<h1>고 찰</h1><p>DGES는 DNA 다양성의 특징을 이용하여 유전자 변이를 비교적 빠른 검색으로 쉽게 판별하는 방법으로 알려져 있는데, 그밖에 RAPD, RFLP 방법과 함께 이용될 수도 있다. RFLP는 DNA 제한효소 염기서열에 변이가 생겼을 때 효과적으로 사용할 수 있지만, DGES는 모든 염기서열의 변이에 대해 광범위한 loci를 동시에 검색할 수 있다. 한편, RAPD는 개체의 염기서열이 알려져있지 않더라도 특정 유전자에 한정하지 않고 간단히 random 프라이머를 이용한 PCR 산물의 변화를 관찰함으로써 유전자 다양성을 예측한다. 특히 DEGS는 RAPD보다 재연성이 높은 특이한 degenerating DNA밴드를 얻을 수 있으므로 보다 적은 비용과 시간으로 정확한 DNA 다양성을 관찰할 수 있다.</p><p>본 실험에서 이용한 DGES 방법은 TDGS 방법을 응용한 것으로, 여러 쌍의 프라이머들을 이용하여 multiplex PCR을 하는데 mitochondria DNA와 같은 커다란 유전자를 동시에 검색할 수 있다. 일반적으로 TDGS는 \( 5 \sim 10 \)개 정도의 multiplex PCR 산물을 수평 방향으로 전기영동을 실시한 다음 다시 DNA 크기별로 구분하기 위해 2차 수직 방향의 denature and gradient gel을 전기영동하여 각각의 단일 가닥의 DNA (ssDNA)의 다양성을 구별할 수 있는 방법이다. 본 연구에서는 Ham 등(2002)이 이용한 방법으로 TDGS 장치에서 특이적 DNA 다양성을 관찰하기 위한 것으로 4개 지역의 3개 샘플로 총 12개의 샘플을 하나의 gel에 동시에 진행시켜 넙치 유전자에 존재하는 이형다양성을 관찰하였다. 본 실험도 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)의 TEA 완충액 내에서 deionided formamidc가 포함되어 있는 acrylamide gel을 이용하여 DNA melting과 denature가 이루어지게 되는데, 이를 효과적으로 실행하기 위하여, PCR에 사용되는 프라이머 5' 쪽에 GGGCCC의 염기를 첨가하여 DNA melting 속도를 조절하여 단일한 ssDNA에서 전이가 생긴 경우에 DNA melting 후, single strand conformation polymorphism으로 다른 지역의 샘플과 DNA 변이가 나타나므로 그 변이를 관찰할 수 있었다. 우선 각각의 DNA 영역을 개별적으로 PCR 한 후, 그 산물로 각각 DGES를 실시하였으나, 이 경우 이형다양성으로 판별하기 위해서 보다 많은 시간이 소요될 수 있으므로 본 실험에서는 우선 넙치의 ND-4와 cytochrome b 염기서열에서(AB028664, 38-1371) 5개 영역(ND4-1, 2,3) PCR 산물을 한번에 DGES를 실시하여 밴드의 차이가 있는지를 먼저 알아 보았으며, 연이어서 DNA 염기서열을 확인함으로써 정확한 DNA 다양성을 판별할 수 있었다. 결과적으로 지역간 개체의 유전자 변이가 넙치의 ND-4 유전자에서는 ND-4-2와 ND-4-3 영역에서 집중적으로 관찰되었으며, 넙치의 cytochrome b 유전자에서는 지역간 개체의 유전자 변이가 발견되지 않았다.</p><p>넙치의 ND-4-2 영역의 유전자 변이는 먼저 DGES 검색으로 파악되었는데 거제의 양식산 넙치의 ND-4-2 DNA는 degenerating gel에서 전기영동의 이동 거리 변화를 보이지 않았으나 주문진 근해의 동해산 넙치, 통영의 양식산 넙치, 그리고 북한 해역의 동해산 넙치들에서는 모두 특이한 degenerating DNA band를 보였으며, 이들 DNA를 염기서열 분석한 결과 G390A, C402T, 그리고 A411G의 유전자 변이를 확인하였다. 특히 넙치의 ND-4-3에서는 매우 빈번한 유전자 변이가 발견되었는데, 우선 DGES 검색에서 매우 다양한 크기의 degenerating DNA band가 관찰되었고 이들 DNA들을 각각 염기서열 분석한 결과 ND-4-3 DNA 영역에서 C515G, C537T, C538T, A567G, G714A, C736T, G756A, A759T, T817C, 그리고 T829G 등의 빈번한 DNA 변이가 확인되었다. 반면에 본 연구에서 조사한 4 군데의 지역에서 얻은 넙치들은 ND-4-1, ND-4-4, 그리고 ND-4-5 영역에서 DNA 변이가 발견되지 않았으며, 넙치의 cytochrome b 유전자를 5 영역으로 나누어 조사하였으나 DGES와 DNA 염기서열 분석에서 모두 DNA 변이가 발견되지 않았다. 따라서 넙치의 유전자 다양성을 이용하여 넙치 원산지를 판정하기 위해서는 ND-4-2와 ND-4-3 영역을 검사하는 것이 적절하며, 본 연구에 사용된 넙치는 우리나라 해안의 4 군데(주문진 해역, 통영과 거제의 양식장, 북한의 동해안)에서 얻어진 넙치로서 ND4-2와 ND-4-3를 제외한 유전자 영역에서는 모두 일치되는 염기서열을 보였으므로 개체간 연관성이 매우 높은 것으로 추정된다. 결과적으로 넙치의 ND-4-2와 ND-4-3 영역은 유전적으로 개체간 유전자 변이가 쉽게 발생되어 질 수 있는 영역으로 추측된다.</p><p>유전자 변이를 검색하는 방법으로 결국에는 DNA 염기서열 분석을 통하여 확인하는 것이 가장 정확하고 확실한 방법이기는 하지만 염기서열 분석을 위한 시간과 경비가 많이 소요되어서 특정한 유전자의 위치(loci)를 모르는 경우에는 염기서열 분석을 시도하기 어려운 실정이다. 따라서 여러 종류의 유전자와 커다란 유전자를 신속하게 검색하기 위해서는 DGES와 같은 방법이 유용한데, 본 연구에서 얻은 결과를 자세히 분석하자면 DGES가 DNA 변이의 가능성을 예측할 수는 있지만 아직도 DGES의 degenerating DNA band 변화만을 보고 DNA 변이가 발생하였는가 정확하게 판정하기는 어려우며, 특히 여러 개의 DNA 변이가 생겼을 때는 몇 개의 DNA 변이가 발생하였는지를 예측할 수가 없다. 그러므로 DGES 방법은 유전자 변이를 쉽게 예측하는 방편으로 사용될 수 있으나 유전자 변이를 확인하기 위해서는 반드시 DNA 염기서열을 확인해야 할 것이다.</p><p>본 연구에서 사용된 DGES 방법은 비록 원래의 TDGS (two dimensional gel electrophoresis scanning) 방법을 개체 간 DNA 검색에 맞게 고안한 것이며 DGES를 위하여 urea, formamide 등의 농도와 gradient gel의 농도, 그리고 PCR 프라이머 DNA의 고안 등에 대한 조건을 맞추기 위하여 반복적인 연구를 수행하여 최적의 상태를 얻었으나 아직도 degenerating DNA melting이 동일한 재연성으로 완전하게 구별되는 DNA band를 확인하기 위하여는 향후 보다 심도있는 연구가 더 필요할 것으로 여겨진다. 아울러 이러한 연구기법의 개선은 해양생물은 물론 다른 종류의 개체들에서 genomic 또는 mitochondria DNA를 사용하여 각각의 원산지 판정하는 방법을 개발하는데 중요한 도움이 될 것이다.</p>
DNA의 다양성 특징을 이용하여 유전자 변이를 확인하기 위한 방법을 이용되는 DGES는 무엇을 동시에 검색할 수 있을까?
광범위한 loci