<h1>결과 및 고찰</h1><h2>홍화자 분획물의 대식세포에 대한 독성</h2><p>대식세포는 NO, \( \mathrm{PGE}_{2} \), leukotriene 및 pro-inflammatorycytokine들의 2차 매개물을 생산하고 분비한다. 이런 물질들은 선천성 및 후전성 면역을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 한다. 그러나 이런 물질들이 과잉 생산 되었을 때에는 세균성 패혈증, 류마티스성 관절염, 만성 염증, 자가면역 질환등을 유발하기도 한다. 염증에 중요한 역할을 하는 대식세포를 이용하여 경북 약용작물 홍화자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물에 의한 세포 독성을 MTT assay에 의해 확인한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 홍화자 부탄올, 물 분획물은 \( 5,10,25,50 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 높은 생존율을 나타내었으며,헥산 및 에틸아세테이트 분획물의 경우 대조군에 비해 높은 생존율은 나타내지 않았지만 세포 독성을 나타내지는 않았다. 따라서 본 연구에 사용된 홍화자 분획물은 \( 5,10,25,50 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서는 세포독성이 낮음을 확인하였으며, 에틸아세테이트층의 경우 가장 높은 세포 생존율을 나타내는 것을 확인하였다. 이에 ELISA kit, western blot, RT-PCR의 실험에서 \( 50 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도를 벗어나지 않는 범위인\( 5,10,25,50 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도를 사용하여 실험을 진행하였다.</p><h2>홍화자 분획물의 nitric oxide 저해활성 측정</h2><p>체내 염증과정에서는 과량의 NO 및 PGE2등의 염증인자가 유도형 iNOS 및 COX-2에 의해 형성된다. 이 중 NO는 체내방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관 확장 등의 다양한 생리기능을 가지고 있다. NO 자체는 반감기자 6~10초 정도로 매우 짧으며, NO를 형성하는 NOS들은 l-argine을 l-citrullin으로 전환시키면서 NO를 하며, 이들 NOS는 iNOS에 의한 발현성이 절대적으로 많으며, 이는 병리적으로 중요한 작용을한다. Raw 264.7 cell의 NO 생성 정도를 측정하기 위하여 홍화자 \( 70 \% \) 에탄올 추출물과 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올,물 분획물을 \( 50 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO량을 측정한 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 특히 홍화자 에틸아세테이트 분획물이 LPS를 처리한 대조군에 비해 NO생성량이 \( 40 \% \)를 나타내었기 때문에 홍화자 추출물 및 분획물 중에서 가장 우수한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.</p><h2>홍화자 분획물의 \( \mathrm{PGE}_{2} \) 저해 활성 측정</h2><p>LPS로 유도 되어진 Raw 264.7 cell의 monocyte는 LPS를 투여하지 않은 대조군 보다 pro-inflammatory cytokine들을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한 이러한 염증매개물질의 형성은 phospholipase A2의 활성으로 인해 arach-idonic acid가 prostaglandin으로 바뀌는 과정 및 NO형성 과정으로 이어지게 된다. 체내 염증과정에서는 과량의 NO및 PGE2등의 염증인자가 iNOS 및 COX-2에 의해 형성된다. 이 중 PGE2는 염증반응, 면역반응, 그리고 angiogenesis를 촉진하는등 암발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져있다. Raw 264.7 세포에서 염증성 PGE2 억제효과를 ELISA kit로 측정하였다. 홍화자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물 \( 50 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) 농도를 처리하여 PGE2 의 발현을 측정하였다. PGE2의 경우 모두 홍화자 에틸아세테이트 분획물에서 가장 좋은 효과를 나타내었으며, 홍화자 에틸아세테이트 분획물을 각각 \( 5,10,25,50 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 측정한 결과농도 의존적으로 발현양이 줄어드는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 3). 이와 같은 결과로 홍화자 에틸아세테이트 분획물은 염증성 질환의 치료에 유의할 것으로 사료되어진다.</p><h2>홍화자 분획물의 cytokine저해 활성 측정</h2><p>한편 인체에서 염증반응이 진행되기 위해서는 NO와 PGE2와 같은 염증 매개물 이외에 면역 반응에서 필연적으로 염증성 사이토카인이 동반되는데, 대표적인 사이토카인으로는 tu-mor necrosis factor-α (TNF- α), interleukin-1β (IL-1β)와 in-terleukin-6 (IL-6)이다. IL-1β는 대표적인 전 염증성 사이토카인이다. IL-1β의 수용체는 TNF-α의 수용체와 명확히 다른 구조를 가지고 있는데도 면역 생물학적 기능으로 볼 때 다른 사이토카인보다 TNF-α와 매우 밀접한 관련이 있다. 일반적으로 IL-1β는 생체에서 매우 낮은 농도로 작용하는데, 낮은 농도에서는 세포 성장이나 체내 항상성 유지에 필요하지만, 염증반응이나 상처 또는 면역학적 자극을 주었을 때는 대량으로 생산되어 인체 질환을 악화시키는 것으로 알려져 있다. 또한 TNF-α는 주로 활성화된 대식세포에서 대량 생산되지만, 림포이드계의 세포(lymphoid cells), 비만세포(mast cells), 내피세포(endothelial cells)을 비롯하여 생체에 존재하는 다양한 세포에서도 생산된다. 특히 LPS로 자극할 경우 대량 생산된다. 홍화자 분획물이 Raw 264.7 세포에서 LPS에 의해서 생성된 pro-inflammatory cytokine의 형성을 억제하는지 알아보기 위하여 TNF-α, IL-1β와 IL-6의 생성을 측정하였다. 홍화자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물\( 50 \mathrm{pg} / \mathrm{ml} \) 농도를 처리하여 TNF-α, IL-1β와 IL-6의 발현을 측정하였다. TNF-α, IL-1β와 IL-6의 경우 모두 홍화자 에틸아세테이트 분획물에서 가장 좋은 효과를 나타내었으며, 홍화자 에틸아세테이트분획물을 각각 \( 5,10,25,50 \mathrm{\nu g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 측정한 결과 농도의존적으로 발현양이 줄어드는 것을 확인 할 수 있었다(Fig.4). 이와 같은 결과로 홍화자 에틸아세테이트 분획물이 염증성질환의 치료에 유의할 것으로 사료되어 진다.</p><h2>홍화자 분획물의 LPS로부터 자극된 세포내 염증관련 단백질 및 mRNA 발현 양상 측정</h2><p>iNOS는 평소에는 세포내에 존재하지 않으나 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성하였다. 한편, 염증상태에서 iNOS에 의해 생성된 NO는 혈관투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진시킬뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다. NO는 염증과 암의 발생에 관여하였으며, iNOS의 발현은 NF-kB 활성으로 유도되며, 이는macrophage에서 LPS나 cytokine에 의해 염증성 매개물들이 과잉 생산되는 중요한 메카니즘이다. COX는 arachidonicacid를 PGE2로 전화시키는 효소로 COX-1과 COX-2로 분류된다. COX-1은 체내에서 혈소판을 형성, 위벽보호, 신장 기능의 유지 등 정상적인 생체기능에 작용하였다. 많은 염증 억제 약물들의 작용 기전은 prostaglandin 합성 억제를 나타내며, 이는 COX-2의 생성 및 활성저해에 의한 것이다. Raw 264.7cell에서 LPS \( (1 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} )\)를 사용하여 NO 생성을 유도한 후 홍화자 에틸아세테이트 분획층을 5, 10, 25 및 \( 50 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) 농도로 처리하였을 때 iNOS와 COX-2 단백질 및 mRNA 발현은 Fig.37∼40과 같이 \( 50 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) 농도에서 가장 낮게 발현되는 것을 확인하였다. 이상의 결과들은 Lee t등의 양마에서 분리한 kaempferol 정제물이 \( 100 \mathrm{uM} \) 의 농도에서 PGE2를 \( 40 \% \) 가까이 저해 하였으며, IL-6는 \( 70 \% \) 가까이 저해하는 것을 확인한 논문과 비교시 홍화자 추출물은 kampferol 정제물과 비슷한 효능을 가지는 것을 확인 할 수 있었다. 추후 홍화자 정제물의 염증활성을 검토하여 홍화자 추출물이 염증 예방 물질로 사용할수 있는 가능성을 높이기 위한 정제물의 염증성 작용기전에 대한 자세한 연구가 필요할 것으로 사료된다.</p>
대식세포는 NO, \( \mathrm{PGE}_{2} \), leukotriene 및 pro-inflammatorycytokine들의 3차 매개물을 생산하고 분비해?
NO