<h2>In vivo transient activity assay</h2><p>잎에서의 표현형과 공초점 현미경을 통한 리그닌의 축적 및 감소를 확인하고 후 이러한 현상이 MYB7 전사조절인자 하위에 존재하는 리그닌 생합성 유전자에 영향을 미쳐서인지를 확인하기 위하여 애기장대 잎으로부터 추출한 protoplast를 이용하여 in vivo transient activity assay를 실시하였다. 4주 생육한 애기장대의 잎으로부터 protoplast를 추출하고 여기에 PEG를 이용 하여 effector 벡터와 reporter 벡터를 동시에 형질전환 시켰다(Fig. 3A). 이때 effector로는 MYB46 또는 MYB7 및 이두 전사조절인자를 co-transformation한 것을 사용하였고 reporter로는 리그닌 생합성 유전자 중 하나인 4CL1 유전자의 프로모터를 GUS 단백질 앞에 삽입한 것을 사용하였다. 그 결과 effector 벡터를 넣어 주지 않고 report 벡터만 넣어준 대조 구에 비하여 MYB46 전사조절인자는 약 4배 정도의 4CL1 유전자의 발현을 활성화시켰다(Fig, 3). 흥미롭게도 MYB7 전사조절인자를 넣어 준 시험구간에서는 4CL1 유전자의 발현을 대조 구에 비하여 9배 이상 감소시켰으며 리그닌 생합성 유전자의 활성화 능력이 있는 것으로 보고된 MYB46 전사조절인자가 같이 들어간 구간에서조차 대조 구에 비하여 3.5배 이상의 4CL1 유전자의 발현을 감소시켰다(Fig. 3).</p><h2>식물의 이차세포벽 구성에 미치는 MYB7 전사인자의 영향 조사</h2><p>대부분의 바이오매스는 식물에 이차세포벽에 축적된다. 상기의 실험들은 잎에서의 MYB7 전사인자의 역할을 확인한 것으로 실제 바이오매스의 축적이 일어나는 즉, 이차세포벽이 많이 생성되는 줄기에서의 MYB7 전사인자의 역할을 확인하기 위하여 8주 생육 된 애기장대의 줄기로부터 리그닌 함량을 조사하였다. 리그닌에 염색되는 것으로 알려진 Phloroglucinol-\(\mathrm{HCl}\) 시약을 애기장대 줄기의 횡단면에 염색시키고 이를 광학현미경을 통하여 관찰하였다. 그 결과 표피조직의 경우 야생형 애기장대에서는 염색되지 않았지만 MYB7-SRDX 식물체의 줄기에서는 상당히 많은 양의 리그닌 염색을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이는 기존에 리그닌 생합성을 활성화하는 것으로 알려진 MYB46 전사조절인자의 결과와 같은 것으로 MYB7 전사조절인자가 식물의 이차세포벽의 리그닌 생합성에도 관여하는 것을 증명하는 결과로서 이를 이용하면 바이오 에탄올 발효과정에 저해 물질로 작용하는 리그닌을 경감시킬 수 있는 기초 자료로 사용할 수 있을 것이다.</p><h2>MYB7 유전자의 제거에 의한 식물체내 변화 조사</h2><p>MYB7 전사인자의 특성을 좀 더 살펴보기 위하여 MYB7 유전자의 기능을 상실시킨 T-DNA가 삽입된 knockout 식물체를 ABRC로부터 분양받아 실험하였다(Fig. 5A). 우선 분양 받은 종자의 MYB7 유전자의 발현을 확인하기 위하여 RT-PCR을 실시한 결과 MYB7 유전자의 발현 knockout 된 것임을 확인할 수 있었다(Fig. 6B). 이렇게 확인된 종자와 이 종자에 리그닌의 생합성 활성화 능력이 있는 것으로 알려진 MYB46 전사인자를 과발현시킨 식물체의 생육을 조사한 결과 MYB7 유전자의 발현 knockout 시킨 식물체 및 MYB7 knockout에 MYB46를 과발현시킨 식물체에서는 특이적인 변화를 관찰할 수 없었다(Fig. 6A). 또한, 이들 식물체로부터 추출한 cDNA를 이용하여 리그닌 생합성에 관여하는 4CL1 유전자의 발현 정도를 확인한 결과에서도 특이한 변화를 관찰할 수 없었다. 이는 애기장대 내에 MYB7 전사조절인자의 역할을 대신해줄 수 있는 다른 전사 인자(MYB4 및 MYB32)에 기인한 것으로 사료된다. 종합적으로 상기의 결과들로부터 애기장대의 MYB7 전사조절 인자는 식물의 구성성분 중 하나인 리그닌의 생합성을 억제 조절하는 것으로 판단되며 좀 더 구체적인 연구를 진행한다면 에너지 작물 개발 분야에서는 저 리그닌 또는 추출이 쉬운 리그닌을 가진 작물의 개발 및 효소들이 쉽게 접근이 가능한 작물 개발의 기초 자료로 사용될 수 있을 것이다.</p>
in vivo transient activity assay 는 어떤 물질로 했어?
protoplast