<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주 및 plasmids</h2><p>Plasmid 구축 및 증폭을 위한 E. coli 숙주세포는 DH5\( \alpha \)를 사용하였고, C. thermocellum endoglucanase A 유전자(celA) 발현을 위한 효모 숙주세포는 invertase 결손 변이주 (suc2-9) 및 uracil 영양요구성 변이주 (ura3-52)이며 haploid인 Saccharomyces cerevisiae SEY2102 와 S. cerevisiae 2805를 사용하였다. Endoglucanase A 공여 plasmid는 GAPDH pro-moter 하류에 celA를 subcloning한 pYGAP-CT1 을 사용하였다. 효모 S. cerevisiae에서 celA를 발현하기 위해 GAL10 promoter와 K. marxianus exoinulinase 유전자(INU1)의 분비 서열을 포함하는 pYInu-AT를 이용하였다.</p><h2>재조합 plasmid 제작 및 형질전환</h2><p>효모에서의 endoglucanase A 자체 분비 서열과 GAL10 promoter 이용하기 위한 plasmid 구축은 celA를 함유한 pYGAP-CT1와 primer-1 (5'- CCG GAA TTC TCT AGA ATG AAG AAC GTA AAA AAA AGA GTA GG-3'), primer-2 (5'-GCT GTC GAC CTA ATA AGG TAG GTG GGG TAT G(T-3') 를 이용하여 celA 유전자를 증폭하고, plasmid DNA mini-prep kit (Geneall Biotechnology Co., Ltd)를 이용하여 정제하였다. 얻어진 단편은 EcoR I / Sal I 으로 처리하고 동일한 제한효소에 의해 pYInu-AT 의 INU1 분비 서열과 \( \alpha_{1} \)-antitrypsin 유전자를 celA로 치환시켜 pYEG-CT1을 구축하였다. INU1 분비 서열과 GAL10 promoter를 이용하여 celA 를 발현시키기 위한 plasmid 구축은 pYGAP-CT1와 pri-mer-3 (5'-GCT AGA TCT GCA GGT GTG CCT TTT AAC ACA-3'), primer-2를 이용하여 자체 분비 서열을 제외한 성숙형 endoglucanase A 를 encoding하는 부분을 증폭, 정제하였다. 얻어진 단편은 Bgl Ⅱ /Sal Ⅰ 으로 처리하고 동일한 제한 효소에 의해 pYInu-AT의 \( \alpha_{1} \)-antitrypsin 유전자 대신에 성숙 endoglucanase A 유전자가 치환되어 pYInu-CT1이 구축되었다. 구축된 재조합 plasmid는 E. coli DH5\( \alpha \)로부터 증폭, 추출하여 LiCl 법으로 효모 숙주세포 S. cerevisiae SEY2102와 S. cerevisiae 2805에 형질전환하였다.</p><h2>효모 형질전환체 선별 및 배양조건</h2><p>효모 형질전환체의 선별을 위한 배지로는 SD 배지 (\( 0.67 \% \) Bacto-yeast nitrogen base without amino acids, \( 0.5 \% \) casa-mino acids, \(2\%\) dextrose)를 사용하였고, 재조합 효모의 배양은 YPD 배지 (\( 1 \% \) Bacto-yeast extract, \(2 \% \) Bacto-peptone, \( 2 \% \) dextrose) 또는 YPDG 배지 (\(1 \% \) Bacto-yeast extract, \(2 \% \)Bacto-peptone, \( 1 \% \) dextrose, \( 1 \% \) galactose)를 사용하였다. 재조합 효모 균주는 \( 10 \mathrm{ml}\) SD 배지에서 24 시간 동안 전배양 한 후 \( 500 \mathrm{ml} \) baffled-flask (working volume : \( 50 \mathrm{ml} \) )에 접종 (\( 1 \%, \mathrm{v} / \mathrm{v} \)) 하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(200 \mathrm{rpm} \) 에서 48 시간 배양하면서 12 시간 간격으로 균체 농도와 endoglucanase A 발현양과 분비 국재성을 측정하였다. 각각의 숙주세포에 따른 형질전환체들 중 발현율이 높은 것을 얻기 위해 \( 10 \mathrm{ml} \) 시험관 배양과 colony 활성 염색이 수행되었다. Colony 활성 염색의 배지로는 carboxymethyl cellulase sodium salt (CMC, Junsei Chemical Co., Ltd.)를 \(1\% \) 함유한 YPDG 배지를 사용하였다.</p>
본 연구에서 Plasmid 구축 및 증폭을 위한 E. coli 숙주세포는 무엇을 사용했어?
DH5\( \alpha \)