<h1>결과 및 고찰</h1><h2>alcA 유전자가 결손된 재조합 suicide plasmid 구축을 위한 subcloning</h2><p>B. bronchiseptica의 alcaligin siderphore 생합성에 관여하는 효소인 ornithine decarboxylase 유전자의 결손 돌연변이주를 활용한 연구에서 alcaligin 생합성의 필수 전구체로 putrescine이 관여한다는 사실은 이미 밝혀져 있다. 이에 alcA 유전자를 결손시키기 위해 먼저 alcaligin 생합성에 관여하는 5 개의 유전자를 함유하는 alc operon을 가지는 pCP1.11 플라스미드 DNA를 주형가닥으로 해서 primer sF와 aR을 이용해서 pHS1의 구축을 위한 실험을 실시하였다. PCR 법으로 얻어진 \( 0.6 \mathrm{~kb} \) alcA 5'-flanking DNA와 pGEM-T easy vector을 ligation시킨 후 E. coli 숙주에 형질전환시켰다. 분리한 플라스미드 DNA를 제한효소 KpnI, KpnI / BamHI을 처리하였을 때 \( 3.6 \mathrm{~kb} \) 및 \( 3.0 \mathrm{~kb} / 0.6 \mathrm{~kb} \) 의 DNA 크기를 확인함으로서 cloning 산물을 확인할 수 있었다(data not shown). pCP1.11 플라스미드 DNA를 주형가닥으로 해서 primer s1F와 a1R을 이용해서 \( 0.7 \mathrm{~kb} \) 의 alcA 3'-flanking DNA를 증폭하였다. 5'-flanking DNA를 함유하고 있는 pHS1 DNA vector에 primer s1F와 a1R을 사용하여 PCR을 통해 획득한 \( 0.7 \mathrm{~kb}\) 3'-flanking DNA를 각각 제한효소 BamHI/Sacl으로 처리하여 ligation시켜 재조합 플라스미드 pHS2를 구축하였다. 플라스미드 pHS2 DNA를 제한효소 SacI, SacI/BamHI을 처리하였을 때 \( 4.3 \mathrm{~kb} \) 와 \( 3.0 \) \( \mathrm{kb} / 1.3 \mathrm{~kb} \) 의 DNA 크기를 확인함으로서 원하는 형태의 재조합 DNA가 구축되었음을 확인할 수 있었다(data not shown).</p><h2>alcA 유전자의 결손돌연변이주 구축</h2><p>alcA의 5'-과 3'-flanking DNA가 연결되어 alcA 유전자가 결손된 재조합 DNA를 함유하고 있는pHS2로부터 이 DNA fragment를 suicide vector pDMS197로 옮기는 실험을 하였다. pHS2에 제한효소 KpnI / SacI 을 처리하여 원하는 재조합 DNA fragment를 잘라내고 동일 제한효소로 처리된 pDMS197과 ligation한 후 \( \mathrm{CaCl}_{2} \) 방법으로 DAP 요구주인 E. coli \(\chi\)7213에 형질전환하여 alcA 유전자 결손을 위한 재조합 suicide 플라스미드를 제작하였다. 목적 재조합 suicide 플라스미드를 제한효소 KpnI, KpnI/SacI의 처리와 PCR로서 해당 유전자의 크기를 \( 6.9 \mathrm{~kb}, 5.6 \mathrm{~kb} / 1.3 \mathrm{~kb} \) 그리고 \( 1.3 \mathrm{~kb} \) 로 확인하였다(data not shown). 생성된 재조합 suicide 플라스미드를 pDM1으로 명명하였다.</p><p>B. bronchiseptica와 E. coli \(\chi\)7213/pDM1을 \(4:1\)의 비율로서 혼합하여 DAP을 함유한 LB 평판배지상에서 pDM1 plasmid DNA를 접합에 의해 B. bronchiseptica로 전달하였다. 데트라사이클린이 첨가된 LB 고체평판배지상에서 single crossover가 이루어진 균을 일차적으로 선택한 후 double crossover가 일어나서 alcA 유전자가 결손된 mutant을 구축하기 위해 다음 과정을 진행하였다. 일차적으로 선택된 colony를 LB 액체배지에서 2일간 배양하고, \(5\%\) sucrose와 Tet이 첨가된 LB 고체한천배지상에서 tooth picking하여 counter-selection을 실시하였다. \( 5 \% \) sucrose 배지에서만 성장하는 colony를 염색체 DNA를 분리하여 PCR 방법으로 확인한 후 alcA 유전자가 결손된 돌연변이주를 B. bronchiseptica H1 이라고 명명하였다. alcA 유전자가 결손된 돌연변이주와 야생형에 대해서 CAS 배지상의 alcaligin siderophore의 활성을 비교하였다. B. bronchiseptica H1은 B. bronchiseptica의 야생형과 비교하였을 때 현저히 낮은 alcaligin siderophore의 활성을 나타내었다. 이상의 유전적, 생화학적 실험결과를 통하여 alcA 유전자가 결손된 돌연변이주를 확인하였으며 B. bronchiseptica H1이라 명명하였다.</p><h2>alcA 유전자의 complementation assay</h2><p>alcA가 결손된 돌연변이주인 Bordetella bronchiseptica H1의 alcA 유전자의 complementation assay을 위해 pCP1.11의 DNA에서 alcA 유전자의 promoter 부위를 포함한 alcA 유전자를 증폭하기 위한 primer로 primer-F와 primer-R을 합성하였다. pCP1.11 플라스미드 DNA를 template로 하여 promoter를 포함한 alcA 유전자를 증폭시킨 후 pRK 415 벡터에 DNA 단편을 ligation시킨 후 E.coli에 형질전환시켰다. alcA가 재조합된 플라스미드는 alcA 유전자가 결손된 돌연변이주인 B. bronchiseptica H1에 electroporation법으로 형질전환되었다. alcA 유전자의 활성이 complementation 되었는지 CAS 배지에서 확인하였다. Fig. 5에서 나타나는 바와 같이 alcA 유전자가 결손된 B. bronchiseptica H1은 낮은 alcaligin siderophore의 활성을 보인 반면, 야생형과 alcA 유전자의 complementation이 이루어진 B. bronchiseptica H1/pCalcA은 높은 활성을 보였다. 그러나 B. bronchiseptica H1/pCalcA이 야생형에 비교하여 약간 불완전하게 활성의 회복을 보였는데 그 이유는 명확하게 알 수가 없었다.</p><p>이상의 결과를 종합하면 alcA 유전자는 B. bronchiseptica의 alcaligin siderophore 생합성에 직접적으로 관여한다는 것을 알 수 있었으며, 본 연구에서 구축된 B. bronchiseptica 돌연변이주나 pCalcA 플라스미드는 앞으로 진행 될 AlcA 단백질의 생화학적인 기능 분석에 유용하게 사용될 것으로 사료된다.</p>
alcaligin 생합성의 필수 전구체로 관여하는 것은 뭐야?
putrescine