<h1>재료 및 방법</h1><h2>암세포배양 및 HDAC 억제제 TSA의 처리</h2><p>본 연구에 사용된 A549 인체 폐암세포는 한국생명공학연구소에서 분주 받아 사용하였으며, \( 90 \% \) 의 RPMI- 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 \( 10\%\) fetal bovine serum (FBS), \( 1\%\)의 penicillin 및 streptomycin (Biofluids, Rockville, MD, USA)이 포함된 배지를 사용하여 배양하였다. TSA는 Sigma Chemical Co. (St. Luis, MO, USA)에서 구입하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma)에 용해하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였고, 매회 처리 전 배지에 희석 후 사용하였다.</p><h2>MTT assay를 이용한 세포 성장율의 측정 및 세포형태 변화의 관찰</h2><p>암세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, TSA를 적정 농도별로 처리하고 48 시간동안 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Amresco, Solon, Ohio, USA) 시약을 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농도가 되게 성장배지로 희석하여 분주하고 3시간 동안 배양 후 MTT 시약을 제거하고 DMSO 를 첨가하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 TSA 미처리 배지에서 배양된 세포와 TSA가 처리된 배지에서 배양된 세포들의 성장률을 비교하였다. 세포형태 변화 관찰을 위해서는 세포배양용 petridish에 세포를 24 시간동안 안정화시킨 다음 TSA를 농도별로 처리하여 48 시간동안 배양한 후, 위상차 현미경하에서 각 농도에 따른 변화를 관찰하였다.</p><h2>DNA flow cytometry에 의한 세포주기의 분석</h2><p>세포주기의 분포도에 미치는 TSA의 영향을 조사하기 위하여 Cycle TEST PLUS kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하였으며, TSA 미함유 및 TSA가 함유된 배지에서 48시간 배양된 암세포들을 kit에서 제공된 buffer solution을 이용하여 씻어내고, Cycle TEST PLUS solution A 및 B를 상온에서 각각 10 분씩 처리한 후 Cycle TEST PLUS solution C를 처리하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 동안 염색하였다. 이를 nylon mesh로 세포를 하나씩으로 분리시킨 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램으로 분석하였다.</p>
TSA를 적정 농도별로 처리하고 몇 시간 동안 배양하는 가?
48 시간