<h2>PAT 단백질의 glycosylation 여부 평가</h2><p>JG21-MS1 잔디에서 발현 된 PAT 단백질이 당화(glycosylation)되지 않았음을 실험적으로 증명하기 위해, JG21-MS1 잔디에서 PAT 단백질을 정제하여 당단백 염색 실험을 수행하였다. 먼저 GM 잔디에서 PAT 단백질을 정제하기 위해 항체 및 항체칼럼을 제작하였다. PAT 항체(Rabbit polyclonal antibody)는 대장균에서 정제한 PAT 단백질을 항원으로 (주)영인프런티어에 의뢰하여 제작하였고, 정제한 rabbit anti-PAT 항체를 이용하여 항체칼럼을 제작하였다. 항체칼럼은 Pierce사의 Kit (Pierce, product number 44894)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 제작하였고, 이 항체칼럼을 사용하여 GM 잔디로부터 PAT 단백질을 정제하였다. 정제한 PAT 단백질의 생성 후 변이 여부(glycosylation)는 Glycoprotein Staining Kit (Pierce)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 분석하였다.</p><h2>단회 경구투여 독성실험 시험물질의 제조</h2><p>단회 경구투여 독성실험은 대구경북첨단의료산업진흥재단 실험동물센터에 의뢰하여 수행하였다. 본 실험은 ‘의약품등의 독성시험기준' 식품의약품안전처 고시 제 2015-82호에 근거하여 실시하였다. 또한 본 실험은 동물보호법에 근거한 대구경북첨단의료산업진흥재단 실험동물센터 동물윤리위원회(IACUC)에 의해 승인되었다(승인번호: DGMIF-17092102-00).</p><p>경구투여 실험의 부형제로는 PBS 버퍼가 사용되었으며 정제된 PAT 단백질은 투여 하루 전 무게를 측정하여 투여용량에 맞게 부형제에 3시간 용해시킨 후 3시간 방치하며 침전여부를 확인하였고 투여시작 전까지 \( 2 \sim 8^{\circ} \mathrm{C} \)에 냉장 보관한 뒤 투여직전 상온에서 차광한 상태로 보관하였다</p><h2>실험동물</h2><p>실험동물로는 6주령 ICR 마우스를 암수 각각 25 마리를 입수하여 7일간 순화기간을 가졌으며, 순화기간 종료일에 체중을 측정하고 일반증상을 관찰하였다. 마우스는 입수 후 IVC케이지 (\( 391\mathrm{W} \times 199\mathrm{D} \times 130\mathrm{H} \mathrm{mm} \))에 케이지당 5-6마리씩 수용하였고, 실험기간에는 케이지당 5마리로 분류하여 시험을 실시하였다. 사육실의 온도는 \( 23 \pm 3^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지하였고 상대습도는 \( 55 \pm 10 \% \), 환기횟수는 10 ~ 20 회/시간, 명암주기는 12시간/일(07:00 19:00), 조도는 \(150 \sim 300 \mathrm{lux}\)로 유지하였다. 마우스 사료는 (주)우정BSC로부터 공급받아 모니터링 정보를 확인하고 급이기에 고형사료를 넣어 자유 섭취시켰다. 음수의 경우 대구광역시 상수도를 RO수 장치를 통하여 정수한 뒤 자유 섭취시켰다.</p><h2>실험동물의 군분리 및 실험물질 투여</h2><p>실험동물의 군분리는 순화종료일에 평균체중에 가까운 수컷 및 암컷 각각 20 마리를 선별하여 각 군 평균체중이 균등하도록 무작위로 8 군, 군당 5 마리로 군분리를 실시하였다. 실험동물 개체별 실험물질 투여액량은 절식 후(투여당일)의 체중을 기준으로 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \)으로 투여하였다. 경구투여용 카테터를 부착한 일회용 주사기 (\( 1 \mathrm{~mL} \)) 를 이용하여 위내에 단회 강제 투여하였다. 모든 동물은 투여 전에 음수는 자유 섭취시키면서 약 4시간이상 절식시켰고, 투여 약 4시간 후 사료를 급여하였다. PAT 단백질은 대조군(G1)에는 \( 0 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \), 시험물질 저용량군 (G2)에는 \( 1,000 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \), 시험물질 중용량군 (G3)에는 \( 2,000 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \), 시험물질 대용량군(G4)에는 \( 4,000 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 용량으로 각각 투여하였다.</p><h2>실험동물의 임상증상 관찰</h2><p>모든 동물은 매일 사료 및 음수 섭취, 운동성, 사망률 및 부상 여부 등을 관찰하였다. 시험동물의 관찰은 투여 1 일차에 30분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간 이후 7 일간 매일 1 회 증상을 관찰하였다. 모든 동물은 군분리 전 체중을 측정하고 측정된 체중에 따라 군을 나누었으며, 실험물질 투여를 실시한 후에는 1 일, 5 일 및 7 일차에 체중을 측정하였다. 모든 동물은 실험기간이 종료된 후 \( \mathrm{CO}_{2} \) 가스를 이용한 안락사를 실시한 후 부검을 통하여 5 대장기(심장, 폐, 간, 신장, 비장)의 이상 여부를 육안으로 관찰하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>본 실험에서 얻은 결과는 평균 \( \pm \) 표준편차(mean \(\pm \)SD) 로 나타내었으며, 통계처리는 SPSS (20.0, Statistical Package for Social Sciences Inc., USA)를 이용하여 일원변량분석(One way ANOVA)을 실시한 후 영양성분 함량 분석 실험은 Student's t-test로 동물실험은 Duncan's multiple range test로 실험군 사이의 유의성을 \(p<0.05\) 수준에서 검증하였다.</p>
PAT 단백질은 어디에서 발현되었나요?
JG21-MS1 잔디