text: Тонкослойная хроматография — хроматографический метод, в котором в качестве неподвижной фазы используется тонкий слой адсорбента. Метод основан на том, что разделяемые вещества по-разному распределяются между сорбирующим слоем и протекающим через него элюентом, вследствие чего расстояние, на которое эти вещества смещаются по слою за одно и то же время, различается. Тонкослойная хроматография даёт большие возможности для качественного анализа и разделения веществ, поскольку и сорбент, и элюент могут варьироваться в широких пределах. Пластинки с различными сорбентами выпускаются промышленно, что делает возможным быстрое и рутинное использование метода. Разновидностью тонкослойной хроматографии является более надёжная и воспроизводимая , для которой используются специальные пластины и сложное оборудование. Тонкослойная хроматография была открыта в 1889 году, получила существенное развитие в середине XX века и до настоящего времени широко используется в фундаментальной и прикладной науке, а также фармацевтической, медицинской и пищевой сферах. История Предпосылкой к созданию метода стало использование бумажной хроматографии Кристианом Фридрихом Шёнбейном в 1861 году. Этот метод получил развитие в работах Гоппельсредера, ученика Шёнбейна, в 80-х годах XIX века. Методика в то время носила название капиллярного анализа. Работа фактически была забыта, а в 1944 году хроматография на целлюлозе была переоткрыта Консденом и др. Впервые метод тонкослойной хроматографии почти в том виде, в котором он известен сейчас, был применён голландским биологом Мартином Бейеринком в 1889 году. Изучая диффузию серной и соляной кислот в желатине, Бейеринк обнаружил, что соляная кислота перемещалась быстрее, чем серная. В своих экспериментах он детектировал зону соляной кислоты, добавляя на слой раствор хлорида серебра, а зону серной кислоты — раствор хлорида бария. В 1898 году Вийсмен применил подобный метод для определения ферментов в диастазе солода и впервые употребил флуоресцентную детекцию; чувствительность метода на то время позволила определить присутствие вещества в количестве 40 пг. Несмотря на это, и колоночная хроматография, разработанная М. С. Цветом в начале XX века, и тонкослойная хроматография фактически не использовались до 30-х годов. В 1938 году Измайлов и Шрайбер сообщили о проведении круговой хроматографии на слое оксида алюминия, нанесённом на стеклянную пластинку. При этом слои разделяемых веществ приобретали вид концентрических кругов. Исследователи продемонстрировали, что метод можно применять для испытания сорбентов и элюентов для колоночной хроматографии. Существенные успехи в разработке метода ТСХ были достигнуты Ю. Кирхнером и сотрудниками, которые в 1945—1954 годах работали над выделением пахучих веществ из цитрусовых хроматографическими методами. Убедившись в неприменимости бумажной хроматографии для их целей, они разработали метод, сочетающий преимущества бумажной и колоночной хроматографии, однако он не привлекал особого внимания до тех пор, пока не был разрекламирован фирмами Desaga и Merck. До середины 50-х годов XX века для описания метода использовали термины «хроматография на полосках», «хроматография на пластинках», «хроматография в тонких плёнках», «хроматография в открытой колонке», однако термин «тонкослойная хроматография», который был предложен Э. Шталем в 1956 году оказался настолько удачным, что вытеснил все остальные. Примерно в это же время авторитетный журнал Chemical Abstracts выделил публикации по этой теме отдельным индексом, признав его самостоятельным методом аналитической химии. Неподвижная фаза Пластинки с нанесённым адсорбционным слоем появились в продаже в 1961 году и сейчас практически вытеснили из употребления самодельные. На подложку, обычно изготовленную из стекла, пластика или алюминия, наносят сорбенты с размером частиц 10—20 мкм. Толщина слоя составляет от 100—250 мкм (для аналитических пластинок) до 2 мм (для препаративных пластинок). Стандартный формат пластинок — 20×20 см, но существуют также форматы 10×20, 5×20 и 2,5×5 см. Пластинку необходимого размера можно вырезать самостоятельно. Выпускаются также пластинки с каналами, облегчающими нанесение образцов и препятствующие их смешиванию. Пластинки с преадсорбционным слоем производят из материала с более низкой адсорбирующей способностью (целлюлоза, кизельгур). Такие слои служат для очистки образца, а также для формирования узкой полосы перед достижением образцом разделяющего слоя. Пластинки для высокопроизводительной ТСХ были предложены в 1975 году и также имеют размеры 10×20 и 10×10 см при толщине адсорбционного слоя в 200 мкм. Такие пластинки обладают повышенной разрешающей способностью, более низким пределом обнаружения, требуют меньше растворителя для элюирования. В 1995 году появились улучшенные высокопроизводительные пластинки со сферическими частицами. В 2001 году на рынке были предложены пластинки с монолитным слоем, которые нашли применение лишь в научных исследованиях. В качестве адсорбентов исторически применялись несколько материалов: оксид алюминия (кислый, нейтральный и основный), кизельгур (очищенная диатомитовая земля), полиамиды, катионообменные смолы. Эти материалы и сегодня упоминаются в учебниках и научных статьях, однако они утратили своё значение, и их производство, в основном, остановлено. Для упрочнения пластин может использоваться связывающее вещество. Ранее для этих целей, например, в пластинках с силикагелем G, широко использовался гипс в количестве 13 массовых процентов. В современных имеющихся в продаже пластинках используются органические связывающие вещества (например, метакрилаты). В литературе описано также применение крахмала и карбоксиметилцеллюлозы. Фактически, связывающее вещество является компонентом неподвижной фазы, поэтому использование различных связывающих веществ может привести к различным результатам хроматографии. Чтобы сделать определение положений зон веществ более удобным, в адсорбционный слой могут вводить флуоресцентный индикатор. При облучении такого слоя ультрафиолетовым излучением с длиной волны 254 нм он даёт зелёное (F254) или бледно-голубое (F254 s) свечение. При этом зона вещества, поглощающего ультрафиолет, выглядит на фоне флуоресцирующего слоя тёмной. Силикагель Одним из самых важных материалов для неподвижных фаз является силикагель, он используется в более чем 90 % пластин для тонкослойной хроматографии. Силикагель получают путём осаждения кислотой из растворов силикатов или гидролизом производных кремния. Диаметр получаемых частиц зависит от условий, например, изменение pH позволяет получать силикагель с площадью поверхности от 200 до 800 м2/г. С химической точки зрения, поверхность силикагеля содержит силоксановые (Si–O–Si) и силанольные группы (Si–O–H). Силанольные группы могут быть свободными, вицинальными или геминальными. Они также могут взаимодействовать друг с другом за счёт образования водородных связей. Таким образом, силикагель характеризуется множеством варьируемых параметров, контроль которых может быть разным у различных производителей. Тем не менее, разработаны методы, позволяющие получать силикагель сферической формы с заданным размером пор. Многие марки имеют размер пор 60 Å и обозначаются как «силикагель 60». Силикагель имеет весьма высокое сродство к воде и быстро устанавливает с ней равновесие, поэтому результат, получаемый при проведении ТСХ, может в некоторой мере зависеть от влажности в помещении. Оксид алюминия Оксид алюминия является полярным неорганическим гидрофильным сорбентом. Его получают, термически удаляя воду из гидратированного гидроксида алюминия. Оксид алюминия для хроматографии обычно нагревают до невысокой температуры, получая материал с удельной поверхностью 50—250 м2/г. Сорбированная вода удаляется при температуре 250 °С. Модифицированные неподвижные фазы Силикагель может быть модифицирован тремя типами реакций: этерификацией, взаимодействием с хлорсиланом, содержащим необходимый органический заместитель, или хлорированием с последующей обработкой литийорганическим соединением. Такая модификация приводит к образованию неподвижных фаз с особенными свойствами, которые зависят от природы заместителей и способа их присоединения к силикагелю. Наиболее распространены обращённые фазы (), в которых вводимым в силикагель заместителем является алкильная цепь длиной от 2 до 18 атомов углерода. Фазы С2 вытеснили методики импрегнирования силикагеля парафином или силиконовым маслом для последующего использования в обращённо-фазовой хроматографии. Полноценные обращённые фазы содержат цепи С8 или С18. Гидрофильные фазы содержат на поверхности аминогруппы, диольные группы, нитрильные группы и могут быть использованы как в обращённо-фазовой, так и нормально-фазовой хроматографии. В нормально-фазовом режиме они обладают меньшей удерживающей способностью и нечувствительны к влажности. Такие фазы часто обладают особой селективностью за счёт основности аминогрупп или кислотности гидроксильных групп, что позволяет изменять порядок выхода компонентов анализируемой смеси. Целлюлоза Первой формой использования целлюлозы в тонкослойной хроматографии была бумажная хроматография. Доступные пластинки для ТСХ и высокопроизводительной ТСХ позволяют разделять смеси полярных веществ, при этом в качестве элюента используются, по крайней мере, тройные смеси из воды, несмешивающегося с ней органического растворителя и водорастворимого растворителя, способствующего образованию одной фазы. Подвижная фаза Подвижная фаза отвечает за перемещение образца по хроматографической системе, и её правильный выбор важен для получения оптимальных результатов. В качестве подвижной фазы ТСХ позволяет использовать как индивидуальный растворитель, так и сложные смеси. При проведении хроматографии на силикагеле обычно используют смеси органических растворителей. В обращённо-фазовой хроматографии применяют смесь воды с органическим растворителем. В обоих случаях подвижная фаза может быть охарактеризована двумя параметрами: силой растворителя, определяющей степень подвижности компонентов образца по сорбенту, и селективностью, влияющей на порядок зон веществ. Минимальным требованием к подвижной фазе является по крайней мере частичная растворимость в ней образца. Сила растворителя Сила растворителя — это параметр, определяющий способность подвижной фазы перемещать вещества по сорбенту. Так, слабый растворитель не способен сдвинуть зону вещества с точки нанесения, а сильный, напротив, смещает зону вещества практически с линией фронта. Подходящий элюент сдвигает вещество примерно на 1/3 от общего расстояния, преодолённого элюентом. В случае силикагеля более сильными являются полярные растворители, а более слабыми — неполярные (эта зависимость отличается для различных сорбентов). Количественное описание силы растворителя даётся параметром E°, который может быть определён как адсорбционная энергия растворителя на единицу стандартного сорбента. На практике расстояние, проходимое веществом, не может быть рассчитано на основе данного параметра, однако возможна относительная оценка: при большем значении E° для элюента вещество проходит больший путь, и наоборот. Для обращённых фаз ситуация противоположная. Расстояние миграции зоны вещества связано также с его полярностью: более полярные вещества сильнее взаимодействуют с силикагелем и движутся медленнее, в то время как неполярные проявляют более слабое взаимодействия и мигрируют дальше. Подходящий элюент определяют экспериментально. Например, образец может быть отхроматографирован в этилацетате. Если сила этилацетата слишком высока, необходимо перейти к менее полярному растворителю или использовать смесь этилацетата с менее полярным растворителем (например, гексаном). Если же сила растворителя слишком низка, то можно провести эксперимент с более полярным растворителем или повысить силу этилацетата добавлением метанола. Качество растворителей В тонкослойной хроматографии существенную роль может играть качество используемых растворителей. Рекомендуется применять растворители по крайней мере аналитической чистоты, поскольку содержащиеся в элюенте примеси могут взаимодействовать с сорбентом или растворённым веществом. Некоторые растворители при хранении подвергаются автоокислению. Растворители при хранении в металлических ёмкостях могут разлагаться или вступать в иные реакции. Значительно влияет на воспроизводимость содержащаяся в растворителе вода, количество которой может меняться со временем, что приводит к изменению силы элюента. Например, кроме иных примесей, хлороформ часто содержит в качестве стабилизатора этанол, даже малые количества которого могут значительно повлиять на результат хроматографии. Проведение эксперимента Приготовление образца Для правильного приготовления образца необходимо выбрать репрезентативную порцию материала. Обычно для этого необходимо полностью растворить его в подходящем растворителе. Иногда растворить весь образец не удаётся: в этом случае необходимо убедиться, что растворены по крайней мере необходимые вещества. Наличие в веществе большого количества примесей или матрицы может ухудшить результаты анализа или разделения, поэтому предварительно может применяться этап очистки образца методами экстракции. Этот шаг реализуется при использовании пластинок с преадсорбционным слоем, который задерживает полярные компоненты матрицы. По сравнению с колоночной, тонкослойная хроматография менее чувствительна к примесям, поскольку колонки необходимо отмывать перед нанесением новых образцов, а пластинки для ТСХ используются только один раз. Подготовка пластинок Иногда перед постановкой ТСХ пластинки подвергают дополнительным этапам подготовки. Предварительная отмывка пластинок служит для их очистки от сорбированных примесей и проводится обычно погружением в метанол либо элюированием пустой пластинки в этом элюенте (в последнем случае эффективность отмывки выше). Активация предназначена для удаления связанной воды со слоя сорбента. Она проводится путём нагревания пластинок в течение 30 минут при 120 °C (для пластинок с силикагелем). Более сильное и продолжительное нагревание может привести к удалению химически связанной воды и необратимому изменению свойств хроматографического слоя. По сравнению с неактивированными пластинками, активированные пластинки обладают бо́льшими удерживающими свойствами, подвижность веществ на них замедляется. Прекондиционирование представляет собой помещение активированной или неактивированной пластинки в атмосферу заданной влажности или газового состава для того, чтобы хроматографический слой сорбировал то или иное количество воды или другого компонента атмосферы (например, паров элюента). Этот процесс неконтролируемо происходит в сосуде для элюирования, содержащем необходимый растворитель, однако существуют приёмы, позволяющие проводить направленную сорбцию на пластинке. Для этого, например, используются насыщенные растворы некоторых солей, атмосфера над которыми имеет определённую влажность. Наконец, полезным может оказаться импрегнирование пластинок органическими или неорганическими веществами для изменения сорбционных свойств слоя. Оно проводится погружением, опрыскиванием или предварительным элюированием импрегнирующим раствором. Типичным примером использования импрегнированного силикагеля в тонкослойной хроматографии может служить анализ ненасыщенных органических веществ на силикагеле, содержащем ионы серебра. Нанесение образца Нанесение образца на пластинку существенно влияет на качество получаемого результата. Так, разделение компонентов смеси зависит от размеров нанесённой зоны в направлении проведения хроматографии, а сравнивать образцы по их подвижности можно лишь при позиционно точном нанесении зон на пластинку. При проведении количественного анализа необходимо наносить точно измеренные объёмы растворов веществ. Существует два способа нанесения образца: ручной и автоматический. В случае ручного нанесения на пластинке карандашом отмечают точки, лежащие на отрезке, параллельном нижнему краю пластинки, и отстоящем от него на такое расстояние, чтобы точки не погружались в элюент. Число точек должно быть равно числу анализируемых образцов. Затем на отмеченные точки при помощи микрокапилляров наносят раствор анализируемого образца, объём которого обычно ограничен 5 мкл в случае ТСХ и 1 мкл в случае высокопроизводительной ТСХ. Большие объёмы растворов наносят несколькими касаниями, высушивая между ними пластинку от растворителя. При этом растворитель, в котором находится образец, должен иметь как можно меньшую полярность, поскольку при нанесении происходит круговая хроматография, которая может приводить к распространению и разделению компонентов образца. Автоматические и полуавтоматические системы для нанесения образцов используют принцип спрея. Раствор набирается в иглу шприца, игла затем точно позиционируется над поверхностью пластинки, и поршень выдавливает заданный объём раствора. Растворитель удаляется путём обдувания сжатым воздухом или азотом. Технология позволяет создавать узкие зоны веществ, что способствует максимальному разрешению. Нанесение веществ возможно также в виде точек либо прямоугольных зон, а наносимые объёмы могут варьироваться от нескольких нанолитров для высокопроизводительной ТСХ до сотен микролитров для препаративной ТСХ. В последнем случае техника позволяет создать однородную вытянутую зону вдоль всей пластинки. Элюирование После нанесения раствора исследуемой смеси веществ пластинка помещается в сосуд, в котором на дне налит слой элюента. При погружении нижнего края пластины в жидкость элюент под действием капиллярных сил начинает подниматься вверх по хроматографическому слою. Чтобы избежать испарения летучего элюента с поверхности пластинки в процессе хроматографирования, сосуд герметизируют. После того, как линия фронта достигнет достаточной для анализа высоты, пластинку извлекают и высушивают. Расстояние, проходимое линией фронта, принято отсчитывать от линии старта. Его выбирают достаточным для последующей идентификации разделённых веществ на поверхности пластинки. Разделение компонентов смеси улучшается с увеличением этого расстояния, но существует оптимальное значение, которое для обычных пластин составляет 12—15 см. Это обусловлено тем, что капиллярные силы действуют на линии фронта смачивания, и подвижная фаза по мере продвижения по хроматографическому слою испытывает всё меньшее воздействие капиллярных сил из-за уравновешивания их силой тяжести. При проведении хроматографии для продвижения фронта на оптимальную длину требуется, в зависимости от вязкости элюента, от 45 до 150 минут. В высокопроизводительной ТСХ упаковка частиц хроматографического слоя плотнее, оптимальная дистанция составляет приблизительно 6 см, а элюирование занимает от 15 до 50 минут. Существуют различные способы элюирования образцов на пластинках. Наиболее распространён способ с вертикальной пластинкой и поднимающимся элюентом: он даёт приемлемые результаты для большинства целей. Существуют также сосуды, позволяющие направлять подвижную фазу горизонтально. Результаты в этом случае сравнимы со стандартными, но преимущество состоит в том, что подавать элюент можно одновременно в двух встречных направлениях, что позволяет удвоить число образцов (на высокопроизводительной пластине размером 20×10 см можно разделить одновременно 72 образца). Круговая и антикруговая хроматография, при которой движение элюента происходит от центра к периферии или наоборот, применяется весьма ограниченно, например, при подборе растворителя для хроматографии. Многократное элюирование применяется, когда однократное не позволяет эффективно разделить компоненты смеси. При повторном элюировании в одной и той же системе растворителей оптимизация происходит за счёт концентрирования неправильно нанесённых зон веществ. Можно также предварительно провести элюирование в очень полярном растворителе в течение небольшого времени, что позволит сконцентрировать вещества на слое. Предварительное элюирование в неполярном растворителе позволяет удалить неполярную матрицу из объекта. Двумерное элюирование содержит два последовательных элюирования в перпендикулярных направлениях. После первого элюирования пластинка извлекается, просушивается, и линия, на которой расположились разделённые компоненты, становится линией старта во втором элюировании. При этом можно пользоваться двумя элюентами различной силы, а также одним и тем же элюентом, что полезно для оценки устойчивости вещества в хроматографическом эксперименте. Визуализация После элюирования разделяемые вещества смеси оказываются расположенными на поверхности пластинки в определённых положениях. Для определения их положений на пластинке предложен ряд методов. Если вещество окрашено, то положение пятна определяют визуально невооруженным глазом, какая-либо дополнительная обработка реактивами или визуализация иными методами не требуется. Однако большинство органических соединений бесцветны. Если вещество поглощает в ультрафиолетовой области, то оно визуализируется на пластинке с флуоресцентным индикатором F254 под ультрафиолетовым излучением (пятна таких веществ на пластинке выглядят либо тёмными, либо флуоресцирующими). Широко применяются более или менее селективные химические методы визуализации, в которых реагент или раствор, который используется для визуализации, называют проявителем. Например, простейший метод заключается в обработке парами иода, при этом сорбированные вещества становятся тёмно-коричневыми, а фон остаётся светлым. Универсальные методы основаны на применении растворов различных кислот или окислителей, при нагревании с которыми вещества определённых классов образуют коричневые или чёрные пятна. Селективные реагенты, например, нингидрин, позволяют визуализировать соединения конкретного класса — амины и аминокислоты. Другим проявителем для обнаружения аминов и алкалоидов служит реактив Драгендорфа. Хроматографические тонкослойные пластинки также могут быть использованы в биологических тестах для выявления веществ с биологической активностью к микроорганизмам методом посева культур микроорганизмов в питательной среде на пластины. Оценка результатов Визуальное сравнение подвижности и характера визуализации (цвета, флуоресценции) образца и неких стандартов даёт информацию о природе анализируемого вещества, а интенсивность зоны характеризует его количество. Вещества могут также быть смыты с хроматографического слоя для дальнейшего анализа другими методами. Количественная оценка в высокопроизводительной ТСХ проводится по цифровым изображениям после проведения эксперимента согласно стандартизированным методикам. Сканирующая денситометрия даёт информацию о спектральных свойствах веществ на пластинке. Для повышения точности анализа применяется сравнение спектров с записями баз данных, а также масс-спектрометрия разделённых веществ. Количественная оценка также проводится при помощи сканирующего денситометра. Теория тонкослойной хроматографии Поток растворителя Поток подвижной фазы через слой в тонкослойной хроматографии вызван действием капиллярных сил. Движение фронта жидкости можно описать квадратичной зависимостью: <p align="center"> где zf — расстояние от линии погружения до линии фронта, t — время элюирования, а κ — постоянная потока, или коэффициент скорости. Эта зависимость была установлена в 1856 г. инженером Анри Дарси, который исследовал скорость проникновения почвенных вод через пористую поверхность. Уравнение показывает, что скорость миграции фронта гиперболически убывает с увеличением пути миграции. Так, например, при заданном значении κ = 3,3 см2/с миграция фронта на 10 см занимает 30 минут, а на 15 см — 68 минут. Постоянная потока κ определяется диаметром частиц сорбента, а также отношением поверхностного натяжения элюента к его вязкости. Сорбированная на слое вода часто связывается со слоем более сильно, чем компоненты элюента. В таком случае попавшая в слой вода снижает пористость слоя и увеличивает скорость прохождения элюента. Если сила элюента и воды сопоставима, то элюент вытесняет воду из слоя. Изотерма сорбции Любой хроматографический процесс основан на перераспределении вещества между подвижной и неподвижной фазами. Это равновесие связано с температурой, причём при её повышении доля вещества в подвижной фазе обычно увеличивается. Для численного описания равновесия вводятся коэффициенты перераспределения: <p align="center"> где Сs и Сm — концентрации вещества в сорбирующей и несорбирующей фазах, соответственно. Коэффициент перераспределения определяет угол наклона изотермы сорбции — линейного графика зависимости между Сs и Сm при постоянной температуре. Интерес представляет случай искривлённой изотермы сорбции: в этом случае наклон кривой зависит от концентрации, и пятна на хроматограмме размываются. Для вогнутой изотермы сорбции (где K снижается при увеличении концентрации вещества) у пятна образуется «хвост». При выпуклой изотерме сорбции наблюдается противоположная ситуация: размывается передняя часть пятна. Подобные эффекты объясняются кинетическими процессами (т. н. сопротивлением массопередаче) или нелинейным характером изотермы сорбции («перегрузкой»). В сложных смесях компоненты могут влиять друг на друга и создавать условия взаимной перегрузки. В этом случае К снижается. Как правило, в аналитических приложениях нелинейность изотерм сорбции нежелательна, поскольку она приводит к размытию зон и изменению подвижностей пятен. Спрямление изотерм может быть достигнуто путём дезактивации сорбента (например, при добавлении воды или при повышении элюирующей силы растворителя). В этом случае наиболее активные сорбционные центры занимаются дезактивирующими добавками, и сорбирующий слой становится более однородным. Положение зон на пластинке Обычным и самым простым параметром, описывающим положение зоны вещества на пластинке, является фактор удерживания: <p align="center"> где zx — расстояние, пройденное зоной, а zf – z0 — расстояние от линии старта до фронта растворителя. Этот параметр легко измеряется, однако он не содержит информации об условиях хроматографического процесса. По этой причине предложены другие определения данного параметра Rf''' как относительного времени пребывания вещества в подвижной фазе либо доли молекул сорбата в подвижной фазе и др. Вычисляемое значение фактора удерживания всегда меньше единицы, поэтому для удобства введён параметр hRf, который всегда выражается целым числом и используется для количественного описания положения зоны на пластинке: <p align="center"> Как правило, расстояние, пройденное веществом, измеряют от точки старта до середины зоны вещества. Такой метод подходит для зон небольшого размера, однако в анализах чистоты фармацевтических препаратов, где загрузка вещества достигает 1000 мкг на точку, пятна часто уширяются настолько, что колебания значений hRf могут достигать 18 единиц. Кроме того, если рядом с такой точкой элюировать образец с гораздо более низкой концентрацией, то центр получившейся точки небольшого размера вряд ли точно совпадёт с центром уширенной зоны. Поэтому значение hRf иногда дают в виде интервала, охватывающего значения от нижней части зоны до её верхней части. Принципиально иным параметром является значение Rst, вычисляемое как частное от деления пути, пройденного веществом, на путь, пройденный некоторым эталонным веществом. В настоящее время этот параметр практически утратил своё значение. <p align="center"> Параметры разделения Чтобы чётко описать степень разделения двух веществ, в тонкослойной хроматографии вводится параметр разрешающей способности Rs, определяемой как частное от деления расстояния между центрами двух пятен zx2 — zx1 на ширину хроматографического пика: <p align="center"> Из уравнения видно, что чем выше расстояние между центрами пятен, тем разделение лучше, а чем шире пятна (соответственно, больше параметр σ — среднеквадратическое отклонение), тем вещества разделены хуже. При Rs'' = 0,5 расстояние между пятнами составляет σ1 + σ2 ≈ 2σ, то есть в данном случае происходит «разделение на 2σ» и перекрывается 20 % площади двух зон. При разделении на 4σ перекрывается лишь 3 % площади. Применение Выделяют три основных области применения тонкослойной хроматографии. Демонстрация основ хроматографии, быстрые предварительные эксперименты для оптимизации препаративных хроматографических разделений. Исследовательские инструменты в фундаментальной и прикладной науке, используемые для изучения большого числа образцов; комбинация планарного разделения с биологической, спектроскопической и масс-спектрометрической детекцией (в качестве замены методу колоночной хроматографии). Идентификация медицинских и пищевых растительных компонентов по валидированным методикам с повышенными требованиями к точности, воспроизводимости и чувствительности. Примечания Литература Книги Обзоры Хроматография


source: wikipedia

text: Жидкостная хроматография — хроматография, в которой подвижной фазой является жидкость. Жидкостная хроматография разделяется на жидкостно-адсорбционную (разделение соединений происходит за счёт их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности адсорбента), жидкостно-жидкостную, или распределительную (разделение осуществляется за счёт различной растворимости в подвижной фазе — элюенте и неподвижной фазе, физически сорбированной или химически привитой к поверхности твёрдого адсорбента), ионообменную хроматографию, где разделение достигается за счёт обратимого взаимодействия анализируемых ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента — ионита. Особое место в использовании методов жидкостной хроматографии занимают эксклюзионная, или гель-хроматография и аффинная, или биоспецифическая. Жидкостная хроматография как метод была открыта в 1903 году русским учёным Михаилом Цветом, который использовал для разделения растительных пигментов на их составляющие колонки, заполненные порошком мела. Предложенный Цветом метод жидкостной хроматографии был незаслуженно забыт и почти не применялся более 30 лет. Хроматография


text: Лабораторное оборудование — различные инструменты и снаряжение, используемое учёными, работающими в лаборатории для выполнения экспериментов или осуществления измерений. Лабораторное оборудование подразделяется на общелабораторное, измерительное, специализированное, испытательное и аналитическое. Хроматография Метод разделения и анализа смесей веществ, а также изучения физико-химических свойств веществ. Хроматограф; Хроматографическая колонка: Потенциометрия Метод определения различных физико-химических величин, основанный на измерении электродвижущих сил (ЭДС) обратимых гальванических элементов. pH-метр; Иономер; Ион-селективные электроды: Электрохимические методы анализа Кулонометрия; Вольтамперометрия; Кондуктометр; Оксиметр: Спектрофотометрия Физико-химический метод исследования растворов и твёрдых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200—400 нм), видимой (400—760 нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра. Фотоколориметр; Фотометр; Спектрофотометр: Спектрометрия Рентгенофлуоресцентный спектрометр; Волнодисперсионный спектрометр; Атомно-абсорбционный спектрометр: Аналитическая химия Газоанализатор: Разное Микроскоп; Лабораторная электропечь; Весы; Водоструйный насос; Автоклав; Термостат; Лабораторный газометр; Лабораторный пресс; Ультразвуковая ванна Масс-спектрометрия Непрерывные масс-анализаторы Магнитный секторный масс-анализатор (); Квадрупольный масс-анализатор (): Импульсные масс-анализаторы Времяпролётный масс-анализатор (); Ионно-циклотронная ловушка (); Квадрупольная линейная ловушка (); Масс-анализатор ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (); Орбитрэп (): См. также Лабораторная посуда Оборудование для физических экспериментов Лабораторное оборудование


text: Хроматографи́ческая коло́нка — устройство для хроматографии, используемое как для работы ручным методом, так и в составе специального агрегата, хроматографа. Принцип действия и основные характеристики В хроматографической колонке происходит разделение исходной многокомпонентной смеси на ряд бинарных смесей, состоящих из жидкости или газа-носителя (для газовой хроматографии) и одного из разделяемых компонентов. Разделение может происходить как за счёт образования временных связей между разделяемыми веществами и неподвижной фазой колонки (адсорбционная хроматография), так и по иным принципам (например, эксклюзионная хроматография). Точнее значения объёма или времени выхода каждого компонента из колонки устанавливают при калибровке. Колонка характеризуется материалом, из которого состоит неподвижная фаза, внутренним диаметром и длиной. Размеры колонок зависят от количества разделяемых веществ и типа хроматографии. На колонках разного калибра можно разделять как микрограммы, так и килограммы различных веществ. Способ применения Для набивки колонок твёрдой фазой существует два основных метода, сухой и мокрый. В первом случае колонку сначала наполняют сухим порошком, после чего пропускают подвижную фазу (жидкость или газ). Во втором случае колонку наполняют суспензией наполнителя в подвижной фазе. Если подвижная фаза является жидкой, то в обоих случаях следует предусмотреть отсутствие пузырей воздуха в готовой колонке, что может повлиять на качество хроматографии или полностью её блокировать. Кроме того, всегда существует опасность выхода колонки из строя в результате попадания в неё недопустимых веществ (нерастворимые вещества или слишком активные молекулы, забивающие канал колонки), не устранённых при пробоподготовке. В качестве твёрдой фазы могут быть использованы такие материалы, как силикагель, оксид алюминия, микрокристаллическая целлюлоза, агароза и другие материалы, в частности, приготовленные путём специальной обработки целлюлозы или агарозы для эксклюзионной, ионообменной или аффинной хроматографии. В процессе хроматографии отдельные компоненты нанесённой на колонку смеси выходят из неё с различной скоростью. Их собирают по фракциям, определяя концентрацию ожидаемых веществ в каждой фракции. Окрашенные вещества кроме того могут быть видны через стеклянные стенки колонки. См. также Изотерма сорбции Коэффициент ёмкости Коэффициент удерживания Твердофазная экстракция Дериватизация Ссылки Library 4 Science бесплатные онлайн книги по хроматографии (англ.) Хроматография Лабораторная техника


text: pH-метр (произносится «пэ аш метр», ) — прибор для измерения водородного показателя (показателя pH), характеризующего активность ионов водорода в растворах, воде, пищевой продукции и сырье, объектах окружающей среды и производственных системах непрерывного контроля технологических процессов, в том числе в агрессивных средах. В частности, pH-метр применяется для аппаратного мониторинга pH растворов разделения урана и плутония, где требования к корректности показаний аппаратуры без её калибровки чрезвычайно высоки. Схема и принцип действия Действие pH-метра основано на измерении величины ЭДС электродной системы, которая пропорциональна активности ионов водорода в растворе — pH (водородному показателю). Измерительная схема по сути представляет собой вольтметр, проградуированный непосредственно в единицах pH для конкретной электродной системы (обычно измерительный электрод — стеклянный, вспомогательный — хлорсеребряный). Входное сопротивление прибора должно быть очень высоким — входной ток не более 10−10А (у хороших приборов менее 10−12А), сопротивление изоляции между входами не менее 1011Ом, что обусловлено высоким внутренним сопротивлением зонда — стеклянного электрода. Это основное требование к входной схеме прибора. Исторически, сначала ЭДС измерялась компенсационным методом с помощью потенциометра и чувствительного гальванометра. Когда схема в равновесии, ток через гальванометр не течёт, и нагрузка на электроды не действует — по шкале потенциометра корректно отсчитывается ЭДС. Также применялся метод с баллистическим гальванометром. Сначала от электродов заряжался конденсатор, затем он разряжался на рамку гальванометра, максимальное отклонение которой пропорционально заряду конденсатора, а следовательно — напряжению. Далее появились приборы с входным усилителем на электронных лампах. Специальные («электрометрические») лампы имеют ток утечки сетки порядка пикоампер, что позволяет получать большие входные сопротивления. Недостатком таких схем является большой дрейф и уход калибровки из-за неизбежного старения и изменения характеристик лампы. Решить проблему дрейфа и одновременно высокого входного сопротивления позволили компенсационные схемы с усилителем, построенным по принципу модулятор — демодулятор. Механический ключ (вибропреобразователь) поочерёдно соединяет небольшой конденсатор с входом и цепью обратной связи. Если постоянные напряжения на них отличаются, то через конденсатор протекает небольшой переменный ток, который создаст переменное напряжение на сеточном резисторе входной лампы. Далее пульсации усиливаются несколькими каскадами, и поступают на фазочувствительный демодулятор (в простейшем случае — такой же вибропреобразователь, электромагнит которого включён параллельно электромагниту первого). На выходе получается напряжение, пропорциональное разности напряжений на входе. Цепь обратной связи (резистивный делитель) задаёт общий коэффициент усиления, стремясь поддерживать на входе усилителя нулевую разность напряжений. Эта схема практически лишена дрейфа, усиление мало зависит от степени износа ламп. Снижаются требования к самим лампам — вместо дорогих электрометрических можно применять массовые приёмно-усилительные лампы. Так работает, например, отечественный прибор pH-340. В более поздних моделях вместо контактного преобразователя применялся динамический конденсатор, позднее ключ на фотосопротивлении, освещаемом импульсами света (например иономер ЭВ-74), а лампы на входе сменились полевыми транзисторами. В настоящее время большинство прецизионных операционных усилителей с входом на полевых МОП-транзисторах, и даже простейшие АЦП удовлетворяют требованиям по входному сопротивлению. Так как ЭДС электродной системы сильно зависит от температуры, то важной является схема термокомпенсации. Изначально применялись медные термометры сопротивления, включённые в сложные мостовые схемы обратной связи, или потенциометр со шкалой в градусах, ручкой которого устанавливали значение температуры, измеренное ртутным термометром. Такие схемы имеют большое число подстроечных резисторов и крайне сложны в настройке и калибровке. Сейчас датчик температуры работает на отдельном АЦП, все необходимые корректировки вносит микроконтроллер. Примерная зависимость напряжения от pH (для системы со стеклянным и хлорсеребряным электродами) следующая. Большинство современных стеклянных электродов делают так, чтобы в паре с хлорсеребряным ЭДС была примерна равна нулю при pH = 7, то есть в нейтральной среде. При основном (щелочном) pH, (но, обычно, не более 14 — предел для стеклянных электродов) напряжение на выходе датчика варьируется от 0 до −0,41В ((14-7)* −0,059 = −0,41). Например, pH 10 (на 3 ед. выше нейтрального), (10-7) * −0,059 = −0,18В). При кислотном pH, напряжение на выходе датчика колеблется от 0 до +0,41В. Так, например, pH 4 (3 ед. ниже нейтрального), (4-7)* −0,059 = +0,18В. Две главные настройки выполняются при калибровке по буферным растворам с точно известным значением pH — устанавливается крутизна усиления и смещение нуля. Также настраивается так называемая изопотенциальная точка (pHи, Eи) — значение pH и соответствующая ему ЭДС, при которых ЭДС системы не зависит от температуры. Современные электродные системы (за исключением специальных электродов для сильных кислот и щелочей) делают с изопотенциальной точкой около pH = 7 и ЭДС в пределах +/- 50мВ. Эти характеристики указываются для каждого типа стеклянного электрода. Требования к электроду В конце 1940-х — начале 1950-х годов оборонный заказ явился стимулом интенсивных исследований в области измерительной аппаратуры такого рода. Обусловлено это было, в числе прочих причин, и тем, что особая роль в контроле реакций при различных химических процессах отводится приборам, от точности показаний которых напрямую зависит корректность всей технологической цепи; в наибольшей степени, конечно, во вредных производствах, когда снятие показаний состояния среды либо представляет опасность для здоровья, либо вообще технически невозможно (агрессивная среда, высокие температуры и давление, процессы, требующие изоляции и т. д.). Так, при ядерном синтезе и получении оружейного плутония первостепенное значение имеет выраженное количественно понимание структуры и свойств материалов, влияющих на функции, и обратимость сделанных из них стеклянных электродов — как уже отмечено, важнейших элементов этой измерительной аппаратуры. В 1951 году физикохимиком М. М. Шульцем первым термодинамически строго и экспериментально была доказана натриевая функция различных стёкол в разных областях pH, являвшаяся одной из ключевых гипотез ионообменной теории стеклянного электрода Б. П. Никольского. Это стало определяющим этапом на пути к промышленной технологии настоящих приборов, — формированию ионометрии со стеклянными, позднее — с мембранными электродами, что позволило организовать их массовое производство и сделало доступным для использования в любых лабораторных и производственных условиях. Производство первых образцов этой категории аналитической аппаратуры было налажено при участии Тбилисского СКБ «Аналитприбор» в лице его сотрудников В. А. Долидзе, Г. А. Симоняна и др., московских исследователей В. П. Юхновского, А. С. Беневольского и др., харьковских учёных В. В. Александрова, Н. А. Измайлова, — на Гомельском заводе измерительных приборов в 1959 году; и с того времени к 1967 году выпуск электродов стеклянных и вспомогательных — промышленного и лабораторного назначения, вырос с 1,5 тысяч почти до 2 миллионов штук. Количество электродного стекла всех типов, сваренного на заводе за этот же период выросло с 1 тысячи кг более чем до 200 тысяч кг. Развитие, расширение производства электродного стекла сделало доступной эту аналитическую аппаратуру. Современные измерительные электроды конструктивно бывают: со встроенным контрольным электродом и с отдельно выполненным; перезаряжаемые и неперезаряжаемые; В большинстве иностранные электроды для бытовых нужд изготавливаются в виде не перезаряжаемого датчика со встроенным контрольным электродом. Реже встречаются перезаряжаемые со встроенным контрольным электродом. Электроды советского образца чаще всего с отдельно выполненным контрольным и перезаряжаемые, что значительно снижало затраты при замене стеклянной части. Основной практический недостаток любых современных электродов заключается в постепенном накоплении микротрещин в стекле или загрязнении микропор. В случае органического и части неорганических загрязнений помогает очистка раствором соляной кислоты. Однако, в случае инертных к хлорированию загрязнений или значительном накоплении микротрещин показания датчика необратимо изменяются. Тут стоит отметить, что даже при не использовании электрода происходит изменение пористости стекла и старение. В определённом диапазоне изменения показаний электрода последние нивелируются регулярной очисткой и калибровкой. Как только возможности измерительного блока не позволят выставить калибруемое значение - электрод подлежит утилизации. Также, стоит отметить и другой недостаток использования старых или бракованных электродов. При чётких показателях в калибровочных растворах, в измеряемых растворах может наблюдаться медленный дрейф параметра. Подобное поведение после тщательной очистки и калибровки также служит показанием для замены стеклянной/мембранной части или датчика целиком. Области и методы применения Прибор может использоваться во многих производствах, где необходим контроль среды, универсальным показателем состояния которой и соответствия её требуемым — является pH: при высокотехнологичном производстве всех видов горючего, в фармакологической, косметической, лакокрасочной, химической, пищевой промышленности и мн. др.; pH-метры имеют широкое применение в научно-исследовательской практике химиков, микробиологов и почвоведов, агрохимиков, в лабораториях стационарных и передвижных, в том числе полевых, а также клинико-диагностических (для контроля физиологических норм и диагностики), судебно-медицинских. Последнее время pH-метры также широко используются в аквариумных хозяйствах, для контроля качества воды в бытовых условиях, в земледелии (особенно в гидропонике). Медицинский pH-метр, применяемый для измерения кислотности непосредственно в полых органах человека, называется ацидогастрометр. Примечания Ссылки Применение, pH метрия в гидропонике: Схема и работа самодельного электронного ph-метра — На странице представлены: простейшая схема электронного pH-метра (без термокомпенсации), который можно сделать своими руками, и графики изменения уровня pH питательного раствора. Оборудование для физических экспериментов Аналитическая химия


text: Кулонометри́я — один из электрохимических методов анализа, основанный на измерении электрического заряда, который проходит через электролизёр при электрохимических окислительно-восстановительных реакциях на рабочем электроде. Потенциал рабочего электрода при кулонометрии отличается от равновесного значения. В основе кулонометрии заложен объединённый закон Фарадея, который устанавливает связь между массой электропревращённого вещества m (г) и количеством заряда Q (Кл): где: F = 96 485,33(83) Кл·моль−1 — постоянная Фарадея; M — молярная масса вещества; z — валентное число ионов вещества (число электронов на один ион). Классификация Все методы кулонометрии разделяют на две большие группы: потенциостатические (потенциал рабочего электрода либо остаётся неизменным в течение всего времени электролиза, либо изменяется по определённому закону) и гальваностатические (остаётся неизменной в течение всего времени величина тока, текущего через рабочий электрод). Потенциостатическая кулонометрия включает в себя прямой метод (прямая потенциостатическая кулонометрия), метод внутреннего электролиза и метод весового электроанализа (электрогравиметрия). Гальваностатическая кулонометрия также объединяет в себе несколько методов: электрогравиметрию (как и в случае с потенциостатической кулонометрией), прямой метод (прямая гальваностатическая кулонометрия), инверсионный метод и кулонометрическое титрование. Применение метода Кулонометрический метод анализа используется не только для определения массы вещества, которое участвует в электрохимической реакции. Так, кулонометрия применяется для исследования стехиометрии, кинетики реакций, идентификации образовавшихся продуктов реакции, а также для изучения состава малорастворимых и комплексных веществ, разделения металлов и в фазовом анализе. Примечания Аналитическая химия


text: Вольтамперометрия — метод анализа, основанный на исследовании зависимости тока поляризации от напряжения, прикладываемого к электрохимической ячейке, когда электрический потенциал рабочего электрода значительно отличается от равновесного значения (см. электрохимическая поляризация). По разнообразию методов вольтамперометрия — самая многочисленная группа из всех электрохимических методов анализа, широко используемая для определения веществ в растворах и расплавах (например, полярография, амперометрия). Электрохимия Методы экспериментальной химии


text: Фотоколори́метр — оптический прибор для измерения концентрации веществ в растворах. Действие колориметра основано на свойстве окрашенных растворов поглощать проходящий через них свет тем сильнее, чем выше в них концентрация окрашивающего вещества. В отличие от спектрофотометра, измерения ведутся в луче не монохроматического, а полихроматического узко спектрального света, формируемого светофильтром. Применение различных светофильтров с узкими спектральными диапазонами пропускаемого света позволяет определять по отдельности концентрации разных компонентов одного и того же раствора. В отличие от спектрофотометров, фотоколориметры просты, недороги и при этом обеспечивают точность, достаточную для многих применений. Колориметры разделяются на визуальные и объективные (фотоэлектрические) — фотоколориметры. В визуальных колориметрах свет, проходящий через измеряемый раствор, освещает одну часть поля зрения, в то время как на другую часть падает свет, прошедший через раствор того же вещества, концентрация которого известна. Изменяя толщину l слоя одного из сравниваемых растворов или интенсивность I светового потока, наблюдатель добивается, чтобы цветовые тона двух частей поля зрения были неотличимы на глаз, после чего по известным соотношениям между l, I и с может быть определена концентрация исследуемого раствора. Фотоэлектрические колориметры (фотоколориметры) обеспечивают большую точность измерений, чем визуальные; в качестве приёмников излучения в них используются фотоэлементы (селеновые и вакуумные), фотоэлектронные умножители, фоторезисторы (фотосопротивления) и фотодиоды. Сила фототока приёмников определяется интенсивностью падающего на них света и, следовательно, степенью его поглощения в растворе (тем большей, чем выше концентрация). Помимо фотоэлектрического колориметра (фотоколориметра) с непосредственным отсчётом силы тока, распространены компенсационные колориметры, в которых разность сигналов, соответствующих стандартному и измеряемому растворам, сводится к нулю (компенсируется) электрическим или оптическим компенсатором (например, клином фотометрическим); отсчёт в этом случае снимается со шкалы компенсатора. Компенсация позволяет свести к минимуму влияние условий измерений (температуры, нестабильности свойств элементов колориметра) на их точность. Показания колориметра не дают сразу значений концентрации исследуемого вещества в растворе — для перехода к ним используют градуировочные графики, полученные при измерении растворов с известными концентрациями. Измерения с помощью колориметра отличаются простотой и быстротой проведения. Точность их во многих случаях не уступает точности других, более сложных методов химического анализа. Нижние границы определяемых концентраций в зависимости от метода составляют от 10−3 до 10−8 моль/л. См. также Спектрофотометр Примечания Оптические приборы Оборудование для физических экспериментов Аналитическая химия


text: Фото́метр — прибор для измерения каких-либо из фотометрических величин, чаще других — одной или нескольких световых величин. При использовании фотометра осуществляют определённое пространственное ограничение потока излучения и регистрацию его приёмником излучения с заданной спектральной чувствительностью. Освещённость измеряют люксметрами, яркость — яркомерами, световой поток и световую энергию — с помощью фотометра интегрирующего. Приборы для измерения цвета объекта называют колориметрами. Если в качестве приёмника используется глаз, фотометры называются визуальными, или зрительными, если же применяется какой-либо физический приёмник, фотометры называются физическими. Оптический блок фотометра, иногда называемый фотометрической головкой, содержит линзы, светорассеивающие пластинки, ослабители света, светофильтры, диафрагмы и приёмник излучения. Общий принцип действия визуальных фотометров Человеческий глаз чрезвычайно плохо оценивает абсолютные фотометрические величины, но весьма хорошо распознаёт границу полей с разной освещённостью, на чём и основано действие большинства фотометров визуального наблюдения. При помощи оптической системы прибора свет от источника, характеристики которого необходимо измерить, и свет от эталонного источника образуют два смежных поля. Свет одного из источников тем или иным образом ослабляется до тех пор, пока глаз не перестанет различать границу полей. В этот момент освещённости, созданные обоими источниками, считают одинаковыми. Такой метод пригоден только для источников света близкого спектрального состава, поскольку визуальное сравнение освещённостей полей разного цвета практически невозможно. Фотометры с физическими приёмниками Чаще всего в фотометрах с физическими приёмниками поток излучения преобразуется в электрический сигнал, регистрируемый устройствами типа микроамперметра, вольтметра и т. д. В импульсных фотометрах применяют регистрирующие устройства типа электрометра, запоминающего осциллографа, пикового вольтметра. В визуальном фотометре равенство яркостей двух полей сравнения, освещаемых по отдельности сравниваемыми световыми потоками, устанавливается глазом, который располагается у окуляра фотометрической головки. Интегральные фотометры Если распределение светового потока по различным направлениям несущественно, а имеет значение лишь средняя сферическая сила света, то есть значение полного потока, посылаемого источником, применяются интегральные фотометры. Одна из конструкций — шаровой фотометр Ульбрехта, представляющий собой полый шар с отверстием, прикрытым матовым стеклом, внутренняя поверхность шара максимально близка к идеально рассеивающей. Источник подвешивается внутри шара, специальный экран защищает отверстие от прямого света, и из шара, таким образом, выходит только свет, диффузно отражённый от его внутренней поверхности. В таком случае освещённость отверстия E пропорциональна полному потоку источника : Освещённость измеряется обычным фотометром, константа прибора c устанавливается из измерений со стандартной лампой. На практике используются фотометры Ульбрехта диаметром не менее 1 м, чаще больше. Применение Фотометры находят широкое применение в лабораторной практике. Например, с помощью фотометров можно определять спектр образцов, что позволяет установить их химический состав. Особый класс этих приборов — пламенные фотометры — предназначен для выявления в образцах наличия щелочных металлов (литий, натрий, калий). Для этого образец сжигается при высокой температуре, а анализ спектра пламени с помощью фотометра позволяет выявить наличие щелочных металлов в образце. Решить эту задачу другими способами гораздо труднее. В современных фотометрах световое излучение обычно преобразуется в электрические импульсы, которые регистрируются по принципу вольтметра и амперметра и затем преобразуются в компьютерный формат. Метод фотометрии — один из самых распространённых и востребованных методов химического анализа. На фотометре реализуется едва ли не половина всех имеющихся методик. Ссылки 3.2 PHOTOMETER / Language of Light, Konica Minolta Источники Фотометрия Оборудование для физических экспериментов Оптика


text: А́томно-абсорбцио́нная спектрометри́я (ААС) — распространённый в аналитической химии инструментальный метод количественного элементного анализа (современные методики атомно-абсорбционного определения позволяют определить содержание почти 70 элементов Периодической системы) по атомным спектрам поглощения (абсорбции) для определения содержания металлов в растворах их солей: в природных и сточных водах, в растворах-минерализатах, технологических и прочих растворах. Прибором для ААС служит атомно-абсорбционный спектрометр, основными элементами которого являются источник света, атомизатор, спектральный прибор и электронная система. Определение содержания элемента в пробе проводят с использованием экспериментально установленной функциональной зависимости между аналитическим сигналом и концентрацией элемента в градуировочном растворе. История Впервые спектральные линии поглощения атомов были обнаружены при изучении спектра Солнца в начале XIX века английским врачом и химиком Уильямом Волластоном, а затем и немецким физиком Иосифом Фраунгофером. Связь между видами спектров атомного поглощения и испускания и химическим составом нагретого газа была установлена немецкими учёными Робертом Бунзеном и Густавом Кирхгофом в 1859—1861 годах. С того времени спектры испускания (эмиссии) атомов стали широко применять в качественном и количественном определении элементов ПСХЭ в пробах разного состава и агрегатного состояния. Спектры поглощения (абсорбции) атомов в аналитических целях стали применять с 1930—1940-х годов для идентификации некоторых элементов в атмосферах звёзд, а также для определения содержания ртути в различных пробах и атмосфере помещений, однако они не были широко распространены в связи с тем, что отсутствовала удобная и высокочувствительная схема В 1955 году британско-австралийский физик предложил простой и легко осуществимый на практике способ количественного определения содержания элементов в растворах, распыляемых в пламя ацетилен—воздух, по поглощению излучения атомных линий от специальных селективных ламп. Этот способ, лежащий в основе аналитического метода атомно-абсорбционной спектрометрии, предопределил развитие метода в дальнейшем. В 1962 году основанная Уолшем фирма выпустила первый в мире серийный атомно-абсорбционный спектрометр АА-2. В качестве атомизатора вначале служило пламя, однако в 1960-х годах Борис Львов и Ганс Массман предложили использовать графитовую печь, которые для ААС впоследствии стали производить в промышленности. Аппаратура Приборы для атомно-абсорбционного анализа — атомно-абсорбционные спектрометры. Они представляют собой прецизионные высокоавтоматизированные устройства, которые обеспечивают воспроизводимость условий измерений, автоматическое введение проб и регистрацию результатов измерения. Основными элементами данного устройства являются: источник света, излучающий характерную узкую спектральную линию анализируемого вещества; атомизатор для перевода данного вещества в атомный пар; спектральный прибор для выделения характерной аналитической линии вещества и электронная система, необходимая для детектирования, усиления и обработки аналитического сигнала поглощения. Определение содержания элемента в пробе проводят с использованием экспериментально установленной функциональной зависимости (градуировочной функции) между аналитическим сигналом (абсорбция, оптическая плотность) и концентрацией элемента в образце сравнения. Градуировочная функция может представлять собой либо математическую формулу, либо график. Источник излучения Основными требованиями к источникам излучения, применяемым в атомно-абсорбционной спектрометрии, являются их узкополосность, высокая стабильность по частоте и интенсивности, высокая интенсивность резонансных линий, низкий уровень шумов, отсутствие сплошного фонового излучения, отсутствие спектральных наложений на резонансную линию и незначительное её самопоглощение, минимальное время установления рабочего режима и минимальный размер тела свечения (для фокусировки прибора в узких аналитических зонах). Существует несколько видов источников света. Наиболее часто применяют лампы с полым катодом, безэлектродные лампы и настраивающиеся лазеры. Лампа с полым катодом состоит из полого катода цилиндрической формы, рядом с которым находится вольфрамовая проволока — анод. Сама лампа представляет собой цилиндрический стеклянный баллон, который наполнен инертным газом. Катод лампы изготовлен из определяемого в ходе анализа элемента или его сплава. Свет необходимой длины волны, поглощаемый в атомизаторе атомами определяемого элемента, в результате излучается. Наибольшая длина волны определяется линией Cs — 852 нм, наименьшая — линией As — 193,7 нм; более короткие волны в атомно-абсорбционном анализе не используют из-за сильного поглощения их кислородом воздуха. Внутри безэлектродной лампы с помощью катушки, по которой проходит ток высокой частоты, создается сильное электромагнитное поле. В это поле помещается маленькая кварцевая ампула, содержащая летучее соединение определяемого вещества. Принцип действия аналогичен принципу лампы с полым катодом. Основной недостаток такого вида источника света — необходимость в дополнительном устройстве для питания — высокочастотном генераторе. Настраивающиеся лазеры в качестве источников излучения стали применять с 1974 года. Их применение позволяет обойтись без большого набора ламп, так как один такой лазер можно использовать для всех элементов, однако широкому его использованию препятствует дороговизна. Атомизатор Атомно-абсорбционный метод анализа основан на поглощении излучения оптического диапазона свободными атомами. В связи с тем, что в оптическом диапазоне, соответствующем энергиям валентных электронов, свободные атомы и многоатомные частицы дают различные спектры. Поэтому важнейшей предпосылкой АА определений является перевод определяемого вещества в атомный пар. Для этого используется источник высокой температуры — атомизатор. Существуют два основных метода атомизации, широко применяемых на практике: пламенный электротермический (непламенный). Пламенная атомизация характеризуется тем, что источником высокой температуры служит пламя. Атомизатор представляет собой горелку, в которую непрерывно подаются горючие газы в смеси с окислителями. В атомизатор с помощью форсунки-распылителя подаётся анализируемый раствор. Наиболее распространёнными в атомной абсорбции являются следующие составы смесей: светильный газ—воздух: пламя с температурой в интервале 1500—1800 °С; ацетилен—воздух: пламя с температурой до 2200—2300 °С (зависит от соотношения потоков ацетилен—воздух); ацетилен—закись азота: высокотемпературное пламя (до 2900 °С). Воздушно-ацетиленовое пламя применяют для определения щелочных и щелочноземельных металлов, а также Cr, Fe, Со, Ni, Mg, Mo, Sr и благородных металлов. Такое пламя обладает высокой прозрачностью в области длин волн более 200 нм, слабой собственной эмиссией и обеспечивает высокую эффективность атомизации более 30 элементов. Частично ионизируются в нём только щелочные металлы. Пламя ацетилена и оксида азота (I) имеет гораздо бо́льшую температуру, так как закись азота является термодинамически неустойчивым соединением. В пламени оно быстро распадается, высвобождая значительную дополнительную энергию, в то время как при сгорании воздушно-ацетиленовой смеси часть тепла расходуется на нагрев азота до температуры пламени. Пламя ацетилена и N2O отличается высокой прозрачностью во всем интервале длин волн, используемых в атомно-абсорбционном анализе (190—850 нм). Основными его недостатками являются сильное собственное свечение и высокая степень ионизации ряда элементов. Эти два вида пламени совместно позволяют определить около 70 элементов, когда другие типы газовых смесей имеют более узкое применение. Например, воздушно-пропановое пламя используется, как правило, только для определения щелочных металлов, Cd, Cu, Ag и Zn. Метод электротермической атомизации был разработан Борисом Львовым, который в 1959 году сконструировал первый непламенный атомизатор — графитовую кювету, а в 1961 году опубликовал данные о её аналитических возможностях. Данный метод характеризуется тем, что атомизатором служит графитовая печь (трубка, длиной 50 мм и внутренним диаметром 4—5 мм), которая нагревается электрическим током большой силы. Анализируемое вещество вводится на торец графитового электрода, который после высушивания нанесённой капли подаётся в предварительно нагретую графитовую печь через коническое отверстие в её стенке. В момент соприкосновения электрода с трубкой происходит дополнительный разогрев электрода мощным дуговым разрядом, зажигаемым между внешним концом введённого в печь электрода с пробой и вспомогательным электродом. В итоге внутри печи происходит эффективная атомизация вещества. Для того, чтобы предотвратить быстрое выгорание графита, трубку помещают в атмосферу инертного газа (аргона высокой чистоты). Позже Ганс Массман упростил конструкцию графитовой печи: его графитовый трубчатый атомизатор представляет собой открытый с обоих концов цилиндр длиной 40 мм с внутренним диаметром 6 мм и толщиной стенок не более 1,5 мм, а в центре атомизатора — отверстие для ввода анализируемого вещества. Принципиальное различие между графитовой кюветой Львова и печью Массмана заключается в том, что в конструкции Львова испарение вещества с подставного электрода осуществляется в уже нагретую до необходимой температуры полость, а в печи Массмана проба размещается на стенке холодной трубки, и последующее её испарение происходит по мере нарастания температуры стенок. Это привело к определённому кризису в применении электротермических атомизаторов в 1970-х годах. Из-за сильного влияния состава проб на результаты определений при использовании графитовой печи Массмана наблюдалась отчётливая тенденция устранить или ослабить этот недостаток. Однако в 1977 году Борис Львов усовершенствовал графитовую печь. В его новой конструкции испарение проб в печь происходило с платформы, которая получила название «платформа Львова». Максимальная рабочая температура при непламенном методе атомизации — в интервале от 2600 до 2700 °С. Принцип действия Атомно-абсорбционная спектрометрия наиболее широко разработана для работы с жидкими веществами. Исходя из этого, для проведения анализа выполняют следующие операции: Проводят пробоотбор (отбирают часть вещества от объекта анализа, которая максимально полно отражает его химический состав). От твёрдой пробы отбирают определённую навеску, растворяют её в подходящих растворителях с целью перевода изучаемого элемента в раствор. От жидкой пробы отбирают фиксированную аликвоту и подготавливают рабочий раствор для анализа по тем же принципам. Готовят серию рабочих градуировочных растворов, охватывающих необходимый диапазон градуировочного графика. Подготавливают к работе атомно-абсорбционный спектрометр для регистрации сигнала в оптимальных условиях абсорбции изучаемого элемента. Вводят анализируемое вещество в атомизатор, создают поглощающий слой атомного пара и производят измерение аналитического сигнала. Последовательно вводя в атомизатор градуировочные растворы, получают градуировочную характеристику (функциональную зависимость между аналитическим сигналом и концентрацией элемента в градуировочном растворе). С её использованием определяют концентрацию изучаемого элемента в растворе пробы и в исходной пробе. Применение Методы атомно-абсорбционной спектрометрии применяют в анализе практически любого технического или природного объекта. Современные методики АА определения позволяют определить содержание почти 70 элементов Периодической системы. Из технических объектов методами атомно-абсорбционной спектрометрии анализируют металлы, сплавы, продукты гидрометаллургической переработки руд и так далее. Например, в золоте определяют содержание серебра, свинца и меди, в почвах, удобрениях, растениях — цинк, железо, магний, медь и другие элементы. Данный метод часто используют в клинических и различных биологических анализах (кровь, сыворотка крови и другие) на определение свинца, ртути и висмута. Примечания Литература Аналитическая химия Спектроскопия


text: Оптический или световой микроско́п (от «маленький» и «рассматриваю») — оптический прибор для получения увеличенных изображений объектов (или деталей их структуры), невидимых невооружённым глазом. История микроскопа Невозможно точно определить, кто изобрёл микроскоп. Считается, что голландский мастер очков Ханс Янсен и его сын Захарий Янсен изобрели первый микроскоп в 1590 г., но это было заявление самого Захария Янсена в середине 17 века. Дата, конечно, не точна, так как оказалось, что Захарий родился около 1590 году. Возможность скомбинировать две линзы так, чтобы достигалась большее увеличение, впервые предложил в 1538 году знаменитый врач из Вероны Джироламо Фракасторо. Другим претендентом на звание изобретателя микроскопа был Галилео Галилей. Он разработал «occhiolino» («оккиолино»), или составной микроскоп с выпуклой и вогнутой линзами в 1609 году. Галилей представил свой микроскоп публике в Академии деи Линчеи, основанной Федерико Чези в 1603 году. Изображение трёх пчёл Франческо Стеллути было частью печати Папы Урбана VII и считается первым опубликованным микроскопическим символом (см. «Stephen Jay Gould, The Lying stones of Marrakech, 2000»). Десятью годами позже Галилея, Корнелиус Дреббель изобретает новый тип микроскопа, с двумя выпуклыми линзами. Кристиан Гюйгенс, другой голландец, изобрёл простую двухлинзовую систему окуляров в конце 1600-х, которая ахроматически регулировалась и, следовательно, стала огромным шагом вперёд в истории развития оптики (Гюйгенс разработал окуляр для телескопа). Окуляры Гюйгенса производятся и по сей день, но им не хватает широты поля обзора, а расположение окуляров при микроскопии неудобно для глаз по сравнению с современными широкообзорными окулярами. В 1665 г. англичанин Роберт Гук сконструировал собственный микроскоп и опробовал его на пробке. В результате этого исследования появилось название «клетка». Антони ван Левенгук (1632—1723) считается первым, кто сумел привлечь к микроскопу внимание биологов, несмотря на то, что простые увеличительные линзы уже производились с 1500-х годов, а увеличительные свойства наполненных водой стеклянных сосудов упоминались ещё древними римлянами (Сенека). Изготовленные вручную, микроскопы Левенгука представляли собой относительно небольшие изделия с одной очень сильной линзой. Они были неудобны в использовании, однако позволяли очень детально рассматривать изображения лишь из-за того, что не перенимали недостатков составного микроскопа (несколько линз такого микроскопа удваивали дефекты изображения). Понадобилось около 150 лет развития оптики, чтобы составной микроскоп смог давать такое же качество изображения, как простые микроскопы Левенгука. Так что, хотя Антони ван Левенгук был великим мастером микроскопа, он не был его изобретателем вопреки широко распространённому мнению. Недавние достижения В команде немецкого учёного Штефана Хелля (Stefan Hell) из научного сообщества Макса Планка (Гёттинген) в сотрудничестве с аргентинским учёным Мариано Босси (Mariano Bossi) в 2006 г. был разработан оптический микроскоп под названием Наноскоп, позволяющий преодолевать барьер Аббе и наблюдать объекты размером около 10 нм (а на 2010 год и ещё меньше), оставаясь в диапазоне видимого излучения, получая при этом высококачественные трёхмерные изображения объектов, ранее недоступных для обычной световой и конфокальной микроскопии. Ведутся работы над получением кристаллов нитрида бора с гексагональной решёткой (hBN) из чистых на 99 % изотопов бора. Такой материал линз за счёт поляритонов, образующихся на поверхности кристалла, позволяет многократно понизить дифракционный предел и достичь разрешений порядка десятков и даже единиц нанометров. Российские учёные из Томского государственного политехнического университета усовершенствовали наноскоп, использовав в нём не микролинзы, как в классической конфигурации, а специальные дифракционные решетки с золотыми пластинками. При получении изображения с такого прибора срабатывают одновременно эффект аномальной амплитудной аподизации, резонанс Фабри — Перо и резонанс Фано. Вместе они и помогают увеличить разрешение, по сравнению с обычной дифракционной решеткой, до 0,3 λ. Применение Человеческий глаз представляет собой биологическую оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением, то есть наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или линии), при котором они ещё могут быть отличены один от другого. Для нормального глаза при удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм), среднестатистическое нормальное разрешение составляет 0,176 мм. Размеры микроорганизмов, большинства растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п. значительно меньше этой величины. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены микроскопы различных типов. С помощью микроскопов определяли форму, размеры, строение и многие другие характеристики микрообъектов. Оптический микроскоп в видимом свете давал возможность различать структуры с расстоянием между элементами до 0,20 мкм. Так было до создания оптического микроскопа наноскопа. Развитие видеотехники оказало существенное влияние на оптические микроскопы. Помимо упрощения документирования наблюдений электроника позволяет автоматизировать рутинные операции. А при отказе от непосредственного наблюдения глазом отпадает необходимость в классическом окуляре. В простейшем случае при модернизации микроскопа вместо окуляра устанавливается специальная оптическая конструкция для проецирования изображения на матричный фотоприёмник. Изображение фотоприёмника передаётся в ЭВМ и/или на дисплей. Существуют также комбинированные профессиональные микроскопы оснащённые третьим оптическим портом для установки фотоаппаратуры. В некоторых современных устройствах возможность прямого наблюдения глазом может отсутствовать полностью, что позволяет создавать простые и удобные в работе приборы компактного дизайна. Использование многоэлементных фотоприемников позволяет вести наблюдения не только в видимом, но и примыкающем к нему участках спектра. Устройство микроскопа Оптическая система микроскопа состоит из основных элементов — объектива и окуляра. Они закреплены в подвижном тубусе, расположенном на металлическом основании, на котором имеется предметный столик. Увеличение оптического микроскопа без дополнительных линз между объективом и окуляром равно произведению их увеличений. В современном микроскопе практически всегда есть осветительная система (в частности, конденсор с ирисовой диафрагмой), макро- и микровинты для настройки резкости, система управления положением конденсора. В зависимости от назначения, в специализированных микроскопах могут быть использованы дополнительные устройства и системы. Объективы Объектив микроскопа представляет собой сложную оптическую систему, образующую увеличенное изображение объекта, и является основной и наиболее ответственной частью микроскопа. Объектив создаёт изображение, которое рассматривается через окуляр. Поскольку окуляры могут давать существенное увеличение, то и оптические искажения, вносимые объективом, также будут увеличены окуляром. Это накладывает на качество объектива значительно большие требования, чем на окуляр. Объективы биологических микроскопов и других микроскопов (кроме стереоскопических) в значительной степени унифицированы и взаимозаменяемы. На взаимозаменяемость в первую очередь влияют механические (присоединительные) параметры объектива. Механические параметры объектива Присоединительная резьба объективов стандартизована в 1858 году Royal Microscopical Society (RMS, ISO 8038, ГОСТ 3469). Сегодня эта резьба используется практически во всех микроскопах кроме стереомикроскопов или специальных. Диаметр резьбы 4/5" (~20 мм), шаг 1/36". Помимо резьбы на взаимозаменяемость объективов влияет парфокальное расстояние — расстояние между препаратом и посадочным местом объектива в микроскопе. Большинство современных микроскопов рассчитаны на объективы с парфокальным расстоянием 45 мм. Ранее широко применялись объективы на 33 мм. Не всегда микроскоп позволяет устанавливать объективы с нештатным парфокальным расстоянием поскольку не хватает хода столика с препаратом чтобы скомпенсировать разницу. В связи с ростом сложности оптической схемы появляются крупногабаритные объективы с большим парфокальным расстоянием (например, 60 мм и 95 мм). Свободное расстояние от объектива до изучаемого объекта называется рабочим расстоянием объектива. Обычно это расстояние тем меньше чем больше увеличение объектива. Рабочее расстояние объектива плюс длина объектива равны парфокальному расстоянию объектива. Оптические параметры объектива Объектив микроскопа характеризуется номинальным увеличением (как правило из ряда 2,5; 3,2; 4; 5; 10; 20; 40; 63; 100; 120). Кроме того: Через дробь от увеличения указывается числовая апертура — характеристика разрешающей способности объектива. Предельная разрешающая способность объектива в мкм , где λ — длина волны света, мкм; А — числовая апертура. Лучшие объективы имеют апертуру 1,4 и разрешение 0,12 мкм. Оценочно считают что максимальное разумное увеличение микроскопа при наблюдении глазом ограничено величиной апертуры умноженной на 1000. С другой стороны, чем больше апертура тем меньше глубина резкости (глубина зрения). Иногда объектив снабжается регулируемой диафрагмой, изменяющей числовую апертуру (такие объективы маркируются I, Iris). Тип коррекции на длину тубуса микроскопа. Практически всегда это 160 или бесконечность (∞). Как правило объективы с коррекцией на бесконечность качественнее и дороже. Объективы с коррекцией на бесконечность могут применяться самостоятельно (без окуляра), что используют в безлинзовых адаптерах к фотоаппаратуре. Объективы с конечной и бесконечной коррекцией не взаимозаменяемы, оптический тракт микроскопа различается. Для биологических микроскопов указывают наличие коррекции на толщину покровного стекла препарата в мм. Практически всегда это 0,17 или коррекция отсутствует (0 или -). Иногда встречаются объективы для инвертированных микроскопов (то есть для микроскопов в которых наблюдение ведётся снизу, через предметное стекло, чашку петри, стекло колбы и т. д.) с компенсацией на 1,2. Кроме того указывается буквенное обозначение коррекции искажений: Искажений цвета (хроматических). Искажения проявляются в виде цветных ореолов. Объективы с исправлением искажений по двум основным цветам называют ахроматами (обычно не маркируется), по трём — апохроматами (маркируется Apo или созвучно). Неравномерности фокусировки по полю зрения (кривизна поля зрения). Скорректированные объективы с плоским полем зрения обозначаются приставкой план- к обозначению цветовой коррекции, например планахромат или планапохромат. Объектив с такой коррекцией содержит надписи План, Plan, Pl или созвучные. Объективы с неполной коррекцией могут обозначаться как Semi plan или собственным обозначением производителя. Устранение бликов от боковой подсветки на оптике. Буквенные обозначения особенностей применения объектива: Для улучшения светосилы и числовой апертуры пространство между линзой объектива и объектом наблюдения заполняют прозрачной жидкостью с требуемым коэффициентом преломления. Такие объективы называют иммерсионными. Обычно это делается для объективов с увеличением 40 и выше. Если объектив рассчитан на использование определённой жидкости, то эксплуатировать его без неё или с другими жидкостями нельзя. В качестве жидкости чаще всего используют специальное синтетическое масло (объектив маркируется Oil), реже вода (W) или глицерин (Gli). Объективы для люминесцентных исследований выполняют из материалов с минимальной собственной люминесценцией и хорошим пропусканием ультрафиолета, так как зачастую подсветка ультрафиолетом ведётся со стороны объектива (в т. н. люминесцентных микроскопах). При этом объектив выполняет функции конденсора. Объективы для люминесцентных исследований маркируют FLUOR. Окуляры Окуля́р — обращённая к глазу часть микроскопа, предназначаемая для рассматривания с некоторым увеличением оптического изображения, даваемого объективом микроскопа. Типовые увеличения окуляров для микроскопов от 5 до 25 единиц. Так же как и объективы, окуляры различаются по качеству, то есть величине оптических искажений, вносимых окуляром. Однако вклад искажений объектива обычно превалирует в сбалансированном микроскопе благодаря тому, что искажения объектива дополнительно увеличиваются окуляром, а искажения самого окуляра — нет. Поэтому окуляры обычно характеризуются другими параметрами, в первую очередь удобством оператора. Как правило, под этим удобством понимают ширину поля зрения и вынос зрачка. Вынос зрачка — расстояние от окуляра до глаза. Как правило лежит в диапазоне 5..20 мм. Если оператор носит очки, то пользоваться окуляром с выносом 5 мм фактически невозможно. Наиболее комфортным считается расстояние 10..20 мм: с очками побольше без очков меньше. Излишне большой вынос зрачка также неудобен. Поле зрения окуляра — угловой размер изображения, видимого через окуляр. Считается, что широкое поле зрения (большой угловой размер изображения) удобнее для работы, чем узкое. Широкопольные окуляры зачастую обозначаются буквой W и визуально отличаются большой площадью линзы. Система освещения препарата В первых микроскопах исследователи вынуждены были пользоваться естественными источниками света. Для улучшения освещённости стали использовать зеркало, а затем — и вогнутое зеркало, с помощью которого на препарат направляли лучи солнца или лампы. В современных микроскопах освещение регулируют с помощью конденсора. Конденсор Конденсор (от — сгущаю, уплотняю), короткофокусная линза или система линз, используемая в оптическом приборе для освещения рассматриваемого или проецируемого предмета. Конденсор собирает и направляет на предмет лучи от источника света, в том числе и такие, которые в его отсутствие проходят мимо предмета; в результате такого «сгущения» светового потока резко возрастает освещённость предмета. Конденсоры применяются в микроскопах, в спектральных приборах, в проекционных аппаратах различных типов (например, диаскопах, эпидиаскопах, фотографических увеличителях и т. д.). Конструкция конденсора тем сложнее, чем больше его апертура. При числовых апертурах до 0,1 применяют простые линзы; при апертурах 0,2—0,3— двухлинзовые конденсоры, выше 0,7—трёхлинзовые. Наиболее распространён конденсор из двух одинаковых плосковыпуклых линз, которые обращены друг к другу сферическими поверхностями для уменьшения сферической аберрации. Иногда поверхности линз конденсора имеют более сложную форму — параболоидальную, эллипсоидальную и т. д. Разрешающая способность микроскопа повышается с увеличением апертуры его конденсора, поэтому конденсоры микроскопов — обычно сложные двух- или трёхлинзовые системы. В микроскопах и кинопроекционных аппаратах широко применяют также зеркальные и зеркально-линзовые конденсоры, апертура которых может быть очень велика — угол 2u раствора собираемого пучка лучей достигает 240°. Часто наличие в конденсорах нескольких линз вызвано не только стремлением увеличить его апертуру, но и необходимостью однородного освещения предмета при неоднородной структуре источника света. Конденсор тёмного поля Конденсоры тёмного поля применяются в темнопольной оптической микроскопии. Лучи света направляются конденсором таким образом, что они не попадают напрямую во входное отверстие объектива. Изображение формируется светом, рассеивающимся на оптических неоднородностях образца. В ряде случаев метод позволяет исследовать структуру прозрачных объектов без их окрашивания. Разработан ряд конструкций конденсоров тёмного поля, имеющих линзовую или зеркально-линзовую оптическую схему. Методы контрастирования изображения Многие объекты плохо различимы на фоне окружения из-за своих оптических свойств. Поэтому микроскопы оснащаются разнообразными инструментами, облегчающими выделение объекта на фоне среды. Чаще всего это разнообразные методы освещения объекта: в проходящем свете («светлопольная микроскопия»); в отраженном или рассеянном объектом свете («темнопольная микроскопия»); видимая люминесценция объекта в ультрафиолетовом свете («люминесцентная микроскопия»); в поляризованном свете (визуализируется изменение поляризации света при взаимодействии с объектом); в цветном («хроматическом») свете; Фазовый контраст Метод интерференционного контрастирования объекта. Поскольку свет — это электромагнитная волна, то у него есть понятие фазы. Визуализируются фазовые искажения света на объекте наблюдения. Для этого используется сочетание специальных конденсора и объектива. Вспомогательные приспособления Предметный столик Предметный столик выполняет роль поверхности, на которой размещают микроскопический препарат. В разных конструкциях микроскопов столик может обеспечить координатное движение препарата в поле зрения объектива, по вертикали и горизонтали, или поворот препарата на заданный угол. Предметные и покровные стёкла Первые наблюдения в микроскоп производились непосредственно над каким-либо объектом (птичье перо, снежинки, кристаллы и т. п.). Для удобства наблюдения в проходящем свете, препарат стали размещать на стеклянной пластинке (предметное стекло). Позже препарат стали закреплять тонким покровным стеклом, что позволило создавать коллекции образцов, например, гистологические коллекции. Для исследования методом висячей капли используются предметные стёкла с лункой — камеры Ранвье. Счётные камеры Для количественного учёта клеток, взвешенных в какой-либо жидкости, используют счётные камеры — предметные стёкла особой конструкции. В медицине для учёта форменных элементов крови применяется камера Горяева. Устройства защиты объектива В процессе поиска фокуса возможна ситуация, когда оптика объектива упрётся в столик или образец. В микроскопах встречаются механизмы предотвращения контакта или снижения тяжести последствий. К первым относятся настраиваемые ограничители вертикального движения столика. Ко вторым относятся подпружиненные объективы, в которых линзовый узел окружён приливом корпуса и подвижен. При контакте объектива с препаратом прилив корпуса предотвращает воздействие на линзу, а подвижность снижает усилие удара. Измерительные приспособления Наличие в оптическом тракте микроскопа образцового рисунка (штриховки или других знаков с известным проецируемым размером) позволяет лучше оценить размеры наблюдаемых объектов. Классификация Моно-, бино- и тринокулярные микроскопы Изображение, сформированное объективом, может быть непосредственно подано в окуляр или разделено на несколько идентичных изображений. Микроскопы без деления называются монокулярными, в них смотрят одним глазом. Удобство наблюдения двумя глазами предопределило широкое распространение бинокулярных микроскопов с двумя идентичными окулярами. Кроме того, микроскоп может оснащаться фотоаппаратурой, которая может монтироваться либо вместо штатных окуляров, либо в отдельный оптический порт. Такие микроскопы именуются тринокулярными. Некоторые микроскопы позволяют освещать объект через объектив микроскопа. В этом случае используется специальный объектив, выполняющий также функции конденсора света. В оптическом тракте микроскопа устанавливается полупрозрачное зеркало и порт источника света. Чаще всего такой механизм освещения используется при люминесцентной микроскопии в ультрафиолетовых лучах. Стереомикроскопы Стереомикроскопы предназначены для тонких работ под микроскопом, например в часовом деле, микроэлектронике, микромоделизме, нейрохирургии и т. п. Для таких работ нужно правильно оценивать положение наблюдаемых объектов под микроскопом в трёх координатах, для чего требуется стереовидение, большая глубина резкости (глубина зрения) и значительное пространство под объективом для работы. Стереомикроскопы имеют невысокое увеличение (несколько единиц или десятков), большое рабочее расстояние объектива (расстояние от оптики до точки наблюдения, обычно несколько сантиметров), в них нет регулируемых столиков и встроенных систем освещения. Для удобства работы стереомикроскоп не «переворачивает» изображение. Объектив стереомикроскопа чаще всего несменный. Металлографические микроскопы Специфика металлографического исследования заключается в необходимости наблюдать структуру поверхности непрозрачных тел. Поэтому микроскоп построен по схеме отражённого света, где имеется специальный осветитель, установленный со стороны объектива. Система призм и зеркал направляет свет на объект, далее свет отражается от непрозрачного объекта и направляется обратно в объектив. Современные прямые металлургические микроскопы характеризуются большим расстоянием между поверхностью столика и объективами и большим вертикальным ходом столика, что позволяет работать с крупными образцами. Максимальное расстояние может достигать десятки сантиметров. Но обычно в материаловедении используются инвертированные микроскопы, как не имеющие ограничения на размер образца (только на вес) и не требующие параллельности опорной и рабочей граней образца (в этом случае они совпадают). Поляризационные микроскопы При отражении света от объектов его поляризация может изменяться. Чтобы визуально выявить такие объекты, их освещают поляризованным светом, полученным после специального поляризационного фильтра. Отразившись, свет проходит через оптический тракт поляризационного микроскопа, в котором установлен второй поляризационный фильтр. Таким образом, через эту пару фильтров пройдет только тот свет, который соответствующим образом изменит свою поляризацию при отражении от наблюдаемого препарата. Остальные участки препарата окажутся затемнены. Люминесцентные (флуоресцентные) микроскопы Некоторые вещества обладают люминесцентными свойствами, то есть способны излучать свет одной длины волны при облучении другой. Люминесцентные или флуоресцентные микроскопы — это микроскопы, снабжённые осветителем с контролируемой длиной волны для наблюдения свечения таких препаратов. Поскольку свечение возникает со стороны освещения, максимально эффективна подсветка со стороны наблюдателя, то есть прямо через объектив микроскопа, что успешно реализуется в таких микроскопах. Кроме того, микроскопы, предназначенные для работы в ультрафиолетовом диапазоне снабжаются специальными объективами, пропускающими ультрафиолет и не имеющими собственной паразитной люминесценции в ультрафиолете. Такие объективы маркируются FLUOR или аналогично. Флуоресцентные микроскопы часто бывают конфокальными, кроме того, для них реализованы технологии субдифракционного разрешения. Такие микроскопы широко применяются для проведения биологических исследований. Измерительные микроскопы Измерительные микроскопы служат для точного измерения угловых и линейных размеров наблюдаемых объектов. Для оценки размеров в оптическом тракте микроскопа имеется образцовый рисунок (штриховка или другие знаки) с известным проецируемым размером. Используются в лабораторной практике, в технике и машиностроении. См. также Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) Рентгеновский микроскоп Сканирующий зондовый микроскоп (СЗМ, SPM) Сканирующий атомно-силовой микроскоп (AFM, SPM) Сканирующий туннельный микроскоп (STM) Растровый электронный микроскоп (РЭМ) Ультрамикроскоп Примечания Микроскопы Оптические приборы Оборудование для физических экспериментов