<p>분리된 genomic DNA를 제한호소 Sau3A I 으로 부분 절단한 후, \( 0.8 \% \) agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 \( 3\sim 7 \mathrm{kb} \)의 DNA 절편을 분획하여 Gel extraction kit(Bioprogen, Daejeon, Korea)로 정제하였다. 분획된 DNA 절편을 insert로 하여 pWHM3 vector의 BamHI site에 ligation 하였다. 토양 genomic DNA 단편이 포함된 재조합 plasmid는 heatshock(\( 42^{\circ} \mathrm{C} \))에 의해 E. coli DH5\( \alpha \) competent cell에 형질전환 시켰고, ampicillin(50 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), Sigma, MO, USA), IPTG(20 \(\mu \mathrm{M} \), Sigma, USA) 그리고 X-gal(40 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), Sigma, MO, USA) 등이 포함된 LB plate 상에서 재조합 colony를 선별하였다.</p><p>이상의 방법으로 토양 metagenome library (Korea Soil Library, KSL)를 제작한 결과, 토양 DNA \( 1 \mu \mathrm{g} \)당 약 300여 개의 clone을 얻어 현재 약 20,000여 개의 metagenome library가 확보되었으며 모든 clone들은 대장균에서 발현되는 유용 유전자원을 확보하기 위하여 high throughput screening(HTS)에 적용이 가능하도록 96 well plate에서 배양한 후 \( 20 \% \) glycerol을 첨가하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다. 또한 각 well plate의 clone을 따로 모아서 clone pool의 형태로 하여 KSL1~133, 140, 141, 142로 각각 명명하여 총 136개의 clone pool을 \( 20 \% \) glycerol이 함유된 vial에 보관하였다.</p><p>Metagenome library 중 혈전용해 활성을 가진 형질전환주에 대한 효율적인 screening을 위해 우선 단백질 분해 활성을 가진 형질전환주를 선발하고자 \( 0.5 \% \) skim milk가 첨가된 LB plate에 tooth-pick로 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 항온기에서 배양하여 집락 주위에 나타나는 투명환의 생성유무를 기준으로 단백질 분해효소를 생산하는 활성 균주를 선발하였다. 특히, 단백질 분해 활성을 보이는 형질전환주에 대해서는 \( 0.5 \% \) skim milk 대신 \( 0.3 \% \) fibrin을 기질로 첨가한 LB plate 상에서 동일한 방법으로 혈전용해 활성을 조사하였다. \( 0.5 \% \) skim milk가 포함된 LB plate에 형질전환주를 도말하여 조사한 결과, KSL16-1, KSL16-56, KSL28-76, KSL28-88 등 4개의 clone들이 투명환을 보여 단백질 분해효소를 생 산하는 것으로 예상되었지만, 2차 확인 실힘에서는 KSL28-76, 28-88 등 2개의 clone에서만 활성의 재현성이 나타닜다. 이에 단백질 분해 활성이 있는 KSL28-76과 KSL28-88 clone의 배양 상등액을 시료로 하여 \( 0.3 \% \) fibrin 용액을 기질로 하여 가수분해 활성을 조사하였으나 fibrin(혈전)분해 활성은 보이지 않았다. 따라서 최종 선발된 KSL28-76과 KSL28-88 clone은 skim milk에 대한 단백질 분해 활성은 보였지만, 혈전용해 활성은 보이지 않는 것으로 보아 타 기질에 대한 추가적인 활성 조사가 필요할 것으로 생각된다.</p>
분획된 DNA 절편을 insert로 하여 pWHM3 vector의 어디에 ligation 하였는가?
BamHI site