<h1>재료 및 방법</h1><h2>추출 및 분리</h2><p>본 연구에서 사용한 시료인 어리연꽃은 농업회사법인 (주)로터스그린에서 구입하여 사용하였다. 또한, 이 시료는 생물 종 판별 시스템에 의해 확증표본(NIBRVP000012545)으로 확인되었으며, 확인은 국립생물자원관 생물자원연구부 식물자원과를 통해 진행되었다. 추출은 건조된 시료를 \( 100 \% \) methyl alcohol에 침지시켜 \(72\)시간 동안 두었으며 이 과정을 \(3\)회 반복하여 농축 및 동결건조하여 추출물을 확보하였다. 추물을 용매의 극성에 따라 순차적으로 분획하였으며, ethyl acetate 분획물을 medium pressure liquid chromatography (Isocratic, Water: \( \mathrm{ACN}=80: 20 \), \( \mathrm{v} / \mathrm{v}, 40 \mathrm{~min}) \) 을 수행하여 화합물 \( (55.3 \mathrm{mg}) \) 을 분리하였다.</p><h2>시료 및 기기</h2><p>유효성분의 분리 및 정제는 preparative-liquid chromatography (LC-Forte/R, YMC, Kyoto, KP, Japan)로 하였고, 화합물의 구조 동정은 Bruker Ascend \(400\) (Bruker, Karlsruhe, BW, Germany)을 사용하여 NMR 측정을 실시하였다. 효능 측정을 위한 elastase의 경우 porcine pancreas elastase를 사용하였으며, n-succinyl-(L-Ala) \( )_{3} \)-p-nitroanilide와 함께 Sigma chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 배양 배지와 시료인 dulbecco's modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum, penicillin/streptomycin은 gibco BRL Co. (Grand Island, NY, USA)에서, 세포독성 측정 시약 3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 항노화 활성 측정은 ROS-Glo \( \mathrm{iM}_{2} \mathrm{O}_{2} \) assay kit (Promega, Madison, WI, USA), MMP-1 ELISA kit (Abcam, Cambridge, MA, USA), procollagen type I C-peptide kit (Takara Shuzo, Kyoto, \( \mathrm{KP} \), Japan)와 pro-COL1A1, MMP-1, \( \beta \)-actin 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 각각 구입하여 사용하였다.</p><h2>Elastase 저해활성 측정</h2><p>Isoquercitrin (IQC)을 \( 5\),\(10\),\(50\),\(100\) \(\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 로 희석하여 \( 40 \mu \mathrm{L} \) 씩 \(96\) well plate에 넣은 뒤 \( 2.5 \mathrm{U} / \mathrm{mL} \) porcine pancreas elastase 와 \( \mathrm{n} \)-succinyl-(L-Ala \( )_{3} \)-pnitroanilide \( (0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) \) 를 \( 50 \mathrm{mM} \) tris-\( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.6)에 녹여서 well에 넣고 \( 30 \mathrm{~min} \) 반응 후 \( 445 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율(\%)로 elastase 저해활성을 나타내었다.</p><h3>MTT assay에 의한 세포 독성 측정</h3><p>본 실험에 사용된 \( \mathrm{IQC} \) 의 세포독성을 확인하기 위해 CCD-986sk cell을 \(48\) well plate에 각각 \( 5 \times 10^{3} \) cells/well로 분주하고 \(24\)시간 안정화하였다. 그 후 \( \mathrm{IQC} \) 를 \( 0.5,1,5,10,20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 로 희석하여 처리한 후 \(48\) 시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. \(48\) 시간 후 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농도의 시약을 \(4\) 시간 반응시키고 demethyl sulfoxide \( 500 \mu \mathrm{L} \) 를 넣어서 녹여주었다. 그 후 microplate reader를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h3>\( \operatorname{ROS} \) 생성량 측정</h3><p>ROS 생성량을 측정하기 위해 CCD-986sk cell을 48 well plate에 각각 \( 5 \times 10^{3} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \) 로 분주하고 \(24\) 시간 안정화하였다. 이후, 배지를 제거하고 PBS를 넣어 UVB \( \left(20 \mathrm{~mJ} / \mathrm{cm}^{2}\right) \) 를 처리하였다. 다시 DMEM 배지를 넣고 \( \mathrm{IQC} \) 를 \( 0.5,1,5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도로 처리하여 \(48\)시간 배양 후, ROS 발생양을 ROS-Glo \( { }^{\mathrm{TM}} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) assay kit를 사용하여 측정하였다.</p><h3>Procollagen 및 MMP-1 분비량 측정</h3><p>Procollagen과 MMP-1의 발현양은 procollagen type I C-peptide kit와 MMP-1 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. CCD-986sk cell을 48 well plate에 각각 \( 5 \times 10^{3} \) cells/well로 분주한 후 \(24\) 시간 배양하고 UVB \( \left(20 \mathrm{~mJ} / \mathrm{cm}^{2}\right) \) 를 조사한 뒤 DMEM 배지로 교환하여 시료를 48시간 처리하였다. 그 후 상등액을 취해 각각의 kit로 측정하였다.</p><h3>세포내 Procollagen 및 MMP-1 단백질 발현량 측정</h3><p>CCD-986sk cell을 \(6\) well plate에 \( 1 \times 10^{5} \) cells/well로 분주하여 \(24\)시간 배양하고 UVB \( \left(20 \mathrm{~mJ} / \mathrm{cm}^{2}\right) \) 를 처리하였다. 그 후 IQC 를 \( 0.5,1,5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도로 처리하고 \(48\) 시간 배양하였다. 준비된 cell을 RIPA buffer (Pierce, Appleton, WI, USA)로 단백질 추출한 후 BCA protein assay (Pierce)을 이용해 정량하였다. 동량의 단백질 sample들을 \( 10 \% \) SDS-PAGE로 전기영동하고 PVDF membrane으로 transfer시켜 \(1\), \(2\)차 항체 반응을 헸고, 결과는 ImageQuant LAS-4000 (GE life sciences, Taipei, Taiwan)를 사용하여 분석하였다.</p><h3>통계처리</h3><p>본 실험은 SPSS \(10.0\)으로 분산분석(ANOVA: analysis of variance)을 실시하였으며, 유의수준 \( p<0.05 \) 에서 유의차 검정을 하였다.</p>
추출은 건조된 시료를 \( 100 \% \) methyl alcohol에 침지시켜 몇 시간동안 두었는가?
\(72\)시간