<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료 및 시료의 전처리</h2><p>2003년 4월부터 10월까지 부산 및 경남일대의 횟집, 재래시장 등의 소규모제조업소와 백화점, 할인점 등의 대규모 업소에서 생선회, 패류 등의 횟감 118건, 김밥, 햄버거, 샌드위치 등의 도시락류 82건 및 기타 즉석조리식품 40건 둥 총 240건을 구입하여 시료로 사용하였다. 포장된 경우를 제외한 모든 시료들은 sterile sampling bag을 사용하여 채취하였고, 얼음을 채운 ice box에 보관하여 실험실로 운반하였으며, 도착 즉시 실험에 사용하였다.</p><p>표준균주로는 Bacillus cereus KCCM 40935, B. cereus KCTC 1661, B. cereus KCTC 1092, B. cereus KCTC 3062, Bacillus thuringiensis KCCM 41613 및 Bacillus mycoides KCCM 41606을 사용하였다.</p><h2>B. cereus의 분리 및 동정</h2><p>시료 \( 25 \mathrm{g} \)을 멸균된 stomacher bag에 취하고 멸균생리식염수 \( 225 \mathrm{ml} \)를 가한 후 균질화시켜 시험용액으로 사용하였다.</p><p>시헙용액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 \( 100 \mathrm{IU} / \mathrm{ml} \)의 polymyxin B를 첨가한 Tryptic soy broth (TSB) 배지(BD, USA)에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 증균 배양한 후, Mannitol egg yolk polymyxin (MYP) agar (Oxoid, England)에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하였다. MYP Agar에서 혼탁한 환을 갖는 분훙색의 전형적인 집락둘을 선별하여 혈액한천배지(아산제약, Korea)에 이식하였고, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양 후 그람염색을 실시하여 그람양성의 긴 간균으로, oxidase 음성 및 \( \beta \)-용혈성을 보이며 rhizoid growth를 보이지 않는 균주들을 분리하였다.</p><p>각 시료들로부터 분리된 분리균은 61개의 생화학적 시험들을 통해서 동정되었으며, data는 APILAB Plus software V3.3.3 (bioMěrieux, Marcy l'Etoile, France)로서 처리되었다. API 50 CHB를 사용하여 49개의 당발효능을 조사하였고, API 20E를 사용하여 12가지의 생화학적 시험(ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT, H2S, URE, TDA, IND, VP, GEL and NIT)을 행하였으며, 실험은 제조사의 지시에 따라 실험하였다.</p><p>혈액한천배지에 배양함으로써 rhizoid growth 및 \( \beta \)-he-molysis 유-무를 확인하였으며, oxidase test는 filter paper 상에서 oxidase reagent (bioMrrieux)를 사용하여 조사하였으며, 운동성을 알아보기 위하여 \( 0.1 \% \) beef extract를 첨가한 motility test medium (Difco, U.S.A.)를 사용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간동안 배양하면서 관찰하였다.</p><p>최종 동정된 균주들은 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하여 사용하였다.</p><h2>Diarrhoeal enterotoxin 생성</h2><p>설사형 장독소의 생성유무는 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 24 \) 시간동안 Brain Heart Infusion broth (Oxoid, England)에서 배양한 배양액을 원심 분리 \( (10,000 \mathrm{rpm}, 20 \mathrm{~min}) \)하여 균체를 제거한 배양상등액을 대상으로 B. cereus enterotoxin reverse passive latex agglutination (BCET-RPLA) test kit (Oxoid)를 사용하여 조사하였으며, 실험방법은 제조사의 지시에 따랐다.</p><h2>항생제 감수성</h2><p>B. cereus로 확인 동정 된 36균주를 디스크법에 따라 항생제 감수성검사를 실시하였다. Mueller-Hinton broth (Difco)에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양시킨 균을 멸균된 액체배지로 희석하여 표준탁도액(McFarland No. 0.5)의 농도와 같도록 한 후, 멸균된 면봉을 이용하여 Mueller-Hinton agar (Difco)에 균등하게 도말하였다. 곧이어 항생제 감수성 실험용 disc (Oxoid) 들을 배지위에 놓고 가볍게 밀착시킨 후, \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 18시간동안 배양한 후 저지환을 측정하였다. 이번 연구에 사용한 항생제는 ampicillin \( (10 \mu \mathrm{g}) \), bacitracin \( (10 \mathrm{~units}) \), chloramphenicol \( (30 \mu \mathrm{g}) \), erythromycin \( (15 \mu \mathrm{g}) \), gen-tamicin \( (10 \mu \mathrm{g}) \), kanamycin \( (30 \mu \mathrm{g}) \), penicillin \( G \) \( (10 \mathrm{~units}) \), rifampicin \( (5 \mu \mathrm{g}) \), streptomycin \( (10 \mu \mathrm{g}) \), tetracycline \( (30 \mu \mathrm{g}) \) 및 vancomycin \( (30 \mu \mathrm{g}) \) 이며, 결과의 판독은 National Com-mittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)법에 준하였다.</p><h2>온도-시간에 따른 생육특성 분석</h2><p>온도 및 시간에 따른 생육특성의 분석을 위해 표준균주인 B. cereus KCCM 40935와 분리균인 18PE (독소생성균) 및 228SF (독소비생성균)의 3균주률 선정하여 각각 TSB에서 하룻밤동안 전 배양한 후 배양액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 \( 10 \mathrm{ml} \) TSB에 접종하여 각 온도별 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}, 10^{\circ} \mathrm{C}, 20^{\circ} \mathrm{C}\right. \) 및 \( \left.30^{\circ} \mathrm{C}\right) \)로 보관하면서 시간별 (4시간 후, 7시간 후, 24시간 후)로 균수를 측정하였다. 균수의 측정은 멸균생리식염수를 사용하여 단계별로 희석한 액을 pour plate method로서 MYP agar에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 24~48시간 배양하여 혼탁한 환을 가지는 분홍색의 전형적인 집락의 수를 측정하였다.</p>
위 실험은 어느지역의 횟집, 재래시장 등의 소규모제조업소와 대규모 업소에서 횟감, 도시락류 및 즉석조리식품을 시료로 사용하였는가?
부산 및 경남일대