<h1>결 과</h1><h2>셀레늄이 HT-29 대장암 세포의 증식과 사멸에 미치는 영향</h2><p>본 연구에서는 셀레늄이 HT-29 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 셀레늄을 농도별(0.125 \( \mathrm{mM}, 0.25 \mathrm{mM}, 0.5 \) \( \mathrm{mM}, 1 \mathrm{mM}) \) 과 시간별 \( (0,3,6,12,24 \mathrm{hr}) \) 로 처리한 후 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과 Fig. 1A와 같이 셀레늄을 농도별로 24시간 처리하였을 때 \( 0.125 \mathrm{mM} \)에서는 약 \( 78 \%, 0.25 \mathrm{mM} \)에서는 약 \( 61 \%, 0.5 \mathrm{mM} \)에서는 약 \( 34 \% \) 그리고 \( 1 \mathrm{mM} \)에서는 약 \( 12 \% \)로 농도 의존적으로 세포의 증식이 억제됨을 확인하였다. 또한 Fig. 1B에서와 같이 셀레늄 \( 0.25 \mathrm{mM} \)을 시간별로 처리하였을 때 1 시간 후에는 \( 98 \% \) 로 크게 차이가 없었으나 3시간후부터 통계적으로 유의하게 세포의 증식이 억제됨을 확인하였다.</p><h2>셀레늄에 의한 HT-29 세포의 apoptosis 유도 효과</h2><p>셀레늄이 HT-29 세포의 apoptosis에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 셀레늄 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 을 처리하여 Annexin V-PI 염색을 통해 apoptosis시 나타나는 phosphatidyl serine의 발현을 측정해 보았다. 그 결과 셀레늄을 처리하였을 때 phosphatidyl serine을 측정하는 Annexin V 염색시약에 positive한 세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 HT-29 세포의 증식 억제에 있어서 셀레늄이 효과적으로 작용하며, 세포의 apoptosis를 유도함을 확인하였다.</p><h2>셀레늄에 의한 p-Akt, COX-2 신호단백질의 발현 조절</h2><p>HT-29 세포에 셀레늄을 농도별로 6시간 처리하여 p-Akt와COX-2의 신호단백질의 조절 양상을 알아보기 위하여 Western blotting을 실시하였다. Fig. 2에 나타난 바와 같이셀레늄을 \( 0.125 \mathrm{mM}, 0.25 \mathrm{mM}, 0.5 \mathrm{mM}, 1 \mathrm{mM} \) 로 처리했을 때, 농도에 의존적으로 p-Akt와 COX-2의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 셀레늄 \( 0.5 \mathrm{mM} \)을 6시간 처리하여 \( \mathrm{im}- \) munofluorescence를 실시한 결과, 셀레늄을 처리하였을 때 세포질 내부에 활성화 되어 있는 p-Akt (red)의 발현이 저해되었으며, 세포질 및 핵내 발현이 증가되어 있던 COX-2 (green)가 감소하였다.</p><h2>Akt, COX-2 저해제 처리 및 Akt siRNA가 HT-29 세포의 증식에 미치는 효과</h2><p>Akt의 저해제인 LY294002와 COX-2의 저해제인 celecoxib를 셀레늄과 병행처리 하였을 때 HT-29 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. Fig. 5에서와 같이 LY294002 \( 20 \mu \mathrm{M} \), celecoxib \( 25 \mu \mathrm{M} \), 셀레는 \( 0.25 \mathrm{mM} \)을 24시간 동안 각각 그리고 병행처리하였을 때의 암세포의 증식을 확인한 결과, LY294002를 단독으로 처리하였을 때에는 약 \( 81 \% \)의 생존율을 보였고, 셀레늄과 LY294002를 병행처리 하였을 때에는 약 \( 51 \% \) 의 생존율을 보였다. 또한 celecoxib를 단독 으로 처리하였을 때에는 약 \( 89 \% \)의 생존율을 보였다. 또한 celecoxib를 단독으로 처리하였을 때에는 약 \( 49 \% \)의 생존율을 나타내었다. 이와 같이 셀레늄과 Akt, COX-2의 저해제를 병행처리한 결과가 셀레늄을 단독으로 처리하였을 때 보다 세포증식억제 효과가 더 강하게 나타나는 것을 확인하였다.</p><p>HT-29 세포에 Akt siRNA를 이용하여 gene knockdown을 시킨 뒤 세포증식억제 효과를 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 그 결과 Fig. 6에서와 같이 control군에서는 셀레늄을 \( 0.25 \mathrm{mM} \) 처리하였을 때 약 \( 57 \% \) 의 생존률을 보였으나 동일한 조건에서 Akt siRNA transfection 군에서는 약 \( 43 \% \)의 생존율을 보였다. 셀레늄을 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 처리하였을 때에도 con-trol군에서는 약 \( 34 \% \)의 생존률을 보였으나 Akt siRNA transfection 군에서는 약 \( 13 \% \) 생존율을 나타내었다.</p><h2>Akt siRNA에 의한 셀레늄의 COX-2 신호분자의 조절</h2><p>Akt가 COX-2를 조절하는 조절자로서 작용할 수 있는지 알아보기 위하여 Akt siRNA를 이용하여 gene을 knockdown시킨 뒤 셀레늄을 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 처리하여 \( \mathrm{COX}-2 \) 의 발현을 확인하였다. 그 결과 Fig. 7에서와 같이 control군에 비하여 AktsiRNA transfection 군에서의 COX-2 발현은 약하게 나타났으나 COX-2의 발현이 완전히 저해되지는 않았으며 셀레늄을 처리하였을 때 아무것도 처리하지 않은 none에 비하여 COX-2의 발현이 저해된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 셀레늄이 Akt 경로를 거치지 않고도 COX-2의 발현을 저해하는 것으로 보인다.</p>
셀레늄을 \( 1 \mathrm{mM} \)농도로 24시간 처리하였을 때, 세포 증식이 몇 % 억제되는가?
\( 12 \% \)