<h1>재료 및 방법</h1><h2>균주 분리 및 배지</h2><p>충청남도와 충청북도 목천과 오창 일원의 논 토양을 채취하여, 각각의 토양 \( 1 \mathrm{~g} \)을 멸균 생리식염수 \( 100 \mathrm{ml} \)이 들어 있는 \( 250 \mathrm{ml} \) 삼각 플라스크에 넣고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 진탕한 후, 그 현탁액 100 µl를 망간 최소배지 (\( 0.05 \% \) yeast extract,\( 0.05 \% \) casamino acid,\( 0.0901 \% \) glucose,\( 0.2603 \% \) HEPES,\( 0.007 \% \) \( \mathrm{CaCl}_{2} \),\( 0.014 \%\) \(\mathrm{MgSO}_{4} \),\( 0.0001 \%\) \(\mathrm{FeCl}_{3} \),\( 0.002 \%\) \(\mathrm{MnCl}_{2} \),\( 1 \mathrm{ml} \) trace element solution,\( \mathrm{pH} 7.0 \))에 접종하고 \(2 \sim 3\)일 배양한 다음, 단일 콜로니를 분리하였다. 분리된 세균집락은 망간 최소 고체배지에 접종해서 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하며 갈색 콜로니를 형성하고 생장이 가장 우수한 균주를 육안으로 확인하여 1차 선별하였고, 1차 선별된 균주 중 최소배지에서 성장이 가장 우수하고, 망간산화능이 가장 우수한 규주를 최종 선별하여 본 실험에 사용하였다. 당 이용능은 bushnell-hass 최소배지 (\(0.02 \% \) magnesium sulfate, \( 0.002 \% \) calcium chloride, \( 0.1 \% \) monopotassium phosphate, \( 0.1 \% \) ammonium phosphate di-basic, \( 0.1 \% \) potassium nitrate, \( 0.005 \% \) ferric chloride, \( \mathrm{pH} \) 7.0)에 \( 1 \% \)의 당을 단일 탄소원으로 첨가하여 조사하였고, 영양배지로는 nutrient broth (NB, \( 0.3 \% \) beef extract, \( 0.5 \% \) peptone, \( \mathrm{pH} \) 7.0)를 사용하였다.</p><h2>생리, 생화학적 특성 조사</h2><p>최종 선별된 균주는 Bergey's mannual of systematic bacteriology와 LWW's Organism Central 및 Biochemical tests for identification of medical bacteria에 의거하여 형태, 생리 및 생화학적 특성을 조사하였고, 당 이용능과 중금속과 항생제 내성 등의 균주 특성도 조사하였다.</p><h2>16S rRNA 염기 서열 조사</h2><p>최종 선별 균주의 정확한 동정을 위해 최종 선별균주의 genomic DNA를 CTAB방법으로 추출하고, 이 DNA률 주형으로 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하여 16S rRNA 유전자 염기 서열을 조사하였다. 이 때 선별 균주의 16S rRNA를 증폭하기 위해 forward primer 5 -AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'(27F)와 reverse primer 5 -GGT TAC CTT TGT TAC GAC TT-3'(1492R)를 사용하고(BIONEX), 염기서열은 ABI model 310(Applied Bio-system, U.S.A)을 사용하여 분석하였다. 이렇게 분석된 rDNA 염기서열은 BLAST search (wWW. ncbi.nih.gov/BLAST/)를 사용하여 비표, 분석 하였다.</p><h2>망간 산화능 조사</h2><p>Aeromonas sp. MN44의 망간산화능과 관련된 factor가 세포내부에 있는 물질인지 아니면 세포밖으로 분비되는 물질인지 확인하기위해 세포외 분비물질은 배양 상등액으로, 그리고 세포내 물질은 세포를 초음파로 파쇄하여 용균 시킨 것으로 망간 산화능을 측정하였다.</p><p>\( 100 \mu \mathrm{M} \mathrm{~MnCl_{2}}\)가 함유된 NB 영양배지에 균을 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 배양하며 시간별로 일정량을 취하여 실온에서 \( 10,000 \times \mathrm{g} \)로 5분간 원심분리 하여 얻은 상등액은 세포 외 분비물질 시료로, 그리고 침전된 균액은 \( 300 \mu \mathrm{l} \)의 \( 10 \mathrm{~mM} \) HEPES-\(\mathrm{NaOH}\)\((\mathrm{pH} 7.4) \) 완충액으로 현탁 시킨 후 15초 동안 얼음에서 파쇄하고 15초 쉬는 것을 6번 반복해서 3분간 파쇄 (output watts 14W; SONICS \& MATERIAL INC., Vibra-Cell \( ^{\mathrm{TM}} \), U.S.A.)하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 10,000 \times \mathrm{g} \) 로 15분간 원심분리하여 얻은 상등액을 세포내 물질 시료로 사용하였다. 각 시료의 망간 산화능은 \( 45 \mathrm{mM} \) acetic acid에 \(0.04\%\) Leukoberbelin blue를 첨가한 반응액 \( 1 \mathrm{ml} \)에 기질로 \( \mathrm{MnCl}_{2} \) 를 \( 100 \mu \mathrm{M} \) 이 되게 첨가하고 시료 \( 0.2 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후, 분광광도계를 이용하여 \( 620 \mathrm{~nm} \)에서 홉광도로 조사하였고 시료를 첨가하지 않은 용액을 대조구로 사용하였다. 표준곡선은 \( \mathrm{KMnO}_{4} \)를 시료 대신 사용하여 망간의 산화된 정도를 비교 분석하였으며 이때 \( 40 \mu \mathrm{M} \)의 \( \mathrm{KMnO}_{4} \)는 100\( \mu \mathrm{M} \)의 \( \mathrm{MnO}_{2} \)와 같은 산화 값을 갖고, 망간 산화 활성은 1분 동안 \( 1 \mathrm{nmol} \)의 망간이 산화하는데 관여하는 양을 \( 1 \mathrm{unit} \)로 환산하였다.</p><p>또 완충액의 \( \mathrm{pH} \)가 망간 산화능에 미치는 영향을 조사하기 위하여 \( 10 \mathrm{mM}\) HEPES-\(\mathrm{NaOH} \) 완충액을 \( \mathrm{pH}\) 4, \( \mathrm{pH}\) 5, \( \mathrm{pH}\) 6, \( \mathrm{pH}\) 7, \( \mathrm{pH}\) 7.4, \( \mathrm{pH}\) 8, \( \mathrm{pH}\) 9, \( \mathrm{pH}\) 10으로 각각 조정하여 균배양액을 첨가한 후 망간 산화능을 조사하였다</p><h2>망간 산화 factor의 정제</h2><p>최종선별균주가 생성하는 망간산화 factor의 분리를 위해 NB 배지 1 l에 균을 배양한 후, 배양액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 \( 6,000 \times \mathrm{g} \)로 원심 분리하여 상등액을 제거하고 균체를 얻었다. 이 균체를 \( 10 \mathrm{mM}\) HEPES-\(\mathrm{NaOH} \) (\( \mathrm{pH}\) 7.4) 완충액으로 3번 세척 후 동일 완충액 \( 100 \mathrm{ml} \)로 현탁 시켜 얼음에서 sonication (output watis 14W; SONICS \& MATERIAL INC., VIbra-Cell \( ^{\mathrm{TM}} \), U.S.A)후 원심분리 \( \left(10,000 \times \mathrm{g}, 20\right. \)분, \( \left.4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 하여 상등액을 얻었다. 이렇게 얻어진 상등액은 \( 10 \% \) 35\% ammonium sulfate로 침전시킨 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 10,000 \times \mathrm{g} \) 에서 20 분 동안 원심분리하고 \( 10 \mathrm{mM}\) HEPES-\(\mathrm{NaOH} \) (\( \mathrm{pH}\) 7.4) 완충액 \( 3 \mathrm{ml} \)에 녹인 후, 같은 완충액으로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 Spectrum Nedical Industries, Inc., MWCO: 12-14,000(VWR Scientific, USA) 투석막을 이용하여 투석하였다. 투석된 시료는 \( 10 \mathrm{mM}\) HEPES-\(\mathrm{NaOH} \) (\( \mathrm{pH}\) 7.4) 완충액으로 평형화된 DEAE-toyopearl 650\( \mathrm{M} \)으로 충진된 column \( (2.5 \times 20 \mathrm{~cm}) \)에 \( 0.0 \mathrm{M}-1.0 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \)로 농도경사를 유지하며 유속을 \( 2 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 로 하여 1200분 동안 완충액을 흘려주면서 단백질을 용출하고, 이중 망간 산화능이 있는 분획을 모아 동결건조한 후 \( 0.5 \mathrm{ml} \)의 \( 10 \mathrm{mM} \) HEPES-\( \mathrm{NaOH}(\mathrm{pH} \) 7.4)완충액에 다시 녹여 \( 10 \mathrm{mM} \) HEPES- \( \mathrm{NaOH} \)\( (\mathrm{pH} \) 7.4) 완충용액으로 평형화한 Sephadex G-200(Pharmacia, USA)으로 충진된 column \( (1 \times 90 \mathrm{~cm}) \)에 주입하여 \( 0.25 \mathrm{ml} /\min \) 속도로 800분간 총 \( 200 \mathrm{~ml} \)의 동일 완충액을 홀려주어 망간활성능이 있는 분획을 모아 동결건조 후 동일 완충액에 녹여 전기영동 하였다. 이때 망간산화 factor의 분자량은 Laemmli 방법에 따라 \(12\%\) SDS polyacrylamide 전기영동장치(Mighty Small \( { }^{\mathrm{TM}} \) SE245, Hoefer)를 이용하여 확인하였고, 표준 단백질로는 Bio-Rad사의 myosin (\( 209 \mathrm{kDa} \)), \( \beta \)-galacto-sidase (\( 124 \mathrm{kDa} \)), bovine serum albumin (BSA,\( 80 \mathrm{kDa} \)) , ovalbumin (\( 49.1 \mathrm{kDa} \)), carbonic anhydrase (\( 34.8 \mathrm{kDa} \)), soybean trypsin inhibitor (\( 28.9 \mathrm{kDa} \)), lysozyme (\( 20.6 \mathrm{kDa} \)), aprotinin (\( 7.1 \mathrm{kDa} \))를 사용하였다. 또 정제된 factor의 망간산화능은 native gel을 이용하여 전기영동한 gel을 망간 최소배지에 부착하여 24시간 반응시킨후 나타난 band를 \( 12 \% \) SDS poly-acrylamide gel과 비교하여 조사하였다.</p>
최종 선별 균주의 정확한 동정을 위해 genomic DNA를 어떻게 추출했는가?
CTAB방법