<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료 및 세포배양</h2><p>본 실험에 사용된 sulforaphane은 Sigma Chemical Co. (St.Luis, MO, USA)에서 구입하였으며 \( 10 \mathrm{mM} \)의 농도로 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma)에 용해하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하여 사용하였고, 매회 처리 전 배지에 희석 후 사용하였다. 실험에 사용한 인체 자궁경부암 HeLa 세포는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였으며, 세포의 배양을 위해 \( 90 \% \)의 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)과 \( 10 \% \) 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Gibco BRL), \(1 \% \)의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL) 등이 포함된 배지를 사용하여 배양하였다. 세포는 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건하에서 배양하였고, 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위해 적정시간 배양 후 \( 0.05 \% \) trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA, Gibco BRL)를 처리하여 세포를 부유시킨 다음 세포 배양용 petridish로 옮겨 배양하였다.</p><h2>MTT assay를 이용한 세포 성장율의 측정 및 세포형태 변화의 관찰</h2><p>암세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, sulforaphane을 적정 농도별로 처리하고 48시간동안 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Amresco, Solon, Ohio, USA) 시약을 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농도가 되게 성장배지로 희석하여 분주하고 3시간 동안 배양 후 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 첨가하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 정상 배지에서 배양된 암세포와 sulforaphane이 처리된 배지에서 배양된 세포들의 성장률을 비교하였다. 세포형태 변화 관찰을 위해서는 세포배양용 petridish에 세포를 24시간동안 안정화시킨 다음 sulforaphane을 농도별로 처리하여 48시간동안 배양한 후, 위 상차 현미경하에서 각 농도에 따른 형태의 변화를 관찰하였다.</p><h2>DNA flow cytometry에 의한 세포주기의 분석</h2><p>세포주기의 분포도에 미치는 sulforaphane의 영향을 조사하기 위하여 Cycle TEST PLUS kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하였으며, 정상 및 sulforaphane이 함유된 배지에서 48시간 배양된 암세포들을 buffer solution을 이용하여 두세 번 씻어내고, Cycle TEST PLUS solution A 및 B를 상온에서 각각 10분씩 처리한 후 Cycle TEST PLUS solution C를 처리하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 염색하였다. 이를 nylon mesh로 세포를 하나씩으로 분리시킨 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram 을 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램으로 분석하였다.</p><h2>RT-PCR에 의한 mRNA 발현의 분석</h2><p>상기와 동일한 조건으로 준비된 암세포를 대상으로 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 처리하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, oligo dT primer AMV reverse transcriptase (RT)를 이용하여 \( 2 \mu \mathrm{g} \)의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 template로 사용하여 관찰 대상 유전자(Table 1)를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다. 이 때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehy-drogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산물들을 \( 1 \% \) agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, Sigma)를 이용하여 염색한 후 ultra violet (UV)하에서 확인하였다.</p><h2>Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석</h2><p>정상 및 sulforaphane이 처리된 배지에서 자란 세포들을 수집하여 적당량의 lysis buffer를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후, \( 14,000 \mathrm{rpm} \)으로 15분간 원심분리하여 그 상층액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 측정하였으며, 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, \( 10 \% \) skim milk롤 함유 한 PBS-T (\( 0.1 \% \) Tween 20 in PBS)에 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 이상 배양하면서 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하였다. 그리고 특정 단백질에 대한 항체를 membrane에 적용시켜 항원 항체 반응을 일으킨 후, PBS-T로 씻어내고 톡정 항체에 대한 이차 항체 반응을 실시한 후enhanced chemilum-inoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, 이차 항체로 사용된 horseradish peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다.</p>
암 세포를 어디에서 배양했어?
\( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건하