<h1>결과 및 고찰</h1><h2>HaCaT에서 TQE의 농도에 따른 세포 생존율 측정</h2><p>TQE 추출물 독성에 따른 세포 생존율을 확인하기 위하여 추출물을 농도 별(\( 10\), \(20\), \(50\), \(100\), \(200\), \(500 \mathrm{~mg} / \mathrm{mL}) \)로 처리한 결과는 Fig. \(1\)에 나타내었다. 그 결과 농도가 증가함에 따라 세포 생존율은 유의적으로 감소하는 경향을 보이고, \( 50 \mathrm{~mg} / \mathrm{mL} \) 처리 시 약 \( 70 \% \) 정도의 생존율을 나타내었으며, 이 결과를 통해 TQE 추출물은 \( 50 \mathrm{~mg} / \mathrm{mL} \) 이상으로 세포에 처리 할 경우 세포의 생존에 영향을 줄 수 있을 것이라 판단하였다. 따라서, 세포 생존율에 영향을 미치지 않은 것으로 판단 되는 \( 20 \mathrm{~mg} / \mathrm{mL} \)의 농도이하에서 이후 모든 실험을 진행하였으며 추출물에 의해 피부 활성에 미치는 효과를 확인하고자 하였다.</p><h2>HaCaT에서 TQE 추출물이 MMP-1 발현에 미치는 효능 평가 분석</h2><p>자외선은 MMP-\(1\)의 생성을 유도하여 콜라겐의 분해 단백질의 일종인 MMP-\(1\)의 발현을 증가한다고 알려져 있다. 따라서, TQE 추출물이 자외선에 의해 유도되는 MMP-\(1\)의 생성을 억제하는지 확인하고자 HaCaT에서 RT-PCR 방법으로 MMP-\(1\) mRNA 발현 정도를 비교 분석하였으며, 단백질의 발현 정도를 확인하기 위하여 western blot 방법을 이용하여 검증 하였다. 또한, 발현된 단백질의 정량을 위해 HaCaT 배양액만을 회수하여 MMP- \(1\) ELISA kit를 이용하여 정량하였다. TQE 추출물을 농도 별로 처리 하였을 때, TQE 추출물에 의해 MMP-\(1\) mRNA 발현을 강하게 저해하였으며(Fig. \(2\)A), 단백질 발현 양상도 mRNA 발현 양상과 유사한 패턴으로 저해하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. \(2\)B). 이와 같은 결과에 따라 억제된 MMP-\(1\) 단백질을 정량하기 위해 ELISA assay 실험을 통해 MMP-\(1\) 단백질의 발현양을 검증한 결과 역시 유전자 수준에서의 저해 양상과 유사한 결과를 확인할 수 있었다(Fig. \( 2 \)C). 이러한 결과를 볼때 TQE 추출물은 광노화 억제 소재로 유용하게 활용될 수 있을 가능성을 확인하였다.</p><h2>TQE 추출물에 대한 콜라겐 분해 효소 발현 억제 기전 분석 평가</h2><p>다음으로 TQE 추출물의 MMP-\(1\) 발현 억제 활성에 대한 생물학적 기전을 분석 하고자 하였다. 이미 설명한 대로 MMP-\(1\) 단백질은 UVB 등의 자외선 자극에 따라 MEK/MAPK 신호전달 단백질의 인산화가 일어난다고 알려져 있다. 따라서, MAPK 단백질을 대상으로 인산화 정도를 분석 하고 특정 단백질의 인산화 저해 정도를 파악하고자 특정 단백질의 항체를 이용한 western blot을 이용하여 확인하였다. Fig. \(3\)의 결과를 살펴보면 자외선 자극을 주었을 때 MAPK 단백질의 인산화 정도가 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 TQE 추출물을 농도 별로 처리하였을 때 MAPK단백질의 인산화가 저해되는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과로 TQE 추출물은 자외선 조사에 따른 MMP-\(1\)의 억제 기전에 있어 MAPK 단백질의 인산화를 억제하는 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.</p><h2>HaCaT에서 TQE 추출물에 의한 IKK의 인산화 및 NF-\(\mathrm{\kappa}\)B 단백질의 핵내로 이동에 미치는 영향 분석</h2><p>다음으로 MMP-\(1\) 단백질의 전사에 중요한 역할을 하는 NF-\(\mathrm{\kappa}\)B 단백질에 미치는 영향에 대해 조사 하고자 하였다. NF-\(\mathrm{\kappa}\)B 단백질은 세포질에서 IKB 단백질과 구조적 결합을 하고 있는데 IKK 단백질의 인산화에 따라 IKB 단백질과 분리되어 핵 내로 이동한 다음 MMP-\(1\) 단백질의 전사에 관여 한다고 알려져 있다. 따라서 Fig. \(4\)에서 확인하듯이 세포질에서의 IKK 인산화는 TQE 의 농도 의존적으로 억제 되는 것을 확인 할 수 있었다. 반면 유리된 NF-\(\mathrm{\kappa}\)B 단백질의 핵 안으로 이동 저해 현상은 아주 미약 하게 나타나는 것을 확 인 할 수 있었다. 결국 TQE는 UV-B 자극에 의해 유도되는 MAPK/IKK 인산화 과정을 효과적으로 억제 한 다는 것을 확인 할 수 있었으며, 그 결과 MMP-\(1\)의 단백질 발현이 억제 될 것이라고 유추 해 볼 수 있다. 그러나 이를 증명 하기 위하여 MMP-\(1\) 단백질의 전사 활성화 부분을 조사하여 실질적인 전사 억제 활성을 검증 해야 할 부분으로 생각 된다. 또한 MMP-\(1\)의 발현 증가에 따른 실질적인 콜라겐의 분해 정도를 확인 하거나 TQE에 의한 콜라겐 합성에 관한 추가 연구도 반드시 필요하다고 생각된다. 본 연구 결과는, 사람 피부 각질 세포를 활용하여 UV-B 자극에 의한 MMP-\(1\)발현 억제 효능을 중심으로 연구를 진행 하였고, MMP-\(1\) mRNA 발현 억제 활성을 RT-PCR 방법으로 검증 하였으며, 직접적인 MMP-\(1\) 단백질의 발현 억제 활성은 western 및 ELISA 실험을 통해 검증 하였다. 그 결과를 미루어 보아 TQE는 아마 자외선에 의한 피부의 주름과 손상에 효과적인 기능 소재로 활용할 수 있을 것으로 기대 된다.</p>
TQE의 농도는 얼마 이하면세포 생존율에 영향을 미치지 않아?
\( 20 \mathrm{~mg} / \mathrm{mL} \)