10 \% \) FBS(fetal bovine serum), \( 100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)의 페니실린 G, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) streptomycin sulfate를 함유하고 있는 Dulbeccco's Modified Eagles' Medium(DMEM) 을 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\left(5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \)의 incubator에서 배양하였다. 세포는 \( 30 \mathrm{~mm} \) plate에 \( 2 \mathrm{ml} \) 당 \( 1 \times 10^{4} \) 세포를 분주하고 24시간 후 여러 가지 농도 \( (0,3.125,6.25,12.5,25,50 \mu \mathrm{M}) \)의 EGCG를 처리하여 4일 동안 배양하였다. 배지는 3일 후 교환해 주었으며, EGCG 또한 배지 교환 시 재처리하였다. EGCG 처리 시간의 경과에 따른 smooth muscle \( \alpha \)-actin과 transgelin mRNA의 변화를 알아보기 위하여 \( \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) 세포를 분주한 뒤 24시간 후 \( 50 \mu \mathrm{M} \) 의 EGCG를 0,24,48,72시간동안 처리하였다.</p><h2>Immunofluorescent staining</h2><p>C2C12 myoblast 세포를 6 wells 배양 plate에 고정(fix)시키기 위하여 \( 3.7 \% \) formaldehyde \( (\mathrm{pH} 7-8) \) 를 함유하고 있는 PBS \( 1 \mathrm{ml} \) 를 각각의 well에 10 분간 처리하였다. 그 후 PBS 용액으로 fix된 세포를 씻어낸 후 \( 0.2 \% \) trinton X-100과 \( 10 \% \) goat serum을 포함하고 있는 PBS로 상온에서 15 분간 처리하여 세포를 permeabilization을 시켰다. 다음은 \( \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) myoblasts 세포에 mouse IgG smooth muscle \( \alpha \)-actin primary 항체 (Sigma, St. Louis, MO)를 1:1000 비율로 희석시킨 \( 600 \mathrm{ml} \)를 각각의 well에 상온에서 30 분간 배양시켰다. 다음 세포는 PBS로 3번 씻은 후 1:250 비율로 희석된 Alexa488-conjugated goat anti-mouse IgG secondary 항체(Molecular Probes, Eugene, OR)로 상온에서 30분간 더 배양하였다. 마지막 단계로서 세포를 PBS로 3번 헹군 후 핵의 변화를 살펴보기 위하여 \( 1.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 4',6-diamidino-2phenylindole(DAPI)를 이용하여 세포를 staining한 후 PBS로 3번 헹구어 내었다. 세포 배양 plate상에서의 smooth muscle \( \alpha \)-actin protein 단백질의 발현 정도는 디지털 이미지 system을 갖춘 Axiovert 200 epi-fluorescence 현미경(Zeiss, Germany)을 이용하여 사진 촬영을 하였다.</p><h2>Total RNA 추출과 cDNA 합성</h2><p>대조군과 EGCG로 처리된 세포를 TRIzol reagent(Life Technologies, Grand Island, NY)를 각 well당 \( 600 \mu \mathrm{l} \) 넣은 후 total RNA를 RNeasy RNA extraction kit(Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 얻었다. 추출된 RNA를 ultrapure water에 용해시킨 후 UV \( 260 \mathrm{~nm} \)에서 농도를 측정하였다. 그 다음 \( 0.5 \mu \mathrm{g} \)의 total RNA와 first strand cDNA synthesis \( k i t( \) Roche)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성조건은 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분, \( 42{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60분, \( 95{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분순으로 진행되었고, final volume은 \( 20 \mu \mathrm{l} \)였다.</p><h2>Real-time qunatitative PCR</h2><p>Transgelin(smooth muscle 22 protein)과 smooth muscle \( \alpha \)-actin messenger RNA(mRNA) 발현을 측정하기 위하여, double-stranded DNA dye인 SYBR Green(Perkin Elmer, Boston, MA)을 이용하여 fluorescence real-time PCR을 실시하였다. 본 실험에서 사용한 primer sequence는 Table 1에 나타난 바와 같다. SYBR Green 분석은 ABI PRISM 7700 system(Perkin Elmer, Applied Biosystems)을 이용하였으며, 모든 샘플은 최소한 2회 이상 반복 측정하였으며, 각각의 target mRNA의 발현은 glyceraldehyde 3-phosphate de-hydrogenase(GAPDH) mRNA양으로 보정하였다.</p>
Transgelin과 smooth muscle \( \alpha \)-actin messenger RNA발현을 측정하기 위하여 실시한 것은 뭐야?
fluorescence real-time PCR