<h1>재료 및 방법</h1><h2>넙치 표본 채취</h2><p>본 연구에서는 주문진 근처 동해산 넙치와 북한 해역의 넙치 그리고 경상남도 통영과 거제에서 양식된 넙치를 사용하였는데 각각의 신선한 시료의 간장을 채취하여 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 냉동 보관하였으며, 필요에 따라 일부를 적출하여 연구에 사용하였다.</p><h2>Mitochondria DNA의 추출</h2><p>각각 냉동 보관된 넙치의 간장에서 mitochondria DNA를 얻기 위하여 일반적인 세포 DNA 추출 방법을 사용하였다 (Qiagen, Germany). 약 \( 70 \mathrm{mg} \)의 간조직을 세절한 뒤, lysis 완충액 \( 9.5 \mathrm{ml}\) \((800 \mathrm{mM} \) guanidine \( \mathrm{HCl}\) ; \(30 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \), \( \mathrm{pH} ~ 8.0\) ; \(30 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \mathrm{pH}~ 8.0\) ; \(5 \% \) Tween-20; \( 0.5 \% \) Triton X-100)와 RNase \( (100 \mathrm{mg} / \mathrm{ml})\) \(19 \mu \mathrm{l} \)을 넣어 homogenize한 다음, \( 50 \mathrm{ml} \) tube에 옮기고 proteinase K ( \(20 \mathrm{mg} / \mathrm{ml})\) \(0.5 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 잘 혼합한 후, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 용해시켰으며 Genomic-tip 100/G에 여러 번 여과시킴으로서 mito-chondria DNA를 추출하였다(Blood \& Cell Culture DNA Midi Kit, Qiagen, Germany). 추출된 DNA 용액에 0.7배의 isopropanol \( (3.5 \mathrm{ml}) \)을 넣어 DNA를 침전시킨 다음, \( 75 \% \) 에탄올 \( 2 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 다시 한번 원심분리 \( (5,000 \mathrm{~g}\), 10 분, \( 4 \left.{ }^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 하였다. 원심분리 후, 침전물은 공기 중에서 건조시키고 적당량의 TE 완충액(\( 10 \mathrm{mM} \) Tris- HCl, \( \mathrm{pH} 8.5\) ; \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \mathrm{pH} 8.0)\) 을 첨가하여 DNA를 용해시켰다. 추출된 DNA는 파장 \( 260 \mathrm{~nM} \)와 \( 280 \mathrm{~nM} \)에서의 흡광도를 측정하여 농도와 순도를 확인하였으며, 정량된 DNA는 PCR의 주형 DNA로 이용하였다.</p><h2>넙치의 ND-4와 cytochrome b 유전자 검색 및 프라이머 제작</h2><p>Genbank 검색을 통하여 NADH dehydrogenase subunit 4 (ND-4, AB028664)와 cytochrome b (AF370628) 유전자에 대한 염기서열을 확인하고 약 \( 250 \mathrm{bp} \) 내외의 PCR 산물이 얻어지도록 프라이머 set를 고안하였다. 충분한 양의 DNA를 얻기 위하여 여러 부위에서 프라이머 set를 고안하였으며, DGES 전기영동에서 DNA melting이 적당한 속도로 지연되게 하기 위하여 각각의 sense 프라이머의 \( 5^{\prime} \) 말단부위에 CCCGGG 염기서열을 부착시켰다. PCR 프라이머로 고안된 염기서열은 DNA/RNA synthesizer (Applied Bio-system, USA)를 이용하여 제작한 다음, 에탄올과 \( 3 \mathrm{M} \) sodium acetate로 침전시켜 최종적으로 \( 30 \mathrm{pM} \) 농도로 만들어 사용하였다.</p>
본 연구에서는 주문진 근처 동해산 넙치와 그리고 경상남도 통영과 거제에서 양식된 넙치와 또 어디의 넙치를 사용하였는가?
북한 해역의 넙치