<h1>재료 및 방법</h1><h2>시료의 추출</h2><p>본 실험에 사용한 홍화자(Carthamus tinctorious seed)는 경북 영천에서 2009년 11월경 건조된 씨를 구입하여 실험재료로 사용하였다. 홍화자 \( 5 \mathrm{~kg} \)을 헥산을 이용하여 먼저 탈지한 뒤, \( 70 \% \) 에탄올을 가하여 상온에서 1주일간 3회 추출한 다음 filterpaper (Whatman No. 2)로 여과하였고, 얻어진 여액은 감압농축하여 아세톤 추출물(615 g)을 얻었다. 이 \( 70 \% \) 에탄올 추출물을 증류수에 현탁 시킨 후 용매 극성 차를 이용해 서로 다른 용매를 첨가하여 단계적으로 분획하였다. 홍화자 추출물과 헥산을 1:1 비율로 분획 깔대기에 넣고 헥산으로 분획하였고,헥산층을 다시 감압 농축하여 헥산 분획물 15.8 g을 얻었다. 동일한 과정을 통해 에틸아세테이트(129.7 g), 부탄올(182.9 g),물(854.6 g)층의 분획물을 얻었다.</p><h2>시약 밎 기기</h2><p>세포 배양액인 dulbeco's modifide eagle medium(DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin penicillin등의 세포배양용 시약들은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 sodium dodecylsulfate (SDS), acrylamide, bis-acrylamide는 Bio-rad사(Hercules, CA, USA)에서 구입하였고, NP-40, protease in-hibitor, RIPA buffer, griess reagent 등은 Sigma ChemicalCo. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 1차 항체인 iNOS BD bioscience (Sanjose, CA, USA) COX-2cayman (Ann arbor, MI, USA), β-Actin과 2차 항체인 an-ti-rabbit Ig-G horseradish peroxidase (HRP)-conjugated an-tibody (Santa cruz, CA, USA)에서 구입하였다. PGE2 측정을 위한 ELISA kit는 (R&D systems Inc., Minneapolis, MN USA)에서 구입하였다.</p><h2>세포배양</h2><p>마우스의 대식세포주인 Raw 264.7 cell은 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 \( 10 \% \) FBS과 \( 1 \% \) penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 \( 37 \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다.</p><h2>MTT assay에 의한 세포 생존율 측정</h2><p>홍화자 분획물의 세포에 대한 독성 측정은 MTT 방법으로 분석하였다. Raw 264.7 cell \( 5 \times 10^{4} \) cells \( / \mathrm{ml} \)를 96 well plate에 분주하고 홍화자 분획물을 농도별 \( (5,10,25,50,100 \mathrm{ug} / \) ml)로 24시간 동안 처리하였다. Well당 20 μl의 MTT용액을 첨가하여 \( 37 \mathrm{r}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator (Hanbaek, Gyeonggi-do,Korea)에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader(Tecan, Mönnedorf, Switzerland)를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율울 백분율로 표시하였다.</p><h2>Nitric Oxide 생성량 측정</h2><p>NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess reagent를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 \( 5 \times 10^{4} \) cells/ml로 조절한 후 12 well plate에 접종하고, \( 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 전 배양하였다. 세포에 \( 1 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \의 LPS를 처리하고 1시간 뒤에 \( 5,10,25,50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 홍화자 분획물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후 griess reagent과 반응 시킨 후 ELISA reader로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 NO 생성율을 백분율로 표시하였다.</p><h2>Prostaglandin \( \mathrm{E}_{2} \) 와 cytokine 생성량 측정</h2><p>세포배양액 내의 PGE2, TNF-α, IL-1β, IL-6 생성량은 ELISAkit를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 \( 5 \times 10^{4} \) cells/ \( \mathrm{ml} \)로 조절한 후 12 well plate에 접종하고, \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 배양하였다. 세포에 \( 1 \mathrm{\nu g} / \) \( \mathrm{ml} \) 의 LPS를 처리 한 뒤 1시간 후에 \( 0,1,10,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 홍화자 분획물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양배지를 취하여 PGE2를 측정하였다.</p><h2>홍화자 분획물에 의한 세포내 염증관련 단백질 발현 양상측정</h2><p>홍화자 분획물의 피부 염증 효과를 알아보기 위하여 염증과 관계되어진 iNOS, COX-2 단백질의 양을 측정하였다. 대식세포주(Raw264.7)를 이용하여 culture dish에 배양한 뒤 sample처리를 한 다음 24시간 후에 PBS로 세척한 후 원심분리하여 세포를 수집하고, RIPA buffer를 사용하여 cell lysate를 제조하였다. 세포 lysate에 함유된 단백질의 양은 Bradford 법으로 측정하였다. 단백질 \( 20 \mu g \)을 \( 10 \% \) polyacrylamide를 함유한 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF membrane으로 electroblot \( 120 \mathrm{~V} \)에서 1시간을 실시하였다. 이어 PVDF membrane을 \( 5 \% \) skim milk에서 1시간 방치한 뒤 primary antibody에서\( 4 \mathrm{C} \)에서 overnight하여 주었다. 다시 tris-buffered saline and tween20 (TBST)로 세 번 세척한 뒤 secondary antibody를 상온에서 1시간 반응 시킨 뒤 TBST로 세 번 세척하고 ECL kit(Amersham-Pharmacia)와 반응시켜 X-ray film에 노출시켰다. LAS4000 image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo,Japan)를 이용하여 밴드 현상 및 정량화 하였다.</p><h2>홍화자 분획물에 의한 세포내 염증관련 mRNA 발현 양상측정</h2><p>홍화자 분획물의 효과를 알아보기 위하여 RT-PCR 방법을 통해 iNOS, COX-2의 mRNA 발현을 측정하였다. 대식세포주를 이용하여 culture dish에 배양한 뒤 sample 처리를 한 다음 24 hr 후에 PBS로 세척한 후, Total RNA는 DEPC처리된 sal-ine으로 3번 세척하고 세포를 포집한 다음 trizol을 이용하여 분리하였다. Total RNA \( 2 \mu g \) 과 PCR primer oligonucleotide(target 유전자와 내부표준 β-actin 유전자)를 RP-PCR mixer와 혼합하고 RT-PCR을 실시하였다. RT의 조건은 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 방치하여 cDNA를 제조하고 \( 94 \mathrm{C} \)에서 5분간 방치하여 reverse transcriptase를 불활성화시켰다. 이어 PCR 조건은 \( 94 \mathrm{C} \)에서 30초(denaturation), \( 50 \mathrm{C} \)에서 30초(annealing), \( 72 \mathrm{C} \)에서 90초(extension)의 반응을 25~35회 반복하는 것을 기본으로 target cDNA 종류에 따라 최적의 조건으로 조절하였다. 증폭된 cDNA는 \( 1.2 \% \) agarose gel을 사용한 전기영동으로 분리하고 ethidium bromide로 염색한 다음 LAS4000 image an-alyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)로 정량하였다.</p>
본 실험에서 세포 lysate에 함유된 단백질을 어떻게 정량하였는가?
Bradford 법