<h2>균체 농도 및 Plasmid 안정성</h2><p>균체 농도는 일정시간마다 채취한 배양액을 적당한 비율로 희석하여 분광광도계(Shimadzu UV-160A, Japan)를 사용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도 (\( \mathrm{OD}_{600} \)) 를 측정하였다. Plasmid 안정성은 배양액을 적당히 희석하여 YPD 평판배지에 도말한 후 자란 100~200개의 colonies를 SD 선별배지로 tooth pick-ing한 다음 형성된 colony 수의 비(백분율)로 측정하였다.</p><h2>균체분획, endoglucanase A 활성 측정 및 분비효율</h2><p>균체 침전물을 Beadbeater (Biospec, Thailand)와 glass beads (\( 0.5 \mathrm{~mm} \))를 사용하여 전세포분획을 얻었으며, 이들 분획과 상등액을 사용하여 각 분획에서의 효소활성을 dini-trosalicylic acid (DNS) 방법으로 5회씩 반복 측정하였다. Endoglucanase A 활성은 \( 1 \%\) CMC를 기질로 사용하여 측정하였으며 \( \mathrm{pH} 5.0\)(\(0.2 \mathrm{M}\) \(\mathrm{Na} \cdot \)) acetate buffer), \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분 당 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 환원당(glucose equivalent)을 생성하는 효소의 양을 \(1 \mathrm{unit}\)로 정의하였다. 각 효소들의 분비효율 (secretion ef-ficiency)은 전체 효소활성 (세포외 활성 + 세포내 활성)에 대한 세포외 효소 활성 비를 백분율로 나타내었다.</p><h2>Colony 활성 염색법</h2><p>효모 형질전환체로부터 endoglucanase A 의 발현 유무는 Congo-red 염색법으로 확인하였다. 즉, \( 1 \%\) CMC 를 함유하는 YPDG 평판배지에서 48 시간 자란 효모 형질전환체 colony들을 증류수로 세척한 후 Congo-red (\( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)) 로 15 분간 반응시켰다. \( 1 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl} \) 로 세척 후 colony 주위의 un-stained white area는 효모에 의해 발현된 endoglucanase A 에 의해 CMC 가 \( \beta \) (1-4) glucan으로 가수분해되었음을 나타낸다.</p><h2>SDS-PAGE 및 active band staining</h2><p>Laemmli 법에 따라 \( 0.1 \% \) SDS 존재 하에서 poly-acrylamide gel (\( 10 \% \)) 전기영동을 수행하였으며, 전기영동 후 gel은 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 염색하였다. Active band staining은 시료를 열처리 하지 않은 것 외에는 위와 동일한 방법으로 SDS-PAGE가 수행되었고, gel를 \( 0.2 \mathrm{M}\) \(\mathrm{Na} \cdot \) acetate buffer ( \( \mathrm{pH} 5.0\))에 10 분 동안 담그어 SDS를 제거하고 \( \mathrm{pH} \) 를 보정한 후 잠시 표면을 건조 시킨 뒤 \( 1 \% \) CMC 와 \( 1.5 \% \) agar를 섞어 녹인 slab gel을 중층하고 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 또는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응시켰다. 반응 후 agar gel을 Congo-red 염색하여 endoglucanase A 활성을 갖는 단백질 band를 확인 하였다.</p>
흡광도는 어느 파장에서 측정하였는가?
\( 600 \mathrm{~nm} \)