<h2>Polyacrylamide gel 전기영동: Western blotting과 면역침강반응에 의한 동위효소 분석</h2><p>Native-PAGE한 결과 조직별 LDH 활성의 차이가 나타났고, 동위효소 간의 이동거리도 크게 확인되었다. LDH\( \mathrm{A}_{4}, \mathrm{~B}_{4} \), eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 에 대한 항혈청을 사용하여 Western blotting과 면역 침강반응을 실시하여 LDH\( \mathrm{A}_{4}, \mathrm{~B}_{4}, \mathrm{C}_{4} \) 동위효소 및 진화 양상을 확인하였다. 골격근에 \( \mathrm{A}_{4} \)-항혈청을 사용하여 Western blotting 한 결과 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소가 강하게 확인되고, \( \mathrm{A}_{3} \mathrm{~B}, \mathrm{~A}_{2} \mathrm{~B}_{2}, \mathrm{AB}_{3} \) 도 흐리게 나타났다. 심장 조직에 \( \mathrm{B}_{4-} \) 항혈청을 가한 경우 음극 쪽에 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소는 강하고 \( \mathrm{AB}_{3} \)는 흐리게 나타났다. 또한 눈 조직에 \( \mathrm{C}_{4} \) 항혈청을 반응시킨 결과 양극 쪽부터 \( \mathrm{C}_{4}, \mathrm{C} \) hybrid, \( \mathrm{A}_{4} \) 및 \( \mathrm{A} \) hybrid가 모두 나타났으나 \( \mathrm{B}_{4} \) 는 확인되지 않았다. 그리고 골격근과 눈 조직에 \( \mathrm{A}_{4-} \)항혈청을 가하여 면역침강 후 PAGE 한 결과 밴드가 나타나지 않았고, 심장에 \( \mathrm{A}_{4-} \)항혈청을 가한 경우 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소만 나타났고, 심장과 눈 조직에 \( \mathrm{B}_{4-} \)항혈청을 가한경우 \( \mathrm{B}_{4} \) 와 \( \mathrm{B} \) 를 포함한 동위효소는 나타나지 않았고 \( \mathrm{A} \) 와 \( \mathrm{C} \) 를 포함한 동위효소는 약하게 확인되었다. 심장 조직에 \( \mathrm{C}_{4-} \)항혈청을 반응시킨 경우 \( \mathrm{A} \) 를 포함한 동위효소는 흐려지나 모두 확인되었고, 눈 조직에 \( \mathrm{C}_{4-} \)항혈청을 가한 경우 \( \mathrm{C}_{4} \) 와 \( \mathrm{C} \) hybrid가 없어지고 \( \mathrm{A}_{4} \) 는 약간 흐려지나 \( \mathrm{B} \) 를 포함한 밴드는 확인되었으므로 양극쪽 밴드는 \(\mathrm{CA} \) hybrid였다. 반응 결과 \( \mathrm{A}_{4} \) 는 \( \mathrm{B}_{4} \) 또는 \( \mathrm{C}_{4} \) 와 분자구조의 일부가 유사하였지만 \( \mathrm{B}_{4} \) 와 \( \mathrm{C}_{4} \) 는 서로 다른 것으로 나타났으므로, 하부단위체 \( \mathrm{A} \) 는 보존적이고, 하부단위체 \( \mathrm{B} \) 가 \( \mathrm{A} \) 보다 더 빠르게 진화된 것으로 보인다. 따라서 가물치 경우 5 개의 동위효소, \( \mathrm{A}_{4}, \mathrm{~A}_{3} \mathrm{~B}_{1} \mathrm{~A}_{2} \mathrm{~B}_{2}, \mathrm{AB}_{3}, \mathrm{~B}_{4} \) 가 모든 조직에서 확인되었고, 눈 조직에서 \( \mathrm{A}_{2} \mathrm{C}_{2}, \mathrm{AC}_{3}, \mathrm{C}_{4} \) 가 확인되고 뇌 조직에서 \( \mathrm{A}_{3} \mathrm{C} \) 가 확인되었다.</p><p>그러나 가물치 속 4 종의 LDH 를 \( 7.5 \% \) PAGE로 연구한 결과 Channa punctata는 5개 동위효소가 나타났으나, 다른 종은 Ldh-A가 우세하게 2-3개의 동위효소가 확인되었고 C. gachua 와 C. marulius에서만 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 가 확인되고 C. marulius 에서 \( \mathrm{B}_{1} \mathrm{C}_{3}, \mathrm{~B}_{2} \mathrm{C}_{2} \) 가 약하게 확인되어 물의 유용 정도에 따라 이중 공기호흡양식의 비율도 다르게 나타내 종 간, 종 내 호기적/혐기적 대사가 다르게 나타난다고 보고했으나, 본 실험의 가물치와는 큰 차이를 보였다. 본 실험에서는 \( 7.5 \% \) gel에서 LDH\( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소가 분리되지 않고 \(6.5\%\) gel에서 분리되어 5개 동위효소와 CA hybrid가 뚜렷이 나타났으며, C. marulius 에서 BC hybrid라는 결과와 Cichlidae Satanoperca aff. jurupari 눈 조직에서 \( \mathrm{A}_{4}, \mathrm{~B}_{4}, \mathrm{C}_{4}, \mathrm{BC} \) hybrid라는 보고와 차이를 나타냈다. 또한 C. punctaurs 경우 공기가 부족하면 유생은 LDH \( \mathrm{B}_{4} \) 를 일시적으로 발현하고 \( \mathrm{AB}_{3} \) 와 \( \mathrm{A}_{3} \mathrm{~B} \) 도 활성이 나타났으며, 30 일된 유생에서 \( \mathrm{A}_{3} \mathrm{~B} \) 와 \( \mathrm{A}_{4} \) 가 증가되었고, 공기호흡 성체는 혐기적 대사가 활성화되어 심장에서 \( \mathrm{A}_{4} \) 가 증가하고 회복단계에서 \( \mathrm{B}_{4} \) 와 \( \mathrm{AB}_{3} \) 와 \( \mathrm{A}_{2} \mathrm{~B}_{2}, \mathrm{AB}_{3} \) 가 증가되므로 이질사량체가 중요한 역할을 하였고, 회복 단계의 골격근에서 \( \mathrm{A}_{2} \mathrm{~B}_{2} \) 가 조절에 관여되고 근육 양과 저 산소 내성이 증가됨에 따라 LDH A활성이 증가된다는 보고와 같이 본 실험의 가물치에서 LDH A 활성이 강하고 이질사량체가 확인되었다. 또한 담수, 기수, 해양에 서식하는 Gasterosteus aculeatus 눈과 뇌 조직에서만 \( \mathrm{B}_{4} \) 가 나타나고, 저서성 어류에서 \( \mathrm{A}_{4} \) 와 \( \mathrm{B}_{4} \) 또는 \( \mathrm{A}_{4}, \mathrm{~A}_{2} \mathrm{~B}_{2} \) 및 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소가 나타날 뿐 이질사량체 동위효소는 나타나지 않았으며, \( \mathrm{A}_{4} \) 와 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소의 이동거리도 가까이 분리되어, 기능이 유사하게 진화되었다는 보고와 차이를 보였다.즉, 생명체가 어떤 조건의 환경에 적응되었는지에 따라 습성과 행동 양식이 다르고, LDH 유전자의 발현이 조절되어 LDH 동위효소가 다양하게 나타나는 것으로 볼 수 있다. 그리고 큰입우럭은 혐기적 대사인 LDH를 사용하는 젖산 경로로 에너지를 더 빠르게 공급하여 매복행동과 급작스런 추적 행동으로 먹이를 포획한다고 보고하였다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 가물치 경우 다른 종에 비해 골격근의 LDH 활성이 특히 크므로 활동성이 크고 혐기적 대사를 통해 에너지를 공급하는 것으로 볼 수 있으며, 심장 조직은 호기적 대사를 하고, 눈 조직은 LDH 활성은 적지만 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 와 \( \mathrm{AC} \) hybrid가 나타나므로, 골격근을 활용하여 활발한 유영행동을 하며 먹이 포획 시 눈 조직의 \( \mathrm{C}_{4} \) 가 빠르게 에너지를 공급하는 것으로 사료된다.</p>
어디에 \( \mathrm{B}_{4-} \) 항혈청을 가할 때 \( \mathrm{AB}_{3} \)는 음극에서 흐린 양상을 보여?
심장 조직