<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물 재료</h2><p>천안시 입장 소재의 거봉 포도 과원으로부터 개화 이후 일주일 간격으로 포도(Vitis vinifera L X Vitis labrusca L. CV Kyoho)를 수확하였다. 과피에 안토시아닌 색소가 축적된 포도 과실 중 일부를 무작위로 선정해서 과피, 과육, 씨를 분리하고 이를 급속 냉동시켰다. 야생형 담배(Nicotiana tabacum cV Wisconsin) 및 담배 형질전환체는 식물생장기 내에서 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) (16 시간 낮) 조건으로 키웠다.</p><h2>포도 혹은 담배 조직으로부터 total RNA의 추출</h2><p>\( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관되어 있는 시료로부터 \( 5 \mathrm{g} \)을 채취하여 막자사발에 옮겨 고운 가루로 만든 후, \( 25 \mathrm{ml} \) 의 추출완충용액 \( (2 \% \) CTAB, \(\mathrm{w} / \mathrm{v}\); \( 1.4 \mathrm{~M} \mathrm{~NaCl}\) ; \(1 \% \) PVP, \(\mathrm{w} / \mathrm{v}\); \(0.2 \%\) \( \beta\) -mercaptoe-thanol, \(\mathrm{v} / \mathrm{v}\); \( 20 \mathrm{~mM} \) EDTA; \( 100 \mathrm{~mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \(\mathrm{pH} 9.0\); \( 0.4 \mathrm{g}\) PVPP /\( \mathrm{g}) \)을 첨가하여 섞고, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)의 항온 수조에서 5분간 정치시켰다. 같은 양의 phenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1, \(\mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)을 첨가하여 혼합시킨 뒤 \( 12,000 \times g \)로 원심분리하였다. 상층액을 새로운 tube로 옮겨서 0.6배의 이소프로판올을 넣고, 얼음에서 30분간 침전시킨 뒤, \( 12,000 \times g \)로 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 핵산 침전물을 \( 0.6 \mathrm{ml} \)의 \( 0.1 \% \) DEPC (diethyl pyrocarbonate) 처리 멸균 증류수에 녹였다. 같은 양의 \( 4 \mathrm{~M} \mathrm{~LiCl} \)를 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 동안 정치시킨 다음 원심분리하였다. 침전물을 \( 70 \% \) 에탄올로 씻고 \( 20 \mu \mathrm{l} \)의 \( 0.1 \% \) DEPC 처리 멸균 증류수에 녹여서 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하며 사용하였다. Total RNA는 UV Spectrophotometer (BIO-RAD)를 사용하여 정량하였으며, \( 1.8 \% \)의 formladehyde-agarose gel에서 RNA 상태를 확인하였다.</p><h2>포도 ufgt cDNA 클로닝</h2><p>포도 과피에서 분리한 \( 2 \mu \mathrm{g} \)의 total RNA로부터 M-MLV reverse transciptase (Promega)를 이용하여 cDNA를 합성하고 이를 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 프라이머는 기존에 포도(Vitis vinifera L.)에서 보고된 ufgt 유전자의 염기서열을 바탕으로 제작하였으며, forward 및 reverse 프라이머는 각각 5'-GCGTGGCAGC GGATCCATGT CTCAAACCAC CACC-3'와 5'-GCTCCAAACA GGTGGTACAA-3'이었다. PCR 반응을 위해 \( 1 \mu \mathrm{l} \)의 cDNA 주형, \( 0.2 \mathrm{~mM} \)dNTP, \( 1.5 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2}\), \(25 \mathrm{pmol}\) 의 프라이머 쌍, \( 50 \mathrm{~mM} \mathrm{~KCl}\), \(10 \mathrm{~mM} \) Tris\(\mathrm{HCl}\), (\(\mathrm{pH} 9.0\)), \( 1.5 \mathrm{mM} \mathrm{~MgCl}_{2}, 0.1 \% \) Triton X-100 그리고 2.5 units의 Taq DNA polymerase (Promega)를 혼합하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3 분간 변성시키고, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 초, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분, 그리고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분간의 반응을 30 회 반복하였다. 그리고 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10 분간 더 반응시켰다. PCR 산물은 gel 에서 확인하고 정제한 다음 pCR 2.1 TOPO vector에 ligation 하였으며, ligation 혼합물로 E.coli TOP10을 형질전환시켰다.</p><h2>염기서열 작성 및 분석</h2><p>Dideoxy chain termination 방법을 이용하여, 거봉 포도로부터 클로닝한 ufgt cDNA의 염기서열을 작성하였으며, NCBI Blast와 TIGR database를 이용하여 염기서열을 분석하였다.</p><h2>CaMV 35S::ufgt cDNA construct 제작 및 담배 형질전환</h2><p>\( 10 \mu \mathrm{g} \)의 pBI121 벡터 DNA를 SacI과 SmaI로 처리한 다음, GUS 부위를 제외한 나머지 부위만을 DNA.RNA extraction kit (VIOGENE)을 이용하여 분리하였다. 분리하여 얻은 DNA는 gap-filling을 한 뒤 self-ligation시켰다. 거봉 포도로부터 클로닝한 ufgt CDNA의 양쪽 끝에 제한효소 XbaI 인지부위를 붙이기 위해 5'-GGTCTAGA(XbaⅠ)CA GCGGATCCAT GTCT CAAA-3' 와 5'-GGTCTAGA(XbaⅠ)GA CATCCTTTGG TTTTG ACA-3'를 각각 forward 및 reverse 프라이머로 사용하여 PCR을 수행한 다음 PCR 산물을 Xba Ⅰ으로 처리하였다. Xba Ⅰ으로 처리하여 준비한 포도의 ufgt cDNA를, 역시 같은 제한효소로 처리한 pBI121 벡터에 각각 sense와 antisense방향으로 ligation시킨 뒤 이를 사용하여 E.coli TOP10을 형질전환시켰다. 확인된 transformant로부터 DNA를 분리하여 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 도입하고, 이를 사용하여 leaf disc 방법으로 야생형 담배를 형질전환시켰다. 캘러스 유도 및 재 분화는 일반적인 방법을 이용하였다.</p><h2>담배 형질 전환체 및 야생형 담배로부터 ufgt 유전자 발현 분석</h2><p>담배 형질전환체 및 야생형 담배의 조직에서 분리한 \( 2 \mu \mathrm{g} \)의 total RNA로부터 M-MLV reverse transciptase (Promega)를 이용하여 cDNA를 합성하고 이를 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. Foward 및 reverse 프라이머는 각각 5'-GGGGCTTTTG TAACACATTG-3'와 5'-GCTCCAAACA GGTGGTACAA-3'이었다. PCR 반응은 포도로부터 ufgt cDNA를 클로닝할 때와 같은 조건에서 수행하였으며, PCR 산물은 gel에서 확인하였다.</p><h2>담배 형질 전환체로부터 안토시아닌 추출 및 정량 분석</h2><p>담배 형질전환체와 야생형 담배로부터 꽃을 채취한 다음 \( 0.1 \% \mathrm{~HCl}\)-Methaol 용액에 넣고 고르게 분쇄하였다. 최종 부피를 각각 \( 50 \mathrm{ml} \)로 맞추고 \( 0^{\circ} \mathrm{C} \) 암조건에서 20시간 방치한 다음, 용액을 거름종이로 걸렀다. 안토시아닌 함량은 Fuleki와 Francis의 방법을 변형하여 안토시아닌의 흡수 파장을 포함하는 \( 500 \sim 600 \mathrm{~nm} \) 범위의 파장에서 각각의 흡수 스펙트럼을 scanning하여 계산하였다.</p>
\( 10 \mu \mathrm{g} \)의 pBI121 벡터 DNA를 SacI과 SmaI로 처리한 다음, GUS 부위를 제외한 나머지 부위만을 DNA.RNA extraction kit (VIOGENE)을 이용하여 분리해서 얻은 DNA를 self-ligation시키기 전에 어떠한 과정을 수행했니?
gap-filling