<h2>PCR primer 설계와 유용성 검증</h2><p>자연계에 존재하는 미생물의 \( 1\% \) 이상을 배양할 수 없는 현재의 기술로는 유용 유전자 탐색에 한계가 있으며 이러한 한계는 분자생물학적 기술의 발달에 따른 메타게놈의 이용으로 극복할 수 있을 것이다. 메타게놈에서 유용유전자 탐색을 위해 genome library를 구축하고 screen-ing 하는 일은 많은 노동력과 시간을 필요로 한다. 한편 기존에 알려진 서열에 기초한 유용 유전자 탐색법은 이러한 수고를 덜 수 있는데 이는 PCR과 PCR-hybridization 등으로 가능하다. 본 연구에서는 새로운 lipase 유전자를 검색하기 위해 메타게놈이나 메타게놈 library에 screening method로 적용 가능한 PCR primer set를 고안하였다 (Table 3). COG0657에 속하는 24개의 염기서열에서는 uni-versal primer를 검색할 수 없었다. 기존의 lipase 유전자들에서 유래한 primer set이 알려진 lipase 유전자를 검출할 가능성도 있지만 lipase 유전자 염기서열의 다양성에 비추어보면 새로운 lipase 유전자를 중폭할 가능성 또한 높다고 할 것이다. PCR에 기초한 방법은 메타게놈 library를 이용한 expression-based system에서 검출한계 이하로 발현되어 간과할 수 있는 유용 유전자까지 검출할 수 있는 장점까지 내포하고 있다.</p><p>Table 3과 같이 총 10개의 primer set은 \( 222 \sim 713 \mathrm{bp} \) 크기의 lipase 유전자 일부를 증폭시킬 수 있는 것으로 나타났다. Non-Heme peroxidase의 경우는 \( 278 \mathrm{bp} \) 혹은 \( 286\mathrm{bp} \) 의 증폭산물이 생성될 수 있으며 Pseudomonas homolo-gous family의 primer set은 \( 708 \mathrm{bp} \)의 증폭산물도 생성될 수 있는 것으로 나타났다.</p><p>각 homologous group의 lipase 유전자 일부를 증폭시킬 수 있는 각 primer set의 효율은 \( 16.7 \% \) (Moraxella3 lipase homologous group)와 \( 60.0 \% \) (Moraxella lipase homolo-gous group) 사이였고 전체적으로는 총 125개의 실험대상 lipase 유전자중 36개의 유전자를 증폭시킬 수 있어 분석대상 lipase 유전자의 \( 28.8 \% \)를 증폭시킬 수 있는 것으로 판명되었다. 염기서열면에서 파악한 각 homologous lipase 그 룹의 다양성을 보면 Moraxella3 lipase homologous group 이 가장 높고 Moraxella lipase homologous group이 가장 낮은 것으로 판명되었다. 각 homologous group으로 구분하지 않고 전체 염기서열에 대한 분석을 수행하여도 각 그룹으로 구분한 것과 유사한 결과를 구할 수 있었다. 본 연구결과에서 도출된 primer set 들을 이용하면 개별적인 primer를 이용할 때 보다 3.6배 높은 효율로 lipase 유전자의 검출이 가능한 것으로 드러났다. 또한 lipase 유전자의 다양성을 고려하면 새로운 유전자를 메타게놈에서 탐색할 수 있는 가능성은 충분하다고 사료되었다.</p><p>Van Kampen 등은 Staphylococcus의 lipase 유전자를 cloning 하기 위하여 \( 1 \mathrm{~kb} \) 정도를 증폭시킬 수 있는 primer를 설계하였고 Amada 등은 Psedomonas genome의 lipase 유전자를 cloning 하기 위하여 \( 1.8 \mathrm{~kb} \) 정도의 산물을 갖는 PCR primer를 이용하였다. 그들은 배양가능한 균주에서 유래한 게놈을 이용하였지만 향후 메타게놈을 대상으로 연구를 수행하면 좁은 범위의 유전자를 증폭시키는 것이 보다 다양한 lipase 유전자를 탐색할 수 있을 것으로 사료된다. Ruiz 등은 Bacillus megaterium에서 새로운 lipase 유전자를 탐색하기 위해 기존의 Bacillus lipase 일부를 증폭시킬 수 있는 primer set을 이용한 후 염기서열분석을 통해 새로운 primer를 설계하고 적용하는 기법을 이용하여 전체 lipase 유전자를 cloning 하였다. 본 연구에서 설계한 Bacillus homologous lipase의 일부를 증폭시키는 primer의 \( 3^{\prime} \) 말단은 Ruiz 등이 이용한 primer set의 \( 5^{\prime} \) 말단과 겹치는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서 설계 된 primer 역시 새로운 lipase 유전자를 탐색하는데 충분한 효용가치가 있다고 할 것이다. 메타게놈 상태에서 PCR을 이용한 pre-screening으로 여러 primer set 중에서 일부만 증폭되면 genome library에서의 염기서열 추적에 높은 경제성과 신속함을 줄 수 있을 것이다. 그리고 배양을 통한 assay에서 간과할 수 있는 lipase 유전자까지도 검출할 수 있을 것으로 사료되었다.</p><p>설계된 primer set들은 degeneracy에 의해 목적 유전자 외에 다른 염기서열율 증폭시킬 가능성이 있었으므로, NCBI의 blast를 이용하여 조사하였다. Primer set 들은 원핵생물의 lipase외에 동물로는 초파리 (Drosophila sp.), 쥐, 인간의 DNA를 증폭시킬 수 있었으며 식물로는 애기장대 (Arabidopsis thaliana)의 DNA도 중폭시킬 수 있는 것으로 나타났다 (data not shown). 나머지 오염 가능성은 실험과정에서 조금만 주의하면 되지만, 인간 DNA에 의한 오염은 특히 주의하여야 할 것으로 사료되었다.</p>
많은 시간과 노동력이 필요 한 작업은 뭐야?
screen-ing