<h2>CHO 세포주에서 real-time PCR을 이용한 MVM 검출</h2> <p>확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 MVM을 오염시킨 CHO 세포주에서 MVM 검출 시험을 실시하였다. T-25 flask에 배양된 CHO DG44 세포에 MVM을 인위적으로 오염시킨 후 T-25 flask에 3번 이상 계대 배양하면서 병변효과를 관찰하였다. MVM은 CHO DG44 세포주에서 병변효과를 나타내었다(Fig. 6A & 6B). 세포배양 상청액 \( 4 \mathrm { ~mL } \)을 회수하고, CHO DG44 세포를 trypsin을 처리하여 \( 4 \mathrm { ~mL } \) 부피로 회수하였다. 세포배양 상청액과 CHO 세포에서 각각 DNA를 추출하고, 확립된 real-time PCR을 활용하여 MVM을 정량 검출하였다(Fig. 6C). 세포배양액에서는 \( 6.1 \times 10 ^ { 1 } \mathrm { TCID } _ { 50 } \) equivalent/mL MVM이 검출되었고, 세포에서는 \( 5.9 \times 10 ^ { 2 } \) \( \mathrm { TCID } _ { 50 } \) equivalent \( / \mathrm { mL } \) MVM이 검출되었다. 증폭된 PCR 산물을 \( 1.5 \% \)(w/v) agarose gel을 사용하여 전기 영동한 결과 각 MVM 양성시료, 세포배양액, 세포에서 예상 크기의 밴드를 확인할 수 있었지만, 음성 대조군에서는 PCR 산물을 확인할 수 없었다(Fig. 6D).</p> <h2>Real-time PCR을 이용한 바이러스 제거 검증</h2> <p>확립된 real-time PCR을 생물의약품 분리정제공정에서 바이러스 제거 효율 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 B혈우병 치료제 factor Ⅸ 생산을 위한 Viresolve NFP 바이러스 필터 공정에서 MVM 제거 효율을 감염역가 시험법과 비교 검증하였다. 감염역가시험법으로 바이러스를 정량 분석했을 때, 바이러스가 첨가된 factor Ⅸ 용액의 MVM 총 역가는 \( 5.34 ~ \log _ { 10 } \mathrm { TCID } _ { 50 } \) 이었으나, 바이러스 필터 여과액과 인산완충용액 여과액에서는 MVM이 전혀 검출되지 않았다. Real-time PCR로 바이러스를 정량 분석하였을 때에도 바이러스가 첨가된 factor Ⅸ 용액의 MVM 총 역가는 \( 5.32 \log _ { 10 } \mathrm { TCID } _ { 50 } \) equivalents이었으나, 바이러스 필터 여과액과 인산완충용액 여과액에서는 MVM이 전혀 검출되지 않았다. 감염역가시험법으로 검증한 MVM 감소인수는 \( \geq 3.96 \)이었다. Real-time PCR로 검증한 MVM 감소인수는 6.54로 계산되었다.</p> <table border><caption>Table 3. Application of real-time PCR assay to validation of MVM clearance during Viresolve NFP filtration.</caption> <tbody><tr><td rowspan=2>Sample</td><td colspan=2>Total MVM titer</td></tr><tr><td>Infectivity titration ( \( \mathrm { Log } _ { 10 } \mathrm { ~TCID } _ { 50 } \))</td><td>Real-time PCR ( \( \mathrm { Log } _ { 10 } \mathrm { ~TCID } _ { 50 } \) equivalents)</td></tr><tr><td>Factor IX solution spiked with virus</td><td>5.34</td><td>5.32</td></tr><tr><td>Filtrate after Viresolve NFP filtration</td><td>\( \mathrm { ND } ^ {\mathrm { a } } ( \leq 1.38) ^ {\mathrm { b } } \)</td><td>\( \mathrm { ND } (-1.22) ^ {\mathrm { c } } \)</td></tr><tr><td>Post-washed solution with phosphate buffer</td><td>\( \mathrm { ND } ( \leq 1.38) ^ {\mathrm { b } } \)</td><td>\( \mathrm { ND } (-1.22) ^ {\mathrm { c } } \)</td></tr><tr><td>Reduction factor ( \( \log _ { 10 } \))</td><td>\( \geq 3.96 \)</td><td>6.54</td></tr></tbody></table>
바이러스 제거 효율에 관해서 어떻게 검증했어?
Viresolve NFP 바이러스 필터 공정에서 MVM 제거 효율을 감염역가 시험법과 비교 검증