<h2>단백질 분리, 전기영동 및 Western blot analysis</h2><p>준비된 세포들을 적당량의 lysis buffer [\(25 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{Cl}(\mathrm{pH} 7.5\)), \( 250 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(5 \mathrm{mM} \) EDTA, \(1\%\) NP-40, \( 1 \mathrm{mM} \) phenyl-methylsulfonyl fluoride (PMSF), \( 5 \mathrm{mM} \) dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응 시킨 후, \( 14,000 \mathrm{rpm} \)으로 30분간 원심분리하여 상층액을 모았다. 상층액의 단백질을 정량화한 후 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)에 전이시킨 후, 비특이적인 단백질에 대해 blocking을 실시하였다. 준비된 membrane을 적정 항체로 반응시킨 후 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlignton Heights, IL, USA)을 처리하여 특정 단백질의 발현 정도를 비교하였다.</p><h2>In vitro caspase activity 측정</h2><p>동일한 조건에서 준비된 세포들의 단백질을 96-well plate에 동량 분주하고 \( 2 \times \) reaction buffer를 각각 \( 50 \mu \mathrm{l} \)씩 넣어 주어 총 \( 100 \mu \mathrm{l} \)가 되게 한 후 각각의 caspase 기질을 첨가하였다. 준비된 plate를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 암상태에서 3시간 동안 incubation 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 \( 405 \mathrm{~nm} \)의 파장에서 흡광도를 측정하였다. Caspase 활성 측정을 위한 colormetric assay kit는 R\(\&\)D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였고, 실험에 사용된 기질은 caspase-3의 경우에는 Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA)이었고, caspase-8의 경우에는 Ile-Glu-Thr-Asp (IETD)-pNA이었으며, caspase-9은 Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA였다.</p><h2>통계 처리</h2><p>모든 실험결과는 평균 \( \pm \) 표준편차로 표시하였고 SigmaPlot을 이용하여 Student \( t \)-test를 이용하여 통계적 유의성을 얻었다.</p>
서로 다른 단백질을 분리하는 방법은 무엇인가?
전기영동