<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물재료</h2><p>애기장대 야생형(Col-0)을 실험에 사용하였고, MYB7 knockout 종자는 Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC)로부터 분양 받아 사용하였다. 애기장대는 생장상(16시간 명처리/8시간 암처리)에서 온도는 23-21\(^{\circ} \mathrm{C} \) 상대습도는 60 \(\% \)로 유지하며 생육시켰다.</p><h2>벡터 제작 및 식물 형질전환</h2><p>애기장대의 잎으로부터 RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 이렇게 준비된 total RNA를 SuperScript\(^{Ⓡ}\) Ⅱ (invittrogen, Carlsbad, CA, USA) 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. MYB7 (At2g16720) 과발현체의 경우 합성된 cDNA를 주형으로 MYB7영역을 PCR로 증폭하여 pCB302-3 벡터에 삽입하여 제조합 벡터를 제작하였다. MYB7-SRDX 과발현체의 경우는 MYB7 과발현체와 동일 방법으로 제작하되 말단부위에 정지코돈을 없애주고 그대신 거기에 7개의 아미노산(LDLELRL)을 추가로 연결해주어 사용하였다. 위의 방법으로 제작된 제조합 벡터들은 아그로박테리움(GV3101)을 이용하여 애기장대 내로 형질전환시켰다. 대조구로 사용한 MYB46 과발현체는 본 연구진이 기존에 제작해둔 과발현체를 사용하였다.</p><h2>식물 조직 관찰</h2><p>식물체 잎에서 리그닌 축적을 조사하기 위한 공초점 형과 이미지 측정은 Olympus사(Center Valley, PA, USA)의 FV1000 모델 현미경을 사용하였다. 일반 상토에서 3주간 생육 시킨 애기장대 잎을 이용하여 514 \(\mathrm{~nm} \)의 여기(Excitation) 파장 및 519-950 \(\mathrm{~nm} \) 범위의 방출(Emission)파장을 조사하여 형광 이미지를 획득하였다. 상기의 방법으로 잎에 분포되어있는 리그닌의 변화 정도를 자체형광(autoflruoresece)의 형광 발현을 통하여 확인하였다. 식물체 줄기에서 리그닌 축적을 조사하기 위한 이미지 측정은 Leica사(Wetzlar, Germany)의 DM500 모델 광학현미경을 사용하였다. 일반 상토에서 8주간 생육 시킨 애기장대의 줄기 횡단면 부위를 면도칼로 절단하고 여기에 2 \(\% \) Phloroglucinol-\( \mathrm{HCl} \)로 1분간 염색시키고 이를 광학현미경을 통하여 관찰하였다.</p><p>Transcriptional activation analysis 애기장대로부터 protoplast의 준비 및 reporter 및 effector 벡터의 protoplast 내부로의 삽입은 Kim 등(2013)의 방법에 따라 실시하였다. Effector 벡터의 구축을 위하여는 MYB7 및 MYB46의 cDNA를 CaMV 35S 프로모터 하류에 삽입시켰고, reporter 벡터는 4CLI 프로모터를 GUS 리포터 유전자 상류에 삽입하여 제작하였다. 4주간 생육시킨 애기장대 잎으로부터 분리한 Protoplast에 상기에 제작된 effector 및 reporter 벡터를 동시에 형질전환 시키고 상온에서 16시간 반응시킨 후 GUS 단백질에 의한 4-Methylumbelliferyl \( \beta \)-D-galactopyranoside의 분해 양상을 관찰하였다. 이때 GUS 단백질에 의한 분해 산물인 4-methylumbelliferone은 Hoefer Scientific사(Holliston, MA, USA)의 HIS TKO 100 모델로 측정하였다.</p>
실험에 사용한 애기장대는 상대습도 얼마에서 키웠어?
60 \(\% \)