<h1>결과 및 고찰</h1><h2>옥신에 의해 유도되는 옥수수 자엽초 박편의 굽어짐 반응</h2><p>옥수수 자엽초 박편을 완충용액에 배양하면 밖으로 굽어지는 반면, IAA (indole-3-acetic acid)를 처리하면 이에 반응하여 자엽초 박편이 안쪽으로 굽어지는 현상을 확인하였다. 이 반응은 IAA 처리 후 약 24시간까지 진행되었으며, 24시간 이후에는 새로운 IAA 용액을 가해주어도 더 이상의 반응이 진행되지 않았다. 이 굽어짐 반응은 IAA 뿐 아니라 1-NAA (1-naphthaleneacetic acid)에 의해서도 나타나 옥신에 대한 일반적인 반응의 하나임이 확인되었다 (data not shown).</p><h2>옥수수 자엽초 박편에서 추출물의 옥신 작용 촉진효과</h2><p>옥수수에 옥신에 의한 자엽초 박편의 굽어짐 반응을 촉진하는 물질이 존재하는지 확인하기 위해 메탄올로 옥수수 자엽초를 추출하여 옥신 존재 하에 자엽초 박편에 처리하였다. 그 결과 옥수수 추출물에 의한 옥신반응 촉진 효과를 발견하였다. 이러한 효과가 추출물이 옥신의 분해를 억제하여 결과적으로 배양액 내의 옥신 함량을 높여줌으로써 촉진 효과를 나타내었는지 확인하고자, 옥수수 자엽초의 추출물에 의하여 옥신반응이 촉진된 처리구의 배양용액을 채취하여 그에 포함된 옥신 함량을 측정하였지만 옥수수 추출물 처리구에서 옥신 함량이 증가했다는 증거는 찾을 수 없었다. 또한 옥수수 자엽초 박편의 옥신반응을 촉진하는 물질은 옥수수 뿐 아니라 호박 하배축의 메탄올 추출물에도 포함되어 있으므로(Park, unpublished) 옥신 반응 촉진물질이 단자엽 식물과 쌍자엽 식물을 포함하는 식물군에 널리 존재할 것이라 생각되었다. 옥수수에서 얻은 메탄올 추출물의 농도를 \( \mathrm{ml} \)당 추출물이 유래한 조직의 fresh weight로 표시하여 \( 0 \% \) 에서부터 \( 5 \% \) 까지 높여가며 옥신에 의한 옥수수 자엽초 박편의 굽어짐 반응에 대한 영향을 조사했는데, 이 때 추출물의 촉진효과는 약 \( 2.5 \% \) \( \mathrm{g.f.w/ml} \) )이상에서 포화되었다. 시간별로 추출물의 옥신반응 촉진효과를 조사했을 때에는 추출물 처리 후 4시간 정도에 이미 촉진 효과가 관찰되었다.</p><p>특정 자극에 대응하는 식물호르몬의 선량반응곡선(doseresponse curve) 변화를 분석하면 그 변화가 수용체 수준에서 일어난 것인지 아니면 그 이후의 과정에 의한 것인지 추정할 수 있다. 예를 들어 선량 반응곡선이 좌측(저농도측)으로 이동하면 수용체의 친화도가 중가한 것이며, 좌우 이동 없이 곡선이 위로 이동하는 것은 수용체 이후 단계의 작용이 촉진되어 작용이 증폭되는 것이다. 옥수수의 메탄올 추출물이 어떠한 방식으로 옥신작용에 영향을 미치는지 확인하고자 옥신의 선량반응곡선에 대한 추출물의 효과를 조사하였다. 옥수수 자엽초의 메탄올 추출물은 옥신의 선량반응곡선을 좌우로 이동시키지 않았으며, 옥신이 존재하지 않을 때에는 아무런 촉진효과가 없었고, 고농도( \(10 \mu \mathrm{M}\) IAA )의 옥신이 존재할 때 현저한 옥신반응 촉진효과가 나타났다. 따라서 옥수수 추출물은 조직의 옥신 감지에 대한 감수성을 증가시키는 것이 아니라 동일한 감수성을 유지한 채 반응의 정도를 강화하는 것으로 판단되었다.</p><p>옥수수 자엽초의 박편은 네 방향에 유출면이 존재하므로 apoplast에 존재하는 물질들을 쉽게 잃어버릴 수 있을 것으로 생각되었다. 에너지로 사용되는 물질의 함량이 낮게 유지되다가 옥수수 자엽초 추출물 처리 시 부족한 에너지원이 보충되어 옥신반응이 더 잘 나타나는지 확인하고자 \( 2 \% \) 의 sucrose를 옥신 존재 하에 배양용액에 넣어 보았으나 아무런 효과가 없었다 (data not shown). 따라서 추출물로부터 보충되는 물질은 에너지원이 아닌 조절물질일 것으로 추정되었다.</p><h2>옥신 반응을 촉진하는 내생물질의 부분정제</h2><p>옥신반응 촉진 물질을 부분 정제하는 조건을 찾기 위해 \( \mathrm{pH~} 5\), \(\mathrm{pH~} 7\), \(\mathrm{pH~} 10\), \(\mathrm{pH~} 11 \) 에서 일회용 \( \mathrm{C}_{18} \) 컬럼을 평형시켜 시료를 흡착하고 \( 100 \% \) 메탄올로 용리한 결과, 모든 \( \mathrm{pH} \)에서 활성물질이 \( \mathrm{C}_{18} \) 컬럼에 흡착되는 것을 발견하였다 (data not shown). 따라서 활성 물질은 \( \mathrm{pH} \)의 변화에 의하여 이온화되지 않는 물질일 것으로 추정되었다.</p><p>\( \mathrm{C}_{18} \) 컬럼으로부터의 용리조건을 찾기 위하여 메탄올 농도를 \( 30 \% \) 부터 \( 100 \% \) 까지 \( 10 \% \) 씩 단계적으로 올려가며 \( 1.5 \mathrm{ml} \)의 용액으로 용리하고 이들 분획의 활성을 조사하였다. 그 결과 옥신에 의한 굽어짐 반응을 촉진하는 물질은 \( 50 \% \) 메탄올에 의해 용리되는 것과 \( 80 \% \) 이상의 메탄올에 의해 용리되는 2가지가 있음을 확인하고, 이들을 각각 Curvature-Enhancing Factor-1 (CEF-1)과 Curvature-Enhancing Factor-2 (CEF-2)라 명명하였다. 또 Nucleosil RP-\( \mathrm{C}_{18} \) 분석용 HPLC 컬럼에서도 50분간 \( 25 \% \) 에서 \( 95 \% \) 까지 메탄올 농도를 직선적으로 증가시키며 용리했을 경우에도 일회용 \( \mathrm{C}_{18} \) 컬럼을 사용했을때와 동일하게 \( 50 \% \) 메탄올과 \( 80 \% \) 이상의 메탄올에 의해 용리되는 2개의 분획에서 활성이 나타났으므로(data not shown), 이후 모든 분리단계에서 CEF-1과 CEF-2를 부분 정제된 활성 물질로 사용하였다. CEF-1과 CEF-2가 시간별로 자엽초 박편의 굽어짐 반응에 미치는 영향을 조사하였는데, CEF-1 과 CEF-2의 작용 시간은 차이가 없었다(data not shown).</p><h2>HPLC를 이용한 Curvature-Enhancing Factor-2의 정제</h2><p>CEF-2 분획에 들어있는 활성 물질을 순수 분리하기 위해 부분 정제된 시료인 CEF-2를 Nucleosil RP-\( \mathrm{C}_{18} \) 컬럼에 유입하여 흡착하고 산성 조건에서(\(0.3\%\) acetic acid) 50분간 메탄올 농도를 \( 40 \% \) 에서부터 \( 95 \% \) 까지 직선적으로 높여가며 용리하였다. 이때 각 분획을 매 1분 간격으로 받아 옥수수 자엽초 박편의 옥신에 의한 굽어짐 반응을 촉진하는 활성을 조사한 결과, 36분 이후에 용리되는 분획물이 활성을 지니고 있는 것으로 확인되었다. 용리양상을 분석하여 \(280 \mathrm{nm} \) 에서의 흡광도를 시간에 따라 표시하였을 때 활성을 나타내는 피크는 다른 물질들에 비하여 매우 작아서 이 활성 물질의 농도는 매우 낮음을 알 수 있었다.</p><p>옥수수 자엽초에는 옥신 활성을 촉진하는 물질들이 최소한 2 가지가 존재하며, 그 중 더욱 소수성인 CEF-2는 HPLC에 의하여 정제 조건이 확립되었다. 그러나 그 함량이 낮으므로 분자 구조를 결정하기 위해서는 대량 분리에 성공해야 할 것으로 사료된다. 동일한 조건에서 CEF-1은 약 10 분 정도에 용리될 것으로 예측되었지만, 이 시간대에는 다양한 물질들이 동시에 용리되어 분리양상을 뚜렷하게 구분하기 어려웠으므로 CEF-1의 분리조건 확립은 일단 보류하였다.</p><p>옥신에 의한 생장 반응에 영향을 미치는 것으로 알려진 기존 물질로는 brassinosteoids가 있지만, 본 연구에서 분리한 물질이 brassinosteroid는 아닌 것으로 판단된다. 그 이유는 CEF-1과 CEF-2가 brassinosteroid와 달리 standard elongation assay에서는 뚜렷한 촉진효과를 나타내지 않았기 때문이다(unpublished data). 화학적 실체가 알려지지 않은 옥신 작용 촉진 물질은 메뚜기의 중장 추출물에서 발견되었는데, 이 물질은 옥신의 선량 반응곡선(dose-response curve)을 좌측(저농도측)으로 이동시켜 감수성을 증가시켰다. 그러나 CEF들에 의해서는 반응이 증폭될 뿐 감수성 증가가 나타나지는 않았으므로 CEF와 메뚜기 중장 추출물에 들어 있는 물질은 서로 다를 것으로 판단된다. 따라서 CEF는 이제까지 빍혀지지 않은 미지의 물질일 가능성이 높을 것으로 사료된다.</p><p>옥신의 작용이 나타나는 조직에 옥신 활성을 조절하는 물질들이 함께 존재한다는 사실은 옥신 작용에 요구되는 제 2의 요소가 존재할 것이라는 Hertel의 제안을 지지하는 결과이다. 그러나 아직 CEF-1과 CEF-2의 작용 메커니즘이 밝혀지지 않았기 때문에 CEF-1과 CEF-2가 Hertel이 제안한 바와 같이 옥신 수용체 상에 함께 결합하는 "co-auxin"에 해당하는 물질인지는 확인할 수 없었다. 따라서 CEF의 구조 결정과 더불어 이들의 작용 메커니즘에 관한 연구가 필요한 것으로 사료된다.</p>
옥수수 자엽초 박편이 안쪽으로 굽어지게 하려면 무엇을 처리 해야하니?
IAA