<h2>Affinity chromatography와 Preparative PAGE Cells에 의한 LDH 동위효소의 정제</h2><p>Oxamate-agarose gel은 \( \mathrm{O}^{\prime} \mathrm{Carra} \) 의 방법을 변형하여 준비하였고 column \( (25 \times 85 \mathrm{~mm}) \) 은 \( 0.20 \mathrm{mM}\) NADH 를 함유한 \( 0.05 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.85, buffer) 로 평형 시킨 후 affinity chromatography (Econo System, Bio-Rad)를 실시하였다. Pyruvate와 유사한 oxalate를 sepharose에 결합시킨 oxamate-linked sepharose gel에 \( 0.5 \mathrm{M} \mathrm{KCl} \) 과 \( 0.2 \mathrm{mM} \) NADH 를 첨가한 골격근, 심장, 눈 및 뇌 조직을 합한 조직액 \( 10 \mathrm{ml} \) 를 유입시키고, \( 0.2 \mathrm{mM}\) NADH를 함유한 buffer \( 100 \mathrm{ml} \)로 씻었다. 이어 \( 1.6 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{I} \mathrm{NAD}^{+} \) 를 함유한 buffer \( 80 \mathrm{ml} \) 를 유입시키고, 이어 buffer \( 110 \mathrm{ml} \) 를 유입시켰으며, 용출액을 \( 1.6 \mathrm{ml} \)씩 분획하였다. 각 분획은 cellulose acetate strip에 점적하여 LDH 활성이 있는 분획을 확인한 후 LDH 동위효소의 활성을 측정하고, 단백질을 정량하여 정제 그래프를 그렸다. LDH 활성이 확인된 분획은 native-PAGE하였고, 단일 동위효소가 확인된 분획은 Amicon (PM-10)으로 농축한 후 전기영동으로 재확인하고 정제 용액으로 사용하였다. 그리고 동위효소가 섞인 분획들은 합하여 농축시킨 후 Preparative PAGE Cells로 동위효소를 분리하였다.</p><p>Preparative PAGE Cells (Prep Cell Model 491, Bio-Rad)은 \( 4 \% \) acrylamide separation gel과 stacking gel을 5:1로 섞어 만든 gel \( (28 \times 50 \mathrm{~mm}) \) 에 시료 \( 5 \mathrm{ml} \) 와 buffer \( (0.0625 \mathrm{M} \) Tris-HCl, \( \mathrm{pH} 6.8 \), \(10\%\) glycerol, \( 0.025 \% \) bromophenol blue)를 1:1(v/v) 로 섞은 용액을 가하고, \( 0.025 \mathrm{M} \) Tris-glycine buffer ( \( \mathrm{pH} \) 8.3)로 \( 460 \mathrm{~V}, 40 \mathrm{~mA} \) 에서 실시하였다. Buffer를 \( 0.75 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 로 유입시키면서 \( 2 \mathrm{ml} \) 씩 분획하였고, 각 분획에 대해 효소활성 측정 및 단백질 정량을 실시하였고, elution profile을 작성하였으며 LDH 활성이 확인된 분획은 native-PAGE하고 동위효소가 정제된 분획만 농축시켜 시료로 사용하였다.</p><h2>LDH 동위효소들의 기질의존성 측정</h2><p>정제한 LDH\( \mathrm{A}_{4}, \mathrm{~A}_{2} \mathrm{~B}_{2}, \mathrm{~B}_{4} \) 및 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 피루브산 \( 0.1-10 \mathrm{mM}\)에서 LDH 활성을 측정한 후, 최대 활성에 대한 상대 활성(\(\%\))을 구하여 기질농도에 의해 저해되는 정도를 확인하였다. 또한 피루브산 \( 10-500\mu \mathrm{M} \) 에서 LDH 활성을 구하여 Lineweaver-Burk plot에 의해 \( \mathrm{Km}^{\text {PYR }} \) 을 구하였다.</p><h2>LDH 의 최적 \( \mathrm{pH} \)</h2><p>정제한 LDH\( \mathrm{A}_{4}, \mathrm{~A}_{3} \mathrm{~B}, \mathrm{~A}_{2} \mathrm{~B}_{2}, \mathrm{AB}_{3}, \mathrm{~B}_{4} \) 및 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate buffer \( (\mathrm{pH} 4.0,4.5,5.0) \), \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium citrate buffer \( (\mathrm{pH} 5.5) \), \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.0,5.7.0) \), \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer \( (\mathrm{pH} \) \( 7.5,8.0,8.5), 0.1 \mathrm{M} \) Tris-glycine buffer \( (\mathrm{pH} 9.0) \) 및 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium carbonate buffer \( (\mathrm{pH} 9.5,10.0,10.5) \) 에 12시간 반응시킨 후 LDH 활성을 측정하였고, 최대 활성에 대한 상대 활성\((\%\))을 구하여 최적 \( \mathrm{pH} \) 를 확인하였다.</p>
씻어 낸 buffer의 양은 얼마야?
\( 100 \mathrm{ml} \)