<h1>결과 및 고찰</h1><h2>HeLa 자궁경부암세포의 증식에 미치는 sulforaphane의 영향</h2><p>먼저 인체 자궁경부암 HeLa 세포의 증식에 미치는 sul-foraphane의 영향을 알아보기 위하여 실험재료 및 방법에서 서술한 것처럼 HeLa 세포를 안정화 시킨 후 48시간 동안 배지에 sulforaphane을 적정 농도로 희석하여 처리한 후, MTT assay를 실시하였으며, 그 결과를 Fig. 1A에 나타내었다. Fig. 1A에 나타낸 바와 같이 48 시간 동안 정상 배지에서 자란 HeLa 세포에 비하여 sulforaphane이 함유된 배지에서는 sulforaphane의 첨가 농도 의존적으로 세포의 증식이 감소하였음을 알 수 있었다. 즉 \( 10 \mu \mathrm{M} \) 처리군의 경우 대조군에 비하여 \( 40 \% \) 이상 세포증식이 억제되었으며, \( 20 \mu \mathrm{M} \) 처리군에서는 약 \( 78 \% \) 정도의 세포증식 억제현상을 관찰할 수 있었다. 그리고 \( 30 \mu \mathrm{M} \) 처리군에서는 생존율이 \( 10 \% \) 정도로 암세포가 정상적인 생존을 하지 못하였음을 알 수 있었다. 이상의 결과들은 인체 유방암세포, 전립선암세포, 대장암세포, 췌장암 세포 및 악성 백혈구 등에서 관찰된 최근의 선행연구들에서 관찰된 경우와 유사한 경향성을 보여주는 것으로, sulforaphane은 자궁경부암세포에서도 다른 암세포에서처럼 비슷한 증식억제 효능이 있음을 알 수 있었다. 아울러 sulforaphane의 처리가 암세포의 형태에 어떠한 영향을 주는지에 대해 알아보기 위하여 여러 농도의 sulforaphane을 48시간동안 처리 후 위상차 현미경을 이용하여 세포의 형태를 관찰한 결과는 Fig. 1B에 나타낸 바와 같다. 즉 sul-foraphane 처리 농도 의존적으로 현저한 세포밀도의 감소현상과 형태적인 변화를 관찰 할 수 있으며, sulforaphane의 처리 농도 증가에 따라 세포막의 shrinking 및 blebbing 현상도 관찰할 수 있었고, 처리농도가 높은 경우 cell elongation을 포함하는 dendrite-like structure가 관찰되었다. 따라서 인체 자궁경부암세포의 sulforaphane 처리 농도 의존적인 형태적 변화와 밀도의 감소는 sulforaphane 처리에 따른 세포 증식 억제와 부합되는 결과임을 알 수 있었다.</p><h2>세포주기 분포에 미치는 sulforaphane의 영향</h2><p>세포 증식과 연관된 세포주기의 조절은 각 주기별 관여하는 다양한 유전자들에 의해 조절되는데, 기본적으로 세포주기 checkpoint 각 시기에 요구되어지는 양성 조절인자인 cyclins에 의하여 Cdks의 연속적인 활성과 불활성이 결정되어진다. 세포주기 조절의 관점에서 암세포는 세포주기의 비정상화에 기인된 질병으로 정의 될 수 있으며, 특정 시기의 세포주기 억제는 세포주기 조절 양성인자의 발현 저하 또는 음성 조절 인자의 과발현에 의한 것으로 요약될 수 있다. 따라서 sulforaphane의 처리에 의한 HeLa 자궁경부암세포의 성장억제가 세포주기 특정 시기의 교란과 연관성을 지니는지의 여부를 조사하기 위하여 세포주기 분포에 미치는 sulforaphane의 영향을 조사하였다. 이를 위하여 정상 및 다양한 농도의 sulforaphane이 처리된 배지에서 48시간 배양한 후 flow cytometry를 이용하여 분석한 결과는 Fig. 2 및 Table 2에 나타낸 바와 같다. 즉 sulforaphane이 함유되지 않은 정상 배지에서 자란 암세포의 경우 G1, S 및 G2/M기에 해당되는 세포의 빈도는 약 \( 66.55 \%, 6.82 \% \) 및 \( 21.86 \% \) 정도였다. 그리고 \( 10 \mu \mathrm{M} \) 및 \( 15 \mu \mathrm{M} \) 처리군의 경우 S기 및 G2/M기의 빈도는 대조군과 유사하였으나, apoptosis 유발에 해당 되는 sub-G1기에 해당되는 빈도가 대조군의 \( 5.06 \% \)에 비하여 각각 \( 22.18 \% \) 및 \( 31.40 \% \)로 매우 증가되었다. 따라서 sub-G1기에 속한 세포를 제외한 나머지 세포들을 고려할 경우, sul-foraphane의 처리에 따라 G1기에 속하는 세포의 빈도는 감소된 반면, G2/M기에 속하는 암세포의 빈도가 상대적으로 증가하였음을 알 수 있었다. 그리고 \( 20 \mu \mathrm{M} \) sulforaphane의 처리군의 경우 약 \( 50 \% \)에 해당되는 세포가 sub-G1기에 속하여 sulforaphane 처리에 따른 암세포의 증식억제는 세포주기 G2/M arrest와 연관된 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. HeLa 자궁경부암세포에서 관찰된 이러한 현상은 췌장암세포, 유방암세포, 대장암세포, 전립선암세포, 흑색종세포 등에서 나타난 결과와 매우 유사하였다.</p><h2>Cyclins 및 Cdks의 발현에 미치는 sulforaphane의 영향</h2><p>일반적으로 진핵세포에서 세포주기의 진행을 위해서는 세포주기 특이적인 cyclin의 발현 증가가 우선적으로 이루어져야한다. 즉 mid G1에서 D-type cyclin (cyclin D1, D2 및 D3)의 발현을 필요로 하며, late G1에서 S기로의 진입을 위해서는 cyclin E의 발현이 증가되어야한다. 그리고 S기에서 G2기로의 진입 및 G2기와 M기 진행 동안에는 각각 cyclin A 및 B-type cyclin (cyclin B1 및 B2)의 발현이 증가되어야한다. 그리고 이들 cyclin들은 특정 Cdks와 특이적인 결합에 의하여 cyclin/Cdk complex를 형성하여 세포주기진행을 조절한다. 특히 Cdk2는 cyclin A와 결합하여 S기와 G2기 동안 역할을 하는 반면 Cdc2는 cyclin B1과 결합하면 핵막의 histone H1과 lamin이 인산화에 의해 kinase 활성이 증가하여 핵막의 붕괴 및 염색체의 재배열이 일어나서 M기로 진행이 된다. 따라서 HeLa 자궁경부암세포에서 sulfora-phane의 처리에 따른 세포주기 조절관련 기전을 조사하기 위하여 cyclins 및 Cdks의 발현에 미치는 sulforaphane의 영향을 RT-PCR 및 Western immunoblotting 법으로 먼저 조사하였다. Fig. 3A 및 B의 결과에서 알 수 있듯이 조사된 cyclins 중, cyclin B1을 제외한 다른 cyclin은 전사 수준에서 sulfora-phane 처리에 따라 농도 의존적으로 다소 감소되는 경향을 보였으나, 단백질 수준에서의 발현은 sulforaphane 처리에 의하여 cyclin A의 발현이 다른 cyclin에 비하여 매우 억제되었음을 알 수 있었다. 그리고 Cdks의 발현에 미치는 sulfora-phane의 영향을 조사한 결과는 Fig. 4A 및 B에서 알 수 있듯이, Cdk4가 sulforaphane 처리 농도의존적으로 강하게 전사 및 번역 수준에서 발현이 감소되었으나, Cdk2 및 Cdk6의 경우 sulforaphane 처리에 따른 유의적인 변화는 관찰할 수 없었다. 그러나 Cdc2의 경우 대조군에 비하여 sulforaphane 처리군에서 전체적으로 단백질 발현이 오히려 다소 증가되었음을 알 수 있었다. 최근 Jackson과 Singletary는 MCF-7 인체 유방암세포에서 sulforaphane의 처리에 의한 G2/M arrest 유발은 cyclin B1의 발현 증가에 따른 histone H1의 인산화 증가와 연관성이 있다고 보고한 바 있었다. 그러나 PC-3 인체 전립선암세포에서 sulforaphane 처리에 따른 G2/M arrest에서는 오히려 cyclin B1, Cdc25B 및 Cdc25C의 발현이 감소되면서 Cdc2의 인산화 증가와 연관성이 있는 것으로 보고된 바 있다. 특히 sulforaphane 처리에 따른 Cdc2의 인산화 증가현상은 인체암세포에서 뿐만 아니라 쥐의 유방암 세포에서도 관찰된 현상이다. 따라서 HeLa 세포에서 Cdc2의 단백질 발현이 sulforaphane 처리로 다소 증가되었던 것은 아마도 sulforaphane에 의하여 Cdc2 단백질의 인산화 유도와 연관되었을 가능성이 클 것으로 추정되어진다.</p>
\( 30 \mu \mathrm{M} \) 처리군에서 살펴볼 수 있는 양상은?
생존율이 \( 10 \% \) 정도로 암세포가 정상적인 생존을 하지 못하였음을 알 수 있었다.