<h1>재료 및 방법</h1><h2>지방기질줄기세포의 분리 및 배양</h2><p>지방조직으로부터 지방기질줄기세포롤 분리하기 위하여 성형외과에서 피하지방 제거 술을 시행한 환자로부터 동의하에 지방조직을 얻었다. 분리한 지방조직은 HBSS로 씻어준 후 지방조직을 얇게 자른 다음 0.075\(\%\) collagenase (Sigma) 를 첨가한 serum이 없는 \(\alpha\)-MEM배지로 현탁하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) \( \mathrm{CO} 2 \)농도의 조건 하에서30분간 처리하였다. 원심분리 후 pellet에 다음과 같은 2가지 조성의 배양용액을 각각 사용하여 기질 줄기세포를 배양하였다. Fibronectin (10 \( \mathrm{ng} / \mathrm{ml}\)) 이 coating된 배양용기에 \( 60 \% \) low-glucose DMEM (L-glutamine) (Life Technologies), 40\(\%\) F-12 Nutrient Mixture (Life Technologies), 1x insulin-transferrin-selenium (Sigma),\( 10^{-8} \) \( \mathrm{M} \) dexamethasone (Sigma), \( 100 \mathrm{U} \) penicillin \( / 1,000 \mathrm{U} \) streptomycin (Sigma), 10 \( \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) EGF (Daewoong 제약), ① \( 10 \% \) 소태아혈청로 이루어진 배양용액, ② \( 10 \% \) 인체혈청으로 이루어진 배양용액에서 배양하였다. 분리된 세포들을 dish에 plating해서 24시간 후 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 세포가 70-80\(\%\) 까지 자란 후 trypsin/EDTA를 처리하여 세포를 단일세포로 분리하고 이를 \( 2,000 / \mathrm{cm}^{2} \) 의 밀도로 깔아 계대배양하였다.</p><p>지방기질줄기세포의 동결시에는 먼저 세포를 떼어내서 \(20\%\) human serum이나 소 태아혈청을 포함한 세포배양배지 (DMEM-low glucose/F-12배지) 900 \( \mu \mathrm{l} \) 로 현탁시킨다. Freezing vial에 DMSO 100 \( \mu \mathrm{l} \) 를 넣고 현탁된 세포를 넣어 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 30분간 보관 후 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)로 옮겨 보관한다.</p><h2>지방기질줄기세포의 지방 및 골 세포로의 분화유도</h2><p>지방기질줄기세포의 지방 및 골세포로의 분화를 유도하기 위해서 지방세포유도 분화배지 (10\(\%\) 소 태아혈청 또는 인체 혈청, 1 \( \mu \mathrm{M} \) dexamethasone, 0.5 \( \mathrm{mM} \) 3-isobutyl-1-methylxanthine and 200 \(\mu\mathrm{M}\) indomethacin in \(\alpha\)-MEM) 및 골세포 유도 분화배지 (10\( \% \) 소 태아혈청 또는 인체혈청, 0.1 \(\mu\mathrm{M}\) dexamethasone, 10 \( \mathrm{mM} \) \(\beta\)-glycerophosphate, and 50 \(\mu\mathrm{M}\) ascorbic acid in \( \alpha\)-MEM)에서 각각 배양14일 동안 배양 하였으며, 배지는 3일에 한번씩 교환하였다. 분화된 지방세포는 세포표면에 축적된 lipid를 Oil Red O로 염색하고, 여기에 isopropyl alcohol을 처리한 후 510 \( \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. Oil Red O로의 염색과정은 분화배지를 제거한 후 4\(\%\)formaldehyde로 15분간 실온에서 고정시키고 HBSS 로 두 번 씻어준다. 2\(\%\) Oil Red O로 실온에서 1시간 염색한 후 HBSS로 깨끗하게 씻어주고 현미경에서 분화정도를 관찰하였다. 분화된 골세포는 alizarin red S로 염색한 후 Meta Morph 프로그램을 이용하여 전체 세포에서 분화된 세포의 퍼센트를 측정 수치화하여 정량하였다. Alizarin red S로의 염색과정은 분화배지를 제거한 후 70\(\%\) ethanol로 15분간 실온에서 고정시키고 증류수로 두 번 씻어주었다. Alizarin red S를 실온에서 10분 염색한 후 분화정도를 현미경하에서 관찰하였다.</p><h2>유세포분석</h2><p>소 태아혈청 및 인체혈청에서 배양한 인체지방기질줄기세포에서 표면항원의 발현이 변화하는지를 확인하기 위하여 유세포분석을 실시하였다. 유세포분석을 위하여 세포를 72시간 배양한 후 0.25\(\%\) trypsin/EDTA로 세포를 떼어낸 후 4\(\%\) formaldehyde로 30분간 고정시킨다. 고정된 세포는 flow cytometry buffer (FCB; \( 1 x \) PBS, 2\(\%\) FBS, 0.05\(\%\) sodium azide)로 씻어주고 \( 10^{6} \) 세포로 나눠 담은 뒤 CD29, CD44, CD117, HLA-DR 항체를 포함하는 flow cytometry buffer를 각각 처리하였다. 항체로 처리된 세포는 FACScan argon laser cytometer (Becton Dickson, San Jose, CA)를 이용하여 측정하였다.</p><h2>증식능의 측정</h2><p>인체지방기질줄기세포를 \( 2000 / \mathrm{cm}^{2} \)의 밀도로 깔아 3일 간격으로 계대배양 하면서 각 계대배양 시기마다 현미경에서 haematometer를 사용하여 세포 수를 측정하였다.</p><h2>CFU (colony forming unit, CFU) 측정</h2><p>세포 집락 형성(colony forming unit, CFU) 능력을 확인하기 위해서 인체지방기질줄기세포를 최종 \( 60 \mathrm{cells} / 10 \mathrm{~cm}^{2} \) plates로 세포배양기에서 10일간 배양한 후 도립현미경을 통하여 CFU를 측정하였다.</p><h2>혈청분리</h2><p>인체혈청분리를 위하여 채혈 후 응고된 혈액을 3000 \( \mathrm{rpm} \)에서 10 분 동안 원심분리 하여 혈청을 회수하였다. 혈청은 0.2 \( \mu \mathrm{m} \) 필터에서 여과하여 1 \(\mathrm{ml} \)씩 분주하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다. 열처리된 혈청을 얻기 위해 사용하기 전 56\( { }^{\circ} \mathrm{C} \) 수조에서 30 분간 불활성화 시킨 후 실험에 사용하였다.</p><h2>cDNA chip</h2><p>인체혈청 및 소 태아혈청에서 배양한 인체지방기질줄기세포의 유전자 분석을 위해서 total RNA는 RNeasy mini kit(QIAGEN, Inc., Valencia, CA)로 분리하고 Affymetrix(Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA )사의 protocol에 따라 유전자 칩U133A array로 유전자 발현을 비교, 분석하였다.</p><h2>통계분석</h2><p>각 실험군 간의 통계학적 차이는 Student's t-test를 이용하였으며, 통계학적으로 유의성이 있는 p 수치는 0.05미만으로 하였다.</p>
단일세포로 분리된 세포는 어떤 밀도로 계대배양했어?
\( 2,000 / \mathrm{cm}^{2} \)