<h1>결과 및 고찰</h1><h2>망간 산화 균주의 분리, 선별, 동정 및 생리 - 생화학적 특성</h2><p>충청남도 목천과 충청북도 오창 일원의 토양을 망간 최소 평판 배지에 도말하여 집락을 형성하는 64 개의 망간산화 균주를 분리하였다. 이 중 망간 최소 평판배지에서 갈색을 형성하고 생장이 우수한 3균주를 1차 선별하고, 그 중 \( 100 \mu \mathrm{M} \) \( \mathrm{MnCl}_{2} \)가 포함된 망간 최소 배지에서의 생장이 우수하고, 망간산화능이 우수한 한 균주를 최종 선별하여 본 실험에 사용하였다. 일반적으로 망간산화가 일어나면 배지내의 +2가의 망간이 +3가나 +4가의 망간으로 산화하여 갈색 집락을 형성한다. 본 실험에 최종 선별되어 사용된 균주도 망간이 함유된 배지에서 배양했을 경우 갈색 집락을 형성하는 것을 확인하였다.</p><p>최종 선별된 균주는 그람음성의 무포자 호기성 간균으로 운동성이 없고, oxidase에만 양성반응을 나타낼 뿐, catalase, indole 생성, methyl red, Vogesproskauer, starch hydolase, urease등에 음성반응을 나타냈다. 당 이용능 조사에서 이 균주는 lactose만 이용하고, fructose, arabinose, sorbose, ribose, cellobiose, maltose, glucose, rhammose, mannose, sucrose 등을 모두 이용하지 못하는 것으로 확인되었다. 그리고 이러한 형태, 생리◦생화학적 특성과 16s rRNA 염기 서열 분석 결과, 최종 선별된 균주는 Aeromonas sp. 으로 동정 되어 Aeromonas sp. MN44라 명명하였다.</p><p>Aeromonas sp. MN44의 항생제에 대한 내성조사 결과 이 균은 ampicillin, chloramphenicol, kanamycin, spectinomycin, tetracycline등 조사한 모든 항생제에서 생장하지 않아 이들 항생제에 대한 내성이 전혀 없는 것으로 확인 되었다. 또 Aeromonas sp. \( \mathrm{MN} 44 \)의 중금속에 대한 내성 시험 결과, \( \mathrm{Li} \)과 \( \mathrm{Mn} \)은 각각 \( 3.2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)과 \( 1.6 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)까지의 높은 내성을 나타내었고, \( \mathrm{Rb} \)는 \( 800 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}, \mathrm{Br} \)은 \( 600 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}, \mathrm{Pb} \) 는 \( 400 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}, \mathrm{Cu} \)는 \( 150 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}, \mathrm{Co} \)는 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도까지 그리고 \( \mathrm{Zn} \) 은 \( 25 \mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{ml}, \mathrm{Hg} \)은 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)까지 내성을 나타내었다. 그러나 \( \mathrm{Cd} \)에 대해서는 전혀 내성을 갖지 않은 것으로 확인되었다.</p><h2>Aeromonas sp. MN44의 망간 산화능</h2><p>Aeromonas sp. MN44의 망간 산화능을 영양 복합배지에서 균체 생육과 함께 주기적으로 측정해본 결과, 접종 후 27시간 후에 정지기로 접어들었으며, 망간 산화능은 배양 3시간 후부터 나타나기 시작해 배양 15시간 후에 최고치를 나타낸 후 배양 약 21시간 후부터 점자 감소하였다. 이러한 망간 산화능 변화는 Okazaki의 보고와 비슷한 결과이다.</p><p>망간산화와 관련된 factor를 조사하기 위해 세포외로 분비되는 물질인 세포배양액과 초음파로 파쇄시켜 얻은 세포내부물질을 이용해 망간 산화능을 측정하였다. 그 결과 Aeromonas sp. MN44의 망간 산화능은 세포외 분비물질인 세포배양액에서는 검출되지 않았고, 초음파로 세균을 용균시킨 시료에서 망간산화능이 검출되어 망간산화기작은 세포 내부에 존재하는 factor에 의해 이루어지는 것으로 확인되었다. 이와 같이 세포내 효소에 의해 망간산화가 진행되는 균이 Pseudomonas, Citrobacter, Arthrobacter에서 이미 보고된 바 있다. 그러나 Leptothrix가 생성하는 망간산화물은 세포외 분비효소에 의해서 만들어진다고 밝혀져 있어 미생물에 따라 망간산화에 관련된 물질이 다양하게 존재하는 것으로 추정된다.</p><p>망간을 산화하는 물질이 단백질인지를 확인하기 위해 단백질 분해효소인 proteinase K를 처리한 것과 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)로 10분 가열 처리를 한 후의 망간 산화능을 측정한 결과 proteinase K와 가열 처리를 한 것의 망간 산화능이 처리하지 않은 것에 비해 각각 \( 1.6 \% \) 와 \( 0.8 \% \)만이 남아있어 Aeromonas sp. MN44의 망간 산화능은 Okazaki[15]의 결과와 유사하게 단백질에 의해 나타난 것임을 확인 하였다.</p><p>또 완충액의 \( \mathrm{pH} \) 가 망간 산화능에 미치는 영향을 조사하기 위하여 \( 10 \mathrm{mM}\) HEPES-\(\mathrm{NaOH} \) 완충액을 \( \mathrm{pH} \) 4, \( \mathrm{pH} \) 5, \( \mathrm{pH} \) 6, \( \mathrm{pH} \) 7, \( \mathrm{pH} \) 7.4, \( \mathrm{pH} \) 8, \( \mathrm{pH} \) 9, \( \mathrm{pH} \) 10 으로 조정하여 \( \mathrm{pH} \)에 따른 망간 산화능을 측정하였다. 그 결과 pH \( 4 \sim 6 \) 의 산성 \( \mathrm{pH} \)에서는 망간 산화능이 저조하였고 \( \mathrm{pH} 7 \sim 9 \) 에서 망간 산화능이 우수하여 Aeromonas sp. MN44의 망간 산화는 중성부터 약 알카리성에서 잘 이루어짐을 확인하였다. 이 결과는 Okazaki의 \( \mathrm{pH} \) 범위와 일치되는 결과이다.</p><h2>망간 산화 factor의 부분 정제</h2><p>NB 배지 1 l에 Aeromonas sp. MN44를 18시간 배양한 후, 배양액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 6,000 \times \mathrm{g} \)로 10 분간 원심 분리하여 상등액을 제거하고 균체를 수획하였다. 이 균체는 \( 10 \mathrm{mM} \) HEPES-\( \mathrm{NaOH}(\mathrm{pH} 7.4) \) 완충액으로 3번 세척 후 동일 완충액 소량으로 현탁 시켜 얼음에서 30 초 퐈쇄 후 40 초 쉬는 방법으로 7분간 파쇄를 5 번 반복(output watts \( 14 \mathrm{~W} \); SONICS \& MA-TERIAL INC., VIbra-Cell \( { }^{\mathrm{TM}} \), USA) 하고 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm{g} \), 20분, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) )하여 상등액을 조효소액(crude extract)으로 사용하였다. 수획한 조효소액은 \( 10 \sim 35 \% \) 사이의 ammonium sulfate로 침전시켜, 이 침전물을 가지고 단백질 농도 및 망간산화능을 측정하였다. 그 결과 ammonium sulfate로 침전된 것의 망간 산화능은 \( 4,790 \mathrm{unit} \)로 조효소액에 비해 2.21배 농축 되었으며 회수율은 \( 20.7 \% \)임을 확인하였다. 또 \( 10 \sim 35 \% \)ammonium sulfate로 침전시킨 시료를 DEAE-toyopearl \( 650 \mathrm{M} \)으로 충진 시킨 column으로 ion exchange chromatography를 수행한 결과 망간 산화능이 \( 539 \mathrm{unit} \)로 조효소액에 비해 5 배 농축되었고 회수율은 \( 11.3 \% \)로 나타났다. 그리고 Sephadex G-200으로 충진한 column으로 gel filtration 한 물질의 망간 산화능은 12.88배 농축되었고, 회수율은 \( 2.87 \% \) 이었다. 각 단계에서 정제된 단백질을 \( 12 \% \) SDS polyacrylamide gel로 전기 영동한 결과 단</p><p>일 band가 아닌 여러 band가 나타났고, 망간 산화능을 갖는 단백질을 native gel에서 망간이 함유된 배지에 접촉시켜 갈색의 band를 나타내는 부위를 확인한 결과, Aeromonas sp. MN44가 생성하는 망간 산화 factor는 약 \( 113 \mathrm{kDa} \)의 분자량을 갖는 단백질인 것으로 추정된다. 이는 망간산화와 관련되어 지금까지 부분 정제되어 밝혀진 Okazaki의 망간산화 factor \( 180 \mathrm{kDa} \)과 \( 250 \mathrm{kDa} \)보다는 작은 단백질로 추후 이 단백질을 정제하여 망간 산화효소에 대한 특성을 밝힌다면 다양한 분야에 이용될 수 있을 것이라 사료된다.</p>
실험 실시를 위하여 1차 선별한 균주는 몇 개인가?
3균주