</p><h1>재료 및 방법</h1><h2>식물재료</h2><p>본 연구에서는 S. hygroscopicus 유래의 bar 유전자가 도입된 제초제저항성 GM 잔디에 감마선 (\( { }^{60} \mathrm{Co} \))을 조사하여 육성한 GM 들잔디 이벤트 JG21-MS1 과 대조구 식물로서 JG21-MS1의 모품종 들잔디(Zoysia japonica Steud.)를 사용하였다.</p><h2>일반성분 분석</h2><p>일반성분 분석을 위한 잔디 시료는 LMO환경위해성평가기관으로 지정된 제주대학교 및 서귀포시 남원 LMO격리포장에서 재배하여 사용하였다. 일반성분 분석을 위한 시료는 제주대학교 및 남원의 격리포장에서 재배되고 있는 잔디의 지상부를 대상으로 7 ~ 9월 사이에 채취하였고, 채취한 잔디는 액체질소를 이용하여 분말화한 다음 동결건조하여 분석용 시료로 사용하였다. 일반성분 분석은 제주대학교 생명과학기술혁신센터에 의뢰하여 식품공전의 일반시험법에 따라 분석하였다.</p><h2>아미노산 분석</h2><p>아미노산 분석을 위한 잔디 시료는 일반성분 분석에 사용한 시료와 동일한 방법으로 준비하였고 아미노산 분석은 한국기초과학지원연구원에 의뢰하여 분석하였다. 잔디 분말 약 \( 0.3 \mathrm{~g} \)을 \( 6 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \)로 직접 가수분해하고 가수분해된 아미노산을 PITC (phenylisothiocyanate)로 유도체화한 다음 아미노산 분석기를 이용하여 분석하였다. 칼럼은 Nova-Pak \( \mathrm{C}_{18}\)(\(3.9 \times 300 \mathrm{~mm} \), Waters Co., Milford, MA, USA)을 사용하였다.</p><h2>아미노산 서열 상동성 검색</h2><p>제초제저항성 GM 들잔디에서 발현된 PAT (phosphinothricin acetyltransferase) 단백질의 아미노산 서열과 기존 알레르겐과의 아미노산 서열 상동성 분석은 AllergenOnline 프로그램을 이용하여 수행하였다. Codex 지침과 FAO/WHO에서 권장하고 있는 방법에 따라 80개 단위의 아미노산 단편이 \( 35 \% \) 이상 상동성을 가질 경우와 8개의 연속된 아미노산 서열이 완전히 일치하는 알레르겐의 존재유무를 검색하였다. 또한 NCBI의 BLAST 검색을 통하여 제초제저항성 GM 들잔디에서 발현된 PAT 단백질의 기존 독소와의 상동성 여부를 분석하였다.</p><h2>PAT 단백질 정제</h2><p>PAT 단백질의 인공위액에서의 안정성 평가 및 급성 경구투여 독성시험 연구를 수행하기 위해 대장균에서 PAT 단백질의 발현을 유도하고 대량으로 정제하였다. 제초제저항성 유전자인 bar 유전자가 도입되어 있는 형질전환 들잔디(JG21-MS1)에서 genomic DNA를 분리하고 이를 주형으로 PCR을 수행하여 bar 유전자를 클로닝한 다음 pET-30a(\(+\)) 벡터에 도입하였다. Bar 유전자를 도입한 발현 벡터는 E. coli BL21(DE3)에 형질전환하고, kanamycin이 \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 로 첨가된 LB 고체배지에 도말하여 형질전환된 콜로니를 선발한 다음 PAT 단백질의 발현 및 정제에 이용하였다. PAT 단백질의 발현은 IPTG를 최종농도가 \( 1 \mathrm{mM} \) 이 되도록 첨가하여 유도하였고, PAT 단백질은 Ni-Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences) 칼럼을 이용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 정제하였다. 정제된 PAT 단백질은 PBS buffer로 투석한 다음 항체 제작, 인공위액에서의 안정성평가 및 급성 경구투여 독성시험 연구에 사용하였다.</p><h2>PAT 단백질의 인공위액에서의 안정성평가</h2><p>대장균에서 정제한 PAT 단백질을 펩신을 첨가하지 않은 인공위액 ( \(0.084 \mathrm{M} \mathrm{HCl}\), \(35 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(\mathrm{pH} 1.2 \))과 펩신을 첨가한 인공위액 (\( 0.084 \mathrm{M} \mathrm{HCl}\), \(35 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(0.32 \% \) pepsin, \(\mathrm{pH} 1.2\)) 에 각각 처리하고 시간경과에 따른 PAT 단백질의 안정성을 SDS-PAGE를 통하여 분석하였다. 정제한 PAT 단백질 각 \( 300 \mu \mathrm{L} \) (PAT 단백질의 농도, \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) )에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 약 5 분간 전배양한 펩신을 첨가하지 않은 인공위액과 펩신을 첨가한 인공위액을 각각 \( 300 \mu \mathrm{L} \)씩 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60분간 반응시켰다. 각 반응액에서의 샘플은 0, 0.5, 1,5, 10, 60분에 각각 \( 50 \mu \mathrm{L} \) 씩 채취하여 반응정지액 [\(0.12 \mathrm{M} \mathrm{Tris}-\mathrm{HCl}\), \( 20 \% \) glycerol, \( 5 \% \beta- \)mercaptoethanol, \( 4 \% \) SDS, \( 0.04 \% \) bromophenol blue \(\mathrm{pH} 6.8\)) and \( 0.09 \mathrm{M} \mathrm{NaOH} \)] \( 50 \mu \mathrm{L} \)를 미리 넣어 둔 \( 1.5 \mathrm{~mL} \) 튜브에 넣어 잘 혼합한 후 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 반응시킨 다음 각각 \( 20 \mu \mathrm{L} \)씩을 SDS-PAGE 분석에 사용하였다. SDS-PAGE에 의해 분리된 단백질들은 CBB로 염색한 다음, \( 7.5 \% \) 아세트산 용액으로 탈색하여 PAT 단백질의 인공위액에서의 안정성을 평가하였다.</p>
일반성분 분석을 위한 잔디 시료는 언제 채취하였나?
7 ~ 9월 사이