<h2>PCR을 이용한 유전자의 증폭</h2><p>각각의 넙치 시료의 mitochondria DNA를 사용하여 PCR 방법으로 ND-4와 cytochrome b 유전자를 증폭시켰다. PCR 반응액은 \( 0.1 \mu \mathrm{g} \) 의 template DNA와 \( 1 \times \) PCR 완충액 (\( 100 \mathrm{mM}\) Tris- HCl; \( \mathrm{pH}~ 8.3\), \( 500 \mathrm{mM} \) KCl, \( 15 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{MgCl}_{2} \), \( 0.01 \% \) gelatin), \( 1 \mathrm{ unit} / \mu \mathrm{l} \) pfu DNA polymerase (Qiagen, Germany), \( 200 \mathrm{mM} \)dNTP와 \( 100 \mathrm{pM} \)의 각 프라이머를 섞은 반응총액 \( 50 ~\mu \mathrm{l} \)를 반응시켰다.</p><p>PCR반응 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 동안 초기 반응 후(initial-activation), \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초(denaturation), \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초(annealing) 그리고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초(extension)의 3단계를 35회 반복하고 난 다음, 마지막 과정으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10 분(final-extension) 동안 반응시켰다(GeneAmp PCR System 6500, PE Biosystem, USA). 증폭된 PCR 산물은 \( 1 \% \) agarose gel 상에서 \( 100 \mathrm{~V} \)로 40분간 전기영동한 다음, ethidium bromide \( (0.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)에 염색하여 Image Pro-4.0 (Media Cybernetics, MA, USA) analysis system으로 분석하였다.</p><h2>Degenerating Gel Electrophoresis Scanning</h2><p>본 연구에서 이용된 DGES는 two dimensional gel electrophoresis (TDGS; C.B.S Scientific, USA) 장치를 응용하였는데 multiplex PCR 대신 여러 종류의 어류에 대한 PCR DNA를 동시에 진행하기 위하여 원래의 TDGS에서 사용하는 수평 전기영동을 생략하고 수직 전기영동만을 하기 위한 comb을 제작하여 이용하였으며, 수직 전기영동을 위한 gradient denature gel을 만들었다. Gradient gel 조성은 \( 90 \% \) urea-formamide (UF) solution ( \( 10 \% \) acrylamide/bis-acrylamide solution 37.5:1, \( 50 \times \) TAE buffer, \( 6.6 \mathrm{M} \) urea, \( 36 \% \) deionized formamide: \( \mathrm{ddH}_{2} \mathrm{O} \)를 첨가하여 \( 1 \mathrm{~l} \)를 만든다)과 \( 30 \% \) UF solution ( \( 25 \% \) acrylamide/bis-acrylamide solution, \( 50 \times \) TAE buffer, \( 2.2 \mathrm{M} \) urea, \( 12 \% \) deionized formamide: \( \mathrm{ddH}_{2} \mathrm{O} \)를 첨가하여 \( 1 \mathrm{~l} \)를 만든다)으로 만들었으며, 각각을 오른쪽 chamber에는 \( 90 \% \) UF solution \( 13 \mathrm{ml} \)을, 왼쪽 chamber 에는 \( 30 \% \) UF solution \( 13 \mathrm{ml} \)을 넣어 두 용액이 점차로 섞이면서 plate에 들어가도록 펌프를 이용하여 미리 제작된 plate에 넣고 acrylamide gel을 제작하였다.</p><p>Gel plate를 \( 1 \times \) TAE 완충액이 들어있는 DGES 장치에 각각의 PCR 산물을 적당량 \((12 \mu \mathrm{l}) \) 넣은 후 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 상에서 \( 90 \mathrm{~V} \)로 약 15시간 동안 전기영동을 실시하였는데 PCR 산물 DNA는 전기영동 중에 충분히 변성되면서 이동하였다. 전기영동이 끝난 후, gel을 ethidium bromide \( (0.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)로 염색한 후 자외선 검출기와 Image Pro-4.0 (Media Cybernetics, MA, USA) analysis system으로 분석하였다.</p><h2>DNA sequencing</h2><p>각각의 넙치 mitochondria DNA를 이용한 DGES의 결과와 비교분석하기 위하여 DGES에 사용된 PCR 생산 DNA를 순수 분리하여, DNA를 \( 0.5 \sim 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{\mu l} \) 로 농축시킨 후에, 염기서열 검색을 시행하였다(ABI 3730XI, Macrogen Co. Seoul, Korea).</p>
Primary Standard로 사용되는 Tris- HCl 몰양은 얼마나 되나요?
\( 100 \mathrm{mM}\)