Regulation of the activity of DnaA and its role during the cell cycle of caulobacter crescentus
The initiation of chromosomal replication must be tightly regulated so that the genome is replicated only once per cell cycle. In most bacteria, DnaA binds to the origin of replication and initiates chromosomal replication. DnaA is a dual function protein that also acts as an important transcription factor that regulates the expression of many genes in bacteria. Thus, understanding how this protein is regulated during the bacterial cell cycle is of major importance. The a proteobacterium Caulobacter crescentus is an excellent model to study the bacterial cell cycle, mainly because it is possible to isolate synchronized cell cultures and because it initiates the replication of its chromosome once per cell cycle and at a specific time of the cell cycle. This latest feature is of special interest for the major aim of my thesis work, which focused on the temporal and spatial regulation of the activity of the essential DnaA protein in C. crescentus. In Escherichia coli, the Hda protein converts ATP DnaA into ADP DnaA by stimulating the ATPase activity of DnaA, to prevent over initiation of chromosome replication. We propose that there exists a similar mechanism in C. crescentus, which is not only involved in the temporal control of chromosome replication, but also in the control of gene expression. First, we provided evidences indicating that the hydrolysis of the ATP bound to DnaA is essential for the viability of C. crescentus. Our results suggest that ATP DnaA promotes the initiation of chromosome replication, since we found that cells over expressing a DnaA protein with a mutated ATPase domain, DnaA(R357A) over initiated chromosome replication, unlike cells expressing the wild type DnaA protein at similar levels. By contrast, the DnaA(R357A) protein was less active than DnaA in promoting the transcription of three essential genes, suggesting that these may be more efficiently activated by ADP DnaA than ATP DnaA. We propose that the ATP DnaA to ADP DnaA switch down regulates the initiation of DNA replication while activating the transcription of several essential genes involved in subsequent cell cycle events. Second, we studied the role of the HdaA protein, homologous to Hda, in promoting the ATP DnaA to ADP DnaA switch in C. crescentus. HdaA is essential for viability and its depletion in the cell leads to an over replication of the chromosome, indicating that HdaA is a negative regulator of DNA replication. HdaA dynamically co localizes with the replisome. In this work, we identified DnaN, the b clamp of the DNA polymerase, as the replisome component that interacts directly with HdaA and that recruits HdaA to the replisome in live C. crescentus cells. We also showed that a mutant HdaA protein that cannot interact or co localize with DnaN is not functional, indicating that HdaA is probably activated by DnaN. However, we found that another non functional HdaA protein, mutated in the conserved Arginine finger of its AAA+ domain, was able to localize at the replisome, suggesting that the AAA+ domain of HdaA exerts its essential function after the recruitment of HdaA to the replisome. We propose that HdaA stimulates the ATPase activity of DnaA once DNA replication is ongoing, via its interaction with DnaN and the activity of the two conserved R fingers of DnaA and HdaA. Finally, we created different strains in which HdaA, DnaN or DnaA were over produced. We observed that the over production of HdaA seems to lead to a delay in chromosome replication, while the over production of DnaN had an opposite effect. Our results also indicate that the over production of DnaA may intensify the over initiation phenotype of cells depleted for HdaA. We conclude that the dynamic interplay of HdaA and DnaN in the cell contributes to regulating the ATP DnaA/ADP DnaA ratio in the cell, to ensure once per cell cycle initiation of chromosomal replication in C. crescentus. Altogether, our work provided important information on the regulation of the activity of DnaA in C. crescentus. Since DnaA, HdaA and DnaN are well conserved proteins, most of our findings are useful to understand how chromosome replication and gene expression are controlled by DnaA in many other bacterial species. L'initiation de la replication des chromosomes doit etre precisement regulee de telle sorte que le genome ne soit replique qu'une seule fois par cycle cellulaire. Chez la plupart des bacteries, DnaA se lie a l'origine de replication du chromosome et en initie sa replication. DnaA est aussi un facteur de transcription qui regule l'expression de nombreux genes bacteriens. De ce fait, il est tres important de comprendre comment DnaA est regulee au cours du cycle cellulaire bacterien. L'a proteobacterie Caulobacter crescentus est un excellent modele pour etudier le cycle cellulaire bacterien, essentiellement parce qu'il est aise d'isoler des populations de cellules synchronisees a la meme etape du cycle cellulaire et parce que cette bacterie n'initie la replication de son chromosome qu'une seule fois et a un moment precis de son cycle. Cette derniere caracteristique est particulierement pertinente pour l'objectif de mon travail doctoral, qui consistait a comprendre comment l'activite de la proteine essentielle DnaA est regulee dans l'espace et dans le temps chez C. crescentus. Chez Escherichia coli, la proteine Hda convertie DnaA ATP en DnaA ADP en stimulant l'activite ATPasique de DnaA, ce qui empeche la sur initiation de la replication du chromosome. Nous proposons qu'un mecanisme similaire existe chez C. crescentus. Il serait non seulement necessaire au controle de la replication du chromosome, mais aussi au controle de l'expression de certains genes. Dans un premier temps, nous avons mis en evidence le fait que l'hydrolyse de l'ATP lie a DnaA est un processus essentiel a la viabilite de C. crescentus. Nos resultats suggerent que DnaA ATP initie la replication du chromosome, comme nous avons observe que des cellules qui sur expriment une proteine DnaA(R357A) mutee sans domaine ATPasique fonctionnel, sur initie la replication de leur chromosome, contrairement aux cellules qui sur expriment la proteine DnaA sauvage a des niveaux equivalents. Au contraire, la proteine DnaA(R357A) etait moins active que la proteine DnaA sauvage pour promouvoir la transcription de trois genes essentiels, ce qui suggere que ces derniers sont peut etre plus efficacement actives par DnaA ADP que DnaA ATP. Nous proposons que la conversion de DnaA ATP en DnaA ADP reprime l'initiation de la replication, tandis qu'elle active la transcription de plusieurs genes impliques dans des etapes plus tardives du cycle cellulaire. Dans un deuxieme temps, nous avons etudie le role de la proteine HdaA, homologue a Hda, dans la conversion de DnaA ATP en DnaA ADP chez C. crescentus. Cette proteine est essentielle a la viabilite de C. crescentus et sa depletion donne des cellules qui sur initient la replication de leur chromosome, suggerant que HdaA est un represseur de la replication du chromosome. HdaA co localise de maniere dynamique avec le replisome. Lors de mon travail doctoral, nous avons demontre que DnaN, le b clamp de l'ADN polymerase, est l'element qui recrute HdaA au replisome in vivo. Nous avons aussi montre qu'une proteine HdaA mutante qui ne peut pas interagir ou co localiser avec DnaN, n'est pas fonctionnelle, ce qui suggere que HdaA est activee par DnaN. Nous avons neanmoins aussi isole une autre proteine HdaA non fonctionnelle, dont une arginine conservee de son domaine AAA+ etait mutee, mais qui pouvait toujours co localiser avec le replisome, ce qui suggere que le domaine AAA+ de HdaA est necessaire apres le recrutement de HdaA au replisome. Nous proposons que HdaA stimule l'activite ATPasique de DnaA qu'une fois que la replication a commence, grace a son interaction avec DnaN et aux deux arginines conservees des proteines HdaA et DnaA. Finalement, nous avons construit differentes souches sur exprimant HdaA, DnaN ou DnaA. Nous avons observe que la sur production de HdaA retarde la replication du chromosome, tandis que la sur production de DnaN a un effet oppose. Nos observations suggerent aussi que la sur expression de DnaA dans des cellules depletees pour HdaA aggrave leur phenotype de sur initiation. Nous en concluons que HdaA et DnaN collaborent etroitement et de maniere dynamique pour reguler le rapport DnaA ATP/DnaA ADP dans la cellule, pour s'assurer que la replication du chromosome ne soit initiee qu'une seule fois par cycle cellulaire chez C. crescentus. Globalement, notre travail a mis en evidence des informations importantes sur la regulation de l'activite de DnaA chez C. crescentus. Comme DnaA, HdaA et DnaN sont des proteines tres conservees, la plupart de nos decouvertes sont utiles pour mieux comprendre comment la replication du chromosome bacterien et l'expression des genes sont controlees par DnaA chez de nombreuses autres especes bacteriennes.