<h2>분석방법</h2><p>미생물 농도는 분광광도계 (Spectronic 20, Milton Inc., USA)의 파장 \( 660 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여, 먼저 구한 흡광도와 세포건조무게의 검량선을 이용하여 미생물 농도를 환산하여 계산하였다. 납 흡착시 미생물의 보관시간에 따른 영향의 분석에서는 정상기까지 배양해서 이를 회수한 후, 이온이 제거된 초순수 증류수에 미생물을 현탁시켜 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 냉장 보관하면서 일정시간이 경과할 때 마다 현탁액을 사용하여 흡착실험을 하였다. 흡착속도는 중금속의 초기농도를 약 \( 50 \sim 500 \mathrm{mg} /\mathrm{l}\) 로 바꾸어 가면서 각 중금속 농도에서 일정시간 (10 min) 동안에 흡착된 중금속 양을 구하여 초기속도법으로 계산하였다. 세포외 고분자물질을 추출하기 위해서는 초음파세척법, \( \mathrm{NaOH} \) 추출법, 증기추출법 등 여러가지가 있는데 그 중에서도 고속 원심분리법과 ethylene diamine-tetra acetic acid (EDTA)법을 혼합하여 사용하였다. 미생물 현탁액 \( 25 \mathrm{ml} \) 에 \(5 \mathrm{M}\)-EDTA와 \( \mathrm{NaCl} \)을 각각 \( 0.2 \mathrm{ml} \)씩 첨가한 후, vortex mixer로 교반시켰다. 이 시료를 \( 36,000 \mathrm{rpm} \) 에서 40 분 간 고속으로 원심분리한 후, pellet은 이온이 제거된 증류수로 현탁시켜 원심분리하고 다시 현탁시키는 과정을 3차례 실시하여 흡착실험에 사용하였으며 상등액은 isopropyl alcohol과 1:4 의 부피로 혼합한 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3시간 동안 정지시킨 다음 무게를 아는 여과지에 여과하여 세포외 고분자물질의 무게를 측정했다. 수용액중 중금속의 분석은 Atomic Absorption Spectrometer (Varian, SpectrA 55B)를 사용하였다. 투과전자현미경 Transmission Electron Microscope; TEM, Hitach H-600)으로 흡착된 미생물을 관찰하기 위해서 중금속을 흡착한 미생물을 원심분리기로 회수하여 멸균 증류수로 3회 세척한 후, \( 25 \% \) glutaraldehyde로 실온에서 2시간 전고정시킨 다음 \( 1 \% \) osmium tetroxide로 24시간 후고정시킨다. 이때 사용한 모든 시약의 희석은 \( 0.1 \mathrm{M} \) 인산완충용액 \( (\mathrm{pH} 7.0) \)로 하였으며, 동일한 완충용액으로 세척하였다. 균체를 언속적으로 \( 60,70,80,90,100 \% \) 의 에탄올로 탈수하고 propylene oxide로 조직을 치환시켜서 Epon 812에 포매 (embedding)하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 건조기에서 24 시간 중합시킨 후에 ultramicrotome (ULTRACUT, Reicher-Jung)을 이용해서 \( 0.35 \mu \mathrm{m} \) 그기로 절단하여 carbon coated \(200 \mathrm{mesh}\) nickel 또는 copper grid에 고정시켜 투과전자현미경으로 \( 75 \mathrm{KV} \) 에서 관찰하였다.</p>
세포외 고분자물질을 추출할 때 혼합하여 쓰는 두가지 방법으로 무엇이 있는가?
고속 원심분리법과 ethylene diamine-tetra acetic acid (EDTA)법