<h2>DGGE-PCR</h2><p>DGGE-PCR은 세균과 진균의 경우 모두 16S rRNA와 28S rRNA gene의 증폭산물을 주형으로 nested PCR과 touch down PCR을 병행하여 수행하였다. 16S rRNA gene으로 부터 DGGE-PCR을 위한 primer는 GC-clamp인 338F-GC primer (5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')와 518R primer (5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')이었으며 PCR을 위한 조건은 다음과 같다. \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분 동안 pre-denaturation 한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 denaturation 30초, \( 64 \sim 55^{\circ} \mathrm{C} \) touchdown으로 30초, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 extension 30초 과정을 30 cycle 반복한 후, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7분 동안 post-extension하였다. 28S rRNA gene으로 부터 DGGE-PCR을 위한 primer는 GC-clamp 인 GCNL-1 primer (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')와 LS-2 primer (5'-ATT AAA CAA CTC GAC TC-3') 이었으며 PCR을 위한 조건은 16S rRNA gene의 경우와 동일하게 수행하였다.</p><h2>DGGE</h2><p>DGGE는 Bio-Rad Dcode \( { }^{\mathrm{TM}} \) universal mutation detection system (Bio-Rad, USA)를 이용하였으며 권과 손에 의해 기술된 방법에 의거하여 수행하였다.</p><h2>DGGE band elution 및 sequencing</h2><p>DGGE profile에서 나타난 band는 절단하여 E-tube에 담은 후 \(100 \mu \mathrm{l}\)의 \(0.1 \times\) TE buffer를 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 overnight하였다. 용출된 밴드를 주형DNA로 사용하여 16S rRNA gene은 GC338F와 518R primer로, 26S rRNA gene은 GCNL-1, LS-2 primer를 이용하여 DNA를 증폭 하였다. 증폭된 산물은 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)로 정제 한 뒤 (주)코스모진텍에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다.</p><h2>염기서열 분석</h2><p>결정된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool에 등록되어 있는 database를 사용하여 검색하였으며, 높은 유사성을 가지는 염기서열을 기초로 하여 group별로 정리한 후, PHYDIT 운영프로그램을 이용하여 CLUSTAL_X software, version 1.64b에 의한 align-ment와 similarity를 통해 sequence data들을 비교하였다.</p>
DGGE-PCR을 진행하는 과정은 어떻게 되니?
\( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분 동안 pre-denaturation 한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 denaturation 30초, \( 64 \sim 55^{\circ} \mathrm{C} \) touchdown으로 30초, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 extension 30초 과정을 30 cycle 반복한 후, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7분 동안 post-extension