<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>본 실험에서 사용된 셀레늄은 Sigma (Sigma Aldrich, St.Louis, MO)에서 구입하여 증류수에 녹인 뒤 10 mM stock으로 만들어 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하여 사용하였다. 3-(4,5-dime thylth-iazol-2-yl)-2.5-diphenyltetrzolium bromide (MTT)는 Sigma(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)에서 구입하여 5mg/ml stock으로 만들어서 사용하였다. 또한, celecoxib와 LY294002는 Calbiochem (San Diego, CA)에서 구입하여 DMSO에 녹인 뒤 각각 25 mM과 10 mM stock으로 만들어 사용하였다.</p><h2>세포 배양</h2><p>HT-29 세포는 American Type Culture Collection (ATCC,Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며, \( 10 \% \) 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY,USA)과 \( 1 \% \) antibiotics (100 mg/l streptomycin, \( 100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) penicillin)가 포함된 RPMI 1640 배지(WelGENE Inc., Seoul, Korca)를 사용하여 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 조건 하에서 베양하였다. 매 48시간마다 Trypsin-EDTA (WelGENE Inc., Seoul, Korea)를 이용하여 세포를 부유상태로 만든 다음 세포를 \( 1 \times 10^{6} \) 개/ml 로 분주하고 계대하여 실험에 사용하였다.</p><h2>MTT assay에 의한 암세포의 생존율 측정</h2><p>세포배양용 12 well plate에 HT-29 세포를 \( 1 \times 10^{4} \) 개/ml로 분주하고 24시간 동안 배양시킨 후 셀레늄을 처리하였다. Celecoxib와 LY294002를 처리시에는 celecoxib와 LY294002를 30분 먼저 처리한 후 셀레늄을 처리하였으며 MTT 용액(5 \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)을 30μl씩 첨가하여 1 시간 동안 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. MTT시약이 들어있는 배지를 제거한 후에 DMSO를 150 μl 넣어 well에 생성된 formazan을 모두 녹인후, 96 well plate에 100 μl씩 옮겨서 Microplate Reader(BIO-RAD Laboratories, Inc. USA)로 \( 595 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번 하였으며, 그에 따르는 평균값과 표준오차는 Microsoft Excel program을 이용하여 분석하였다.</p><h2>Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)에 의한 apoptosis 관찰</h2><p>Apoptosis는 FITC-Annexin V apoptosis detection kit (BDPharmingenTM, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. AnnexinV-PI staining을 하기 위해, HT-29 세포에 celecox-ib \( 25 \mu \mathrm{M} \), LY294002 \( 20 \mu \mathrm{M} \) 을 30분 먼저 처리한 후 셀레늄 \( 0.25 \mathrm{mM} \) 을 처리하여 24시간 배양하였다. 처리된 세포는 차가운 PBS로 세척하고 나서 trypsin-EDTA로 모은 다음, \( 1 \times 10^{6} \) 개 \( / \mathrm{ml} \)의 농도에서 binding buffer로 suspension 하였다. 그 다음에 \( 1 \times 10^{5} \) 개의 HT-29 세포를 Annexin V-FITC와 prodipium iodide (Pl)로 15분간 염색한 후, 1 시간 정도 flow cytometry (Becton-Dickinson Biosciences, Drive Frankline Lages, NJ, USA)로 분석하였다.</p><h2>Western blotting</h2><p>셀레늄을 농도 별로 처리한 후 6시간 동안 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양한 후, 단백질을 추출하기 위하여 RIPA lysis buffer [50 mM Tris-HCl (pH 8.0), \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 1 \% \) NP 40, 0.5\% sodium deoxycholate, \( 1 \mathrm{mM} \) phenylmethysulfonyl]를 각 well에 150 pl식 첨가하여 반응시킨 후, \( 14,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분 동안 원심분리 하여 상등액을 취하였다. 그런 다음, ELISA-reader \( 595 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 각 표본의 단백질 농도를 결정하였다. \( 5 \times \) Laemmi sample buffer (loading dye; \( 250 \mathrm{mM} \) Tris-Cl (pH 6.8), 40\% glycerol, 4\% \( \beta \) -mercaptoethanol, \( 0.08 \% \) bromophenol blue, \( 8 \% \) SDS)와 HT-29 세포에서 추출한 단백질을 흔합하여 표본을 제작한 후, HT-29 세포에서 추출한 단백질을 혼합하여 표본을 제작한 후, p-Akt, COX-2, β-actin의 1차 항체를 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로 부터 구입하여 각각 희석한 후, 반응시켰다. 2차 항체는 GenDEPOT (Barker, TX)에서 구입하여 각가 회석하여 1 시간 반응시킨 다음, LAS-4000 (Fuï Film, Japan)을 이용하여 감광하였다.</p><h2>Immuofuorescence</h2><p>셀레늄 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 을 처리한 후 6시간 동안 CO2 incubator에서 배양한 뒤 배지를 제거하고 \( 3.5 \% \) formaldehyde에 20분간 고정 한 뒤 \( 0.1 \% \) triton X-100 용액에 permiabilization 하였다. 그런 다음 \( 1 \% \) BSA 용액에 넣고 1시간 blocking한 후, p-Akt,COX-2의 1차 항체를 Cell Signaling Technology (Beverly,MA, USA)로 부터 구입하여 각각 희석하여 반응시켰다. 2차항체는 Invitrogen (Carlsbad, CA)에서 Alexa488 (green)과 Alexa546 (red)을 구입하여 각각 희석하여 1시간 반응시킨 다음, confocal microscope (Carl Zeiss, USA)를 이용하여 감광하였다.</p><h2>Small interfering RNA (siRNA) transfection</h2><p>siRNA transfection에 필요한 Akt1 siRNA와 Dharmafect는 Dharmacon (Lafayette, CO)에서 구입하여 transfection을 실시하였다. 세포를 plate에 \( 1 \times 10^{6} \) 개/ml로 분주한 뒤 24시간 동안 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양한 후 \( 5 \mathrm{nmol} \) 의 Akt1 siRNA와Dharmafect, 그리고 media를 반응시킨 다음 각 well당 \( 1 \mathrm{ml} \)씩 분주한 뒤 48 시간 동안 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. 48 시간 후 새로운 media로 바꿔 준 뒤에 72시간 후 셀레늄 \( 0.25 \) \( \mathrm{mM}, 0.5 \mathrm{mM} \) 을 처리한 다음 24 시간 동안 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양한 후 MTT assay를 실시하였다. Western blotting의 경우 6 well plate에 각 well당 \( 2 \mathrm{ml} \) 씩 분주한 뒤 72 시간 후 셀레늄 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 을 처리한 다음 6시간 후에 RIPA lysis buffer를 이용하여 수행하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>통계 프로그램인 SPSS 17.0을 사용하여 실험설계에 대한 분산분석은 ANOVA로, 각 처리군들 과의 비교는 일원배치 분산분석을 실시하여 검정하였다. 각 자료는 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과로 검정하였고 \( p<0.05 \) 인 경우 통계적으로 유의하다고 관정하였다.</p>
Sigma (Sigma Aldrich, St.Louis, MO)에서 구입, 사용한 셀레늄을 어디에 녹였는가?
증류수에