<h1>결과 및 고찰</h1><h2>Ethanol 농도에 따른 phenol성 물질의 용출량</h2><p>감나무잎 추출물의 추출 조건을 확립하기 위해 다양한 농도의 ethanol을 추출용매로 하여 phenol성 물질의 용출량을 측정하였다. 그 결과 Fig. 1 과 같이 \( 60 \% \) ethanol을 사용하여 추출하였을 경우 가장 높은 용출량을 확인 할 수 있었으며, tyrosinase 억제 효과도 \( 60 \% \) ethanol 추출물에서 가장 높게 나타나는 것으로 보아 phenol성 물질의 함량과의 상관관계가 인정되었다. 따라서 이후의 실험은 물 추출물과 \( 60 \% \) 에탄올 추출물을 이용하여 실시하였다.</p><h2>추출물의 tyrosinase 억제 효과 측정</h2><p>Tyrosinase는 tyrosine으로부터 3,4-dihydroxyphenylalanine과 DOPA-quinone을 거쳐 최종적으로 흑갈색의 melanin 색소 생성에 관계하는 효소로써 야채나 과실류 특히 감자의 갈변현상과 피부에 암갈색의 색소 물질을 침착 시키는 원인이 되기도 한다. 본 연구에서는 식물 유래 추출물로부터 미백 및 갈변 저해물질을 분리하고 미백효과를 검토하여 기능성 화장품 소재로서 활용키 위해 tyrosinase 억제효과를 검토한 결과 Fig.2 에서와 같이 감잎 \( 60 \% \) 에탄올 추출물에서 약 \( 37 \% \) 의 tyrosinase 억제효과를 나타내어 가장 높은 저해효과를 확인할 수 있었다. 그리고 전체적으로 물 추출물보다는 에탄올 추출물이 tyrosinase 저해활성이 높은 것을 확인할 수 있었다. Tyrosinase 저해활성은 폴리페놀의 종류 및 그 구조와 상관관계가 있는 것으로 Kim 등은 보고하였고, 또한 폴리페놀 중에서도 catechin류는 tyrosinase 저해활동을 나타내지 않았지만, gallocatechin이나 epicatechin류에서 높은 저해활성을 나타내었으며, monomer보다 dimer에서 저해활성이 더 우수하였다고 안 등은 보고하였다.</p><h2>감잎 추출물로부터 tyrosinase 저해 물질의 정제 및 동정</h2><p>Tyrosinase 저해 활성 측정 결과 감잎 추출물에서 \( 37 \% \) 의 저해력을 나타내어 감잎으로부터 효소활성 저해 물질로 생각되어지는 화합물인 polyphenol류를 정제하고자 하였다. 감잎을 \( 60 \%\) EtOH로 추출하여 농축하고 Sephadex LH-20 column에 충진하여 \( 60 \%\) EtOH을 용매로 하여 용리한 결과 Fig. 3과 같이 3가지 분획물을 얻을 수 있었으며, 세가지 분획 중 B 분획에서 효소 저해 활성이 확인되어, Sephadex LH-20 column을 이용하여 EtOH을 \( 0 \rightarrow 100 \% \)까지 변화시키며 2차 분리를 수행한 결과 B 분획에서 3 가지 (B-1, B-2, B-3) 분획이 검출되었고, C 분획에서 2가지 (C-1, C-2)분획이 검출되었다. 이들 분획 중 B-2와 C-1에서 tyrosinase 저해활성이 검출되었으나, TLC 상에서 혼합물로 판정되어 순수물질로 분리하기 위하여, B-2와 C-1을 MCI-gel CHP-20 column을 이용하여 3차 분리 하였다. 이때 용리 조건은 MeOH을 \( 0 \rightarrow 100 \% \) 로 gra-dient로 용출하였다. 그 결과 Fig. 3에서와 같이 B-2로부터 B-2-1와 B-2-2을, C-1으로 부터 C-1-1, C-1-2 및 C-1-3의 단일 물질을 얻을 수 있었으며, 각 정제물을 이용하여 tyrosinase저해 활성을 측정한 결과 B-2-2(compound A)와 C-1-2(com-pound B)에서 높은 효소 저해 활성을 확인할 수 있었다. 정제된 2가지 compound의 동정을 위하여 구조 분석을 한 결과, compound A는 무색침상형으로 melting point가 \(186 \sim 189^{\circ} \mathrm{C} \) 이었고, \( [\mathrm{a}]_{\mathrm{D}} \)가 \( +2.4^{\circ}(\mathrm{C}=1.0 \), acetone\()\)이었으며, negative FAB-MS에서 305의 분자량을 얻었으므로 (-)-epicatechin 및 (+)-catechin에 산소 분자 1개가 더 결합한 물질임을 알 수 있었고, \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR} \) spectrum에서 \( 2.56 \mathrm{ppm} \) (dd), \( 2.75 \mathrm{ppm} \) (dd)는 alipatic 영역의 \( 4-\mathrm{H} \) 를 의미하고 \( 4.13 \mathrm{ppm}(\mathrm{s})\), \(4.74 \mathrm{ppm} \) (d)은 catechol의 전형적인 signal로써 \( 3,2-\mathrm{H} \) 를 확인할 수 있었다. 또한 \( 5.86\), \(5.99 \mathrm{ppm} \) spectrum은 doublet의 분열 양상으로 \( 6,8-\mathrm{H} \)임을 시사하였고 \( 6.52 \mathrm{ppm} \)의 \( 2 \mathrm{H} \)분의 singlet는 \( 2^{\prime}, 6^{\prime}-\mathrm{H} \) 로서 (+)-gallocatechin으로 동정하였다. 이러한 결과는 Sakanaka등의 분석 결과와 일치하였다. Compound B는 염갈색의 무정형으로 \( [a]_{D} \)는 \( -157.6^{\circ}(\mathrm{C}=1.0 \), acetone\( ) \) 이었고 anisalde-hyde- \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)에서 갈색반응을 나타내었으며, negative FAB-MS에서 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} ; 609[\mathrm{M}-\mathrm{H}]^{-} \)의 분자량을 얻었으므로 축합형 탄닌의 dimeric 이상의 화합물임을 알 수 있었다. Compound \( \mathrm{B} \)를 monomer로 제조하기 위해 thiolysis반응을 거쳐 Sephadex LH-20 column으로 분리한 결과 Fig. 4에서와 같이 compound B-1과 B-2가 \( 1: 1 \mathrm{~mol} \) 의 비율로 얻어 졌으며 B-1의 \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR} \) spectrum을 확인한 결과 \( 4.09 \mathrm{ppm} \) (2 \( \left.\mathrm{H}, \mathrm{s}^{2},-\mathrm{SCH}_{2}-\right) \), \( 7.16 \sim 7.46 \mathrm{ppm} \) (\( 5 \mathrm{H} \), aromatic)에서 benzylthioether화된 물질로 확인 되었고, 다시 물질의 확실한 귀속을 위하여 Raney \( \mathrm{Ni} \)하에 탈황 반응을 거쳐 Sephadex LH-20으로 정제한 결과 B-3를 얻을 수 있었다. B-3의 \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR} \) 을 살펴본 결과 com-pound A의 \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR} \)과 일치하여 (+)-gallocatechin으로 동정 하였으며 B-2의 \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR} \) 도 (+)-gallocatechin의 signal과 일치하였다. 또한 compound B물질의 spectrum에서 상부에 해당하는 \( 4-\mathrm{H} \) 의 결합정수가 크므로 compound \( \mathrm{B} \) 는 상부에 \( (+) \)-gallocatechin, 하부에 (+)-gallocatechin이 \( 4 \mathrm{a}-8 \) 의 결합형태로 결합된 prodelphinidin B-3로 동정하였다. 이러한 결과는 안 등의 결과와 일치하였다.</p>
감나무잎 추출물의 추출 조건을 수립하기 위해 어떻게 하였나?
다양한 농도의 ethanol을 추출용매로 하여 phenol성 물질의 용출량을 측정하였다.