<h1>재료 및 방법</h1><h2>수삼 재료 및 사용 균주</h2><p>실험 재료인 6년근 수삼은 부전시장 인삼상가에서 구입하여 사용하였다. 대조군으로 사용된 compound K(IH901, \( \mathrm{Rh} 2\), \(\mathrm{Rb} 1\), \(\mathrm{Rg} 3 \) 는 경희대학교 야학대학 김*현 교수님으로부터 제공 받아 실험에 사용하였다. 실험에 사용한 생균제는 Aspergillus oryzae KCTC6292, Bacillus subtillis KCTC1666, Lactobacillus acidophilus KCTC3155, Lactobacillus plantarum KCTC3108, Saccharomyces cerevisiae KCTC7919는 한국 생명공학연구원(KRIBB)으로부터 분양 받아 사용하였다.</p><h2>생균제를 이용한 수삼의 발효</h2><p>\( 10 \% \) 수삼을 멸균하여 생균제인 A. oryzae KCTC6292, B. subtillis KCTC1666, L. acidophilus KCTC3155, L. plantarum KCTC3108, S. cerevisiae KCTC7919를 \( 10 \% \) 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 150 \mathrm{rpm} \) 으로 5 일간 진탕배양 한 다음; 각 배양액을 분석하여 수삼의 전환 활성이 가장 높은 A. oryzae 를 선별하였다. A. oryzae 를 이용하여 대량 배양하기 위해, 수삼 \( 3 \mathrm{~kg} \) 을 homogenizer로 분쇄하여 \( 30 \mathrm{~L} \) potato dextrose broth (PDB; Difco, USA)와 함께 멸균한 후, 종배양한 A. oryzae를 \( 10 \% \) 접종하여 \( 50 \mathrm{~L} \) 발효조(Biotron, Korea)에 넣고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(140 \mathrm{rpm} \) 으로 5 일간 배양하였다. 배양기간 동안 \( 0.5 \mathrm{~g} \) 의 소포제 (LS-303, Dow-corning, Korea)를 2 회 첨가하여 saponin에 의해 생성되는 배양액의 기포를 제거하였다.</p><h2>전환산물의 분석</h2><p>전환된 배양물질을 확인하기 위하여 시료를 silica gel (\( 60 \mathrm{~F}_{254} \), Merck, Darmstadt, Germany) thin layer chromatography (TLC)하였다. 전개용매로 chloroform/methanol/ water \( (4 / 2 / 1, \mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 아래층을 사용하여 전개한 후, anisaldehyde sulfuric acid로 분무하고 \( 110^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 약 10 분간 가온하여 발색하였다. 본 실험에 사용된 high performance liquid chromatography (HPLC)는 SCL-10A controller, SPD-M10A UV spectrophotometric detector, LC-10AT liquid chromatograph, FCV-10AL, DGU-14A (Shimadzu Scientific Co., Japan)로 구성되었다. 시료의 농도를 \(1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 로 맞추어 \(5 \mu \mathrm{l}\)씩 주입하였으며, 이동상으로 0-5 분에 는 \(30\%\) \(\mathrm{CH}_{3} \mathrm{CN}\), 5-40분에는 \(30\sim 80\%\) \(\mathrm{CH}_{3} \mathrm{CN}\), 40-50분에는 \( 80 \%\) \(\mathrm{CH}_{3} \mathrm{CN} \) 으로하여 유속 \( 0.5 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \), 고정상으로는 YMC-PACK C18 ( \( 6.0 \times 150 \mathrm{~mm} \)) column(YMC Co., Japan)을 사용하였다.</p><h2>전환산물의 분리</h2><p>수삼의 배양물로부터 유용물질로 전환되었거나 신규 가능성이 있는 전환물질을 분리하기 위하여 먼저 발효산물과 전환산물을 methanol MeOH로 추출하고 상등액만을 농축하여 buthanol BuOH 추출을 하였다. BuOH 추출물의 산, 알카리 안정성, 수지에 대한 흡착성, 용매 이행성을 조사하여 정제하기 위하여 Diaion HP-20 흡착 chromatography, silica gel TLC와 column chromatography, Sephadex LH-20 column chromatography, reverse phase (RP-18) column chromatography 그리고 HPLC를 통해 활성물질을 분리 및 정제하였다.</p><h2>전환산물의 세포독성</h2><p>실험에 사용된 세포주로는 PC- 3 cell (\( 1 \times 10^{4} \text{cells}/ 250 \mu \mathrm{l} /\text{well}\))을 \( 5 \%} \mathrm{CO}_{2} \) 가 포함된 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 12 시간 배양한 후, 측정시료를 처리하고 다시 48 시간 동안 배양하였다. MTT 용액을 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 배양세포에 첨가한 후, \(3 7^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 시간 동안 반응하고 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 처리하여 20 분간 shaking한 뒤, ELISA reader (VERSA, USA)를 사용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도를 측정하였다.</p>
어디에서 생균제를 분양 받아 실험에 사용하였지?
한국 생명공학연구원