<h1>재료 및 방법</h1><h2>Tolaasin의 분리</h2><p>Tolaasin의 분리는 Nutkins 등에 의한 방법을 약간 수정하여 이루어졌다. P. tolaasii \( 6264 \) 균주를 PAF 액체배지에서 접종한 후, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 18 \)시간 동안 정체기에 도달하도록 진탕배양하였다. 배양액은 상온에서 \( 8,000 \mathrm{rpm}(10,000 \times \mathrm{g}) \)으로 \( 30 \)분간 원심 분리하여 세균을 제거하고 얻은 배양여액으로부터 crude tolaasin을 분리하였다. 이렇게 얻어진 tolaasin 액에 \( 30 \% \)가 되도록 ammonium sulfate를 가하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 1 \)시간 동안 정치한 후, \( \mathrm{SW} 28 \) rotor (Beckman Instruments,Inc., Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 \( 20,000 \mathrm{rpm} \) \((60,000 \times \mathrm{g} \))에서 \( 1 \) 시간 동안 초고속 원심분리하였다. 침전으로 얻은 crude tolaasin은 HBS 완충액( \( \mathrm{pH} 7.0 \)) 또는 \( 10 \mathrm{mM} \) sodium phosphate 완충액 ( \( \mathrm{pH} 7.0 \))으로 녹이고, 실온에서 같은 용액으로 \( 4 \)시간 투석하여 Glass-Teflon homogenizer로 균질화한 후, aliquot을 만들어 액체질소로 급랭시키고 사용 전까지 \( -60^{\circ} \mathrm{C} \)의 초저온냉동고(deep freezer)에 보관하였다.</p><h2>적혈구 분리</h2><p>Diethyl ether를 이용하여 마취한 쥐를 개복하여 대정맥으로부터 채혈한 후, 멸균된 glass bead가 담긴 삼각 플라스크에 옮겨 약 \( 1 \)시간 동안 교반하여 fibrin을 제거하였다. 얻어진 혈액은 \( 150 \mu \mathrm{L} \) 씩 분주하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하였으며, 사용시에는 HEPES-buffered saline (HBS; \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(5 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{KCl}\), \(5 \mathrm{mM} \) HEPES, \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{MgSO}_{4} \), \( \mathrm{pH} 7.4 \)) 용액으로 \(10 \)배 희석하여 원심분리로 온전한 적혈구만을 분리하여 사용하였다. 채취한 혈구는 약 \( 3 \)주간 실험에 사용하였다.</p><h2>용혈활성 측정</h2><p>Tolaasin의 용혈활성은 Rainey 등의 방법에 따라 쥐의 적혈구를 이용하여 측정하였다. 용혈활성 측정에 사용한 적혈구는 사용직전에 멸균한 HBS 완충액으로 \( 10 \)배 희석하였고, 이것을 최종 반응 용액의 \( 10 \% \)가 되도록 처리하였다. 용혈활성 측정시 \( 1 \% \) 적혈구를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 30 \)분 이내에 모두 용혈 시키는 톨라신의 농도를 \( 1 \mathrm{HU} \)으로 정하여 사용하였다. 용혈활성은 UV/Vis spectrophotometer를 사용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 변화로 측정하였다.</p><h2>인지질의 효과 측정</h2><p>Chloroform에 용해되어 있는 \( 1 \),\( 2 \)-didecanoyl-sn-glycero-\( 3 \)-phospho-ethanolamine (DDPE)와 \( 1 \),\( 2 \)-dimyristoyl-sn-glycero-\( 3 \)-phospho-ethanolamine (DMPE), \( 1 \),\( 2 \)-distearoyl-sn-glycero-\( 3 \)-phosphocthanolamine(DSPE)는 \( \mathrm{N}_{2} \) gas를 이용하여 chloroform을 제거하고, 증류수에 용해하여 약 \( 2 \mathrm{mM} \)의 stock solution으로 만들어젔다. 용혈활성 측정시, 제조한 lipid 용액을 전체 반응부피의 \( 10 \% \)가 되도록 첨가하여 \( 200 \mu \mathrm{M} \) 농도가 되게 하였다. \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정함으로써 각각의 지질이 tolasin의 용혈활성에 미치는 영향을 관찰하였다.</p>
HBS 완충액은 중성인가요?
YES