<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 대상</h2><p>본 연구의 실험은 (주)샘타코 바이오 코리아 실험동물센터에서 분양 받은 Balb/c 수컷 쥐(♂: 7 주령, 몸무게 \( 22.78 \pm 0.27 \)g) 13마리를 대상으로 실험하였다. 실험동물에게는 고형사료와 멸균된 3차 증류수를 충분히 공급하였으며, 실험 환경은12:12-hr 낮과 밤의 사이클에 맞추었으며, 실내온도는 \( 23 \pm 2^{\circ} {C} \), 상대습도 \( 60 \% \)를 유지하는 통제된 실험실에서 사육하였다.</p><h2>실험 설계</h2><p>실험동물은 통제군(control, CON)과 실험군(exercise, EX) 두 집단으로 나누었다. 쥐들은 5일 동안 동일한 조건에서 적응 운동을 실시하였으며, 5일간의 적응 훈련이 끝난 후에 통제군 (CON, n=6) 과 고강도 일회성 트레드밀 훈련을 실시 할 실험군 (EX, n=7)을 무선 배정하였다.</p><h2>운동 프로토콜</h2><p>본 실험에 앞서 쥐가 트레드밀 운동에 대한 적응훈련의 필요성에 따라 본 운동 전 5일간 하루 한 번 동일한 시간대에 속도 \( 17 \mathrm{~cm} / \mathrm{sec} \), 경사 \( 0^{\circ} \)의 조건에서 10분간 트레드밀에 대한 사전 적응훈련을 시행하였다. 본 운동의 하루 전에는 적응훈련 없이 모든 실험동물이 동일하게 충분한 휴식을 취하도록 하였다. 본 운동은 실험군 쥐 7마리를 트레드밀 경사 \( 10^{\circ} \) 고정 후, \( 17 \mathrm{~cm} / \mathrm{sec} \) 10분, \( 33 \mathrm{~cm} / \mathrm{sec}\) 10분, \( 50 \mathrm{~cm} / \mathrm{sec} \)의 속도로 탈진 시까지 운동을 실시하였다. 운동이 끝나는 시점은 동물에게 가벼운 \( 0.1 \mathrm{~mA} \)의 전기충격(electric shock)에도 불구하고 지속적으로 뛰지 않을 경우를 탈진시점으로 규정하였다. 실험군 쥐의 탈진 시까지 트레드밀 운동 시간은 평균 \( 100 \pm 22 \)분이다.</p><h2>쥐 해부</h2><p>고강도 일회성 트레드밀 훈련을 실시한 실험군은 트레드밀 훈련을 실시한 시간으로부터 24시간 후에 근육을 적출하였다. 실험동물은 아이프란액(isoflurane, 하나제약, Korea)을 사용하여 전신마취 시킨 후, 실험에 사용 할 양쪽 하퇴 가자미근(soleus)과 족저근(plantaris)을 빠른 시간 내에 분리 한 후 분석 시까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)의 냉동기에 보관하였다.</p><h2>RNA 추출 및 cDNA 합성</h2><p>조직 프로세싱 전용 튜브인 CK28 ceramic beads에 Trizol reagent (Invitrogen, Japan) \( 1 \mathrm{ml} \)을 넣은 후 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 보관된 조직을 튜브에 각각 넣은 후, 프로세싱 기기인 Precellys 24를 사용하여 \( 6,500 \mathrm{rpm} / 20 \mathrm{sec} / 1 \mathrm{cycle} \) 프로그램에 맞추어 조직을 분쇄하였다. 동일하게 갈린 조직을 새로운 튜브에 옮겨 상온에서 5분간 배양하였으며, 원심분리기 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm} \)으로 5분간 원심분리 한 후 상층액을 \( 950 μl \) 분리하였다. 상층액의 \( 20 \% \)인 \(190 μl\)의 chloroform을 처리하여 잘 섞어주고, 상온에서 5분간 배양 한 후에 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm} \)으로 15분 동안 원심분리 하였다. 분리 된 상층액 \( 350 \mu l \)와 isopropanol를 1: 1비율인 \(350 μl\)를 넣고 섞어 준 후 상온에서 10분간 배양 하였다. \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm} \)으로 10분간 원심분리 후 생성된 pellet을 RNase free water로 희석한 \( 75 \% \) 에탄올 \( 500 \mu \) 넣은 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\ 7,600 \mathrm{rpm} \)으로 10분간 원심분리 과정을 거쳐 pellet을 씻어주었다. 최종 추출된 pellet을 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에 1분 동안 건조한 뒤 RNase free water를 가자미근과 족저근에 각각 \( 10 \mu 1,20 \mu l\) 넣어 용해시킨 후, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에 15분, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 5분간 두어 안정화 시켰다. Nano drop기기를 이용하여 UV 흡광도 \( 260 athrm{~nm} \)에서 최종적으로 RNA 농도를 측정하였다. 농도 측정 후 RNA를 정량하여 통제집단을 비롯한 실험집단 모두 동일하게 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mu l\)의 RNA와 5X buffer \( 4 \mu \mathrm{l} \), Random primer \( 2 \mu \mathrm{l}, 2.5 \mathrm{mM} \) dNTP \(2 \mu l\), RNase inhibitor \( 0.5 \mu l\), M-MLV reverse tran-scriptase \( 0.25 \mu l\)를 섞어 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\) 10분/ \( 42^{\circ} \mathrm{C}\) 60 분/ \( 95^{\circ} \mathrm{C}\) 5분의 조건으로 polymerase chain reaction (PCR)을 실행하여 \( 20 \mu l \)의 cDNA를 증폭, 합성하였다.</p><h2>정량 실시간 연쇄반응(Real-time quantitative PCR)</h2><p>TLR4, IL-6, TNF-a, SOCS-3 messenger RNA (mRNA) 발현량을 측정하기 위하여 KAPA SYBR®FAST qPCR kit (KAPA Biosystem, USA)를 사용하였으며, 흔합물의 조성은 2X master mixture \(10 \mu l\), ADW \( 7.2 \) ll, cDNA \(2 \mu l\), forward primer, reverse primer 각각 \( 0.4 \mu l\)를 함께 섞어 반응시켰다. 실험에 사용한 primer sequence는 Table 1에 제시하였으며, 모든 Primer는 코스모사(Cosmo Genetech, Korea)에서 제작 및 구입하여 사용하였다. Realtime PCR 분석은 ABI PRISM 7700 system (Applied Biosystems Inc., USA)을 이용하였으며, 모든 샘플은 측정값의 신뢰도 확보를 위해 2회 반복 측정하였다. 또한 각각의 target mRNA 발현량은 glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA 발현량으로 보정하였다.</p><h2>자료 분석방법</h2><p>본 연구에서 실시한 트레드밀 운동에 따른 mRNA 발현량이 유의한 차이가 있는지 검증하기 위하여 window용 SPSS 12.0 프로그램을 이용하여 다음과 같은 방법으로 분석하였다. 고강도 일회성 트레드밀 운동에 따른 쥐의 가자미근과 족저근의 mRNA 발현 변화를 보기 위해 실시한 real-time PCR 데이터 값에 대하여 독립표본 t검정을 실시하여, 통제집단과 고강도 일회성 트레드밀 운동을 한 실험집단의 두 집단의 측정값이 통계적으로 유의한지 검증하였다. 통계적 유의수준은 0.05로 하였다.</p>
본 연구가 실험에 쓴 실험대상은 몇 주 된 생명체인가?
7 주령