<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>Lipase 유전자중 원핵생물(procaryote)이 보유하고 있는 lipase 유전자 염기서열만을 대상으로 분석하였다. 분석에 이용된 lipase 유전자의 염기서열은 NCBI 산하의 Genbank 등에서 추출(parsing)하였다. LED를 경유하여 125개 그리고 COG를 경유하여 24개의 염기서열을 추출하여 총 149개의(Table 1) 서열을 분석하였다.</p><p>LED (http://www.led.uni-stuttgart.de/) 는 EMBL (Euro-pean Molecular Biology Laboratory, http://www1.embl-heidelberg.de/), DDBJ (DNA DataBase of Japan, http:// www.ddbj.nig.ac.jp/), GB (GenBank, http://www.ncbi. nlm.nih.gov/), SP (SWISS PROT, http://www.expasy. org/sprot/), PIR (Protein Information Resource, http://pir.georgetown.edu/), PDB (Protein Data Bank, http:// www.rcsb.org/pdb/) 등에서 lipase 관련 자료를 취합한 공개용 대이터베이스이다. Lipase를 22개의 상동성그룹 (homology family)와 11개의 superfamily로 분류해 놓은 LED 데이터베이스에서 염기서열 추출 대상을 선정하였다. 선정된 Bacillus sp., Burkholderia sp., Moraxella sp.,Mycobacterium sp., Pseudomonas sp., 그리고 Staphylococcus sp. lipases와 non-heme peroxidases superfamily에 해당하는 염기서열을 NCB의 공개용 데이터베이스에서 구하였다. 이 때 원핵생물과 진핵생물의 lipase들로 구성된 상동성그룹에서는 원핵생물의 lipase만 대상으로 하였다.</p><h2>서열정렬 (sequence alignment) 및 보존적 영역 탐색</h2><p>LED 와 COG를 매개로 획득한 lipase 염기서열과 아미노산 서열들을 ClustalW의 윈도우 인터페이스인 ClustalX (ver. 1.64b)를 이용하여 정렬하였다. Gap opening penalty GOP와 Gap extension penalty (GEP)는 아미노산 \(( \mathrm{GOP}= 8\), \(\mathrm{GEP}=2 )\)과 염기 \(( GOP=3\), \(GEP=1 )\)에 대하여 다르게 설정하였고 가중치 매트릭스로는 아미노산의 경우 BLOSUM30을 그리고 핵산의 경우에는 IUB를 아용하였다. 그 외의 parameter는 Clustal 프로그램의 기본값을 이용하였다. 이 후 manual alignment로 Clustal 프로그램 정렬결과를 검증 하고 보완하여 여러 lipase 사이에 존재하는 보존적인 염기 서열과 아미노산 서열을 추적하였다.</p><h2>Phylogram 작성</h2><p>염기서열정렬 결과를 이용하여 neighbor joining method로 각 염기서열간의 유사성을 조사하여 계통도(phylo-gram)를 그렸고 이때 bootstrap method \( (n=1000) \)를 이용하였다.</p><h2>PCR primer 설계</h2><p>새로운 lipase 유전자 후보군의 확인과 cloning에 필요한 PCR primer는 염기서열정렬을 통하여 확보된 자료를 바탕으로 하였다. 각 그룹별로 정렬된 lipase 유전자들의 3'-말단과 5'-발단 영역에서 정렬대상 lipase 유전자 전체 혹은 다수를 증폭시킬 수 있는 염기서열을 확보하고 PCR primer를 설계하였다. 정렬을 끝낸 각 lipase 그룹에서 공통적으로 보이는 염기서열들을 보존적 영역으로 간주하고, 17개 이상의 연속된 염기서열에서 3개 이하의 차이를 보이는 경우 각 lipase 그룹을 증폭시킬 수 있는 primer 후보군 으로 간주하였다. 이후 primer dimer 형성여부와 oligonucleotide melting temperature을 고려하여 선택하였다. 선택된 primer 등을 NCBI의 BLAST search (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)를 통하여 lipase가 아닌 다 른 염기서열까지 증폭시킬 수 있는 지 확인하였다.</p>
LED 와 COG를 매개로 어떤 것들을 얻었어?
lipase 염기서열과 아미노산 서열들