<h2>RT-PCR에 의한 mRNA 발현의 분석</h2><p>TSA 미함유 및 TSA가 함유된 배지에서 48시간 배양된 암세포들에 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 동안 처리하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase (RT)를 이용하여 \( 2 \mu \mathrm{g} \) 의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 template로 사용하여 관찰 대상 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다. 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 를 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산물들을 \( 1 \% \) agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, Sigma)를 이용하여 염색한 후 ultra violet (UV)하에서 확인하였다.</p><h2>Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석</h2><p>TSA 미처리 및 TSA가 처리된 배지에서 자란 세포들을 수집하여 적당량의 lysis buffer (\( 40 \mathrm{mM} \) Tris, \( \mathrm{pH} 8.0 \) , \( 120 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{~NaCl}\), \(0.5 \% \) Nonidet P-40, \(0.1 \mathrm{mM} \) sodium orthovanadate, \( 2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) aprotinin, \( 2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) leupeptin, and \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) PMSF)를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시킨 후, \( 14,000 \mathrm{rpm} \)으로 15 분간 원심분리하여 그 상층액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 측정하였으며, 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, \( 10 \% \) skim milk를 함유한 PBS-T (\( 0.1 \% \) Tween 20 in PBS)에 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 이상 배양하면서 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하였다. 그리고 특정 단백질에 대한 항체를 membrane에 적용시켜 항원 항체 반응을 일으킨 후, PBS-T로 씻어내고 특정 항체에 대한 이차 항체 반응을 실시한 후 enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, 이차 항체로 사용된 horseradish peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Corp.에서 구입하였다.</p>
lysis buffer 를 첨가하여 4도에서 30분간 반응시킨 후 14,000rpm 으로 몇분간 어떤 방법을 이용하여 상층액을 취하였나
15 분간 원심분리