<h1>재료 및 방법</h1><h2>공시균주</h2><p>임의로 채취한 약 300여 점의 부식토 및 부엽토 등으로부터 carboxy methyl cellulase (CMCase), protease 및 chitinase활성이 높고, 식물병원성균주에 대하여 생육억제력이 강한 균주를 최종 순수분리하여 공시균주로 사용하였다. 항균활성 측정을 위한 식물병원성균주는 농업진흥청 응용미생물과에서 분양 받은 잿빛 곰팡이병을 유발하는 Botrytis cinerea, 잎마름병의 원인균인 Corynespora cassicola, 시들음병을 유발하는 Fusarium oxysporum, 잘록병의 원인균인 Rhizoctonia solani의 균주를 사용하였다.</p><h2>사용배지</h2><p>항균미생물의 분리용 배지로는 carboxy methyl cellulose (CMC가 함유된 CY배지 (CMC \(1 \%\), yeast extract \( 1 \%\), \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \) \( 0.1 \%\),\(\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} 0.1 \%\), \(\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.05 \% \) 및 agar \(2 \%) \)를 사용하였고, 식물 병원성균주의 생육 및 보존을 위한 배지는 PDA (Difco) 평판배지를 사용하였다. 분리균주의 최적배지 검토를 위한 최소배지는 M9 minimal medium (glucose \( 2 \% \) , \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.2 \%\) \((\mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 6.4 \%\), \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 1.5 \% \), \( \mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl} ~0.5 \%\) 및 \( \left.\mathrm{NaCl} ~0.02 \%\right) \) 를 사용하였다.</p><h2>항균미생물의 선정 및 동정</h2><p>채취한 시료 \( 1 \mathrm{~g} \)을 멸균 생리식염수 \( 9 \mathrm{ml} \)에 희석하여 그 시료용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 CY평판배지에 직접 도말한 다음 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양한 후 \( 0.1 \% \) congo red를 뿌려 나타나는 clear zone의 크기로 1차 선별하였다. 1차 선별한 미생물은 액체 배지상에서 진탕배양한 후 CMCase, protease 및 chitinase 활성을 측정하여 3종류의 효소활성이 동시에 높은 균주를 2차 선별한 다음 PDA 평판 배지 상에서 식물 병원성균주에 대한 항균활성이 높은 군주를 최종 분리균주로 선정하였다. 분리균주의 동정을 위한 형태학적 및 생화학적특성을 검토하여 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 및 Bergey's mannual of determinative bacteriology. 9th에 준하여 1차 동정하였다. 당 발효실험은 API 50 CHL carbohydrate test kit (Bio Merieux, France)를 사용하여 Nutrient broth 배지에 24시간 배양하면서 배양액의 색도변화 결과를 ATB identification computer system (Bio Merieux, France)에 입력하여 조사하고, 16S rDNA 유전자 분석을 행하여 동정하였다.</p><h2>효소활성</h2><p>분리균주의 효소활성 측정은 \( 500 \mathrm{ml} \) 삼각플라스크에 CY배지 \( 200 \mathrm{ml} \)를 넣고 분리균주의 전배양액을 \( 2 \mathrm{ml} \) 접종하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양한 다음, 배양액을 \( 8,000 \times g \)에서 10분 동안 원심분리하여 얻은 상징액을 조효소액으로 사용하였다. CMCase활성은 조효소액 \( 0.25 \mathrm{ml} \)에 \( 1 \%\) CMC \(0.75 \mathrm{ml} \) 을 혼합하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)의 항온수조에서 10분간 반응시킨 다음, 3,5-dinitrosalysilic acid (DNS)법으로 측정하여 CMCase \(1 \mathrm{unit}\)는 1분 동안에 \( 1 \mu \mathrm{g} \)의 D-glucose를 생산하는 효소의 양으로 나타내었다. Protease 활성은 Anson 등의 방법에 준하여 측정하였으며, protease \(1 \mathrm{unit}\)는 조효소액 \( 1 \mathrm{ml} \)가 1 분간 \( 1 \mu \mathrm{g} \)의 trosine을 생성하는 효소의 양으로 나타내었다. Chitinase의 활성은 \( 0.05 \mathrm{M} \) phosphate buffer ( \( \mathrm{pH}7.0 \) )에 현탁시킨 colloidal chitin을 효소반응 기질로 사용하여 DNS법에 따라 측정하였다. Chitinase \(1 \mathrm{unit}\)는 시간당 colloidal chitin으로부터 \( 1 \mu \mathrm{M} \) N-acetyl-D-glucosamine을 생성하는 효소량으로 나타내었다.</p>
공시균주 사용한 균주는 어디에서 채취하였는가?
부식토 및 부엽토 등