<h1>재료 및 방법</h1><h2>Fluorescein과 4-MU의 \( \mathrm{pH} \)에 따른 형광 세기 변화</h2><p>fluorescein (Sigma, USA)과 4-MU (Sigma)는 각각 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate, pH \( 8.0 \) 완충용액과 떼탄올에 \( 10 \mathrm{mM} \) 의 농도로 녹여 냉동실에 보관하였다. fluorescein과 4-MU 에 대해 \( \mathrm{pH} \) 변화에 따른 형광의 세기 변화를 측정하기 위해 \( \mathrm{pH} \) 를 8.0,7.0,6.5,6.0,5.0 으로 조정한 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate 완충용액에 두 형광물질을 각각 \( 1 \mu \mathrm{M} \) 의 농도로 녹여 F-2000 fluorometer (Hitachi, Japan)로 형광을 측정하였다. 이때 bandwidth는 \( 20 \mathrm{~nm} \) 로 하고 PM voltage는 \( 700 \mathrm{~V} \) 로 조정하였다. fluorescein의 형광을 측정할 때는 excitation wavelength 와 emission wavelength를 각각 \( 490 \mathrm{~nm} \) 와 \( 514 \mathrm{~nm} \) 로 하고 4-MU의 경우에는 excitation wavelength와 emission wave-length를 각각 \( 360 \mathrm{~nm} \) 와 \( 450 \mathrm{~nm} \) 로 하였다.</p><h2>표준 활성 측정 방법</h2><p>오일 에멀션은 올리브 오일(Sigma) \( 5 \mathrm{ml} \) 과 arabic gum (Sigma) \( 2 \mathrm{~g} \) 을 물에 넣고 최종 부피가 \( 100 \mathrm{ml} \) 이 되도록 물을 더하여 조정한 후 sonication 하여 만들었다. 각 반응 용액은 형광측정용 검정색 96-well microplate (PerkinElmer, USA)에 다음과 같은 방법으로 만들었다. 반응 용액 \( 10 \mathrm{ml} \) 을 만들 경우 10×TK 완충용액(10 mM Tris-Cl, \( \mathrm{pH} 7.0,200 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{KCl}) 1 \mathrm{ml} \), 오일 에멀션 \( 2 \mathrm{ml}, 2 \mu \mathrm{M} \) fluorescein 용액 \( 1 \mathrm{ml} \), 탈이온수 \( 5 \mathrm{ml} \) 을 혼합한 후 10 초 정도 sonication 하고 다시 \( \mathrm{pH} \) 를 7.0으로 조정하였다. Microplate의 각 well에 \( \mathrm{pH} \) 가 조정된 혼합 용액을 \( 180 \mu 1 \) 씩 넣기 효소 시료. \( 20 \mu 1 \) 를 더하여 반응 용액의 최종부피를 \( 200 \mu \) 로 조정하였다. 이렇게 만들어진 반응 용엑에서 기질로 사용된 올리브 오일의 최종 농도는 \( 1 \% \) 가 된다. Fluorescein은 \( 10 \mathrm{mM} \) stock solution을 증류수를 이용하여 사용 직전에 \( 2 \mu \mathrm{M} \) 로 묽혀 사용하였다. 이 실험에서 사용된 Candida rugosa (C. rugosa) lipase는 Sigma에서 구입하였으며 1 Unit은 \( \mathrm{pH} 7.7,37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 조건에서 1 시간에 1.0 마이크로당량의 TAG를 가수분해하는 활성으로 정의하였다. 10×TK 완충용엑의 \( \mathrm{pH} \) 는 필요에 따.라 변경하였으며 효소 시료의 부피 역시 물과 효소 시료를 합한 부피를 \( 120 \mu 1 \) 로 유지하며 필요에 따라 변경하였다. 반응용액이 담긴 microplate를 30 분간 반응시키면서 Victor \( { }^{3} \) multilabel coun-ter (PerkinElmer, USA)를 이용하여 1분 간격으로 형광을 측정하였다. Excitation wavelength와 emission wavelength는 각각 \( 490 \mathrm{~nm} \) 와 \( 514 \mathrm{~nm} \) 로 하였으머 multilabel counter의 온도조절 장치를 이용하여 반응온도를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 로 유시하였다. 활성을 측정할 때마다 항상 효소를 넣지 않은 blank 용액을 만들이 각 측정값에서 blank 값을 빼 주었다. 초기반응속도를 측정하는 것이 일정한 시간이 지난 후의 형광변화를 측정하는 것보다 더 정확한 결과를 가져다 줄 수 있기 때문에 30 분 또는 10 분간 시간에 따른 형광변화 그레프의 기울기 값을 계산하여 반응속도를 구하였다.</p>
올리브 오일과 arabic gum을 물에 넣고 만든게 뭐야?
오일 에멀션