<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포배양 및 amyloid-\( \beta \)의 처리</h2><p>본 연구에 사용된 C6 신경교세포(astroglioma cells)는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였으며, \( 10 \% \) FBS 및 \( 1 \% \) penicillin 및 streptomycin (Biofluids, Rockville, MD, USA)이 포함된 dulbecco's modified eagle medium (DMEM) 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양하였다. Resveratrol 및 amyloid-\( \beta \) (amyloid-\( \beta \)-protein fragment 31~35)는 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Resveratrol은 ethanol에 희석하여 \( 200 \mathrm{~mM} \)의 stock solution을 만들어 사용하였으며, amyloid-\( \beta \)는 3차 증류수에 \( 2.5 \mathrm{~mM} \)의 농도로 희석하여 사용하였다. Amyloid-\( \beta \) 및 resveratrol의 혼합 처리를 위한 실험에서는 resveratrol을 amyloid-\( \beta \) 처리 40분전에 적적농도로 배지에 희석하여 먼저 처리하였다.</p><h2>Hematocytometer를 이용한 생존율의 측정</h2><p>세포배양용 60-mm dish 당 \( 1 \times 10^{5} \) cells개의 C6 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, amyloid-\( \beta \) 단독 또는 resveratrol과 혼합처리 후 적정시간 동안 배양하였다. 준비된 세포들은 phosphate-buffered saline (PBS) 용액으로 수세하고 trypan blue (Gibco BRL)로 염색하였으며, 이를 hematocytometer에 옮긴 후 위상차 현미경 \( (\times 200) \) 하에서 살아있는 세포의 수를 추정하여 대조군과 비교 분석하였다.</p><h2>Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석</h2><p>동일한 조건에서 준비된 세포들을 대상으로 TRIzol B (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, ONE-STEP RT-PCR PreMix (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Korea)를 이용하여 \(2 \mu g \)의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였다. 선행연구 조건에 준하여 이 cDNA를 template로 사용하여 관찰 대상 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다. 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산물들을 \( 1 \% \) agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, Sigma)로 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.</p><h2>단백질의 분리, 전기영동 및 Western blotting</h2><p>선행 방법에 준하여 amyloid-\( \beta \) 단독 또는 resveratrol과 혼합 처리된 배지에서 자란 세포들을 lysis buffer로 용해한 후, 고속원심분리로 세포 내 잔사물을 분리시킨 후 동량의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, \( 10 \% \) skim milk를 함유한 PBS-T \( \left(0.1 \%\right. \) Tween 20 in PBS)에 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 이상 배양하면서 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하였다. 그리고 특정 단백질에 대한 항체를 membrane에 적용시켜 항원 항체 반응을 일으킨 후, PBS-T로 씻어내고 특정 항체에 대한 이차 항체 반응을 실시한 후 ECL (Enhanced Chemi Luminoesence) 용액 (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, 이차 항체로 사용된 horseradish peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다.</p>
분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, 10 \%10% skim milk를 함유한 PBS-T \left(0.1 \%\right.(0.1% Tween 20 in PBS)에 몇 도(ºC)에서 1시간 이상 배양하면서 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하였다. 몇 몇 도(ºC) 인가요?
\( 4^{\circ} \mathrm{C} \)