<h2>배양연골세포내 조직편의 이식</h2><p>배양 중인 연골세포를 이용한 연골형성과 생체이식전 이식여부를 확인하기 위하여 세포가 완전히 포화된 배양 25 일에 \( 0.05 \% \) Trypsin-\(0.53 \mathrm{mM}\) EDTA (Gibco BRL)로 처리하여 배양용기에서 세포를 분리하였다 이식할 조직편은 늑연골과 늑연골마을 무균적으로 채취하여 늑연골막은 대락 \( 0.5 \mathrm{~cm} \times 0.2 \mathrm{~cm} \) 크기로 잘라서 연골세포 분리액으로 수세한 후 \(35 \mathrm{mm}\) petridish 배양용기 바닥에 납작하게 부착시킨 후 약 3000개의 세포를 분주하고 매일 성장배지를 교환하였다.</p><p>늑연골은 두께 \( 1 \mathrm{~mm} \) 이하로 얇게 절편하고 \( 1 \mathrm{~cm} \times 0.5 \mathrm{~cm} \) 크기로 자른 다음 반원형으로 두 개의 홈을 내었다. 절편은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 하에서 교반시키면서 \( 0.25 \% \) trypsin 용액 \( 2 \mathrm{ml} \) 를 가하여 1 시간동안 처리한 후 \( 200 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) collagenase \( 2 \mathrm{ml} \)를 가하여 다시 1시간 교반시키고 \( 35 \mathrm{~mm} \) petridish 배양용기에 3000개의 세포를 분주하고 매일 성장배지를 교환하였다.</p><h2>배양연골세포의 반월판내 이식</h2><p>배양 25일의 연골세포는 시간경과에 따라서 \( 0.05 \% \) Trypsin-\( 0.53 \mathrm{mM} \) EDTA용액을 사용하여 세포를 분리하고 \(800\mathrm{g}\)에서 10분간 원심분리하여 세포 pellets을 만들어 이식하였다. 배양된 연골의 이식을 위하여 수술하기전 3일 동안 genamycin \( 1.5 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \), mezlocillin \( \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) oxazillin \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{km} \)을 근육주사 한다. 토끼는 염산 케타민(유한양행) \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \)으로 마취시킨 후 오른쪽 무릎의 외측 반월판을 노출시키고 반월판을 동물용 생검 펀치를 이용하여 원형으로 절단해내고 배양한 연골조직을 넣어 무릎을 봉합하였다.</p><h2>광학현미경용 조직표본의 제작</h2><p>광학현미경용 조직은 neutral buffered formalin (\(\mathrm{pH} 7.4\))으로 고정하고 ethyl alcohol과 xylene을 이용하여 탈수와 청명과정을 거친 후 파라핀으로 포매하였다. 조직절편은 \( 6 \mu \mathrm{m} \)으로 자르고 탈파라핀 하여 함수시켰다. 일반적인 조직학적인 소견은 toluidin blue 염색을 시행하였고, type Ⅱ collagen에 대한 면역조직학적 염색은 DAKO LSAB Kit를 이용하여 염색하였다.</p><h2>전자현미경용 조직표본의 제작</h2><p>실험군별로 이식한 연골편을 채취하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 생리식염수(중외제약)에 5분간 담구어 혈액을 완전히 제거하었다. 조직의 고정은 전고정으로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)의 \( 2 \% \) glutaraldehyde-phosphate buffer (\(\mathrm{pH}7.4\)) 용액으로 처리하였다. 후고정은 \( 1 \% \) osmium tetroxide-phosphate buffer로 1 시간 동안 deep black이 될 때까지 처리하였다.</p><p>탈수는 Ethyl Alcohol을 사용하였으며 청명과 수지침투과정은 propylene oxide와 polyresin을 이용하여 beem capsule에 포매하고 dry oven에서 중합시켜 블럭을 만들었다. 전자현미경 관찰을 위하여 금색이나 회색을 띠는 초박절편을 200 mesh의 구리 그리드에 얹어 uranyl acetate-lead citrate 이중 전자염색을 시행하였으며 \( 100 \mathrm{kv}\), \(61 \mu \mathrm{A} \) 상태의 투과전자현미경(JEOL 1200EX Ⅱ)으로 5000배에서 주로 관찰하였다.</p><h1>결과</h1><h2>성장판 연골세포의 배양과 증식능</h2><p>성장판으로부터 분리한 연골세포는 배양 2일째에는 대부분 원형인 상테로 즌재하였고 소수의 세포들만이 돌기를 내어 삼각형이나 다가형의 별모양을 하고 있었다. 배양 4일째에는 대부분의 세포들이 돌기를 가지고 있었으며 바닥에 부착하였다. 배양 6일째에는 대부분의 세포들이 무딘돌기를 가진 불규칙한 다각형모양으로 배양용기의 바닥에 부착되어 있었다. 배양 8일째에는 세포의 증식이 현저하여 방추형 혹은 추체형을 나타내었다.</p><p>배양 10일째에는 연골세포들이 서로 돌기들에 의해서 바닥면에서 맞물고 있어서 세포질은 두드러지지 않았으나 세포경계가 주름모양의 선상으로 두드러져 보였다. 배양 18일째에는 연골세포들이 수없이 많은 가늘고 긴 돌기들을 내어 그물 같이 서로 연결되어 선명하게 나타났으며 세포질의 일부가 두드러져 보이기 시작하였다. 배양 22일째에는 더 많은 연골세포의 돌기들이 입체적으로 세포질보다 더 두드러지게 엉켜붙어 있어서 전체적으로 세포질부분이 함몰되고 돌기들이 그물같은 모습으로 더 튀어나와 있었다.</p><p>배양 24일째에는 연골세포들의 수가 늘어나고 세포질의 두께가 두꺼워지면서 원형으로 함몰된 핵부위가 관찰되는 전형적인 연골세포들이 부분적으로 모이면서 절(nodules)을 형성하기 시작하였다. 배양 26일째에는 대부분의 세포질이 두꺼워지면서 대부분 원형의 핵부위가 함몰되어 오목하게 보였으며 세포들이 모여서 절을 형성하였다. 배양 33일째에는 전반적으로 세포질의 두께가 두드려져 상대적으로 핵이 묻히면서 핵의 크기가 감소된 것으로 보였다.</p>
어떤 것을 neutral buffered formalin (\mathrm{pH} 7.4pH7.4)으로 고정하였는가?
광학현미경용 조직