<h1>서 론</h1><p>전세계적으로 판매되고 있는 소의 사료 원료로 옥수수 등의 곡물이 이용됨에 따라, 소의 위가 산성화되는 생리작용의 큰 변화를 초래하게 되었다. 소의 위에 존재하는 수 많은 미생물중 cellulolytic bacteria는 일부분이며, 그 중에서도 주종을 이루는 것들은 Ruminicoccus albus, Ruminicoccus flavefa-ciens, Butyrivibrio fibrisolvens, Fibrobacter succinogenes 등이다. 이들 미생물들은 낮은 \( \mathrm{pH} \) 에 견딜 수 없고, 특히 장내 미생물 중 가장 강력한 cellulose 분해 미생물인 F. succino-genes는 \( \mathrm{pH} 5.9 \) 이하에서 자랄 수 없음이 발표되었다. 즉, 소 위의 \( \mathrm{pH} \) 가 \( 6.0 \) 이하로 되면 소의 장내 미생물에 의한 cel-lulose 등의 분해가 현저히 억제되어 소의 영양상태에 막대한 지장을 초래하게 되는 것이다. 현재, 국내 사육우의 대부분이 만성 소화 불량상태에 있는 이유도 이와 간은 이유에서 비롯된다고 할 수 있다. 따라서 가축의 소화불량 상태를 치료하고자 cellulosic biomass 분해효소를 대량 생산하는 미생물 생균제 (probiotic)를 사료에 첨가함으로서 가축의 소화흡수 효율을 높이는 유전공학적 연구가 최근 들어 활발히 진행되고 있다.</p><p>본 연구에서 사용한 효모 Saccharomyces cerevisiae는 식물성 원료물질인 전분이나 섬유소를 활용하는 다양한 생물공정분야에 이용될 수 있다. 그러나 효모는 전분 분해효소를 소량으로 분비 생산하며 섬유소 기질을 전혀 분해할 수 없는 단점이 있다. 유전자 재조합 기술을 이용하여 섬유소 분해 효모를 새로이 육종하게 되면 양조, 제빵, 알콜 생산, 생균제 개발 등에 많은 활용성이 기대된다. 또한, 효모 S. cerevisiae는 인체에 비병원성이며 미국 FDA에서 허가한 GRAS (Generally Recognized As Safe) 미생물이며 고등생물세포와 유사한 번역 후 수식계 (post-translational modification system)가 있어 folding, disulfide 결합 등 단백질의 구조와 기능이 천연 상태로 생산된다. 또한 효모는 대장균에 비해 유전자 재조합 단백질을 더 효율적으로 세포 밖으로 분비 생산하여 단백질의 분리 정제에 도움을 줄 수 있고, 효모에서 단백질을 생산할 때 의약용 단백질의 경우에 꼭 제거되어야만 하는 endo-toxin 등이 문제가 되지 않는 장점을 가지고 있다.</p><p>섬유소 분해효소로는 C1 (exoglucanase), Cx (endoglu-canase), \( \beta \)-glucosidase가 있다. 천연섬유소에 작용하여 이것을 절단하여 직쇄분자를 생성하는 C1 효소, 즉 exoglucanase(cellobiohydrolase)와 직쇄분자나 modified cellulose에 작용하는 \( \mathrm{Cx} \), 즉 endoglucanase, 그리고 cellobiose에 작용하여포도당을 생성하는 \( \beta \)-glucosidase가 있다. Endoglucanase는 고분자의 cellulose polymer를 random하게 가수분해하며 주로 cellobiose, cellotriose 그리고 celloligosaccharide와 같은 다당류를 생성한다. Exoglucanase는 저분자의 다당류에 작용하여 비환원성 말단에서 포도당 분자를 유리한다. \( \beta \)-gluco-sidase는 cellobiose, cellotriose 등과 갇은 단쇄의 과당류를 분해하여 포도당을 생성한다.</p><p>강력한 cellulose 분해 균주인 Trichoderma reesei에서 분리한 cellobiohydrolase Ⅰ 과 Ⅱ 및 endoglucanase Ⅰ 등의 유전자가 효모 S. cerevisiae에서 발현 분비되었으며, 또한 Clostridium themocellum의 endoglucanase A를 효모에서 발현 생산시킨 바도 있다. 그러나 효모에서 이들 단백질의 분비효율은 매우 낮았다.</p><p>효모로부터 재조합 단백질의 분비생산을 위해서는 효모의 분비 서열을 이용하는 것이 효율적이다. 이에 본 연구에서는 Kluyveromyces marxianus exoinulinase 유전자의 분비 신호 서열을 이용하여 S. cerevisiae 형질전환체로부터 배지내로 재조합 endoglucanase A의 효율적인 분비 생산을 시도하고자 한다. 이렇게 함으로써 cellulose 분해 활성을 가지는 효모 생균제를 개발할 수 있고, 나아가 재조합 endo-glucanase A 효소를 다양한 생물공정에도 활용할 수 있을 것이다.</p>
소의 위에 존재하는 수 많은 미생물은 산성도가 높은 환경에서 잘 생활할 수 있어?
NO