<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물재료</h2><p>애기장대(Arabidopsis thaliana) 는 야생형으로 Col-0(Columbia-0)를 이용하였으며, 애기장대의 BRs 관련 mutants (bri1-301, bak1, BRI-GFP)는 모두 University of Michigan(Ann Arbor, MI)의 Jianming Li로부터 공여 받았다.</p><h2>애기장대 종자의 생육</h2><p>돌연변이체를 포함한 애기장대 종자는 \( 70 \% \) ethanol과 bleach solution (\(30\%\) clorox, \(0.025\%\) Triton X-100)을 사용하여 표면 소독한 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), 암조건에서 2일간 춘화 처리하여 사용하였다. 춘화처리 된 종자는 굴중성 반응과 길이를 측정하기 위해 MS (\(1\%\) sucrose, \( 0.8 \% \) phytagel) 배지에서 생육하였다.</p><h2>호르몬 처리 및 굴중성 반응과 길이 측정</h2><p>MS배지에 BL과 IAA를 처리한 후, 종자를 일렬로 심어, growth chamber에서 수직으로 5일 또는 10일간 생육한 것을 굴중성 반응과 길이 측정에 사용하였다. RT-PCR을 통한 유전자의 발현 분석을 위해서는 호르몬을 처리하지 않은 MS 고체 배지에서 5일간 생육한 뒤, 새로운 액상 MS 배지에 각각의 호르몬을 처리한 후, 개체를 액상 MS 배지에서 1 시간 처리하였다. 이후 실험에 따라 뿌리와 자엽을 분리하여 total RNA를 뽑아 RT-PCR에 사용하였다. 굴중성 반응과 길이 측정은 digi-tal camera (SANYO, VCTAZ1)를 이용하여 촬영한 뒤, 측정은 Image-Pro Plus 프로그램(Yongma)을 이용하여 각도와 길이를 측정하였다.</p><h2>AtEXPA3 RNAi knockout 돌연변이체의 제작</h2><p>RNAi를 위한 DNA construct를 제작하기 위하여, AtEXPA3의 3개의 exon 중에서 exon1 (E1)과 intron1 (I1)을 표적으로 하여 primer를 제작하였다. E1I1의 primer는 5'에 XbaI site와 BamHI site를 각각 첨가하여 5'-tctagaCTG CGTTTAGGGTCGGCTT-3'과 5'-ggatccTAGCAAAACCCCA-3'를 제작하였으며, reverseE1 (RE1)의 primer는 5'에 BamHI site와 SacI site를 각각 첨가하여 5'-ggatccATTGTGCCGGAG-3'과 5'-gagctcGACTGCGTTTAGGGTCGGCTT-3'를 제작하여, Col-0에서 추출한 DNA를 이용하여 PCR을 이용하여 증폭하였다. 이후 양방향 염기서열 분석에 의해 E1I1-RE1의 con-struct를 확인한 뒤 pBI121 vector에 삽입하였다. E1I1-RE1/pBI 121vector 이후 electroporator를 이용하여 agrobacterium에 형질전환 한 후, floral dipping방법을 이용하여 애기장대에 형질전환 하였다. 이후 실온에서 이틀간 애기장대(T0)를 말린 후, growth chamber (light \( 16 \mathrm{hr}\), \(22^{\circ} \mathrm{C} / \) dark \( 8 \mathrm{hr}\), \(20^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 70 \% \))에서 생육하여 종자(T1)를 얻었다.</p><p>얻어진 애기장대의 종자(T1)는 상기의 방법으로 표면 소독 후, 춘화 처리하여 kanamycin (\( 50 \mu \mathrm{g} \mathrm{ml}^{-1}\))이 포함된 MS(\(1\%\) sucrose, \( 0.8 \% \) micro agar) 배지가 고형화된 사각 pet-ri-dish (\( 125 \times 125 \times 20 \mathrm{~mm} \))에 일렬로 심은 뒤, growth cham-ber에서 생육하여 kanamycin에 저항성을 나타내는 개체를 선별하였으며, 선별된 개체는 peat moss와 vermiculite를 \(1:1\)로 혼합하여 만든 화분(pot)에 옮겨 심어 다음 세대의 종자(T2)를 얻었다. 각각의 개체에서 얻어진 종자는 다시 ka-namycin이 포함된 멸균된 \( 1 \times \mathrm{MS} \) 고체 배지에서 저항성을 갖는 개체만을 화분에 옮겨 얻어진 종자(T3)만을 RNAi mu-tant로 실험에 사용하였다.</p><h2>RT-PCR을 이용한 AtEXPA3의 발현 조사</h2><p>5일 또는 10일간 생육된 애기장대 seedling을 액체 질소에 바로 얼린 후 cold pestle과 mortar를 이용해 분쇄한 뒤 Tri reagent를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 역전사 시킨 후 얻어진 cDNA와 AtEXPA3 유전자의 5'-GTC CCTATCCAATACACATCTCT CTCTCT-3'와 5'-TTACACG GTCCATTCGACTCGATCACTGA-3'를 각각 forward와 re-verse primer로 사용하여 발현 양상을 조사하였다.</p>
애기장대가 야생형으로 무엇을 이용해?
Col-0