<h1>재료 및 방법</h1><h2>유용 미생물의 선별</h2><p>본 연구실에서 선별해 놓은 균주들 중에서 tri-calcium phosphate와 hydroxyapatite가 함유된 sucrose minimal SM 고체배지(sucrose \( 10 \mathrm{~g}\),\( \mathrm{NH}_{4} \mathrm{NO}_{3} ~0.27 \mathrm{~g}\),\( \mathrm{~KCl} ~0.2 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~0.1 \mathrm{~g}\),\( \mathrm{MnSO}_{4} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~1 \mathrm{mg}\),\( \mathrm{~FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~1 \mathrm{mg} \), Yeast extract \( 0.1 \mathrm{~g} \), 난용성 인산염 \( 5 \mathrm{~g} \), agar \( 12 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) )에 접종하여 \( 27^{\circ} \mathrm{C}\), 3일간 배양하여 가장 높은 투명대(clear zone)를 형성하는 균주를 선발하였다.</p><h2>균주의 배양 조건 및 배지</h2><p>성장 양상을 조사하기 위해 사용한 배지조성 \( (\mathrm{g} / \mathrm{l}) \)은 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~15 \mathrm{~g}\),\( \mathrm{~KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} ~3 \mathrm{~g}\),\( \mathrm{~NaCl} ~0.5 \mathrm{~g}\),\( \mathrm{~NH}_{4} \mathrm{Cl} ~1 \mathrm{g} \), 멸균 전 \( \mathrm{pH} \)는 7.4이며, \( \mathrm{CaCl}_{2} ~1 \mathrm{~nM} \), casamino acid 와 Glucose는 분리 멸균하여 최종농도가 각각 \( 0.2 \% \) 가 되도록 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15분간 분리 멸균 후 첨가하였고 아미노산은 멸균 후 배양액의 \( 0.1 \%\), \(0.05 \% \)가 되도록 첨가하였다. 계대 배양된 각각의 균주를 \( 500 \mathrm{~ml} \) 삼각 플라스크에 \( 100 \mathrm{~ml} \)의 배지에 접종하였다. 아미노산 농도별로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 180 \mathrm{~rpm} \)으로 rotary에서 108시간동안 배양을 실시한 다음, 주기적으로 성장 양상을 살펴보기 위하여 배양시간에 따른 \( \mathrm{pH} \) 값의 변화를 측정하였고, 세포 성장률은 분광광도계(Helios \( \beta \), Unucan, England)를 사용하여 흡광도 \( 600\mathrm{~nm} \)에서 변화 값을 측정하였다.</p><h2>아미노산액 농도에 따른 인산가용화 특성 조사</h2><p>아미노산액에 의한 가용화 특성은 DA23과 DA71-1 균주를 사용하여 SM 액체배지 \( 100 \mathrm{~ml} \)에 아미노산액을 각각 \( 0.1 \%\), \(0.05 \%\), \( 0.01 \% \)의 농도로 첨가하여 조사하였다. DA23과 DA71-1은 \(0.5\% \)tri-calcium phosphate 및 \( 0.5 \% \) hydroxyapatite가 포함된 SM배지에서 108 시간동안 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(\mathrm{pH} ~6.0\), \(180 \mathrm{~rpm} \)으로 배양하면서 12시간 단위로 균주에 의한 \( \mathrm{pH} \) 변화와 유리인산생성능을 조사하였다.</p><h2>아미노산액 농도에 따른 DA23, DA71-1의 인산 가용화능의 측정</h2><p>삼각 플라스크 \( (500 \mathrm{ml}) \)에 \( 0.5 \% \)의 인산염이 함유된 SM 액체배지 \( 100 \mathrm{~ml} \)에 전배양한 균주를 접종한 후, 배양 상등액내의 유리인산 농도와 \( \mathrm{pH} \) 변화를 12시간마다 측정하였다. 균체배양액 \( 1 \mathrm{~ml} \)을 소형 원심용 튜브에 담은 후, 소형원심분리기로 실온에서 \( 5,500 \mathrm{~rpm} \)으로 10분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액을 취하고, 여기에 멸균수를 첨가하여 총 \( 200\mathrm{~ul} \)가 되게 하였다. 여기에 phosphorus reagent \( 800 \mathrm{~ul} \) 를 첨가하여 혼합한 후 20분간 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시킨 다음 \( 820 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 이때 phosphrous reagent는 kit (Sigma) 를 사용하였다.</p><h2>인산염별에 따른 인산가용화 특성 조사</h2><p>인산 가용화 균주, DA23 및 DA71-1의 인산염별에 따른 아미노산에 의한 난용성 인산염 가용화능의 차이는 tri-calcium phosphate와 hydroxyapatite 인산염을 사용하여 조사하였다. 균주에 의한 \( \mathrm{pH} \) 변화와 유리인산 생성능은 12시간마다 변화를 측정하였으며, 이상의 배양 환경에 관한 모든 실험은 2회 반복 수행하여 평균값을 구함으로서 실험 오차를 최소화하였다.</p>
sucrose minimal SM 고체배지에 포함된 난용성 인산염의 질량은 무엇인가?
\( 5 \mathrm{~g} \)