<h1>재료 및 방법</h1><h2>막걸리의 제조</h2><p>막걸리의 제조는 (유)금정산성토산주에서 제조하는 금정산성 막걸리의 전통제조방식에 의해 조제하였다. 냉각순환 시스템이 설치된 1,000 1 용량의 스테인레스 용기에 증자된 멥쌀, 전통누룩((유)금정산성토산주 자체생산), 물을 첨가하여 혼합시켰다. 이후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지하여 6일간 발효시켰다. 시료는 0, 1, 2, 3, 5, 6일째에 발효조를 혼합한 후 2 1의 시료를 채취하여 냉장상태로 실험실에 운반한 후 미생물, 이화학 및 DGGE분석을 수행하였다.</p><h2>미생물 계수 및 분리</h2><p>균질화된 막걸리 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 생리식염수 \( 9 \mathrm{ml} \) 에 첨가한 후 연속 희석법에 의해 희석한 후 일반세균은 Plate Count Agar (PCA; Difco, USA)배지에 진균은 Potato Dextrose Agar (PDA; Difco, USA)배지에 도말하여 접종하였다. 배양은 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수행하였으며 PCA는 3 일간 그리고 PDA는 5일간 배양 한 후 성장된 집락(colony)을 계수하였다. 미생물의 분리는 성장된 집락의 모양과 색을 기준으로 동일배지를 이용하여 분리하였으며 순수 분리된 균주는 \( 20 \%(\mathrm{v}/\mathrm{v})\) glycerol용액에 현탁 한 후 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보존하였다.</p><h2>이화학적 성분분석</h2><p>\( \mathrm{pH} \) 는 \( \mathrm{pH} \) meter (Mettle-Toledo, Switzerland)로 측정하였다. 총산은 \( 1 \% \) phenolphthalein을 지시약으로 하여 \( 0.1 \mathrm{~N} \) \( \mathrm{NaOH} \) 용액으로 적정하고 적정소비량에 \( 0.009 \) 를 곱하여 시료 중의 산을 lactic acid로 계산하였다. 환원당은 Somogyi 변법에 의해 정량하였고 포도당농도로 환산하였다. 에탄올 함량은 발효액 \( 100 \mathrm{ml} \) 에 증류수 \( 30 \mathrm{ml} \) 을 넣어 증류시켜 증류액 \( 70 \mathrm{ml} \) 에 증류수를 첨가하여 \( 100 \mathrm{ml} \) 로 정용한 후 주정계 (Deakwang Inc., Korea)로 측정하였고 Gay-Lussac 표에 의해 \( 15^{\circ} \mathrm{C} \) 로 보정하여 \(\%(\mathrm{v}/\mathrm{v})\)로 표시하였다.</p><h2>Total genomic DNA 의 추출 및 PCR</h2><p>금정산성 막걸리로부터 세균과 진균의 genomic DNA 추출을 위해 잘 균질화된 \( 30 \mathrm{ml} \) 막걸리는 원심분리(\(15,000\times g\), \(4^{\circ} \mathrm{C} \), \( 15 \mathrm{~min} \) 한 후 침전물을 회수하여 동결건조하였다. 동결건조된 분말을 막자 사발에 넣어 액체질소를 이용하여 세포파쇄를 하였으며 동일과정을 4회 반복하였다. Genomic DNA의 추출은 권과 손에 기술된 방법에 의해 수행하였다. Genomic DNA를 주형으로 하여 16S rRNA와 28S rRNA gene을 증폭하여 PCR 산물을 획득하였다. 세균은 16S rRNA gene 증폭을 위한 universal primer인 27F primer (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492 R primer (5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 이용하여 증폭하였다. 진균은 28S rRNA gene의 증폭을 위한 D1/D2영역의 eukaryotic univer-sal primer인 LROR primer (5'-ACC CGC TGA ACT TAA GC-3')와 LR5 primer (5'-TCC TGA GGG AAA CTT CG-3')를 이용하여 증폭하였다. 증폭을 위한 프로그램은 다음과 같다: \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분 동안 pre-denaturation 한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 denaturation 30초, \( 56^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 annealing 15초, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 extension 1 분 과정을 30 cycle 반복한 후, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분 동안 post-extension하였다. 반응산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 EtBr로 염색하여 확인 한 다음 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)를 사용해 정제하였다.</p>
희석할 때는 어떤 희석법을 이용했나요?
연속 희석법