<h1>결과 및 고찰</h1><h2>생균제를 이용한 수삼의 배양</h2><p>Compound K 를 포함한 새로운 전환물질을 탐색하기 위하여 생균제로서 이용되고 있는 B. subtillis KCTC1666, A. oryzae KCTC6292, S. cerevisiae KCTC7919, L. plantarum KCTC3108, 및 L. acidophilus KCTC3155를 멸균된 수삼에 \( 10 \% \) 씩 각각 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 150 \mathrm{rpm} \) 으로 5 일간 배양하였다. 수삼 배양액을 MeOH로 추출, 건조하고 물에 현탁한 뒤, BuOH 로 재 추출 및 건조하여 MeOH에 녹여 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도의 시료로 만들어 대사산물의 변화를 TLC로 확인하였다.</p><p>새로운 전환물질을 확인하기 위하여 수삼배양물의 BuOH추출물에 대해 TLC를 실시한 결과, Fig. 1에서와 같이 A. oryzae KCTC6292로 배양한 분획물의 Rf치 0.9 부근에서 새로이 생성된 것으로 예상되는 성분변화를 확인할 수 있었으나, B. subtillis KCTC1666, L. acidophilus KCTC3155, L. plantarum KCTC3108 및 S. cerevisiae KCTC7919를 첨가하여 배양한 수삼에서는 전환물질을 확인할 수 없었다. \( 90 \%\) MeOH을 전개 용매로 한 RP-18 TLC 결과에서도 순상 TLC에서 확인된 물질로 추정되는 spot을 확인할 수 있었다(data not shown). 한편 수삼을 첨가하지 않고 A. oryzae KCTC6292의 종배양액만으로 배양한 분획물에서는 이러한 전환물질을 확인할 수 없었기 때문에 전환물질은 배양에 사용한 수삼에서 유래된 것으로 추정되었다.</p><h2>A. oryzae KCTC6292에 의한 수삼의 대량 배양</h2><p>Fig. 1에 나타난 Rf치 0.9의 대사산물의 생성 양상을 검토하기 위하여 수삼의 양과 배양 일자를 달리하여 실험하였다. 종배양액은 \( 10 \% \) A. oryzae KCTC6292로 고정하고 수삼의 양을 각각 \( 5 \%\), \(10 \%\), \(20 \% \) 로 하였으며, 배양 0,3,5,8,10일째 배양액 을 회수하였다. 그 결과, 전환물질이 3 일째부터 생성되기 시작하여 배양 후 5 8 일째에서 최대로 전환되었고 특히 \( 10 \% \) 수삼을 사용했을 때 최대로 생성되는 것을 확인하였다.</p><p>전환물질의 대량 생산 및 분리를 위하여 PDB에 6년근 수삼을 첨가하고 A. oryzae KCTC6292 종배양액을 \( 10 \% \) 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 140 \mathrm{rpm} \) 의 속도로 교반하면서 5 일간 배양하였다. A. oryzae KCTC6292의 접종 시 배양액의 pH는 4.91에서 2 일째 \( \mathrm{pH} 6.6\), 4일째는 \( \mathrm{pH} 6.96 \), 배양이 끝나는 5 일째 \( \mathrm{pH} \) 는 7.67로 상승하였다. 0,2,4,5 일째 배양액을 회수하여 MeOH로 추출하고 HPLC를 실시하였다. Fig. 3과 같이 표준물질로서 수삼의 protopanaxdiol ginsenoside인 Rb1은 24 분대에 확인이 되었고, Rb1에서 포도당이 1개 분해되어 제거된 Rg3 는 33 분대와 36 분대에서 확인할 수 있었다. 또한 Rb1에서 포도당이 2 개 분해되어 제거되거나 \( \mathrm{Rg} 3 \) 에서 포도당이 1개 분해되어 제거된 Rh2의 경우, 43.5분에 확인할 수 있었다. 한편 protopanaxatriol ginsenoside로서 포도당이 2 개 분해되어 제거된 compound K 의 경우, Rh2 와 유사하게 43.0분에서 peak를 보였다. 배양 날짜에 따른 배양액 내의 전환 물질의 양을 비교한 결과, compound K 로 추정되는 물질이배양 2 일부터 검출되기 시작하여 배양 기간에 따라 점점 증가하여 배양 5일째 최대로 생성되는 것을 확인하였다.</p><h2>전환물질의 분리 및 정제</h2><p>A. oryzae KCTC6292를 이용하여 얻은 배양액으로부터 compound K 를 포함한 새로운 전환물질을 분리하기 위하여 배양액을 \( 5,000 \mathrm{rpm} \) 으로 원심분리하고, 침전물은 \( 30 \mathrm{~L} \) 의 MeOH로 2 일간 추출하였다. 증류수에 현탁한 수삼의 MeOH 추출물을 ethylacetate (EtOAc)로 3회 추출하여 농축시킨 분획을 chloroform으로 충진한 silica gel column에서 chloroform과 methanol의 비율을 단계적으로 증가시키는 stepwise 용출법(\(\text{chloroform}: \text{methanol}=50:1 \rightarrow 10: 1 , \mathrm{v}/\mathrm{v}\))으로 전개하여 WG1, WG2, WG3를 분리하였다. 이 중 전환물질이 포함된 WG2를 선택하여 2차 silica gel column chromatography를 실시하였으며, 이 때 \(\text{chloroform}/ \mathrm{MeOH} / \text{water} (65 / 35 / 10, \text{lower phase})\)를 전개용매로 사용하여 WG2-1과 WG2-2의 분획을 분리하였다. WG2-2 분획물을 \( 80 \%\) \(\mathrm{MeOH} \) 을 전개용매로 \( \mathrm{RP}-18 \) column chromatography하여 WG2-2-2를 분리하였으며 HPLC (\( 3 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \), \( 70 \% \) acetonitrile ; 고정상, YMC C18 column, \( 20.0 \times 150 \mathrm{~mm} \); detector, PDA)를 이용하여 나머지 분획으로부터 WG2-2-1 을 분리하였다.</p><h2>전환물질의 동정</h2><p>A. oryzae KCTC6292에 의해 전환되어 분리된 WG2-2-1과 WG2-2-2는 HPLC, TLC 분석, UV 홉수 및 발색반응을 통해 ginsenoside 화합물로 추정되었다. WG2-2-1의 경우, 분리된 시료의 양이 기기분석에 충분하지 못하여 더 이상의 분석이 불가능하였으며 \( W G 2-2-2 \) 의 경우, compound K 와 동일한 것으로 예상되어 이를 확인하기 위하여 compound K 의 표준 물질과 분리한 WG2-2-2와 함께 LR-MS를 수행하여 분절된</p>
A. oryzae KCTC6292로 배양한 분획물의 Rf치가 얼마일때 새로이 생성되는가?
0.9 부근