<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포배양</h2><p>HUVECs은 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였으며, \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)penicillin/streptomycin이 함유된 정상 RPMI 1640 (글루타민 농도: \( 2.05 \mathrm{mM} \) ) 및 글루타민 결핍 RPMI 1640 (Invitrogen)배지를 이용하여 배양하였다.</p><h2>Hemocytometere를 이용한 세포 생존율 및 MTT assy에 의한 세포 증식율 측정</h2><p>글루타민 또는 혈청 결핍이 HUVECs의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여 6-well plate에 세포를 \( 1 \times 10^{5} \)개 \( / \mathrm{ml} \)로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음, 글루타민 또는 혈청이 결핍된 RPMI-1640 배지로 교체하였다. 적정 시간 경과 후 상층액을 제거하고 \( 0.05 \% \) trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 부유시킨 다음 phosphate-buffered saline (PBS)와 \(0.5\%\) trypan blue solution을 각 well 당 첨가하였다. 약 2분 후 sample을 hemocytometer에 적용한 후 도립 현미경을 이용하여 살아있는 세포를 계수하여 상대적 수치로 비교하였다. MTT assay를 위하여 적정 시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO,USA)를 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도가 되게 배지로 희석하여 분주하고 3시간 동안 \(\mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양시킨 다음 MTT 시약을 깨끗하게 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO)를 적정량 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 96 well plate에 \( 200 \mu \mathrm{l} \)씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Apoptosis 유도의 확인</h2><p>글루타민 또는 혈청 결핍에 의한 HUVECs의 증식억제가 apoptosis 유도와 연관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma-Aldrich) 염색을 이용한 핵의 형태적 변화를 관찰하였다. 이를 위하여 동일조건에서 배양된 HUVECs를 \( 37 \% \) formaldehyde 용액과 PBS를 \( 1: 9 \)의 비율로 섞은 fixing solution을 이용하여 상온에서 10분 동안 고정하고 DAPI 용액으로 염색시켰다. 15분 정도 염색시킨 후, mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 400배의 배율로 핵의 형태 변화를 관찰하였다. 또한 apoptosis 유도의 정량적인 비교 분석을 위하여 준비된 세포를 모은 후 PBS로 충분히 씻고 CycleTEST Plus DNA Reagent Kit (Becton Dickison, San Jose, CA, USA)를 사용하여 고정 및 propidium iodide (PI)를 처리하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), 암조건에서 10분 이상 염색시켰다. 염색된 세포를 25-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACSCallibur (Becton Dickison)를 이용하여 형광반응에 따른 Cellular DNA content 및 histogram을 Cell Quest software 프로그램을 이용하여 sub-G1기에 해당되는 세포의 빈도를 apoptosis가 일어난 세포로 정량화하였다.</p>
배양된 HUVECs를 10분 동안 고정시키기 위해 어떤 용액을 사용하였는가?
\( 37 \% \) formaldehyde 용액과 PBS를 \( 1: 9 \)의 비율로 섞은 fixing solution을 이용