<h2>효소 및 시약</h2><p>고정화 담체로 사용된 키토산 분말은 Sigma (St. Louis, USA)에서 구입하였고 효소인 \( \beta \)-galactosidase는 상업적 용도로 사용되는 Lactozym 3000L (Novozymes, Denmark)을 구입하여 사용하였다. Glutaraldehyde와 o-nitrophenyl \( \beta \)-D-galactopyranoside (ONPG)은 Sigma (St. Louis, USA)에 구입하였고 다른 모든 시약들도 1급 이상을 사용하였다.</p><h2>효소 고정화</h2><p>\( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 키토산 용액에 무수 아세트산을 첨가하여 아세트산의 농도를 \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)으로 하였다. \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)로 가열한 후 불용성 물질을 제거하기 위해 여과하였다. 노즐 직경이 \( 5 \mathrm{~mm} \)인 주사기(syringe)에 키토산 용액을 넣고 \( 1 \mathrm{M} \mathrm{KOH} \) 용액 \( 500 \mathrm{ml} \)에 잘 혼합하면서 주사기로 투입하였다. 생성된 키토산 담체를 경화시키기 위해 상온에서 4 hr 동안 교반 하였다. 직경이 \( 5 \mathrm{mm} \)의 균일한 형태로 담체가 생성되었고 인산완충용액으로 3회 세척과 여과한 후에 담체를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)로 인산완충용액에 보관하였다.</p><p>효소를 담체에 고정화하는 가교제로 glutaraldehyde를 사용하였고 인산완충용액 (\( 50 \mathrm{mM}\), \(\mathrm{pH} 7.0\))에서 glutaraldehyde의 농도를 1에서 \( 5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)으로 변화시키면서 상온에서 12 hr 동안 혼합하여 키토산 담체를 활성화하였다. 활성화된 키토산 담체에 결합되지 않은 잔류 glutaraldehyde를 제거하기 위해 인산완충용액으로 5회 세척하였다. \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 효소 Lactozym \( 3000 \mathrm{L} \) \( 0.1 \sim 1 \mathrm{ml} \)를 담체 \( 1 \mathrm{ml} \)에 첨가한 후 12 hr 동안 고정화하였다. 고정화되지 않은 효소 단백질을 제거하기 위해 인산완충용액 (\( 50 \mathrm{mM}\), \(\mathrm{pH} 7.0 \))으로 3회 세척하였다. 고정화 효소를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 인산완충용액 (\( 50 \mathrm{mM}\), \(\mathrm{pH} 7.0\))에 보관하였다. 효소가 담체에 고정화되는 효율은 아래의 관계를 이용하여 측정하였다.</p><p>\(\text{Immobilization yield} (\%)=\frac{\text { Immobilized enzyme activity}(\mathrm{U})}{\text { Total enzyme activity added }(\mathrm{U})} \times 100 \)</p><p>여기서 고정화 효소의 활성은 투입된 효소의 활성에서 고정화되지 않고 배출된 효소의 활성을 뺀 값이다.</p><h2>효소 활성 측정</h2><p>\( 3.0 \mathrm{mM} \)의 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)를 포함하는 인산 완충용액 (\( 50 \mathrm{mM}\), \(\mathrm{pH} 7.0\)) \(1.0 \mathrm{ml} \)와 \( 14 \mathrm{mM} \)의 ONPG \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 혼합하여 반응용액으로 하였다. 자유 효소의 경우에는 효소용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 그리고 고정화 효소의 경우에는 질량이 측정된 담체 1개 혹은 2개를 반응용액에 첨가한 후 항온조에서 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \), \(10 \mathrm{min}\) 동안 반응시킨 후 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 효소 활성은 ONPG가 반응하여 o-nitrophenol을 생성하는 양에 비례하여 증가한다. \( \beta \)-galactosidase 활성 \(1 \mathrm{unit} \) 는 인산 완충용액 (\( 50 \mathrm{mM}\), \(\mathrm{pH} 7.0\))에서 \(1 \mathrm{min}\) 동안 \( 1 \mathrm{~mmol} \) 의 ONPG를 분해하는 효소의 양으로 정의한다.</p><p>단백질의 양은 Lowry 방법으로 분석하였다. 고정화 효소의 단백질 양은 고정화를 위해 투입된 효소 단백질의 양에서 고정화되지 않고 빠지는 효소의 양을 뺀 준 것으로 계산하였다. 담체에 고정화된 효소 단백질의 양은 \( 23 \mathrm{~mg} ~ \mathrm{enzyme} / \mathrm{g} ~ \mathrm{bead}\)이었다.</p>
무수 아세트산을 첨가하여 아세트산의 농도를 \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)으로 한 것은 어디에 했나?
\( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 키토산 용액