<h2>Tyrosinase inhibition assay</h2><p>0.1 \( \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.5) 220\( \mu \mathrm{L} \) 에 농도별로 희석한 시료 20 \( \mu \mathrm{L} \)를 첨가 한 후 1250\( \mathrm{unit} / \mathrm{mL} \) 농도의 tyrosinase 20\( \mu \mathrm{L} \) 를 첨가하였다. 여기에 1.5\( \mathrm{mM} \) 의 L-tyrosine 기질을 40 \( \mu \mathrm{L} \) 씩 첨가하여 잘 섞은 후 37\( { }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분 반응시킨 다음 490\( \mathrm{~nm} \) 에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 효소대신 시료액과 완충으로 대체하여 측정한 실험군의 흡광도와 비교하여 아래의 계산식에 따라 tyrosinase 저해활성을 계산하여 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값을 산출하였으며, 양성대조군으로 arbutin을 사용하였다.</p><p>\( ^* \) Inhibition \( \%=100-\{(\mathrm{A}-\mathrm{B}) /(\mathrm{C}-\mathrm{D}) \times 100\} \)</p><p><ol type=A start=1><li>시료액의 반응 후의 흡광도</li><li>tyrosinase 대신 완충액으로 대체하여 측정한 시료액의 흡광도</li><li>공시료액의 반응 후의 흡광도</li><li>tyrosinase 대신 완충액으로 대체하여 측정한 공시료액의 흡광도</li></ol></p><h2>통계분석</h2><p>실험결과의 통계적인 유의성은 Student's t-test 로 분석하였으며 \( p \) value가 0.05미만인 경우 통계적으로 유의성 있는 것으로 판단하였다.</p><h2>HPLC 분석조건</h2><p>HPLC는 Waters사의 alliance 시스템을 사용하여 측정하였다. 분석에 사용된 컬럼은 YMC-Pack ODS-A ( \(250 \times 4.6 \mathrm{~mm} \), \(S-5 \mu \mathrm{m}\), \(12 \mathrm{~nm} \), YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan) 컬럼을 사용하였고, 컬럼온도는 30\( { }^{\circ} \mathrm{C} \) 로 유지하였다. 유속은 1.0\( \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) 으로 흘려주었으며 주입량은 10\( \mu \mathrm{L} \) 였다. 이동상은 0.05\( \% \) trifluoroacetic acid가 함유된 증류수 (A)와 acetonitrile (B)을 사용하여 기울기 용매조건 0-5 분, 5\( \% \)B, 5-50분, 5-50\(\% \) B)이며, 검출파장은 210\( \mathrm{~nm} \) 에서 검출하였다</p>
시료, L-tyrosine 기질, tyrosinase 등을 넣은 potassium phosphate buffer를 무엇으로 흡광도를 측정했어?
ELISA reader