<h1>결과 및 고찰</h1><h2>재조합 plasmids의 구축</h2><p>재조합 효모의 균체 증식과 동시에 자체 분비 서열을 이용하여 \( celA \) 를 유도적으로 발현 분비시키기 위해 GAL10 promoter 하류에 \( celA \)의 자체 분비 서열를 포함하는 \( celA \) 전체 유전자를 cloning하여 pYEG-CT1 (\( 7.5 \mathrm{~kb} \)) 을 구축하였다. 효모 유래 분비 서열을 이용하여 \( celA \)를 유도적으로 발현 분비시키기 위해 GAL10 promoter 하류에 K. marxianus exoinulinase의 분비 서열(INU1 ss; 23개 아미노산 잔기로 구성; MKLAYSLL LPLAGVSASVINYKR)과 자체 분비 서열이 제외된 성숙 endoglucanase A 유전자를 cloning 하여 pYInu-CT1 (\( 7.5 \mathrm{~kb} \)) 을 구축하였다. INU1 분비 신호와 \( celA \) 연결 부위의 서열은 5'-ATC AAT TAC AAG AGA TCT GCA GGT -3'로서 BglⅡ로 절단하여 연결함으로써 INYKRSAG의 아미노산 서열을 가지게 되어, 번역 후 분비 과정 중 KEX2 protease에 의해 절단된다 (Fig .1). 구축된 발현 plasmid는 선택표지로 URA3 유전자를 함유하고 있어 uracil 영양요구성 변이주 효모세포 (ura3)를 숙주세포로 사용할 수 있다.</p><h2>효모 형질전환체의 선별 및 활성 염색</h2><p>구축된 pYEG-CT1와 pYInu-CT1을 uracil 영양요구성 변이주인 S. cerevisiae SEY2102와 S. cerevisiae 2805에 형질전환 시켰다. Uracil 결핍 SD 배지로 효모 형질전환체를 1 차 선별한 다음, \( 1 \%\) CMC 를 함유하는 평판배지상의 colony로 Congo-red 활성염색을 행하였다. PYEG-CT1의 형질전환체를 galactose를 포함하지 않는 배지에서 배양하여 Congo-red 염색할 경우 활성환이 거의 나타나지 않는 반면, \( 1 \% \) 의 gal-actose가 포함된 배지에서는 활성환이 뚜렷하게 나타남으로써 PYEG-CT1의 형질전환체에서 galactose에 의해 celA가 성공적으로 유도 발현됨을 확인할 수 있었다(data not shown). 이는 PYInu-CT1의 형질전환체에서도 확인할 수 있었다. 그리고 PYEG-CT1의 효모 형질전환체의 경우 숙주세포인 S.cerevisiae SEY2102와 S. cerevisiae 2805에서 활성환의 큰 차이를 보이지 않은 반면, INU1 분비 서열을 사용한 pYInu-CT1의 경우 S. cerevisiae SEY2102에서보다 S. cerevisiae 2805에서 훨씬 큰 활성환을 보였다(data not shown). Endoglucanase A 의 분비 서열에 따른 활성환을 비교한 결과, 두 개의 숙주세포(S. cerevisiae SEY2102, S. cerevisiae 2805) 모두에서 자체분비 서열을 사용하는 pYEG-CT1의 형질전환체보다 INU1 분비 서열을 사용하는 pYInu-CT1의 형질전환체가 더 높은 활성환을 나타냈다. 따라서 Congo-red 활성 염색 상으로 celA 자체 분비 서열보다는 INU1 분비 서열의 분비 효율이 더 좋은 것으로 확인되었다. 이어 정확한 분비효율을 확인하기 위한 실험이 행해졌다.</p>
재조합 효모의 균체 증식과 동시에 무엇을 이용했는가?
자체 분비 서열