<p>(2) Acylthiocholine ester의 ChE에 의한 가수분해도상수</p><p>촉매화된 BChE에 의한 acylthiocholine의 가수분해는 Ellman에 의해 설명된 coupled enzyme assay로 측정하였다.</p><p>촉매화된 EE-BChE 에 의한 가수분해 초기반응속도의 측정에 사용된 기질, 효소, 발색제는 cuvette내의 농도로 계산하여 제조하였고 염화나트륨 NaC 이 \( 0.1 \mathrm{~N} \) 첨가된 \( p \mathrm{H} \) \( 7.3 \) 인 \( 0.1 \mathrm{M} \) 인산염(sodium phosphatej 완충용액에 녹였다. 각 기질 \( (200 \mu l / 1000 \mu \ell) \) 은 예상되는 \( \mathrm{K}_{\mathrm{M}} \) 의 \( 1 / 10 \) 배 농도에서 부터 시작하여 10 배 농도까지, Michaelis 상수 \( K_{M} \) 과 최대 속도 \( \mathrm{V}_{\max } \) 가 큰 오차 없이 유도될 수 있도록 2 배수의 농도로 여덟 가지를 제조하였다. DTNB는: \( 0.5 \mathrm{mM}(100 \mu \ell / 1000 \) \( \mu \ell) \) 이 되도록 제조하였고, 측정이 용이하도록 BChE \(50 \mu l / \) \( 1000 \mu \ell) \) 의 농도는 4unit가 되도록 제조하였다. 반응속도 측 정시 cuvette내의 최종량이 \( 1000 \mu l \) 가 되도록 준비된 시료들은 냉동 보관하면서 각각의 농도로 제조한 acylthiocholine 한가지씩을 준비된 DTNB와 인산염 완충용액과 함께 autopipettes을 사용하여 cuvette에 채우고 온도를 \( 25.0 \pm \) \( 0.1^{\circ} \mathrm{C} \) 를 유지하며 BChE가 없는 상태로 3 분 40 초간 cuvette 안에서 배양시킨 후 BChE 를 넣고 잘 섞은 다음 60 초 동안의 초기반응속도를 측정하였다. 각 농도에 대해 2회씩 반복하여 측정하였다.</p><p>HepTCh, OcTCh의 촉매화된 BChE에 의한 가수분해 초 기반응속도의 측정은 신뢰성을 확보하기 위해 HexTCh 의 실험과 동일한 조건에서 진행하였고, 실험 결과의 대조구가 되는 ATCh, BuTCh, PrTCh의 가수분해 초기반응속도의 측정값과 비교하였다.</p><h2>HexTCh 에 의해 촉매화된 BChE 의 pH-rate profile</h2><p>HexTCh의 cuvette내의 농도는 초기반응속도 연구에서 얻은 \( \mathrm{K}_{\mathrm{M}}(1.4 \mathrm{mM}) \) 의 약 \( 1 / 15 \) 배 \( (0.01 \mathrm{mM}) \) 의 아주 낮을 때와 8 배(10mM)의 아주 높을 때로 나누어 실험하였다. 즉 Hex\( \mathrm{TCh} \) 의 농도가 \(\mathrm{K}_{\mathrm{M}} \) 보다 아주 작은 \( \mathrm{V} / \mathrm{K} \) 조건과 \( \mathrm{K}_{\mathrm{M}} \) 보다 아주 큰 \( \mathrm{V}_{\max } \) 조건이다. 넓은 범위의 \( p \mathrm{H} \) 완충용액은 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate 완충용액 \( (p \mathrm{H} 3.98 \sim 5.56) \) 과 \( 0.1 \mathrm{M} \) 인산염 완충용액 \( (p \mathrm{H} \mathrm{5.75} 7.95) \) 을 대략 \( p \mathrm{H} \) 가 \( 0.2 \) 정도 차이가 생기도록 각각 제조하였으며 이 각각의 완충용액에 두 가지 농도의 HexTCh을 제조하였고, DTNB는 HexTCh의 농도가 \( \mathrm{V} / \mathrm{K} \) 조건일 때 \( 0.26 \mathrm{mM} \) 로, 또 \( \mathrm{V}_{\max } \) 조건일 때 \( 0.5 \mathrm{mM} \) DTNB 가 되도록 녹여 용액을 만들었다. BChE 용액은 HexTCh의 농도가 \( \mathrm{V} / \mathrm{K} \) 조건일 때 10unit로, \( \mathrm{V}_{\max } \) 조건일 때 3unit로 실험을 진행하였으며, \( p \mathrm{H} \) 7.1의 완충용액에 녹이되 아주 높은 농도로 제조하여 실제적인 cuvette내의 \( p \mathrm{H} \) 에 주는 영향을 최소화하였다.</p><p>Cuvette에 각각의 \( p \mathrm{H} \) 로 제조한 HexTCh, DTNB, 완충용 액을 두 가지 농도에 대하여 초기반응속도 측정과 동일한 방법으로 수행하였고, \( \mathrm{V}_{\max } \) 조건일 때는 BChE 가 없이 3 분 40 초 후에 자발적으로 일어나는 가수분해 속도를 측정하여 BChE 에 의한 가수분해 반응속도에서 감하여 보정하였다.</p><h2>HexTCh에 의해 촉매화된 BChE의 용매동위원소 효과</h2><p>BChE에서 HexTCh의 proton inventory는 cuvette내의 농도가 초기 반응속도 연구에서 얻은 \( \mathrm{K}_{\mathrm{M}} \) 의 약 \( 1 / 15 \) 의 아주 작을 때와 8 배의 아주 클 때로 나누어, \( \mathrm{V} / \mathrm{K} \) 조건과 \( \mathrm{V}_{\max } \) 조건을 만들었다. 같은 농도의 인산염을 함유한 중수소 치환된 완충용액 \( \left(\mathrm{D}_{2} \mathrm{O}\right) \) 과 양성자 치환된 완충용액 \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\right) \) 에 \(\mathrm{V} / \mathrm{K} \) 조건과 \( \mathrm{V}_{\max } \) 조건을 갖도록 두 가지 농도의 HexTCh를 두 완충용액 간에 동일한 농도로 각각 제조하였다. DTNB는 동일하게 \( 0.3 \mathrm{mM} \) 되도록 각각 녹여 용액을 만들었다. BChE용액은 \( \mathrm{V} / \mathrm{K} \) 조건일 때 10unit로, 또 \( \mathrm{V}_{\max } \) 조건일때 5unit로 실험을 진행하였으며, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 완충용액에 녹이되 아주 높은 농도로 제조하여 실제적인 cuvette내에 미치는영향을 최소화하였다. 두가지 농도에 대하여 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 완충용액으로 제조한 HexTCh, DTNB, 완충용액과 \( \mathrm{D}_{2} \mathrm{O} \) 완충용액으로 제조한 HexTCh, DTNB, 완충용액을 몰분율에 맞게 0 부터 약 1 까지 0.1단위, 총 11 종류로 교차시켜가며 증감하여 cuvette에 담아 각각의 몰분율에 대해 초기반응속도 측정과 동일한 방법으로 2회 이상 측정하였다.</p><p>DecTCh은 \( 48 \% \) 의 수득율로 합성되었는데 분자구조상 4 차 암모늄 구조를 가지지만 탄소 사슬이 길어짐에 따라 물에는 용해되지 않았다. 따라서, 먼저 물로 세척하여 불순물을 제거한 후 alcohol, ether, methylene chloride 등에 용해시켜 용해되지 않는 불순물을 제거하여 순수한 DecTCh을 얻었다.</p><p>첫 번째 방법으로 합성한 acylthiocholine chloride는 매우 흡습성이 강하여 효소와의 반응을 위한 기질로 사용하기 위해 매우 조심스레 다루어야 했다. 반면에 두 번째 방법으로 합성한 acylthio- choline iodide는 흡습성을 가지지 않았고 아실기 탄소 개수가 10 개인 DecTCh은 물에 용해되지 않았다. 첫 번째 방법으로 DecTCh chloride를 합성한다면 반응속도론적 연구에 적합한 수용성 DecTCh을 합성할 수 있을 것으로 기대된다.</p>
BChE의 농도를 4unit이 되도록 제조한 이유는 무엇인가?
측정이 용이하도록