<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료 및 화분관 검경</h2><p>시판중인 \( \mathrm{F}_{1} \) 채종에 사용되고 있는 양배추 계통(SC20, 농우)을 분양받아 공시재료로 사용하였다. 화분관 검경은 당일 개화예정인 자가불화합성 및 자가화합성 계통의 꽃봉우리를 각각 3개씩 채취하여 \( 1 \% \) agar gel에 정치하고 인공수분 시킨 후 상온에서 over night 시켰다. 그 후, 주두 조직은 acetic alcohol (acetic acid : ethanol, \(1:3\))용액에서 24시간 고정하였고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( 1 \mathrm{~N} \) \( \mathrm{NaOH} \) 용액에 1 시간 침적시켜 조직을 부드럽게 하였다. 조직은 \( 0.01 \% \) Aniline blue dye가 포함된 \( 2 \% \mathrm{~K}_{3} \mathrm{PO}_{4} \) 용액에 2시간 침적시켜 염색한 후, 형광현미경(ECLIPSE E800, Nicon)을 이용하여 화분관 신장을 관찰하였다.</p><h2>DNA 추출 및 정제</h2><p>DNA는 Dellaporta 등 방법 또는 CTAB 방법을 약간 변형하여 추출하였다. 액체질소를 이용하여 시료를 곱게 마쇄하고 \( 50 \mathrm{ml} \) 튜브로 옮겨 시료 15배 부피의 extraction buffer (1M Tris-\(HCl\) \(pH 8.0\), \(5M\) \(NaCl\), 0.5M EDTA) 를 첨가하여 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 반응시켰다. 반응액과 동량의 phenol/ chloroform용액을 처리 후 원심분리 \( (15,000 \mathrm{rpm}, 20 \mathrm{~min} \), \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) )하여 상징액을 새 튜브로 옮기고 총 부푀의 \( 2 / 3 \)에 해당하는 isopropyl alcohol을 섞고 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 침전물을 \( 70 \% \) ethanol로 세척한 후 공기 중에서 건조시켰다. 건조물을 적정량의 TE buffer에 녹여 \( 1.5 \mathrm{ml} \)용 튜브로 옮기고 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 RNase를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 반응시켰으며 동량의 phenol/chloroform용액을 처리 후 정제 및 건조하였다. DNA의 농도는 \( 200 \sim 500 \mu \mathrm {l} \)의 TE buffer에 녹여 DNA Fluorometer로 정량하였다.</p><h2>DNA 증폭 및 염기배열의 결정</h2><p>자가화합성 계통의 SLG와 SRK 유전자의 전장을 증폭하기 위하여 여러 조합의 primer를 이용하여 PCR (PE-9700, Perkin-Elmer, USA)을 수행하였다. SLG 및 MOD 유전자를 증폭하기 위하여 2분간 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 pre-denaturation 시킨 후 denaturation은 \( 93^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분, annealing은 \( 57^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분, extension은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분간 30회 반응시켰다. SRK 유전자의 증폭을 위하여 annealing은 \( 57^{\circ} \mathrm{C} \sim 61^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분간, post-extension은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 행하였다. PCR 증폭반응은 총 \( 25 \mu \mathrm{l} \) 반응액으로 \( 2.5 \mu l \)의 \( 10 \times \) buffer \( (100 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) \( \mathrm{pH} 8.3,500 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}, 15 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl} 2,0.01 \% \) gelatin)를 첨가하고 genomic DNA \( 2.5 \mu \mathrm{l}(50 \mathrm{ng}) \), primer \( 100 \mathrm{pM} \), dNTP \( 2.5 \) \( \mathrm{mM} \), 그리고 Taq polymerase 1 unit를 첨가하였다. 증폭된 PCR 산물은 \( 1.0 \% \) agarose gel 전기영동으로 분리 후 UV transilluminator상에서 확인하였다. 증폭된 PCR 산물은 pGEM-T Easy Vector (Promega USA)에 cloning하였고, cloning된 DNA 염기 서열은 Auto sequencer (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 염기를 결정하였다. 염기 서열의 상동성 분석은 NCBI 프로그램(http//www.ncbi.nlm. nih.gov)을 이용하여 분석하였다.</p><h2>Plasmid DNA 추출</h2><p>Plasmid DNA 추출은 Kit (Promega. USA)를 이용하여 추출하였다. 간략하게 설명하면 single colony를 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \)의 항생제가 첨가된 \( \mathrm{LB} \)배지에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 진탕배양하였다. 배양액을 원심분리 \( \left(1,000 \mathrm{rpm}, 5 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)하여 pellet 을 수집하였고 solution Ⅰ \((50 mM \), Glucose, \( 25 \mathrm{mM} \) Tris-\(HCl\), \( \mathrm{pH} 8.0 \), \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA)에 현탁한 후 sloution Ⅱ \( (0.2 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \), \( 1 \% \mathrm{SDS}) \)를 첨가하여 원심분리하였다.</p><p>다시 3M potassium acetate \( (60 \mathrm{ml} 5 \mathrm{M} \) potassium acetate, \( 11.5 \mathrm{ml} \) glacial acetic acid, \( 28.5 \mathrm{ml} \mathrm{SDW)} \)를 첨가하여 얼음물 속에 20 분간 방치한 후, 원심분리 하여 상징액을 새로운 tube에 옮기고 동량의 TE-saturated phenol을 첨가하여 원심분리 하였다. 상청액에 phenol : chloroform : isoamyl alcohol ( \(25 : 24: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)을 동량 첨가하여 원심분리 하였고, 회수한 상청액에 다시 chloroform : isoamyl alcohol \( (24: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)을 첨가하였다. 상청액을 새로운 tube에 옮기고 이와 동량의 isopropylalcohol을 첨가하여 얼음에 20분 동안 방치한 후 원심분리하여 수집된 pellet을 \( 70\% \) 냉각 ethyl alcohol로 세척하여 건조시켰다. 적당량의 TE buffer ( \( 10 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}, 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \mathrm{pH} 8.0\) )에 녹여 micro centrifuge tube에 옮긴 후 RNase A를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분 동안 반응시키고 \( 600 \mu \mathrm{l} \)의 PEG용액(\( 20\% \) PEG, \( 2.5 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}) \)을 첨가하고 얼음에 20분 동안 방치한 후 원심분리하여 DNA를 회수하였다.</p><h2>mRNA 추출 및 RT-PCR</h2><p>개화전의 꽃봉우리를 채취한 후 Micro-Fast Track 2.0 kit (Invitrogen)를 사용하여 mRNA를 추출한 후 \( 150 \mathrm{ng} \)의 mRNA로 부터 First Strand cDNA Synthesis kit (Amersham Bioscience)를 이용하여 합성한 cDNA를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR은 Ex Taq DNA polymerase (Takara)를 이용하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 30회 반응시켰다. 사용된 primer는 Table 1에 나타내었다.</p>
\( \mathrm{F}_{1} \) 채종에 사용되고 있는 양배추 계통을 분양 받아서 어디에 사용했어?
공시재료