<h1>재료 및 방법</h1><h2>목질바이오매스 분해 토양 박테리아 분리</h2><p>목질바이오매스 분해 토양 박테리아 분리를 위해 경남과학기술대학교내의 약 60-80년생의 활엽수와 침엽수가 약 8:2의 비율로 이루어진 쥬라기 숲에서 2015년 3월에 토양샘플을 채집하였다. 각기 다른 세 군데의 장소에서 소독한 원예용 모종삽을 이용하여 지표면으로부터 \( 10 \mathrm{cm} \) 아래 부분에서 약 \( 100 \mathrm{g} \)의 토양샘플을 채취하였다. 토양은 실험실로 운반한 후 가는체\((2-\mathrm{mm})\)를 사용하여 큰 부유물을 제거하고 남은 부드러운 토양을 실험에 이용하였다. 토양 \( 1 \mathrm{g} \)을 멸균수 \( 9 \mathrm{mL} \)에 첨가하여 소용돌이 교반기를 이용하여 잘 섞어 주었다. 그 후 샘플은 \( 10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3}, 10^{-4}, 10^{-5}, 10^{-6} \) 배로 희석하여 10분간 정치 배양 후 실험에 이용하였다. 각 비율로 희석된 샘플은 \( 0.01 \% \) trypan blue (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)와 \( 0.4 \% \) carboxymethyl cellulose (CMC)가 첨가된 Luria-Bertani (LB) agar plate에 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 씩 도말 하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 인큐베이터에서 2일간 배양하였다. 목질바이오매스 분해 박테리아는 균락의 주변에 생기는 밝은 색의 halo의 존재 유무에 근거 하여 선발하였다. 선발된 균주의 액체 배양은 LB배지를 이용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \)의 조건에서 24시간 진탕 배양하였다. 배양액은 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 3,500 \mathrm{rpm} \)의 환경에서 10분간 원심 분리하여 조효소 액이 들어 있는 상등액을 회수하였으며, CMCase 및 xylanase의 활성 검정에 이용하였다.</p><h2>16S rRNA 유전자를 이용한 박테리아 동정</h2><p>도시공원 토양으로부터 분리한 목질바이오매스 분해 박테리아균의 동정을 위해 사용된 \( 16 \mathrm{S} \) rRNA universal primer는 Forward primer로서 877F: \(5^{\prime}\)-CGGAGAGTTTGATCCTGG-\(3^{\prime}\) 와 Reverse primer로서 878R: \(5^{\prime}\)-TACGGCTACCTTGTTAGCGAC-\(3^{\prime}\)이었다. \( 16 \mathrm{S} \) rRNA 유전자는 제조사의 사용설명서에 따라 Qiagen DNeasy kit (Hilden, Germany)를 사용하여 분리한 게놈 DNA를 이용하여 polymerase chain reaction (PCR)을 이용하여 증폭하였다. PCR 반응용액은 게놈 DNA의 \( 1 \mu \mathrm{L}, 2.5 \mathrm{mM} \) dNTPs의 \( 3 \mu \mathrm{L}, 10 \mathrm{X} \) 반응 완충용액의 \( 3 \mu \mathrm{L} \), 각각의 primer \( (10 \mathrm{pmol} / \mathrm{uL}) \)의 \( 3 \mu \mathrm{L}\), nTaq-HOT polymerase (Enzynomics, Daejeon, Korea)의 \( 0.3 \mu \mathrm{L} \)와 멸균수를 첨가하여 최종볼륨이 \(30 \mu \mathrm{L} \)가 되게 조제 하였다. PCR은 Taq-HOT polymerase를 활성화시키기 위하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C}\) 10분간 반응한 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분 30초의 사이클을 총 40회 실시한 후 \( 72{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응을 실시하였다. PCR반응물 \( 1.5 \% \) 아가로스 겔을 이용하여 전기영동을 실시하였다. 아가로스겔상에서 예상되는 크기에 위치한 DNA를 면도칼로 자른 후 DNA 정제 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 순수한 DNA를 정제하였다. 정제한 \( 16 \mathrm{S} \) rRNA 유전자는 pGEMT-easy 벡터 (Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝 하여 염기서열을 분석하였다. \( 16 \mathrm{S} \) rRNA유전자의 염기서열 유사성과 multiple sequence alignment는 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 제공하는 BLSTN과 CLUSTAL W 프로그램을 이용하여 분석하였다. 분리한 Bacillus 종의 \( 16 \mathrm{S} \) rRNA유전자의 염기서열과 기존에 보고된 다른 박테리아의 \(16\mathrm{S}\) rRNA유전자 염기서열을 이용하여 계통도를 작성하였다. 계통도는 Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.0 (MEGA 6.0) 프로그램에 내장되어 있는 neighbor-joining 방법을 이용하였다(Tamura 등, 2013). 1,000번의 반복에 의해 생성된 데이터를 이용한 Bootstrap 분석은 계통도의 신뢰도와 분지 패턴을 평가하기 위하여 사용하였다.</p>
목질바이오매스 분해 토양 박테리아 분리를 위해 진행된 실험은 경남과학기술대학교 내의 약 60-80년생의 활엽수와 침엽수가 약 8:2의 비율로 이루어진 쥬라기 숲에서 진행되었다. 토양샘플을 채집한 시기는 언제인가?
2015년 3월