text:
Ô nhiễm môi trường đang là vấn đề đáng lo ngại không những đối với các nước phát triển mà còn là sự thách thức đối với các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam. Nước thải chưa qua xử lý đổ vào sông là tình trạng phổ biến ở các đô thị, nghiêm trọng nhất là ở Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh. ở Hà Nội, 62 cơ sở giết mổ gia súc (37 cơ sở giết mổ lợn, còn lại là giết mổ trâu, bò) dù đã có đầu tư nâng cấp nhà xưởng, bể chứa và đường ống nước, nhưng vẫn không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm và đều giết mổ thủ công. Chất thải từ quá trình giết mổ ở các cơ sở tư nhân đều chảy thẳng ra cống thoát nước thành phố, bể phốt là thứ hiếm hoi ở các lò mổ này. Vì thế, dù được nhân viên thú y kiểm dịch, không thể đảm bảo thịt đưa ra thị trường đủ tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm. Thực chất các lò mổ này hiện nay chỉ là điểm “thu gom” các lò mổ tự phát, nhỏ lẻ để cơ quan thú y dễ kiểm dịch hơn mà thôi. Bỏ ra hơn 5 tỷ đồng để đầu tư cho mỗi lò mổ hiện đại được “cơ giới hoá” là điều mới nằmvtrong “kế hoạch”. Tình trạng ở Thành phố Hồ Chí Minh cũng tương tự.
Lò mổ “tự phát” tại nông thôn thì sao? Làng nào cũng có vài hộ gia đình làm nghề. Tất nhiên, nước thải từ giết mổ thường chảy xuống ao, xuống sông như mọi loại nước thải sinh hoạt khác. Ao vẫn là nơi rửa bát, rửa rau, giặt chăn, chiếu ở nhiều vùng nông thôn, thậm chí có nơi còn sử dụng làm nước ăn, uống. Thuốc trừ sâu bị sử dụng bừa bãi, các loại bao bì đựng thuốc trừ sâu vương vãi bên bờ ruộng, cạnh đường làng...
Các loại ô nhiễm thường thấy tại các đô thị Việt Nam là ô nhiễm nguồn nước, ô nhiễm bụi, ô nhiễm các khí sulfure, cacbonic, nitrit, ô nhiễm chì (Pb), chất thải rắn (trong sinh hoạt, bệnh viện). Các nơi bị ô nhiễm nặng nhất là khu dân cư gần nhà máy, KCN... ở một số khu dân cư gần các KCN nồng độ khí sulffure vượt chỉ số tiêu chuẩn cho phép nhiều lần. Tính trung bình lượng chất thải rắn sinh hoạt thải ra ở các thành phố lớn (Hà Nội, Hải Phòng, Đà Nẵng, Thành phố Hồ Chí Minh) từ 0,6 - 0,8 kg/người/ngày, chất thải rắn trong bệnh viện (cơ sở y tế) được thải ra ước tính từ 50-70 tấn/ngày. Chất thải rắn này ảnh hưởng rất lớn đến môi trường đô thị... Hiện nay, khả năng thu gom chất thải rắn còn rất thấp so với yêu cầu đặt ra. Tại nhiều thị xã, tỷ lệ thu gom chất thải rắn trung bình chỉ đạt 20-40%. Biện pháp thu gom chất thải rắn hiện nay chủ yếu là chôn lấp.
Theo thống kê, Việt Nam có trên 800.000 cơ sở sản xuất công nghiệp với gần 70 KCX-KCN tập trung, trong đó, khoảng 90% cơ sở sản xuất công nghiệp và phần lớn các KCN chưa có trạm xử lý nước thải. Các ngành công nghiệp gây ô nhiễm môi trường nặng nhất là công nghiệp nhiệt điện, công nghiệp sản xuất xi măng và vật liệu xây dựng, công nghiệp khai thác khoáng sản. Bên cạnh đó, với sự phát triển kinh tế và chất lượng cuộc sống được nâng cao, lượng chất thải rắn tạo ra cũng sẽ tăng tương ứng. Lấy ví dụ, tính từ năm 2000 đến năm 2003, tỉ lệ chất thải rắn ở Thành phố Hà Nội tăng 9%. Nếu tỉ lệ này tăng liên tục, thì lượng chất thải rắn ước tính khoảng 1 kg/ngày/người vào cuối thập kỷ này tương đương với các thành phố lớn của Châu á. Đây sẽ trở thành mối đe doạ nghiêm trọng đối với môi trường.
Hiện nay, Thành phố Hà Nội có khoảng 620.000 tấn rác thải các loại mỗi năm, trong đó khoảng 500.000 tấn được đổ tại bãi rác Nam Sơn, cách Thành phố Hà Nội khoảng 65km. Mặc dù bãi rác này được quản lý tương đối tốt nhưng vấn đề về nước rác vẫn đang là vấn đề bức xúc cần phải giải quyết. Bên cạnh đó, sự tăng đáng kể khối lượng rác hàng năm dẫn đến tình trạng quá tải tại các bãi chôn lấp. Hiện nay, Hà Nội có 05 bãi chôn lấp nhưng chỉ có bãi rác Nam Sơn và bãi Lâm Du đang hoạt động, trong đó bãi rác Lâm Du chủ yếu dùng để chôn lấp rác xây dựng.

markdown:
Ô nhiễm môi trường đang là vấn đề đáng lo ngại không những đối với các nước phát triển mà còn là sự thách thức đối với các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam. Nước thải chưa qua xử lý đổ vào sông là tình trạng phổ biến ở các đô thị, nghiêm trọng nhất là ở Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh. ở Hà Nội, 62 cơ sở giết mổ gia súc (37 cơ sở giết mổ lợn, còn lại là giết mổ trâu, bò) dù đã có đầu tư nâng cấp nhà xưởng, bể chứa và đường ống nước, nhưng vẫn không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm và đều giết mổ thủ công. Chất thải từ quá trình giết mổ ở các cơ sở tư nhân đều chảy thẳng ra cống thoát nước thành phố, bể phốt là thứ hiếm hoi ở các lò mổ này. Vì thế, dù được nhân viên thú y kiểm dịch, không thể đảm bảo thịt đưa ra thị trường đủ tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm. Thực chất các lò mổ này hiện nay chỉ là điểm “thu gom” các lò mổ tự phát, nhỏ lẻ để cơ quan thú y dễ kiểm dịch hơn mà thôi. Bỏ ra hơn 5 tỷ đồng để đầu tư cho mỗi lò mổ hiện đại được “cơ giới hoá” là điều mới nằmvtrong “kế hoạch”. Tình trạng ở Thành phố Hồ Chí Minh cũng tương tự.
Lò mổ “tự phát” tại nông thôn thì sao? Làng nào cũng có vài hộ gia đình làm nghề. Tất nhiên, nước thải từ giết mổ thường chảy xuống ao, xuống sông như mọi loại nước thải sinh hoạt khác. Ao vẫn là nơi rửa bát, rửa rau, giặt chăn, chiếu ở nhiều vùng nông thôn, thậm chí có nơi còn sử dụng làm nước ăn, uống. Thuốc trừ sâu bị sử dụng bừa bãi, các loại bao bì đựng thuốc trừ sâu vương vãi bên bờ ruộng, cạnh đường làng...
![ ](http://1.bp.blogspot.com/_1KRDI8arRaU/RmuvYh-VTFI/AAAAAAAAAAk/T8VlYg8_JQ4/s400/images834653_rac1.jpg)
Các loại ô nhiễm thường thấy tại các đô thị Việt Nam là ô nhiễm nguồn nước, ô nhiễm bụi, ô nhiễm các khí sulfure, cacbonic, nitrit, ô nhiễm chì (Pb), chất thải rắn (trong sinh hoạt, bệnh viện). Các nơi bị ô nhiễm nặng nhất là khu dân cư gần nhà máy, KCN... ở một số khu dân cư gần các KCN nồng độ khí sulffure vượt chỉ số tiêu chuẩn cho phép nhiều lần. Tính trung bình lượng chất thải rắn sinh hoạt thải ra ở các thành phố lớn (Hà Nội, Hải Phòng, Đà Nẵng, Thành phố Hồ Chí Minh) từ 0,6 - 0,8 kg/người/ngày, chất thải rắn trong bệnh viện (cơ sở y tế) được thải ra ước tính từ 50-70 tấn/ngày. Chất thải rắn này ảnh hưởng rất lớn đến môi trường đô thị... Hiện nay, khả năng thu gom chất thải rắn còn rất thấp so với yêu cầu đặt ra. Tại nhiều thị xã, tỷ lệ thu gom chất thải rắn trung bình chỉ đạt 20-40%. Biện pháp thu gom chất thải rắn hiện nay chủ yếu là chôn lấp.
Theo thống kê, Việt Nam có trên 800.000 cơ sở sản xuất công nghiệp với gần 70 KCX-KCN tập trung, trong đó, khoảng 90% cơ sở sản xuất công nghiệp và phần lớn các KCN chưa có trạm xử lý nước thải. Các ngành công nghiệp gây ô nhiễm môi trường nặng nhất là công nghiệp nhiệt điện, công nghiệp sản xuất xi măng và vật liệu xây dựng, công nghiệp khai thác khoáng sản. Bên cạnh đó, với sự phát triển kinh tế và chất lượng cuộc sống được nâng cao, lượng chất thải rắn tạo ra cũng sẽ tăng tương ứng. Lấy ví dụ, tính từ năm 2000 đến năm 2003, tỉ lệ chất thải rắn ở Thành phố Hà Nội tăng 9%. Nếu tỉ lệ này tăng liên tục, thì lượng chất thải rắn ước tính khoảng 1 kg/ngày/người vào cuối thập kỷ này tương đương với các thành phố lớn của Châu á. Đây sẽ trở thành mối đe doạ nghiêm trọng đối với môi trường.
Hiện nay, Thành phố Hà Nội có khoảng 620.000 tấn rác thải các loại mỗi năm, trong đó khoảng 500.000 tấn được đổ tại bãi rác Nam Sơn, cách Thành phố Hà Nội khoảng 65km. Mặc dù bãi rác này được quản lý tương đối tốt nhưng vấn đề về nước rác vẫn đang là vấn đề bức xúc cần phải giải quyết. Bên cạnh đó, sự tăng đáng kể khối lượng rác hàng năm dẫn đến tình trạng quá tải tại các bãi chôn lấp. Hiện nay, Hà Nội có 05 bãi chôn lấp nhưng chỉ có bãi rác Nam Sơn và bãi Lâm Du đang hoạt động, trong đó bãi rác Lâm Du chủ yếu dùng để chôn lấp rác xây dựng.

Set-Cookie: NVS=o0tkgpgrd3jf963q0i3p2ru6p1; path=/


text:
Công Nghệ Sinh Học
Giới thiệu phản ứng chuỗi polymerase pha rắn SP-PCR
- Chi tiết bài viết
- Bài viết liên quan
I. Giới thiệu:
Từ khi được phát minh vào năm 1983, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã tạo ra một bước đột phá lớn cho ngành sinh học phân tử bằng cách cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra số lượng bản sao không giới hạn của một đoạn DNA chỉ trong vài giờ. PCR thường được thực hiện bằng cách phối trộn các thành phần cần thiết vào tube. Sự khuếch đại sau đó diễn ra qua nhiềuchu kỳ nhiệt. Thông thường, chỉ có một đoạn DNA được khuếch đại cho mỗi thí nghiệm PCR. Điều này có nghĩa là nếu nhiều đoạn DNA khác nhau được khuếch đại đồng thời (ví dụ như Multiplex PCR), chúng sẽ được tách ra sau đó (ví dụ, điện di gel, theo Pang và cộng sự, 2002). Tuy nhiên, một kỹ thuật khuếch đại DNA mới, được gọi là khuếch đại pha rắn (solid phase amplification-SPA hay SP-PCR), đã được giới thiệu bởi hai nhóm khác nhau: Adessi et al. (2000) và Bing et al. (1996). Bằng cách gắn các đoạn mồi vào bề mặt rắn (attaching the primers to a solid surface), SP-PCR cho phép khuếch đại giới hạn trong một vùng hai chiều được xác định rõ ràng (well-defined two-dimensional area). Vì nó tạo ra một vùng không gian khuếch đại (spatially located amplification) có thể khuếch đại một số lượng lớn các chuỗi DNA khác nhau trong cùng một phản ứng (nghĩa là trên cùng một bề mặt rắn) mà không cần phối trộn chúng. Đặc tính này có thể rất hữu ích cho việc thiết kế các chip DNA [11].
Công nghệ chip DNA đang trở thành một lĩnh vực quan trọng của nghiên cứu trên quy mô tự động hóa (high-throughput research) trong sinh học cơ bản và bệnh lý (disease pathways). Công nghệ SP-PCR được sử dụng để tạo ra các chip DNA đang phát triển nhanh chóng. Trong lịch sử, phân tích gen được thực hiện bằng cách lai các đầu dò được đánh dấu với các DNA mục tiêu và bị hấp thụ thụ động đến các bề mặt rắn như nitrocellulose, màng nylon hoặc các miếng kính thủy tinh được tráng lysine. Sự liên kết cộng hóa trị của DNA với bề mặt đã trở thành cách tiếp cận lý tưởng vì nó cho phép gắn kết ổn định hơn trong các điều kiện được sử dụng để lai tạo (hybridization).
II. Cơ chế:
SP-PCR khác với PCR truyền thống (solution PCR) trong việc sử dụng bề mặt rắn cố định các đoạn mồi thay vì dạng dung dịch khuyếch tán tự do để khuếch đại DNA. Điều này hạn chế khuếch đại trên bề mặt hai chiều (5’ và 3’) và do đó cho phép dễ dàng song song hóa sự khuếch đại nhiều chuỗi DNA trong một hệ thống. Đối với solution-PCR thường được đặc trưng bằng sự nhân lên các bản saotheo cấp số nhân (ít nhất là trong các chu kỳ đầu) và phân bố đều trong dung dịch với mật độ cao. Tuy nhiên, đặc điểm trên không được biết đến với SP-PCR vì các hiệu ứng không gian (Steric effects) [9] và hình học trong môi trường cố định trên pha rắn.
Có hai kiểu phổ biến của SP-PCR. Trong kiểu thứ nhất, sự khuếch đại DNA được bắt đầu với cả hai primer trong dung dịch để cho phép amplicon [4] được tạo ra với một lượng đủ để kéo dài một primer cố định.Kiểu thứ hai liên quan đến việc tạo ra một amplion cố định bằng cách ghép cả hai primer trên bề mặt.Các primer có thể được cố định trên một đĩacó kích thước lỗ tính bằng micromet (microtiter plate), một mặt phẳng (flat surface), hoặc một microbead [5] được bao phủ trong một micelle [6]. Trong mỗi trường hợp, sự kéo dài của primer bởi enzyme DNA Polymerase tạo ra một amplicon gắn kết (tethered amplicon) có thể dễ dàng phát hiện, định lượng và thao tác cho các ứng dụng tiếp theo bao gồm cloning, high-throughput DNA sequencing [7] và phát hiện SNP [8].
Ý tưởng trung tâm của SP-PCR là gắn đầu 5′-primer vào bề mặtrắn như: silic, polystyrene bead, thủy tinh, polydimethylsiloxane (PDMS), Cyclo-olefin Polymer (COP),Cyclic Olefin Copolymer (COC)và polypropylene (PP) bằng liên kết cộng hóa trịvà đầu 3’ tự do thay vì cho phép các primer tự do khuếch tán trong dung dịch với số lượng lớn(Adessi et. Al., 2000; Bing et al., 1996).
Các primer sau đó tạo thành một thảm dày đặc (mật độ là ~ 1011primer trên mm2-Adessi và cộng sự, 2000-tương ứng với một khoảng cách trung bình từ ~ 5-10 nm giữa các primer, là chiều dài lớn nhất có thể của primer (contour length of a primer). Trong kỹ thuật này, khuếch đại có thể xảy ra thông qua hai quá trình. Đầu tiên, một DNA mục tiêu tự do có thể bị bắt trên bề mặt bởi các primer và sau đó sao chép bằng polymerase (hình 3, a-d), được gọi là interfacial amplification. Lưu ý rằng các bản sao vẫn gắn liền với bề mặt trong khi các phân tử DNA ban đầu quay trở lại dung dịch sau bước gắn primer (annealing step). Sau khi một số bản sao DNA được gắn vào bề mặt thông qua interfacial amplification, một bước khuếch đại thứ hai có thể xảy ra, quá trình ‘surface amplification’. Trong trường hợp này, các bản sao gắn kết bề mặt của các phân tử DNA cũng có thể lai với primer tương ứng và tạo thêm bản sao trong vùng lân cận của các bản sao ban đầu (hình 3, e-l). Điều quan trọng cần lưu ý là quá trình khuếch đại bề mặt này để lại cả hai phân tử gắn liền với bề mặt. Do đó, khuếch đại DNA pha rắn dẫn tới sự phát triển của một nhóm các phân tử gắn liền với bề mặt và nằm trong cùng một vùng. Đặc tính này có thể dễ dàng được khai thác trong việc thiết kế các DNA microarrays [9].
Để có SP-PCR, các primerđước gắn lên bề mặt rắn phải đáp ứng ba yêu cầu chính.
- Mật độ bề mặt của các primer được gắn lên bề mặt rắnphải đủ cao để phát hiện các sản phẩm khuếch đại DNA cố định bằng phương pháp hybridisation assay sau SP-PCR
- Liên kết cộng hóa trị giữa primer và bề mặt không nên bị ảnh hưởng bởi chu kỳ nhiệt lặp lại trong quá trình khuếch đại DNA.
Mỗi primer phải được cố định đầu5’lên bề mặt rắn và đảm bảo sự đặc hiệu trong suốt quá trìnhSP-PCR [3].
Một số phương pháp hóa học đã được nghiên cứu để gắn trực tiếp các oligonucleotides 5′-end trên bề mặt rắn như: liên kết cộng hóa trị giữa các oligonucleotide 5′-amino-modified và bề mặt thủy tinh tạo ra epoxy silan, oligonucleotide 5′-succinylated cố định trên bề mặt thủy tinh với dẫn xuất amin, gắn kết cộng hoá trị với 5′-termini sử dụng các cross-linkers tạo ra các liên kết đồng hóa trị (phenyldiisothiocyanate hoặc anhydrit maleic). Ngoài ra, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) – carbodiimide hydrochloride (EDC) cũng được sử dụng để gắn các nucleotide vào màng xenlulo thông qua nhóm 5′-phosphate.
III. Quy trình thực hiện SP-PCR trên microbead [3]
Bước 1: Chuẩn bị Fluorescently Encoded Microbeads (silica bead)
Chuẩn bị silica bead có đường kính 6μm [10]
Các microbeads đã được bao phủ (coated)bởi aminopropylsilane, và bề mặt đã được dẫn xuất (derivatized) bằng acid adipic
Bước 2: Chuẩn bị các Oligonucleotides
Các Oligonucleotides không đánh dấu huỳnh quang và đánh dấu huỳnh quang được đặt mua từ các nhà cung cấp như GeneWorks (GeneWorks Pty. Ltd., Adelaide, Australia) và Invitrogen (Invitrogen Corporation, California, USA)
Bước 3: Gắn (Coupling) Oligonucleotides (primer) lên Microbeads
Đầu 5 ‘của forward primer được gắnlên những microbead được bao phủ bởi acidic acid bằng cách sử dụng 1-ethyl 3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDC). Các DNA gắn với microbead được thu nhận bằng cách ly tâm ở 10.000rpm trong 30 giây và rửa ba lần với 1 mL 0,1 M 2-morpholinoethane sulfonic acid (đệm MES bổ sung với 0,01% SDS) và được bảo quản ở 4oC
Bước 4: Thực hiện phản ứng SP-PCR
50 pg của single-stranded (ss) DNA template được khuếch đạitrong thể tích phản ứng 30uL
chứa 1.25 U of Taq DNA polymerase (GoTaq Flexi DNApolymerase, Promega Corporation, Wisconsin, USA), 0.2 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl2,1X PCR buffer (GoTaq PCR buffer, Promega), 0.1% Tween 20, 0.5µM of A488 reverse primer, khoảng 4×104microbeads đã gắn với đầu 5’forward primer.
Chu kỳ nhiệt PCR (PCR protocol) được thực hiện như sau:
Bước 5: DNA Hybridization
Sau SP- PCR, những amplicon cố định được làm biến tính tại 100°C trong 90 giây bởi 400uL buffer 4X SSC (0.6 M NaCl, 0.06 M sodium citrate) để tạo ra ssDNA cố định. The microbeads đượcthu nhận và bước biến tính được thực hiện lần thứ 2.
50 ng của reverse primer có đánh dấu huỳnh quang được cho gắn với ssDNA cố định trên microbead trong 10uL dung dịch miliQ và 4uL hybridization buffer (50mM NaHPO3, 0.5 M NaCl, and 0.5% SDS). Phản ứng này được thực hiện tại nhiệt độ Ta (temperature annealing) của reverse primer trong 60 phút trong thiết bị ủ lắc với tốc độ 1400rpm.
Microbeads sau đó được rửa bằng dung dịch NaOH 0.1N và hòa tan trong 100uL dung dịch SDS 0.1% và chuẩn bị cho bước phân tích bằng flow cytometry.
Bước 6: Phân tích hiệu quả SP-PCR bằng phương pháp Flow Cytometry
Mật độ huỳnh quang trên bề mặt microbeads được đo đạc bằng cách sử dụng DakoCytomation Moflo flow Cytometer. Dữ liệu được thu thập dưới dạng biểu đồ logarit và được phân tích bởi phần mềm Summitv 4.0 để xác định lượng DNA được khuếch đại bởi SP-PC.
IV. Đặc điểm nổi bậtcủa SP-PCR
Cơ chế của SP-PCR định hướng việc thiết kế thí nghiệm để thực hiện phản ứng khuếch đại chỉ diễn ra đối với các DNA đã được gắn lên bề mặt cố định thông qua forward primer.Quá trình SP-PCR được bắt đầu với việc ssDNA template bắt vào các forward cố định trên bề mặt rắn.Sự kéo dài của các primer được tạo ra bởi enzyme DNA polymerase tạo ra các amplicon. Các reverse primer sau đó bắt vào các amplicon cố định và trải qua giai đoạn kéo dài để tạo ra một bản sao của ssDNA template ban đầu. Vì vậy, SP-PCR sẽ chỉ tiếp diễn sau khi các amplicon được tạo ra. Điều này giúp cho SP-PCRlà công cụ giúp khắc phục hiệu quả được 2 nhược điểm chính của multiplex PCR trong dung dịch gồm:
- Sự hình thành primer-dimer bởi sự tương tác không thể kiểm soát giữa primer-primer và sự khuếch đại ưu thế của một trình tự mục tiêu so với các trình tự khác.
- Sự xác định chính xác các sản phẩm khuếch đại của multiplex PCR đòi hỏi một phương pháp phân tích thứ 2 sau điện di trên gel, đặc biệt trong trường hợp Multiplex RT-PCR (Reverse transcriptase PCR) như: slab gel electrophoresis, melting curve (Real time PCR), microarray hybridization hoặc điện di mao quản (capillary electrophoresis) để phân tách hoặc xác định kích thước.
Vì vậy, SP-PCR đã và đang được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực chẩn đoán nhanh phát hiện bệnh.
V. Những ứng dụng của SP-PCR
Phát hiện nhanh mầm bệnh trong thực phẩm [14]
Phát hiện nhanh RNA trong mẫu bệnh cúm gia cầm (AIV) [15]
Bệnh virus cúm gia cầm (AIV) ở Châu Á và dịch bệnh động vật ở một số khu vực ở Châu Âu đã gây ra thiệt hại về kinh tế nghiêm trọng. Multiplex reverse-transcriptase (RT) PCR đã được phát triển để phát hiện và phân typ AIV. Tuy nhiên, số mục tiêu có thể được khuếch đại trong một lần chạy PCR bị hạn chế do nhiễu primer-dimer không kiểm soát được. Trong bài viết này, chúng tôi mô tả một thiết bị lab-on-a-chip để sàng lọc nhanh AIV bằng cách tích hợp DNA microarraydựa trên SP-PCR trên một chip microfluidic. Phương pháp UV cross-linking đơn giản đã được sử dụng để cố định các đầu dò DNA trên bề mặt thủy tinh không có các đệm gắn (unmodified glass surface), điều này làm cho việc tương tác giữa microarray với microfluidic rất thuận tiện. Phương pháp RT-SP-PCR kết hợp khuếch đại RT của RNA tách chiết trong pha lỏng và nested PCR riêng biệt trên pha rắn. Sử dụng phương pháp tiên tiến, virus AIV và các phân typ của chúng đã được xác định rõ ràng bằng các mô hình sản phẩm khuếch đại riêng biệt. Toàn bộ quá trình được giảm xuống dưới 1 giờ và thể tích mẫu được sử dụng trong chip microfluidic ít hơnít nhất 10 lần so với solution PCR. Bằng cách phân chia không gian các primer, sự khuếch đại cao có thể được thực hiện trong SP-PCR. Hơn nữa, multiplex PCR và phát hiện trình tự đã được thực hiện trong một bước, đơn giản hóa việc khảo nghiệm và giảm thời gian xử lý. Hơn nữa, bằng cách kết hợp microarray vào microchamber dựa trên chip PCR, mẫu và mức tiêu hao hóa chất giảm được rất nhiều, và các vấn đề hình thành bọt khí và bốc hơi dung dịch đã được ngăn chặn hiệu quả. Microchip PCR dựa trên microarray này có thể được sử dụng rộng rãi để phát hiện virut và giám sát hiệu quả dịch cúm gia cầm của chim trong môi trường hoang dã và vật nuôi gia cầm.
Phát hiện nhanh chóng sự biến đổi di truyền trong các bệnh ung thư [18]
Lần đầu tiên một kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt/phát hiện trên bề mặt rắn (ISAD) được nghiên cứu để phát hiện đột biến điểm đơn có thể được thực hiện mà không cần đánh dấu huỳnh quang trong Real time PCR bằng cách sử dụng SPA (solid-phase amplification) trên thiết bị microring silicon (silicon microring-based solid-phase amplification) và enzyme khuếch đại đẳng nhiệt tái tổ hợp (RPA). Kỹ thuật ISAD được thực hiện trên một thiết bị microring silicon với một lỗ nhỏ chứa 10 μL hỗn hợp phản ứng, và đặc trưng để phát hiện sự đột biến điểm đơn gen HRAS (Harvey RAS). VớiSPA, primer của gen đích được gắn trực tiếp vào bề mặt của thiết bị thông qua một phản ứng với nhóm amine. Sự khuếch đại DNA được phát hiệnbằng cách đo sự thay đổi cộng hưởng bước sóng quang học của silic microring trong quá trình phản ứng. Độ nhạy của kỹ thuật ISAD đã được chứng minhcao hơn 100 lần của RPA và phương pháp PCR truyền thống (solution-PCR). Hơn nữa, kỹ thuật này có thể được sử dụng để phân biệt một đột biến điểm đơn của gen HRAS thông qua khuếch đại gen mục tiêu. Kỹ thuật ISAD sẽ hữu ích để phát hiện các trình tự thay đổi như đột biến và SNP được xem như DNA biomarkers trong bệnh của con người.
Ứng dụng trong kỹ thuật giải trình tự NGS [17]
VI. Tối ưu các thông số cho SP-PCR:
– Rửa microbead với buffer PCR trước khi khuếch đại là điều cần thiết cho sự thành công của SP-PCR.
– Nồng độion Magiê dao động từ 2 đến 3 mM và khuếch đại tối ưu là 2,5 mM.
– Sử dụng 4×104 microbead cho SP-PCR, lượng forward primer thay đổi theo lượng microbead được sử dụng, thông thường khoảng 0.17pmol cho mỗi 4×104 microbead. Một nữa lượng microbead không ảnh hưởng đến sự hình thành các amplicon cố định, trong khi đó lượng bead cao hơn sẽ làm giảm sự hình thành amplicon cố định của SP-PCR
– Thời gian 2 phút là tối ưu cho giai đoạn bắt cặp bổ sung giữa DNA và primer cố định
– Tín hiệu huỳnh quang tăng (lượng amplicon tăng) khi nồng độ DNA template tăng (hình 3). Nhưng khi nồng độ DNA template tăng đến 1ng thì không có sự thay đổi đáng kể lượng amplicon được tạo ra bởi sự bảo hòa trên bề mặt microbead bởi PCR product
VII. Kết luận:
- Quy trình khuếch đại DNA theo SP-PCR có thể được tách ra theo ba bước riêng biệt-annealing, extension và denaturation-được lặp đi lặp lại theo một cơ chế chuyên biệt của SP-PCR. Trong chu kỳ đầu tiên, interfacial amplificationlà loại khuyếch đại duy nhất có thể. Kết quả của chu trình đầu tiên là thu được một số lượng nhất định DNA gắn với bề mặt rắn thông qua các forward primer. Trong các chu kỳ tiếp theo, surface amplificationcũng có thể xảy ra vì một số DNA mục tiêuđã được gắn vào bề mặt. Tuy nhiên, khi hai quá trình interfacial amplification và surface amplification cùng tồn tại, sự khuếch đại dạng interfacial amplificationthường chiếm ưu thế hơn (Adessi và cộng sự, 2000). Do đó, để thực hiện quá trình surface amplification, dung dịch ban đầu phải được rửa sạch và thay thế bằng dung dịch không có các DNA mục tiêu. Sau đó, surface amplificationlà khuếch đại duy nhất có thể và chu trình nhiệt độ có thể được bắt đầu trở lại. Kết quả của surface amplificationlà để có được một phân tử ssDNA mới gắn liền với bề mặt ngay sausợi ban đầu (Hình 3, h-i). Lưu ý rằng độ dài của các phân tử được sử dụng trong SPA thường là 400 base (chiều dài đường kính ~ 170 nm). Bán kính của sự chuyển động trong pha hybridization(ssDNA) là khoảng ~ 15-20 nm, lớn hơn khoảng cách trung bình giữa các primer gần nhất (~ 5-10 nm). Ngoài ra, chiều dài DNA điển hình lớn hơn nhiều so với độ dài của ssDNA (~ 10 base hoặc ~ 4 nm) nhưng tương tự như dsDNA (~ 150 basepairs hoặc ~ 51 nm). Do đó, phân tử rất linh hoạt trong pha hybridization, và không có vấn đề cần uốn cong để tìm primers phù hợp. Tuy nhiên, khi kết thúc giai đoạn kéo dài (khi phân tử hoàn toàn là sợi đôi), nó sẽ trở nên cứng và phải chịu áp suất uốn cong đáng kể.
- Hiệu quả khuếch đạicủa SP-PCRtrong một vùngtrên bề mặt được bao phủ bằng nhiều bản sao của DNA đích và xem như là một DNA colony. Số colony phụ thuộc vào số lượng các DNA mục tiêubắt được (captutred) trên bề mặt rắn bởi forward primer (trong giai đoạn interfacial amplification) trước khi những lượng DNA còn tự do được rửa sạch. Nếu các DNA mục tiêu khác nhau cùng bắt (captured) vào các forward primer cố định khác nhau, sẽ có nhiều loại DNA colony trên bề mặt.
- Quá trình mô tả trong hình 3 tương ứng với trường hợp lý tưởng, trong đó primer không bị loại bỏ khỏi bề mặt. Trong thực tế, việc nung nóng và làm mát tiếp theo của dung dịch có thể khiến các forward primer tách ra khỏi bề mặt, tùy thuộc vào loại vật liệu được sử dụng làm bề mặt rắn và linker gắn forward primer vào bề mặt rắn. Vì vậy cần nghiên cứu kỹ protocol cho việc cố định các primer khi bắt đầu với SP-PCR[11].
- Số lượng các phân tử trong một vùng thuộc SPA không tăng theo cấp số nhân (ngoại trừ vài chu kỳ đầu tiên) như trong trường hợp solution- PCR do sự phân bố của phân tử.
- Đặc điểm trong cơ chế của SP-PCR trong tăng trưởng hình học và phân bố kích thước rõ ràng không bị ảnh hưởng bởi các phân tử xâm nhiễm từ bên ngoài bởi sự bắt cặp đặc hiệu rất cao.
- AmpaSand bead có thể là một sự lựa chọn đáng xem xét cho SP-PCR [18]
Nguyễn Thanh Phượng
Tài liệu tham khảo
- Mercier, Jean-Francois, Gary W. Slater, and Pascal Mayer. “Solid phase DNA amplification: a simple Monte Carlo Lattice model.” Biophysical journal 85.4 (2003): 2075-2086.
- Ramkumar Palanisamy., et al., Considerations of Solid-Phase DNA Amplification, Bioconjugate Chem.2010,21,690–695
- Celine Adessi., et al., Solid Phase DNA amplification: Characterisation of primer attachment and amplification mechanism, DOI: 10.1093/nar/28.20.e87, Nucleic Acids Research 28(20):E87, 2000
- Amplicon. Wikipedia.
- Microbead. Wikipedia.
- Micelle. Wikipedia.
- High-throughput sequencing. Sumanas, Inc.
- Kwok, Pui-Yan, and Xiangning Chen. “Detection of single nucleotide polymorphisms.” (2003).
- DNA microarray. Wikipedia.
- Miller, C. R., Vogel, R., Surawski, P. P., Jack, K. S., Corrie,S. R., and Trau, M. (2005) Functionalized organosilica micro-spheres via a novel emulsion-based route. Langmuir 21, 9733–40.
- Jochen Hoffmann,*a Sebastian Hin,a Felix von Stetten,ab Roland Zengerleabc and Günter Rothabc.,Universal protocol for grafting PCR primers onto various lab-on-a-chip substrates for solid-phase PCR.,3885–3889,DOI: 10.1039/c2ra01250b, RSC Advances, 2012, 2.
- AmpaSand® Bead technology. Genera Biosystems
- Shin, Yong, et al. “Real-time, label-free isothermal solid-phase amplification/detection (ISAD) device for rapid detection of genetic alteration in cancers.” Lab on a Chip 13.11 (2013): 2106-2114.
- Fast detection of pathogens in food. DTU Nanotech.
- Yi Sun.,et al.,A lab-on-a-chip device for rapid identification of avian influenza viral RNA by solid-phase PCR, DOI: 10.1039/c0lc00528b, Lab on a chip journal, 8, 2011
- El Mustapha Bahassi, Peter J Stambrook.,Next-generation sequencing technologies: Breaking the sound barrier of human genetics, DOI: 10.1093/mutage/geu031, 2014
- Yong Shin., et al.,Real-time, label-free isothermal solid-phase amplification/detection (ISAD) device for rapid detection of genetic alteration in cancers, DOI: 10.1039/C3LC50129A, Lab on a chip journal, 11, 2013
- AmpaSand® Bead technology. Genera Biosystems

markdown:
Công Nghệ Sinh Học
# Giới thiệu phản ứng chuỗi polymerase pha rắn SP-PCR
- Chi tiết bài viết
- Bài viết liên quan
### I. Giới thiệu:
Từ khi được phát minh vào năm 1983, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã tạo ra một bước đột phá lớn cho ngành sinh học phân tử bằng cách cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra số lượng bản sao không giới hạn của một đoạn DNA chỉ trong vài giờ. PCR thường được thực hiện bằng cách phối trộn các thành phần cần thiết vào tube. Sự khuếch đại sau đó diễn ra qua nhiềuchu kỳ nhiệt. Thông thường, chỉ có một đoạn DNA được khuếch đại cho mỗi thí nghiệm PCR. Điều này có nghĩa là nếu nhiều đoạn DNA khác nhau được khuếch đại đồng thời (ví dụ như Multiplex PCR), chúng sẽ được tách ra sau đó (ví dụ, điện di gel, theo Pang và cộng sự, 2002). Tuy nhiên, một kỹ thuật khuếch đại DNA mới, được gọi là khuếch đại pha rắn (solid phase amplification-SPA hay SP-PCR), đã được giới thiệu bởi hai nhóm khác nhau: Adessi et al. (2000) và Bing et al. (1996). Bằng cách gắn các đoạn mồi vào bề mặt rắn (attaching the primers to a solid surface), SP-PCR cho phép khuếch đại giới hạn trong một vùng hai chiều được xác định rõ ràng (well-defined two-dimensional area). Vì nó tạo ra một vùng không gian khuếch đại (spatially located amplification) có thể khuếch đại một số lượng lớn các chuỗi DNA khác nhau trong cùng một phản ứng (nghĩa là trên cùng một bề mặt rắn) mà không cần phối trộn chúng. Đặc tính này có thể rất hữu ích cho việc thiết kế các chip DNA [11].
Công nghệ chip DNA đang trở thành một lĩnh vực quan trọng của nghiên cứu trên quy mô tự động hóa (high-throughput research) trong sinh học cơ bản và bệnh lý (disease pathways). Công nghệ SP-PCR được sử dụng để tạo ra các chip DNA đang phát triển nhanh chóng. Trong lịch sử, phân tích gen được thực hiện bằng cách lai các đầu dò được đánh dấu với các DNA mục tiêu và bị hấp thụ thụ động đến các bề mặt rắn như nitrocellulose, màng nylon hoặc các miếng kính thủy tinh được tráng lysine. Sự liên kết cộng hóa trị của DNA với bề mặt đã trở thành cách tiếp cận lý tưởng vì nó cho phép gắn kết ổn định hơn trong các điều kiện được sử dụng để lai tạo (hybridization).
![ ](http://ibsgacademic.com/wp-content/uploads/2018/03/sp-pcr-01.png)
### II. Cơ chế:
SP-PCR khác với PCR truyền thống (solution PCR) trong việc sử dụng bề mặt rắn cố định các đoạn mồi thay vì dạng dung dịch khuyếch tán tự do để khuếch đại DNA. Điều này hạn chế khuếch đại trên bề mặt hai chiều (5’ và 3’) và do đó cho phép dễ dàng song song hóa sự khuếch đại nhiều chuỗi DNA trong một hệ thống. Đối với solution-PCR thường được đặc trưng bằng sự nhân lên các bản saotheo cấp số nhân (ít nhất là trong các chu kỳ đầu) và phân bố đều trong dung dịch với mật độ cao. Tuy nhiên, đặc điểm trên không được biết đến với SP-PCR vì các hiệu ứng không gian (Steric effects) [9] và hình học trong môi trường cố định trên pha rắn.
Có hai kiểu phổ biến của SP-PCR. Trong kiểu thứ nhất, sự khuếch đại DNA được bắt đầu với cả hai primer trong dung dịch để cho phép amplicon [4] được tạo ra với một lượng đủ để kéo dài một primer cố định.Kiểu thứ hai liên quan đến việc tạo ra một amplion cố định bằng cách ghép cả hai primer trên bề mặt.Các primer có thể được cố định trên một đĩacó kích thước lỗ tính bằng micromet (microtiter plate), một mặt phẳng (flat surface), hoặc một microbead [5] được bao phủ trong một micelle [6]. Trong mỗi trường hợp, sự kéo dài của primer bởi enzyme DNA Polymerase tạo ra một amplicon gắn kết (tethered amplicon) có thể dễ dàng phát hiện, định lượng và thao tác cho các ứng dụng tiếp theo bao gồm cloning, high-throughput DNA sequencing [7] và phát hiện SNP [8].
Ý tưởng trung tâm của SP-PCR là gắn đầu 5′-primer vào bề mặtrắn như: silic, polystyrene bead, thủy tinh, polydimethylsiloxane (PDMS), Cyclo-olefin Polymer
*(* *COP* *)* *,*Cyclic Olefin Copolymer *(* *COC* *)*và polypropylene (PP) bằng liên kết cộng hóa trịvà đầu 3’ tự do thay vì cho phép các primer tự do khuếch tán trong dung dịch với số lượng lớn(Adessi et. Al., 2000; Bing et al., 1996). ![ ](http://ibsgacademic.com/wp-content/uploads/2018/03/sp-pcr-02.png)
**Hình 1**[18]: Quá trình liên kết cộng hóa trị gắn các phân tử axit nucleic vào một lớp thủy tinh. Các bề mặt thuỷ tinh chứa nhóm hydroxyl (OH) được silan hóa bằng cách sử dụng amino-silan được minh họa ở đây bằng ATS. Các chất EDC và imidazole tạo ra mối liên kết giữa các bề mặt thủy tinh dẫn xuất amino và các modify oligonucleotide 5′-phosphat trong một phản ứng (a). Đối với hóa học liên kết chéo (b), một liên kết amit được hình thành giữa các nhóm amin của bề mặt và phần tử este succinimidyl của các hợp chất liên kết chéo được minh họa bằng các chất phản ứng s-MBS hoặc s-SIAB. Oligonucleotides, 5′-thiol được cải biến, phản ứng với một trong hai phần maleimid của các hợp chất s-MBS-like hoặc phần iodoacetamide của s-SIAB
Các primer sau đó tạo thành một thảm dày đặc (mật độ là ~ 10
11primer trên mm 2-Adessi và cộng sự, 2000-tương ứng với một khoảng cách trung bình từ ~ 5-10 nm giữa các primer, là chiều dài lớn nhất có thể của primer (contour length of a primer). Trong kỹ thuật này, khuếch đại có thể xảy ra thông qua hai quá trình. Đầu tiên, một DNA mục tiêu tự do có thể bị bắt trên bề mặt bởi các primer và sau đó sao chép bằng polymerase (hình 3, a-d), được gọi là *interfacial amplification*. Lưu ý rằng các bản sao vẫn gắn liền với bề mặt trong khi các phân tử DNA ban đầu quay trở lại dung dịch sau bước gắn primer (annealing step). Sau khi một số bản sao DNA được gắn vào bề mặt thông qua *interfacial amplification*, một bước khuếch đại thứ hai có thể xảy ra, quá trình ‘surface amplification’. Trong trường hợp này, các bản sao gắn kết bề mặt của các phân tử DNA cũng có thể lai với primer tương ứng và tạo thêm bản sao trong vùng lân cận của các bản sao ban đầu (hình 3, e-l). Điều quan trọng cần lưu ý là quá trình khuếch đại bề mặt này để lại cả hai phân tử gắn liền với bề mặt. Do đó, khuếch đại DNA pha rắn dẫn tới sự phát triển của một nhóm các phân tử gắn liền với bề mặt và nằm trong cùng một vùng. Đặc tính này có thể dễ dàng được khai thác trong việc thiết kế các DNA microarrays [9]. ![ ](http://ibsgacademic.com/wp-content/uploads/2018/03/sp-pcr-03.png)
**Hình 2**[18]: Khuếch đại DNA bằng PCR pha rắn. Các primer DNA (1 hoặc 2) là 5′-end gắn kết cộng hóa trị với chất rắn. Sự hiện diện của DNA mục tiêu trong dung dịch, nucleotide và enzyme polymerase có khả năng chịu nhiệt dẫn đến sự khuếch đại các phân tử DNA trên bề mặt rắn. Trong chu kỳ ban đầu chỉ có interfacial amplification, vì DNA mục tiêu chỉ có trong dung dịch. Trong các chu kỳ tiếp theo, ngoài interfacial amplification, surface amplificationcũng xảy ra giữa DNA mục tiêu được sao chép (5′-end gắn liền với bề mặt) và các primer trong vùng lân cận. ![ ](http://ibsgacademic.com/wp-content/uploads/2018/03/sp-pcr-04.png)
**Hình 3:**Mô tả quá trình SP-PCR. Trong chu kỳ đầu tiên (a-b-c-d), DNA được nhân bản bởi sự khuếch đại bề mặt. Kết quả là một ssDNA gắn liền với bề mặt thông qua primer, sau đó được thay thế bằng một DNA mục tiêu mới tự do trong dung dịch. Trong các chu kỳ sau (e-f-g-h và i-j-k-l), chỉ diễn ra quá trình khuếch đại bề mặt. Điều này dẫn đến một dòng DNA mục tiêu tại vị trí của primer đặc hiệu. Lưu ý rằng vì một phân tử luôn sinh ra chuỗi bổ sung của nó trong chu trình nhiệt, hai nhánh bổ sung sẽ có mặt trong một dòng và hai primer(forward và reverse primer) phải được gắn trên bề mặt rắn.
Để có SP-PCR, các primerđước gắn lên bề mặt rắn phải đáp ứng ba yêu cầu chính.
- Mật độ bề mặt của các primer được gắn lên bề mặt rắnphải đủ cao để phát hiện các sản phẩm khuếch đại DNA cố định bằng phương pháp hybridisation assay sau SP-PCR
- Liên kết cộng hóa trị giữa primer và bề mặt không nên bị ảnh hưởng bởi chu kỳ nhiệt lặp lại trong quá trình khuếch đại DNA.
Mỗi primer phải được cố định đầu5’lên bề mặt rắn và đảm bảo sự đặc hiệu trong suốt quá trìnhSP-PCR [3].
Một số phương pháp hóa học đã được nghiên cứu để gắn trực tiếp các oligonucleotides 5′-end trên bề mặt rắn như: liên kết cộng hóa trị giữa các oligonucleotide 5′-amino-modified và bề mặt thủy tinh tạo ra epoxy silan, oligonucleotide 5′-succinylated cố định trên bề mặt thủy tinh với dẫn xuất amin, gắn kết cộng hoá trị với 5′-termini sử dụng các cross-linkers tạo ra các liên kết đồng hóa trị (phenyldiisothiocyanate hoặc anhydrit maleic). Ngoài ra, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) – carbodiimide hydrochloride (EDC) cũng được sử dụng để gắn các nucleotide vào màng xenlulo thông qua nhóm 5′-phosphate.
### III. Quy trình thực hiện SP-PCR trên microbead [3]
**Bước 1: Chuẩn bị Fluorescently Encoded Microbeads (silica bead)**
Chuẩn bị silica bead có đường kính 6μm [10]
Các microbeads đã được bao phủ (coated)bởi aminopropylsilane, và bề mặt đã được dẫn xuất (derivatized) bằng acid adipic
**Bước 2: Chuẩn bị các Oligonucleotides**
Các Oligonucleotides không đánh dấu huỳnh quang và đánh dấu huỳnh quang được đặt mua từ các nhà cung cấp như GeneWorks (GeneWorks Pty. Ltd., Adelaide, Australia) và Invitrogen (Invitrogen Corporation, California, USA)
**Bước 3: Gắn (Coupling) Oligonucleotides (primer) lên Microbeads**
Đầu 5 ‘của forward primer được gắnlên những microbead được bao phủ bởi acidic acid bằng cách sử dụng 1-ethyl 3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDC). Các DNA gắn với microbead được thu nhận bằng cách ly tâm ở 10.000rpm trong 30 giây và rửa ba lần với 1 mL 0,1 M 2-morpholinoethane sulfonic acid (đệm MES bổ sung với 0,01% SDS) và được bảo quản ở 4
oC **Bước 4: Thực hiện phản ứng SP-PCR**
50 pg của single-stranded (ss) DNA template được khuếch đạitrong thể tích phản ứng 30uL
chứa 1.25 U of Taq DNA polymerase (GoTaq Flexi DNApolymerase, Promega Corporation, Wisconsin, USA), 0.2 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl2,1X PCR buffer (GoTaq PCR buffer, Promega), 0.1% Tween 20, 0.5µM of A488 reverse primer, khoảng 4×10
4microbeads đã gắn với đầu 5’forward primer.
Chu kỳ nhiệt PCR (PCR protocol) được thực hiện như sau:
|
|Nhiệt độ |
|Thời gian
|
|Bước 1 |94
|oC |1 phút|
|
|Bước 2 |94
|oC |1 phút|
|T
|a (temperature annealing) |2 phút|
|Lặp lại 30 chu kỳ|
|
|Bước 3 |72
|oC |5 phút|![ ](http://ibsgacademic.com/wp-content/uploads/2018/03/sp-pcr-05.png)
**Hình 4:**SP-PCR. Microbeads có gắn cố định forward primer tại đầu 5’đã nằm trong dung dịch chứa reverse primer và DNA mục tiêu (template). Giai đoạn Anneal (1) DNA bắt vào forward primer cố định trên microbead và cho phép Taq polymerase kéo dài-Extend (2) đầu 3 ‘của primer để tạo ra dsDNA (double strand DNA). dsDNA bị biến tính nhiệt-Denature (3) để cho phép reverse primer gắn vào (anneal) và tổng hợp một sợi amplicon bổ sung. Sự gắn của reverse primer vào dsDNA-Anneal (4)sẽ giúp kéo dài dsDNA-Extend (5) và sự lặp lại chu kỳ denaturation, annealing và kéo dài để tạo ra nhiều amplicon cố định. Mức độ nhân lên của SP-PCR được xác định bằng cách làm biến tính ampliconvà mẫu dògắn trên ssDNA cố định trên bề mặt cùng với một reverse primer có gắn huỳnh quang. Mức huỳnh quang được định lượng bằng cách sử dụng một flow cytometer **Bước 5: DNA Hybridization**
Sau SP- PCR, những amplicon cố định được làm biến tính tại 100°C trong 90 giây bởi 400uL buffer 4X SSC (0.6 M NaCl, 0.06 M sodium citrate) để tạo ra ssDNA cố định. The microbeads đượcthu nhận và bước biến tính được thực hiện lần thứ 2
*.*
50 ng của reverse primer có đánh dấu huỳnh quang được cho gắn với ssDNA cố định trên microbead trong 10uL dung dịch miliQ và 4uL hybridization buffer (50mM NaHPO3, 0.5 M NaCl, and 0.5% SDS). Phản ứng này được thực hiện tại nhiệt độ Ta (temperature annealing) của reverse primer trong 60 phút trong thiết bị ủ lắc với tốc độ 1400rpm.
Microbeads sau đó được rửa bằng dung dịch NaOH 0.1N và hòa tan trong 100uL dung dịch SDS 0.1% và chuẩn bị cho bước phân tích bằng flow cytometry.
**Bước 6: Phân tích hiệu quả SP-PCR bằng phương pháp Flow Cytometry**
Mật độ huỳnh quang trên bề mặt microbeads được đo đạc bằng cách sử dụng DakoCytomation Moflo flow Cytometer. Dữ liệu được thu thập dưới dạng biểu đồ logarit và được phân tích bởi phần mềm Summitv 4.0 để xác định lượng DNA được khuếch đại bởi SP-PC.
![ ](http://ibsgacademic.com/wp-content/uploads/2018/03/sp-pcr-06.png)
### IV. Đặc điểm nổi bậtcủa SP-PCR
Cơ chế của SP-PCR định hướng việc thiết kế thí nghiệm để thực hiện phản ứng khuếch đại chỉ diễn ra đối với các DNA đã được gắn lên bề mặt cố định thông qua forward primer.Quá trình SP-PCR được bắt đầu với việc ssDNA template bắt vào các forward cố định trên bề mặt rắn.Sự kéo dài của các primer được tạo ra bởi enzyme DNA polymerase tạo ra các amplicon. Các reverse primer sau đó bắt vào các amplicon cố định và trải qua giai đoạn kéo dài để tạo ra một bản sao của ssDNA template ban đầu. Vì vậy, SP-PCR sẽ chỉ tiếp diễn sau khi các amplicon được tạo ra. Điều này giúp cho SP-PCRlà công cụ giúp khắc phục hiệu quả được 2 nhược điểm chính của multiplex PCR trong dung dịch gồm:
- Sự hình thành primer-dimer bởi sự tương tác không thể kiểm soát giữa primer-primer và sự khuếch đại ưu thế của một trình tự mục tiêu so với các trình tự khác.
- Sự xác định chính xác các sản phẩm khuếch đại của multiplex PCR đòi hỏi một phương pháp phân tích thứ 2 sau điện di trên gel, đặc biệt trong trường hợp Multiplex RT-PCR (Reverse transcriptase PCR) như: slab gel electrophoresis, melting curve (Real time PCR), microarray hybridization hoặc điện di mao quản (capillary electrophoresis) để phân tách hoặc xác định kích thước.
Vì vậy, SP-PCR đã và đang được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực chẩn đoán nhanh phát hiện bệnh.
### V. Những ứng dụng của SP-PCR
**Phát hiện nhanh mầm bệnh trong thực phẩm **[14] ![ ](http://ibsgacademic.com/wp-content/uploads/2018/03/sp-pcr-07.png)
**Hình 6:**Nếu các mầm bệnh có mặt trong mẫu thử, thì DNA của chúng sẽ được ghi nhận bằng các đầu dò DNA đặc biệt cố định trên bề mặt bản SAF. Trong quá trình SP-PCR, hàng triệu bản sao của DNA gây bệnh sẽ được tạo ra, và các sản phẩm PCR sẽ được đánh dấu với thuốc nhuộm huỳnh quang (các sao cam) và được phát hiện qua bản SAF **Phát hiện nhanh RNA trong mẫu bệnh cúm gia cầm (AIV) **[15]
Bệnh virus cúm gia cầm (AIV) ở Châu Á và dịch bệnh động vật ở một số khu vực ở Châu Âu đã gây ra thiệt hại về kinh tế nghiêm trọng. Multiplex reverse-transcriptase (RT) PCR đã được phát triển để phát hiện và phân typ AIV. Tuy nhiên, số mục tiêu có thể được khuếch đại trong một lần chạy PCR bị hạn chế do nhiễu primer-dimer không kiểm soát được. Trong bài viết này, chúng tôi mô tả một thiết bị lab-on-a-chip để sàng lọc nhanh AIV bằng cách tích hợp DNA microarraydựa trên SP-PCR trên một chip microfluidic. Phương pháp UV cross-linking đơn giản đã được sử dụng để cố định các đầu dò DNA trên bề mặt thủy tinh không có các đệm gắn (unmodified glass surface), điều này làm cho việc tương tác giữa microarray với microfluidic rất thuận tiện. Phương pháp RT-SP-PCR kết hợp khuếch đại RT của RNA tách chiết trong pha lỏng và nested PCR riêng biệt trên pha rắn. Sử dụng phương pháp tiên tiến, virus AIV và các phân typ của chúng đã được xác định rõ ràng bằng các mô hình sản phẩm khuếch đại riêng biệt. Toàn bộ quá trình được giảm xuống dưới 1 giờ và thể tích mẫu được sử dụng trong chip microfluidic ít hơnít nhất 10 lần so với solution PCR. Bằng cách phân chia không gian các primer, sự khuếch đại cao có thể được thực hiện trong SP-PCR. Hơn nữa, multiplex PCR và phát hiện trình tự đã được thực hiện trong một bước, đơn giản hóa việc khảo nghiệm và giảm thời gian xử lý. Hơn nữa, bằng cách kết hợp microarray vào microchamber dựa trên chip PCR, mẫu và mức tiêu hao hóa chất giảm được rất nhiều, và các vấn đề hình thành bọt khí và bốc hơi dung dịch đã được ngăn chặn hiệu quả. Microchip PCR dựa trên microarray này có thể được sử dụng rộng rãi để phát hiện virut và giám sát hiệu quả dịch cúm gia cầm của chim trong môi trường hoang dã và vật nuôi gia cầm.
![ ](http://ibsgacademic.com/wp-content/uploads/2018/03/sp-pcr-08.png)
**Hình 7:**Mô tả về SP-PCR trên chip để phát hiện nhanh AIV (a) RNA virus và hỗn hợp RT-PCR được bơm lên bề mặt chip. (B) RNA được sao chép ngược để tạo thành cDNA trong chất lỏng. (C) cDNA được khuyếch đại bằng PCR với các primer tự do di chuyển. (D) Các PCR amplicon mới được khuếch đại trong pha lỏng tương tác với các đầu dò lồng nhau cố định trên bề mặt rắn. (E) Các đầu dò phù hợp được mở rộng bởi các enzyme polymerase. (F) Trong chu kỳ tiếp theo, các forward primer trong pha lỏng được gắn vào các đầu dò mở rộng. (G) Các sợi bổ sung được tạo thành và dùng làm mẫu mới cho việc khuếch đại pha rắn. Sau phản ứng, các sản phẩm PCR vẫn gắn với mặt kính thủy tinh thông qua liên kết cộng hóa trị và có thể được quan sát khi các forward primer được gắn đánh dấu huỳnh quang với Cy5. ![ ](http://ibsgacademic.com/wp-content/uploads/2018/03/sp-pcr-09.png)
**Hình 8:**Tính đặc hiệu của SP-PCR trên chip. (A) Microarray layout. Các máy dò DNA cho gen M và HA đặc hiệu cho H5 và H7 được thể hiện như các vòng tròn màu xám. Mỗi điểm có đường kính 150mm với khoảng cách center-to-centerlà 300 mm. Vòng tròn màu xanh lá cây là những chấm hướng dẫn sử dụng để định hướng. Hình ảnh huỳnh quang sau khi khuếch đại 40 chu kỳ của bốn dòng virut RNA khác nhau: (b) AIV H1N1, (c) AIV H5N1, (d) AIV H7N5 và (e) virus bệnh Newcastle (NDV). Sự phát huỳnh quang mạnh bên ngoài chip là do sự tự phát huỳnh quang của dư lượng PDMS **Phát hiện nhanh chóng sự biến đổi di truyền trong các bệnh ung thư** [18]
Lần đầu tiên một kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt/phát hiện trên bề mặt rắn (ISAD) được nghiên cứu để phát hiện đột biến điểm đơn có thể được thực hiện mà không cần đánh dấu huỳnh quang trong Real time PCR bằng cách sử dụng SPA (solid-phase amplification) trên thiết bị microring silicon (silicon microring-based solid-phase amplification) và enzyme khuếch đại đẳng nhiệt tái tổ hợp (RPA). Kỹ thuật ISAD được thực hiện trên một thiết bị microring silicon với một lỗ nhỏ chứa 10 μL hỗn hợp phản ứng, và đặc trưng để phát hiện sự đột biến điểm đơn gen HRAS (Harvey RAS). VớiSPA, primer của gen đích được gắn trực tiếp vào bề mặt của thiết bị thông qua một phản ứng với nhóm amine. Sự khuếch đại DNA được phát hiệnbằng cách đo sự thay đổi cộng hưởng bước sóng quang học của silic microring trong quá trình phản ứng. Độ nhạy của kỹ thuật ISAD đã được chứng minhcao hơn 100 lần của RPA và phương pháp PCR truyền thống (solution-PCR). Hơn nữa, kỹ thuật này có thể được sử dụng để phân biệt một đột biến điểm đơn của gen HRAS thông qua khuếch đại gen mục tiêu. Kỹ thuật ISAD sẽ hữu ích để phát hiện các trình tự thay đổi như đột biến và SNP được xem như DNA biomarkers trong bệnh của con người.
![ ](http://ibsgacademic.com/wp-content/uploads/2018/03/sp-pcr-11.png)
**Hình 9:**Sơ đồ đại diện các nguyên tắc của Isothermal SP-PCR / cơ chế phát hiện (A) Ban đầu, một primer được cố định bằng bề mặt của bộ cộng hưởng microring silic và hỗn hợp RPA được đặt trong dung dịch. (B) Các phức hợp enzyme recombinase (vàng) – các phức hợp primer kết hợp để tăng gấp đôi DNA mục tiêu và tạo sự thuận lợi cho việc bắt cặp ở 37 o C. (C) Sau khi dải di chuyển tạo thành một vòng lặp D bằng gp32 (xanh dương), các primer cố định được kéo dài bằng polymerase (màu xanh lá cây) trên bề mặt của bộ cộng hưởng microring silic. (D) sự hình thành của hai duplexes gây ra bởi sự khuếch đại của SP-PCR và solution PCR. (E) Sự khuếch đại DNA ở giai đoạn trên bề mặt rắn đạt được bằng cách lặp lại quá trình này. Trong quá trình phản ứng ISAD, sự khuếch đại và phát hiện mục tiêu đã được giám sát đồng thời bằng cách đo sự thay đổi bước sóng đối với các bộ cộng hưởng microring silic **Ứng dụng trong kỹ thuật giải trình tự NGS [17]** ![ ](http://ibsgacademic.com/wp-content/uploads/2018/03/sp-pcr-12.png)
**Hình 10:**Công nghệ NGS: chuẩn bị mẫu, giải trình tự-ghi nhận dữ liệu và phân tích dữ liệu. Đối với WGS, gDNA được cắt bỏ bằng sonication hoặc nebulisation để tạo thành các đoạn từ 300-500bp. Việc khuếch đại thư viện gen có thể được thực hiện bằng mô hình khuếch đại emPCR hoặc SP-PCR. Trong emPCR (A), một hỗn hợp phản ứng bao gồm một nhũ tương dầu-nước được tạo ra để “đóng gói” các phức hợp DNA-bead vào các giọt dung dịch nhỏ riêng lẽ. Khuếch đại PCR được thực hiện trong các giọt nhỏ này để tạo ra các hạt có chứa vài ngàn bản sao của cùng một trình tự mẫu. Các hạt EmPCR có thể được gắn vào một tấm kính hoặc đưa vào các giếng PicoTiterPlate. SP-PCR (B) bao gồm hai bước cơ bản: khởi đầu và mở rộng mô hình một đơn phân tử, và ssDNA khuôn mẫu không cố định với các primers liền kề để tạo thành các cụm. (C) Giải trình tự và hình ảnh ghi nhận sử dụng một trong những nền tảng được mô tả ở trên. (D) Phân tích dữ liệu sử dụng phần mềm sẵn có hoặc quy trình công việc được tích hợp như GATK.
### VI.
**Tối ưu các thông số cho SP-PCR:**
– Rửa microbead với buffer PCR trước khi khuếch đại là điều cần thiết cho sự thành công của SP-PCR.
– Nồng độion Magiê dao động từ 2 đến 3 mM và khuếch đại tối ưu là 2,5 mM.
– Sử dụng 4×104 microbead cho SP-PCR, lượng forward primer thay đổi theo lượng microbead được sử dụng, thông thường khoảng 0.17pmol cho mỗi 4×104 microbead. Một nữa lượng microbead không ảnh hưởng đến sự hình thành các amplicon cố định, trong khi đó lượng bead cao hơn sẽ làm giảm sự hình thành amplicon cố định của SP-PCR
– Thời gian 2 phút là tối ưu cho giai đoạn bắt cặp bổ sung giữa DNA và primer cố định
– Tín hiệu huỳnh quang tăng (lượng amplicon tăng) khi nồng độ DNA template tăng (hình 3). Nhưng khi nồng độ DNA template tăng đến 1ng thì không có sự thay đổi đáng kể lượng amplicon được tạo ra bởi sự bảo hòa trên bề mặt microbead bởi PCR product
![ ](http://ibsgacademic.com/wp-content/uploads/2018/03/sp-pcr-13.png)
**Hình 11:**Biểu diễn sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang tương ứng với nồng độ DNA template
### VII.
**Kết luận:**
- Quy trình khuếch đại DNA theo SP-PCR có thể được tách ra theo ba bước riêng biệt-annealing, extension và denaturation-được lặp đi lặp lại theo một cơ chế chuyên biệt của SP-PCR. Trong chu kỳ đầu tiên, interfacial amplificationlà loại khuyếch đại duy nhất có thể. Kết quả của chu trình đầu tiên là thu được một số lượng nhất định DNA gắn với bề mặt rắn thông qua các forward primer. Trong các chu kỳ tiếp theo, surface amplificationcũng có thể xảy ra vì một số DNA mục tiêuđã được gắn vào bề mặt. Tuy nhiên, khi hai quá trình interfacial amplification và surface amplification cùng tồn tại, sự khuếch đại dạng interfacial amplificationthường chiếm ưu thế hơn (Adessi và cộng sự, 2000). Do đó, để thực hiện quá trình surface amplification, dung dịch ban đầu phải được rửa sạch và thay thế bằng dung dịch không có các DNA mục tiêu. Sau đó, surface amplificationlà khuếch đại duy nhất có thể và chu trình nhiệt độ có thể được bắt đầu trở lại. Kết quả của surface amplificationlà để có được một phân tử ssDNA mới gắn liền với bề mặt ngay sausợi ban đầu (Hình 3, h-i). Lưu ý rằng độ dài của các phân tử được sử dụng trong SPA thường là 400 base (chiều dài đường kính ~ 170 nm). Bán kính của sự chuyển động trong pha hybridization(ssDNA) là khoảng ~ 15-20 nm, lớn hơn khoảng cách trung bình giữa các primer gần nhất (~ 5-10 nm). Ngoài ra, chiều dài DNA điển hình lớn hơn nhiều so với độ dài của ssDNA (~ 10 base hoặc ~ 4 nm) nhưng tương tự như dsDNA (~ 150 basepairs hoặc ~ 51 nm). Do đó, phân tử rất linh hoạt trong pha hybridization, và không có vấn đề cần uốn cong để tìm primers phù hợp. Tuy nhiên, khi kết thúc giai đoạn kéo dài (khi phân tử hoàn toàn là sợi đôi), nó sẽ trở nên cứng và phải chịu áp suất uốn cong đáng kể.
- Hiệu quả khuếch đạicủa SP-PCRtrong một vùngtrên bề mặt được bao phủ bằng nhiều bản sao của DNA đích và xem như là một DNA colony. Số colony phụ thuộc vào số lượng các DNA mục tiêubắt được (captutred) trên bề mặt rắn bởi forward primer (trong giai đoạn interfacial amplification) trước khi những lượng DNA còn tự do được rửa sạch. Nếu các DNA mục tiêu khác nhau cùng bắt (captured) vào các forward primer cố định khác nhau, sẽ có nhiều loại DNA colony trên bề mặt.
- Quá trình mô tả trong hình 3 tương ứng với trường hợp lý tưởng, trong đó primer không bị loại bỏ khỏi bề mặt. Trong thực tế, việc nung nóng và làm mát tiếp theo của dung dịch có thể khiến các forward primer tách ra khỏi bề mặt, tùy thuộc vào loại vật liệu được sử dụng làm bề mặt rắn và linker gắn forward primer vào bề mặt rắn. Vì vậy cần nghiên cứu kỹ protocol cho việc cố định các primer khi bắt đầu với SP-PCR[11].
- Số lượng các phân tử trong một vùng thuộc SPA không tăng theo cấp số nhân (ngoại trừ vài chu kỳ đầu tiên) như trong trường hợp solution- PCR do sự phân bố của phân tử.
- Đặc điểm trong cơ chế của SP-PCR trong tăng trưởng hình học và phân bố kích thước rõ ràng không bị ảnh hưởng bởi các phân tử xâm nhiễm từ bên ngoài bởi sự bắt cặp đặc hiệu rất cao.
- AmpaSand bead có thể là một sự lựa chọn đáng xem xét cho SP-PCR [18]
**Nguyễn Thanh Phượng** **Tài liệu tham khảo**
- Mercier, Jean-Francois, Gary W. Slater, and Pascal Mayer. “Solid phase DNA amplification: a simple Monte Carlo Lattice model.” Biophysical journal 85.4 (2003): 2075-2086.
- Ramkumar Palanisamy., et al., Considerations of Solid-Phase DNA Amplification, Bioconjugate Chem.2010,21,690–695
- Celine Adessi., et al., Solid Phase DNA amplification: Characterisation of primer attachment and amplification mechanism, DOI: 10.1093/nar/28.20.e87, Nucleic Acids Research 28(20):E87, 2000
[Amplicon](https://en.wikipedia.org/wiki/Amplicon). Wikipedia. [Microbead](https://en.wikipedia.org/wiki/Microbead). Wikipedia. [Micelle](https://en.wikipedia.org/wiki/Micelle). Wikipedia. [High-throughput sequencing](http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/highthroughput2.html). Sumanas, Inc.
- Kwok, Pui-Yan, and Xiangning Chen. “Detection of single nucleotide polymorphisms.” (2003).
[DNA microarray](https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_microarray). Wikipedia.
- Miller, C. R., Vogel, R., Surawski, P. P., Jack, K. S., Corrie,S. R., and Trau, M. (2005) Functionalized organosilica micro-spheres via a novel emulsion-based route. Langmuir 21, 9733–40.
- Jochen Hoffmann,*a Sebastian Hin,a Felix von Stetten,ab Roland Zengerleabc and Günter Rothabc.,Universal protocol for grafting PCR primers onto various lab-on-a-chip substrates for solid-phase PCR.,3885–3889,DOI: 10.1039/c2ra01250b, RSC Advances, 2012, 2.
- AmpaSand
®Bead technology. Genera Biosystems
- Shin, Yong, et al. “Real-time, label-free isothermal solid-phase amplification/detection (ISAD) device for rapid detection of genetic alteration in cancers.” Lab on a Chip 13.11 (2013): 2106-2114.
[Fast detection of pathogens in food](http://www.nanotech.dtu.dk/english/Samples-newsletter/Dec-15/Smartdetect). DTU Nanotech.
- Yi Sun.,et al.,A lab-on-a-chip device for rapid identification of avian influenza viral RNA by solid-phase PCR, DOI: 10.1039/c0lc00528b, Lab on a chip journal, 8, 2011
- El Mustapha Bahassi, Peter J Stambrook.,Next-generation sequencing technologies: Breaking the sound barrier of human genetics, DOI: 10.1093/mutage/geu031, 2014
- Yong Shin., et al.,Real-time, label-free isothermal solid-phase amplification/detection (ISAD) device for rapid detection of genetic alteration in cancers, DOI: 10.1039/C3LC50129A, Lab on a chip journal, 11, 2013
- AmpaSand
®Bead technology. Genera Biosystems

WARC-Type: response

Content-Type: application/http; msgtype=response

WARC-Identified-Payload-Type: text/html

X-UA-Compatible: IE=edge

X-Crawler-Content-Encoding: gzip

Content-Type: text/html; charset=UTF-8

Accept-Ranges: bytes

Vary: Accept-Encoding, User-Agent

X-Cache: uncached

X-Cache-Hit: MISS


text: Một số ứng dụng của microbiome trong thực vật Khi đề cập đến các microbiome (hệ vi sinh vật), hầu hết mọi người đều nghĩ rằng chúng là một đội quân to lớn bao gồm các vi khuẩn và nấm phát triển mạnh mẽ bên trong cơ thể con... Đọc tiếp


text: Neeuss như vị trí như Vinhomes Central Park được gọi là vị trí vàng thì vị trí dự án Vinhomes Golden River được đánh giá là vị trí kim cương lần đầu tiên tại thành phố Hồ Chí Minh có một dự án được đầu tư với số vốn lên đến hơn hàng chục ngàn tỷ đồng tọa lạc tại một vị trí đẹp giữa lòng trung tâm thành phố lại có hướng view sông tuyệt đẹp rất thích hợp với nhu cầu và mục đích của các cư dân nằm trong phân khúc cao cấp. Phong cách hay điểm nhấn chính của dự án này là lối thiết kế đẹp mắt tiện lợi mang đến cho người sở hữu những căn hộ tại đây một không gian sống đẳng cấp thoải mái nhất. Được thiết kế theo tiêu chuẩn Châu Âu hiện đại, mỗi căn hộ Vinhomes Golden River có tối thiểu 1 phòng ngủ đến 5 phòng ngủ. Ngôi nhà này được tận hưởng tối đa ánh sáng thiên nhiên và gió trời thông qua hệ thống cửa sổ được tính toán tỉ mỉ và thiết kế hợp lý. Hơn thế nữa, cư dân sống trong Vinhomes Golden River còn được tận hưởng đầy đủ các dịch vụ tiện ích nội khu như: công viên cây xanh, trung tâm thương mai, Hồ bơi, pa, Gym, TDTTT, khu sinh hoạt cộng đồng, khu vui chơi, Bệnh Viện Vinmec, Trường Học Vinschools,... Vinhomes là thương hiệu bất động sản uy tín do tập đoàn Vingroup thực hiện đây là tập đoàn uy tín nhất Việt Nam trong lĩnh vực bất động sản. Các dự án: Vinhomes Central Park, Vinhomes Đồng Khởi... đã khẳng định thương hiệu Vinhomes trên thị trường và uy tín đối với khách hàng. Nếu lựa chọn dự án Vinhomes Golden River để đầu tư bạn có thể hoàn toàn an tâm vào quyết định của mình bởi những dự án đẳng cấp như thế này được tập đoàn Vingroup đầu tư rất tốt cả về mặt thiết kế lẫn xây dựng mục đích là giúp cho những khách hàng hay nói đúng hơn là những cư dân sống trong khu đô thị này được tận hưởng một cuộc sống thoải mái đầy đủ tiện nghi.

Server: Apache

Cache-control: private, max-age=0

X-Frame-Options: SAMEORIGIN

Vary: Accept-Encoding

Keep-Alive: timeout=5, max=100

Connection: Keep-Alive


text:
WOBBLER QUẢNG CÁO SẢN PHẨM
wobbler quảng cáo, wobbler kẹp sắt, wobbler nhựa để bàn, con lắc quảng cáo, kẹp quảng cáo bằng nhựa, posm trưng bày tại điểm bán lẻ, siêu thị.
WOBBLER QUẢNG CÁO SẢN PHẨM
wobbler quảng cáo, wobbler kẹp sắt, wobbler nhựa để bàn, con lắc quảng cáo, kẹp quảng cáo bằng nhựa, posm trưng bày tại điểm bán lẻ, siêu thị.

markdown:
**WOBBLER QUẢNG CÁO SẢN PHẨM** *wobbler* quảng cáo, *wobbler* kẹp sắt, *wobbler* nhựa *để bàn*, con lắc quảng cáo, kẹp quảng cáo bằng nhựa, posm trưng bày tại điểm bán lẻ, siêu thị.
**WOBBLER QUẢNG CÁO SẢN PHẨM** *wobbler* quảng cáo, *wobbler* kẹp sắt, *wobbler* nhựa *để bàn*, con lắc quảng cáo, kẹp quảng cáo bằng nhựa, posm trưng bày tại điểm bán lẻ, siêu thị.

Cache-Control: no-store, no-cache, must-revalidate

Pragma: no-cache

X-Crawler-Transfer-Encoding: chunked

Vary: Accept-Encoding,User-Agent

Server: LiteSpeed

Connection: close


text:
Thiết kế miễn phí
Chất lượng ISO
Giá tốt nhất Hà Nội
Giao hàng miễn phí
Dịch vụ hoàn hảo
Top 3 loại khăn ướt dạng viên nén tốt nhất hiện nay
0947 944 944

Server: nginx

Connection: keep-alive

Cache-Control: no-store, no-cache, must-revalidate, post-check=0, pre-check=0


text:
Giới thiệu
Đối với các doanh nghiệp hoạt động trong lĩnh vực kinh doanh dịch vụ, chuỗi nhà hàng, khách sạn, karaoke… thì khăn lạnh khăn ướt là sản phẩm với khả năng truyền tải thông điệp cũng như gây ấn tượng vô cùng tốt. Loại sản phẩm này cũng giúp khẳng định độ chuyên nghiệp và chu đáo của chất lượng dịch vụ. Và chắc chắn, công ty sản xuất khăn lạnh khăn ướt tại Hà Nội nào đảm bảo chất lượng cũng như yếu tố kinh tế là điều được nhiều doanh nghiệp quan tâm và tìm kiếm.
Công ty sản xuất khăn lạnh khăn ướt tại Hà Nội chuyên nghiệp và uy tín là nơi các doanh nghiệp, hộ kinh doanh, công ty tổ chức sự kiện, nhà hàng, nhà xe… đặt niềm tin về sự độc đáo của mẫu mã sản phẩm, chất lượng sản phẩm. Vì thế, tìm được một công ty như vậy trong số rất nhiều công ty trên thị trường hiện nay là điều không dễ dàng.
- Lựa chọn nào khi tìm kiếm công ty sản xuất khăn lạnh khăn ướt tại Hà Nội?
Nhắc tới công ty sản xuất khăn ướt khăn lạnh tại Hà Nội thì có vô số địa chỉ với những mức giá khác nhau, chất lượng sản phẩm cũng vì thế mà khác nhau.
Tuy nhiên, in ấn Kim Trọng là thương hiệu nổi bật trong nhiều năm nay và nhận được sự tín nhiệm của đông đảo các doanh nghiệp hoạt động trong lĩnh vực dịch vụ.
Kim Trọng tự hào là địa chỉ sản xuất khăn ướt khăn lạnh với chất lượng tốt nhất tại Hà Nội. Đồng thời, giá thành cũng tốt nhất cho khách hàng.
Kim Trọng mang tới cho khách hàng vô số lựa chọn từ thiết kế mẫu mã cho tới lựa chọn chất liệu, bao bì… Đội ngũ thiết kế chuyên nghiệp và sáng tạo đảm bảo làm hài lòng ngay cả những khách hàng khó tính nhất.
Đặc biệt, sử dụng tới 3 phương pháp in ấn khác nhau. Trong đó, có 2 công nghệ in máy hiện đại, cho phép tạo ra mẫu mã sản phẩm độc đáo, có độ sắc nét hoàn hảo nhất, tốt nhất.
Lựa chọn Kim Trọng là lựa chọn sản phẩm tâm đắc nhất cho bạn
- Khách hàng được gì khi chọn lựa Kim Trọng?
- Luôn luôn dành nhiều nhất sự lụa chọn cho khách hàng từ hình thức và mẫu mã bao bì, lõi khăn cho tới công nghệ in ấn.
- Thiết kế, tư vấn mẫu sản phẩm hoàn toàn miễn phí.
- Đảm bảo chất lượng tốt nhất thị trường mà vẫn đáp ứng được giá thành tốt nhất cho khách hàng.
- Quá trình đặt hàng, giao hàng và thanh toán vô cùng linh hoạt, đơn giản.
- Các sản phẩm khăn ướt khăn lạnh khi được sản xuất bởi Kim Trọng đảm bảo tuyệt đối an toàn vệ sinh thực phẩm của Bộ Y Tế.
- Luôn có chương trình ưu đãi tốt nhất cho khách hàng.
Kim Trọng luôn cam kết mang tới những sản phẩm hoàn hảo nhất cho khách hàng
Đặc biệt, mạng lưới hoạt động của Kim Trọng rộng khắp cả nước với các tỉnh thành khác nhau, cho phép khách hàng khắp mọi miền tổ quốc đều được phụ vụ nhanh nhất, chú đáo nhất và linh hoạt nhất.
Nếu bạn đang tìm kiếm một công ty sản xuất khăn lạnh khăn ướt tại Hà Nội có kinh nghiệm cũng như uy tín thì chắc chắn không nên bỏ qua In Kim Trọng.
CÔNG TY IN KIM TRỌNG có trụ sở tại địa chỉ: Số 21 ngõ 75 Nguyễn Xiển, Thanh Xuân, Hà Nội và được thành lập vào 19/6/2013.
Hoạt động trong các lĩnh vực: sản xuất các mặt hàng khăn ướt khăn lạnh đơn chiếc dùng 1 lần, in các sản phẩm trên giấy: bao đũa, hóa đơn, order, vé gửi xe, giấy lót bàn….chuyên cung cấp cho các nhà hàng, karaoke, tiệc cưới, khách sạn…..
In Kim Trọng với đội ngũ nhân viên trẻ năng động nhiệt tình chu đáo, chăm sóc khách hàng 24/24. Đến nay, IN KIM TRỌNG tiếp tục mở rộng thêm quy mô và các chi nhánh mới ở Bắc Ninh, Đông Anh……và hệ thống các nhà phân phối, đại lí ở khắp các tỉnh: Quảng Ninh, Lào Cai, Ninh Bình, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Hưng Yên, Hải Phòng, Hải Dương…..cùng với sản lượng hơn gần 2.000 thùng sản phẩm/ tháng, có chỗ đứng vững chắc trên thị trường hiện nay.
Mục tiêu: ” SẢN PHẨM CAO CẤP – GIÁ THÀNH TỐT NHẤT THỊ TRƯỜNG HÀ NỘI – DỊCH VỤ CHUYÊN NGHIỆP UY TÍN “
Mọi thông tin xin liên hệ:
CÔNG TY IN KIM TRỌNG
Điện thoại hỗ trợ đặt hàng: 086 9999 099 – 0947 944 944
Email hỗ trợ: inkimtrong@gmail.com
Trụ sở chính : Số 21 ngõ 75 Nguyễn Xiển, Thanh Xuân, Hà Nội
Cơ sở 2: Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh.
Cơ sở 3: Phố Vân Trì, Đông Anh, Hà Nội.
Website: http://inkimtrong.vn
Facebook: https://www.facebook.com/inkhanlanhkhanuot/
In Kim Trọng chuyên cung cấp khăn lạnh, khăn ướt, vỏ bao đũa, bao tăm, bao thìa… các nhà hàng, khách sạn, quán karaoke, du lịch… Hotline: 0947 944 944

markdown:
## Giới thiệu
Đối với các doanh nghiệp hoạt động trong lĩnh vực kinh doanh dịch vụ, chuỗi nhà hàng, khách sạn, karaoke… thì khăn lạnh khăn ướt là sản phẩm với khả năng truyền tải thông điệp cũng như gây ấn tượng vô cùng tốt. Loại sản phẩm này cũng giúp khẳng định độ chuyên nghiệp và chu đáo của chất lượng dịch vụ. Và chắc chắn,
**công ty sản xuất khăn lạnh khăn ướt tại Hà Nội** nào đảm bảo chất lượng cũng như yếu tố kinh tế là điều được nhiều doanh nghiệp quan tâm và tìm kiếm.
Công ty sản xuất khăn lạnh khăn ướt tại Hà Nội chuyên nghiệp và uy tín là nơi các doanh nghiệp, hộ kinh doanh, công ty tổ chức sự kiện, nhà hàng, nhà xe… đặt niềm tin về sự độc đáo của mẫu mã sản phẩm, chất lượng sản phẩm. Vì thế, tìm được một công ty như vậy trong số rất nhiều công ty trên thị trường hiện nay là điều không dễ dàng.
**Lựa chọn nào khi tìm kiếm công ty sản xuất khăn lạnh khăn ướt tại Hà Nội?**
Nhắc tới công ty sản xuất khăn ướt khăn lạnh tại Hà Nội thì có vô số địa chỉ với những mức giá khác nhau, chất lượng sản phẩm cũng vì thế mà khác nhau.
Tuy nhiên, in ấn
**Kim Trọng** là thương hiệu nổi bật trong nhiều năm nay và nhận được sự tín nhiệm của đông đảo các doanh nghiệp hoạt động trong lĩnh vực dịch vụ. **Kim Trọng** tự hào là địa chỉ sản xuất khăn ướt khăn lạnh với chất lượng tốt nhất tại Hà Nội. Đồng thời, giá thành cũng tốt nhất cho khách hàng. **Kim Trọng** mang tới cho khách hàng vô số lựa chọn từ thiết kế mẫu mã cho tới lựa chọn chất liệu, bao bì… Đội ngũ thiết kế chuyên nghiệp và sáng tạo đảm bảo làm hài lòng ngay cả những khách hàng khó tính nhất.
Đặc biệt, sử dụng tới 3 phương pháp in ấn khác nhau. Trong đó, có 2 công nghệ in máy hiện đại, cho phép tạo ra mẫu mã sản phẩm độc đáo, có độ sắc nét hoàn hảo nhất, tốt nhất.
![ công ty in khăn lạnh khăn ướt tại Hà Nội](http://inkimtrong.vn/wp-content/uploads/2017/05/khan-lanh-quan-bia.jpg)
**Kim Trọng công ty in khăn lạnh khăn ướt tại Hà Nội**
Lựa chọn
**Kim Trọng** là lựa chọn sản phẩm tâm đắc nhất cho bạn **Khách hàng được gì khi chọn lựa Kim Trọng?**
- Luôn luôn dành nhiều nhất sự lụa chọn cho khách hàng từ hình thức và mẫu mã bao bì, lõi khăn cho tới công nghệ in ấn.
- Thiết kế, tư vấn mẫu sản phẩm hoàn toàn miễn phí.
- Đảm bảo chất lượng tốt nhất thị trường mà vẫn đáp ứng được giá thành tốt nhất cho khách hàng.
- Quá trình đặt hàng, giao hàng và thanh toán vô cùng linh hoạt, đơn giản.
- Các sản phẩm khăn ướt khăn lạnh khi được sản xuất bởi
**Kim Trọng**đảm bảo tuyệt đối an toàn vệ sinh thực phẩm của Bộ Y Tế.
- Luôn có chương trình ưu đãi tốt nhất cho khách hàng.
![ in khăn lạnh nhà hàng](http://inkimtrong.vn/wp-content/uploads/2017/05/khan-lanh-cho-cac-nha-hang.jpg)
**Thiết kế khăn lạnh nhà hàng** **Kim Trọng** luôn cam kết mang tới những sản phẩm hoàn hảo nhất cho khách hàng
Đặc biệt, mạng lưới hoạt động của
**Kim Trọng** rộng khắp cả nước với các tỉnh thành khác nhau, cho phép khách hàng khắp mọi miền tổ quốc đều được phụ vụ nhanh nhất, chú đáo nhất và linh hoạt nhất.
Nếu bạn đang tìm kiếm một công ty sản xuất khăn lạnh khăn ướt tại Hà Nội có kinh nghiệm cũng như uy tín thì chắc chắn không nên bỏ qua
**In Kim Trọng**. **CÔNG TY IN KIM TRỌNG** có trụ sở tại địa chỉ: Số 21 ngõ 75 Nguyễn Xiển, Thanh Xuân, Hà Nội và được thành lập vào 19/6/2013.
Hoạt động trong các lĩnh vực: sản xuất các mặt hàng
**khăn ướt khăn lạnh đơn chiếc dùng 1 lần**, in các sản phẩm trên giấy: **bao đũa, hóa đơn, order, vé gửi xe, giấy lót bàn**….chuyên cung cấp cho các *nhà hàng, karaoke, tiệc cưới, khách sạn…..*
In Kim Trọng với đội ngũ nhân viên trẻ năng động nhiệt tình chu đáo, chăm sóc khách hàng 24/24. Đến nay, IN KIM TRỌNG tiếp tục mở rộng thêm quy mô và các chi nhánh mới ở
**Bắc Ninh, Đông Anh**……và hệ thống các nhà phân phối, đại lí ở khắp các tỉnh: **Quảng Ninh, Lào Cai, Ninh Bình, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Hưng Yên, Hải Phòng, Hải Dương**…..cùng với sản lượng hơn **gần 2.000 thùng** sản phẩm/ tháng, có chỗ đứng vững chắc trên thị trường hiện nay.
Mục tiêu: ”
* “ SẢN PHẨM CAO CẤP – GIÁ THÀNH TỐT NHẤT THỊ TRƯỜNG HÀ NỘI – DỊCH VỤ CHUYÊN NGHIỆP UY TÍN* **Mọi thông tin xin liên hệ:** **CÔNG TY IN KIM TRỌNG**
Điện thoại hỗ trợ đặt hàng:
** 086 9999 099 – 0947 944 944**
Email hỗ trợ:
**inkimtrong@gmail.com**
Trụ sở chính :
**Số 21 ngõ 75 Nguyễn Xiển, Thanh Xuân, Hà Nội**
Cơ sở 2:
**Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh**.
Cơ sở 3:
**Phố Vân Trì, Đông Anh, Hà Nội.**
Website
**: http://inkimtrong.vn**
Facebook:
**https://www.facebook.com/inkhanlanhkhanuot/**
In Kim Trọng chuyên cung cấp khăn lạnh, khăn ướt, vỏ bao đũa, bao tăm, bao thìa… các nhà hàng, khách sạn, quán karaoke, du lịch… Hotline: 0947 944 944

Link: <http://inkimtrong.vn/wp-json/>; rel="https://api.w.org/", <http://inkimtrong.vn/?p=32>; rel=shortlink


text:
Tưng bừng khuyến mãi - tri ân khách hàng nhân dịp tết Đinh Dậu 2017
- Thứ sáu - 20/01/2017 22:02
- |In ra
- |Đóng cửa sổ này
Nhằm tri ân quý khách hàng đã luôn sát cánh ủng hộ các dịch vụ của Vungtau Intourco Resort trong thời gian qua. Vungtau Intourco Resort xin trân trọng gửi đến quý khách hàng chương trình khuyến mãi nhân dịp tết Đinh Dậu.
- “Bữa cơm thân mật”: Như thường lệ vào chiều 30 tết Đinh Dậu ( 27/01/2017), Vungtau Intourco Resort tổ chức bữa cơm thân mật dành cho Qúy khách đang lưu trú tại Resort. Nhằm mang lại những giây phút thanh bình đầm ấm như bữa cơm gia đình Việt vào dịp năm hết tết đến.
- Kính mời quý khách cùng thưởng thức MÚA LÂN SƯ RỒNG đón chào năm mới vào khoảng 8h00-8h30 MÙNG 1 TẾT ĐINH DẬU (28/01/2017).
- Nhân dịp tết Đinh Dậu 2017 vào các tối Mùng 5 tết, 6 tết, 7 tết và 8 tết Đinh Dậu, Vungtau Intourco Resort tổ chức tiệc Buffet tối miễn phí cho Qúy khách lưu trú tại Resort trong một không gian rộng rãi thoáng mát nằm sát biển.

markdown:
# Tưng bừng khuyến mãi - tri ân khách hàng nhân dịp tết Đinh Dậu 2017
- Thứ sáu - 20/01/2017 22:02
-
|
[In ra](javascript:;)
-
|
[Đóng cửa sổ này](javascript:;) ![ Tưng bừng khuyến mãi - tri ân khách hàng nhân dịp tết Đinh Dậu 2017](http://intourcoresort.com.vn/files/news/thumb/dsc_0002_1.jpg)
Nhằm tri ân quý khách hàng đã luôn sát cánh ủng hộ các dịch vụ của Vungtau Intourco Resort trong thời gian qua. Vungtau Intourco Resort xin trân trọng gửi đến quý khách hàng chương trình khuyến mãi nhân dịp tết Đinh Dậu.
![ ](http://intourcoresort.com.vn/uploads/news/2017_01/nha-hang-copy.jpg)
- “
**Như thường lệ vào chiều 30 tết Đinh Dậu ( 27/01/2017), Vungtau Intourco Resort tổ chức bữa cơm thân mật dành cho Qúy khách đang lưu trú tại Resort. Nhằm mang lại những giây phút thanh bình đầm ấm như bữa cơm gia đình Việt vào dịp năm hết tết đến.** *Bữa cơm thân mật”:*
- Kính mời quý khách cùng thưởng thức
**MÚA LÂN SƯ RỒNG**đón chào năm mới vào khoảng 8h00-8h30 MÙNG 1 TẾT ĐINH DẬU (28/01/2017).
- Nhân dịp tết Đinh Dậu 2017 vào các tối Mùng 5 tết, 6 tết, 7 tết và 8 tết Đinh Dậu, Vungtau Intourco Resort tổ chức tiệc
**cho Qúy khách lưu trú tại Resort trong một không gian rộng rãi thoáng mát nằm sát biển.** *Buffet tối miễn phí* ![ ](http://intourcoresort.com.vn/uploads/news/2017_01/nha-hang-copy.jpg)

WARC-Identified-Payload-Type: application/xhtml+xml

Content-Language: vi

Cache-Control: no-cache, pre-check=0, post-check=0

Set-Cookie: nv3c_Qj31p_nvvithemever=lQ%2C%2C; expires=Thu, 19-Sep-2019 16:30:33 GMT; Max-Age=31536000; path=/; domain=.intourcoresort.com.vn; httponly

Content-Type: text/html; charset=utf-8


text:
1. Lãnh đạo Viện:
a) Lãnh đạo Viện có Viện trưởng và không quá 03 Phó Viện trưởng do Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn bổ nhiệm, miễn nhiệm theo quy định;
Viện trưởng điều hành hoạt động của Viện, chịu trách nhiệm trước Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn và trước pháp luật về hoạt động của Viện;
b) Phó Viện trưởng giúp Viện trưởng theo dõi, chỉ đạo một số mặt công tác theo sự phân công của Viện trưởng và chịu trách nhiệm trước Viện trưởng, trước pháp luật về nhiệm vụ được phân công.
2. Các Phòng chức năng:
a) Phòng Tổ chức, Hành chính;
b) Phòng Khoa học và Hợp tác quốc tế;
c) Phòng Tài chính, Kế toán.
3. Các Bộ môn nghiên cứu:
a) Bộ môn Nghiên cứu Chính sách và Chiến lược;
b) Bộ môn Nghiên cứu Thị trường và Ngành hàng;
c) Bộ môn Nghiên cứu Kinh tế Tài nguyên và Môi trường;
d) Bộ môn Nghiên cứu Thể chế nông thôn.
4. Các Trung tâm trực thuộc:
a) Trung tâm Thông tin phát triển nông nghiệp nông thôn;
b) Trung tâm Tư vấn Chính sách nông nghiệp;
c) Trung tâm Phát triển Nông thôn;
d) Trung tâm Chính sách và Chiến lược nông nghiệp nông thôn Miền Nam.
Các Trung tâm là tổ chức sự nghiệp công lập trực thuộc Viện có tư cách pháp nhân, có con dấu, có tài khoản riêng, hoạt động theo quy định của pháp luật.
Phòng có Trưởng phòng và không quá 02 Phó Trưởng phòng, Bộ môn có Trưởng Bộ môn và không quá 02 Phó Trưởng Bộ môn, Trung tâm có Giám đốc Trung tâm và không quá 02 Phó Giám đốc Trung tâm do Viện trưởng quyết định bổ nhiệm, miễn nhiệm theo quy định của pháp luật.
Viện trưởng quy định chức năng, nhiệm vụ của các tổ chức trực thuộc Viện; bố trí sắp xếp công chức, viên chức và người lao động phù hợp với vị trí việc làm; xây dựng trình Bộ phê duyệt Điều lệ tổ chức và hoạt động của Viện theo quy định của pháp luật.
© 2006 Viện Chính sách và Chiến lược Phát triển Nông nghiệp Nông
thôn - IPSARD
Số 16 Thụy Khuê - Tây Hồ - Hà nội.
Tel: 04-39722067, Fax: 84-4-39711062. Email:ipsard@fpt.vn, agroinfo@ipsard.gov.vn
Số giấy phép 234/GP-BC

Cache-Control: private


text:
Toggle navigation
Home
Phim Sex HD
Phim Sex Nhật Bản
Hiếp Dâm
Học Sinh
Loạn Luân
Việt Nam
Tập Thể
You can skip ad in xx second
Skip Ad
loading...
lonni bella bbw chocolate fucked by bbc
603,201
Download
Share
Bạn Đang Xem lonni bella bbw chocolate fucked by bbc , Bạn có thể tải lonni bella bbw chocolate fucked by bbc , miễn phí tại JavNoi.com. Chúc bạn xem phim lonni bella bbw chocolate fucked by bbc , Vui vẻ!
360p
Tags:

Set-Cookie: __cfduid=dda9e67ce8853da3eeb5786fbdb44c7b21537375853; expires=Thu, 19-Sep-19 16:50:53 GMT; path=/; domain=.javnoi.com; HttpOnly

X-XSS-Protection: 1; mode=block

X-Content-Type-Options: nosniff

Server: cloudflare


text:
Infonet – Báo điện tử của Bộ Thông tin và Truyền thông.
Bản quyền thuộc Infonet. Không được phép sao chép khi chưa được chấp thuận bằng văn bản
Giấy phép số 2162/GP – BTTTT ngày 13/12/2011 và số 03/GP-CBC ngày 10/8/2015.
Tổng Biên tập: Võ Đăng Thiên. Phó Tổng biên tập: Nguyễn Bá
Email: khoeplus@infonet.vn - Điện thoại: 04.39369362 - Đường dây nóng: 0916.75.2288
Liên hệ quảng cáo : Ms. Dương - 0901.01.6699 - hongduong@infonet.vn
Tòa soạn: Tầng 7, Tòa nhà Cục Tần số Vô tuyến điện, 115 Trần Duy Hưng, Quận Cầu Giấy, Hà Nội

Cache-Control: no-cache

X-Cache: MISS from cache_cmss

X-Cache-Lookup: MISS from cache_cmss:80

Via: 1.0 cache_cmss (squid/3.1.10)


text:
Banner đầu
Tin tức vàng và ngoại tệ
Tỷ giá ngoại tệ ngày 6/9 diễn biến theo xu hướng đồng USD trên thị trường quốc tế hạ nhiệt sau 1 phiên tăng mạnh. Tuy nhiên, đồng bạc xanh vẫn đứng ở mức cao do một số lượng lớn các đồng tiền trên thế giới suy giảm nghiêm trọng. Ngày 6/9 Ngân hàng Nhà nước công bố tỷ giá trung tâm của đồng Việt Nam... Xem tiếp
Tỷ giá vàng
Chiến lược vàng và ngoại tệ
Dự kiến hôm nay : Sáng nay Aud bất ngờ giảm mạnh trở lại sau khi tăng lên gần kháng cự 0.7450. Tuy nhiên nhìn trong biểu đồ dài hạn thì Aud vẫn trong xu hướng giảm giá , theo nhận định của chúng tôi thì Aud tăng điều chỉnh từ mức thấp 0.7260 đến 0.7530 trước khi quyết định xu hướng tiếp theo trong dài hạn .Hôm... Xem tiếp
Kiến thức
Như chúng ta đã biết, candlestick là một trong những công cụ khá phổ biến và mạnh mẽ với lĩnh vực phân tích kỹ thuật. Và Fibonacci cũng là một công cụ quan trọng để tính toán trong việc phân tích. Nếu đứng riêng lẽ thì 2 công cụ đó cũng cho ta được những dấu hiệu mua bán rất tốt. Nhưng tuyệt vời hơn nữa nếu... Xem tiếp

markdown:
#
Tin tức vàng và ngoại tệ
Tỷ giá ngoại tệ ngày 6/9 diễn biến theo xu hướng đồng USD trên thị trường quốc tế hạ nhiệt sau 1 phiên tăng mạnh. Tuy nhiên, đồng bạc xanh vẫn đứng ở mức cao do một số lượng lớn các đồng tiền trên thế giới suy giảm nghiêm trọng. Ngày 6/9 Ngân hàng Nhà nước công bố tỷ giá trung tâm của đồng Việt Nam...
[Xem tiếp](http://kinhdoanh.dongabank.com.vn/newestdetail/-/asset_publisher/i9TBInPyxkPk/content/ty-gia-ngoai-te-ngay-6-9-toan-the-gioi-lao-doc-usd-treo-cao)
# Tỷ giá vàng
#
Chiến lược vàng và ngoại tệ
Dự kiến hôm nay : Sáng nay Aud bất ngờ giảm mạnh trở lại sau khi tăng lên gần kháng cự 0.7450. Tuy nhiên nhìn trong biểu đồ dài hạn thì Aud vẫn trong xu hướng giảm giá , theo nhận định của chúng tôi thì Aud tăng điều chỉnh từ mức thấp 0.7260 đến 0.7530 trước khi quyết định xu hướng tiếp theo trong dài hạn .Hôm...
[Xem tiếp](http://kinhdoanh.dongabank.com.vn/newestdetail/-/asset_publisher/i9TBInPyxkPk/content/chien-luoc-ngoa-676)
#
Kiến thức
Như chúng ta đã biết, candlestick là một trong những công cụ khá phổ biến và mạnh mẽ với lĩnh vực phân tích kỹ thuật. Và Fibonacci cũng là một công cụ quan trọng để tính toán trong việc phân tích. Nếu đứng riêng lẽ thì 2 công cụ đó cũng cho ta được những dấu hiệu mua bán rất tốt. Nhưng tuyệt vời hơn nữa nếu...
[Xem tiếp](http://kinhdoanh.dongabank.com.vn/newestdetail/-/asset_publisher/i9TBInPyxkPk/content/ket-hop-candlestick-va-fibonacci)
#
Bảng tỷ giá
|TGTG||Mua TM||Mua CK||Bán CK|
| |![]()
|AUD|
| |![]()
|CAD|
| |![]()
|CHF|
| |![]()
|CNY|
| |![]()
|EUR|
| |![]()
|GBP|
| |![]()
|HKD|
| |![]()
|JPY|
| |![]()
|NZD|
| |![]()
|PNJ_DAB|
| |![]()
|SGD|
| |![]()
|THB|
| |![]()
|USD|
| |![]()
|XAU|

Server: ISS/4.0 (Windows XP)

Set-Cookie: COOKIE_SUPPORT=true; Expires=Thu, 19-Sep-2019 17:44:51 GMT; Path=/

Liferay-Portal: Liferay Portal Community Edition 6.1.1 CE GA2 (Paton / Build 6101 / July 31, 2012)

Keep-Alive: timeout=15, max=100


text:
Sáng ngày 04/11/2016 tại Công viên Văn Miếu - Thành phố Cao Lãnh - Tỉnh Đồng Tháp, học sinh Trường THPT Lấp Vò 2 đã tham dự Hội thi Vẽ tranh Cổ động cấp Tỉnh năm 2016.
Nhằm nâng cao ý thức trách nhiệm trong việc bảo vệ môi trường, ý thức tham gia giao thông và phòng chống các tệ nạn xã hội cho học sinh, Sở Giáo dục và Đào tạo Tỉnh Đồng Tháp đã tổ chức Hôi thi Vẽ tranh Cổ động với nhiều chủ đề như: An toàn giao thông, bảo vệ môi trường,… Hội thi đã diễn ra trong không khí mát mẻ với sự tham gia của 08 học sinh Tiểu học, chia thành 04 đội; 06 học sinh THCS chia thành 02 đội và hơn 40 đội cấp THPT với hơn 100 học sinh tham gia. Trong đó, Trường THPT Lấp Vò 2 có 01 đội tham dự gồm 03 học sinh là em Lê Thị Thủy Tiên lớp 12A1, em Phạm Thị Hải Yến lớp 12A1 và em Hồ Phạm Trường Thanh lớp 11A5.
Tác giả bài viết: Trần Kim Thúy

X-Powered-By-Plesk: PleskWin


text:
Họ và tên:
Số điện thoại:
Đếm ngược thời gian bàn giao căn hộ:
Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *
Bình luận
Tên *
Email *
Trang web
GỌI NGAY : 093 15 68886
TẢI BẢNG GIÁ TRỰC TUYẾN Đất nền Nhà liền kề Phổ Yên Thái Nguyên
Cam kết bảo vệ thông tin khách hàng, Đưa thông tin chính xác mới nhất, không làm phiền..
BẠN NHẬN ĐƯỢC GÌ KHI CHỌN CHÚNG TÔI
Thông tin mở bán dự án
Chính sách bán hàng
Tiến độ dự án được cập nhật liên tục
Mua với giá gốc, không chênh
Ký hợp đồng trực tiếp với chủ đầu tư
Được hưởng tất cả các ưu đãi
Tư vấn, hỗ trợ làm thủ tục pháp lýĐược vay các gói vay có lãi suất thấp nhất thị trường
Thời gian vay lên tới 25 năm
Được tư vấn miễn phí bởi các đơn vị tư vấn thiết kế uy tín Được tham khảo hàng ngàn mẫu thiết kế căn hộ mẫu
XEM NHANH SẢN PHẨM KHÁC TẠI THÁI NGUYÊN
Tài liệu dự án Đất nền Nhà liền kề Phổ Yên Thái Nguyên
Vui lòng điền Đẩy đủ + Chính xác các thông tin Thông tin bảo mật tuyệt đối
Bảng giá căn hộ Đất nền Nhà liền kề Phổ Yên Thái Nguyên
Nhận thông tin Lịch mở bán
Báo Giá căn hộ Đất nền Nhà liền kề Phổ Yên Thái Nguyên
Nhận thông tin giá căn hộ, Quý khách vui lòng nhập thông tin chính xác Mọi thông tin bảo mật tuyệt đối
Trả lời

markdown:
Họ và tên:
Số điện thoại:
Đếm ngược thời gian bàn giao căn hộ:
Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *
Bình luận
Tên *
Email *
Trang web
GỌI NGAY : 093 15 68886
TẢI BẢNG GIÁ TRỰC TUYẾN Đất nền Nhà liền kề Phổ Yên Thái Nguyên
Cam kết bảo vệ thông tin khách hàng, Đưa thông tin chính xác mới nhất, không làm phiền..
BẠN NHẬN ĐƯỢC GÌ KHI CHỌN CHÚNG TÔI
Thông tin mở bán dự án
Chính sách bán hàng
Tiến độ dự án được cập nhật liên tục
Mua với giá gốc, không chênh
Ký hợp đồng trực tiếp với chủ đầu tư
Được hưởng tất cả các ưu đãi
Tư vấn, hỗ trợ làm thủ tục pháp lýĐược vay các gói vay có lãi suất thấp nhất thị trường
Thời gian vay lên tới 25 năm
Được tư vấn miễn phí bởi các đơn vị tư vấn thiết kế uy tín Được tham khảo hàng ngàn mẫu thiết kế căn hộ mẫu
XEM NHANH SẢN PHẨM KHÁC TẠI THÁI NGUYÊN
Tài liệu dự án Đất nền Nhà liền kề Phổ Yên Thái Nguyên
Vui lòng điền Đẩy đủ + Chính xác các thông tin Thông tin bảo mật tuyệt đối
Bảng giá căn hộ Đất nền Nhà liền kề Phổ Yên Thái Nguyên
Nhận thông tin Lịch mở bán
Báo Giá căn hộ Đất nền Nhà liền kề Phổ Yên Thái Nguyên
Nhận thông tin giá căn hộ, Quý khách vui lòng nhập thông tin chính xác Mọi thông tin bảo mật tuyệt đối
## Trả lời Hủy

Server: nginx-V-ddos