<h1>재료 및 방법</h1><h2>267B1 세포의 배양 및 TSA의 처리</h2><p>본 연구에 사용된 267B1 인체 전립선 상피세포는 Georgetown 대학의 Dr. Jung에게 제공받았으며, 선행연구 방법에 제시된 바와 같이, \( 90 \% \) 의 RPMI-1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY) 에 \(10\%\) fetal bovine serum (FBS), \( 1 \% \)의 penicillin 및 streptomycin (Biofluids, Rockville, MD)과 \( 0.7 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) geneticin (G418 sulfate, Sigma Chemical Co., St. Luis, MO)이 함유된 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건하에서 배양하였다. TSA는 Sigma에서 구입하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma)에 용해하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였고, 매회 처리 전 배지에 희석 후 사용하였다.</p><h2>Flow cytometer에 의한 sub-G1 세포의 빈도 측정</h2><p>TSA가 함유된 배지에서 적정시간 동안 배양시킨 267B1 세포들을 모아 고정시킨 후 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 propidium iodide (Pl, concentration, \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \); Sigma)와 10kunit의 RNase (Sigma)를 처리하여 암실, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 염색하였다. 다시 phosphate-buffered sal-ine (PBS)로 세척 과정을 거친 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) program을 사용하여 분석하였다.</p><h2>DAPI 염색에 의한 핵의 형태 변화 관찰</h2><p>준비된 세포를 \( 3.7 \% \) formaldehyde 용액으로 10분 동안 고정 후, cytospin으로 slide glass 위에 부착시켰다. PBS로 수세 후 \( 0.2 \% \)의 Triton X-100 (Amresco)을 첨가하여 상온에서 10분간 고정하였다. 그 후 다시 PBS로 수세하고 4',6-dia-midino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액으로 암하에서 15분 정도 염색시킨 후, PBS로 DAPI 용액을 충분하게 세척하고 absolute alcohol을 이용하여 탈수 및 slide glass 위에 mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 400 배의 배율로 각 조건에 따른 암세포 핵의 형태 변화를 관찰하였다.</p><h2>DNA 단편화 분석을 위한 agarose gel 전기영동</h2><p>Apoptosis가 유발된 세포에서 관찰될 수 있는 DNA 단편화 분석을 위하여 준비된 세포에 lysis buffer [\( 5 \mathrm{mM} \) tris-\( \mathrm{HCL}(\mathrm{pH} \) 7.5), \( 5 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.5 \% \) triton X-100]를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 처리하였다. 그 후 \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 에서 20분간 원심분리하고, 그 상층액에 proteinase K (sigma)를 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리하였다. 여기에 phenol:chloroform:isoamylalcohol 혼합 용액(\(25:24:1\), Sigma)을 첨가하고 30분간 rotate시킨 다음 \( 14,000 \mathrm{rpm} \)에서 1분간 원심분리하였다. 여기서 얻어진 상층액에 적정량의 isopropanol과 \( 5 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \)를 첨가하였다. 24시간 정도 냉장 보관 후, \( 14,000 \mathrm{rpm}\left(4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에서 30분간 원심분리 시킨 후 상층액을 버리고, RNase \( \mathrm{A} \)를 이용하여 pellet을 녹이고 여기에 \( 5 X \) gel loading dye (Bioneer, Daejeon, Korea)를 섞어 주었다. 준비된 시료를 \( 1.0 \% \) agarose gel을 이용하여 1시간 가량 \( 50 \mathrm{~V} \)로 전기영동 시킨 후 ethidium bromide (EtBr, Sigma)로 염색하여 ultra violet (UV) 하에서 사진 촬영하였다.</p><h2>Western blot 분석</h2><p>단백질 발현 분석을 위하여 준비된 세포들을 lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.5), \( 250 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaCl}, 5 \mathrm{~mM} \) EDTA, \( 1 \% \) NP-40, \( 1 \mathrm{mM} \) phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), \( 5 \mathrm{mM} \) dithiothreitol (DTT)]로 용해한 후(세포질과 핵 내 단백질 추출은 아래 참고), 정량하고 동량의 단백질을 SDS-poly-acrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH)으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, 특정 단백질에 대한 항체와 그에 따른 이차 항체 반응을 실시한 후 enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL)을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA) 및 Calbiochem (Cambridge, MA)에서 구입하였으며, 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled don-key anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse im-munoglobulin은 Amersham Life Science에서 구입하였다.</p><h2>In vitro caspase 활성의 측정</h2><p>준비된 세포들로부터 단백질을 추출하고 정량하여 각각 \( 150 \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 fluorogenic peptide 기질 \( 100 \mu \mathrm{M} \)이 함유 된 extraction buffer [\(40 \mathrm{~mM}\) HEPES (\(\mathrm{pH} 7.4\)), \(20\%\) glycerol \( (\mathrm{v} / \mathrm{v})\), \(1 \mathrm{~mM}\) EDTA, \( 0.2 \% \) NP-40 and \( 10 \mathrm{mM} \) DL-DTT] \( 50 \mu \mathrm{l} \)에 혼합하였으며, microtiter plate에 다시 extraction buffer에 희석하여 각 sample 당 총 volume이 \( 100 \mu \mathrm{l} \)가 되게 하였다. 실험에 사용된 기질[caspase-1, Z-Val-Ala-Asp (Z-VAD)-p nitroaniline (pNA); caspase-3, Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-pNA; caspase-8, lle-Glu-Thr-Asp (IETD)-pNA; caspase-9, Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA] 및 caspase 특이적 저해제 (caspase-1, Ac-AAVALLPAVLLALLAP-IETD-CHO; caspase-2, Ac-YVAD-CMK; caspase-3, Ac-DEVD-CHO 및 Z-DEVD-FMK)는 Calbiochem에서 구입하였다. 제공된 실험 방법에 의하여 준비된 plate를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3시간 동안 incubation 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 홉광도에 따른 반응의 정도를 비교하였다.</p><h2>Electrophoretic mobility shift assay(EMSA)</h2><p>NF-\(\kappa\)B 활성 측정을 위한 EMSA를 위하여 \( 100 \mathrm{~mm} \) dish에 \( 1 \times 10^{7} \)개의 세포를 분주하여 24시간 안정화시키고 다양한 농도의 TSA를 적정 시간 동안 처리한 후, PBS로 수세하고 pellet을 준비하였다. 준비된 pellet을 ice-cold lysis buffer (10 \( \mathrm{mM} \) Tris-Cl, \(\mathrm{pH} 7.4\), \( 3 \mathrm{~mM} \mathrm{~CaCl}_{2}\), \(2 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2}\), \(0.5 \mathrm{~mM} \) PMSF, \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) of leupeptin, pepstatin, and aprotinin, re-spectively)로 resuspend하고 일정 간격으로 vortexing하면서 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에 15분 정도 방치하였다. \( 35,000 \mathrm{rpm} \)으로 5분간 원심분리하여 핵을 수거 후, washing buffer \(10 \mathrm{~mM}\ \mathrm{HEPES}-\mathrm{KOH}\) , \(\mathrm{pH} 7.9\), \(10 \mathrm{~mM} \mathrm{~KCl}\), \(1.5 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2}\), \(0.5 \mathrm{mM} \) DTT, \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) of leupeptin, pepstatin, and aprotinin, re-spectively)를 5분간 처리하고 적정양의 hypertonic buffer (\( 20 \mathrm{~mM}\ \mathrm{HEPES}-\mathrm{KOH}\), \(\mathrm{pH} 7.9\), \(25\%\) Glycerol, \( 420 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaCl}\), \(1.5 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2}\), \(0.2 \mathrm{~mM} \) EDTA, \( 0.5 \mathrm{mM} \) DTT, \( 5 \mu \mathrm{g}/\mathrm{ml} \) of leupeptin, pepstatin, and aprotinin, respectively)를 첨가하여 40분간 반응시켰다. \( 14,000 \mathrm{rpm} \)로 30분간 원심분리 하여 얻은 핵 단백질을 정량하여 각각의 sample에 대한 \( 5 \mu \mathrm{g} \)을 EMSA에 사용하였다. 이때 사용-된 oligonucleotide NF-\(\kappa\)B probe \( \left(5^{\prime}\right. \)-CAAAACAGGGGCTTTCCCTCCTCA-3')는 Santa Cruz Biotechnology Inc. 에서 구입하였으며, binding re-action 후 \( 6 \% \) native polyacrylamide gel을 이용하여 분리 후 autoradiography에 적용하였다.</p><h2>NF-\(\kappa\)B luciferase assay</h2><p>NF-\(\kappa\)B 전사활성의 정량적 비교를 위하여 NF-\(\kappa\)B promoter의 활성에 미치는 TSA의 영향을 조사하였다. 이를 위하여 \( 1 \times 10^{6} \)개의 세포를 대상으로 \( 2 \mu \mathrm{g} \) NF-\(\kappa\)B-luciferase reporter plasmids (BD Sciences, San Jose, CA)를 Lipofectamine (Gibco BRL)을 이용하여 주어진 방법에 준하여 transfection을 실시하였다. DNA-Lipofectamine mixtures로 적정 시간 반응시킨 후, 관찰 대상 세포들에 다양한 농도의 TSA를 적정 시간동안 처리하였다. 준비된 세포들을 모아 수세하고 lysis 시켜 microplate luminometer LB96V (Perkin Elmer, Foster City, CA)를 이용하여 Promega사의 Luciferase Assay System kit를 이용하여 luciferase 활성을 분석하였다.</p>
Flow cytometer에 의한 sub-G1세포의 빈도 측저은 어떻게 하니?
형광물질인 propidium iodide (Pl, concentration, \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \); Sigma)와 10kunit의 RNase (Sigma)를 처리하여 암실, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 염색하였다. 다시 phosphate-buffered sal-ine (PBS)로 세척 과정을 거친 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) program을 사용하여 분석하였다.