<h1>결과 및 고찰</h1><h2>CGTase 발현 vector 구축</h2><p>CGTase 유전자를 Bacillus에서 구성적으로 발현시키기 위해 B. stearothermophilus NO2 의 CGTase 유전자는 pVT-CGTS를 주형으로 사용하고 PS-1과 PS-2 primers를 사용하여 PCR를 이용해 증폭시켰다. 증폭된 양말단에 EcoRI·HindIII-HindIII·BamHI 부위가 생기도록 primers를 설계하였고. 증폭된 단편을 Bacillus에서 유전자 발현이 균체증식과 비례하여 일어나는 구성적인 \( \mathrm{P}_{\mathrm{jH}} \) promoter를 함유하는 pBE1에 subcloning하여 pJH-CGT1 \( (8.14 \mathrm{~kb}) \) 를 구축하였다(Fig.1). 대장균에서 증폭된 재조합 plasmid \( \mathrm{pJH} \)-CGT1로 다시 B.subtilis DB431에 형질전환하여 그 중 CGTase를 발현하는 Bacillus 형질전환주를 kanamycin 함유 LB agar 배지에서 1 차적으로 선별하였다. 1 차 선별된 균주는 다시 CS 배지에서 전분 분해환을 나타내는 고활성 균주 선별하는 과정을 3회 반복하여 발현 효율이 높은 균주를 최종 선별하였다(Fig. 2).</p><h2>배지 최적화</h2><p>B. subtilis DB431/pJH-CGT1를 LB, 2×LB, CS, [\(5\%\) molasses+\(2\%\) CSL], LBG (LB+glucose \( 0.5 \% \sim 5 \%) 50 \mathrm{ml} \) flask 베양하여 균체증식과 CGTase 발현량을 토대로 최적 배지를 선정하였다. 균체증식은 \( [5 \% \) molasses+\(2\%\) CSL] 배지가 다른 배지에서보다 높게 나왔고 다른 4가지 배지에서의 균체증식은 비슷한 양상을 보였다. 세포는 9시간까지 활발히 자라다가 12 시간 이후에는 바로 정지기에 들어섰고, 균체증식과 비례하여 CGTase가 발현되었다(data not shown). 그 중 LB와 LBG (1\% glucose), [5\% molasses \( +2 \% \) CSL] 배지에서 9 시간에 최대 CGTase 발현량이 각각 \( 1.0 \mathrm{unit} / \mathrm{ml}\), \( 1.5 \mathrm{unit} / \mathrm{ml}\), \( 1.8 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \) 로 나왔다. 재조합 CGTase의 세포밖 배지로의 분비효율은 \( 93 \% \) 이상이였다(Table 1).</p><p>LB 배지에서 최적 포도당 농도를 결정하기 위해 \( 0.5 \% \sim 5 \% \) 로 포도당 농도를 바꾸어 베양하였다. 베양결과, 넣어준 포도당을 거의 절반정도 \( (2 \mathrm{~g} / 1 \sim 23 \mathrm{~g} / \mathrm{l}) \) 소모하였고, 포도당 농도가 \( 2 \% \) 이상이 되면 균체 증식과 CGTase 발현량이 오히려 감소하였다(Table 2). 이는 B. subtilis 숙주세포 자체내 탄소원 대사 작용의 결핍 또는 베지내 증식제한 인자(들)의 존재로 사료된다. Endoxylanase 발현에서도 B. subtilis 숙주세포의 당 이용능이 효율적이지 못함이 관찰되었다.</p><p>결과적으로 균체증식과 CGTase 발현이 높은 \( 1 \% \) 포도당을 최적 농도로 결정하였다.</p>
B. subtilis DB431/pJH-CGT1를 LB, 2×LB, CS, [\(5\%\) molasses+\(2\%\) CSL], LBG (LB+glucose \( 0.5 \% \sim 5 \%) 50 \mathrm{ml} \) flask 베양한 세포의 활동 절차가 어떻게 돼?
세포는 9시간까지 활발히 자라다가 12 시간 이후에는 바로 정지기에 들어섰고, 균체증식과 비례하여 CGTase가 발현되었다