<h1>재료 및 방법</h1><h2>채집 및 분리</h2><p>실험에 사용한 민자주방망이버섯은 2000년 9월 초순경, 경상북도 경산시 하양읍에 소재한 대구가톨릭대학교 북편 야산의 참나무와 소나무, 아카시아나무 혼합림에서 채집하였다. 채집한 버섯으로부터 조직의 일부분을 분리하여 PDA배지와 Yamanaka배지에 접종하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 배양하였다. 균사의 성장과정 중 육안과 현미경상으로 균사의 색깔과 모양 등에서 기존의 문헌에서 서술한 민자주방망이버섯과 일치하는 특징을 나타내는 균사를 Lepista nuda로 간주하여 계대배양하였고, 그 중 성장속도가 빠른 균주를 분리하여 실험에 사용하였다.</p><h2>균사의 생장속도 측정</h2><p>배지에 따른 민자주방망이버섯 균사의 생장속도를 알아보기 위하여, 일반적으로 버섯균사의 배양실험에서 많이 사용하는 4종의 배지(PDA, YM, GPB, MEA)와 균근성버섯의 배지로 많이 사용하는 1종의 배지(Yamanaka)를 선정하였다. 이들 배지 중 PDA배지의 경우는 PDA \( 39.0 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\), \(\mathrm{pH} 5.4\) 로 조제하였으며, MEA배지는 MEA \( 33.6 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\), \(\mathrm{pH} 5.4\) 로 조제하였다. 그리고 YM 배지는 glucose \( 10.0 \mathrm{~g} \), peptone \( 5.0 \mathrm{g} \), malt extract \( 3.0 \mathrm{~g} \), yeast extract \( 3.0 \mathrm{~g} \), agar \( 20.0 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \( \mathrm{pH} 5.4 \) 로, GPB배지는 glucose \( 10.0 \mathrm{~g} \), peptone \( 10.0 \mathrm{~g}\), \( \mathrm {KCl} \) \( 0.3 \mathrm{~g} \), potassium phosphate \( 0.87 \mathrm{~g} \), magnessium sulfate \( 0.5 \mathrm{~g} \), agar \( 1.5 \%\), \(\mathrm{pH} 5.4 \) 로, Yamanaka배지는 glucose \( 20.0 \mathrm{g} \), ammonium tartrate \( 2.0 \mathrm{~g} \), potassium phosphate \( 1.0 \mathrm{~g} \), calcium chloride \( 5 \mathrm{mg} \), citric acid \( 1.0 \mathrm{~g} \), ferric chloride \( 100 \mathrm{mg} \), zinc sulfate \( 5 \mathrm{mg} \), cupric sulfate \( 10 \mathrm{mg} \), man-ganese sulfate \( 0.5 \mathrm{mg} \), magnesium sulfate \( 1.5 \mathrm{~g} \), thiamine \( \mathrm {HCl} \) \(3 \mathrm{mg} \), nicotinic acid \( 0.3 \mathrm{mg} \), folic acid \( 0.1 \mathrm{mg} \), HEPES \( 7 \mathrm{~g} \), agar \( 15 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\), \(\mathrm{pH} 5.4 \) 로 조제하여, \( 121^{\circ} \mathrm{C}\)(\(1.2 \mathrm{~kg} / \) \( \left.\mathrm{cm}^{2}\right) \) 에서 20분간 멸균하고, clean bench 하에서 E.O Gas로 멸균된 직경 \( 87 \mathrm{~mm} \) 의 Petri dish에 \( 50 \mathrm{ml} \) 씩 분주하여 완전히 식힌 후, 직경 \( 5 \mathrm{~mm} \) 의 cork borer를 이용하여 접종하였다. 접종 후 \( 25 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \) 의 incubator에서 25일간 배양하여 균총의 직경을 측정하여 평균하였다.</p><p>\( \mathrm{pH} \) 별 균사의 생장속도를 알아보기 위하여 Yamanaka배지를 기본배지로 하여 \( 1 \mathrm{M} \) \( \mathrm{HCl} \) 과 \( 1 \mathrm{M} \) \( \mathrm{NaOH} \) 로 \( \mathrm{pH}\) 4, 5, 6, 7, 8 로 각각 조절한 뒤, \( 121^{\circ} \mathrm{C}\left(1.2 \mathrm{~kg} / \mathrm{cm}^{2}\right) \) 에서 20분간 멸균 하고, 고체배지의 경우 E.O Gas로 멸균한 직경 \( 87 \mathrm{~mm} \) 의 Petri-dish에 \( 50 \mathrm{ml} \) 씩 분주하여 완전히 식히고 직경 \( 5 \mathrm{~mm} \) 의 cork borer로 접종한 후, \( 25 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \) 의 incubator에 25일간 배양하여 균총의 직경을 측정하여 평균하였다. 액체배지의 경우는 \( 250 \mathrm{ml} \) flask에 \( 100 \mathrm{ml} \) 의 배지를 분주하여 \( 1 \mathrm{M}\) \(\mathrm{HCl} \) 과 \( 1 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaOH} \) 로 \( \mathrm{pH} \) 를 각각 4, 5, 6, 7, 8로 조절한 후 \( 121^{\circ} \mathrm{C}\)\((1.2 \mathrm{~kg} / \mathrm{cm}) \) 에서 20 분간 멸균하고 접종한 뒤, shaking incubator에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), \(120 \mathrm{rpm} \) 으로 25일간 배양하고 배양액을 filter paper로 여과시킨 후, \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 의 dry oven에서 24시간 건조시켜 균사의 건중량을 측정하였다.</p><p>탄소원의 변화에 따른 균사의 생장속도를 알아보기 위하여 첨가탄소원으로 단당류인 glucose, 이당류인 sucrose, 다당류인 starch의 3종을 선정하여, \( \mathrm{pH} 5.4 \) 의 기본배지에 각각의 탄소원을 \( 20.0 \mathrm{~g} \) 씩 첨가하여 제조하였고, 질소원의 변화에 따른 균사생장속도를 알아보기 위하여 첨가질소원으로 무기태질소원 중 암모늄태인 ammonium tartrate, 유기태질소원인 yeast extract, 복합질소원인 peptone, 그리고 유기태질소원 중 아미노산태인 asparagine의 4종의 질소원을 선정하여 위와 동일한 방법으로 배양, 측정하였다.</p><h2>유전적특성분석(PCR-RAPD)</h2><p>민자주방망이버섯의 균사로부터 DNA를 추출하기 위하여 균사 \( 500 \mathrm{mg} \) 을 pre-cooled mortar에 넣고 liguid nitrogen으로 잘 마쇄 한 다음, 마쇄한 분말을 \( 1.5 \mathrm{ml} \) tube에 옮기고 Lysis buffer \((50 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\): \(\mathrm{pH}7.2\) , \(50 \mathrm{mM} \) EDTA: \( \mathrm{pH} \) 7.2, \( 3 \% \) SDS, \( 1 \%\) 2-mercaptoethanol) \( 500 \mathrm { \mu l } \) 를 넣어서 잘 섞고, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 의 Water bath에서 1시간 동안 배양하여, \( 12,000 \mathrm{~g} \) 에서 15분간 원심분리하고 상층액을 micropippet 으로 채취하여 동량의 phenol-chloroform-isoamylalcohol (\( 25: 24: 1 \))을 넣어 잘 섞은 뒤, 다시 \( 12,000 \mathrm{~g} \)에서 5분간 원심분리하였다. 다시 동량의 phenol-chloroform-isoamylalcohol (\( 25: 24: 1 \))을 넣어 섞은 뒤 \( 12,000 \mathrm{~g} \)에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 채취하여 2배의 냉장한 \( 70 \% \) ethanol을 넣고 \( 12,000 \mathrm{~g} \) 에서 3 분간 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. pellet을 제외한 용액은 버리고, 냉장한 \( 80 \% \) ethanol을 \( 200 \mu\mathrm{ l} \) 정도 넣어 섞은 후 \( 12,000 \mathrm{~g} \) 에서 3분간 원심분리하였다. pellet은 30분정도 실온에서 건조시키고, TE buffer \( 100 \mu \mathrm{ l}\) 을 넣어 PCR 재료로 사용하였다. PCR에 사용한 primer는 대전에 소재한 Genotech사에 주문제작하여 사용하였다.</p><p>PCR을 위한 reaction mixture의 조성은 Takara PCR kit에 첨부된 사용지침에 따랐다. Lepista nuda의 genomic DNA\( 1 \mathrm{\mu l}\) 에 Taq polymerase \( 0.5 \mathrm{\mu l}\) (Takara), 10X buffer \( 10.0 \mathrm{\mu l}\) (Takara), dNTPs mixture \( 8.0 \mathrm{\mu l}\) (Takara), \( \mathrm{MgCl}_{2} \) \( 6.0 \mathrm{\mu l}\) (Takara), primer \( 1.0 \mathrm{\mu l}\) (Genotech)를 넣고 D.D.W. 를 \( 100 \mathrm{\mu l}\) 까지 채웠다. PCR에 사용한 thermal cycler는 영국 Techne사의 Progene였으며, PCR 조건은 박 등(1997)의 방법에 따라 수행하였다. Denaturation을 위해 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분간 1 cycle을 program하고, 45 cycle을 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초간 denaturation, \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분간 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 분간 extension한 후 최종적으로 1 cycle을 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 extension하였다. PCR한 product들을 ethdium bromide를 첨가한 \( 1 \% \) agarose gel에서 TAE buffer를 사용하여 \( 85 \mathrm{volt} \) 로 전기영동한 후 UV상에서 나타나는 band 들을 관찰하였다.</p>
일반적으로 버섯균사의 배양실험에 많이 사용하는 배지는 1종이다.
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