<p>화합물 4는 White amorphous powder 형상으로서 TLC 전개 후, \( 10 \% \) 황산 발색 시 진한 갈색으로 발색 되었다. 고분해능 질랑분석 장비를 이용하여 측정한 결과, \( m / z 1193.5993[\mathrm{M}-\mathrm{H}]^{-} \) peak의 관측으로 질량 값은 \( 1194[\mathrm{M}]^{+} \)로 확인하였다(Fig. 2). \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR}\left(600 \mathrm{MHz}\right., \text{pyridine}- \left.d_{5}, \delta_{\mathrm{H}}\right) \) spectrum과 \( { }^{13} \mathrm{C}-\mathrm{NMR} ( 150 \mathrm{MHz}, \text{pyridine}- d_{5}, \delta \mathrm{c} \)) spectrum을 통하여 역시 화합물 1 (malonyl ginsenoside Rd)과 매우 유사한 구조에 당이 하나 더 결합했음을 예상하였다. 당에서 유래한 signal들의 chemical shift 및 anomer proton signal의 결합정수 (\( J=7.7 \mathrm{~Hz} \)) 로부터 당의 구조가 \( \beta \)-D-glucopyranose임을 확인하였다. 당의 결합 위치를 확인하기 위하여 \( \mathrm{gHMBC} \) 를 확인한 결과, anomer proton (\( \delta_{\mathrm{H}} 5.80, \mathrm{H}-1^{\prime \prime \prime}\)) 이 C-6"의 oxygenated methylene carbon ( \( \delta \mathrm{cc} 65.56 \)) 과 cross peak를 보여 \( \beta \)-D-glucopyranose가 다른 \( \beta \)-D-glucopyranose 의 6 "번에 결합하고 있음을 알 수 있었다(Fig. 3).<p><p>분리된 화합물 4종 및 인삼의 UPLC-Q-TOF/MS profiling 결과를 활용하여(Fig. 2) 정랑분석을 실시하였다. 미량의 정랑분석을 검출하기 위하여 UPLC가 부착된 QTRAP mass spectrometer ABSCIEX를 사용하여 질랑 스펙트럼과 크로마토그램을 분석 하였다. 최적화된 기기분석조건을 고려하여 머무름 시간을 비교하였을 때, 화합물 1은 9.40 분, 화합물 2은 8.61분, 화합물 3은 9.08 분, 화합물 4는 7.73분에서 검출되었다(Table 3). MRM-mode로 정량 분석을 실시하기 위하여 선텍된 선구이온(precursorion)은 화합물 1은 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} 1033 \), 화합물 2 는 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} 1163 \), 화합물 3 는 \( m / z \quad 1163 \), 화합물 4 는 \( m / z \quad 1193 \) 로 선텍되었다. 최적의 fragment 에너지를 형성하였고 조각난 질랑 값 중에 가장 감도가 총은 생성이온(products ion)을 선텍하여(화합물 \( 1: \mathrm{m} / \mathrm{z} \) 987.5, 화합물 2: \( \mathrm{m} / \mathrm{z} \quad 1119.5 \), 화합물 3 는 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} \quad 1119.4 \), 화합물 4 는 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} 1149.4 \) ) 정랑분석을 실시하였다(Table 3). 검량 곡선은 표준물질의 5농도 범위 안에서 측정된 값을 회귀 분석을 통해 작성하였다. 분석된 각 화합물의 상관계수 \( \left(r^{2}\right) \) 는 \( 0.9956 \) 에서 \( 0.9988 \) 으로서 매우 높은 값을 보여주었다(Table 4). 인삼에 함유 되어있는 malonyl ginsenoside의 함량 분석을 진행하기 위하여 수확 후, 바로 동결건조를 시킨 인삼 5 년근 및 6년근을 세근을 제거하고 동체만을 분석하였다. 그 결과 malonyl ginsenoside Rb2 를 제외한 3증의 malonyl ginsenoside는 6년근에 비해서 5 년근의 함랑이 높게 나오는 것을 확인하였으며, 화합물들의 총 함량의 합은 각각 \( 6.62 \) 및 \( 2.34 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) 으로 5 년근이 약 2.8 배 높은 것을 확인하였다(Table 4).</p><p>한편, 분리된 malonyl ginsenoside 4종의 간세포에 대한 독성을 평가하기 위해 MTT assay를 수행한 결과, 화합물 모두 HepG2 (\( 100 \mu \mathrm{M} \)) 세포에 대한 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(Fig. 4B). 세포손상을 유발하기 위하여 알코올 (\( 1 \mathrm{M} \)) 를 처리하여 독성 유발에 따른 세포의 손상 또는 세포 사멸에 대한 화합물의 간세포 보호효과를 확인하기 위해 알코올 처리에 따른 세포 생존율의 변화를 확인한 결과, 알코올 처리군은 상 대조군 (\( 100 \% \)) 과 비교하여 세포 생존율이 약 \( 48.6 \% \) 까지 감소하였다. 알코올 처리 후 Malonyl ginsenoside \( \mathrm{Rd} \) 의 처리군은 \( 71.3 \% \) 의 세포 생존율을 나타났었고, 알코올 처리군과 비교 시 \( 41.4 \%(50 \mu \mathrm{M}) \) 의 세포가 회복되었으며, 나머지 화합물은 활성이 없었다(Fig. 4A). Malonyl ginsenoside Rd는 항당뇨 효과가 보고되어 있으며, 손상된 간세포 회복 개선 효과에는 본 논문에서 처음 보고하였다. 본 연구 결과를 종합해 볼 때, 분리가 어럽고 분해가 되기 쉬운 주요 malonyl ginsenoside의 수율을 최대화하기 위하여 \(10 { }^{\circ} \mathrm{C} \) 이하에서 추출 및 저온 감압 농축하였다. 4종의 malonylginsenoside의 분리 및 동정 된 자료의 최신 NMR data 값 및 고분해능 질량 값을 제공하였으며, 인삼의 연근별 주요 ginsenoside의 변화 및 가공 시 변화가 될 수 있는 ginsenoside 의 제안을 위한 기초자료로 이용할 수 있을 것으로 기대된다.</p><h2>초 록</h2><p>고려인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)을 \( 70 \% \) EtOH 수용액으로 저온 추출한 뒤, 감압 농축한 추출물을 \( \mathrm{SiO}_{2}\), ODS column chromatograph 및 중압분취(MPLC) 장비를 반복 실시하여 4 종의 인삼 사포넌 화합물을 분리 및 정제하였다. NMR 및 고분해능 질량분석 장비를 이용하여 malonyl ginsenoside Rd(1), Rc(2), Rb2 (3), 및 Rb1(4)로 구조 동정하였다. 분리한 4 종의 화합물에 대하여 UPLC-MS/MS 질랑분석기를 이용하여 수삼의 5년 및 6년근 뿌리의 동체를 정량분석 하였으며, malonyl ginsenoside의 총 함량의 합은 각각 6.62 및 \( 2.34 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) 으로 5년 근이 약 2.8 배 노은 것을 확인하였다. 인삼으로부터 분리된 화합물 중 malonyl ginsenoside Rd 의 경우, 알고올에 의해 저해된 HepG2세포에 대해서 간세포를 보호하는 효과가 있음을 확인하였다.</p>
무엇을 통해 화합물 4가 화합물 1과 유사한 구조에 당이 하나더 결합했음을 예상했나요?
\( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR}\left(600 \mathrm{MHz}\right., \text{pyridine}- \left.d_{5}, \delta_{\mathrm{H}}\right) \) spectrum과 \( { }^{13} \mathrm{C}-\mathrm{NMR} ( 150 \mathrm{MHz}, \text{pyridine}- d_{5}, \delta \mathrm{c} \)) spectrum