<h2>Testosterone, aromatase 및 5 \( \alpha \)-reductase 2 측정</h2><p>호로파 추출물 및 야관문 추출물의 최적의 혼합비율을 결정하기 위해 96 well에 \( 7.5 \times 10^{3} \mathrm{cells} / 0.1 \mathrm{~mL} / \mathrm{well} \) 이 되도록 세포를 분주하고 24 시간 후 추출물 및 여러 가지 비율로 혼합한 추출물이 포함된 배지로 교환하여 24시간 배양하고 배양배지를 수거하여 테스토스테론 농도를 측정하였다. 과산화수소 스트레스를 준 세포에서의 최적 혼합비율 추출물 YHM의 효능측정을 위해서는 6well에 \( 3 \times 10^{5} \mathrm{cells} / 3 \mathrm{~mL} / \mathrm{well} \) 보 분주하고 24 시간 후, 과산화수소가 \( 50 \mu \mathrm{M} \) 포함된 serum free 배지로 교환하였다. 4 시간 후 YHM이 농도별로 포함된 배양배지로 교환하여 20 시간 배양하고 배양배지를 수거하여 시험에 사용하였다. 테스토스테론은 Enzo Life Sciences의 ELISA kit (Farmingdale, NY, USA)를 aromatase와 5 \( \alpha \)-reductase2의 농도는 EIAab Science의 kit (Wuhan, China)를 사용하여 측정하였다.</p><h2>Real-time PCR</h2><p>\( 60 \mathrm{~mm} \) dish에 \( 6.0 \times 10^{5} \mathrm{cells} / 5 \mathrm{~mL} \) 로 분주하고 24 시간 후, 과산화수소가 \( 50 \mu \mathrm{M} \) 포함된 serum free 배지로 교환하였다. 4시간 후 \( \mathrm{YHM} \) 이 농도별로 포함된 배양배지로 교환하여 20시간 배양하였다. easy-BLUE \( { }^{\mathrm{TM}} \) (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용해 RNA를 추출하여 spectrophotometer (UV-2450, SHIMADZU, Nakagyo-ku, Kyoto, Japan)로 흡광도를 측정하여 정량하여 사용하였다. 측정에 사용된 유전자 및 primer는 Table 1 에 표시하였다. Total RNA \( 2 \mu \mathrm{g} \) 을 RevoScript \( ^{\mathrm{TM}} \) Reverse Transcriptase premix kit (iNtRON Biotechnology)를 이용하여 총 부피 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 로 반응하여 cDNA로 합성하고, SYBG Green supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) \( 5 \mu \mathrm{L} \), cDNA \( 1 \mu \mathrm{L} \), 각각의 프라이머 \( (10 \mathrm{pmol} / \mu \mathrm{L}) 1 \mu \mathrm{L} \) 그리고 \( 2 \mu \mathrm{L} \) 멸균증류수를 섞어 Chromo \( 4^{\mathrm{TM}} \) Real-Time Detector (Bio-rad)로 다음 조건으로 real time PCR을 수행하였다: 초기 변성은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초, Annealing & Extension은 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초 씩 40 회 반복시켰다. 모든 반응은 housekeeping 유전자인 \( \beta \)-actin으로 보정하고 과산화수소를 처리하지 않은 control을 기준으로 보정하였다. 보정은 Vandesompele 등(2002)의 방법으로 계산하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>모든 자료들은 평균과 표준편차로 나타내었으며 SPSS 프로그램(ver. 21.0, SPSS INC., Chicago, IL, USA)을 이용하여 통계해석을 실시하였다. One-way analysis of variation (ANOVA)를 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군과 유의차가 있는 시험군을 확인하기 위해 Dunnett’s t-test를 실시하였다(유의수준 양측 \(5 \%\)).</p>
혼합비율 결정 실험에서 세포를 96 well plate에 분주 한 후 몇시간 후에 배지에 도포해야 하는가?
24시간