<h1>재료 및 방법</h1><h2>효소, 시약 및 세포주</h2><p>실험에 사용한 황금은 전남 여수 율촌산으로 여수시 동인당 한약국에서 구입 하여 사용하였다. 시약은 1 급 및 특급시약으로 \( \mathrm{HPLC} \) 분석과 관련하여 acetonitrile을, 항산화환성 측정을 위한 DPPH (a, \( \alpha^{\prime} \)-diphenyl- \( \beta \)-picrylhydrazyl)와 L-ascorbic acid를 Sigma Inc. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 항암활성 측정에 관련하여 인간간암 (HepG2), 후두암 (HeLa), 위암 (SNU 601)세포는 서울대병원에서 분양받았으며, 폐암세포 (CCL-185)는 ATCC에서, 멜라닌 생성저해와 관련하여 human melanoma cell (HTB 67)을 ATCC에서 분양받아 사용하였다. ACE 저해활성 측정용 시약으로는 Angiotensin Converting Enzyme (ACE, peptidyldipeptide hydrolase, EC 3.4.15.1), Hippuryl-His-Leu 등은 Sigma Inc. (USA)에서 구입하여 사용하였다.</p><h2>시료추출</h2><p>열처리 전후 물질의 변화와 기능성을 살펴보기 위하여 황금을 분말로 만든 후 상온수 추출을 하였다. 황금 분말 \( 10 \mathrm{~g} \)에 증류수 \( 150 \mathrm{ml} \) 율 넣고 하루 동안 침출한 후 Whatman NO. 4 여과지로 여과하여 여과액을 동결 건조하여 열처리 전 시료로서 보관하였다(CW). 이 때 수율은 \( 5.7 \% \) 로서 일반 열수 추출법과 메탄올 추출 보다 낮은 농도이나 본 실헙의 목적인 열처리 전의 시료로는 충분한 양이었다. 이 열처리 하지 않은 건조시료 \( (\mathrm{CW}) \) 를 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 으로 용해한 후, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2 시간, \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간, \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 가열하여 열처리한 시료(CHW)를 준비하였다.</p><h2>\( \mathrm{HPLC} \) 분석방법</h2><p>황금을 상온수로 추출한 후 건조된 시료를 증류수로 녹여 열처리하여 HPLC 분석을 통한 열처리 전후의 Peak 분석과 생리환성열 검토하였다. 주요변화를 생리환성 기준으로 판별한 후 HPLC로 상이접을 분석하고 기존의 황금 주요성분과 비교 판변하였다. HPLC는 Shimadzu \( 10 \mathrm{~A} \) 를 사용하였고, col-umn은 Shim-pack CLC-ODS \( (\mathrm{M}, 250 \times 4.6 \mathrm{~mm}) \), Detector는 UV/VIS (228 nm), flow rate는 \( 1 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 이었고, 이동상은 ace-tonitrile 과 \( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}(\mathrm{pH} 4.3) \) 의 비율을 \( 15: 85 \) 로 하였다. 그리고, oven 온도는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \), injection volume은 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 이었다.</p><h2>항산화 할성(수소 공여능) 측정</h2><p>\( \mathrm{DPPH} \) 는 안정한 free radical로 cystein, glutathion, 함황아미노산, ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy aromatic compounds, aromatic amine 등에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되어 수소 공여제, 또는 유리기 소거 작용의 항산화 활성을 측정하는데 널리 이용된다. 따라서 본 연구에서는\( \alpha, a^{\prime} \)-diphenyl- \( \beta \)-picrylhydrazyl (DPPH) \( 16 \mathrm{mg} \) 을 \( 100 \mathrm{ml} \) 에탄올에 녹인 후 \( 100 \mathrm{ml} \) 중류수를 흔합하여 Whatmann filter paper No.2로 여과하였다. 이 여액 \( 5 \mathrm{ml} \) 에 조제된 시료 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 혼합한 후 \( 528 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도의 감소를 측정하였다. 대조군은 L-ascorbic acid \( (0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 를 사용하였다.</p><h2>항고혈압 활성(ACE 저해활성) 측정</h2><p>\( \mathrm{ACE} \) 저해활성의 측정은 Cushman과 Cheung의 방법을 변형하여 측정하였다. ACE (Angiotensin Converting Enzyme, peptidyldipeptide hydrolase, EC3.4.15.1) \( 0.38 \mathrm{mg} \)을 \( 300 \mathrm{mM} \) Sodium chloride롤 포함한 \( 50 \mathrm{mM} \) HEPES HCI Buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.3) \( 3 \mathrm{ml} \) 에 용해시켰으며, 기질인 Hippuryl-His-Leu (HHL)은 \( 300 \mathrm{mM} \) Sodium chloride를 포합한 \( 50 \mathrm{mM} \) HEPES HClBuffer ( \( \mathrm{pH} \) 8.3)에 용해시켜 \( 0.3 \% \) 의 \( \mathrm{HHL} \) 기질용액을 만들었다. 황금추출물 시료는 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}, 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \), \( 2.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}, 5.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 로 제조하여 시료 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 에 \( 0.3 \%-\mathrm{HHL} \) 기질용액 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 preincubation 시켰다. 반응액에 \( \mathrm{ACE} \) 용핵 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15분 반응시켰다. 반응이 끝나면 \( 1 \mathrm{M} \mathrm{HCl} 250 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 반응을 정지 시키고 ethyl acetate \( 2,000 \mu \mathrm{l} \) 를 가하여 60 초간 강하게 shake한 다음 \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 예서 2분간 원심분리 시켜 상징액 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 취하였다. 이 상징앵을 \( 140^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 건조 후 3차 중류수 \( 3 \mathrm{ml} \) 을 용해시켜 \( 228 \mathrm{~nm} \) 에서 홉광도를 측정한 후 계산식 \{Inhibiting ratio(\%) \( =\left(\mathrm{C}-5 / \mathrm{C}-S^{\prime}\right) \times 100 \) 이에 따라 \( \mathrm{ACE} \) 저해율을 나타내었다. 앞의 식에서 S는 Sample의 흡광도이고, \( \mathrm{C} \) 는 Control(sample 대신 중류수를 넣은 군)의 흡광도이며, \( S^{\prime} \) 는 Sample 대조군 \( (\mathrm{HCl} \) 에 의한 반옹 정지 후 효소를 넣은 군)외 흡광도를 나타낸 것이다.</p>
실험에 활용된 황금을 구매한 곳은 어디인가?
동인당 한약국