text:
Chương 1: Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử
Chia sẻ: Phuong Nha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:15
lượt xem 185
download
Chương 1: Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử
Các enzyme hạn chế được phân lập từ các sinh vật prokaryote, có khả năng phân hủy DNA của bacteriophage để hạn chế khả năng sinh trưởng của chúng ở trong vi khuẩn. Hiện nay, người ta đã tìm thấy hơn 900 enzyme hạn chế khác nhau từ khoảng 250 chủng vi sinh vật.
Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!
Nội dung Text: Chương 1: Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử
- Chương 1 Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử I. Các enzyme hạn chế Các enzyme hạn chế được phân lập từ các sinh vật prokaryote, có khả năng phân hủy DNA của bacteriophage để hạn chế khả năng sinh trưởng của chúng ở trong vi khuẩn. Hiện nay, người ta đã tìm thấy hơn 900 enzyme hạn chế khác nhau từ khoảng 250 chủng vi sinh vật. Các enzyme hạn chế có ba loại (type): I, II và III. Các enzyme được dùng phổ biến hiện nay thuộc type II, có cơ chế tác động đơn giản nhất. Đây là các nuclease cắt ở một vị trí đặc hiệu nằm bên trong sợi DNA (chứ không phân hủy DNA từ hai đầu), nên được gọi là endonuclease. Tên gọi đầy đủ của chúng là các restriction endonuclease type II, hay được gọi đơn giản là enzyme hạn chế (restriction enzyme, RE). 1. Các enzyme hạn chế type II Cách gọi tên các enzyme hạn chế dựa trên các qui ước quốc tế. Tên chi và tên loài của sinh vật, mà ở đó tìm thấy enzyme, được dùng để đặt cho phần đầu của tên enzyme (viết nghiêng) bao gồm: chữ thứ nhất của tên chi và hai chữ đầu của tên loài. Ví dụ: enzyme được tách chiết từ vi khuẩn Escherichia coli thì có tên là Eco, còn enzyme được tách chiết từ vi khuẩn Bacillus globigii thì viết là Bgl… Ngoài ra, tên gọi enzyme hạn chế còn được bổ sung thêm phần sau (viết thẳng), tùy thuộc vào chủng vi khuẩn liên quan và tùy thuộc vào sự có mặt hay không của các yếu tố ngoài nhiễm sắc thể. Ví dụ: RI trong enzyme EcoRI có nghĩa như sau: R là viết tắt của chủng RY13, I là bậc xác định đầu tiên trong vi khuẩn (first identified order in bacterium). Giá trị của enzyme hạn chế là ở tính đặc hiệu của chúng. Các enzyme này cắt DNA ở các vị trí nhận biết riêng biệt bao gồm từ 4-6 cặp nucleotide có trình tự đối xứng đảo ngược nhau, các đoạn ngắn này gọi là palindrome (đoạn đối xứng: là đoạn DNA có hai sợi hoàn toàn đối xứng giống hệt nhau nếu lật ngược đầu đuôi). Ví dụ: enzyme EcoRI nhận biết chuỗi hexanucleotide (6 nucleotide): Giống như EcoRI, nhiều enzyme hạn chế đã tạo ra các đoạn DNA với đầu lồi (protruding) 5’. Một số enzyme hạn chế khác (ví dụ: PstI) tạo ra các đoạn DNA có đầu lồi 5’. Trong khi đó, một số enzyme hạn chế (ví dụ: SmaI) lại cắt ở trục đối xứng để tạo ra các đoạn DNA mang đầu bằng (DNA mạch đôi có hai đầu sợi đơn bằng nhau) (Bảng 1.1). Bảng 1.1. Trình tự nhận biết của một số enzyme hạn chế tiêu biểu
- Với bốn loại nitrogen base trong phân tử DNA và giả thiết rằng trình tự sắp xếp của chúng là ngẫu nhiên, thì tần số mong đợi (kỳ vọng) của bất kỳ đoạn trình tự xác định nào, theo tính toán sẽ là 4n, n ở đây là chiều dài của đoạn nhận biết. Từ đó, có thể thấy rằng với các đoạn có bốn nucleotide thì cứ cách 256 cặp base chúng lặp lại một lần, các đoạn sáu nucleotide thì cách 4096 cặp base mới lặp lại. Tất nhiên, các giá trị này có thể dao động rất lớn, nhưng nói chung chiều dài của các đoạn sinh ra đều gần với các giá trị tính toán. Chẳng hạn, một enzyme nhận biết đoạn trình tự bốn nucleotide sẽ sản sinh ra các đoạn ngắn hơn so với đoạn sáu nucleotide. 2. Gắn các đầu tận cùng được cắt bởi enzyme hạn chế - Các đầu dính (cohesive ends) , còn gọi là đầu lồi hay đầu so le. Ví dụ: đầu dính được tạo ra nhờ PstI - Các đầu bằng (blunt ends) , còn gọi là đầu thô Ví dụ: đầu bằng được tạo ra nhờ HaeIII - Dùng enzyme DNA ligase của phage T4 có thể gắn lại các đầu dính hoặc đầu bằng. Tuy nhiên, trường hợp đầu bằng thường cho hiệu quả thấp vì thế người ta có thể dùng các biện pháp khác như: + Gắn vào đầu bằng một đoạn bổ sung để tạo ra đầu dính. Ví dụ: gắn đoạn linker (đoạn nối) bằng
- cách tổng hợp những trình tự oligonucleotide nhân tạo có từ 10-20 nucleotide để làm linker như sau: 5' NN GAATTC NN 3' 3' NN CTTAAG NN 5' + Dùng terminal transferase. Enzyme này sẽ tạo ở đầu 3’ của DNA sợi đôi một homopolymer (xem chương 6). 3. Isochizomer Nói chung, các RE khác nhau nhận biết các trình tự khác nhau (Bảng 1.1), tuy nhiên cũng có một số trường hợp cho thấy có những enzyme được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau nhưng lại cắt trong một trình tự, các enzyme đó được gọi là isochizomer. Hơn nữa, một vài enzyme nhận biết các chuỗi tetranucleotide (4 nucleotide) mà trong một số trường hợp các tetranucleotide này lại xuất hiện trong các chuỗi hexanucleotide của các enzyme khác. Ví dụ: - MboI và Sau3AI cùng nhận biết trình tự: - Trong khi đó BamHI nhận biết trình tự: Trong một vài trường hợp khác các đoạn được tạo ra nhờ một enzyme hạn chế này khi gắn với các đoạn được tạo ra nhờ một enzyme hạn chế khác đã hình thành các thể lai (hybrid) mà các enzyme bố mẹ không thể nhận biết được. Ví dụ: SalI cắt trình tự (G¯TCGAC) và XhoI cắt trình tự (C¯TCGAG), các trình tự được sinh ra này đã gắn với nhau tạo thành thể lai mà các vị trí cắt hạn chế của chúng không thể nhận biết bởi các enzyme SalI và XhoI: 4. Methyl hóa Sự methyl hóa (methylation) nhằm mục đích bảo vệ DNA của các đoạn palindrome, nghĩa là gắn gốc methyl (CH3) ở vị trí cần thiết nên không bị RE cắt. Ví dụ: EcoRI nhận biết chuỗi: Khi có sự methyl hóa thì enzyme không nhận biết được vị trí cắt hạn chế và do đó DNA không bị cắt, những DNA của phage không có gắn gốc methyl sẽ bị cắt bởi RE. Trong kỹ thuật gen, enzyme methyl hóa được gọi là methylase enzyme. Methylase được dùng để bảo vệ đoạn DNA cần gắn vào. Tất cả các chủng E. coli đều chứa hai enzyme methyl hóa DNA là: dam và dcm. - dam (DNA adenine methylase) Enzyme methylase này gắn các nhóm methyl ở vị trí N6 của adenine trong chuỗi 5’…GmeATC…3’ .
- Nhưng DNA của eukaryote không bị methyl hóa ở vị trí N6 của adenine. - dcm (DNA cystosine methylase) Enzyme methylase này gắn các nhóm methyl ở vị trí C5 của cytosine bên trong các chuỗi 5’…CmeCAGG…3’ hoặc 5’…CmeCTGG…3’ . Enzyme chủ yếu ảnh hưởng đến sự methyl hóa dcm là EcoRII, enzyme BstNI có thể nhận biết chính xác cùng một trình tự như EcoRII (mặc dù nó cắt DNA ở vị trí xác định khác trong chuỗi này). Nếu không thể thay BstNI cho EcoRII thì DNA phải được chuẩn bị từ các chủng E. coli dcm. 5. Cắt DNA bằng enzyme hạn chế 5.1. Các loại đệm dùng trong phản ứng cắt DNA Mỗi enzyme hạn chế có một điều kiện phản ứng tối ưu, nhiệt độ ủ và thành phần của dung dịch đệm là những yếu tố quan trọng. Nhiệt độ yêu cầu khá chính xác còn sự khác nhau giữa các dung dịch đệm thường là không đáng kể. Để thuận tiện trong nghiên cứu người ta chia các enzyme ra làm ba nhóm: - Nhóm đệm cao (H). Hoạt động tốt nhất ở các dung dịch đệm có hoạt độ ion cao. - Nhóm đệm trung bình (M). Thích hợp với các dung dịch đệm có hoạt độ ion trung bình. - Nhóm đệm thấp (L). Thích hợp với các dung dịch đệm có hoạt độ ion thấp. Như vậy, theo cách phân chia này chỉ có ba loại đệm stock là cần chuẩn bị cho phản ứng cắt DNA bằng RE (Bảng 1.2). Thường các đệm stock trong bảng 1.2 được pha ở nồng độ ( ´ 10), và có thể giữ ở nhiệt độ 4oC/1-2 tuần hoặc -20oC/không hạn định. Bảng 1.2. Các loại dung dịch đệm cho phản ứng cắt DNA bằng RE Chú ý Riêng enzyme SmaI không thể sử dụng các loại đệm ở trên mà cần phải pha dung dịch đệm đặc biệt, bao gồm: 20 mM KCl, 10 mM Tris.Cl (pH 8), 10 mM MgCl2, và 1 mM dithiothreitol. 5.2. Phương pháp cắt DNA bằng enzyme hạn chế Các phản ứng đặc trưng dùng khoảng 0,2-1 mg DNA/20 mL dung dịch phản ứng hoặc ít hơn. Ví dụ: a. Pha dung dịch DNA bằng nước cất hai lần vô trùng trong eppendorf tube vô trùng tới dung tích 17 mL. b. Bổ sung 2 mL đệm phản ứng ( ×10) thích hợp của RE và trộn đều (vortex). Ví dụ: BstXI : Dùng đệm cao 10×(H) XbaI : 10×(H) EcoRI : 10×(H)
- c. Bổ sung 1 unit/mL RE và lắc đều nhẹ. Một unit (đơn vị, ký hiệu là u) RE được xác định như là số lượng yêu cầu đủ để thủy phân hoàn toàn 1 mg DNA plasmid/1 giờ ở dung dịch đệm và nhiệt độ thích hợp trong 20 mL phản ứng. d. Ủ ở nhiệt độ thích hợp, thời gian tùy thuộc vào yêu cầu. Ví dụ: BstXI : 1-2 giờ/50oC XbaI : 1 giờ/37oC EcoRI : 1 giờ/37oC e. Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 0,5 M EDTA (pH 7,5) để đạt tới nồng độ cuối cùng là 10 mM. - Nếu DNA sau khi cắt bằng RE, được phân tích trực tiếp trên gel thì bổ sung 1 μ L ( × 10) gel-loading-dye I, trộn đều và chạy điện di. - Nếu DNA sau khi cắt bằng RE, cần được tinh sạch thì chiết một lần với phenol, một lần với phenol:chloroform (1:1), một lần với chloroform và kết tủa DNA bằng hai thể tích ethanol hoặc một thể tích isopropanol. Chú ý - Kết quả hoạt động của enzyme hạn chế phụ thuộc rất nhiều vào độ sạch của DNA. Các chế phẩm DNA còn lẫn đệm chiết, phenol hoặc EtOH sẽ làm giảm chất lượng hoạt động của enzyme. - Enzyme hạn chế được giữ ở -20oC (hoặc -80 o C nếu bảo quản lâu dài). Nếu lấy enzyme ra khỏi tủ lạnh sâu trong một thời gian ngắn để dùng thì phải đặt trên đá tuyết (ice bath). II. Các enzyme trùng hợp 1. DNA polymerase (DNA-dependent DNA polymerase) DNA polymerase được dùng để tổng hợp DNA trong cơ thể hoặc trong điều kiện in vitro. 1.1. DNA polymerase I của E. coli Enzyme này dịch chuyển điểm đứt (nick) của DNA, nick là điểm đứt trên một sợi của DNA sợi đôi. Chức năng chính của enzyme là sửa sai dọc theo phân tử DNA. Nếu gặp chỗ sai sót, nó sẽ đi ngược lại để cắt bỏ sau đó mới tổng hợp DNA. DNA polymerase I của E. coli mang chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử (M) là 109.000 Da với ba hoạt tính riêng biệt: - Hoạt tính polymerase 5’®3’ . DNA polymerase I của E. coli xúc tác cho sự tổng hợp DNA theo chiều 5’®3’ bằng cách bổ sung các gốc nucleotide vào đầu tận cùng 3’-OH được tạo ra khi một sợi của phân tử DNA sợi đôi bị đứt. - Hoạt tính exonuclease 3’®5’. DNA polymerase I của E. coli cắt các chuỗi nucleotide ở các đầu tự do của DNA, xúc tác cho sự thoái biến bậc thang từ đầu 3’ của cả DNA sợi đôi và sợi đơn khi không có dNTPs. Trong trường hợp có dNTPs, hoạt tính exonuclease trên sợi đôi sẽ bị ức chế bởi hoạt tính polymerase. Trong quá trình tổng hợp DNA, hoạt tính exonuclease thực hiện chức năng đọc sửa (proofreading) bằng cách cắt bỏ những nucleotide lắp ráp sai. - Hoạt tính exonuclease 5’®3’. DNA polymerase I của E. coli có thể chuyển chỗ các nucleotide từ phía 5’ của điểm đứt và bổ sung tức thời các nucleotide từ phía 3’ tạo ra chuyển động của điểm đứt dọc theo DNA.
- - Ứng dụng chính + Đánh dấu đoạn DNA để làm mẫu dò bằng dịch chuyển điểm đứt. + Khởi đầu cho sự tổng hợp sợi thứ hai trong tạo dòng cDNA. + Xác định trình tự DNA bằng phương pháp dideoxynucleotide. 1.2. Đoạn Klenow của DNA polymerase I của E. coli Enzyme này có tác dụng lấp đầy các đầu khuyết 3’ của DNA sợi đôi. Do DNA polymerase I có ba hoạt tính, nhưng hoạt tính exonuclease 5’®3’ ít sử dụng nên Klenow đã dùng protease để cắt bớt đoạn có hoạt tính đó. Vì vậy, khối lượng phân tử của enzyme chỉ còn lại 76.000 Da (được gọi là đoạn lớn của DNA polymerase I). - Ứng dụng chính + Làm đầy đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra. + Đánh dấu đầu tận cùng của các đoạn DNA bằng cách dùng [ a -32P]dNTPs để làm đầy đầu khuyết 3’. + Đánh dấu đầu tận cùng của các phân tử DNA mang đầu lồi 3’. Đầu tiên, hoạt tính exonuclease 3’®5’ loại bỏ đầu lồi 3’ để tạo ra đầu khuyết 3’. Sau đó, nhờ sự có mặt ở nồng độ cao của một tiền chất được đánh dấu đồng vị phóng xạ, sự thoái biến bậc thang được cân bằng do sự hợp nhất của các dNTP ở
- đầu 3’. + Tổng hợp sợi thứ hai của cDNA trong tạo dòng cDNA. + Tổng hợp DNA sợi đôi từ các khuôn mẫu sợi đơn trong phát sinh đột biến in vitro. 1.3. DNA polymerase của bacteriophage T4 (T4-infected E. coli) Enzyme này giống đoạn Klenow của DNA polymerase I của E. coli . DNA polymerase của phage T4 (M = 114.000 Da) có hoạt tính polymerase 5’®3’ và exonuclease 3’®5’ . Tuy nhiên, hoạt tính exonuclease của DNA polymerase phage T4 lớn hơn của DNA polymerase I đến 200 lần. Đoạn Klenow phải cần có đoạn mồi (primer) mới tổng hợp DNA được, còn DNA polymerase phage T4 thì không cần mồi cũng tổng hợp được DNA. - Ứng dụng chính + Làm đầy hoặc đánh dấu đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra. + Đánh dấu đầu tận cùng của các phân tử DNA mang đầu lồi 3’, tương tự như ứng dụng của đoạn Klenow. + Đánh dấu các đoạn DNA để làm mẫu dò. + Biến đổi đầu sole của DNA sợi đôi thành đầu bằng. 1.4. Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) Taq DNA polymerase (Taq pol) là một loại DNA polymerase chịu nhiệt (M = 65.000 Da) của vi khuẩn Thermus aquaticus. Enzyme này được dùng để kiểm tra sự có mặt hoặc không của một gen bằng cách xúc tác cho sự tổng hợp gen đó ở điều kiện in vitro nhờ phản ứng chuỗi polymerase (PCR) (xem chương 3). Taq pol thay thế cho DNA polymerase I của E. coli do có khả năng chịu nhiệt cao phù hợp với điều kiện phản ứng của PCR, và nó có thể tổng hợp một sợi DNA dài 1 kb trong vòng 30 giây ở 72oC. - Một trong những hạn chế của Taq pol là sự chính xác không cao trong quá trình sao chép của nó do bị mất cơ chế đọc sửa (hoạt tính exonuclease 3’®5’). Enzyme Taq pol thương mại có tỷ lệ sao chép lỗi 1/10.000 nucleotide, và có thể tạo ra 16% sản phẩm PCR dài 1 kb bị đột biến trong phản ứng khuếch đại. Mặc dù có nhược điểm trên, Taq pol vẫn có thể được dùng trong các thí nghiệm đòi hỏi một trình tự di truyền chính xác (như trong tạo dòng phân tử). Tuy nhiên, kết quả cho ra một vector mang đoạn chèn (sản
- phẩm PCR) cần phải được kiểm tra bằng sequencing. - Ưu điểm của Taq pol là sản xuất các đoạn gen mang hai đầu lồi A. Điều này đặc biệt hữu ích trong “TA cloning” là kỹ thuật mà vector (plasmid) được sử dụng đã có sẵn hai đầu lồi T bổ sung với hai đầu lồi A của sản phẩm PCR, nhờ đó đã làm tăng hiệu quả của phản ứng gắn. Ngoài Taq pol, nhiều DNA polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với các chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Chẳng hạn: Pfu DNA polymerase (Pfu pol) được tách chiết từ Pyrococcus furiosus, thường được dùng thay cho, hoặc kết hợp, với Taq pol. Enzyme này ổn nhiệt hơn và có khả năng đọc sửa, vì thế cho tỷ lệ sao chép lỗi thấp. Hoặc Tth DNA polymerase (Tth pol), được tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn mẫu và ion Mn2+; nhưng nếu có sự hiện diện của DNA khuôn mẫu và ion Mg2+, thì Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. Enzyme này cho phép khuếch đại khuôn mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA. 2. RNA polymerase (DNA-dependent RNA polymerase) (Bacteriophage SP6-infected Salmonella typhimurium LT2, bacteriophage T7 hoặc T3-infected E. coli) Các bacteriophage SP6, T7 và T3 sản xuất enzyme RNA polymerase để khởi đầu tổng hợp RNA trên khuôn mẫu DNA sợi đôi có mang promoter đặc trưng bacteriophage. Quá trình tổng hợp này không cần mồi. - Ứng dụng chính + Sản xuất RNA để làm mẫu dò. + Xác định trình tự của một phân tử DNA được tạo dòng trong một vector có mang promoter đặc trưng cho bacteriophage SP6, T7 hoặc T3. + Sản xuất một lượng lớn RNA từ một phân tử DNA được tạo dòng để nghiên cứu về cấu trúc, điều hòa và các mối tương tác của phiên bản RNA. 3. Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase, RNA-dependent DNA polymerase) Đây là enzyme tổng hợp DNA từ khuôn mẫu RNA. Enzyme này có ở trong các virus: AMV (avian myeloblastosis virus), Mo-MLV (moloney murine leukemia virus) thuộc nhóm virus ngược (retrovirus: virus mang RNA) và có các hoạt tính sau:
- - Hoạt tính polymerase 5’®3’. Tổng hợp DNA theo chiều 5’®3’. Cơ chất của nó là RNA hay DNA (sợi đơn hoặc sợi đôi): - Hoạt tính RNase H. Bao gồm hai hoạt tính exoribonuclease 5’®3’ và 3’®5’ phân hủy các DNA hoặc RNA trong tổ hợp lai. Enzyme này được dùng trong kỹ thuật di truyền là nhờ vào khả năng tổng hợp được cDNA của chúng (xem chương 6). Người ta có thể tách chiết mRNA ở những tế bào tổng hợp protein mạnh, sau đó dùng enzyme reverse transcriptase để tổng hợp cDNA. Có thể tổng hợp nên oligonucleotide rồi dùng nó để xác định trình tự của DNA. 4. Terminal transferase (Tuyến ức của bê) Hoạt tính của enzyme này là xúc tác gắn các nucleotide vào đầu 3’-OH tự do của DNA sợi đôi làm lồi ra một đầu ở cuối sợi DNA. Phản ứng gắn này là ngẫu nhiên, do đó thành phần nucleotide của đầu lồi phụ thuộc vào nồng độ của bốn loại nucleotide có trong phản ứng. - Ứng dụng chính + Thêm đuôi đồng trùng hợp (homopolymer) để tạo ra đầu so le cho phân tử DNA dùng trong tạo
- dòng (xem chương 6). + Đánh dấu đầu 3’-OH của DNA trong kỹ thuật xác định trình tự gen theo Maxam và Gilbert. III. Các enzyme gắn Enzyme ligase thường dùng là của phage T4 xâm nhiễm trong E. coli. Chức năng của enzyme này là nối các đoạn hở bằng liên kết cộng hóa trị, sử dụng năng lượng ATP. 1. Bacteriophage T4 DNA ligase (Bacteriophage T4-infected E. coli) Enzyme này là một chuỗi polypeptide (M = 68.000 Da) xúc tác cho sự tạo thành liên kết phosphodiester giữa đầu 3’-OH tự do của một phân tử DNA này với đầu cuối 5’-PO4 của một phân tử DNA khác. DNA ligase có tác dụng cho cả trường hợp đầu so le lẫn đầu bằng, tuy nhiên đối với đầu bằng enzyme đòi hỏi nồng độ cao hơn và điều kiện phản ứng cũng khác. 2. Bacteriophage T4 RNA ligase (Bacteriophage T4-infected E. coli) Enzyme này xúc tác cho mối liên kết cộng hóa trị giữa nhóm 5’-PO4 của DNA sợi đơn hoặc RNA với nhóm 3’-OH của DNA sợi đơn hoặc RNA. Do cơ chất thích hợp cho enzyme này là các phân tử nhỏ nên nó thường được dùng để đánh dấu đầu 3’ của các phân tử RNA sử dụng làm mẫu dò.
- 3. Bacteriophage T4 polynucleotide kinase (Bacteriophage T4-infected E. coli) Enzyme bacteriophage T4 polynucleotide kinase xúc tác chuyển nhóm γ-phosphate của ATP tới đầu 5’ của DNA hoặc RNA. Hai loại phản ứng thường có thể xảy ra là phản ứng thuận và phản ứng trao đổi. Trong phản ứng thuận, nhóm γ-phosphate được chuyển tới đầu 5’ của DNA đã được dephosphoryl hóa (mất nhóm phosphate). Trong phản ứng trao đổi, khi có một ADP thừa, enzyme sẽ chuyển nhóm 5’ phosphate từ DNA đã được phosphoryl hóa tới ADP, DNA sau đó sẽ được phosphoryl hóa trở lại bằng cách nhận một nhóm γ-phosphate đã được đánh dấu đồng vị phóng xạ từ một phân tử [γ-32P]ATP. - Ứng dụng chính + Đánh dấu phóng xạ đầu 5’ của DNA để phân tích trình tự bằng phương pháp Maxam và Gilbert (1977), dùng làm mẫu dò trong các kỹ thuật lai phân tử (xem chương 5). + Phosphoryl hóa các đoạn nối (linker) và các đoạn DNA không có nhóm 5’ phosphate để chuẩn bị cho phản ứng gắn trong phương pháp tạo dòng. 4. Alkaline phosphatase (E. coli và ruột bê) Cả hai enzyme alkaline của vi khuẩn (bacteria alkaline phosphatase, BAP) và ruột bê (calf intestinal alkaline phosphatase, CIP) đều xúc tác loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi DNA và RNA. - Ứng dụng chính + Loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi DNA hoặc RNA trước khi đánh dấu đầu 5’ bằng 32P. + Loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi các đoạn DNA để ngăn cản sự tự gắn. Trong kỹ thuật tạo dòng,
- khi một vector được mở vòng DNA bằng một RE rồi sau đó được loại bỏ nhóm 5’ phosphate thì nó không thể tự gắn lại (tự tái tạo lại vòng). Chỉ khi có đoạn DNA ngoại lai mang các đầu 5’ phosphate cần thiết được đưa vào thì phản ứng gắn giữa vector và DNA ngoại lai mới xảy ra. IV. Các enzyme phân cắt Là nhóm các enzyme xúc tác thủy phân liên kết phosphodiester trong phân tử DNA hoặc RNA, bao gồm các endonuclease (cắt bên trong phân tử nucleic acid) và exonuclease (cắt bên ngoài phân tử nucleic acid). Các RE cũng là các endonuclease, nhưng chúng có tính đặc hiệu rất cao cho từng trình tự 4 hoặc 6 nucleotide. Dưới đây là các nuclease chính thường được sử dụng: 1. Deoxyribonuclease I (DNase I) (Tụy bò) DNase I xúc tác thủy phân DNA sợi đơn hoặc sợi đôi ở các liên kết phosphodiester nằm bên cạnh các pyrimidine nucleotide, tạo ra các oligonucleotide và các oligonucleotide có đầu tận cùng 5' monophosphate. Khi có mặt Mg2+, DNase I tác dụng độc lập trên mỗi sợi DNA, và các vị trí cắt được phân bố ngẫu nhiên. Khi có mặt Mn2+, DNase I sẽ cắt cả hai sợi DNA gần như ở cùng một vị trí để tạo ra các đoạn DNA đầu bằng hoặc đầu lồi nhưng chỉ nhô ra một hoặc hai nucleotide. - Ứng dụng chính + Tạo ra các điểm đứt (nick) trên DNA sợi đôi để đánh dấu mẫu dò đồng vị phóng xạ bằng phương pháp dịch chuyển điểm đứt. + Tạo ra các dòng ngẫu nhiên để phân tích trình tự trong bacteriophage M13 vector. + Phân tích phức hợp protein:DNA (DNase footprinting). + Loại bỏ DNA trong các phân đoạn RNA hay protein. 2. Nuclease S1 (Aspergillus oryzae) Enzyme nuclease S1 cắt DNA sợi đơn hoặc RNA để tạo ra đầu 5’ monophosphate hoặc các oligonucleotide. DNA sợi đôi và thể lai DNA:RNA ít chịu tác dụng của enzyme này. Tuy nhiên, các nucleic acid sợi đôi sẽ bị nuclease S1 cắt hoàn toàn nếu chúng bị xử lý với một lượng rất lớn enzyme. Một lượng vừa đủ của enzyme sẽ tách các nucleic acid sợi đôi ở các điểm đứt hoặc các lỗ hổng nhỏ thành hai hoặc nhiều đoạn.
- - Ứng dụng chính + Phân tích cấu trúc thể lai DNA:RNA. + Loại bỏ các phần sợi đơn trên đầu sole ra khỏi đoạn DNA sợi đôi để tạo ra các đầu bằng. + Mở vòng cặp tóc xuất hiện trong quá trình tổng hợp cDNA sợi đôi. Một enzyme có hoạt tính tương tự nuclease S1 là mung-bean nuclease (endonuclease) được tách chiết từ mầm đậu xanh (Phaseolus aureus). 3. Exonuclease III (Exo III) (E. coli) Exo III xúc tác loại bỏ các 5’ mononucleotide từ đầu 3’ OH của DNA sợi đôi (DNA mạch thẳng hoặc mạch vòng chứa các điểm đứt hoặc lỗ hổng). Hoạt tính enzyme cho kết quả tạo thành các vùng sợi đơn dài trong DNA sợi đôi. Enzyme này có 3 hoạt tính khác nhau: endonuclease đặc hiệu cho apurinic DNA, RNase H và 3’ phosphatase (loại bỏ đầu 3’ phosphate nhưng không cắt các liên kết phosphodiester bên trong). Exo III không cắt các DNA sợi đơn hoặc DNA sợi đôi có đầu lồi 3’.
- - Ứng dụng chính + Tạo ra các cấu trúc sợi đơn ở một số vùng trên phân tử DNA dùng làm cơ chất cho đoạn Klenow của DNA polymerase I (để sản xuất mẫu dò đặc trưng cho từng sợi). + Tạo ra các đột biến khuyết đoạn (deletion) tại các trình tự tận cùng của DNA sợi đôi mạch thẳng. Phản ứng này thường phối hợp với mung-bean nuclease hoặc nuclease S1. Một exonuclease tương tự là nuclease BAL31, có hoạt tính exonuclease 5’®3’ và 3’®5’, có khả năng tạo các DNA sợi đôi đầu bằng mà không cần sự hiện diện của nuclease S1. 4. Ribonuclease (RNase A) (Tụy bò) Enzyme xúc tác thủy phân RNA thành các đoạn nhỏ hơn. RNase A có hoạt tính rất mạnh, hiện diện ở mọi nơi và rất bền vững (không bị mất hoạt tính khi bị xử lý ở 90°C trong 1 giờ). RNase A cắt liên kết phosphodiester nằm ngay sau một pyrimidine của một RNA sợi đơn. - Ứng dụng chính + Loại bỏ RNA trong các chế phẩm DNA hay protein. + Loại bỏ các vùng không bắt cặp trên RNA trong thể lai RNA:DNA. 5. RNase H Enzyme RNase H là một loại ribonuclease có khả năng cắt liên kết 3’-O-P của RNA trong sợi đôi của thể lai DNA:RNA để tạo ra các sản phẩm có đầu tận cùng 3’-OH và 5’-PO4. RNase H là một endonuclease không đặc hiệu, xúc tác cắt RNA thông qua cơ chế thủy phân nhờ một ion kim loại hóa trị 2 liên kết với enzyme. Trong tạo dòng phân tử, RNase H xúc tác cắt đặc hiệu RNA trong thể lại RNA:DNA mà không cắt DNA hoặc RNA không ở trong thể lai, enzyme này thường được dùng để phá hủy khuôn mẫu RNA sau khi tổng hợp sợi cDNA thứ nhất bằng phiên mã ngược, để tiếp tục tổng hợp sợi cDNA thứ hai tạo thành một sợi đôi cDNA. V. Các protein liên kết DNA sợi đơn Các protein liên kết DNA sợi đơn (single stranded DNA-binding proteins, SSB) kết hợp với DNA sợi đơn nhưng không kết hợp với DNA sợi đôi. Chúng được xem như là các chất phản ứng trong tạo dòng phân tử xuất phát từ chỗ chúng có khả năng phá vỡ sự ổn định của các cấu trúc thứ cấp bên trong sợi nucleotide; tăng nhanh sự tái ủ của các polynucleotide bổ sung và tăng hoạt tính của các enzyme DNA polymerase bằng cách loại bỏ các cấu trúc thứ cấp bên trong sợi là những yếu tố ngăn cản sự tiến triển của các enzyme này. Nhờ tính chất này, các protein SSB trở thành các chất phản ứng hữu ích trong xác định trình tự DNA. - Ứng dụng chính
- + Phát sinh đột biến điểm trực tiếp bao gồm D-loops. + Tăng chiều dài chuỗi của sản phẩm trong mọi phản ứng được xúc tác bởi DNA polymerase trên các khuôn mẫu dài. Các protein SSB đặc biệt có thể kích thích các DNA polymerase đặc hiệu dùng trong các phản ứng phân tích trình tự chuỗi DNA. Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Hồ Huỳnh Thùy Dương. 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo dục, Hà Nội. 2. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA. 3. Brown TA. 2001. Gene Cloning-An Introduction. 4th ed. Blackwell Science, Oxford, UK. 4. Glick BR and Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. 3rd ed. ASM Press, USA. 5. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. Cold Spring Habor Laboratory Press, USA. 6. Ohman DE. 1989. Experiments in Gene Manipulation. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, USA. 7. Primrose SB, Twyman R and Old RW. 2001. Principles of Gene Manipulation. 6th ed. Blackwell Science, Oxford, UK.
CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD
-
Bài giảng Sinh học phân tử - GV.TS Võ Minh Trí
190 p | 724 | 340
-
Chương 4: Các hệ thống vector
21 p | 554 | 283
-
Giáo trình Kỹ thuật cơ bản trong Sinh học phân tử - TS. Phạm Hồng Sơn
172 p | 508 | 204
-
Chương 4: CÁC VECTOR VÀ SỰ TẠO DÒNG
19 p | 278 | 99
-
Chương 2: CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (tiếp theo)
46 p | 158 | 72
-
Kỹ thuật gen trong sinh học phân tử
43 p | 117 | 39
-
Bài giảng Sinh học phân tử: Phương pháp và kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử - Nguyễn Thị Ngọc Yến
81 p | 60 | 18
-
Bài giảng Chương 1: Các phương pháp xác định vi sinh vật trong thực phẩm
108 p | 72 | 18
-
Giáo trình Kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử
172 p | 45 | 13
-
Phương pháp tách dòng phân tử và xây dựng thư viện hệ gen
11 p | 53 | 12
-
Bài giảng Công nghệ DNA tái tổ hợp - Nguyễn Hoàng Lộc
128 p | 43 | 9
-
Bài giảng Công nghệ di truyền: Chương 1 - Nguyễn Vũ Phong
37 p | 18 | 7
-
Bài giảng lý sinh: Chương 1
127 p | 32 | 6
-
Bài giảng Chương 1: Các Enzyme chủ yếu - Nguyễn Vũ Phong
37 p | 28 | 4
-
Bài giảng sinh học đại cương Công nghệ hóa dầu và công nghệ hóa hữu cơ: Chương 1
10 p | 35 | 4
-
Bài giảng Một số thuật ngữ thường gặp trong sinh học phân tử
0 p | 5 | 3
-
Bài giảng Sinh học phân tử: Chương 7 - Nguyễn Hữu Trí
34 p | 2 | 1

markdown:
# Chương 1: Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử
Chia sẻ: Phuong Nha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:15
lượt xem 185
download
![](http://image.tlvnimg.com/document/thumbnail/2009/20091205/aries-smile/80x100/c1_2703.jpg)
##
Chương 1: Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử
[Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ](javascript:void(0);)
Download
![](http://static.tlvnimg.com/b2013az/templates/version1/default/images/down16x21.png)
Các enzyme hạn chế được phân lập từ các sinh vật prokaryote, có khả năng phân hủy DNA của bacteriophage để hạn chế khả năng sinh trưởng của chúng ở trong vi khuẩn. Hiện nay, người ta đã tìm thấy hơn 900 enzyme hạn chế khác nhau từ khoảng 250 chủng vi sinh vật.
Bình luận(0)
[Đăng nhập để gửi bình luận!](javascript:void(0);)
##
Nội dung Text: Chương 1: Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử
- Chương 1 Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử I. Các enzyme hạn chế Các enzyme hạn chế được phân lập từ các sinh vật prokaryote, có khả năng phân hủy DNA của bacteriophage để hạn chế khả năng sinh trưởng của chúng ở trong vi khuẩn. Hiện nay, người ta đã tìm thấy hơn 900 enzyme hạn chế khác nhau từ khoảng 250 chủng vi sinh vật. Các enzyme hạn chế có ba loại (type): I, II và III. Các enzyme được dùng phổ biến hiện nay thuộc type II, có cơ chế tác động đơn giản nhất. Đây là các nuclease cắt ở một vị trí đặc hiệu nằm bên trong sợi DNA (chứ không phân hủy DNA từ hai đầu), nên được gọi là endonuclease. Tên gọi đầy đủ của chúng là các restriction endonuclease type II, hay được gọi đơn giản là enzyme hạn chế (restriction enzyme, RE). 1. Các enzyme hạn chế type II Cách gọi tên các enzyme hạn chế dựa trên các qui ước quốc tế. Tên chi và tên loài của sinh vật, mà ở đó tìm thấy enzyme, được dùng để đặt cho phần đầu của tên enzyme (viết nghiêng) bao gồm: chữ thứ nhất của tên chi và hai chữ đầu của tên loài. Ví dụ: enzyme được tách chiết từ vi khuẩn Escherichia coli thì có tên là Eco, còn enzyme được tách chiết từ vi khuẩn Bacillus globigii thì viết là Bgl… Ngoài ra, tên gọi enzyme hạn chế còn được bổ sung thêm phần sau (viết thẳng), tùy thuộc vào chủng vi khuẩn liên quan và tùy thuộc vào sự có mặt hay không của các yếu tố ngoài nhiễm sắc thể. Ví dụ: RI trong enzyme EcoRI có nghĩa như sau: R là viết tắt của chủng RY13, I là bậc xác định đầu tiên trong vi khuẩn (first identified order in bacterium). Giá trị của enzyme hạn chế là ở tính đặc hiệu của chúng. Các enzyme này cắt DNA ở các vị trí nhận biết riêng biệt bao gồm từ 4-6 cặp nucleotide có trình tự đối xứng đảo ngược nhau, các đoạn ngắn này gọi là palindrome (đoạn đối xứng: là đoạn DNA có hai sợi hoàn toàn đối xứng giống hệt nhau nếu lật ngược đầu đuôi). Ví dụ: enzyme EcoRI nhận biết chuỗi hexanucleotide (6 nucleotide): Giống như EcoRI, nhiều enzyme hạn chế đã tạo ra các đoạn DNA với đầu lồi (protruding) 5’. Một số enzyme hạn chế khác (ví dụ: PstI) tạo ra các đoạn DNA có đầu lồi 5’. Trong khi đó, một số enzyme hạn chế (ví dụ: SmaI) lại cắt ở trục đối xứng để tạo ra các đoạn DNA mang đầu bằng (DNA mạch đôi có hai đầu sợi đơn bằng nhau) (Bảng 1.1). Bảng 1.1. Trình tự nhận biết của một số enzyme hạn chế tiêu biểu
- Với bốn loại nitrogen base trong phân tử DNA và giả thiết rằng trình tự sắp xếp của chúng là ngẫu nhiên, thì tần số mong đợi (kỳ vọng) của bất kỳ đoạn trình tự xác định nào, theo tính toán sẽ là 4n, n ở đây là chiều dài của đoạn nhận biết. Từ đó, có thể thấy rằng với các đoạn có bốn nucleotide thì cứ cách 256 cặp base chúng lặp lại một lần, các đoạn sáu nucleotide thì cách 4096 cặp base mới lặp lại. Tất nhiên, các giá trị này có thể dao động rất lớn, nhưng nói chung chiều dài của các đoạn sinh ra đều gần với các giá trị tính toán. Chẳng hạn, một enzyme nhận biết đoạn trình tự bốn nucleotide sẽ sản sinh ra các đoạn ngắn hơn so với đoạn sáu nucleotide. 2. Gắn các đầu tận cùng được cắt bởi enzyme hạn chế - Các đầu dính (cohesive ends) , còn gọi là đầu lồi hay đầu so le. Ví dụ: đầu dính được tạo ra nhờ PstI - Các đầu bằng (blunt ends) , còn gọi là đầu thô Ví dụ: đầu bằng được tạo ra nhờ HaeIII - Dùng enzyme DNA ligase của phage T4 có thể gắn lại các đầu dính hoặc đầu bằng. Tuy nhiên, trường hợp đầu bằng thường cho hiệu quả thấp vì thế người ta có thể dùng các biện pháp khác như: + Gắn vào đầu bằng một đoạn bổ sung để tạo ra đầu dính. Ví dụ: gắn đoạn linker (đoạn nối) bằng
- cách tổng hợp những trình tự oligonucleotide nhân tạo có từ 10-20 nucleotide để làm linker như sau: 5' NN GAATTC NN 3' 3' NN CTTAAG NN 5' + Dùng terminal transferase. Enzyme này sẽ tạo ở đầu 3’ của DNA sợi đôi một homopolymer (xem chương 6). 3. Isochizomer Nói chung, các RE khác nhau nhận biết các trình tự khác nhau (Bảng 1.1), tuy nhiên cũng có một số trường hợp cho thấy có những enzyme được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau nhưng lại cắt trong một trình tự, các enzyme đó được gọi là isochizomer. Hơn nữa, một vài enzyme nhận biết các chuỗi tetranucleotide (4 nucleotide) mà trong một số trường hợp các tetranucleotide này lại xuất hiện trong các chuỗi hexanucleotide của các enzyme khác. Ví dụ: - MboI và Sau3AI cùng nhận biết trình tự: - Trong khi đó BamHI nhận biết trình tự: Trong một vài trường hợp khác các đoạn được tạo ra nhờ một enzyme hạn chế này khi gắn với các đoạn được tạo ra nhờ một enzyme hạn chế khác đã hình thành các thể lai (hybrid) mà các enzyme bố mẹ không thể nhận biết được. Ví dụ: SalI cắt trình tự (G¯TCGAC) và XhoI cắt trình tự (C¯TCGAG), các trình tự được sinh ra này đã gắn với nhau tạo thành thể lai mà các vị trí cắt hạn chế của chúng không thể nhận biết bởi các enzyme SalI và XhoI: 4. Methyl hóa Sự methyl hóa (methylation) nhằm mục đích bảo vệ DNA của các đoạn palindrome, nghĩa là gắn gốc methyl (CH3) ở vị trí cần thiết nên không bị RE cắt. Ví dụ: EcoRI nhận biết chuỗi: Khi có sự methyl hóa thì enzyme không nhận biết được vị trí cắt hạn chế và do đó DNA không bị cắt, những DNA của phage không có gắn gốc methyl sẽ bị cắt bởi RE. Trong kỹ thuật gen, enzyme methyl hóa được gọi là methylase enzyme. Methylase được dùng để bảo vệ đoạn DNA cần gắn vào. Tất cả các chủng E. coli đều chứa hai enzyme methyl hóa DNA là: dam và dcm. - dam (DNA adenine methylase) Enzyme methylase này gắn các nhóm methyl ở vị trí N6 của adenine trong chuỗi 5’…GmeATC…3’ .
- Nhưng DNA của eukaryote không bị methyl hóa ở vị trí N6 của adenine. - dcm (DNA cystosine methylase) Enzyme methylase này gắn các nhóm methyl ở vị trí C5 của cytosine bên trong các chuỗi 5’…CmeCAGG…3’ hoặc 5’…CmeCTGG…3’ . Enzyme chủ yếu ảnh hưởng đến sự methyl hóa dcm là EcoRII, enzyme BstNI có thể nhận biết chính xác cùng một trình tự như EcoRII (mặc dù nó cắt DNA ở vị trí xác định khác trong chuỗi này). Nếu không thể thay BstNI cho EcoRII thì DNA phải được chuẩn bị từ các chủng E. coli dcm. 5. Cắt DNA bằng enzyme hạn chế 5.1. Các loại đệm dùng trong phản ứng cắt DNA Mỗi enzyme hạn chế có một điều kiện phản ứng tối ưu, nhiệt độ ủ và thành phần của dung dịch đệm là những yếu tố quan trọng. Nhiệt độ yêu cầu khá chính xác còn sự khác nhau giữa các dung dịch đệm thường là không đáng kể. Để thuận tiện trong nghiên cứu người ta chia các enzyme ra làm ba nhóm: - Nhóm đệm cao (H). Hoạt động tốt nhất ở các dung dịch đệm có hoạt độ ion cao. - Nhóm đệm trung bình (M). Thích hợp với các dung dịch đệm có hoạt độ ion trung bình. - Nhóm đệm thấp (L). Thích hợp với các dung dịch đệm có hoạt độ ion thấp. Như vậy, theo cách phân chia này chỉ có ba loại đệm stock là cần chuẩn bị cho phản ứng cắt DNA bằng RE (Bảng 1.2). Thường các đệm stock trong bảng 1.2 được pha ở nồng độ ( ´ 10), và có thể giữ ở nhiệt độ 4oC/1-2 tuần hoặc -20oC/không hạn định. Bảng 1.2. Các loại dung dịch đệm cho phản ứng cắt DNA bằng RE Chú ý Riêng enzyme SmaI không thể sử dụng các loại đệm ở trên mà cần phải pha dung dịch đệm đặc biệt, bao gồm: 20 mM KCl, 10 mM Tris.Cl (pH 8), 10 mM MgCl2, và 1 mM dithiothreitol. 5.2. Phương pháp cắt DNA bằng enzyme hạn chế Các phản ứng đặc trưng dùng khoảng 0,2-1 mg DNA/20 mL dung dịch phản ứng hoặc ít hơn. Ví dụ: a. Pha dung dịch DNA bằng nước cất hai lần vô trùng trong eppendorf tube vô trùng tới dung tích 17 mL. b. Bổ sung 2 mL đệm phản ứng ( ×10) thích hợp của RE và trộn đều (vortex). Ví dụ: BstXI : Dùng đệm cao 10×(H) XbaI : 10×(H) EcoRI : 10×(H)
- c. Bổ sung 1 unit/mL RE và lắc đều nhẹ. Một unit (đơn vị, ký hiệu là u) RE được xác định như là số lượng yêu cầu đủ để thủy phân hoàn toàn 1 mg DNA plasmid/1 giờ ở dung dịch đệm và nhiệt độ thích hợp trong 20 mL phản ứng. d. Ủ ở nhiệt độ thích hợp, thời gian tùy thuộc vào yêu cầu. Ví dụ: BstXI : 1-2 giờ/50oC XbaI : 1 giờ/37oC EcoRI : 1 giờ/37oC e. Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 0,5 M EDTA (pH 7,5) để đạt tới nồng độ cuối cùng là 10 mM. - Nếu DNA sau khi cắt bằng RE, được phân tích trực tiếp trên gel thì bổ sung 1 μ L ( × 10) gel-loading-dye I, trộn đều và chạy điện di. - Nếu DNA sau khi cắt bằng RE, cần được tinh sạch thì chiết một lần với phenol, một lần với phenol:chloroform (1:1), một lần với chloroform và kết tủa DNA bằng hai thể tích ethanol hoặc một thể tích isopropanol. Chú ý - Kết quả hoạt động của enzyme hạn chế phụ thuộc rất nhiều vào độ sạch của DNA. Các chế phẩm DNA còn lẫn đệm chiết, phenol hoặc EtOH sẽ làm giảm chất lượng hoạt động của enzyme. - Enzyme hạn chế được giữ ở -20oC (hoặc -80 o C nếu bảo quản lâu dài). Nếu lấy enzyme ra khỏi tủ lạnh sâu trong một thời gian ngắn để dùng thì phải đặt trên đá tuyết (ice bath). II. Các enzyme trùng hợp 1. DNA polymerase (DNA-dependent DNA polymerase) DNA polymerase được dùng để tổng hợp DNA trong cơ thể hoặc trong điều kiện in vitro. 1.1. DNA polymerase I của E. coli Enzyme này dịch chuyển điểm đứt (nick) của DNA, nick là điểm đứt trên một sợi của DNA sợi đôi. Chức năng chính của enzyme là sửa sai dọc theo phân tử DNA. Nếu gặp chỗ sai sót, nó sẽ đi ngược lại để cắt bỏ sau đó mới tổng hợp DNA. DNA polymerase I của E. coli mang chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử (M) là 109.000 Da với ba hoạt tính riêng biệt: - Hoạt tính polymerase 5’®3’ . DNA polymerase I của E. coli xúc tác cho sự tổng hợp DNA theo chiều 5’®3’ bằng cách bổ sung các gốc nucleotide vào đầu tận cùng 3’-OH được tạo ra khi một sợi của phân tử DNA sợi đôi bị đứt. - Hoạt tính exonuclease 3’®5’. DNA polymerase I của E. coli cắt các chuỗi nucleotide ở các đầu tự do của DNA, xúc tác cho sự thoái biến bậc thang từ đầu 3’ của cả DNA sợi đôi và sợi đơn khi không có dNTPs. Trong trường hợp có dNTPs, hoạt tính exonuclease trên sợi đôi sẽ bị ức chế bởi hoạt tính polymerase. Trong quá trình tổng hợp DNA, hoạt tính exonuclease thực hiện chức năng đọc sửa (proofreading) bằng cách cắt bỏ những nucleotide lắp ráp sai. - Hoạt tính exonuclease 5’®3’. DNA polymerase I của E. coli có thể chuyển chỗ các nucleotide từ phía 5’ của điểm đứt và bổ sung tức thời các nucleotide từ phía 3’ tạo ra chuyển động của điểm đứt dọc theo DNA.
- - Ứng dụng chính + Đánh dấu đoạn DNA để làm mẫu dò bằng dịch chuyển điểm đứt. + Khởi đầu cho sự tổng hợp sợi thứ hai trong tạo dòng cDNA. + Xác định trình tự DNA bằng phương pháp dideoxynucleotide. 1.2. Đoạn Klenow của DNA polymerase I của E. coli Enzyme này có tác dụng lấp đầy các đầu khuyết 3’ của DNA sợi đôi. Do DNA polymerase I có ba hoạt tính, nhưng hoạt tính exonuclease 5’®3’ ít sử dụng nên Klenow đã dùng protease để cắt bớt đoạn có hoạt tính đó. Vì vậy, khối lượng phân tử của enzyme chỉ còn lại 76.000 Da (được gọi là đoạn lớn của DNA polymerase I). - Ứng dụng chính + Làm đầy đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra. + Đánh dấu đầu tận cùng của các đoạn DNA bằng cách dùng [ a -32P]dNTPs để làm đầy đầu khuyết 3’. + Đánh dấu đầu tận cùng của các phân tử DNA mang đầu lồi 3’. Đầu tiên, hoạt tính exonuclease 3’®5’ loại bỏ đầu lồi 3’ để tạo ra đầu khuyết 3’. Sau đó, nhờ sự có mặt ở nồng độ cao của một tiền chất được đánh dấu đồng vị phóng xạ, sự thoái biến bậc thang được cân bằng do sự hợp nhất của các dNTP ở
- đầu 3’. + Tổng hợp sợi thứ hai của cDNA trong tạo dòng cDNA. + Tổng hợp DNA sợi đôi từ các khuôn mẫu sợi đơn trong phát sinh đột biến in vitro. 1.3. DNA polymerase của bacteriophage T4 (T4-infected E. coli) Enzyme này giống đoạn Klenow của DNA polymerase I của E. coli . DNA polymerase của phage T4 (M = 114.000 Da) có hoạt tính polymerase 5’®3’ và exonuclease 3’®5’ . Tuy nhiên, hoạt tính exonuclease của DNA polymerase phage T4 lớn hơn của DNA polymerase I đến 200 lần. Đoạn Klenow phải cần có đoạn mồi (primer) mới tổng hợp DNA được, còn DNA polymerase phage T4 thì không cần mồi cũng tổng hợp được DNA. - Ứng dụng chính + Làm đầy hoặc đánh dấu đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra. + Đánh dấu đầu tận cùng của các phân tử DNA mang đầu lồi 3’, tương tự như ứng dụng của đoạn Klenow. + Đánh dấu các đoạn DNA để làm mẫu dò. + Biến đổi đầu sole của DNA sợi đôi thành đầu bằng. 1.4. Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) Taq DNA polymerase (Taq pol) là một loại DNA polymerase chịu nhiệt (M = 65.000 Da) của vi khuẩn Thermus aquaticus. Enzyme này được dùng để kiểm tra sự có mặt hoặc không của một gen bằng cách xúc tác cho sự tổng hợp gen đó ở điều kiện in vitro nhờ phản ứng chuỗi polymerase (PCR) (xem chương 3). Taq pol thay thế cho DNA polymerase I của E. coli do có khả năng chịu nhiệt cao phù hợp với điều kiện phản ứng của PCR, và nó có thể tổng hợp một sợi DNA dài 1 kb trong vòng 30 giây ở 72oC. - Một trong những hạn chế của Taq pol là sự chính xác không cao trong quá trình sao chép của nó do bị mất cơ chế đọc sửa (hoạt tính exonuclease 3’®5’). Enzyme Taq pol thương mại có tỷ lệ sao chép lỗi 1/10.000 nucleotide, và có thể tạo ra 16% sản phẩm PCR dài 1 kb bị đột biến trong phản ứng khuếch đại. Mặc dù có nhược điểm trên, Taq pol vẫn có thể được dùng trong các thí nghiệm đòi hỏi một trình tự di truyền chính xác (như trong tạo dòng phân tử). Tuy nhiên, kết quả cho ra một vector mang đoạn chèn (sản
- phẩm PCR) cần phải được kiểm tra bằng sequencing. - Ưu điểm của Taq pol là sản xuất các đoạn gen mang hai đầu lồi A. Điều này đặc biệt hữu ích trong “TA cloning” là kỹ thuật mà vector (plasmid) được sử dụng đã có sẵn hai đầu lồi T bổ sung với hai đầu lồi A của sản phẩm PCR, nhờ đó đã làm tăng hiệu quả của phản ứng gắn. Ngoài Taq pol, nhiều DNA polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với các chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Chẳng hạn: Pfu DNA polymerase (Pfu pol) được tách chiết từ Pyrococcus furiosus, thường được dùng thay cho, hoặc kết hợp, với Taq pol. Enzyme này ổn nhiệt hơn và có khả năng đọc sửa, vì thế cho tỷ lệ sao chép lỗi thấp. Hoặc Tth DNA polymerase (Tth pol), được tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn mẫu và ion Mn2+; nhưng nếu có sự hiện diện của DNA khuôn mẫu và ion Mg2+, thì Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. Enzyme này cho phép khuếch đại khuôn mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA. 2. RNA polymerase (DNA-dependent RNA polymerase) (Bacteriophage SP6-infected Salmonella typhimurium LT2, bacteriophage T7 hoặc T3-infected E. coli) Các bacteriophage SP6, T7 và T3 sản xuất enzyme RNA polymerase để khởi đầu tổng hợp RNA trên khuôn mẫu DNA sợi đôi có mang promoter đặc trưng bacteriophage. Quá trình tổng hợp này không cần mồi. - Ứng dụng chính + Sản xuất RNA để làm mẫu dò. + Xác định trình tự của một phân tử DNA được tạo dòng trong một vector có mang promoter đặc trưng cho bacteriophage SP6, T7 hoặc T3. + Sản xuất một lượng lớn RNA từ một phân tử DNA được tạo dòng để nghiên cứu về cấu trúc, điều hòa và các mối tương tác của phiên bản RNA. 3. Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase, RNA-dependent DNA polymerase) Đây là enzyme tổng hợp DNA từ khuôn mẫu RNA. Enzyme này có ở trong các virus: AMV (avian myeloblastosis virus), Mo-MLV (moloney murine leukemia virus) thuộc nhóm virus ngược (retrovirus: virus mang RNA) và có các hoạt tính sau:
- - Hoạt tính polymerase 5’®3’. Tổng hợp DNA theo chiều 5’®3’. Cơ chất của nó là RNA hay DNA (sợi đơn hoặc sợi đôi): - Hoạt tính RNase H. Bao gồm hai hoạt tính exoribonuclease 5’®3’ và 3’®5’ phân hủy các DNA hoặc RNA trong tổ hợp lai. Enzyme này được dùng trong kỹ thuật di truyền là nhờ vào khả năng tổng hợp được cDNA của chúng (xem chương 6). Người ta có thể tách chiết mRNA ở những tế bào tổng hợp protein mạnh, sau đó dùng enzyme reverse transcriptase để tổng hợp cDNA. Có thể tổng hợp nên oligonucleotide rồi dùng nó để xác định trình tự của DNA. 4. Terminal transferase (Tuyến ức của bê) Hoạt tính của enzyme này là xúc tác gắn các nucleotide vào đầu 3’-OH tự do của DNA sợi đôi làm lồi ra một đầu ở cuối sợi DNA. Phản ứng gắn này là ngẫu nhiên, do đó thành phần nucleotide của đầu lồi phụ thuộc vào nồng độ của bốn loại nucleotide có trong phản ứng. - Ứng dụng chính + Thêm đuôi đồng trùng hợp (homopolymer) để tạo ra đầu so le cho phân tử DNA dùng trong tạo
- dòng (xem chương 6). + Đánh dấu đầu 3’-OH của DNA trong kỹ thuật xác định trình tự gen theo Maxam và Gilbert. III. Các enzyme gắn Enzyme ligase thường dùng là của phage T4 xâm nhiễm trong E. coli. Chức năng của enzyme này là nối các đoạn hở bằng liên kết cộng hóa trị, sử dụng năng lượng ATP. 1. Bacteriophage T4 DNA ligase (Bacteriophage T4-infected E. coli) Enzyme này là một chuỗi polypeptide (M = 68.000 Da) xúc tác cho sự tạo thành liên kết phosphodiester giữa đầu 3’-OH tự do của một phân tử DNA này với đầu cuối 5’-PO4 của một phân tử DNA khác. DNA ligase có tác dụng cho cả trường hợp đầu so le lẫn đầu bằng, tuy nhiên đối với đầu bằng enzyme đòi hỏi nồng độ cao hơn và điều kiện phản ứng cũng khác. 2. Bacteriophage T4 RNA ligase (Bacteriophage T4-infected E. coli) Enzyme này xúc tác cho mối liên kết cộng hóa trị giữa nhóm 5’-PO4 của DNA sợi đơn hoặc RNA với nhóm 3’-OH của DNA sợi đơn hoặc RNA. Do cơ chất thích hợp cho enzyme này là các phân tử nhỏ nên nó thường được dùng để đánh dấu đầu 3’ của các phân tử RNA sử dụng làm mẫu dò.
- 3. Bacteriophage T4 polynucleotide kinase (Bacteriophage T4-infected E. coli) Enzyme bacteriophage T4 polynucleotide kinase xúc tác chuyển nhóm γ-phosphate của ATP tới đầu 5’ của DNA hoặc RNA. Hai loại phản ứng thường có thể xảy ra là phản ứng thuận và phản ứng trao đổi. Trong phản ứng thuận, nhóm γ-phosphate được chuyển tới đầu 5’ của DNA đã được dephosphoryl hóa (mất nhóm phosphate). Trong phản ứng trao đổi, khi có một ADP thừa, enzyme sẽ chuyển nhóm 5’ phosphate từ DNA đã được phosphoryl hóa tới ADP, DNA sau đó sẽ được phosphoryl hóa trở lại bằng cách nhận một nhóm γ-phosphate đã được đánh dấu đồng vị phóng xạ từ một phân tử [γ-32P]ATP. - Ứng dụng chính + Đánh dấu phóng xạ đầu 5’ của DNA để phân tích trình tự bằng phương pháp Maxam và Gilbert (1977), dùng làm mẫu dò trong các kỹ thuật lai phân tử (xem chương 5). + Phosphoryl hóa các đoạn nối (linker) và các đoạn DNA không có nhóm 5’ phosphate để chuẩn bị cho phản ứng gắn trong phương pháp tạo dòng. 4. Alkaline phosphatase (E. coli và ruột bê) Cả hai enzyme alkaline của vi khuẩn (bacteria alkaline phosphatase, BAP) và ruột bê (calf intestinal alkaline phosphatase, CIP) đều xúc tác loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi DNA và RNA. - Ứng dụng chính + Loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi DNA hoặc RNA trước khi đánh dấu đầu 5’ bằng 32P. + Loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi các đoạn DNA để ngăn cản sự tự gắn. Trong kỹ thuật tạo dòng,
- khi một vector được mở vòng DNA bằng một RE rồi sau đó được loại bỏ nhóm 5’ phosphate thì nó không thể tự gắn lại (tự tái tạo lại vòng). Chỉ khi có đoạn DNA ngoại lai mang các đầu 5’ phosphate cần thiết được đưa vào thì phản ứng gắn giữa vector và DNA ngoại lai mới xảy ra. IV. Các enzyme phân cắt Là nhóm các enzyme xúc tác thủy phân liên kết phosphodiester trong phân tử DNA hoặc RNA, bao gồm các endonuclease (cắt bên trong phân tử nucleic acid) và exonuclease (cắt bên ngoài phân tử nucleic acid). Các RE cũng là các endonuclease, nhưng chúng có tính đặc hiệu rất cao cho từng trình tự 4 hoặc 6 nucleotide. Dưới đây là các nuclease chính thường được sử dụng: 1. Deoxyribonuclease I (DNase I) (Tụy bò) DNase I xúc tác thủy phân DNA sợi đơn hoặc sợi đôi ở các liên kết phosphodiester nằm bên cạnh các pyrimidine nucleotide, tạo ra các oligonucleotide và các oligonucleotide có đầu tận cùng 5' monophosphate. Khi có mặt Mg2+, DNase I tác dụng độc lập trên mỗi sợi DNA, và các vị trí cắt được phân bố ngẫu nhiên. Khi có mặt Mn2+, DNase I sẽ cắt cả hai sợi DNA gần như ở cùng một vị trí để tạo ra các đoạn DNA đầu bằng hoặc đầu lồi nhưng chỉ nhô ra một hoặc hai nucleotide. - Ứng dụng chính + Tạo ra các điểm đứt (nick) trên DNA sợi đôi để đánh dấu mẫu dò đồng vị phóng xạ bằng phương pháp dịch chuyển điểm đứt. + Tạo ra các dòng ngẫu nhiên để phân tích trình tự trong bacteriophage M13 vector. + Phân tích phức hợp protein:DNA (DNase footprinting). + Loại bỏ DNA trong các phân đoạn RNA hay protein. 2. Nuclease S1 (Aspergillus oryzae) Enzyme nuclease S1 cắt DNA sợi đơn hoặc RNA để tạo ra đầu 5’ monophosphate hoặc các oligonucleotide. DNA sợi đôi và thể lai DNA:RNA ít chịu tác dụng của enzyme này. Tuy nhiên, các nucleic acid sợi đôi sẽ bị nuclease S1 cắt hoàn toàn nếu chúng bị xử lý với một lượng rất lớn enzyme. Một lượng vừa đủ của enzyme sẽ tách các nucleic acid sợi đôi ở các điểm đứt hoặc các lỗ hổng nhỏ thành hai hoặc nhiều đoạn.
- - Ứng dụng chính + Phân tích cấu trúc thể lai DNA:RNA. + Loại bỏ các phần sợi đơn trên đầu sole ra khỏi đoạn DNA sợi đôi để tạo ra các đầu bằng. + Mở vòng cặp tóc xuất hiện trong quá trình tổng hợp cDNA sợi đôi. Một enzyme có hoạt tính tương tự nuclease S1 là mung-bean nuclease (endonuclease) được tách chiết từ mầm đậu xanh (Phaseolus aureus). 3. Exonuclease III (Exo III) (E. coli) Exo III xúc tác loại bỏ các 5’ mononucleotide từ đầu 3’ OH của DNA sợi đôi (DNA mạch thẳng hoặc mạch vòng chứa các điểm đứt hoặc lỗ hổng). Hoạt tính enzyme cho kết quả tạo thành các vùng sợi đơn dài trong DNA sợi đôi. Enzyme này có 3 hoạt tính khác nhau: endonuclease đặc hiệu cho apurinic DNA, RNase H và 3’ phosphatase (loại bỏ đầu 3’ phosphate nhưng không cắt các liên kết phosphodiester bên trong). Exo III không cắt các DNA sợi đơn hoặc DNA sợi đôi có đầu lồi 3’.
- - Ứng dụng chính + Tạo ra các cấu trúc sợi đơn ở một số vùng trên phân tử DNA dùng làm cơ chất cho đoạn Klenow của DNA polymerase I (để sản xuất mẫu dò đặc trưng cho từng sợi). + Tạo ra các đột biến khuyết đoạn (deletion) tại các trình tự tận cùng của DNA sợi đôi mạch thẳng. Phản ứng này thường phối hợp với mung-bean nuclease hoặc nuclease S1. Một exonuclease tương tự là nuclease BAL31, có hoạt tính exonuclease 5’®3’ và 3’®5’, có khả năng tạo các DNA sợi đôi đầu bằng mà không cần sự hiện diện của nuclease S1. 4. Ribonuclease (RNase A) (Tụy bò) Enzyme xúc tác thủy phân RNA thành các đoạn nhỏ hơn. RNase A có hoạt tính rất mạnh, hiện diện ở mọi nơi và rất bền vững (không bị mất hoạt tính khi bị xử lý ở 90°C trong 1 giờ). RNase A cắt liên kết phosphodiester nằm ngay sau một pyrimidine của một RNA sợi đơn. - Ứng dụng chính + Loại bỏ RNA trong các chế phẩm DNA hay protein. + Loại bỏ các vùng không bắt cặp trên RNA trong thể lai RNA:DNA. 5. RNase H Enzyme RNase H là một loại ribonuclease có khả năng cắt liên kết 3’-O-P của RNA trong sợi đôi của thể lai DNA:RNA để tạo ra các sản phẩm có đầu tận cùng 3’-OH và 5’-PO4. RNase H là một endonuclease không đặc hiệu, xúc tác cắt RNA thông qua cơ chế thủy phân nhờ một ion kim loại hóa trị 2 liên kết với enzyme. Trong tạo dòng phân tử, RNase H xúc tác cắt đặc hiệu RNA trong thể lại RNA:DNA mà không cắt DNA hoặc RNA không ở trong thể lai, enzyme này thường được dùng để phá hủy khuôn mẫu RNA sau khi tổng hợp sợi cDNA thứ nhất bằng phiên mã ngược, để tiếp tục tổng hợp sợi cDNA thứ hai tạo thành một sợi đôi cDNA. V. Các protein liên kết DNA sợi đơn Các protein liên kết DNA sợi đơn (single stranded DNA-binding proteins, SSB) kết hợp với DNA sợi đơn nhưng không kết hợp với DNA sợi đôi. Chúng được xem như là các chất phản ứng trong tạo dòng phân tử xuất phát từ chỗ chúng có khả năng phá vỡ sự ổn định của các cấu trúc thứ cấp bên trong sợi nucleotide; tăng nhanh sự tái ủ của các polynucleotide bổ sung và tăng hoạt tính của các enzyme DNA polymerase bằng cách loại bỏ các cấu trúc thứ cấp bên trong sợi là những yếu tố ngăn cản sự tiến triển của các enzyme này. Nhờ tính chất này, các protein SSB trở thành các chất phản ứng hữu ích trong xác định trình tự DNA. - Ứng dụng chính
- + Phát sinh đột biến điểm trực tiếp bao gồm D-loops. + Tăng chiều dài chuỗi của sản phẩm trong mọi phản ứng được xúc tác bởi DNA polymerase trên các khuôn mẫu dài. Các protein SSB đặc biệt có thể kích thích các DNA polymerase đặc hiệu dùng trong các phản ứng phân tích trình tự chuỗi DNA. Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Hồ Huỳnh Thùy Dương. 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo dục, Hà Nội. 2. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA. 3. Brown TA. 2001. Gene Cloning-An Introduction. 4th ed. Blackwell Science, Oxford, UK. 4. Glick BR and Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. 3rd ed. ASM Press, USA. 5. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. Cold Spring Habor Laboratory Press, USA. 6. Ohman DE. 1989. Experiments in Gene Manipulation. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, USA. 7. Primrose SB, Twyman R and Old RW. 2001. Principles of Gene Manipulation. 6th ed. Blackwell Science, Oxford, UK.
CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD
-
Bài giảng Sinh học phân tử - GV.TS Võ Minh Trí
190 p |
724 |
340
-
Chương 4: Các hệ thống vector
21 p |
554 |
283
-
Giáo trình Kỹ thuật cơ bản trong Sinh học phân tử - TS. Phạm Hồng Sơn
172 p |
508 |
204
-
Chương 4: CÁC VECTOR VÀ SỰ TẠO DÒNG
19 p |
278 |
99
-
Chương 2: CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (tiếp theo)
46 p |
158 |
72
-
Kỹ thuật gen trong sinh học phân tử
43 p |
117 |
39
-
Bài giảng Sinh học phân tử: Phương pháp và kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử - Nguyễn Thị Ngọc Yến
81 p |
60 |
18
-
Bài giảng Chương 1: Các phương pháp xác định vi sinh vật trong thực phẩm
108 p |
72 |
18
-
Giáo trình Kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử
172 p |
45 |
13
-
Phương pháp tách dòng phân tử và xây dựng thư viện hệ gen
11 p |
53 |
12
-
Bài giảng Công nghệ DNA tái tổ hợp - Nguyễn Hoàng Lộc
128 p |
43 |
9
-
Bài giảng Công nghệ di truyền: Chương 1 - Nguyễn Vũ Phong
37 p |
18 |
7
-
Bài giảng lý sinh: Chương 1
127 p |
32 |
6
-
Bài giảng Chương 1: Các Enzyme chủ yếu - Nguyễn Vũ Phong
37 p |
28 |
4
-
Bài giảng sinh học đại cương Công nghệ hóa dầu và công nghệ hóa hữu cơ: Chương 1
10 p |
35 |
4
-
Bài giảng Một số thuật ngữ thường gặp trong sinh học phân tử
0 p |
5 |
3
-
Bài giảng Sinh học phân tử: Chương 7 - Nguyễn Hữu Trí
34 p |
2 |
1

Set-Cookie: TLDEVNamespace=i16q407dq4uutnn602rd13po76; path=/; domain=.tailieu.vn; HttpOnly

Server: Apache/2.2.31 (CentOS)


text:
Hoàng anh
-
Báo cáo tài chính của Hội đồng Quản trị Công ty Cổ phần Hoàng Anh Gia Lai quý 4 năm 2008
41p haichau 24-06-2009 498 135 Download
-
Ngày 01/06/2006 chuyển thành Công ty cổ phần Hoàng Anh Gia Lai với vốn điều lệ 296 tỷ đồng. · Tiền thân ban đầu là xí nghiệp tư doanh Hoàng Anh được thành lập năm 1993.Ngày 15/12/2008 cổ phiếu của công ty niêm yết tại Hose. · Trải qua 06 lần tăng vốn, vốn điều lệ đầu năm 2009 của công ty là 1.798,1 tỷ đồng, là công ty cổ phần chuyên về bất động sản có vốn lớn hàng đầu tại Việt Nam. · Ngày 18/11/2009: Thay đổi giấy chứng nhận đăng ký kinh doanh lần thứ 13.
10p ngoctoankmn90 30-03-2011 165 57 Download
-
Báo cáo tài chính công ty cổ phần Hoàng Anh Gia Lai_Năm tài chính kết thúc ngày 31 tháng 12 năm 2010
Tham khảo tài liệu 'báo cáo tài chính công ty cổ phần hoàng anh gia lai_năm tài chính kết thúc ngày 31 tháng 12 năm 2010', tài chính - ngân hàng, tài chính doanh nghiệp phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả
51p meomap8 30-12-2011 149 32 Download
-
Tham khảo bài viết 'luận văn: hoàn thiện công tác kế toán vốn bằng tiền tại công ty cptm vt & dl hoàng anh', luận văn - báo cáo, tài chính - kế toán - ngân hàng phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả
78p chieuwindows23 01-06-2013 64 27 Download
-
Hát thuộc lời ca và đúng giai điệu của bài hát. Biết hát kết hợp vổ tay theo nhịp và tiết tấu của bài hát, hát đều giọng, to rỏ lời đúng giai điệu của bài hát. Biết bài hát này là bài hát của nước Pháp lời do nhạc sĩ Hoàng Anh Viết. II/Chuẩn bị của giáo viên: Nhạc cụ đệm. Băng nghe mẫu. Hát chuẩn xác bài hát.
7p toyotayaris 08-08-2010 285 17 Download
-
HAGL Plaza Hotel Đà Nẵng do công ty cổ phần Hoàng Anh Gia Lai làm chủ đầu tư, trực tiếp quản lý và khai thác được xây dựng theo tiêu chuẩn 5 sao, toạ lạc tại số 1 Nguyễn Văn Linh trung tâm thành phố Đà Nẵng Với 23 tầng Hoàng Anh Gia Lai Plaza Đà Nẵng là một trong những toà nhà cao nhất miền Trung hiện nay, trong bài tiểu luận trình bày hệ sản phẩm khách sạn Hoàng Anh Gia Lai Đà Nẵng
13p xuka_12 17-12-2013 38 16 Download
-
Dự án đầu tư Dây chuyền giết mổ bò Hoàng Anh Gia Lai có nhiều tác động tích cực đến sự phát triển kinh tế xã hội, đóng góp vào sự phát triển và tăng trưởng của nền kinh tế quốc dân nói chung và của khu vực nói riêng. Nhằm giúp các bạn hiểu hơn về vấn đề này, mời các bạn cùng tham khảo nội dung thuyết minh dự án đầu tư "Dây chuyền giết mổ bò Hoàng Anh Gia Lai" dưới đây để nắm bắt nội dung chi tiết.
72p ctymoitruongtnx 15-03-2016 32 10 Download
-
Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Quản trị Kinh doanh: Phân tích hiệu quả kinh doanh của Công ty Cổ phần Du lịch Hoàng Anh Đất Xanh Quy Nhơn
Đề tài hệ thống hóa cơ sở lý luận về hiệu quả kinh doanh của công ty; phân tích và đánh giá hiệu quả kinh doanh của Công ty Cổ phần Du lịch Hoàng Anh Đất Xanh Quy Nhơn; đề xuất một số giải pháp nhằm nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty Cổ phần Du lịch Hoàng Anh Đất Xanh Quy Nhơn.
26p uocvongxua06 13-08-2015 24 9 Download
-
Và như thế , Em Yêu Anh Hoàng Anh Tú Phải kết thúc. Như một mệnh lệnh từ trong sâu thẳm của Dung. Một tình yêu hơn 2 năm sẽ phải kết thúc. Đã có quá nhiều điều bất ổn.
6p quacquac_123 28-05-2013 42 7 Download
-
Choáng ngợp trước cung điện của Nữ hoàng Anh Lâu đài Windsor là chốn nghỉ ngơi ưa thích của Nữ hoàng Anh và cũng là công trình gắn với lịch sử đảo quốc này trong suốt gần 1000 năm qua. Nếu tới thăm nước Anh, bạn không nên bỏ qua cơ hội ghé vào lâu đài Windsor, một trong 3 nơi ở chính thức của Hoàng gia nước này. Dù không nằm giữa London hoa lệ nhưng lâu đài Windsor là chốn nghỉ ngơi ưa thích của Nữ hoàng Anh và cũng là công trình gắn với lịch sử đảo quốc...
7p hzero5 26-04-2011 54 5 Download
-
Họa sĩ Phạm Hoàng Anh Sinh năm 1967 tại Hải Phòng. Tốt nghiệp Đại học Mỹ thuật Huế năm 1998 Giảng viên trường Đại học Mỹ thuật Huế Hội viên Hội Mỹ thuật Việt Nam Tác phẩm trưng bày tại Nghệ thuật Di sản bán đấu giá tại Jakarta, Indonesia và phòng đọc Nghệ thuật bán đấu giá tại Hồng Kông Nhiều bộ sưu tập tư nhân ở Pháp, Singapore, Hong Kong, Australia, Mỹ, Bỉ, Anh, Thụy Sĩ, Đức
5p tuanloccuoi 04-01-2013 38 3 Download
-
Sinh ngày 19/10/1977 tại Hải Phòng Tốt nghiệp khoa Mỹ thuật trường Cao đẳng sư phạm Nhạc Họa Hội viên hội Mỹ thuật Hải Phòng Địa chỉ: 9/42/179 Lê Lợi, Ngô Quyền, Hải Phòng Tel: 0906097646 .Hoàng Anh - Tĩnh vật - Sơn dầu - 100cm x 80cm .Hoàng Anh - Hoa sen - Sơn dầu - 80cm x 1000cm Hoàng Anh - Mèo- Sơn dầu - 70cm x 50cm .Hoàng Anh - Phong cảnh - Sơn dầu - 120cm x 80cm
4p tuanloccuoi 04-01-2013 29 2 Download
-
Lâu đài Windsor là chốn nghỉ ngơi ưa thích của Nữ hoàng Anh và cũng là công trình gắn với lịch sử đảo quốc này trong suốt gần 1000 năm qua. Dưới đây là một số thông tin để bạn tìm hiểu về vẻ đẹp cung điện của nữ hoàng Anh. Nếu tới thăm nước Anh, bạn không nên bỏ qua cơ hội ghé vào lâu đài Windsor, một trong 3 nơi ở chính thức của Hoàng gia nước này. Dù không nằm giữa London hoa lệ nhưng lâu đài Windsor là chốn nghỉ ngơi ưa thích của Nữ hoàng...
8p mountain123123 02-06-2013 20 2 Download
-
Mời các bạn cùng tìm hiểu lịch sử các học thuyết kinh tế; các cuộc khủng hoảng trong xây dựng;... được trình bày cụ thể trong "Bài giảng Kinh tế và xây dựng - Nguyễn Hoàng Anh". Hy vọng tài liệu là nguồn thông tin hữu ích cho quá trình học tập và nghiên cứu của các bạn.
50p thuchikiem 09-05-2016 30 14 Download
-
Xin giới thiệu tới các bạn học sinh, sinh viên "Bài giảng Toán cao cấp A2" của Th.S Nguyễn Hoàng Anh Khoa. Bài giảng tập trung đến các vấn đề cơ bản về không gian vecto - ánh xạ tuyến tính; chéo hóa ma trận; chuỗi; phương trình vi phân.
27p codon_08 11-03-2016 50 9 Download
-
Nếu tới thăm nước Anh, bạn không nên bỏ qua cơ hội ghé vào lâu đài Windsor, một trong 3 nơi ở chính thức của Hoàng gia nước này. Dù không nằm giữa London hoa lệ nhưng lâu đài Windsor là chốn nghỉ ngơi ưa thích của Nữ hoàng Anh và cũng là công trình gắn với lịch sử đảo quốc này trong suốt gần 1000 năm qua. Đa số các vị vua và các Nữ hoàng của nước Anh đều góp phần xây dựng và mở rộng lâu đài Windsor. Khi đất nước bình yên, nó được mở...
7p meocondoibung 07-04-2011 45 4 Download
-
Bài thu hoạch: Lập kế hoạch kinh doanh Công ty Cổ phần Hoàng Anh - Mêkong trình bày về thực trạng hoạt động, phân tích kết quả kinh doanh, chiến lược - mục tiêu và kế hoạch kinh doanh của doanh nghiệp.
22p diemhong 07-09-2011 961 419 Download
-
Chuyên đề thực tập tốt nghiệp: Công tác kế toán bán hàng và xác định kết quả kinh doanh tại Công ty TNHH TM và DV ô tô Hoàng Anh
Chuyên đề thực tập tốt nghiệp: Công tác kế toán bán hàng và xác định kết quả kinh doanh tại Công ty TNHH TM và DV ô tô Hoàng Anh trình bày các nội dung chính: cơ sở lý luận luận về kế toán bán hàng và xác định kết quả kinh doanh trong các doanh nghiệp sản xuất kinh doanh, thực trạng tổ chức công tác bán hàng và xác định kết quả kinh doanh tại công ty TNHH TM và DV ô tô Hoàng Anh, hoàn thiện về tổ chức kế toán bán hàng và xác định kết quả kinh doanh tại công ty TNHH T...
65p letran9192 28-04-2014 701 310 Download
-
Đề tài " Tìm hiểu nguyên nhân và diễn biến của cuộc khủng hoảng tài chính tiền tệ ở Châu Á năm 1997 "
Ngòi nổ và diễn biến của cuộc khủng hoảng tài chính tiền tệ ở Châu Á năm 1997. - Tình hình kinh tế của một số quốc gia Châu Á trong cuộc khủng hoảng.. - Ảnh hưởng của cuộc khủng hoảng đến một số lĩnh vực kinh tế của Việt Nam. - Bài học cho Việt Nam từ cuộc khủng hoảng tài chính tiền tệ ở Châu Á.
30p chung_kt 15-06-2012 866 293 Download
-
Tình hình tài chính doanh nghiệp ổn định và minh bạch là một trong những điều kiện tiên quyết cho hoạt động kinh doanh của doanh nghiệp diễn ra một cách nhịp nhàng, đồng bộ, đạt hiệu quả cao. Sự ổn định đó có được hay không phụ thuộc phần lớn vào khả năng quản trị tài chính của doanh nghiệp. Ở nhiều nước như Mỹ và châu Âu, trong các công ty, tập đoàn kinh tế lớn như General Motor, Microsoft, Apple, Vodaphone,...
59p thanhphongdn91 29-12-2012 610 219 Download

markdown:
# Hoàng anh
**Hoàng anh**
-
Báo cáo tài chính của Hội đồng Quản trị Công ty Cổ phần Hoàng Anh Gia Lai quý 4 năm 2008
41p
haichau
24-06-2009
498
135
Download
-
Ngày 01/06/2006 chuyển thành Công ty cổ phần Hoàng Anh Gia Lai với vốn điều lệ 296 tỷ đồng. · Tiền thân ban đầu là xí nghiệp tư doanh Hoàng Anh được thành lập năm 1993.Ngày 15/12/2008 cổ phiếu của công ty niêm yết tại Hose. · Trải qua 06 lần tăng vốn, vốn điều lệ đầu năm 2009 của công ty là 1.798,1 tỷ đồng, là công ty cổ phần chuyên về bất động sản có vốn lớn hàng đầu tại Việt Nam. · Ngày 18/11/2009: Thay đổi giấy chứng nhận đăng ký kinh doanh lần thứ 13.
10p
ngoctoankmn90
30-03-2011
165
57
Download
-
[Báo cáo tài chính công ty cổ phần Hoàng Anh Gia Lai_Năm tài chính kết thúc ngày 31 tháng 12 năm 2010](http://tailieu.vn/doc/bao-cao-tai-chinh-cong-ty-co-phan-hoang-anh-gia-lai-nam-tai-chinh-ket-thuc-ngay-31-thang-12-nam-2010-1053525.html)
Tham khảo tài liệu 'báo cáo tài chính công ty cổ phần hoàng anh gia lai_năm tài chính kết thúc ngày 31 tháng 12 năm 2010', tài chính - ngân hàng, tài chính doanh nghiệp phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả
51p
meomap8
30-12-2011
149
32
Download
-
Tham khảo bài viết 'luận văn: hoàn thiện công tác kế toán vốn bằng tiền tại công ty cptm vt & dl hoàng anh', luận văn - báo cáo, tài chính - kế toán - ngân hàng phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả
78p
chieuwindows23
01-06-2013
64
27
Download
-
Hát thuộc lời ca và đúng giai điệu của bài hát. Biết hát kết hợp vổ tay theo nhịp và tiết tấu của bài hát, hát đều giọng, to rỏ lời đúng giai điệu của bài hát. Biết bài hát này là bài hát của nước Pháp lời do nhạc sĩ Hoàng Anh Viết. II/Chuẩn bị của giáo viên: Nhạc cụ đệm. Băng nghe mẫu. Hát chuẩn xác bài hát.
7p
toyotayaris
08-08-2010
285
17
Download
-
HAGL Plaza Hotel Đà Nẵng do công ty cổ phần Hoàng Anh Gia Lai làm chủ đầu tư, trực tiếp quản lý và khai thác được xây dựng theo tiêu chuẩn 5 sao, toạ lạc tại số 1 Nguyễn Văn Linh trung tâm thành phố Đà Nẵng Với 23 tầng Hoàng Anh Gia Lai Plaza Đà Nẵng là một trong những toà nhà cao nhất miền Trung hiện nay, trong bài tiểu luận trình bày hệ sản phẩm khách sạn Hoàng Anh Gia Lai Đà Nẵng
13p
xuka_12
17-12-2013
38
16
Download
-
Dự án đầu tư Dây chuyền giết mổ bò Hoàng Anh Gia Lai có nhiều tác động tích cực đến sự phát triển kinh tế xã hội, đóng góp vào sự phát triển và tăng trưởng của nền kinh tế quốc dân nói chung và của khu vực nói riêng. Nhằm giúp các bạn hiểu hơn về vấn đề này, mời các bạn cùng tham khảo nội dung thuyết minh dự án đầu tư "Dây chuyền giết mổ bò Hoàng Anh Gia Lai" dưới đây để nắm bắt nội dung chi tiết.
72p
ctymoitruongtnx
15-03-2016
32
10
Download
-
[Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Quản trị Kinh doanh: Phân tích hiệu quả kinh doanh của Công ty Cổ phần Du lịch Hoàng Anh Đất Xanh Quy Nhơn](http://tailieu.vn/doc/tom-tat-luan-van-thac-si-quan-tri-kinh-doanh-phan-tich-hieu-qua-kinh-doanh-cua-cong-ty-co-phan-du-l-1767508.html)
Đề tài hệ thống hóa cơ sở lý luận về hiệu quả kinh doanh của công ty; phân tích và đánh giá hiệu quả kinh doanh của Công ty Cổ phần Du lịch Hoàng Anh Đất Xanh Quy Nhơn; đề xuất một số giải pháp nhằm nâng cao hiệu quả kinh doanh của Công ty Cổ phần Du lịch Hoàng Anh Đất Xanh Quy Nhơn.
26p
uocvongxua06
13-08-2015
24
9
Download
-
Và như thế , Em Yêu Anh Hoàng Anh Tú Phải kết thúc. Như một mệnh lệnh từ trong sâu thẳm của Dung. Một tình yêu hơn 2 năm sẽ phải kết thúc. Đã có quá nhiều điều bất ổn.
6p
quacquac_123
28-05-2013
42
7
Download
-
Choáng ngợp trước cung điện của Nữ hoàng Anh Lâu đài Windsor là chốn nghỉ ngơi ưa thích của Nữ hoàng Anh và cũng là công trình gắn với lịch sử đảo quốc này trong suốt gần 1000 năm qua. Nếu tới thăm nước Anh, bạn không nên bỏ qua cơ hội ghé vào lâu đài Windsor, một trong 3 nơi ở chính thức của Hoàng gia nước này. Dù không nằm giữa London hoa lệ nhưng lâu đài Windsor là chốn nghỉ ngơi ưa thích của Nữ hoàng Anh và cũng là công trình gắn với lịch sử đảo quốc...
7p
hzero5
26-04-2011
54
5
Download
-
Họa sĩ Phạm Hoàng Anh Sinh năm 1967 tại Hải Phòng. Tốt nghiệp Đại học Mỹ thuật Huế năm 1998 Giảng viên trường Đại học Mỹ thuật Huế Hội viên Hội Mỹ thuật Việt Nam Tác phẩm trưng bày tại Nghệ thuật Di sản bán đấu giá tại Jakarta, Indonesia và phòng đọc Nghệ thuật bán đấu giá tại Hồng Kông Nhiều bộ sưu tập tư nhân ở Pháp, Singapore, Hong Kong, Australia, Mỹ, Bỉ, Anh, Thụy Sĩ, Đức
5p
tuanloccuoi
04-01-2013
38
3
Download
-
Sinh ngày 19/10/1977 tại Hải Phòng Tốt nghiệp khoa Mỹ thuật trường Cao đẳng sư phạm Nhạc Họa Hội viên hội Mỹ thuật Hải Phòng Địa chỉ: 9/42/179 Lê Lợi, Ngô Quyền, Hải Phòng Tel: 0906097646 .Hoàng Anh - Tĩnh vật - Sơn dầu - 100cm x 80cm .Hoàng Anh - Hoa sen - Sơn dầu - 80cm x 1000cm Hoàng Anh - Mèo- Sơn dầu - 70cm x 50cm .Hoàng Anh - Phong cảnh - Sơn dầu - 120cm x 80cm
4p
tuanloccuoi
04-01-2013
29
2
Download
-
Lâu đài Windsor là chốn nghỉ ngơi ưa thích của Nữ hoàng Anh và cũng là công trình gắn với lịch sử đảo quốc này trong suốt gần 1000 năm qua. Dưới đây là một số thông tin để bạn tìm hiểu về vẻ đẹp cung điện của nữ hoàng Anh. Nếu tới thăm nước Anh, bạn không nên bỏ qua cơ hội ghé vào lâu đài Windsor, một trong 3 nơi ở chính thức của Hoàng gia nước này. Dù không nằm giữa London hoa lệ nhưng lâu đài Windsor là chốn nghỉ ngơi ưa thích của Nữ hoàng...
8p
mountain123123
02-06-2013
20
2
Download
-
Mời các bạn cùng tìm hiểu lịch sử các học thuyết kinh tế; các cuộc khủng hoảng trong xây dựng;... được trình bày cụ thể trong "Bài giảng Kinh tế và xây dựng - Nguyễn Hoàng Anh". Hy vọng tài liệu là nguồn thông tin hữu ích cho quá trình học tập và nghiên cứu của các bạn.
50p
thuchikiem
09-05-2016
30
14
Download
-
Xin giới thiệu tới các bạn học sinh, sinh viên "Bài giảng Toán cao cấp A2" của Th.S Nguyễn Hoàng Anh Khoa. Bài giảng tập trung đến các vấn đề cơ bản về không gian vecto - ánh xạ tuyến tính; chéo hóa ma trận; chuỗi; phương trình vi phân.
27p
codon_08
11-03-2016
50
9
Download
-
Nếu tới thăm nước Anh, bạn không nên bỏ qua cơ hội ghé vào lâu đài Windsor, một trong 3 nơi ở chính thức của Hoàng gia nước này. Dù không nằm giữa London hoa lệ nhưng lâu đài Windsor là chốn nghỉ ngơi ưa thích của Nữ hoàng Anh và cũng là công trình gắn với lịch sử đảo quốc này trong suốt gần 1000 năm qua. Đa số các vị vua và các Nữ hoàng của nước Anh đều góp phần xây dựng và mở rộng lâu đài Windsor. Khi đất nước bình yên, nó được mở...
7p
meocondoibung
07-04-2011
45
4
Download
-
Bài thu hoạch:
**Lập kế hoạch kinh doanh Công ty Cổ phần Hoàng Anh - Mêkong**trình bày về thực trạng hoạt động, phân tích kết quả kinh doanh, chiến lược - mục tiêu và kế hoạch kinh doanh của doanh nghiệp.
22p
diemhong
07-09-2011
961
419
Download
-
[Chuyên đề thực tập tốt nghiệp: Công tác kế toán bán hàng và xác định kết quả kinh doanh tại Công ty TNHH TM và DV ô tô Hoàng Anh](http://tailieu.vn/doc/chuyen-de-thuc-tap-tot-nghiep-cong-tac-ke-toan-ban-hang-va-xac-dinh-ket-qua-kinh-doanh-tai-cong-ty--1674308.html)
Chuyên đề thực tập tốt nghiệp: Công tác kế toán bán hàng và xác định kết quả kinh doanh tại Công ty TNHH TM và DV ô tô Hoàng Anh trình bày các nội dung chính: cơ sở lý luận luận về kế toán bán hàng và xác định kết quả kinh doanh trong các doanh nghiệp sản xuất kinh doanh, thực trạng tổ chức công tác bán hàng và xác định kết quả kinh doanh tại công ty TNHH TM và DV ô tô Hoàng Anh, hoàn thiện về tổ chức kế toán bán hàng và xác định kết quả kinh doanh tại công ty TNHH T...
65p
letran9192
28-04-2014
701
310
Download
-
[Đề tài " Tìm hiểu nguyên nhân và diễn biến của cuộc khủng hoảng tài chính tiền tệ ở Châu Á năm 1997 "](http://tailieu.vn/doc/de-tai-tim-hieu-nguyen-nhan-va-dien-bien-cua-cuoc-khung-hoang-tai-chinh-tien-te-o-chau-a-nam-1997--1200299.html)
Ngòi nổ và diễn biến của cuộc khủng hoảng tài chính tiền tệ ở Châu Á năm 1997. - Tình hình kinh tế của một số quốc gia Châu Á trong cuộc khủng hoảng.. - Ảnh hưởng của cuộc khủng hoảng đến một số lĩnh vực kinh tế của Việt Nam. - Bài học cho Việt Nam từ cuộc khủng hoảng tài chính tiền tệ ở Châu Á.
30p
chung_kt
15-06-2012
866
293
Download
-
Tình hình tài chính doanh nghiệp ổn định và minh bạch là một trong những điều kiện tiên quyết cho hoạt động kinh doanh của doanh nghiệp diễn ra một cách nhịp nhàng, đồng bộ, đạt hiệu quả cao. Sự ổn định đó có được hay không phụ thuộc phần lớn vào khả năng quản trị tài chính của doanh nghiệp. Ở nhiều nước như Mỹ và châu Âu, trong các công ty, tập đoàn kinh tế lớn như General Motor, Microsoft, Apple, Vodaphone,...
59p
thanhphongdn91
29-12-2012
610
219
Download

WARC-Type: response

Content-Type: application/http; msgtype=response

Set-Cookie: TLDEVNamespace=li1810ogsocktq4b6hqdi50n07; path=/; domain=.tailieu.vn; HttpOnly

Connection: close

Cache-Control: no-store, no-cache, must-revalidate, post-check=0, pre-check=0

Pragma: no-cache

Vary: Accept-Encoding

Content-Type: text/html; charset=UTF-8


text:
Tại Sao Zậy Hả
Men That I Need
Thứ Năm, 5 tháng 5, 2016
Justin
Thích bộ ảnh không?
Gửi email bài đăng này
BlogThis!
Chia sẻ lên Twitter
Chia sẻ lên Facebook
Chia sẻ lên Pinterest
Nhãn:
Big Balls
,
Big Dick
,
Porn
,
Randy Blue
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét
Bài đăng Mới hơn
Bài đăng Cũ hơn
Trang chủ
Đăng ký:
Đăng Nhận xét (Atom)
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét

markdown:
Tại Sao Zậy Hả
Men That I Need
Thứ Năm, 5 tháng 5, 2016
Justin
Thích bộ ảnh không?
Gửi email bài đăng này
BlogThis!
Chia sẻ lên Twitter
Chia sẻ lên Facebook
Chia sẻ lên Pinterest
Nhãn:
Big Balls
,
Big Dick
,
Porn
,
Randy Blue
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét
Bài đăng Mới hơn
Bài đăng Cũ hơn
Trang chủ
Đăng ký:
Đăng Nhận xét (Atom)
## Không có nhận xét nào:
## Đăng nhận xét

X-XSS-Protection: 1; mode=block

Server: GSE

Cache-Control: private, max-age=0

X-Content-Type-Options: nosniff


text: Dịch vụ cung cấp nhân công vệ sinh công nghiệp làm sạch bảo dưỡng, bảo trì các công trình hằng ngày và định kỳ: -Vệ sinh cửa kính, cửa gỗ, cửa sắt. ( cửa sổ, cửa chính, cổng chính ) -Vệ sinh trần nhà. -Vệ sinh tường nhà. -Vệ sinh sàn nhà. -Vệ sinh tay vịn thang bộ. -Vệ sinh cầu thang. -Vệ sinh thang máy. -Vệ sinh vật dụng ( bàn, ghế, tủ, và các vật dụng khác…v.v.) -Vệ sinh khu vực Toilet. -Vệ sinh tẩy rửa làm sạch và đánh bóng sàn nhà. -Hút bụi. -Vệ sinh, lau kính bên trong và bên ngoài. -Vệ sinh, giặt ghế salon, sofa, ghế văn phòng …v.v -Giặt thảm cầu thang bộ và thảm sàn nhà. -Đánh bóng các vật dụng, khu vực đá Hoa Cương, Marble. -Vệ sinh hành lang, khu vực xung quanh vỉa hè. -Vệ sinh lối đi chung. -Vệ sinh đại sảnh, quầy tiếp tân. -Vệ sinh tầng hầm. -Vệ sinh hệ thống đèn, điện, v.v… Dịch vụ vệ sinh công nghiệp giặt thảm – giặt ghế sofa, ghế xe hơi -Theo các chuyên gia, ghế sofa có nguy cơ chứa các chất tồn dư của quá trình sản xuất vải bọc. Ngoài ra, nếu không vệ sinh hợp lý, ghế sẽ trở thành ổ chứa các côn trùng, vi khuẩn có hại cho sức khoẻ người dùng. -Thảm là vật liệu rất dễ bị ẩm móc, dễ bị xâm nhập bởi vi trùng, vi khuẩn, gây nên mùi khó chịu và đặc biệt là khi bị dính các đồ ăn thức uống, rất khó tẩy rửa các chất bẩn này Công ty TNHH dịch vụ thương mại 36 Hoàn Mỹ Địa chỉ : 80 Nguyễn công Trứ, Phường Đông Sơn , thành phố Thanh Hóa Hotline : 0977 823 056 – 0975 042 303 Email : phamvanhoe1988@gmail.com

markdown:
[Tp.Thanh Hóa Vệ sinh công nghiệp](http://thanhhoaonline.net)
Thảo luận trong '
[Dịch vụ khác](forums/dich-vu-khac.94/)' bắt đầu bởi [Pham van hoe](members/pham-van-hoe.27644/), [24 Tháng mười 2016](threads/ve-sinh-cong-nghiep.47612/).
Thảo luận trong '
[Dịch vụ khác](forums/dich-vu-khac.94/)' bắt đầu bởi [Pham van hoe](members/pham-van-hoe.27644/), [24 Tháng mười 2016](threads/ve-sinh-cong-nghiep.47612/).

X-Frame-Options: SAMEORIGIN

Vary: Accept-Encoding,User-Agent


text: Vòng tay đá óc eo(15 viên)vân đá tự nhiên,thấu quang tuyệt đẹp!vòng tay loại đá này chỉ dành cho nam giới đeo!Tác dụng trừ tà,hộ mệnh,đem lại may mắn!

markdown:
# Đá Cổ Vòng tay đá óc eo
Xem trong '
[Làng Vàng Bạc- Đá Quý](forum/lang-vang-bac-da-quy.137/)' đăng bởi [Tuyền泉](members/tuyen.4563/), [25/7/16](threads/vong-tay-da-oc-eo.49925/), [ Mã Tin: 49925 ]
**[454 lượt xem - 2 bình luận]**
Xem trong '
[Làng Vàng Bạc- Đá Quý](forum/lang-vang-bac-da-quy.137/)' đăng bởi [Tuyền泉](members/tuyen.4563/), [25/7/16](threads/vong-tay-da-oc-eo.49925/), [ Mã Tin: 49925 ]
**[454 lượt xem - 2 bình luận]**

Server: nginx


text:
01/01/2017
Trong khi ĐH Quốc gia Hà Nội vừa chính thức hủy cuộc thi đánh giá năng lực thì một số trường ĐH khác lại dự kiến sử dụng cách thi đánh giá năng lực để xét tuyển đầu vào.
28/12/2016
24/12/2016
21/12/2016
16/12/2016
15/12/2016
13/12/2016
13/12/2016
12/12/2016
07/12/2016
29/11/2016

WARC-Truncated: length

Server: Apache/2.2.15 (CentOS)

Set-Cookie: password=deleted; expires=Thu, 01-Jan-1970 00:00:01 GMT; path=/

Content-Type: text/html; charset=utf-8


text:
THPT Thượng Cát
Học tập vì ngày mai lập nghiệp
Tìm kiếm
Display results as :
Số bài
Chủ đề
Advanced Search
THPT Thượng Cát
::
Giải trí
::
Giải trí truyện
::
Truyện cười
Share
|
Ôi Bọ Chét @@!
Tác giả
Thông điệp
Trung.DoTrong
Moderators box giải trí
Tổng số bài gửi
:
6
Join date
:
25/08/2010
Age
:
24
Đến từ
:
Sentinel
Tiêu đề: Ôi Bọ Chét @@!
Thu Aug 26, 2010 12:58 pm
===>:Có 2 con Bọ chét nói chuyện với nhau: - Tao sống trên râu của thằng Cơ trưởng, được đi khắp nơi vui lắm. Nhưng mỗi lần đáp xuống thì nó uống rượu nhiều không thể tưởng làm tao say mèm. - Thì tao kêu mày chuyển nhà sang "râu" con tiếp viên sao mày không nghe, chỗ đó vừa ấm lại vừa thơm, thật là sướng! - Thì tao cũng nghe lời mày đó. Nhưng tao vừa chuyển qua đó thì sáng hôm sau lại ở trên râu thằng Cơ trưởng, vậy mới tức chớ
===>Có một cô rất lười tắm rửa quá bẩn nên người đầy bọ chét.Hôm nay do hẹn với bạn trai đi chơi nên cô ta tắm rửa rất sạch nhưng cuối cùng vẫn còn sót 3 con bọ chét.Hôm sau 3 con bọ chét gặp nhau nói chuyện.Con thứ nhất nói:" Hôm qua lũ to quá chúng mày ạ!. May mà tao gặp 2 cái "đồi trọc" leo lên may mà thoát nạn.Con 2 nói :tao thì chui vào một khu rừng rậm nên không bị lũ cuốn trôi.Chúng mày còn may chán...Tao tìm được một cái hang chui vào tránh lũ tưởng may ai dè tự dưng lại có một con trăn to cứ chui ra chui vào tao sợ quá nhưng vẫn chạy ra hỏi:"a trăn ơi a làm gì mà cứ chui ra chui vào thế".Nó không nói không rằng nhổ toẹt vào mặt tao một phát rồi chui ra tức không chịu được.
_________________
H0angD3
Ôi Bọ Chét @@!
Trang
1
trong tổng số
1
trang
Permissions in this forum:
Bạn
không có quyền
trả lời bài viết
THPT Thượng Cát
::
Giải trí
::
Giải trí truyện
::
Truyện cười
THPT Thượng Cát
::
Giải trí
::
Giải trí truyện
::
Truyện cười
Chuyển đến
:
Chọn Diễn Đàn
|
|--Thông báo Của BQT
| |--Thông báo chung
| |--Thắc mắc - Góp ý
| |--Phòng tuyển Mod
| |--Khen thưởng - Kỷ luật - Block
|
|--Diễn đàn chính
| |--Tán gẫu - Chát chính - Tranh luận
| |--Tình yêu - Tình Bạn
| |--Blog thành viên
| |--Thôn con trai
| |--Xóm con gái
| |--Tâm sự - Cảm xúc
|
|--Học tập
| |--Tin - Thể dục
| |--Công nghệ - Công dân
| |--English
| |--Toán - Lý - Hóa
| |--Văn - Sử - Địa
|
|--Thư viện ảnh
| |--Ảnh thành viên nam
| |--Ảnh thành viên nữ
| |--Ảnh Anime - Manga
| |--Ảnh diễn viên - Ca sĩ
|
|--Diễn đàn Music
| |--Nghe nhạc Online
| | |--Thể loại khác
| | |--Nhạc trẻ
| | |--Nhạc quốc tế
| |
| |--Quà tặng âm nhạc
| |--Lời bài hát
|
|--CLB FC bóng đá
| |--Chelsea
| |--Arsenal
| |--Liverpool
| |--Manchester United
|
|--Giải trí
|--Games Online
| |--Võ lâm truyền kỳ
| |--Audition
| |--Đột kích
| |--Games sắp ra mắt
| |--Các game khác
|
|--Giải trí truyện
| |--Thể loại khác
| |--Truyện cười
| |--Truyện cổ tích
| |--Tiểu thuyết
|
|--Thơ ca
|--Thơ sáng tác
|--Thơ sưu tầm
Free forum
|
©
phpBB
|
Free forum support
|
Liên hệ
|
Report an abuse
|
Sosblogs

Cache-Control: post-check=0, pre-check=0

Vary: User-Agent

P3P: CP="IDC DSP COR ADM DEVi TAIi PSA PSD IVAi IVDi CONi HIS OUR IND CNT"


text:
Các bạn truy cập vào Pota.vn để đọc truyện MỚI nha. Mong các bạn ủng hộ website mới này!
Chúc các bạn online vui vẻ !
Liên hệ: Email: vodanhvg@yahoo.com

X-Robots-Tag: Crawl-delay: 10

Cache-Control: private, no-cache, no-cache=Set-Cookie, proxy-revalidate

Vary: Host,Accept-Encoding

P3P: CP="Not supported"

Via: 1.1 varnish

Accept-Ranges: bytes


text:
Vị trí: Quốc Lộ 13 vào 70m, gần cầu vượt Bình Phước.
Hướng: Tây Bắc.
Diện tích: 51m2.
Giá: 918 000 000.
Tiện ích: Gần trường học, trung tâm thương mại, siêu thị, ngân hàng, gần chợ, dân cư hiện hữu văn minh, lối sống lành mạnh, giao thông thuận tiện, đường rộng 6m ôtô ra vào thoải mái, gần khu biệt thự Jamona Sacomreal, gần quỹ đất giáo dục Hiệp Bình Phước, thích hơp ở, kinh doanh, đầu tư….
Sổ hồng riêng công chứng sang tên ngay.
Ngân hàng hỗ trợ 70% giá trị lô đất.
Hỗ trợ xin phép xây dựng.
Xây dựng tự do.
LH 0909.27.06.27
Bán đất đường 10- Hiệp Bình Phước – thoáng mát, siêu đẹp, giá 18tr/m
Tìm nhanh
Đăng lúc: 31/03/2016 10:58
Đánh giá:
(4/1)
Thông tin liên hệ
- Diện tích: 55
- Giá: 918000000
- Liên hệ: Nguyễn thị tuyết nhung
- Điện thoại: 0909.27.06.27
- Email: nhungbds2016@gmail.com
Trạng thái tin rao
Nếu bạn đã XEM NHÀ hoặc GỌI ĐIỆN HỎI THÔNG TIN mua bán, cho thuê nhà đất này, bạn hãy BÌNH LUẬN về TÌNH TRẠNG của nhà đất đó ở bên dưới để giúp cho CỘNG ĐỒNG biết THÔNG TIN này
Ví dụ như:
Ví dụ như:
- Nhà này đã bán rồi
- Nhà này đã cho thuê rồi
- Chủ nhà này khó tính lắm
- Nhà này hay mất nước lắm ==> đừng thuê !
- Ở chung với chủ nhà này thật không chịu nổi !
- etc...
Bán đất Thủ Đức, TPHCM
Cần tiền bán gấp lô đất 94m2, 23tr/m2, giá thị trường khu vực trên 30tr/m2 Nằm ngay vị trí được thừa hưởng tất cả những tiện ích hiện hữu của của hệ thống hạ tầng kinh tế - xã hội ổn định trong khu vực, bao gồm chợ Thủ Đức, siêu thị Coop Mart, bệnh viện Đa khoa Thủ Đức, Đại học Quốc gia TP.HCM và trung tâm Thể dục Thể thao ...Loại tin:Mua bán nhà đấtGiá:2200000000Diện tích:94Quận/Huyện:Thủ Đức, TPHCMĐăng lúc:20/02 10:19
Vị trí mặt tiền đường Bình Chiểu đối diện trạm y tế phường Bình Chiểu khô ráo, không ngập nước. Diện tích 70 m2. Giá 239 tr/70m2 * Tiện ích. - Nằm ngay nút giao thông Gò Dưa thuận tiện đi trung tâm thành phố Q1, Q2, Q9, Gò Vấp, Bình Thạnh. - Đường đi về Lái Thiêu, Thủ Dầu Một, An Phú, Biên Hòa. - Cách chợ Đầu Mối ...Loại tin:Mua bán nhà đấtGiá:239000000Diện tích:70Quận/Huyện:Thủ Đức, TPHCMĐăng lúc:20/02 06:57
Diện tích 70 m2.Giá 239tr/70m2.Địa thế.+ Mặt tiền đường Tỉnh Lộ 43 – nút giao thông kết nối các điểm Thủ Đức, Q1, Q 9, Q2, Q12, Lái Thiêu, Thuận An, Thủ Dầu Một, Tân Uyên.+ Ngay chợ Đồng An – Chợ Lớn nhất khu vực Bình Chiểu, dân cư tụ tập nườm nượp thuận lợi cho việc kinh dinh buôn bán tất thảy các ngành hàng (hoàn kim, quán ăn, thực ...Loại tin:Mua bán nhà đấtGiá:239000000Diện tích:70Quận/Huyện:Thủ Đức, TPHCMĐăng lúc:19/02 06:19
Thông tin mô tả.**Dự án đất nền thuộc khu dân cư Văn Hóa - Bình Chiểu.** Tọa lạc ngay vị trí đắc địa phường Bình Chiểu.Nằm ngay đường Ngô Chí Quốc mở rộng 40m.** Đã có sổ hồng riêng từng nền, xây dựng tự do.** Diện tích đa dạng từ 54m2 đến 100m2.Tiện ích xung quanh:- Đầy đủ cơ sở hạ tầng: Đường sá, điện, nước.- Gần khu dân ...Loại tin:Mua bán nhà đấtGiá:239000000Diện tích:70Quận/Huyện:Thủ Đức, TPHCMĐăng lúc:18/02 07:38
Vị trí đường Ngô Chí Quốc, phía sau chợ Đầu Mối, cách ngã tư Gò Dưa 1km Diện tích đa dạng 70 m2 giá 239tr/70m2 ** Tiện ích & cơ sở hạ tầng + Mặt tiền đường 40m+ Giáp ranh Chợ đầu mối Nông sản Thủ Đức+ Cách chợ đêm Linh Trung 100m +cách bệnh viện Hạnh Phúc 2km+ Ngay chợ Đồng An ,tiện kinh doanh, xây nhà trọ+ Dân cư sầm ...Loại tin:Mua bán nhà đấtGiá:239000000Diện tích:70Quận/Huyện:Thủ Đức, TPHCMĐăng lúc:18/02 00:57
- Đất dự án giá chỉ 239r/nền hạ tầng hoàn thiện,điện âm nước máy,xd tự do,ck 5%. Call 0916303039( loan)
Đường Tỉnh Lộ 43 lộ giới dự kiến 60m, phường Bình Chiểu, quận Thủ Đức đất rẻ (sổ hồng riêng từng nền 100%). Đất nằm ngay khu dân cư đông đúc được trải bê tông, an ninh, gần chợ, gần siêu thị, gần các trường cấp 1, 2 và 3 - chỉ mất 10 phút đi vào các quận trung tâm thành phố. Cách nut giao thông gò dưa 2.5km rất thuận tiện đi các ...Loại tin:Mua bán nhà đấtGiá:239000Diện tích:70Quận/Huyện:Thủ Đức, TPHCMĐăng lúc:17/02 22:19
Thông tin mô tả.**Dự án đất nền thuộc khu dân cư Văn Hóa - Bình Chiểu.** Tọa lạc ngay vị trí đắc địa phường Bình Chiểu.Nằm ngay đường Ngô Chí Quốc mở rộng 40m.** Đã có sổ hồng riêng từng nền, xây dựng tự do.** Diện tích đa dạng từ 54m2 đến 100m2.Tiện ích xung quanh:- Đầy đủ cơ sở hạ tầng: Đường sá, điện, nước.- Gần khu dân ...Loại tin:Mua bán nhà đấtGiá:239000000Diện tích:70Quận/Huyện:Thủ Đức, TPHCMĐăng lúc:17/02 15:38
Tọa lạc ngay vị trí được thừa hưởng tất cả những tiện ích hiện hữu của của hệ thống hạ tầng kinh tế - xã hội ổn định trong khu vực, bao gồm chợ Thủ Đức, siêu thị Coop Mart, bệnh viện Đa khoa Thủ Đức, Đại học Quốc gia TP.HCM và trung tâm Thể dục Thể thao Quốc gia II... là cơ hội lí tưởng cho phép bạn tiếp cận đầy đủ các ...Loại tin:Mua bán nhà đấtGiá:2200000Diện tích:94Quận/Huyện:Thủ Đức, TPHCMĐăng lúc:15/02 15:19
- Vị trí: HXH 4m đường 23, P.Hiệp Bình Chánh, Q. Thủ Đức, Tp.HCM - Khu dân cư đông đúc, gần chợ, trường học, lưu thông đi các quận trung tâm thuận tiện, xung quanh đầy đủ các tiện ích, thích hợp xây nhà ở. - Hiện trạng: đất trống - Diện tích: 4 x 21 = 84m2 (SHR) - Cơ sở hạ tầng hoàn chỉnh, đường trước đất 4m. - Giá: 2.65 tỷ - Liên hệ: ...Loại tin:Mua bán nhà đấtGiá:2650000000Diện tích:84Quận/Huyện:Thủ Đức, TPHCMĐăng lúc:13/02 15:57
- Vị trí: đường 23, P.Hiệp Bình Chánh, Q. Thủ Đức, Tp.HCM - Khu dân cư đông đúc, gần chợ, trường học, lưu thông đi các quận trung tâm thuận tiện, xung quanh đầy đủ các tiện ích, thích hợp xây nhà ở, nghỉ dưỡng - Hiện trạng: đất trống - Diện tích: 8 x 15 = 120m2 - Cơ sở hạ tầng hoàn chỉnh, đường trước đất 8m. - Giá: 4.5 tỷ - Liên ...Loại tin:Mua bán nhà đấtGiá:4500000000Diện tích:120Quận/Huyện:Thủ Đức, TPHCMĐăng lúc:13/02 15:38
Tags (từ khóa) tin rao
Rao vặt nhà đất 24h mới nhất
- Mở bán căn hộ 35 Lê Văn Thiêm trực tiếp từ phòng KD CĐT 0977657997
- bán đất nền dự án Royal Park _ huế
- Chỉ 300tr là có nhà ở
- Cách mạng Tháng 8 Quận 10
- Bán nhà Kim Giang 65 m2x6t, mt 5.3m, 6.5 tỷ, ô tô đỗ cửa, kd.
- CĂN HỘ OFFICETEL ĐẦU TIÊN NGAY NGUYỄN LƯƠNG BẰNG PMH Q7 CHỈ 1,5 TỶ-CK 2%-CAM KẾT LỢI NHUẬN 8%/NĂM-LH 0901476788
- CHO THUÊ NHÀ MẶT TIỀN UNG VĂN KHIÊM, PHƯỜNG 25, QUẬN BÌNH THẠNH, LẦU SUỐT, TIỆN KD, MỞ VP CTY
- Đất gần trung tâm TP Huế giá 450 triệu /105m2
- Đất ven hồ sinh thái,nguyễn văn bứa hóc môn 299tr/nền
- Cần bán lô đất Trần Đại Nghĩa, P8, Đà Lạt diện tích lớn, kinh doanh tốt
- Căn hộ số 1, số 12 tòa B Kim Văn Kim Lũ Vinaconex 2 65 m2 giá từ 1.5 tỷ
- bán căn hộ giá rẻ
- Cần Bán Căn Hộ Mặt Tiền Kinh Dương Vương Giá 1 Tỷ Chiết Khấu Cao CDT Hưng Thịnh
- Bán đất phân lô Tây Mỗ, diện tích 36m2, oto đỗ cách 5m, Giá 27 tr/m2. LH 0961293692
- BÁN BIỆT THỰ RẺ NHẤT Ở SÂN GÔN FLC HẠ LONG, SUẤT NGOẠI GIAO L/H 0961048336
Mua bán nhà đất
Nhà đất theo tỉnh/thành phố
- Hà Nội
- Hải Phòng
- Bắc Ninh
- Vĩnh Phúc
- Đà Nẵng
- TPHCM
- Bình Dương
- Huế
- TP Vinh
- Nam Định
- Ninh Bình
- Phú Thọ
- Quảng Ninh
- Thái Bình
- Thái Nguyên
- Đồng Nai
- Cần Thơ
- Tiền Giang
- Trà Vinh
- Vĩnh Long
- Quảng Trị
- Quảng Ngãi
- Quảng Nam
- Quảng Bình
- Phú Yên
- Tây Ninh
- Sóc Trăng
- Cà Mau
- Đồng Tháp
- Bến Tre
- Hậu Giang
- Kiên Giang
- Bạc Liêu
- Bà Rịa - Vũng Tàu
- An Giang
- Long An
- Ninh Thuận
- Nghệ An
- Lâm Đồng
- Hà Nam
- Lào Cai
- Lạng Sơn
- Lai Châu
- Hưng Yên
- Hoà Bình
- Hải Dương
- Hà Giang
- Điện Biên
- Cao Bằng
- Bắc Giang
- Sơn La
- Thanh Hoá
- Kontum
- Khánh Hoà
- Hà Tĩnh
- Gia Lai
- Đắk Nông
- Đắk Lắk
- Bình Thuận
- Bình Phước
- Bình Định
- Yên Bái
- Tuyên Quang
- Bắc Cạn
- Xem thêm
Nhà đất theo quận/huyện
Chia sẻ bạn bè
Đăng ký nhận tin rao qua email
Tags nhà đất 24h
Tin rao dự án HOT
- Premier Residences Phú Quốc
- Premier Village Phú Quốc
- Vinhomes Gardenia Mỹ Đình
- Vinpearl Condotel Nha Trang
- Vinpearl Paradise Villas Phú Quốc
Liên kết website
- Vinhomes Gardenia Mỹ Đình
- Vinhomes Gardenia Mỹ Đình
- Vinhomes Gardenia - Tag
- Vinpearl Condotel Nha Trang
- Condotel Nha Trang Vinpearl
- Vinpearl Condotel Nha Trang
- Vinpearl Condotel Nha Trang
- Vinhomes Gardenia Mỹ Đình
- kết quả bóng đá euro 2016
- lịch thi đấu euro 2016
- Premier Residences Phú Quốc
- Premier Village Phú Quốc
- Premier Residences Phú Quốc - Tag
- Premier Village Phú Quốc - Tag
- Vinpearl Condotel Nha Trang - Tag
- Vinhomes Gardenia Mỹ Đình - Tag
- Giá biệt thự Premier Village Phu Quoc Resort
- Căn hộ nghỉ dưỡng Premier Residences Phú Quốc hút hàng ngày ra mắt
- Cẩm nang đầu tư Premier Village Phú Quốc

markdown:
Hướng: Tây Bắc.
Diện tích: 51m2.
Giá: 918 000 000.
Tiện ích: Gần trường học, trung tâm thương mại, siêu thị, ngân hàng, gần chợ, dân cư hiện hữu văn minh, lối sống lành mạnh, giao thông thuận tiện, đường rộng 6m ôtô ra vào thoải mái, gần khu biệt thự Jamona Sacomreal, gần quỹ đất giáo dục
[, thích hơp ở, kinh doanh, đầu tư….](/hiep-binh-phuoc) **Hiệp Bình Phước**
Sổ hồng riêng công chứng sang tên ngay.
Ngân hàng hỗ trợ 70% giá trị lô đất.
Hỗ trợ xin phép xây dựng.
Xây dựng tự do.
LH 0909.27.06.27


text:
Vị trí:
Ngay khu dân cư hiện hữu, dân trí cao, liền kề đường cao tốc Long Thành - Dầu Giây, Đường Nguyễn Duy Trinh, Đường Vành đai 2, cách trung tâm quận 1 20 phút, TT.Phú Mỹ Hưng, Quận 7, 25 phút.
Pháp lý:
- Sổ đỏ từng lô
- Xây dựng tự do
- Hỗ trợ giấy phép xây dựng
- Hạ tầng hoàn thiện
- Đường vào 8m
Tiện ích:
- Gần chợ Phú Hữu, trường THCS Long Trường, THCS Phú Hữu, Tiểu học Phú Hữu, Mẫu giáo Ánh Sao, Bệnh viện, UBND Phường Phú Hữu, BV Pháp Việt, Chợ Bến Thành (tất cả tiện ích đang hiện hữu, bạn có thể dễ dàng di chuyển trong vòng bán kính từ 1 đến 1,5km - tương đướng 5-10 phút).
- Số lượng lô đất có hạn và hiện tại có 90% giao dịch đã hoàn thành.
- Chỉ còn 4 lô cuối cùng (ngày 09/09/2014)
Quý khách hàng quan tâm vui lòng liên hệ đường dây nóng chủ đầu tư
Hotline: 0908 63 23 91 (Kim Thu)
Email: kimthudiep@gmail.com
Hân hạnh được phục vụ quý khách.

markdown:
Vị trí:
Ngay khu dân cư hiện hữu, dân trí cao, liền kề đường cao tốc Long Thành - Dầu Giây, Đường Nguyễn Duy Trinh, Đường Vành đai 2, cách trung tâm quận 1 20 phút, TT.Phú Mỹ Hưng, Quận 7, 25 phút.
Pháp lý:
-
**Sổ đỏ** từng lô
- Xây dựng tự do
- Hỗ trợ giấy phép xây dựng
- Hạ tầng hoàn thiện
- Đường vào 8m
Tiện ích:
- Gần chợ Phú Hữu, trường THCS Long Trường, THCS Phú Hữu, Tiểu học Phú Hữu, Mẫu giáo Ánh Sao, Bệnh viện, UBND Phường Phú Hữu, BV Pháp Việt, Chợ Bến Thành (tất cả tiện ích đang hiện hữu, bạn có thể dễ dàng di chuyển trong vòng bán kính từ 1 đến 1,5km - tương đướng 5-10 phút).
- Số lượng lô đất có hạn và hiện tại có 90% giao dịch đã hoàn thành.
- Chỉ còn 4 lô cuối cùng (ngày 09/09/2014)
Quý khách hàng quan tâm vui lòng liên hệ đường dây nóng chủ đầu tư
Hotline:
**0908 63 23 91 (Kim Thu)**
Email:
**kimthudiep@gmail.com**
Hân hạnh được phục vụ quý khách.