<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포 배양 및 isoflavone</h2><p>인간 대장암 세포주인 HCT116는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 구입하였다. 세포주의 배양 및 계대에는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 배지(Gibco-BRL Inc., USA)를 사용하였으며, \( 10 \% \) FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco-BRL Inc., USA), \(1\%\) penicillin 및 streptomycin (WelGene Inc., Korea)을 첨가하여 사용하였다. 본 연구에 사용된 콩 유래의 isoflavone인 genistein과 daidzein은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (USA)에서 구입하였다.</p><h2>세포 생존율 연구</h2><p>Genistein과 daidzein의 처리에 의한 HCT116 세포 생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTS 용액(Promega, USA)을 이용하여 세포생존율 연구를 수행하였다. 즉, 96 well plate에 well당 \( 3 \times 10^{3} \)개의 세포를 접종하고 24시간 동안 배양한 후, genistein과 daidzein의 최종 처리농도가 25, 50 그리고 \(100 \mu \mathrm{M} \)이 되도록 처리하였다. Genistein과 daidzein을 각각 24시간 동안 반응시킨 후, MTS ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium]) 용액을 각 well 당 \( 20 \mu \mathrm{l}\) 씩 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 4시간 동안 반응 시켰다. 반응 종료 후 96 well plate reader(Expert 96 UV ASYS Hitech, Austria)를 이용하여 \( 490 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 결과 수치는 4개의 독립적인 well에서 수행한 값을 mean\( \pm\)SD 값으로 나타내었다.</p><h2>세포 형태변화 관찰</h2><p>Genistein과 daidzein의 처리에 의한 암 세포주 형태 변화를 관찰하기 위하여, 6 well plate에 well 당 \( 2.5 \times 10^{5} \)개의 세포를 분주하고 24시간 동안 배양한 후, genistein과 daidzein의 최종 처리 농도가 25, 50 그리고 \( 100 \mu \mathrm{M} \)이 되도록 처리하였다. 추가적으로 24시간 배양한 후, 역상 현미경(Leica DMIL,Wetzlar, Germany)의 100배 배율 하에서 세포주의 형태 변화를 대조군과 비교 관찰 하였고, 현미경에 설치된 카메라를(Olympus, Japan) 이용하여 well 단위로 세포 형태를 촬영하였다.</p><h2>Total RNA 분리</h2><p>Total RNA 분리는 RNeasy mini kit(Qiagen Inc., USA)을 이용해 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 최종 단계에서 RNase-free water \( 40 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 total RNA를 분리하였다. 분리 정제한 RNA는 정량 후, reverse transcription PCR 및 real-time PCR에 사용하였다.</p><h2>RT-PCR과 real-time PCR</h2><p>유전자의 발현의 확인을 mRNA 수준에서 측정하기 위하여 reverse transcription-PCR과 real-time PCR 방법으로 수행하였다. 각 시료로부터 total RNA를 추출한 후, \( 5 \mu \mathrm{g} \)을 취하여 MMLV RTase (Bioneer, Korea)를 이용하여 cDNA를 제조하였다. RT-PCR의 경우 최종 cDNA를 \( 50 \mu \mathrm{l} \)로 희석한 후 \( 5 \mu \mathrm{l} \)를 사용하였으며, PCR 반응은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 denaturation시키고, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초의 cycle을 30번 반복한 후, 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 수행하였다. Real-time PCR의 경우 최종 cDNA를 \( 200 \mu \mathrm{l}\)로 희석한 후 \(5 \mu \mathrm{l} \)를 사용하였으며, PCR mixture는 Power SYBR\({ }^{\circledR} \) Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA)를 사용하였다. 반응 조건은 첫 번째 step으로 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시키고, 두 번째 step으로 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15초, \( 54^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 33초의 cycle을 40번 반복하여 수행하였다. 결과는 ABI Prism 7500 SDS software program(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 분석, 정량하였으며 분석법으로는 comparative Ct(threshold cycle) method를 이용하였다.</p>
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 배지에 첨가한게 뭐야?
\( 10 \% \) FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco-BRL Inc., USA), \(1\%\) penicillin 및 streptomycin