<h2>Western blot</h2><p>단백질을 추출하기 위하여 cell lysis buffer ( \( 50 \mathrm{mM} \) Tris, pH 7.5, \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 1 \% \) Triton \( X-100 \), and complete pro-tease inhibitor cocktail)를 처리하여 세포를 얻어낸 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 13,000 \mathrm{rpm} \) 으로 15 분간 원심분리 하였다. 분리된 단백질을 얻어낸 뒤 Bradford protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, \( \mathrm{CA}) \) 를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 정량 된 \( 60 \mathrm{\mu g} \) 의 단벽질을 \( 10 \% \) SDS-PAGE gel에서 \( 150 \mathrm{~V} \) 로 1 시간 동안 전기 영동 한 뒤, PVDF membrane으로 옮겨주었다(12 V, 1 시간). 그 후, Ponceau \( \mathrm{S} \) 로 모든 lane의 동량의 단백질을 확인한 후 각각의 membrane을 5% skim milk로 1 시간 blocking 한 뒤 \( 0.1 \% \) TBST로 5 분씩 3 번 씻어내었다. 다음으로 SOCS-3 (polyclonal rabbit antibody, 1:1,000) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 그리고 a-tubulin (monoclonal mouse antibody, 1:2,500) (Calbiochem, Gibbstown, NJ) 1차 항체를 \( 5 \% \) bovine serum albumin(BSA) 에 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 시간 반웅시켰다. 1 차 항체 반응이 끝난 뒤, \( 0.1 \% \) TBST로 5 분씩 3 번 씻어낸 뒤 2차 항체 (anti-rabbit or mouse IgG horse-radish peroxidase-linked secondary antibody, 1:5,000) (Cell signaling, Beverley, MA) 를 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반웅이 끝난 후 위와 동일한 방법으로 씻어낸 뒤, enhanced chemiluminescent (ECL) (GE Healthcare UK Ltd., Little Chalfont, UK) 용액을\( 1: 1 \) 비율로 섞어 1 분 동안 반응 시켜 LAS-3000 imaging sys-tem (Fuii Film, Tokyo, Japan)으로 단백질 발현양을 확인하였다. SOCS-3 단백질 발현양은 a-tubulin의 단백질 양으로 보정하여 densitometry (Scion image)로 수치화 하였다.</p><h2>RNA 추출 및 \( \mathrm{cDNA} \) 합성</h2><p>RNA추출은 TRIzol 용액(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)을 이용한 phenol-chloroform 기법을 사용하였다. TRIzol 용액을 well당 각각 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 넣고, 200 \(\mathrm{\mu l} \)의 chloro- form을 처리하여 섞어준 뒤 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 13,000 \mathrm{rpm} \) 에서 15 분간 원심분리를 하였다. 상충액을 분리하여 isoprophanol과 \( 1: 1 \) 비율로 섞어준 뒤, \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리를 하였다. 생성된 pellet을 \( \mathrm{DEPC} \) 로 희석한 \( 75 \% \mathrm{ETOH} \) 에 씻어내고, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 5 분간 원심분리를 하였다. 최종 추출된 pellet 을 상온에서 10 분간 건조시킨 뒤 ultra pure water 30 pl에 녹인 후, UV 홉광도 \( 260 \mathrm{~nm} \) 에서 농도를 측정하였다. \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{\mu l} \) 의 RNA를 \( 5 \times \) buffer \( 4 \mu \mathrm{ll} \), random primer \( 2 \mu \mathrm{l}, 2.5 \mathrm{mM} \) dNTP 2 \( \mathrm{\mu l} \), Rnase inhibitor \( 0.5 \) \( \mathrm{\mu l} \), 그리고 reverse transcriptase \( 0.25 \) pl (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)와 혼합하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분, \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60 분, 그리고 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 \( \mathrm{PCR} \) 을 이용해 CDNA를 합성하였다.</p>
cell lysis buffer를 구성하는 Tris의 농도는 몇인가?
\( 50 \mathrm{mM} \)