<h1>결과</h1><h2>Immunofluorescent staining</h2><p>다양한 농도의 EGCG를 C2C12 myoblast 세포에 4일간 처리한 후 phase 상에서의 사진을 관찰한 결과 형태학적인 측면에서 C2C12 myoblast가 EGCG 처리 후 smooth muscle 세포로 분화되는 것을 관찰하였다. 세포의 형태로 보았을 때 Fig.2(a)에서 보는 바와 같이 대조군에서는 C2C12 myoblast 세포의 형태가 둥근 형태를 보이며, plate상에 \( 1 \times 10^{4} \) 로 세포를 분주한 후 4일이 경과하자 세포의 수가 많이 증식되었음을 확연히 관찰할 수 있다. 하지만 EGCG로 처리한 후 4일이 경과하자 Fig. 2c의 phase 사진에서 보듯이 C2C1 myoblast 세포의 형태가 elongation이 되었고 주변 세포들과의 fusion이 일어나서 smooth muscle의 형태를 보임을 알 수 있다. 또한 세포를 분주한 후 4일이 지났음에도 불구하고 EGCG로 처리한 세포에서는 세포의 밀도가 대조군에 비해서 확연히 낮음을 볼 수 있다. 세포의 증식 정도를 좀 더 명확히 알기위하여 DAPI로써 C2C12 myoblast 세포의 핵을 염색하였다. Fig. 2의 b와 d에서 보듯이 파란색으로 염색된 것이 각 세포의 핵을 나타낸다. Fig. 2의 b에서 보듯이 대조군에서는 핵의 숫자가 EGCG 처리된 세포에 비해 그 수와 밀도가 많이 증가하였음을 알 수 있다. 본 연구에서는 서론에서 언급하였듯 이 C2C1 세포를 분화배지 조건에서 배양을 하지 않고, \( 10 \% \) FBS 상태에서 EGCG를 처리하였다. 따라서 핵의 숫자가 EGCG 처리군에 비해 대조군에서 확연히 높다는 것은 EGCG가 세포의 증식을 억제하는 역할을 한다고 사료된다. 또한 이러한 결과가 단지 EGCG의 독성에 의한 결과일 가능성을 생각해 보지 않을 수 없다. 만약 독성에 의한 증식 억제라면 세포의 숫자에서는 EGCG 처리군이 적다고 하더라도 형태적으로도 같은 모양이 관찰되어야 할 것이다. 하지만, Fig. 2c의 phase 사진에서 보듯이 형태적으로 대조군과 비교하였을 때 전혀 다른 형태의 세포로 분화되었음을 알 수 있다.</p><h2>Transgelin mRNA</h2><p>Transgelin 유전자는 smooth muscle에 특징적으로 발현되는 유전자로서 smooth muscle의 지표(marker)로서 널리 쓰이고 있다. 따라서C2C12 myoblast 세포에 EGCG를 4일 간 처리한 후 smooth muscle marker인 transgelin mRNA에 어떠한 변화가 일어났는지를 real-time PCR을 이용하여 살펴보기 위하여 세포를 6 wells plate에 \( 1 \times 10^{4} \) 으로 분주를 한 후 24시간 후 EGCG를 대조군에는 처리하지 않았으며, EGCG 처리 군에는 각각 다른 농도 \( (3.125,6.25,12.5,25,50 \) \( \mu \mathrm{M}) \) 로서 4일간 처리하였다. 그 결과 EGCG로 4일간 처리한 세포에서는 transgelin mRNA 발현이 대조군 세포와 비교하 였을 때 농도 의존적으로 증가함을 보여준다. 가장 낮은 농도인 \( 3.125 \mu \mathrm{M} \) 에서는 transgelin mRNA 발현이 대조군 세포와 비교하였을 때 \( 34 \% \) 정도 유의하게 증가하였다. 더 나아가 \( 6.25 \mu \mathrm{M} \) 의 EGCG는 transgelin mRNA 발현을 \( 63 \% \) 정도 유의하게 증가시켰으며, \( 12.5 \mu \mathrm{M} \) 의 EGCG로 처리된 C2C12 myoblast 세포에서는 \( 148 \% \) 정도 중가치를 나타내었다. 본 실험에서 사용한 EGCG의 농도 중 최고 농도인 50\( \mu \mathrm{M} \) 의 EGCG를 4일간 처리하자 transgelin mRNA 발현이 약 9배정도 유의하게 증가되었다. 본 실험의 mRNA 결과는 re-al-time PCR을 실시할 때 각각 샘플의 cDNA copy 수를 보정하기 위하여 transgelin mRNA 발현 정도를 각 샘플의 GAPDH mRNA로 보정하였다.</p><p>시간의 변화에 따른 transgelin mRNA 발현 정도를 살펴보기 위하여 \( 50 \mu \mathrm{M} \)의 EGCG를 각각 24,48,72시간 동안 C2C12 myoblast 세포에 처리한 후 transgelin mRNA 발현 변화를 살펴보았다. \( 50 \mu \mathrm{M} \) 의 EGCG을 24시간동안 세포에 처리한 결과 transgelin mRNA 발현은 대조군과 비교하였을 때 변화가 없었지만 48시간과 72시간동안 EGCG를 처리한 후에는 5-6배 가까이 유의하게 증가하였다.</p><h2>Smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA</h2><p>앞에서 언급한 바와 같이 4일 동안 EGCG를 \( \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) myoblast에 처리 후 smooth muscle a-actin 단백질이 발현됨을 immunofluorescent staining을 통해 입증하였다. 본 연구에서는 더 나아가 EGCG가 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA의 발현에 어떠한 영향을 미쳤는지를 알아보기 위해 smooth muscle \( \alpha \)-actin primer를 이용하여 real-time PCR을 실시하였다. EGCG의 농도가 낮을 때 \( (3.125,6.25 \mu \mathrm{M}) \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) myoblast 세포에서의 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA 발현은 대조군과 비교하였을 때 적은 폭이지만 유의하게 약 \( 40 \% \) 정도 증가하였다. 농도가 점점 더 높아질수록 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA는 이에 비례하여 증가하는 경향을 보였으며, 가장 높은 농도인 \( 50 \mu \mathrm{M} \) 의 EGCG는 \( \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) myoblast 세포의 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA 발현을 약 4.5배정도 유의 하게 증가시켰다.</p><p>시간에 따른 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA의 발현 변화를 보기 위하여 \( 50 \mu \mathrm{M} \) 의 EGCG로 세포를 처리한 후 24,48,72시간이 경과한 후 각 시점에서 mRNA 농도 변화를 살펴본 결과 transgelin mRNA 발현 변화와 비슷한 경향으로 증가하였으며, 72시간 처리 후에는 약 6배정도 대조군과 비교하였 때 smooth muscle a-actin mRNA가 증가하였다.</p>
핵의 숫자가 EGCG 처리군에 비해 대조군에서 확연히 높다는 것으로 알 수 있는 점은 무엇인가?
EGCG가 세포의 증식을 억제하는 역할