text:
Khảo sát hoạt tính và tinh sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki trên môi trường bán rắn
biotechvn
Số bài viết:
447
Số tài liệu đã gửi:
288
Ngày đăng:
21-06-2012
Ngày cập nhật:
27-11-2012 | 06:16:21
Thể loại:
Luận văn - Luận án
Chuyên ngành:
Công nghệ vi sinh
Số lần xem:
5 973
Số bình luận:
0
Ngôn ngữ tập tin:
Tiếng Việt
Bạn phải Đăng nhập để tải tập tin
Hình thức chia sẻ:
Đường dẫn
Mô tả tài liệu:
Nhân tố quan trọng có tác dụng thúc đẩy cho sự phát triển của nền công nghiệp
sản xuất enzyme đó là khả năng to lớn của vi sinh vật - những nhà máy chế tạo
enzyme. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh do đó có khả năng tạo ra
một lượng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme do chúng
tạo ra có hoạt lực cao và chúng ta có thể tận dụng các phế thải của ngành khác để làm
môi trường nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme.
Protease là một trong những nhóm enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và
phổ biến trong đời sống. Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học…Hoạt tính của
enzyme nói chung và của protease nói riêng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Điều
kiện tối thích để mỗi loại enzyme hoạt động là khác nhau. Do đó, để sử dụng enzyme
hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu cho hoạt động của enzyme đó.
Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính protease và tìm hiểu về kĩ thuật sắc ký lọc gel dùng
trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài :“Khảo sát hoạt tính và tinh
sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus
kawasaki trên môi trường bán rắn”.
Aspergillus oryzae từ lâu đã được dùng như là nguồn vi sinh vật được nuôi
cấy để thu nhận enzyme protease. Tuy nhiên, đối với Aspergillus kawasaki thì người ta
chỉ biết đến như là nguồn vi sinh vật để thu nhận amylase. Do đó, qua đề tài, chúng ta
có thể đánh giá được hiệu quả sử dụng protease của chủng Aspergillus kawasaki.
PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Khái quát chung về enzyme
2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme
Từ trước thế kỷ 17, khi loài người hoàn toàn chưa hiểu biết gì về ezyme,
người ta đã biết sử dụng rộng rãi các quá trình enzyme trong hoạt động thực tế như
làm bánh mì, làm bia, rượu,…Việc ứng dụng enzyme trong giai đoạn này hoàn toàn có
tính chất kinh nghiệm thuần túy và sử dụng enzyme thông qua hoạt động sống của tế
bào vi sinh vật.
Ngay từ thế kỷ 17, các nhà khoa học đã quen dùng từ “ferment” do nhà khoa
học người Hà Lan Van Heltmon đề xướng. Theo nghĩa tiếng La Tinh thì “fermentatio”
nghĩa là sự lên men, đó cũng là nguồn gốc của từ “ferment”. Theo ý kiến của ông, yếu
tố tham gia tích cực vào quá trình lên men rượu là “ferment”. Yếu tố đó là gì thì còn là
điều bí ẩn. Các nhà khoa học đã không vừa lòng với hiểu biết này và đã đi sâu vào
thực nghiệm, quan sát, mô tả.
Đến nửa cuối thế kỷ 18 bắt đầu có những thí nghiệm đầu tiên thô sơ và đơn
giản chứng minh tác dụng của men tiêu hóa được nhà tự nhiên học người Pháp
Réaunur tiến hành vào năm 1713 và được Spallanzani người Ý khẳng định lại một
cách chặt chẽ hơn vào năm 1783 với tác dụng của dịch dạ dày phân hủy thịt.
Năm 1814, viện sĩ viện hàn lâm khoa học Petecbua là Kirchov người Nga
làm thí nghiệm chứng minh nước chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển
hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ 40 – 60C .
Năm 1817 hai nhà khoa học Manaxenia (Nga) và Buchner (Đức) đã làm thí
nghiệm thành công quá trình lên men bằng chất dịch vô bào từ nấm men. Nhà sinh lý
học thực vật K.Tinniriazev đã viết “Không còn nghi ngờ gì nữa, lần đầu tiên người ta
đã chứng minh được rằng hiện tượng lên men chung quy chỉ là một quá trình hóa học,
nó có thể dễ dàng lập lại ngoài cơ thể sống nhờ những enzyme hòa tan chiết xuất từ
những tế bào đã bị phá hủy cấu trúc”.
Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là A.Payen và J.Person thu nhận
được chế phẩm enzyme amylase ở dạng kết tủa bằng cách thêm cồn vào dịch chiết từ
hạt lúa nảy mầm. Kết tủa này có khả năng phân giải tinh bột thành đường và được gọi
là diastase. Đây là thực nghiệm đặt nền móng cho các tiến bộ trong lĩnh vực enzyme
vào nửa sau thế kỷ 19.
Năm 1835, Berzelius lần đầu tiên đã đề ra khả năng giải thích tác dụng của
enzyme trên cơ sở hóa học. Ông gọi hiện tượng làm tăng quá trình phản ứng là sự xúc
tác và chất gây ra hiện tượng này là chất xúc tác.
Năm 1856, Pasteur đã tiến hành nghiên cứu bản chất của quá trình lên men
rượu. Theo ông, chính nấm men hay vi khuẩn lên men mà ta nhìn thấy dưới kính hiển
vi là nguyên nhân gây ra hiện tượng lên men rượu . Ông cho rằng chỉ có nấm men hay
vi khuẩn còn sống mới có thể thực hiện quá trình lên men. Từ đó dẫn đến hai khái
niệm mâu thuẫn nhau : men hữu hình (ferment hữu hình ) và men không nhìn được
(ferment hòa tan).
Năm 1862, nhà khoa học người Nga Danilevxki đã sử dụng một kỹ thuật đặc
biệt để tách chiết trypsine ra khỏi hỗn hợp với amylase trong dịch tụy bằng kỹ thuật
“phương pháp hấp thụ chọn lọc enzyme” (tức là gắn enzyme lên bề mặt chất đỡ) và
“phản hấp thụ” (nghĩa là giải phóng enzyme ra khỏi bề mặt chất đỡ) rồi kết tinh. Hiện
nay chúng ta gọi đó là một dạng của “kỹ thuật sắc ký ”.
Năm 1894, nhà khoa học người Pháp G.Bertrand phát hiện ra một loại enzyme
mới là enzyme oxy hóa với việc phát hiện ra enzyme lacasae trong nhựa mủ cây sơn ta
Rhus succedanea.
Từ những thành tựu ban đầu đó, enzyme bắt đầu được chú ý nghiên cứu nhiều
hơn vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20. Liên tiếp trong những năm 1930, 1931 hai nhà
khoa học D.Northop và M.Kunitz đã tách được pepsine và trypsine dưới dạng tinh thể.
(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
Năm 1913, hai nhà khoa học L.Michalis và Menten đã nghiên cứu cơ chế xúc
tác nhờ enzyme có sử dụng chất đồng vị, sử dụng phương pháp quang học và phương
pháp hóa học nghiên cứu các nhóm hoạt động của enzyme đã đem lại cho chúng ta
“phương trình Michalis-Menten” nổi tiếng trong nghiên cứu động học của enzyme.
(Nguyễn Hữu Chấn, 1984).
Hiện nay enzyme đã trở thành một ngành khoa học mũi nhọn phát triển rất
nhanh trên thế giới phân nhánh rất nhiều và liên quan chặt chẽ tới các ngành như hóa
lý, hóa sinh, vi khuẩn, vi sinh học, sinh lý, y học,…Hàng năm trên thế giới xuất bản
hàng chục nghìn công trình nghiên cứu về cơ chế tác dụng của enzyme, các phương
pháp tách chiết và tinh chế, sự điều hòa về rối loạn hoạt động của cơ thể ở trạng thái
sinh lý và bệnh lý.
2.1.2 Định nghĩa về enzyme
Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có hoạt tính xúc tác sinh học, do
tế bào sống tiết ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau
phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác. (Nguyễn Tiến Thắng, 2004)
Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể
sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với
tốc độ nhịp nhàng, có trật tự, theo những chiều hướng xác định. Pavlôv đã nói : “Hoạt
động đầu tiên của enzyme là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống. Không có sự sống
nào lại không có quá trình enzyme”. Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa của
Anghen : “Sự sống, đó là phương thức tồn tại của thể protein”. (Lê Ngọc Tú và ctv,
1982).
Enzyme có trong mọi tế bào, mọi mô của mọi sinh vật nhưng mỗi loại mô, mỗi
loại tế bào thường có những hệ thống enzyme đặc biệt. Các enzyme không chỉ tham
gia xúc tác các phản ứng sinh học trong cơ thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng
ngoài tế bào (in vitro). (Nguyễn Hữu Chấn, 1984).
Enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp
suất thấp và nhiệt độ bình thường của cơ thể. Trong khi đó các chất xúc tác hóa học
cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Hơn nữa, các enzyme có khả năng chọn
lựa cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng.
(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
Các loại enzyme trong cơ thể được tổng hợp, hoạt động một cách rất hài hòa để
sao cho các chất ban đầu được chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng thành một mắt
xích hoàn chỉnh. Sự trục trặc nào đó ở một trong toàn bộ mắt xích này sẽ làm rối loạn
cho cả hệ thống. Trong khi đó điều khiển tổng hợp và hoạt động của enzyme lại do
gen. Mỗi một gen chịu trách nhiệm điều khiển tổng hợp một enzyme. (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh học có thể tóm tắt
như sau :
Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng
sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất.
Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển
hóa rất cao.
Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản
ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.
Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít.
Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lượng
enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy
ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi
enzyme.
Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Ngày nay các nhà khoa
học đã tìm ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này
là rất nhỏ so với số lượng có thật trong mỗi tế bào. Trong hơn 1000 loại enzyme đã
biết, loài người mới thu nhận và kết tinh được khoảng 200 loại. (Nguyễn Đức Lượng,
2002).
2.1.3 Phân loại enzyme
Khi số lượng enzyme được phát hiện còn ít, người ta đặt tên enzyme theo ý
thích từng người tìm ra nó. Dần dần theo thời gian, số lượng enzyme tìm ra ngày càng
nhiều nên cần có một hệ thống phân loại theo quy ước quốc tế. Enzyme được phân loại
theo tính chất của nó, được xếp vào từng nhóm nhỏ tương ứng với các enzyme có bản
chất tương tự nhau, làm cho việc tìm hiểu và nghiên cứu trở nên dễ dàng hơn.
Theo quy ước quốc tế, tên gọi của enzyme thường được đặt theo cơ chất đặc
hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó, tên enzyme
thường có hai phần. Phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân các phản
ứng. Tuy nhiên, có nhiều enzyme theo thói quen vẫn được gọi theo tên cũ, không theo
hệ thống như trypsine, pepsine.
Năm 1930, Hiệp Hội Hóa Sinh Quốc Tế (IOB) đã thống nhất phân loại enzyme
ra làm 6 lớp và được đánh số thứ tự từ một đến sáu. Các số thứ tự này là cố định cho
mỗi lớp. Mỗi lớp lại chia làm nhiều tổ, mỗi tổ có nhiều nhóm. Chính vì thế theo hệ
thống phân loại, mỗi enzyme thường có bốn số : số thứ tự một chỉ lớp, số thứ tự hai
chỉ tổ, số thứ ba chỉ nhóm, số thứ tư chỉ enzyme. Tên của các lớp, tổ và nhóm như sau
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme
Hoạt tính xúc tác của enzyme là do cấu trúc không gian ba chiều của các
phân tử protein quyết định. Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, gấp hàng trăm,
hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác.
Tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau
như nồng độ enzyme, bản chất và nồng độ của các chất phản ứng (cơ chất), nhiệt độ,
pH môi trường, nồng độ ion trong môi trường, nồng độ các chất kìm hãm, các chất
hoạt hóa enzyme. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh huởng đến vận tốc phản ứng enzyme.
a) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc bậc nhất vào nồng
độ enzyme. Đường biểu diễn có dạng như ở hình 2.1
b) Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ enzyme được giữ cố định và
nồng độ cơ chất thay đổi, người ta nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi nồng độ cơ
chất tăng. Khi nồng độ cơ chất tiếp tục gia tăng, đường biểu diễn uốn cong và với
nồng độ cơ chất cao thì vận tốc không còn gia tăng nữa và đường biểu diễn tiệm cận
với giá trị vmax.
c) Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng
enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng
chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ
giảm và dẫn đến mức triệt tiêu.
Nếu đưa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị
giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính.
Ngược lại, ở nhiệt độ 0C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi
đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức tối ưu.
Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), người ta
thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tương ứng với hai hiện tượng khác nhau :
Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 400
C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng.
Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng.
Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme, ở vào khoảng 450C),
vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80
– 100C.
Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ
chất, pH, lực ion của môi trường.
d) Ảnh hưởng của pH
Sự thay đổi pH gây nên :
Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptid của
enzyme, do đó làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ
chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptid của enzyme.
Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn
cản sự tạo thành enzyme – cơ chất trong trường hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất phải ở
dưới dạng ion.
Như vậy, hoạt tính của enzyme phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trường. Đó là vì
pH môi trường có ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và trung tâm
hoạt động của nó, phức chất enzyme – cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của enzyme.
Người ta có thể xác định một giới hạn pH tối ưu cho hoạt động của một
enzyme. Ngoài pH tối ưu, vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng. Điều này cho thấy
tầm quan trọng của môi trường phản ứng trong quá trình nghiên cứu các phản ứng
enzyme in vitro.
Mỗi một enzyme có một pH tối ưu khác nhau, có thể rất acid (từ 1,5 -2),
hoặc rất kiềm (9,5 – 10). pH tối ưu của đa số các enzyme vào khoảng chung quanh giá
trị trung tính (6 – 8). Tuy nhiên pH tối ưu của một enzyme cũng không cố định mà phụ
thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như bản chất và nồng độ cơ chất, tính chất dung dịch
đệm, nhiệt độ.
2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống
2.1.5.1 Nguồn thu nhận
Enzyme được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : động vật (pepsin từ dạ
dày, trypsin từ tụy tạng…), từ thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ
thơm…). Tuy nhiên không thể dùng hai nguồn này làm nguyên liệu để sản xuất với
quy mô công nghiệp lớn các chế phẩm enzyme nhằm thỏa mãn các nhu cầu của nền
kinh tế quốc dân. Như vậy trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu
vi sinh vật (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn. Enzyme thu
nhận từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa các
enzyme từ động vật và thực vật :
Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với một lượng
lớn và có thể mở rộng để sản xuất tới phạm vi cần thiết, đồng thời việc thu chế phẩm
cũng dễ dàng và có thể thỏa mãn trong một mức độ lớn nhu cầu của các ngành công
nghiệp khác nhau.
Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Do đó vi sinh vật có thể đồng
hóa bất kỳ chất nào trong thiên nhiên. Trong khi đó có nhiều chất mà thực vật và động
vật không thể đồng hóa được.
Enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác.
Do vậy chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất.
Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ,
kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quá trình sản xuất
chế phẩm enzyme khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao.
Phần lớn thức ăn để nuôi cấy vi sinh vật dễ kiếm và rẻ tiền. Đa số vi sinh
vật cho enzyme thường có khả năng phát triển trên môi trường đơn giản, rẻ tiền như
các phụ phế liệu, phế phẩm của các nghành sản xuất.
ưu việt lớn của sự thu enzym từ vi sinh vật là có khả năng tăng cường
sinh tổng hợp các enzym nhờ chọn giống khi tạo được những biến chủng có hoạt lực
cao. Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động môi trường, có khả năng thích ứng với
nguồn dinh dưỡng. Vì vậy, khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác động
lên chúng bằng các tác nhân khác nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzym cũng như
hoạt tính của chúng và tăng tối đa sự sinh tổng hợp các enzym trong vi sinh vật nuôi
cấy. Điều đó cho phép ta có thể tạo được những enzym theo ý muốn, dễ dàng thu nhận
được enzym có độ thuần khiết cao.
2.1.5.2 Vai trò
Cùng với những thành tựu đạt được trong nghiên cứu lí thuyết về enzym, các
nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tế ngày càng được mở rộng và đạt hiệu quả
cao. Các chế phẩm enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như
trong hoá phân tích để định tính, định lượng các chất trong nông nghiệp, y học, công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược liệu, công nghiệp nhẹ như công nghiệp dệt, công
nghiệp da.
Trong y học có thể sử dụng enzym tinh chế để chữa bệnh, sản xuất các
sinh tố và các chất kháng sinh.
Sử dụng chế phẩm enzym trong nông nghiệp để chế biến các sản phẩm
nông nghiệp sản xuất thức ăn cho động vật đặc biệt là động vật còn non, xử lý hạt
trước khi gieo.
Trong công nghiệp thực phẩm, chế phẩm enzym được sử dụng khá rộng
rãi trong nhiều ngành chế biến khác nhau : chế biến thịt, cá, sữa, công nghiệp sản xuất
bánh mì và các thứ bánh kẹo khác. Sử dụng chế phẩm enzym thường làm tăng nhanh
quá trình chế biến, tăng hương vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Ngoài ra, sử
dụng enzym còn có thể tái tạo hương vị của các loại rau quả tươi sau khi chế biến.
Ngày nay, người ta cũng đã đạt được nhiều kết quả trong việc sử dụng một số enzyme
trong bảo quản đồ hộp và một số nguyên liệu khác.
2.2 Khái quát chung về enzyme protease
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân
liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do,
một ít peptid ngắn, pepton.
2.2.2 Lược sử phát triển các enzyme protease
2.2.2.1 Protease từ động vật
Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn
cả.
Từ thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp là Reaunur đã làm thí nghiệm
rất đơn giản và đã phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu
hóa thịt.
Năm 1836, Schwam đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch
vị. Tuy nhiên, mãi đến hơn 30 năm sau người ta mới tách được enzyme này.
Năm 1857, Corvisart tách được trypsine từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên
thu nhận được ở dạng chế phẩm, trong chế phẩm vẫn còn lẫn nhiều protein khác.
Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp phụ trên colondion đã tách
được trypsine với amylase tụy tạng. Phương pháp này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên
cứu tinh chế enzyme và protein.
Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm chymotrypsine (renin).
Ngoài những enzyme của hệ tiêu hóa, các nhà khoa học cũng có những
nghiên cứu đầu tiên về protease trong máu. Schidt đã nêu giả thiết rằng trong máu có
enzyme fibrin (ngày nay gọi là trombin) tham gia trong quá trình đông máu. Ông đã
tiến hành việc tách chiết enzyme này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm nhận được có tác
dụng làm cho dung dịch fibrinogen đông lại nhanh chóng.
2.2.2.2 Các protease từ thực vật
So với các protease từ động vật, các protease từ thực vật được phát hiện
muộn hơn.
Năm 1874, Group – Besanez công bố đã nhận được protease từ hạt của một
loại đậu. Họ cũng nhận thấy dịch chiết từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có hoạt động
phân giải protein. Ý kiến này dựa trên cơ sở thực nghiệm là sau khi cho dịch chiết từ
các nguyên liệu trên tác dụng với fibrin, nuớc lọc của hỗn hợp cho phản ứng màu
Biure.
Bằng chứng này không thật sự vững chắc nên Group – Besanez không tiếp
tục nghiên cứu. Vì vậy Wurtz được xem như là người đầu tiên tách chiết thành công
protease từ thực vật (1879). Ông nêu lên rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có
chứa protease, khi dùng cồn để kết tủa sẽ thu nhận được một chế phẩm enzyme không
tinh khiết (100g/1 cây) gọi là papain.
2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật
Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950,
mặc dầu từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein
của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay, số công trình nghiên cứu protease vi vinh vật
tăng lên đáng kể, nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease của động vật và thực
vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp
phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế.
Trong thời gian gần đây người ta cũng đã có những phương pháp thích hợp
để nhận chế phẩm không tan của protesae. Kết quả này mở ra triển vọng to lớn trong
nghiên cứu và các ứng dụng của các protease.
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease
Các enzyme protesae như đã nói ở trên được thu nhận từ nhiều nguồn khác
nhau.
2.2.3.1 Từ động vật
Protesae động vật thường có ở tụy tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ
dày…
Pancreatin gồm : Trysin, chymotrypsin và một enzyme khác có ở tụy tạng,
chúng được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tụy.
Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị.
Renin chỉ có ở ngăn thứ tư ở dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi, là enzyme
đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất fromage.
2.2.3.2 Từ thực vật
Enzyme protease từ thực vật có ở các thanh phần khác nhau của cây như
thân, lá và đặc biệt có nhiều ở quả .
Ví dụ:
Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh
Bromelin có trong thân cây thơm xanh và quả thơm xanh.
Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả.
2.2.3.3 Từ vi sinh vật
Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này
có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi cấy
(protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn các
protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và
được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y
dược.
Có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy các protease của vi sinh vật có
nguồn gốc khác nhau thì cũng có những tính chất khác nhau về nhiều mặt. Căn cứ vào
cơ chế phản ứng, pH hoạt động tối ưu,…Hartley (1960) đã phân loại các protease vi
sinh vật thành 4 nhóm cơ bản như sau :
Protease serine
Protease kim loại (metallo protease)
Protease acid
Protease tiol
2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease
Các protease nói chung cũng như protease vi sinh vật nói riêng được sử dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Trong sản xuất nước chấm : Nước mắm, tương, chao,…
Trong công nghệ thực phẩm : Làm mềm thịt, tăng hương vị thịt sau khi
chế biến,…
Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,…
Trong công nghệ tơ tằm : Làm bóng và tách rời các sợi tơ.
Trong hương mỹ phẩm : Người ta trộn một lượng nhỏ protease vào kem
xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ
dàng lớp tế bào già.
Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn. Đặc biệt ứng
dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải.
Trong công nghiệp sữa, các protease như renine, pepsine được dùng trong
sản xuất formate, sữa đông tụ.
Trong y học :
+ Protease được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật,
sản xuất huyết thanh miễn dịch.
+ Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh
mạch…
+ Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc
trưng.
+ Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những người bị
tiêu hóa kém…
Trong nông nghiệp : Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu
đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.
Trong kỹ nghệ phim ảnh : Protease từ vi khuẩn được dùng để tái sinh các
nguyên liệu như phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp
nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các
loại phim và giấy ảnh quý.
2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
2.3.1.1 Phân loại
2.3.1.2 Đặc điểm
Hình thái
Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển
rất mạnh (chiều ngang 5 – 7 m), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm
đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty.
Điều kiện phát triển :
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử : 45%.
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme : 55 - 58%.
Độ ẩm không khí : 85 -95%.
pH môi trường : 5,5 - 6,5.
Nhiệt độ nuôi cấy : 27 - 30C.
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt.
Để thu nhận chế phẩm protease từ vi sinh vật cũng như các enzyme khác có thể
dùng hai phương pháp nuôi cấy : phương pháp bề mặt và phương pháp bề sâu. Phương
pháp bề mặt thường dùng để nuôi cấy nấm mốc, phương pháp bề sâu thường dùng đối
với vi khuẩn.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật đã được
nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX. Lượng
enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với phương
pháp nuôi cấy chìm. Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những
nguyên liệu có nguồn gốc thực vật như cám mì, cám gạo, gạo, ngô…Khi nuôi cấy vi
sinh vật để thu nhận protease, người ta cho thêm bột đậu xanh hoặc bột đậu nành như
những cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của protease.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng
phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi
cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:
+ Nhiệt độ tăng rất chậm.
+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.
+ Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.
+ Khối môi trường còn rời rạc.
+ Enzym mới bắt đầu được hình thành.
Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt. Tuyệt đối
không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt.
Giai đoạn 2. Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ. Trong giai đoạn này
có những thay đổi cơ bản sau:
+ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển
rất mạnh. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi
trường, trong lòng môi trường.
+ Môi trường được kết lại khá chặt.
+ Độ ẩm môi trường giảm dần.
+ Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC.
+ Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của
nấm sợi.
+ Các loại enzym được hình thành và enzym nào có cơ chất cảm ứng trội
hơn sẽ được tạo ra nhiều hơn.
+ Lượng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai
đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng
29-30oC là tốt nhất.
Giai đoạn 3. Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có
một số thay đổi cơ bản như sau:
+ Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng
sẽ chậm lại.
+ Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí
môi trường xuống còn 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ. Nhiệt
độ nuôi duy trì ở 30C. Trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng
enzym sẽ giảm. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất
cần thiết.
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme. Chế phẩm này
được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn chứa
sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường). Người ta
thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm
enzyme thô không mất hoạt tính nhanh.
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử enzyme protease
2.5.1 Trích ly enzyme
Toàn bộ khối lượng chế phẩm enzyme thô đã sấy được đem đi nghiền nhỏ.
Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần
của chế phẩm thô. Khi thành tế bào bị phá vỡ, các enzyme ngoại bào và cả enzyme nội
bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào.
Các loại enzyme thủy phân hòa tan trong nước nên sau khi nghiền mịn, người
ta dùng nước, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, acetone).
Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này cho kết quả tốt và
dễ được dùng rộng rãi trong sản xuất. Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể
chiết được lượng enzyme trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất
không tan. Nước thường dùng khuyếch tán ở nhiệt độ 25 – 28C. (Lương Đức Phẩm,1998)
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly :
Tỷ lệ nước trích
Chế phẩm đã sấy khô cần nhiều nước để trích ly enzyme hơn chế phẩm
ẩm, tỷ lệ nước trên chế phẩm khác nhau sẽ trích được lượng enzyme khác nhau.
Lượng nước dùng để trích ly gấp từ 2 – 3,5 lần so với lượng chế phẩm nấm mốc.
Thời gian trích
Enzyme thủy phân dễ tan trong nước, thời gian trích ly càng lâu càng có
khả năng trích được nhiều enzyme hơn nhưng làm tăng lượng tạp chất trong dịch chiết
và giảm hoạt tính riêng của enzyme. Thời gian trích ly thích hợp khoảng 30 – 40 phút.
Nhiệt độ trích
Nhiệt độ trích ly càng tăng thì vận tốc trích ly càng tăng nhưng làm giảm
hoạt tính enzyme nên kéo theo giảm hoạt tính riêng của dịch enzyme. Nhiệt độ trích ly
tối thích là 20 – 30C.
Để tăng cường khả năng thu enzyme, chế phẩm được đánh tơi trước khi trích
để đạt được kích thước hạt 1 – 5 mm. Ngoài ra trong công nghiệp, thường dùng hệ
thống trích ly liên tục gồm nhiều thùng chứa chế phẩm nấm mốc, trong mỗi thùng sẽ
Sản phẩm enzyme
tinh khiết
trích được nhiều lần. Cách làm này giúp tăng hiệu suất thu enzyme, tăng chất khô và
hàm lượng enzyme trong dịch chiết thu được.
2.5.2 Quá trình tủa
Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô, vì trong đó còn chứa
nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Dung dịch enzyme thô
thường chứa một lượng enzyme không nhiều, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì
thế việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi những vật chất này.
Để làm được điều đó người ta phải tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác
nhân gây kết tủa. Tủa là phương pháp cô đặc enzyme hữu dụng và là bước ban đầu
trong tinh sạch enzyme. Bằng cách này người ta loại được một số protein tạp ở giai
đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme.
Nguyên tắc :
Enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung
môi.
Ở phân tử enzyme, các gốc ưa nước và kỵ nước thường nằm trên bề mặt.
Chúng quyết định mức độ hòa tan của enzyme ở những loại dung môi khác nhau.
Trong đó, các nhóm kỵ nước có xu hướng nằm trong lòng phân tử protein, một phần
không nhỏ nhóm này nằm trên bề mặt protein và có khả năng tiếp xúc với dung môi,
các nhóm này sẽ cùng với nhóm tích điện và các nhóm lưỡng cực khác có vai trò quyết
định đến tính chất enzyme.
Độ hòa tan của enzyme được coi là kết quả của tương tác lưỡng cực của chất
hòa tan với nước và tương tác ion của chúng với muối có trong dung dịch tạo thành
màng nước bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrate. Nếu loại bỏ các tương tác
này, các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau để tạo thành khối lớn, tách khỏi dung
dịch, thường gọi là tủa protein.
Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa, protein lại có
thể ở dạng tan (dung dịch keo) bền như trước thì được gọi là kết tủa thuận nghịch,
hoặc mất khả năng này gọi là kết tủa không thuận nghịch.
Những phản ứng kết tủa thuận nghịch protein
a) Kết tủa bằng muối
Khi cho thêm muối (amonium sulfate) vào dung dịch protein, các phân tử
muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nước khỏi protein,
do vậy các phân tử protein có khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại.
Khi cho một lượng muối đủ lớn vào thì protein sẽ bắt đầu tủa. Nếu quá trình
này thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính.
Sau đó thu protein bằng cách ly tâm và hòa tan vào dung dịch đệm có nồng độ muối
thấp.
Phương pháp này thường được sử dụng để tách chiết protein hòa tan. Nó
cũng được sử dụng để thu phân đoạn các protein khác nhau trong hỗn hợp, vì các phân
tử protein lớn có khuynh hướng kết tủa trước, các phân tử nhỏ hơn vẫn còn nằm trong
dung dịch. Vì thế chúng ta có thể tìm ra điều kiện mà có thể thu protein ta đang nghiên
cứu nhiều nhất trong hỗn hợp nhiều protein nhờ phân tích các đoạn ở nồng độ muối
khác nhau.
Như vậy với quá trình này ta có thể thu được protein mong muốn một cách
tinh sạch hơn.
b) Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một
trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung những phân tử dung môi
có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulfoxid) có thể ổn định các tương tác
giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của
protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (acetone,
ethanol) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường. Do đó độ hòa
tan của các phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do làm giảm hằng số điện môi
hiện hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan
trong nước (như acetone) vào dung dịch chứa protein.
Sự kết tủa bằng acetone hoặc ethanol 960
có nhiều thuận lợi do tương đối rẻ,
có sẵn dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzyme. Do
nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme
bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió.
Có thể xảy ra hiện tượng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung
môi hữu cơ. Nguyên nhân là do, khi hằng số điện môi giảm, phân tử protein có thể tự
tháo gỡ và trở thành dạng không hoạt động, trong khi đó các gốc kỵ nước lại tiếp xúc
với dung môi. Hiện tượng này xảy ra khi tiến hành tủa ở nhiệt độ phòng. Khi tiến hành
kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ, ta bắt
buộc phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme.
Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt dung môi hữu cơ thường
mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ.
Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 –
100
C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định
bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch
enzyme.
2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký
Sắc ký sinh học là phương pháp nhẹ nhàng để tinh sạch các phân tử sinh
học, đặc biệt là protein mà vẫn duy trì hoạt tính của chúng. Các kỹ thuật sắc ký tinh
sạch protein dựa vào các đặc tính vật lý của chúng.
Bảng 2.1 : Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính vật lý của protein
Đặc tính Kỹ thuật
Điện tích Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography)
Sự phân cực o Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography)
o Sắc ký giấy.
o Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography)
o Sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction
Chromatography – HIC)
Kích thước Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography)
Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của ligand)
Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography)
Hơn 40 năm qua kể từ khi việc đưa vào thị trường sản phẩm thương mại
SephadexTM, kỹ thuật sắc ký lọc gel đã đóng một vai trò quan trọng trong việc tinh
sạch enzyme, polysaccharide, nucleic acid, protein và các đại phân tử sinh học khác.
Nguyên tắc :
Lọc gel là phương pháp đơn giản nhất trong tất cả các loại sắc ký. Kỹ thuật
này dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng khác nhau bằng cách cho
chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel
sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển
bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp (thôi) ra khỏi cột sớm
hơn các phân tử nhỏ. Kỹ thuật này có thể áp dụng theo hai cách :
a) Phân tách nhóm (Group separations)
Các thành phần của một mẫu được phân tách thành hai nhóm chính theo
phạm vi kích thước. Sự phân tách nhóm được sử dụng để loại các phân tử lớn hay các
phân tử tạp chất nhỏ (như đỏ phenol khỏi dịch nuôi cấy) hoặc để loại muối hoặc trao
đổi đệm.
b) Phân đoạn các phân tử sinh học với độ phân giải cao (High resolution
fractionation of biomolecules)
Các thành phần của cùng một mẫu được phân tách theo sự khác biệt về kích
thước phân tử của chúng. Phân tách với độ phân giải cao có thể được dùng để cô lập
một hoặc nhiều thành phần, để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, để xác
định trọng lượng phân tử hoặc để phân tích sự phân bố theo trọng lượng phân tử.
ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel
a) ưu điểm
Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh
học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác
động (cofactor) và các điều kiện môi trường khắc nghiệt.
Sự phân tách có thể được thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các
cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cường độ
ion cao hoặc thấp, ở 370
C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí
nghiệm.
Kỹ thuật này cho phép thu lại lượng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và
dễ dàng khử muối.
b) Nhược điểm
- Chậm (tốc độ thấp = thời gian dài)
- Yêu cầu các cột có kích thước lớn tương đối so với lượng mẫu.
- Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, thường khó
đạt được sản phẩm tinh khiết hoàn toàn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thường được sử
dụng với những kỹ thuật khác nhau như sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ.
Một số thông số vật lý của phương pháp
Giới hạn tách (Exclusion Limit-EL) : Là khối lượng phân tử (MW) nhỏ nhất
không chui vào bên trong hạt gel, như vậy tất cả chúng sẽ bị thổi cùng một lượt ra khỏi
cột. Thí dụ G-50 có giới hạn tách 30.000 Da, có nghĩa là các phân tử lớn hơn 30.000
Da đều không chui vào hạt gel.
Phạm vi tách (Fraction Range-FR) : Thí dụ Sephadex G-50 có giới hạn tách
từ 1.500-30.000 Da, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ được
phân tách dễ dàng bởi Sephadex G-50.
Độ ngậm nước (Water Regain-WR) : Là trọng lượng nước mà 1g bột gel khô
hút nước. Thí dụ G-50 có WR là 5 0,3 g. Giá trị này chưa tính đến lượng nước bao
quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích cột.
Thể tích nền : Là thể tích cuối cùng mà 1g bột gel khô hấp thụ khi trương nở
trong nước. G-50 có thể tích nền 9-11 ml/g gel khô.
Hạt gel : hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thước hạt xác định bằng mesh
hoặc đường kính hạt theo m. Hạt có kích thước lớn (50-100 mesh, 100-300 m) cho
tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhưng kết quả tách thấp. Ngược lại những hạt mịn (400
mesh, 10-40 m) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thường
người ta chọn hạt gel có kích thước 100-200 mesh, 50-150 m.
Thể tích trống : Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột xác
định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Da.
Thể tích thổi : Là thể tích đệm cần thiết để rửa thổi chất cần tách ra khỏi cột.
Phân tách bằng sắc ký lọc gel
Để phân tách, môi trường lọc gel được nhồi trong cột để tạo nền nhồi. Môi
trường này là một chất nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, loại hạt này được chọn vì tính ổn
định về vật lý và hóa học của chúng, và tính trơ (thiếu các đặc tính hấp phụ và phản
ứng).
Nền nhồi được cân bằng bằng dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các lỗ
của chất nền và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong các lỗ đôi khi được
xem như phase tĩnh và chất lỏng này ở trạng thái cân bằng với chất lỏng bên ngoài các
hạt, được xem như phase động. Cần lưu ý rằng, mẫu được giải hấp một cách đồng nhất
(isocraticlly), nghĩa là không cần sử dụng các loại đệm khác nhau trong quá trình phân
tách. Tuy nhiên, bước rửa giải dùng loại đệm đang chạy thường bao gồm ở thời điểm
kết thúc của quá trình phân tách, làm cho việc loại bỏ bất kỳ loại phân tử nào còn lưu
trong cột được dễ dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp.
Quá trình lọc gel
1. Các hạt hình cầu của môi trường lọc gel được nhồi trong cột.
2. Mẫu được nạp vào cột.
3. Dung dịch đệm (phase động) và mẫu di chuyển qua cột. Các phân tử
khuếch tán trong và ngoài các lỗ của chất nền (cũng được miêu tả như quá trình phân
đoạn mẫu giữa phase động và phase tĩnh). Các phân tử nhỏ hơn di chuyển vào sâu
trong chất nền hơn và do đó lưu lại trong cột lâu hơn.
4. Khi dung dịch đệm di chuyển liên tục qua cột, các phân tử lớn hơn kích
thước lỗ gel không thể khuyếch tán vào trong các lỗ và di chuyển qua cột. Các phân tử
nhỏ hơn khuyếch tán vào trong lỗ gel và bị trì hoãn trong quá trình di chuyển xuống
dưới đáy cột.
5. Các phân tử lớn rời cột trước nhất sau đó là các phân tử nhỏ hơn theo trình
tự kích thước của chúng. Quá trình phân tách hoàn toàn xảy ra khi một lượng dung
môi bằng tổng thể tích cột (tương đương với thể tích nền nhồi) di chuyển qua môi
trường lọc gel.
2.5.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện di
SDS – PAGE
Sau khi qua các bước ly trích và tinh sạch, người ta thường kiểm tra lại độ tinh
sạch của protein nhờ kỹ thuật điện di. Nhờ kỹ thuật này ta còn có thể xác định trọng
lượng phân tử và độ tinh sạch của chúng.
Điện di trên gel là tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, protein) bằng cách
cho đi qua chất nền là gel trong một điện trường.
Kĩ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis) là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của
SDS.
Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử
acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa được xúc tác
bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS); N, N ,N’, N’ - tetramethylenediamine
(TEMED).
Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích thước
của lỗ gel.Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử
sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide :
nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích
thước lớn và ngược lại.
SDS là tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ
thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là
mercaptoethanol.Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2,3,4 được biến đổi
thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó,
sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những
phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi
đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử
tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển
về cực âm của điện trường.
Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một
thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác
nhau đã biết.
Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự
phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên
tục (discontinuous gel). Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp:
Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên) : các protein trong mẫu được dồn lại
và tạo một lớp băng mỏng.
Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới) : tạo ra các băng protein có
trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu.
Hai lớp gel này được phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide
và vị trí.
Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng
lượng phân tử từ 10.000-200.000 daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn
hơn 200.000 daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide hơn 2,5%.
MỤC LỤC
Bìa ..................................................................................................................................... i
Trang tựa .......................................................................................................................... ii vi
Lời cảm tạ ...................................................................................................................... iii
Tóm tắt khóa luận ........................................................................................................... iv
Mục lục ............................................................................................................................ v
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... viii
Danh sách các bảng ........................................................................................................ ix
Danh sách các hình và đồ thị .......................................................................................... xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Mục đích nghiên cứu ................................................................................................. 2
1.3 Yêu cầu ...................................................................................................................... 2
2.1 Khái quát chung về enzyme ...................................................................................... 3
2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme ........................................................... 3
2.1.2 Định nghĩa về enzyme ............................................................................................ 5
2.1.3 Phân loại enzyme .................................................................................................... 6
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme ........................ 7
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme ................................................................................................. 7
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme ......................................... 7
2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống .......................................... 9
2.1.5.1 Nguồn thu nhận ................................................................................................... 9
2.1.5.2 Vai trò ................................................................................................................ 11
2.2 Khái quát chung về enzyme protease ...................................................................... 11
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease ................................................................................ 11
2.2.2 Lược sử phát triển các enzyme protease .............................................................. 12
2.2.2.1 Protease từ động vật .......................................................................................... 12
2.2.2.2 Protease từ thực vật ........................................................................................... 12
2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật ........................................................................................ 13
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease......................................................................... 13
2.2.3.1 Từ động vật ........................................................................................................ 13
2.2.3.2 Từ thực vật ......................................................................................................... 13
2.2.3.3 Từ vi sinh vật ..................................................................................................... 14
2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease ............................................................................ 14
2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ...................................... 15
2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................... 15
2.3.1.1 Phân loại ........................................................................................................... 15
2.3.1.2 Đặc điểm ............................................................................................................ 15
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt ................................ 16
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử enzyme protease ................................. 18
2.5.1 Trích ly enzyme .................................................................................................... 19
2.5.2 Quá trình tủa ........................................................................................................ 20
2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký ....................................................... 22
2.5.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện di SDS –
PAGE ............................................................................................................................. 27
PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP ................................................................ 29
3.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................................. 29
3.2 Vật liệu .................................................................................................................... 29
3.2.1 Chế phẩm enzyme thô .......................................................................................... 29
3.2.2 Hóa chất ................................................................................................................ 29 vii
3.2.3 Thiết bị .................................................................................................................. 29
3.3 Phương pháp thí nghiệm .......................................................................................... 30
3.3.1 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 30
3.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme của dịch chiết enzyme
thô .................................................................................................................................. 30
3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ưu để tủa
enzyme protease ............................................................................................................ 36
3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của protease .... 37
3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel...................................... 37
3.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lượng phân tử enzyme bằng phương pháp điện
di SDS – PAGE ............................................................................................................. 41
3.4 Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 44
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.......................................................................... 45
4.1 Hàm lượng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô ................................................ 45
4.2 Nồng độ muối (NH4)2SO4 tối ưu cho việc tủa protease .......................................... 45
4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 46
4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 48
4.3 Tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa protease ..................................................................... 49
4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 49
4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 51
4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 960
và tủa bằng muối (NH4)2SO4 .................... 53
4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease...................... 54
4.5.1 pH tối ưu ............................................................................................................... 54
4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae ........................................................ 54
4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki .................................................... 54
4.5.2 Nhiệt độ tối ưu ...................................................................................................... 55
4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ..................................................................... 55
4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................ 56
4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel ................................................................................... 56
4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae ................................................................................... 57
4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki .............................................................................. 59
4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc
Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki ................................................................. 62
4.7.1 Tủa protease bằng muối ........................................................................................ 62
4.7.2 Tủa protease bằng cồn .......................................................................................... 62
4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phương pháp điện di trên gel SDS –
PAGE ............................................................................................................................. 63
PHẦN 5 : KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 67
5.1 Kết luận.................................................................................................................... 67
5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................................... 67
5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki ................................................................ 67
5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki .......................... 68
5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 69
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 70
sản xuất enzyme đó là khả năng to lớn của vi sinh vật - những nhà máy chế tạo
enzyme. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh do đó có khả năng tạo ra
một lượng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme do chúng
tạo ra có hoạt lực cao và chúng ta có thể tận dụng các phế thải của ngành khác để làm
môi trường nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme.
Protease là một trong những nhóm enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và
phổ biến trong đời sống. Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học…Hoạt tính của
enzyme nói chung và của protease nói riêng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Điều
kiện tối thích để mỗi loại enzyme hoạt động là khác nhau. Do đó, để sử dụng enzyme
hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu cho hoạt động của enzyme đó.
Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính protease và tìm hiểu về kĩ thuật sắc ký lọc gel dùng
trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài :“Khảo sát hoạt tính và tinh
sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus
kawasaki trên môi trường bán rắn”.
Aspergillus oryzae từ lâu đã được dùng như là nguồn vi sinh vật được nuôi
cấy để thu nhận enzyme protease. Tuy nhiên, đối với Aspergillus kawasaki thì người ta
chỉ biết đến như là nguồn vi sinh vật để thu nhận amylase. Do đó, qua đề tài, chúng ta
có thể đánh giá được hiệu quả sử dụng protease của chủng Aspergillus kawasaki.
PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Khái quát chung về enzyme
2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme
Từ trước thế kỷ 17, khi loài người hoàn toàn chưa hiểu biết gì về ezyme,
người ta đã biết sử dụng rộng rãi các quá trình enzyme trong hoạt động thực tế như
làm bánh mì, làm bia, rượu,…Việc ứng dụng enzyme trong giai đoạn này hoàn toàn có
tính chất kinh nghiệm thuần túy và sử dụng enzyme thông qua hoạt động sống của tế
bào vi sinh vật.
Ngay từ thế kỷ 17, các nhà khoa học đã quen dùng từ “ferment” do nhà khoa
học người Hà Lan Van Heltmon đề xướng. Theo nghĩa tiếng La Tinh thì “fermentatio”
nghĩa là sự lên men, đó cũng là nguồn gốc của từ “ferment”. Theo ý kiến của ông, yếu
tố tham gia tích cực vào quá trình lên men rượu là “ferment”. Yếu tố đó là gì thì còn là
điều bí ẩn. Các nhà khoa học đã không vừa lòng với hiểu biết này và đã đi sâu vào
thực nghiệm, quan sát, mô tả.
Đến nửa cuối thế kỷ 18 bắt đầu có những thí nghiệm đầu tiên thô sơ và đơn
giản chứng minh tác dụng của men tiêu hóa được nhà tự nhiên học người Pháp
Réaunur tiến hành vào năm 1713 và được Spallanzani người Ý khẳng định lại một
cách chặt chẽ hơn vào năm 1783 với tác dụng của dịch dạ dày phân hủy thịt.
Năm 1814, viện sĩ viện hàn lâm khoa học Petecbua là Kirchov người Nga
làm thí nghiệm chứng minh nước chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển
hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ 40 – 60C .
Năm 1817 hai nhà khoa học Manaxenia (Nga) và Buchner (Đức) đã làm thí
nghiệm thành công quá trình lên men bằng chất dịch vô bào từ nấm men. Nhà sinh lý
học thực vật K.Tinniriazev đã viết “Không còn nghi ngờ gì nữa, lần đầu tiên người ta
đã chứng minh được rằng hiện tượng lên men chung quy chỉ là một quá trình hóa học,
nó có thể dễ dàng lập lại ngoài cơ thể sống nhờ những enzyme hòa tan chiết xuất từ
những tế bào đã bị phá hủy cấu trúc”.
Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là A.Payen và J.Person thu nhận
được chế phẩm enzyme amylase ở dạng kết tủa bằng cách thêm cồn vào dịch chiết từ
hạt lúa nảy mầm. Kết tủa này có khả năng phân giải tinh bột thành đường và được gọi
là diastase. Đây là thực nghiệm đặt nền móng cho các tiến bộ trong lĩnh vực enzyme
vào nửa sau thế kỷ 19.
Năm 1835, Berzelius lần đầu tiên đã đề ra khả năng giải thích tác dụng của
enzyme trên cơ sở hóa học. Ông gọi hiện tượng làm tăng quá trình phản ứng là sự xúc
tác và chất gây ra hiện tượng này là chất xúc tác.
Năm 1856, Pasteur đã tiến hành nghiên cứu bản chất của quá trình lên men
rượu. Theo ông, chính nấm men hay vi khuẩn lên men mà ta nhìn thấy dưới kính hiển
vi là nguyên nhân gây ra hiện tượng lên men rượu . Ông cho rằng chỉ có nấm men hay
vi khuẩn còn sống mới có thể thực hiện quá trình lên men. Từ đó dẫn đến hai khái
niệm mâu thuẫn nhau : men hữu hình (ferment hữu hình ) và men không nhìn được
(ferment hòa tan).
Năm 1862, nhà khoa học người Nga Danilevxki đã sử dụng một kỹ thuật đặc
biệt để tách chiết trypsine ra khỏi hỗn hợp với amylase trong dịch tụy bằng kỹ thuật
“phương pháp hấp thụ chọn lọc enzyme” (tức là gắn enzyme lên bề mặt chất đỡ) và
“phản hấp thụ” (nghĩa là giải phóng enzyme ra khỏi bề mặt chất đỡ) rồi kết tinh. Hiện
nay chúng ta gọi đó là một dạng của “kỹ thuật sắc ký ”.
Năm 1894, nhà khoa học người Pháp G.Bertrand phát hiện ra một loại enzyme
mới là enzyme oxy hóa với việc phát hiện ra enzyme lacasae trong nhựa mủ cây sơn ta
Rhus succedanea.
Từ những thành tựu ban đầu đó, enzyme bắt đầu được chú ý nghiên cứu nhiều
hơn vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20. Liên tiếp trong những năm 1930, 1931 hai nhà
khoa học D.Northop và M.Kunitz đã tách được pepsine và trypsine dưới dạng tinh thể.
(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
Năm 1913, hai nhà khoa học L.Michalis và Menten đã nghiên cứu cơ chế xúc
tác nhờ enzyme có sử dụng chất đồng vị, sử dụng phương pháp quang học và phương
pháp hóa học nghiên cứu các nhóm hoạt động của enzyme đã đem lại cho chúng ta
“phương trình Michalis-Menten” nổi tiếng trong nghiên cứu động học của enzyme.
(Nguyễn Hữu Chấn, 1984).
Hiện nay enzyme đã trở thành một ngành khoa học mũi nhọn phát triển rất
nhanh trên thế giới phân nhánh rất nhiều và liên quan chặt chẽ tới các ngành như hóa
lý, hóa sinh, vi khuẩn, vi sinh học, sinh lý, y học,…Hàng năm trên thế giới xuất bản
hàng chục nghìn công trình nghiên cứu về cơ chế tác dụng của enzyme, các phương
pháp tách chiết và tinh chế, sự điều hòa về rối loạn hoạt động của cơ thể ở trạng thái
sinh lý và bệnh lý.
2.1.2 Định nghĩa về enzyme
Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có hoạt tính xúc tác sinh học, do
tế bào sống tiết ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau
phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác. (Nguyễn Tiến Thắng, 2004)
Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể
sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với
tốc độ nhịp nhàng, có trật tự, theo những chiều hướng xác định. Pavlôv đã nói : “Hoạt
động đầu tiên của enzyme là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống. Không có sự sống
nào lại không có quá trình enzyme”. Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa của
Anghen : “Sự sống, đó là phương thức tồn tại của thể protein”. (Lê Ngọc Tú và ctv,
1982).
Enzyme có trong mọi tế bào, mọi mô của mọi sinh vật nhưng mỗi loại mô, mỗi
loại tế bào thường có những hệ thống enzyme đặc biệt. Các enzyme không chỉ tham
gia xúc tác các phản ứng sinh học trong cơ thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng
ngoài tế bào (in vitro). (Nguyễn Hữu Chấn, 1984).
Enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp
suất thấp và nhiệt độ bình thường của cơ thể. Trong khi đó các chất xúc tác hóa học
cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Hơn nữa, các enzyme có khả năng chọn
lựa cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng.
(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
Các loại enzyme trong cơ thể được tổng hợp, hoạt động một cách rất hài hòa để
sao cho các chất ban đầu được chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng thành một mắt
xích hoàn chỉnh. Sự trục trặc nào đó ở một trong toàn bộ mắt xích này sẽ làm rối loạn
cho cả hệ thống. Trong khi đó điều khiển tổng hợp và hoạt động của enzyme lại do
gen. Mỗi một gen chịu trách nhiệm điều khiển tổng hợp một enzyme. (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh học có thể tóm tắt
như sau :
Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng
sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất.
Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển
hóa rất cao.
Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản
ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.
Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít.
Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lượng
enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy
ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi
enzyme.
Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Ngày nay các nhà khoa
học đã tìm ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này
là rất nhỏ so với số lượng có thật trong mỗi tế bào. Trong hơn 1000 loại enzyme đã
biết, loài người mới thu nhận và kết tinh được khoảng 200 loại. (Nguyễn Đức Lượng,
2002).
2.1.3 Phân loại enzyme
Khi số lượng enzyme được phát hiện còn ít, người ta đặt tên enzyme theo ý
thích từng người tìm ra nó. Dần dần theo thời gian, số lượng enzyme tìm ra ngày càng
nhiều nên cần có một hệ thống phân loại theo quy ước quốc tế. Enzyme được phân loại
theo tính chất của nó, được xếp vào từng nhóm nhỏ tương ứng với các enzyme có bản
chất tương tự nhau, làm cho việc tìm hiểu và nghiên cứu trở nên dễ dàng hơn.
Theo quy ước quốc tế, tên gọi của enzyme thường được đặt theo cơ chất đặc
hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó, tên enzyme
thường có hai phần. Phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân các phản
ứng. Tuy nhiên, có nhiều enzyme theo thói quen vẫn được gọi theo tên cũ, không theo
hệ thống như trypsine, pepsine.
Năm 1930, Hiệp Hội Hóa Sinh Quốc Tế (IOB) đã thống nhất phân loại enzyme
ra làm 6 lớp và được đánh số thứ tự từ một đến sáu. Các số thứ tự này là cố định cho
mỗi lớp. Mỗi lớp lại chia làm nhiều tổ, mỗi tổ có nhiều nhóm. Chính vì thế theo hệ
thống phân loại, mỗi enzyme thường có bốn số : số thứ tự một chỉ lớp, số thứ tự hai
chỉ tổ, số thứ ba chỉ nhóm, số thứ tư chỉ enzyme. Tên của các lớp, tổ và nhóm như sau
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme
Hoạt tính xúc tác của enzyme là do cấu trúc không gian ba chiều của các
phân tử protein quyết định. Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, gấp hàng trăm,
hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác.
Tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau
như nồng độ enzyme, bản chất và nồng độ của các chất phản ứng (cơ chất), nhiệt độ,
pH môi trường, nồng độ ion trong môi trường, nồng độ các chất kìm hãm, các chất
hoạt hóa enzyme. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh huởng đến vận tốc phản ứng enzyme.
a) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc bậc nhất vào nồng
độ enzyme. Đường biểu diễn có dạng như ở hình 2.1
b) Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ enzyme được giữ cố định và
nồng độ cơ chất thay đổi, người ta nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi nồng độ cơ
chất tăng. Khi nồng độ cơ chất tiếp tục gia tăng, đường biểu diễn uốn cong và với
nồng độ cơ chất cao thì vận tốc không còn gia tăng nữa và đường biểu diễn tiệm cận
với giá trị vmax.
c) Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng
enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng
chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ
giảm và dẫn đến mức triệt tiêu.
Nếu đưa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị
giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính.
Ngược lại, ở nhiệt độ 0C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi
đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức tối ưu.
Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), người ta
thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tương ứng với hai hiện tượng khác nhau :
Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 400
C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng.
Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng.
Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme, ở vào khoảng 450C),
vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80
– 100C.
Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ
chất, pH, lực ion của môi trường.
d) Ảnh hưởng của pH
Sự thay đổi pH gây nên :
Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptid của
enzyme, do đó làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ
chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptid của enzyme.
Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn
cản sự tạo thành enzyme – cơ chất trong trường hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất phải ở
dưới dạng ion.
Như vậy, hoạt tính của enzyme phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trường. Đó là vì
pH môi trường có ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và trung tâm
hoạt động của nó, phức chất enzyme – cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của enzyme.
Người ta có thể xác định một giới hạn pH tối ưu cho hoạt động của một
enzyme. Ngoài pH tối ưu, vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng. Điều này cho thấy
tầm quan trọng của môi trường phản ứng trong quá trình nghiên cứu các phản ứng
enzyme in vitro.
Mỗi một enzyme có một pH tối ưu khác nhau, có thể rất acid (từ 1,5 -2),
hoặc rất kiềm (9,5 – 10). pH tối ưu của đa số các enzyme vào khoảng chung quanh giá
trị trung tính (6 – 8). Tuy nhiên pH tối ưu của một enzyme cũng không cố định mà phụ
thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như bản chất và nồng độ cơ chất, tính chất dung dịch
đệm, nhiệt độ.
2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống
2.1.5.1 Nguồn thu nhận
Enzyme được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : động vật (pepsin từ dạ
dày, trypsin từ tụy tạng…), từ thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ
thơm…). Tuy nhiên không thể dùng hai nguồn này làm nguyên liệu để sản xuất với
quy mô công nghiệp lớn các chế phẩm enzyme nhằm thỏa mãn các nhu cầu của nền
kinh tế quốc dân. Như vậy trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu
vi sinh vật (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn. Enzyme thu
nhận từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa các
enzyme từ động vật và thực vật :
Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với một lượng
lớn và có thể mở rộng để sản xuất tới phạm vi cần thiết, đồng thời việc thu chế phẩm
cũng dễ dàng và có thể thỏa mãn trong một mức độ lớn nhu cầu của các ngành công
nghiệp khác nhau.
Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Do đó vi sinh vật có thể đồng
hóa bất kỳ chất nào trong thiên nhiên. Trong khi đó có nhiều chất mà thực vật và động
vật không thể đồng hóa được.
Enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác.
Do vậy chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất.
Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ,
kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quá trình sản xuất
chế phẩm enzyme khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao.
Phần lớn thức ăn để nuôi cấy vi sinh vật dễ kiếm và rẻ tiền. Đa số vi sinh
vật cho enzyme thường có khả năng phát triển trên môi trường đơn giản, rẻ tiền như
các phụ phế liệu, phế phẩm của các nghành sản xuất.
ưu việt lớn của sự thu enzym từ vi sinh vật là có khả năng tăng cường
sinh tổng hợp các enzym nhờ chọn giống khi tạo được những biến chủng có hoạt lực
cao. Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động môi trường, có khả năng thích ứng với
nguồn dinh dưỡng. Vì vậy, khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác động
lên chúng bằng các tác nhân khác nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzym cũng như
hoạt tính của chúng và tăng tối đa sự sinh tổng hợp các enzym trong vi sinh vật nuôi
cấy. Điều đó cho phép ta có thể tạo được những enzym theo ý muốn, dễ dàng thu nhận
được enzym có độ thuần khiết cao.
2.1.5.2 Vai trò
Cùng với những thành tựu đạt được trong nghiên cứu lí thuyết về enzym, các
nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tế ngày càng được mở rộng và đạt hiệu quả
cao. Các chế phẩm enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như
trong hoá phân tích để định tính, định lượng các chất trong nông nghiệp, y học, công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược liệu, công nghiệp nhẹ như công nghiệp dệt, công
nghiệp da.
Trong y học có thể sử dụng enzym tinh chế để chữa bệnh, sản xuất các
sinh tố và các chất kháng sinh.
Sử dụng chế phẩm enzym trong nông nghiệp để chế biến các sản phẩm
nông nghiệp sản xuất thức ăn cho động vật đặc biệt là động vật còn non, xử lý hạt
trước khi gieo.
Trong công nghiệp thực phẩm, chế phẩm enzym được sử dụng khá rộng
rãi trong nhiều ngành chế biến khác nhau : chế biến thịt, cá, sữa, công nghiệp sản xuất
bánh mì và các thứ bánh kẹo khác. Sử dụng chế phẩm enzym thường làm tăng nhanh
quá trình chế biến, tăng hương vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Ngoài ra, sử
dụng enzym còn có thể tái tạo hương vị của các loại rau quả tươi sau khi chế biến.
Ngày nay, người ta cũng đã đạt được nhiều kết quả trong việc sử dụng một số enzyme
trong bảo quản đồ hộp và một số nguyên liệu khác.
2.2 Khái quát chung về enzyme protease
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân
liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do,
một ít peptid ngắn, pepton.
2.2.2 Lược sử phát triển các enzyme protease
2.2.2.1 Protease từ động vật
Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn
cả.
Từ thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp là Reaunur đã làm thí nghiệm
rất đơn giản và đã phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu
hóa thịt.
Năm 1836, Schwam đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch
vị. Tuy nhiên, mãi đến hơn 30 năm sau người ta mới tách được enzyme này.
Năm 1857, Corvisart tách được trypsine từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên
thu nhận được ở dạng chế phẩm, trong chế phẩm vẫn còn lẫn nhiều protein khác.
Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp phụ trên colondion đã tách
được trypsine với amylase tụy tạng. Phương pháp này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên
cứu tinh chế enzyme và protein.
Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm chymotrypsine (renin).
Ngoài những enzyme của hệ tiêu hóa, các nhà khoa học cũng có những
nghiên cứu đầu tiên về protease trong máu. Schidt đã nêu giả thiết rằng trong máu có
enzyme fibrin (ngày nay gọi là trombin) tham gia trong quá trình đông máu. Ông đã
tiến hành việc tách chiết enzyme này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm nhận được có tác
dụng làm cho dung dịch fibrinogen đông lại nhanh chóng.
2.2.2.2 Các protease từ thực vật
So với các protease từ động vật, các protease từ thực vật được phát hiện
muộn hơn.
Năm 1874, Group – Besanez công bố đã nhận được protease từ hạt của một
loại đậu. Họ cũng nhận thấy dịch chiết từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có hoạt động
phân giải protein. Ý kiến này dựa trên cơ sở thực nghiệm là sau khi cho dịch chiết từ
các nguyên liệu trên tác dụng với fibrin, nuớc lọc của hỗn hợp cho phản ứng màu
Biure.
Bằng chứng này không thật sự vững chắc nên Group – Besanez không tiếp
tục nghiên cứu. Vì vậy Wurtz được xem như là người đầu tiên tách chiết thành công
protease từ thực vật (1879). Ông nêu lên rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có
chứa protease, khi dùng cồn để kết tủa sẽ thu nhận được một chế phẩm enzyme không
tinh khiết (100g/1 cây) gọi là papain.
2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật
Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950,
mặc dầu từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein
của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay, số công trình nghiên cứu protease vi vinh vật
tăng lên đáng kể, nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease của động vật và thực
vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp
phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế.
Trong thời gian gần đây người ta cũng đã có những phương pháp thích hợp
để nhận chế phẩm không tan của protesae. Kết quả này mở ra triển vọng to lớn trong
nghiên cứu và các ứng dụng của các protease.
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease
Các enzyme protesae như đã nói ở trên được thu nhận từ nhiều nguồn khác
nhau.
2.2.3.1 Từ động vật
Protesae động vật thường có ở tụy tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ
dày…
Pancreatin gồm : Trysin, chymotrypsin và một enzyme khác có ở tụy tạng,
chúng được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tụy.
Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị.
Renin chỉ có ở ngăn thứ tư ở dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi, là enzyme
đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất fromage.
2.2.3.2 Từ thực vật
Enzyme protease từ thực vật có ở các thanh phần khác nhau của cây như
thân, lá và đặc biệt có nhiều ở quả .
Ví dụ:
Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh
Bromelin có trong thân cây thơm xanh và quả thơm xanh.
Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả.
2.2.3.3 Từ vi sinh vật
Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này
có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi cấy
(protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn các
protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và
được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y
dược.
Có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy các protease của vi sinh vật có
nguồn gốc khác nhau thì cũng có những tính chất khác nhau về nhiều mặt. Căn cứ vào
cơ chế phản ứng, pH hoạt động tối ưu,…Hartley (1960) đã phân loại các protease vi
sinh vật thành 4 nhóm cơ bản như sau :
Protease serine
Protease kim loại (metallo protease)
Protease acid
Protease tiol
2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease
Các protease nói chung cũng như protease vi sinh vật nói riêng được sử dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Trong sản xuất nước chấm : Nước mắm, tương, chao,…
Trong công nghệ thực phẩm : Làm mềm thịt, tăng hương vị thịt sau khi
chế biến,…
Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,…
Trong công nghệ tơ tằm : Làm bóng và tách rời các sợi tơ.
Trong hương mỹ phẩm : Người ta trộn một lượng nhỏ protease vào kem
xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ
dàng lớp tế bào già.
Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn. Đặc biệt ứng
dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải.
Trong công nghiệp sữa, các protease như renine, pepsine được dùng trong
sản xuất formate, sữa đông tụ.
Trong y học :
+ Protease được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật,
sản xuất huyết thanh miễn dịch.
+ Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh
mạch…
+ Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc
trưng.
+ Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những người bị
tiêu hóa kém…
Trong nông nghiệp : Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu
đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.
Trong kỹ nghệ phim ảnh : Protease từ vi khuẩn được dùng để tái sinh các
nguyên liệu như phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp
nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các
loại phim và giấy ảnh quý.
2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
2.3.1.1 Phân loại
2.3.1.2 Đặc điểm
Hình thái
Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển
rất mạnh (chiều ngang 5 – 7 m), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm
đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty.
Điều kiện phát triển :
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử : 45%.
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme : 55 - 58%.
Độ ẩm không khí : 85 -95%.
pH môi trường : 5,5 - 6,5.
Nhiệt độ nuôi cấy : 27 - 30C.
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt.
Để thu nhận chế phẩm protease từ vi sinh vật cũng như các enzyme khác có thể
dùng hai phương pháp nuôi cấy : phương pháp bề mặt và phương pháp bề sâu. Phương
pháp bề mặt thường dùng để nuôi cấy nấm mốc, phương pháp bề sâu thường dùng đối
với vi khuẩn.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật đã được
nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX. Lượng
enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với phương
pháp nuôi cấy chìm. Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những
nguyên liệu có nguồn gốc thực vật như cám mì, cám gạo, gạo, ngô…Khi nuôi cấy vi
sinh vật để thu nhận protease, người ta cho thêm bột đậu xanh hoặc bột đậu nành như
những cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của protease.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng
phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi
cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:
+ Nhiệt độ tăng rất chậm.
+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.
+ Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.
+ Khối môi trường còn rời rạc.
+ Enzym mới bắt đầu được hình thành.
Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt. Tuyệt đối
không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt.
Giai đoạn 2. Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ. Trong giai đoạn này
có những thay đổi cơ bản sau:
+ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển
rất mạnh. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi
trường, trong lòng môi trường.
+ Môi trường được kết lại khá chặt.
+ Độ ẩm môi trường giảm dần.
+ Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC.
+ Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của
nấm sợi.
+ Các loại enzym được hình thành và enzym nào có cơ chất cảm ứng trội
hơn sẽ được tạo ra nhiều hơn.
+ Lượng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai
đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng
29-30oC là tốt nhất.
Giai đoạn 3. Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có
một số thay đổi cơ bản như sau:
+ Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng
sẽ chậm lại.
+ Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí
môi trường xuống còn 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ. Nhiệt
độ nuôi duy trì ở 30C. Trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng
enzym sẽ giảm. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất
cần thiết.
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme. Chế phẩm này
được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn chứa
sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường). Người ta
thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm
enzyme thô không mất hoạt tính nhanh.
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử enzyme protease
2.5.1 Trích ly enzyme
Toàn bộ khối lượng chế phẩm enzyme thô đã sấy được đem đi nghiền nhỏ.
Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần
của chế phẩm thô. Khi thành tế bào bị phá vỡ, các enzyme ngoại bào và cả enzyme nội
bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào.
Các loại enzyme thủy phân hòa tan trong nước nên sau khi nghiền mịn, người
ta dùng nước, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, acetone).
Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này cho kết quả tốt và
dễ được dùng rộng rãi trong sản xuất. Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể
chiết được lượng enzyme trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất
không tan. Nước thường dùng khuyếch tán ở nhiệt độ 25 – 28C. (Lương Đức Phẩm,1998)
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly :
Tỷ lệ nước trích
Chế phẩm đã sấy khô cần nhiều nước để trích ly enzyme hơn chế phẩm
ẩm, tỷ lệ nước trên chế phẩm khác nhau sẽ trích được lượng enzyme khác nhau.
Lượng nước dùng để trích ly gấp từ 2 – 3,5 lần so với lượng chế phẩm nấm mốc.
Thời gian trích
Enzyme thủy phân dễ tan trong nước, thời gian trích ly càng lâu càng có
khả năng trích được nhiều enzyme hơn nhưng làm tăng lượng tạp chất trong dịch chiết
và giảm hoạt tính riêng của enzyme. Thời gian trích ly thích hợp khoảng 30 – 40 phút.
Nhiệt độ trích
Nhiệt độ trích ly càng tăng thì vận tốc trích ly càng tăng nhưng làm giảm
hoạt tính enzyme nên kéo theo giảm hoạt tính riêng của dịch enzyme. Nhiệt độ trích ly
tối thích là 20 – 30C.
Để tăng cường khả năng thu enzyme, chế phẩm được đánh tơi trước khi trích
để đạt được kích thước hạt 1 – 5 mm. Ngoài ra trong công nghiệp, thường dùng hệ
thống trích ly liên tục gồm nhiều thùng chứa chế phẩm nấm mốc, trong mỗi thùng sẽ
Sản phẩm enzyme
tinh khiết
trích được nhiều lần. Cách làm này giúp tăng hiệu suất thu enzyme, tăng chất khô và
hàm lượng enzyme trong dịch chiết thu được.
2.5.2 Quá trình tủa
Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô, vì trong đó còn chứa
nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Dung dịch enzyme thô
thường chứa một lượng enzyme không nhiều, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì
thế việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi những vật chất này.
Để làm được điều đó người ta phải tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác
nhân gây kết tủa. Tủa là phương pháp cô đặc enzyme hữu dụng và là bước ban đầu
trong tinh sạch enzyme. Bằng cách này người ta loại được một số protein tạp ở giai
đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme.
Nguyên tắc :
Enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung
môi.
Ở phân tử enzyme, các gốc ưa nước và kỵ nước thường nằm trên bề mặt.
Chúng quyết định mức độ hòa tan của enzyme ở những loại dung môi khác nhau.
Trong đó, các nhóm kỵ nước có xu hướng nằm trong lòng phân tử protein, một phần
không nhỏ nhóm này nằm trên bề mặt protein và có khả năng tiếp xúc với dung môi,
các nhóm này sẽ cùng với nhóm tích điện và các nhóm lưỡng cực khác có vai trò quyết
định đến tính chất enzyme.
Độ hòa tan của enzyme được coi là kết quả của tương tác lưỡng cực của chất
hòa tan với nước và tương tác ion của chúng với muối có trong dung dịch tạo thành
màng nước bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrate. Nếu loại bỏ các tương tác
này, các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau để tạo thành khối lớn, tách khỏi dung
dịch, thường gọi là tủa protein.
Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa, protein lại có
thể ở dạng tan (dung dịch keo) bền như trước thì được gọi là kết tủa thuận nghịch,
hoặc mất khả năng này gọi là kết tủa không thuận nghịch.
Những phản ứng kết tủa thuận nghịch protein
a) Kết tủa bằng muối
Khi cho thêm muối (amonium sulfate) vào dung dịch protein, các phân tử
muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nước khỏi protein,
do vậy các phân tử protein có khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại.
Khi cho một lượng muối đủ lớn vào thì protein sẽ bắt đầu tủa. Nếu quá trình
này thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính.
Sau đó thu protein bằng cách ly tâm và hòa tan vào dung dịch đệm có nồng độ muối
thấp.
Phương pháp này thường được sử dụng để tách chiết protein hòa tan. Nó
cũng được sử dụng để thu phân đoạn các protein khác nhau trong hỗn hợp, vì các phân
tử protein lớn có khuynh hướng kết tủa trước, các phân tử nhỏ hơn vẫn còn nằm trong
dung dịch. Vì thế chúng ta có thể tìm ra điều kiện mà có thể thu protein ta đang nghiên
cứu nhiều nhất trong hỗn hợp nhiều protein nhờ phân tích các đoạn ở nồng độ muối
khác nhau.
Như vậy với quá trình này ta có thể thu được protein mong muốn một cách
tinh sạch hơn.
b) Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một
trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung những phân tử dung môi
có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulfoxid) có thể ổn định các tương tác
giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của
protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (acetone,
ethanol) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường. Do đó độ hòa
tan của các phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do làm giảm hằng số điện môi
hiện hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan
trong nước (như acetone) vào dung dịch chứa protein.
Sự kết tủa bằng acetone hoặc ethanol 960
có nhiều thuận lợi do tương đối rẻ,
có sẵn dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzyme. Do
nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme
bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió.
Có thể xảy ra hiện tượng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung
môi hữu cơ. Nguyên nhân là do, khi hằng số điện môi giảm, phân tử protein có thể tự
tháo gỡ và trở thành dạng không hoạt động, trong khi đó các gốc kỵ nước lại tiếp xúc
với dung môi. Hiện tượng này xảy ra khi tiến hành tủa ở nhiệt độ phòng. Khi tiến hành
kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ, ta bắt
buộc phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme.
Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt dung môi hữu cơ thường
mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ.
Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 –
100
C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định
bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch
enzyme.
2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký
Sắc ký sinh học là phương pháp nhẹ nhàng để tinh sạch các phân tử sinh
học, đặc biệt là protein mà vẫn duy trì hoạt tính của chúng. Các kỹ thuật sắc ký tinh
sạch protein dựa vào các đặc tính vật lý của chúng.
Bảng 2.1 : Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính vật lý của protein
Đặc tính Kỹ thuật
Điện tích Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography)
Sự phân cực o Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography)
o Sắc ký giấy.
o Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography)
o Sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction
Chromatography – HIC)
Kích thước Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography)
Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của ligand)
Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography)
Hơn 40 năm qua kể từ khi việc đưa vào thị trường sản phẩm thương mại
SephadexTM, kỹ thuật sắc ký lọc gel đã đóng một vai trò quan trọng trong việc tinh
sạch enzyme, polysaccharide, nucleic acid, protein và các đại phân tử sinh học khác.
Nguyên tắc :
Lọc gel là phương pháp đơn giản nhất trong tất cả các loại sắc ký. Kỹ thuật
này dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng khác nhau bằng cách cho
chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel
sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển
bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp (thôi) ra khỏi cột sớm
hơn các phân tử nhỏ. Kỹ thuật này có thể áp dụng theo hai cách :
a) Phân tách nhóm (Group separations)
Các thành phần của một mẫu được phân tách thành hai nhóm chính theo
phạm vi kích thước. Sự phân tách nhóm được sử dụng để loại các phân tử lớn hay các
phân tử tạp chất nhỏ (như đỏ phenol khỏi dịch nuôi cấy) hoặc để loại muối hoặc trao
đổi đệm.
b) Phân đoạn các phân tử sinh học với độ phân giải cao (High resolution
fractionation of biomolecules)
Các thành phần của cùng một mẫu được phân tách theo sự khác biệt về kích
thước phân tử của chúng. Phân tách với độ phân giải cao có thể được dùng để cô lập
một hoặc nhiều thành phần, để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, để xác
định trọng lượng phân tử hoặc để phân tích sự phân bố theo trọng lượng phân tử.
ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel
a) ưu điểm
Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh
học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác
động (cofactor) và các điều kiện môi trường khắc nghiệt.
Sự phân tách có thể được thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các
cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cường độ
ion cao hoặc thấp, ở 370
C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí
nghiệm.
Kỹ thuật này cho phép thu lại lượng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và
dễ dàng khử muối.
b) Nhược điểm
- Chậm (tốc độ thấp = thời gian dài)
- Yêu cầu các cột có kích thước lớn tương đối so với lượng mẫu.
- Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, thường khó
đạt được sản phẩm tinh khiết hoàn toàn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thường được sử
dụng với những kỹ thuật khác nhau như sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ.
Một số thông số vật lý của phương pháp
Giới hạn tách (Exclusion Limit-EL) : Là khối lượng phân tử (MW) nhỏ nhất
không chui vào bên trong hạt gel, như vậy tất cả chúng sẽ bị thổi cùng một lượt ra khỏi
cột. Thí dụ G-50 có giới hạn tách 30.000 Da, có nghĩa là các phân tử lớn hơn 30.000
Da đều không chui vào hạt gel.
Phạm vi tách (Fraction Range-FR) : Thí dụ Sephadex G-50 có giới hạn tách
từ 1.500-30.000 Da, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ được
phân tách dễ dàng bởi Sephadex G-50.
Độ ngậm nước (Water Regain-WR) : Là trọng lượng nước mà 1g bột gel khô
hút nước. Thí dụ G-50 có WR là 5 0,3 g. Giá trị này chưa tính đến lượng nước bao
quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích cột.
Thể tích nền : Là thể tích cuối cùng mà 1g bột gel khô hấp thụ khi trương nở
trong nước. G-50 có thể tích nền 9-11 ml/g gel khô.
Hạt gel : hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thước hạt xác định bằng mesh
hoặc đường kính hạt theo m. Hạt có kích thước lớn (50-100 mesh, 100-300 m) cho
tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhưng kết quả tách thấp. Ngược lại những hạt mịn (400
mesh, 10-40 m) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thường
người ta chọn hạt gel có kích thước 100-200 mesh, 50-150 m.
Thể tích trống : Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột xác
định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Da.
Thể tích thổi : Là thể tích đệm cần thiết để rửa thổi chất cần tách ra khỏi cột.
Phân tách bằng sắc ký lọc gel
Để phân tách, môi trường lọc gel được nhồi trong cột để tạo nền nhồi. Môi
trường này là một chất nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, loại hạt này được chọn vì tính ổn
định về vật lý và hóa học của chúng, và tính trơ (thiếu các đặc tính hấp phụ và phản
ứng).
Nền nhồi được cân bằng bằng dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các lỗ
của chất nền và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong các lỗ đôi khi được
xem như phase tĩnh và chất lỏng này ở trạng thái cân bằng với chất lỏng bên ngoài các
hạt, được xem như phase động. Cần lưu ý rằng, mẫu được giải hấp một cách đồng nhất
(isocraticlly), nghĩa là không cần sử dụng các loại đệm khác nhau trong quá trình phân
tách. Tuy nhiên, bước rửa giải dùng loại đệm đang chạy thường bao gồm ở thời điểm
kết thúc của quá trình phân tách, làm cho việc loại bỏ bất kỳ loại phân tử nào còn lưu
trong cột được dễ dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp.
Quá trình lọc gel
1. Các hạt hình cầu của môi trường lọc gel được nhồi trong cột.
2. Mẫu được nạp vào cột.
3. Dung dịch đệm (phase động) và mẫu di chuyển qua cột. Các phân tử
khuếch tán trong và ngoài các lỗ của chất nền (cũng được miêu tả như quá trình phân
đoạn mẫu giữa phase động và phase tĩnh). Các phân tử nhỏ hơn di chuyển vào sâu
trong chất nền hơn và do đó lưu lại trong cột lâu hơn.
4. Khi dung dịch đệm di chuyển liên tục qua cột, các phân tử lớn hơn kích
thước lỗ gel không thể khuyếch tán vào trong các lỗ và di chuyển qua cột. Các phân tử
nhỏ hơn khuyếch tán vào trong lỗ gel và bị trì hoãn trong quá trình di chuyển xuống
dưới đáy cột.
5. Các phân tử lớn rời cột trước nhất sau đó là các phân tử nhỏ hơn theo trình
tự kích thước của chúng. Quá trình phân tách hoàn toàn xảy ra khi một lượng dung
môi bằng tổng thể tích cột (tương đương với thể tích nền nhồi) di chuyển qua môi
trường lọc gel.
2.5.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện di
SDS – PAGE
Sau khi qua các bước ly trích và tinh sạch, người ta thường kiểm tra lại độ tinh
sạch của protein nhờ kỹ thuật điện di. Nhờ kỹ thuật này ta còn có thể xác định trọng
lượng phân tử và độ tinh sạch của chúng.
Điện di trên gel là tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, protein) bằng cách
cho đi qua chất nền là gel trong một điện trường.
Kĩ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis) là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của
SDS.
Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử
acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa được xúc tác
bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS); N, N ,N’, N’ - tetramethylenediamine
(TEMED).
Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích thước
của lỗ gel.Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử
sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide :
nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích
thước lớn và ngược lại.
SDS là tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ
thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là
mercaptoethanol.Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2,3,4 được biến đổi
thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó,
sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những
phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi
đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử
tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển
về cực âm của điện trường.
Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một
thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác
nhau đã biết.
Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự
phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên
tục (discontinuous gel). Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp:
Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên) : các protein trong mẫu được dồn lại
và tạo một lớp băng mỏng.
Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới) : tạo ra các băng protein có
trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu.
Hai lớp gel này được phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide
và vị trí.
Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng
lượng phân tử từ 10.000-200.000 daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn
hơn 200.000 daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide hơn 2,5%.
MỤC LỤC
Bìa ..................................................................................................................................... i
Trang tựa .......................................................................................................................... ii vi
Lời cảm tạ ...................................................................................................................... iii
Tóm tắt khóa luận ........................................................................................................... iv
Mục lục ............................................................................................................................ v
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... viii
Danh sách các bảng ........................................................................................................ ix
Danh sách các hình và đồ thị .......................................................................................... xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Mục đích nghiên cứu ................................................................................................. 2
1.3 Yêu cầu ...................................................................................................................... 2
2.1 Khái quát chung về enzyme ...................................................................................... 3
2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme ........................................................... 3
2.1.2 Định nghĩa về enzyme ............................................................................................ 5
2.1.3 Phân loại enzyme .................................................................................................... 6
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme ........................ 7
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme ................................................................................................. 7
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme ......................................... 7
2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống .......................................... 9
2.1.5.1 Nguồn thu nhận ................................................................................................... 9
2.1.5.2 Vai trò ................................................................................................................ 11
2.2 Khái quát chung về enzyme protease ...................................................................... 11
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease ................................................................................ 11
2.2.2 Lược sử phát triển các enzyme protease .............................................................. 12
2.2.2.1 Protease từ động vật .......................................................................................... 12
2.2.2.2 Protease từ thực vật ........................................................................................... 12
2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật ........................................................................................ 13
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease......................................................................... 13
2.2.3.1 Từ động vật ........................................................................................................ 13
2.2.3.2 Từ thực vật ......................................................................................................... 13
2.2.3.3 Từ vi sinh vật ..................................................................................................... 14
2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease ............................................................................ 14
2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ...................................... 15
2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................... 15
2.3.1.1 Phân loại ........................................................................................................... 15
2.3.1.2 Đặc điểm ............................................................................................................ 15
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt ................................ 16
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử enzyme protease ................................. 18
2.5.1 Trích ly enzyme .................................................................................................... 19
2.5.2 Quá trình tủa ........................................................................................................ 20
2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký ....................................................... 22
2.5.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện di SDS –
PAGE ............................................................................................................................. 27
PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP ................................................................ 29
3.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................................. 29
3.2 Vật liệu .................................................................................................................... 29
3.2.1 Chế phẩm enzyme thô .......................................................................................... 29
3.2.2 Hóa chất ................................................................................................................ 29 vii
3.2.3 Thiết bị .................................................................................................................. 29
3.3 Phương pháp thí nghiệm .......................................................................................... 30
3.3.1 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 30
3.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme của dịch chiết enzyme
thô .................................................................................................................................. 30
3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ưu để tủa
enzyme protease ............................................................................................................ 36
3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của protease .... 37
3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel...................................... 37
3.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lượng phân tử enzyme bằng phương pháp điện
di SDS – PAGE ............................................................................................................. 41
3.4 Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 44
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.......................................................................... 45
4.1 Hàm lượng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô ................................................ 45
4.2 Nồng độ muối (NH4)2SO4 tối ưu cho việc tủa protease .......................................... 45
4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 46
4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 48
4.3 Tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa protease ..................................................................... 49
4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 49
4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 51
4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 960
và tủa bằng muối (NH4)2SO4 .................... 53
4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease...................... 54
4.5.1 pH tối ưu ............................................................................................................... 54
4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae ........................................................ 54
4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki .................................................... 54
4.5.2 Nhiệt độ tối ưu ...................................................................................................... 55
4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ..................................................................... 55
4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................ 56
4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel ................................................................................... 56
4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae ................................................................................... 57
4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki .............................................................................. 59
4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc
Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki ................................................................. 62
4.7.1 Tủa protease bằng muối ........................................................................................ 62
4.7.2 Tủa protease bằng cồn .......................................................................................... 62
4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phương pháp điện di trên gel SDS –
PAGE ............................................................................................................................. 63
PHẦN 5 : KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 67
5.1 Kết luận.................................................................................................................... 67
5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................................... 67
5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki ................................................................ 67
5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki .......................... 68
5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 69
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 70
Đánh giá :
0
- 5973 lần xem

markdown:
# Khảo sát hoạt tính và tinh sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki trên môi trường bán rắn
biotechvn
Số bài viết:
447
Số tài liệu đã gửi:
288
Ngày đăng:
21-06-2012
Ngày cập nhật:
27-11-2012 | 06:16:21
Thể loại:
Luận văn - Luận án
Chuyên ngành:
Công nghệ vi sinh
Số lần xem:
5 973
Số bình luận:
0
Ngôn ngữ tập tin:
Tiếng Việt
Bạn phải
[Đăng nhập](/user/login)để tải tập tin
Hình thức chia sẻ:
Đường dẫn
Mô tả tài liệu:
Nhân tố quan trọng có tác dụng thúc đẩy cho sự phát triển của nền công nghiệp
sản xuất enzyme đó là khả năng to lớn của vi sinh vật - những nhà máy chế tạo
enzyme. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh do đó có khả năng tạo ra
một lượng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme do chúng
tạo ra có hoạt lực cao và chúng ta có thể tận dụng các phế thải của ngành khác để làm
môi trường nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme.
Protease là một trong những nhóm enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và
phổ biến trong đời sống. Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học…Hoạt tính của
enzyme nói chung và của protease nói riêng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Điều
kiện tối thích để mỗi loại enzyme hoạt động là khác nhau. Do đó, để sử dụng enzyme
hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu cho hoạt động của enzyme đó.
Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính protease và tìm hiểu về kĩ thuật sắc ký lọc gel dùng
trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài :“Khảo sát hoạt tính và tinh
sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus
kawasaki trên môi trường bán rắn”.
Aspergillus oryzae từ lâu đã được dùng như là nguồn vi sinh vật được nuôi
cấy để thu nhận enzyme protease. Tuy nhiên, đối với Aspergillus kawasaki thì người ta
chỉ biết đến như là nguồn vi sinh vật để thu nhận amylase. Do đó, qua đề tài, chúng ta
có thể đánh giá được hiệu quả sử dụng protease của chủng Aspergillus kawasaki.
PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Khái quát chung về enzyme
2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme
Từ trước thế kỷ 17, khi loài người hoàn toàn chưa hiểu biết gì về ezyme,
người ta đã biết sử dụng rộng rãi các quá trình enzyme trong hoạt động thực tế như
làm bánh mì, làm bia, rượu,…Việc ứng dụng enzyme trong giai đoạn này hoàn toàn có
tính chất kinh nghiệm thuần túy và sử dụng enzyme thông qua hoạt động sống của tế
bào vi sinh vật.
Ngay từ thế kỷ 17, các nhà khoa học đã quen dùng từ “ferment” do nhà khoa
học người Hà Lan Van Heltmon đề xướng. Theo nghĩa tiếng La Tinh thì “fermentatio”
nghĩa là sự lên men, đó cũng là nguồn gốc của từ “ferment”. Theo ý kiến của ông, yếu
tố tham gia tích cực vào quá trình lên men rượu là “ferment”. Yếu tố đó là gì thì còn là
điều bí ẩn. Các nhà khoa học đã không vừa lòng với hiểu biết này và đã đi sâu vào
thực nghiệm, quan sát, mô tả.
Đến nửa cuối thế kỷ 18 bắt đầu có những thí nghiệm đầu tiên thô sơ và đơn
giản chứng minh tác dụng của men tiêu hóa được nhà tự nhiên học người Pháp
Réaunur tiến hành vào năm 1713 và được Spallanzani người Ý khẳng định lại một
cách chặt chẽ hơn vào năm 1783 với tác dụng của dịch dạ dày phân hủy thịt.
Năm 1814, viện sĩ viện hàn lâm khoa học Petecbua là Kirchov người Nga
làm thí nghiệm chứng minh nước chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển
hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ 40 – 60C .
Năm 1817 hai nhà khoa học Manaxenia (Nga) và Buchner (Đức) đã làm thí
nghiệm thành công quá trình lên men bằng chất dịch vô bào từ nấm men. Nhà sinh lý
học thực vật K.Tinniriazev đã viết “Không còn nghi ngờ gì nữa, lần đầu tiên người ta
đã chứng minh được rằng hiện tượng lên men chung quy chỉ là một quá trình hóa học,
nó có thể dễ dàng lập lại ngoài cơ thể sống nhờ những enzyme hòa tan chiết xuất từ
những tế bào đã bị phá hủy cấu trúc”.
Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là A.Payen và J.Person thu nhận
được chế phẩm enzyme amylase ở dạng kết tủa bằng cách thêm cồn vào dịch chiết từ
hạt lúa nảy mầm. Kết tủa này có khả năng phân giải tinh bột thành đường và được gọi
là diastase. Đây là thực nghiệm đặt nền móng cho các tiến bộ trong lĩnh vực enzyme
vào nửa sau thế kỷ 19.
Năm 1835, Berzelius lần đầu tiên đã đề ra khả năng giải thích tác dụng của
enzyme trên cơ sở hóa học. Ông gọi hiện tượng làm tăng quá trình phản ứng là sự xúc
tác và chất gây ra hiện tượng này là chất xúc tác.
Năm 1856, Pasteur đã tiến hành nghiên cứu bản chất của quá trình lên men
rượu. Theo ông, chính nấm men hay vi khuẩn lên men mà ta nhìn thấy dưới kính hiển
vi là nguyên nhân gây ra hiện tượng lên men rượu . Ông cho rằng chỉ có nấm men hay
vi khuẩn còn sống mới có thể thực hiện quá trình lên men. Từ đó dẫn đến hai khái
niệm mâu thuẫn nhau : men hữu hình (ferment hữu hình ) và men không nhìn được
(ferment hòa tan).
Năm 1862, nhà khoa học người Nga Danilevxki đã sử dụng một kỹ thuật đặc
biệt để tách chiết trypsine ra khỏi hỗn hợp với amylase trong dịch tụy bằng kỹ thuật
“phương pháp hấp thụ chọn lọc enzyme” (tức là gắn enzyme lên bề mặt chất đỡ) và
“phản hấp thụ” (nghĩa là giải phóng enzyme ra khỏi bề mặt chất đỡ) rồi kết tinh. Hiện
nay chúng ta gọi đó là một dạng của “kỹ thuật sắc ký ”.
Năm 1894, nhà khoa học người Pháp G.Bertrand phát hiện ra một loại enzyme
mới là enzyme oxy hóa với việc phát hiện ra enzyme lacasae trong nhựa mủ cây sơn ta
Rhus succedanea.
Từ những thành tựu ban đầu đó, enzyme bắt đầu được chú ý nghiên cứu nhiều
hơn vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20. Liên tiếp trong những năm 1930, 1931 hai nhà
khoa học D.Northop và M.Kunitz đã tách được pepsine và trypsine dưới dạng tinh thể.
(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
Năm 1913, hai nhà khoa học L.Michalis và Menten đã nghiên cứu cơ chế xúc
tác nhờ enzyme có sử dụng chất đồng vị, sử dụng phương pháp quang học và phương
pháp hóa học nghiên cứu các nhóm hoạt động của enzyme đã đem lại cho chúng ta
“phương trình Michalis-Menten” nổi tiếng trong nghiên cứu động học của enzyme.
(Nguyễn Hữu Chấn, 1984).
Hiện nay enzyme đã trở thành một ngành khoa học mũi nhọn phát triển rất
nhanh trên thế giới phân nhánh rất nhiều và liên quan chặt chẽ tới các ngành như hóa
lý, hóa sinh, vi khuẩn, vi sinh học, sinh lý, y học,…Hàng năm trên thế giới xuất bản
hàng chục nghìn công trình nghiên cứu về cơ chế tác dụng của enzyme, các phương
pháp tách chiết và tinh chế, sự điều hòa về rối loạn hoạt động của cơ thể ở trạng thái
sinh lý và bệnh lý.
2.1.2 Định nghĩa về enzyme
Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có hoạt tính xúc tác sinh học, do
tế bào sống tiết ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau
phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác. (Nguyễn Tiến Thắng, 2004)
Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể
sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với
tốc độ nhịp nhàng, có trật tự, theo những chiều hướng xác định. Pavlôv đã nói : “Hoạt
động đầu tiên của enzyme là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống. Không có sự sống
nào lại không có quá trình enzyme”. Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa của
Anghen : “Sự sống, đó là phương thức tồn tại của thể protein”. (Lê Ngọc Tú và ctv,
1982).
Enzyme có trong mọi tế bào, mọi mô của mọi sinh vật nhưng mỗi loại mô, mỗi
loại tế bào thường có những hệ thống enzyme đặc biệt. Các enzyme không chỉ tham
gia xúc tác các phản ứng sinh học trong cơ thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng
ngoài tế bào (in vitro). (Nguyễn Hữu Chấn, 1984).
Enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp
suất thấp và nhiệt độ bình thường của cơ thể. Trong khi đó các chất xúc tác hóa học
cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Hơn nữa, các enzyme có khả năng chọn
lựa cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng.
(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
Các loại enzyme trong cơ thể được tổng hợp, hoạt động một cách rất hài hòa để
sao cho các chất ban đầu được chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng thành một mắt
xích hoàn chỉnh. Sự trục trặc nào đó ở một trong toàn bộ mắt xích này sẽ làm rối loạn
cho cả hệ thống. Trong khi đó điều khiển tổng hợp và hoạt động của enzyme lại do
gen. Mỗi một gen chịu trách nhiệm điều khiển tổng hợp một enzyme. (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh học có thể tóm tắt
như sau :
Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng
sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất.
Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển
hóa rất cao.
Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản
ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.
Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít.
Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lượng
enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy
ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi
enzyme.
Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Ngày nay các nhà khoa
học đã tìm ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này
là rất nhỏ so với số lượng có thật trong mỗi tế bào. Trong hơn 1000 loại enzyme đã
biết, loài người mới thu nhận và kết tinh được khoảng 200 loại. (Nguyễn Đức Lượng,
2002).
2.1.3 Phân loại enzyme
Khi số lượng enzyme được phát hiện còn ít, người ta đặt tên enzyme theo ý
thích từng người tìm ra nó. Dần dần theo thời gian, số lượng enzyme tìm ra ngày càng
nhiều nên cần có một hệ thống phân loại theo quy ước quốc tế. Enzyme được phân loại
theo tính chất của nó, được xếp vào từng nhóm nhỏ tương ứng với các enzyme có bản
chất tương tự nhau, làm cho việc tìm hiểu và nghiên cứu trở nên dễ dàng hơn.
Theo quy ước quốc tế, tên gọi của enzyme thường được đặt theo cơ chất đặc
hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó, tên enzyme
thường có hai phần. Phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân các phản
ứng. Tuy nhiên, có nhiều enzyme theo thói quen vẫn được gọi theo tên cũ, không theo
hệ thống như trypsine, pepsine.
Năm 1930, Hiệp Hội Hóa Sinh Quốc Tế (IOB) đã thống nhất phân loại enzyme
ra làm 6 lớp và được đánh số thứ tự từ một đến sáu. Các số thứ tự này là cố định cho
mỗi lớp. Mỗi lớp lại chia làm nhiều tổ, mỗi tổ có nhiều nhóm. Chính vì thế theo hệ
thống phân loại, mỗi enzyme thường có bốn số : số thứ tự một chỉ lớp, số thứ tự hai
chỉ tổ, số thứ ba chỉ nhóm, số thứ tư chỉ enzyme. Tên của các lớp, tổ và nhóm như sau
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme
Hoạt tính xúc tác của enzyme là do cấu trúc không gian ba chiều của các
phân tử protein quyết định. Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, gấp hàng trăm,
hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác.
Tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau
như nồng độ enzyme, bản chất và nồng độ của các chất phản ứng (cơ chất), nhiệt độ,
pH môi trường, nồng độ ion trong môi trường, nồng độ các chất kìm hãm, các chất
hoạt hóa enzyme. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh huởng đến vận tốc phản ứng enzyme.
a) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc bậc nhất vào nồng
độ enzyme. Đường biểu diễn có dạng như ở hình 2.1
b) Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ enzyme được giữ cố định và
nồng độ cơ chất thay đổi, người ta nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi nồng độ cơ
chất tăng. Khi nồng độ cơ chất tiếp tục gia tăng, đường biểu diễn uốn cong và với
nồng độ cơ chất cao thì vận tốc không còn gia tăng nữa và đường biểu diễn tiệm cận
với giá trị vmax.
c) Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng
enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng
chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ
giảm và dẫn đến mức triệt tiêu.
Nếu đưa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị
giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính.
Ngược lại, ở nhiệt độ 0C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi
đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức tối ưu.
Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), người ta
thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tương ứng với hai hiện tượng khác nhau :
Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 400
C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng.
Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng.
Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme, ở vào khoảng 450C),
vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80
– 100C.
Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ
chất, pH, lực ion của môi trường.
d) Ảnh hưởng của pH
Sự thay đổi pH gây nên :
Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptid của
enzyme, do đó làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ
chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptid của enzyme.
Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn
cản sự tạo thành enzyme – cơ chất trong trường hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất phải ở
dưới dạng ion.
Như vậy, hoạt tính của enzyme phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trường. Đó là vì
pH môi trường có ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và trung tâm
hoạt động của nó, phức chất enzyme – cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của enzyme.
Người ta có thể xác định một giới hạn pH tối ưu cho hoạt động của một
enzyme. Ngoài pH tối ưu, vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng. Điều này cho thấy
tầm quan trọng của môi trường phản ứng trong quá trình nghiên cứu các phản ứng
enzyme in vitro.
Mỗi một enzyme có một pH tối ưu khác nhau, có thể rất acid (từ 1,5 -2),
hoặc rất kiềm (9,5 – 10). pH tối ưu của đa số các enzyme vào khoảng chung quanh giá
trị trung tính (6 – 8). Tuy nhiên pH tối ưu của một enzyme cũng không cố định mà phụ
thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như bản chất và nồng độ cơ chất, tính chất dung dịch
đệm, nhiệt độ.
2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống
2.1.5.1 Nguồn thu nhận
Enzyme được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : động vật (pepsin từ dạ
dày, trypsin từ tụy tạng…), từ thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ
thơm…). Tuy nhiên không thể dùng hai nguồn này làm nguyên liệu để sản xuất với
quy mô công nghiệp lớn các chế phẩm enzyme nhằm thỏa mãn các nhu cầu của nền
kinh tế quốc dân. Như vậy trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu
vi sinh vật (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn. Enzyme thu
nhận từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa các
enzyme từ động vật và thực vật :
Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với một lượng
lớn và có thể mở rộng để sản xuất tới phạm vi cần thiết, đồng thời việc thu chế phẩm
cũng dễ dàng và có thể thỏa mãn trong một mức độ lớn nhu cầu của các ngành công
nghiệp khác nhau.
Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Do đó vi sinh vật có thể đồng
hóa bất kỳ chất nào trong thiên nhiên. Trong khi đó có nhiều chất mà thực vật và động
vật không thể đồng hóa được.
Enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác.
Do vậy chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất.
Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ,
kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quá trình sản xuất
chế phẩm enzyme khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao.
Phần lớn thức ăn để nuôi cấy vi sinh vật dễ kiếm và rẻ tiền. Đa số vi sinh
vật cho enzyme thường có khả năng phát triển trên môi trường đơn giản, rẻ tiền như
các phụ phế liệu, phế phẩm của các nghành sản xuất.
ưu việt lớn của sự thu enzym từ vi sinh vật là có khả năng tăng cường
sinh tổng hợp các enzym nhờ chọn giống khi tạo được những biến chủng có hoạt lực
cao. Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động môi trường, có khả năng thích ứng với
nguồn dinh dưỡng. Vì vậy, khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác động
lên chúng bằng các tác nhân khác nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzym cũng như
hoạt tính của chúng và tăng tối đa sự sinh tổng hợp các enzym trong vi sinh vật nuôi
cấy. Điều đó cho phép ta có thể tạo được những enzym theo ý muốn, dễ dàng thu nhận
được enzym có độ thuần khiết cao.
2.1.5.2 Vai trò
Cùng với những thành tựu đạt được trong nghiên cứu lí thuyết về enzym, các
nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tế ngày càng được mở rộng và đạt hiệu quả
cao. Các chế phẩm enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như
trong hoá phân tích để định tính, định lượng các chất trong nông nghiệp, y học, công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược liệu, công nghiệp nhẹ như công nghiệp dệt, công
nghiệp da.
Trong y học có thể sử dụng enzym tinh chế để chữa bệnh, sản xuất các
sinh tố và các chất kháng sinh.
Sử dụng chế phẩm enzym trong nông nghiệp để chế biến các sản phẩm
nông nghiệp sản xuất thức ăn cho động vật đặc biệt là động vật còn non, xử lý hạt
trước khi gieo.
Trong công nghiệp thực phẩm, chế phẩm enzym được sử dụng khá rộng
rãi trong nhiều ngành chế biến khác nhau : chế biến thịt, cá, sữa, công nghiệp sản xuất
bánh mì và các thứ bánh kẹo khác. Sử dụng chế phẩm enzym thường làm tăng nhanh
quá trình chế biến, tăng hương vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Ngoài ra, sử
dụng enzym còn có thể tái tạo hương vị của các loại rau quả tươi sau khi chế biến.
Ngày nay, người ta cũng đã đạt được nhiều kết quả trong việc sử dụng một số enzyme
trong bảo quản đồ hộp và một số nguyên liệu khác.
2.2 Khái quát chung về enzyme protease
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân
liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do,
một ít peptid ngắn, pepton.
2.2.2 Lược sử phát triển các enzyme protease
2.2.2.1 Protease từ động vật
Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn
cả.
Từ thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp là Reaunur đã làm thí nghiệm
rất đơn giản và đã phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu
hóa thịt.
Năm 1836, Schwam đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch
vị. Tuy nhiên, mãi đến hơn 30 năm sau người ta mới tách được enzyme này.
Năm 1857, Corvisart tách được trypsine từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên
thu nhận được ở dạng chế phẩm, trong chế phẩm vẫn còn lẫn nhiều protein khác.
Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp phụ trên colondion đã tách
được trypsine với amylase tụy tạng. Phương pháp này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên
cứu tinh chế enzyme và protein.
Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm chymotrypsine (renin).
Ngoài những enzyme của hệ tiêu hóa, các nhà khoa học cũng có những
nghiên cứu đầu tiên về protease trong máu. Schidt đã nêu giả thiết rằng trong máu có
enzyme fibrin (ngày nay gọi là trombin) tham gia trong quá trình đông máu. Ông đã
tiến hành việc tách chiết enzyme này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm nhận được có tác
dụng làm cho dung dịch fibrinogen đông lại nhanh chóng.
2.2.2.2 Các protease từ thực vật
So với các protease từ động vật, các protease từ thực vật được phát hiện
muộn hơn.
Năm 1874, Group – Besanez công bố đã nhận được protease từ hạt của một
loại đậu. Họ cũng nhận thấy dịch chiết từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có hoạt động
phân giải protein. Ý kiến này dựa trên cơ sở thực nghiệm là sau khi cho dịch chiết từ
các nguyên liệu trên tác dụng với fibrin, nuớc lọc của hỗn hợp cho phản ứng màu
Biure.
Bằng chứng này không thật sự vững chắc nên Group – Besanez không tiếp
tục nghiên cứu. Vì vậy Wurtz được xem như là người đầu tiên tách chiết thành công
protease từ thực vật (1879). Ông nêu lên rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có
chứa protease, khi dùng cồn để kết tủa sẽ thu nhận được một chế phẩm enzyme không
tinh khiết (100g/1 cây) gọi là papain.
2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật
Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950,
mặc dầu từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein
của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay, số công trình nghiên cứu protease vi vinh vật
tăng lên đáng kể, nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease của động vật và thực
vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp
phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế.
Trong thời gian gần đây người ta cũng đã có những phương pháp thích hợp
để nhận chế phẩm không tan của protesae. Kết quả này mở ra triển vọng to lớn trong
nghiên cứu và các ứng dụng của các protease.
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease
Các enzyme protesae như đã nói ở trên được thu nhận từ nhiều nguồn khác
nhau.
2.2.3.1 Từ động vật
Protesae động vật thường có ở tụy tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ
dày…
Pancreatin gồm : Trysin, chymotrypsin và một enzyme khác có ở tụy tạng,
chúng được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tụy.
Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị.
Renin chỉ có ở ngăn thứ tư ở dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi, là enzyme
đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất fromage.
2.2.3.2 Từ thực vật
Enzyme protease từ thực vật có ở các thanh phần khác nhau của cây như
thân, lá và đặc biệt có nhiều ở quả .
Ví dụ:
Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh
Bromelin có trong thân cây thơm xanh và quả thơm xanh.
Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả.
2.2.3.3 Từ vi sinh vật
Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này
có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi cấy
(protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn các
protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và
được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y
dược.
Có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy các protease của vi sinh vật có
nguồn gốc khác nhau thì cũng có những tính chất khác nhau về nhiều mặt. Căn cứ vào
cơ chế phản ứng, pH hoạt động tối ưu,…Hartley (1960) đã phân loại các protease vi
sinh vật thành 4 nhóm cơ bản như sau :
Protease serine
Protease kim loại (metallo protease)
Protease acid
Protease tiol
2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease
Các protease nói chung cũng như protease vi sinh vật nói riêng được sử dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Trong sản xuất nước chấm : Nước mắm, tương, chao,…
Trong công nghệ thực phẩm : Làm mềm thịt, tăng hương vị thịt sau khi
chế biến,…
Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,…
Trong công nghệ tơ tằm : Làm bóng và tách rời các sợi tơ.
Trong hương mỹ phẩm : Người ta trộn một lượng nhỏ protease vào kem
xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ
dàng lớp tế bào già.
Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn. Đặc biệt ứng
dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải.
Trong công nghiệp sữa, các protease như renine, pepsine được dùng trong
sản xuất formate, sữa đông tụ.
Trong y học :
+ Protease được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật,
sản xuất huyết thanh miễn dịch.
+ Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh
mạch…
+ Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc
trưng.
+ Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những người bị
tiêu hóa kém…
Trong nông nghiệp : Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu
đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.
Trong kỹ nghệ phim ảnh : Protease từ vi khuẩn được dùng để tái sinh các
nguyên liệu như phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp
nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các
loại phim và giấy ảnh quý.
2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
2.3.1.1 Phân loại
2.3.1.2 Đặc điểm
Hình thái
Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển
rất mạnh (chiều ngang 5 – 7 m), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm
đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty.
Điều kiện phát triển :
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử : 45%.
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme : 55 - 58%.
Độ ẩm không khí : 85 -95%.
pH môi trường : 5,5 - 6,5.
Nhiệt độ nuôi cấy : 27 - 30C.
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt.
Để thu nhận chế phẩm protease từ vi sinh vật cũng như các enzyme khác có thể
dùng hai phương pháp nuôi cấy : phương pháp bề mặt và phương pháp bề sâu. Phương
pháp bề mặt thường dùng để nuôi cấy nấm mốc, phương pháp bề sâu thường dùng đối
với vi khuẩn.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật đã được
nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX. Lượng
enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với phương
pháp nuôi cấy chìm. Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những
nguyên liệu có nguồn gốc thực vật như cám mì, cám gạo, gạo, ngô…Khi nuôi cấy vi
sinh vật để thu nhận protease, người ta cho thêm bột đậu xanh hoặc bột đậu nành như
những cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của protease.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng
phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi
cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:
+ Nhiệt độ tăng rất chậm.
+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.
+ Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.
+ Khối môi trường còn rời rạc.
+ Enzym mới bắt đầu được hình thành.
Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt. Tuyệt đối
không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt.
Giai đoạn 2. Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ. Trong giai đoạn này
có những thay đổi cơ bản sau:
+ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển
rất mạnh. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi
trường, trong lòng môi trường.
+ Môi trường được kết lại khá chặt.
+ Độ ẩm môi trường giảm dần.
+ Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC.
+ Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của
nấm sợi.
+ Các loại enzym được hình thành và enzym nào có cơ chất cảm ứng trội
hơn sẽ được tạo ra nhiều hơn.
+ Lượng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai
đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng
29-30oC là tốt nhất.
Giai đoạn 3. Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có
một số thay đổi cơ bản như sau:
+ Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng
sẽ chậm lại.
+ Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí
môi trường xuống còn 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ. Nhiệt
độ nuôi duy trì ở 30C. Trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng
enzym sẽ giảm. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất
cần thiết.
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme. Chế phẩm này
được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn chứa
sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường). Người ta
thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm
enzyme thô không mất hoạt tính nhanh.
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử enzyme protease
2.5.1 Trích ly enzyme
Toàn bộ khối lượng chế phẩm enzyme thô đã sấy được đem đi nghiền nhỏ.
Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần
của chế phẩm thô. Khi thành tế bào bị phá vỡ, các enzyme ngoại bào và cả enzyme nội
bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào.
Các loại enzyme thủy phân hòa tan trong nước nên sau khi nghiền mịn, người
ta dùng nước, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, acetone).
Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này cho kết quả tốt và
dễ được dùng rộng rãi trong sản xuất. Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể
chiết được lượng enzyme trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất
không tan. Nước thường dùng khuyếch tán ở nhiệt độ 25 – 28C. (Lương Đức Phẩm,1998)
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly :
Tỷ lệ nước trích
Chế phẩm đã sấy khô cần nhiều nước để trích ly enzyme hơn chế phẩm
ẩm, tỷ lệ nước trên chế phẩm khác nhau sẽ trích được lượng enzyme khác nhau.
Lượng nước dùng để trích ly gấp từ 2 – 3,5 lần so với lượng chế phẩm nấm mốc.
Thời gian trích
Enzyme thủy phân dễ tan trong nước, thời gian trích ly càng lâu càng có
khả năng trích được nhiều enzyme hơn nhưng làm tăng lượng tạp chất trong dịch chiết
và giảm hoạt tính riêng của enzyme. Thời gian trích ly thích hợp khoảng 30 – 40 phút.
Nhiệt độ trích
Nhiệt độ trích ly càng tăng thì vận tốc trích ly càng tăng nhưng làm giảm
hoạt tính enzyme nên kéo theo giảm hoạt tính riêng của dịch enzyme. Nhiệt độ trích ly
tối thích là 20 – 30C.
Để tăng cường khả năng thu enzyme, chế phẩm được đánh tơi trước khi trích
để đạt được kích thước hạt 1 – 5 mm. Ngoài ra trong công nghiệp, thường dùng hệ
thống trích ly liên tục gồm nhiều thùng chứa chế phẩm nấm mốc, trong mỗi thùng sẽ
Sản phẩm enzyme
tinh khiết
trích được nhiều lần. Cách làm này giúp tăng hiệu suất thu enzyme, tăng chất khô và
hàm lượng enzyme trong dịch chiết thu được.
2.5.2 Quá trình tủa
Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô, vì trong đó còn chứa
nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Dung dịch enzyme thô
thường chứa một lượng enzyme không nhiều, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì
thế việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi những vật chất này.
Để làm được điều đó người ta phải tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác
nhân gây kết tủa. Tủa là phương pháp cô đặc enzyme hữu dụng và là bước ban đầu
trong tinh sạch enzyme. Bằng cách này người ta loại được một số protein tạp ở giai
đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme.
Nguyên tắc :
Enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung
môi.
Ở phân tử enzyme, các gốc ưa nước và kỵ nước thường nằm trên bề mặt.
Chúng quyết định mức độ hòa tan của enzyme ở những loại dung môi khác nhau.
Trong đó, các nhóm kỵ nước có xu hướng nằm trong lòng phân tử protein, một phần
không nhỏ nhóm này nằm trên bề mặt protein và có khả năng tiếp xúc với dung môi,
các nhóm này sẽ cùng với nhóm tích điện và các nhóm lưỡng cực khác có vai trò quyết
định đến tính chất enzyme.
Độ hòa tan của enzyme được coi là kết quả của tương tác lưỡng cực của chất
hòa tan với nước và tương tác ion của chúng với muối có trong dung dịch tạo thành
màng nước bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrate. Nếu loại bỏ các tương tác
này, các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau để tạo thành khối lớn, tách khỏi dung
dịch, thường gọi là tủa protein.
Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa, protein lại có
thể ở dạng tan (dung dịch keo) bền như trước thì được gọi là kết tủa thuận nghịch,
hoặc mất khả năng này gọi là kết tủa không thuận nghịch.
Những phản ứng kết tủa thuận nghịch protein
a) Kết tủa bằng muối
Khi cho thêm muối (amonium sulfate) vào dung dịch protein, các phân tử
muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nước khỏi protein,
do vậy các phân tử protein có khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại.
Khi cho một lượng muối đủ lớn vào thì protein sẽ bắt đầu tủa. Nếu quá trình
này thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính.
Sau đó thu protein bằng cách ly tâm và hòa tan vào dung dịch đệm có nồng độ muối
thấp.
Phương pháp này thường được sử dụng để tách chiết protein hòa tan. Nó
cũng được sử dụng để thu phân đoạn các protein khác nhau trong hỗn hợp, vì các phân
tử protein lớn có khuynh hướng kết tủa trước, các phân tử nhỏ hơn vẫn còn nằm trong
dung dịch. Vì thế chúng ta có thể tìm ra điều kiện mà có thể thu protein ta đang nghiên
cứu nhiều nhất trong hỗn hợp nhiều protein nhờ phân tích các đoạn ở nồng độ muối
khác nhau.
Như vậy với quá trình này ta có thể thu được protein mong muốn một cách
tinh sạch hơn.
b) Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một
trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung những phân tử dung môi
có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulfoxid) có thể ổn định các tương tác
giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của
protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (acetone,
ethanol) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường. Do đó độ hòa
tan của các phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do làm giảm hằng số điện môi
hiện hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan
trong nước (như acetone) vào dung dịch chứa protein.
Sự kết tủa bằng acetone hoặc ethanol 960
có nhiều thuận lợi do tương đối rẻ,
có sẵn dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzyme. Do
nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme
bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió.
Có thể xảy ra hiện tượng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung
môi hữu cơ. Nguyên nhân là do, khi hằng số điện môi giảm, phân tử protein có thể tự
tháo gỡ và trở thành dạng không hoạt động, trong khi đó các gốc kỵ nước lại tiếp xúc
với dung môi. Hiện tượng này xảy ra khi tiến hành tủa ở nhiệt độ phòng. Khi tiến hành
kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ, ta bắt
buộc phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme.
Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt dung môi hữu cơ thường
mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ.
Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 –
100
C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định
bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch
enzyme.
2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký
Sắc ký sinh học là phương pháp nhẹ nhàng để tinh sạch các phân tử sinh
học, đặc biệt là protein mà vẫn duy trì hoạt tính của chúng. Các kỹ thuật sắc ký tinh
sạch protein dựa vào các đặc tính vật lý của chúng.
Bảng 2.1 : Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính vật lý của protein
Đặc tính Kỹ thuật
Điện tích Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography)
Sự phân cực o Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography)
o Sắc ký giấy.
o Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography)
o Sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction
Chromatography – HIC)
Kích thước Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography)
Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của ligand)
Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography)
Hơn 40 năm qua kể từ khi việc đưa vào thị trường sản phẩm thương mại
SephadexTM, kỹ thuật sắc ký lọc gel đã đóng một vai trò quan trọng trong việc tinh
sạch enzyme, polysaccharide, nucleic acid, protein và các đại phân tử sinh học khác.
Nguyên tắc :
Lọc gel là phương pháp đơn giản nhất trong tất cả các loại sắc ký. Kỹ thuật
này dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng khác nhau bằng cách cho
chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel
sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển
bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp (thôi) ra khỏi cột sớm
hơn các phân tử nhỏ. Kỹ thuật này có thể áp dụng theo hai cách :
a) Phân tách nhóm (Group separations)
Các thành phần của một mẫu được phân tách thành hai nhóm chính theo
phạm vi kích thước. Sự phân tách nhóm được sử dụng để loại các phân tử lớn hay các
phân tử tạp chất nhỏ (như đỏ phenol khỏi dịch nuôi cấy) hoặc để loại muối hoặc trao
đổi đệm.
b) Phân đoạn các phân tử sinh học với độ phân giải cao (High resolution
fractionation of biomolecules)
Các thành phần của cùng một mẫu được phân tách theo sự khác biệt về kích
thước phân tử của chúng. Phân tách với độ phân giải cao có thể được dùng để cô lập
một hoặc nhiều thành phần, để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, để xác
định trọng lượng phân tử hoặc để phân tích sự phân bố theo trọng lượng phân tử.
ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel
a) ưu điểm
Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh
học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác
động (cofactor) và các điều kiện môi trường khắc nghiệt.
Sự phân tách có thể được thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các
cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cường độ
ion cao hoặc thấp, ở 370
C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí
nghiệm.
Kỹ thuật này cho phép thu lại lượng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và
dễ dàng khử muối.
b) Nhược điểm
- Chậm (tốc độ thấp = thời gian dài)
- Yêu cầu các cột có kích thước lớn tương đối so với lượng mẫu.
- Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, thường khó
đạt được sản phẩm tinh khiết hoàn toàn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thường được sử
dụng với những kỹ thuật khác nhau như sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ.
Một số thông số vật lý của phương pháp
Giới hạn tách (Exclusion Limit-EL) : Là khối lượng phân tử (MW) nhỏ nhất
không chui vào bên trong hạt gel, như vậy tất cả chúng sẽ bị thổi cùng một lượt ra khỏi
cột. Thí dụ G-50 có giới hạn tách 30.000 Da, có nghĩa là các phân tử lớn hơn 30.000
Da đều không chui vào hạt gel.
Phạm vi tách (Fraction Range-FR) : Thí dụ Sephadex G-50 có giới hạn tách
từ 1.500-30.000 Da, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ được
phân tách dễ dàng bởi Sephadex G-50.
Độ ngậm nước (Water Regain-WR) : Là trọng lượng nước mà 1g bột gel khô
hút nước. Thí dụ G-50 có WR là 5 0,3 g. Giá trị này chưa tính đến lượng nước bao
quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích cột.
Thể tích nền : Là thể tích cuối cùng mà 1g bột gel khô hấp thụ khi trương nở
trong nước. G-50 có thể tích nền 9-11 ml/g gel khô.
Hạt gel : hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thước hạt xác định bằng mesh
hoặc đường kính hạt theo m. Hạt có kích thước lớn (50-100 mesh, 100-300 m) cho
tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhưng kết quả tách thấp. Ngược lại những hạt mịn (400
mesh, 10-40 m) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thường
người ta chọn hạt gel có kích thước 100-200 mesh, 50-150 m.
Thể tích trống : Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột xác
định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Da.
Thể tích thổi : Là thể tích đệm cần thiết để rửa thổi chất cần tách ra khỏi cột.
Phân tách bằng sắc ký lọc gel
Để phân tách, môi trường lọc gel được nhồi trong cột để tạo nền nhồi. Môi
trường này là một chất nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, loại hạt này được chọn vì tính ổn
định về vật lý và hóa học của chúng, và tính trơ (thiếu các đặc tính hấp phụ và phản
ứng).
Nền nhồi được cân bằng bằng dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các lỗ
của chất nền và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong các lỗ đôi khi được
xem như phase tĩnh và chất lỏng này ở trạng thái cân bằng với chất lỏng bên ngoài các
hạt, được xem như phase động. Cần lưu ý rằng, mẫu được giải hấp một cách đồng nhất
(isocraticlly), nghĩa là không cần sử dụng các loại đệm khác nhau trong quá trình phân
tách. Tuy nhiên, bước rửa giải dùng loại đệm đang chạy thường bao gồm ở thời điểm
kết thúc của quá trình phân tách, làm cho việc loại bỏ bất kỳ loại phân tử nào còn lưu
trong cột được dễ dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp.
Quá trình lọc gel
1. Các hạt hình cầu của môi trường lọc gel được nhồi trong cột.
2. Mẫu được nạp vào cột.
3. Dung dịch đệm (phase động) và mẫu di chuyển qua cột. Các phân tử
khuếch tán trong và ngoài các lỗ của chất nền (cũng được miêu tả như quá trình phân
đoạn mẫu giữa phase động và phase tĩnh). Các phân tử nhỏ hơn di chuyển vào sâu
trong chất nền hơn và do đó lưu lại trong cột lâu hơn.
4. Khi dung dịch đệm di chuyển liên tục qua cột, các phân tử lớn hơn kích
thước lỗ gel không thể khuyếch tán vào trong các lỗ và di chuyển qua cột. Các phân tử
nhỏ hơn khuyếch tán vào trong lỗ gel và bị trì hoãn trong quá trình di chuyển xuống
dưới đáy cột.
5. Các phân tử lớn rời cột trước nhất sau đó là các phân tử nhỏ hơn theo trình
tự kích thước của chúng. Quá trình phân tách hoàn toàn xảy ra khi một lượng dung
môi bằng tổng thể tích cột (tương đương với thể tích nền nhồi) di chuyển qua môi
trường lọc gel.
2.5.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện di
SDS – PAGE
Sau khi qua các bước ly trích và tinh sạch, người ta thường kiểm tra lại độ tinh
sạch của protein nhờ kỹ thuật điện di. Nhờ kỹ thuật này ta còn có thể xác định trọng
lượng phân tử và độ tinh sạch của chúng.
Điện di trên gel là tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, protein) bằng cách
cho đi qua chất nền là gel trong một điện trường.
Kĩ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis) là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của
SDS.
Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử
acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa được xúc tác
bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS); N, N ,N’, N’ - tetramethylenediamine
(TEMED).
Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích thước
của lỗ gel.Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử
sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide :
nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích
thước lớn và ngược lại.
SDS là tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ
thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là
mercaptoethanol.Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2,3,4 được biến đổi
thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó,
sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những
phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi
đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử
tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển
về cực âm của điện trường.
Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một
thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác
nhau đã biết.
Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự
phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên
tục (discontinuous gel). Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp:
Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên) : các protein trong mẫu được dồn lại
và tạo một lớp băng mỏng.
Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới) : tạo ra các băng protein có
trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu.
Hai lớp gel này được phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide
và vị trí.
Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng
lượng phân tử từ 10.000-200.000 daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn
hơn 200.000 daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide hơn 2,5%.
MỤC LỤC
Bìa ..................................................................................................................................... i
Trang tựa .......................................................................................................................... ii vi
Lời cảm tạ ...................................................................................................................... iii
Tóm tắt khóa luận ........................................................................................................... iv
Mục lục ............................................................................................................................ v
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... viii
Danh sách các bảng ........................................................................................................ ix
Danh sách các hình và đồ thị .......................................................................................... xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Mục đích nghiên cứu ................................................................................................. 2
1.3 Yêu cầu ...................................................................................................................... 2
2.1 Khái quát chung về enzyme ...................................................................................... 3
2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme ........................................................... 3
2.1.2 Định nghĩa về enzyme ............................................................................................ 5
2.1.3 Phân loại enzyme .................................................................................................... 6
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme ........................ 7
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme ................................................................................................. 7
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme ......................................... 7
2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống .......................................... 9
2.1.5.1 Nguồn thu nhận ................................................................................................... 9
2.1.5.2 Vai trò ................................................................................................................ 11
2.2 Khái quát chung về enzyme protease ...................................................................... 11
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease ................................................................................ 11
2.2.2 Lược sử phát triển các enzyme protease .............................................................. 12
2.2.2.1 Protease từ động vật .......................................................................................... 12
2.2.2.2 Protease từ thực vật ........................................................................................... 12
2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật ........................................................................................ 13
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease......................................................................... 13
2.2.3.1 Từ động vật ........................................................................................................ 13
2.2.3.2 Từ thực vật ......................................................................................................... 13
2.2.3.3 Từ vi sinh vật ..................................................................................................... 14
2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease ............................................................................ 14
2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ...................................... 15
2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................... 15
2.3.1.1 Phân loại ........................................................................................................... 15
2.3.1.2 Đặc điểm ............................................................................................................ 15
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt ................................ 16
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử enzyme protease ................................. 18
2.5.1 Trích ly enzyme .................................................................................................... 19
2.5.2 Quá trình tủa ........................................................................................................ 20
2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký ....................................................... 22
2.5.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện di SDS –
PAGE ............................................................................................................................. 27
PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP ................................................................ 29
3.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................................. 29
3.2 Vật liệu .................................................................................................................... 29
3.2.1 Chế phẩm enzyme thô .......................................................................................... 29
3.2.2 Hóa chất ................................................................................................................ 29 vii
3.2.3 Thiết bị .................................................................................................................. 29
3.3 Phương pháp thí nghiệm .......................................................................................... 30
3.3.1 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 30
3.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme của dịch chiết enzyme
thô .................................................................................................................................. 30
3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ưu để tủa
enzyme protease ............................................................................................................ 36
3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của protease .... 37
3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel...................................... 37
3.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lượng phân tử enzyme bằng phương pháp điện
di SDS – PAGE ............................................................................................................. 41
3.4 Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 44
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.......................................................................... 45
4.1 Hàm lượng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô ................................................ 45
4.2 Nồng độ muối (NH4)2SO4 tối ưu cho việc tủa protease .......................................... 45
4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 46
4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 48
4.3 Tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa protease ..................................................................... 49
4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 49
4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 51
4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 960
và tủa bằng muối (NH4)2SO4 .................... 53
4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease...................... 54
4.5.1 pH tối ưu ............................................................................................................... 54
4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae ........................................................ 54
4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki .................................................... 54
4.5.2 Nhiệt độ tối ưu ...................................................................................................... 55
4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ..................................................................... 55
4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................ 56
4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel ................................................................................... 56
4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae ................................................................................... 57
4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki .............................................................................. 59
4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc
Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki ................................................................. 62
4.7.1 Tủa protease bằng muối ........................................................................................ 62
4.7.2 Tủa protease bằng cồn .......................................................................................... 62
4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phương pháp điện di trên gel SDS –
PAGE ............................................................................................................................. 63
PHẦN 5 : KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 67
5.1 Kết luận.................................................................................................................... 67
5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................................... 67
5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki ................................................................ 67
5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki .......................... 68
5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 69
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 70
sản xuất enzyme đó là khả năng to lớn của vi sinh vật - những nhà máy chế tạo
enzyme. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh do đó có khả năng tạo ra
một lượng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme do chúng
tạo ra có hoạt lực cao và chúng ta có thể tận dụng các phế thải của ngành khác để làm
môi trường nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme.
Protease là một trong những nhóm enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và
phổ biến trong đời sống. Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học…Hoạt tính của
enzyme nói chung và của protease nói riêng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Điều
kiện tối thích để mỗi loại enzyme hoạt động là khác nhau. Do đó, để sử dụng enzyme
hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu cho hoạt động của enzyme đó.
Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính protease và tìm hiểu về kĩ thuật sắc ký lọc gel dùng
trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài :“Khảo sát hoạt tính và tinh
sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus
kawasaki trên môi trường bán rắn”.
Aspergillus oryzae từ lâu đã được dùng như là nguồn vi sinh vật được nuôi
cấy để thu nhận enzyme protease. Tuy nhiên, đối với Aspergillus kawasaki thì người ta
chỉ biết đến như là nguồn vi sinh vật để thu nhận amylase. Do đó, qua đề tài, chúng ta
có thể đánh giá được hiệu quả sử dụng protease của chủng Aspergillus kawasaki.
PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Khái quát chung về enzyme
2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme
Từ trước thế kỷ 17, khi loài người hoàn toàn chưa hiểu biết gì về ezyme,
người ta đã biết sử dụng rộng rãi các quá trình enzyme trong hoạt động thực tế như
làm bánh mì, làm bia, rượu,…Việc ứng dụng enzyme trong giai đoạn này hoàn toàn có
tính chất kinh nghiệm thuần túy và sử dụng enzyme thông qua hoạt động sống của tế
bào vi sinh vật.
Ngay từ thế kỷ 17, các nhà khoa học đã quen dùng từ “ferment” do nhà khoa
học người Hà Lan Van Heltmon đề xướng. Theo nghĩa tiếng La Tinh thì “fermentatio”
nghĩa là sự lên men, đó cũng là nguồn gốc của từ “ferment”. Theo ý kiến của ông, yếu
tố tham gia tích cực vào quá trình lên men rượu là “ferment”. Yếu tố đó là gì thì còn là
điều bí ẩn. Các nhà khoa học đã không vừa lòng với hiểu biết này và đã đi sâu vào
thực nghiệm, quan sát, mô tả.
Đến nửa cuối thế kỷ 18 bắt đầu có những thí nghiệm đầu tiên thô sơ và đơn
giản chứng minh tác dụng của men tiêu hóa được nhà tự nhiên học người Pháp
Réaunur tiến hành vào năm 1713 và được Spallanzani người Ý khẳng định lại một
cách chặt chẽ hơn vào năm 1783 với tác dụng của dịch dạ dày phân hủy thịt.
Năm 1814, viện sĩ viện hàn lâm khoa học Petecbua là Kirchov người Nga
làm thí nghiệm chứng minh nước chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển
hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ 40 – 60C .
Năm 1817 hai nhà khoa học Manaxenia (Nga) và Buchner (Đức) đã làm thí
nghiệm thành công quá trình lên men bằng chất dịch vô bào từ nấm men. Nhà sinh lý
học thực vật K.Tinniriazev đã viết “Không còn nghi ngờ gì nữa, lần đầu tiên người ta
đã chứng minh được rằng hiện tượng lên men chung quy chỉ là một quá trình hóa học,
nó có thể dễ dàng lập lại ngoài cơ thể sống nhờ những enzyme hòa tan chiết xuất từ
những tế bào đã bị phá hủy cấu trúc”.
Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là A.Payen và J.Person thu nhận
được chế phẩm enzyme amylase ở dạng kết tủa bằng cách thêm cồn vào dịch chiết từ
hạt lúa nảy mầm. Kết tủa này có khả năng phân giải tinh bột thành đường và được gọi
là diastase. Đây là thực nghiệm đặt nền móng cho các tiến bộ trong lĩnh vực enzyme
vào nửa sau thế kỷ 19.
Năm 1835, Berzelius lần đầu tiên đã đề ra khả năng giải thích tác dụng của
enzyme trên cơ sở hóa học. Ông gọi hiện tượng làm tăng quá trình phản ứng là sự xúc
tác và chất gây ra hiện tượng này là chất xúc tác.
Năm 1856, Pasteur đã tiến hành nghiên cứu bản chất của quá trình lên men
rượu. Theo ông, chính nấm men hay vi khuẩn lên men mà ta nhìn thấy dưới kính hiển
vi là nguyên nhân gây ra hiện tượng lên men rượu . Ông cho rằng chỉ có nấm men hay
vi khuẩn còn sống mới có thể thực hiện quá trình lên men. Từ đó dẫn đến hai khái
niệm mâu thuẫn nhau : men hữu hình (ferment hữu hình ) và men không nhìn được
(ferment hòa tan).
Năm 1862, nhà khoa học người Nga Danilevxki đã sử dụng một kỹ thuật đặc
biệt để tách chiết trypsine ra khỏi hỗn hợp với amylase trong dịch tụy bằng kỹ thuật
“phương pháp hấp thụ chọn lọc enzyme” (tức là gắn enzyme lên bề mặt chất đỡ) và
“phản hấp thụ” (nghĩa là giải phóng enzyme ra khỏi bề mặt chất đỡ) rồi kết tinh. Hiện
nay chúng ta gọi đó là một dạng của “kỹ thuật sắc ký ”.
Năm 1894, nhà khoa học người Pháp G.Bertrand phát hiện ra một loại enzyme
mới là enzyme oxy hóa với việc phát hiện ra enzyme lacasae trong nhựa mủ cây sơn ta
Rhus succedanea.
Từ những thành tựu ban đầu đó, enzyme bắt đầu được chú ý nghiên cứu nhiều
hơn vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20. Liên tiếp trong những năm 1930, 1931 hai nhà
khoa học D.Northop và M.Kunitz đã tách được pepsine và trypsine dưới dạng tinh thể.
(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
Năm 1913, hai nhà khoa học L.Michalis và Menten đã nghiên cứu cơ chế xúc
tác nhờ enzyme có sử dụng chất đồng vị, sử dụng phương pháp quang học và phương
pháp hóa học nghiên cứu các nhóm hoạt động của enzyme đã đem lại cho chúng ta
“phương trình Michalis-Menten” nổi tiếng trong nghiên cứu động học của enzyme.
(Nguyễn Hữu Chấn, 1984).
Hiện nay enzyme đã trở thành một ngành khoa học mũi nhọn phát triển rất
nhanh trên thế giới phân nhánh rất nhiều và liên quan chặt chẽ tới các ngành như hóa
lý, hóa sinh, vi khuẩn, vi sinh học, sinh lý, y học,…Hàng năm trên thế giới xuất bản
hàng chục nghìn công trình nghiên cứu về cơ chế tác dụng của enzyme, các phương
pháp tách chiết và tinh chế, sự điều hòa về rối loạn hoạt động của cơ thể ở trạng thái
sinh lý và bệnh lý.
2.1.2 Định nghĩa về enzyme
Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có hoạt tính xúc tác sinh học, do
tế bào sống tiết ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau
phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác. (Nguyễn Tiến Thắng, 2004)
Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể
sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với
tốc độ nhịp nhàng, có trật tự, theo những chiều hướng xác định. Pavlôv đã nói : “Hoạt
động đầu tiên của enzyme là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống. Không có sự sống
nào lại không có quá trình enzyme”. Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa của
Anghen : “Sự sống, đó là phương thức tồn tại của thể protein”. (Lê Ngọc Tú và ctv,
1982).
Enzyme có trong mọi tế bào, mọi mô của mọi sinh vật nhưng mỗi loại mô, mỗi
loại tế bào thường có những hệ thống enzyme đặc biệt. Các enzyme không chỉ tham
gia xúc tác các phản ứng sinh học trong cơ thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng
ngoài tế bào (in vitro). (Nguyễn Hữu Chấn, 1984).
Enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp
suất thấp và nhiệt độ bình thường của cơ thể. Trong khi đó các chất xúc tác hóa học
cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Hơn nữa, các enzyme có khả năng chọn
lựa cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng.
(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
Các loại enzyme trong cơ thể được tổng hợp, hoạt động một cách rất hài hòa để
sao cho các chất ban đầu được chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng thành một mắt
xích hoàn chỉnh. Sự trục trặc nào đó ở một trong toàn bộ mắt xích này sẽ làm rối loạn
cho cả hệ thống. Trong khi đó điều khiển tổng hợp và hoạt động của enzyme lại do
gen. Mỗi một gen chịu trách nhiệm điều khiển tổng hợp một enzyme. (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh học có thể tóm tắt
như sau :
Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng
sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất.
Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển
hóa rất cao.
Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản
ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.
Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít.
Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lượng
enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy
ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi
enzyme.
Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Ngày nay các nhà khoa
học đã tìm ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này
là rất nhỏ so với số lượng có thật trong mỗi tế bào. Trong hơn 1000 loại enzyme đã
biết, loài người mới thu nhận và kết tinh được khoảng 200 loại. (Nguyễn Đức Lượng,
2002).
2.1.3 Phân loại enzyme
Khi số lượng enzyme được phát hiện còn ít, người ta đặt tên enzyme theo ý
thích từng người tìm ra nó. Dần dần theo thời gian, số lượng enzyme tìm ra ngày càng
nhiều nên cần có một hệ thống phân loại theo quy ước quốc tế. Enzyme được phân loại
theo tính chất của nó, được xếp vào từng nhóm nhỏ tương ứng với các enzyme có bản
chất tương tự nhau, làm cho việc tìm hiểu và nghiên cứu trở nên dễ dàng hơn.
Theo quy ước quốc tế, tên gọi của enzyme thường được đặt theo cơ chất đặc
hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó, tên enzyme
thường có hai phần. Phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân các phản
ứng. Tuy nhiên, có nhiều enzyme theo thói quen vẫn được gọi theo tên cũ, không theo
hệ thống như trypsine, pepsine.
Năm 1930, Hiệp Hội Hóa Sinh Quốc Tế (IOB) đã thống nhất phân loại enzyme
ra làm 6 lớp và được đánh số thứ tự từ một đến sáu. Các số thứ tự này là cố định cho
mỗi lớp. Mỗi lớp lại chia làm nhiều tổ, mỗi tổ có nhiều nhóm. Chính vì thế theo hệ
thống phân loại, mỗi enzyme thường có bốn số : số thứ tự một chỉ lớp, số thứ tự hai
chỉ tổ, số thứ ba chỉ nhóm, số thứ tư chỉ enzyme. Tên của các lớp, tổ và nhóm như sau
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme
Hoạt tính xúc tác của enzyme là do cấu trúc không gian ba chiều của các
phân tử protein quyết định. Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, gấp hàng trăm,
hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác.
Tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau
như nồng độ enzyme, bản chất và nồng độ của các chất phản ứng (cơ chất), nhiệt độ,
pH môi trường, nồng độ ion trong môi trường, nồng độ các chất kìm hãm, các chất
hoạt hóa enzyme. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh huởng đến vận tốc phản ứng enzyme.
a) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc bậc nhất vào nồng
độ enzyme. Đường biểu diễn có dạng như ở hình 2.1
b) Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ enzyme được giữ cố định và
nồng độ cơ chất thay đổi, người ta nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi nồng độ cơ
chất tăng. Khi nồng độ cơ chất tiếp tục gia tăng, đường biểu diễn uốn cong và với
nồng độ cơ chất cao thì vận tốc không còn gia tăng nữa và đường biểu diễn tiệm cận
với giá trị vmax.
c) Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng
enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng
chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ
giảm và dẫn đến mức triệt tiêu.
Nếu đưa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị
giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính.
Ngược lại, ở nhiệt độ 0C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi
đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức tối ưu.
Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), người ta
thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tương ứng với hai hiện tượng khác nhau :
Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 400
C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng.
Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng.
Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme, ở vào khoảng 450C),
vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80
– 100C.
Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ
chất, pH, lực ion của môi trường.
d) Ảnh hưởng của pH
Sự thay đổi pH gây nên :
Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptid của
enzyme, do đó làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ
chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptid của enzyme.
Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn
cản sự tạo thành enzyme – cơ chất trong trường hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất phải ở
dưới dạng ion.
Như vậy, hoạt tính của enzyme phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trường. Đó là vì
pH môi trường có ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và trung tâm
hoạt động của nó, phức chất enzyme – cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của enzyme.
Người ta có thể xác định một giới hạn pH tối ưu cho hoạt động của một
enzyme. Ngoài pH tối ưu, vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng. Điều này cho thấy
tầm quan trọng của môi trường phản ứng trong quá trình nghiên cứu các phản ứng
enzyme in vitro.
Mỗi một enzyme có một pH tối ưu khác nhau, có thể rất acid (từ 1,5 -2),
hoặc rất kiềm (9,5 – 10). pH tối ưu của đa số các enzyme vào khoảng chung quanh giá
trị trung tính (6 – 8). Tuy nhiên pH tối ưu của một enzyme cũng không cố định mà phụ
thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như bản chất và nồng độ cơ chất, tính chất dung dịch
đệm, nhiệt độ.
2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống
2.1.5.1 Nguồn thu nhận
Enzyme được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : động vật (pepsin từ dạ
dày, trypsin từ tụy tạng…), từ thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ
thơm…). Tuy nhiên không thể dùng hai nguồn này làm nguyên liệu để sản xuất với
quy mô công nghiệp lớn các chế phẩm enzyme nhằm thỏa mãn các nhu cầu của nền
kinh tế quốc dân. Như vậy trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu
vi sinh vật (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn. Enzyme thu
nhận từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa các
enzyme từ động vật và thực vật :
Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với một lượng
lớn và có thể mở rộng để sản xuất tới phạm vi cần thiết, đồng thời việc thu chế phẩm
cũng dễ dàng và có thể thỏa mãn trong một mức độ lớn nhu cầu của các ngành công
nghiệp khác nhau.
Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Do đó vi sinh vật có thể đồng
hóa bất kỳ chất nào trong thiên nhiên. Trong khi đó có nhiều chất mà thực vật và động
vật không thể đồng hóa được.
Enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác.
Do vậy chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất.
Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ,
kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quá trình sản xuất
chế phẩm enzyme khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao.
Phần lớn thức ăn để nuôi cấy vi sinh vật dễ kiếm và rẻ tiền. Đa số vi sinh
vật cho enzyme thường có khả năng phát triển trên môi trường đơn giản, rẻ tiền như
các phụ phế liệu, phế phẩm của các nghành sản xuất.
ưu việt lớn của sự thu enzym từ vi sinh vật là có khả năng tăng cường
sinh tổng hợp các enzym nhờ chọn giống khi tạo được những biến chủng có hoạt lực
cao. Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động môi trường, có khả năng thích ứng với
nguồn dinh dưỡng. Vì vậy, khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác động
lên chúng bằng các tác nhân khác nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzym cũng như
hoạt tính của chúng và tăng tối đa sự sinh tổng hợp các enzym trong vi sinh vật nuôi
cấy. Điều đó cho phép ta có thể tạo được những enzym theo ý muốn, dễ dàng thu nhận
được enzym có độ thuần khiết cao.
2.1.5.2 Vai trò
Cùng với những thành tựu đạt được trong nghiên cứu lí thuyết về enzym, các
nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tế ngày càng được mở rộng và đạt hiệu quả
cao. Các chế phẩm enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như
trong hoá phân tích để định tính, định lượng các chất trong nông nghiệp, y học, công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược liệu, công nghiệp nhẹ như công nghiệp dệt, công
nghiệp da.
Trong y học có thể sử dụng enzym tinh chế để chữa bệnh, sản xuất các
sinh tố và các chất kháng sinh.
Sử dụng chế phẩm enzym trong nông nghiệp để chế biến các sản phẩm
nông nghiệp sản xuất thức ăn cho động vật đặc biệt là động vật còn non, xử lý hạt
trước khi gieo.
Trong công nghiệp thực phẩm, chế phẩm enzym được sử dụng khá rộng
rãi trong nhiều ngành chế biến khác nhau : chế biến thịt, cá, sữa, công nghiệp sản xuất
bánh mì và các thứ bánh kẹo khác. Sử dụng chế phẩm enzym thường làm tăng nhanh
quá trình chế biến, tăng hương vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Ngoài ra, sử
dụng enzym còn có thể tái tạo hương vị của các loại rau quả tươi sau khi chế biến.
Ngày nay, người ta cũng đã đạt được nhiều kết quả trong việc sử dụng một số enzyme
trong bảo quản đồ hộp và một số nguyên liệu khác.
2.2 Khái quát chung về enzyme protease
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân
liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do,
một ít peptid ngắn, pepton.
2.2.2 Lược sử phát triển các enzyme protease
2.2.2.1 Protease từ động vật
Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn
cả.
Từ thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp là Reaunur đã làm thí nghiệm
rất đơn giản và đã phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu
hóa thịt.
Năm 1836, Schwam đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch
vị. Tuy nhiên, mãi đến hơn 30 năm sau người ta mới tách được enzyme này.
Năm 1857, Corvisart tách được trypsine từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên
thu nhận được ở dạng chế phẩm, trong chế phẩm vẫn còn lẫn nhiều protein khác.
Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp phụ trên colondion đã tách
được trypsine với amylase tụy tạng. Phương pháp này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên
cứu tinh chế enzyme và protein.
Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm chymotrypsine (renin).
Ngoài những enzyme của hệ tiêu hóa, các nhà khoa học cũng có những
nghiên cứu đầu tiên về protease trong máu. Schidt đã nêu giả thiết rằng trong máu có
enzyme fibrin (ngày nay gọi là trombin) tham gia trong quá trình đông máu. Ông đã
tiến hành việc tách chiết enzyme này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm nhận được có tác
dụng làm cho dung dịch fibrinogen đông lại nhanh chóng.
2.2.2.2 Các protease từ thực vật
So với các protease từ động vật, các protease từ thực vật được phát hiện
muộn hơn.
Năm 1874, Group – Besanez công bố đã nhận được protease từ hạt của một
loại đậu. Họ cũng nhận thấy dịch chiết từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có hoạt động
phân giải protein. Ý kiến này dựa trên cơ sở thực nghiệm là sau khi cho dịch chiết từ
các nguyên liệu trên tác dụng với fibrin, nuớc lọc của hỗn hợp cho phản ứng màu
Biure.
Bằng chứng này không thật sự vững chắc nên Group – Besanez không tiếp
tục nghiên cứu. Vì vậy Wurtz được xem như là người đầu tiên tách chiết thành công
protease từ thực vật (1879). Ông nêu lên rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có
chứa protease, khi dùng cồn để kết tủa sẽ thu nhận được một chế phẩm enzyme không
tinh khiết (100g/1 cây) gọi là papain.
2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật
Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950,
mặc dầu từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein
của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay, số công trình nghiên cứu protease vi vinh vật
tăng lên đáng kể, nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease của động vật và thực
vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp
phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế.
Trong thời gian gần đây người ta cũng đã có những phương pháp thích hợp
để nhận chế phẩm không tan của protesae. Kết quả này mở ra triển vọng to lớn trong
nghiên cứu và các ứng dụng của các protease.
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease
Các enzyme protesae như đã nói ở trên được thu nhận từ nhiều nguồn khác
nhau.
2.2.3.1 Từ động vật
Protesae động vật thường có ở tụy tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ
dày…
Pancreatin gồm : Trysin, chymotrypsin và một enzyme khác có ở tụy tạng,
chúng được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tụy.
Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị.
Renin chỉ có ở ngăn thứ tư ở dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi, là enzyme
đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất fromage.
2.2.3.2 Từ thực vật
Enzyme protease từ thực vật có ở các thanh phần khác nhau của cây như
thân, lá và đặc biệt có nhiều ở quả .
Ví dụ:
Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh
Bromelin có trong thân cây thơm xanh và quả thơm xanh.
Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả.
2.2.3.3 Từ vi sinh vật
Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này
có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi cấy
(protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn các
protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và
được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y
dược.
Có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy các protease của vi sinh vật có
nguồn gốc khác nhau thì cũng có những tính chất khác nhau về nhiều mặt. Căn cứ vào
cơ chế phản ứng, pH hoạt động tối ưu,…Hartley (1960) đã phân loại các protease vi
sinh vật thành 4 nhóm cơ bản như sau :
Protease serine
Protease kim loại (metallo protease)
Protease acid
Protease tiol
2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease
Các protease nói chung cũng như protease vi sinh vật nói riêng được sử dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Trong sản xuất nước chấm : Nước mắm, tương, chao,…
Trong công nghệ thực phẩm : Làm mềm thịt, tăng hương vị thịt sau khi
chế biến,…
Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,…
Trong công nghệ tơ tằm : Làm bóng và tách rời các sợi tơ.
Trong hương mỹ phẩm : Người ta trộn một lượng nhỏ protease vào kem
xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ
dàng lớp tế bào già.
Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn. Đặc biệt ứng
dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải.
Trong công nghiệp sữa, các protease như renine, pepsine được dùng trong
sản xuất formate, sữa đông tụ.
Trong y học :
+ Protease được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật,
sản xuất huyết thanh miễn dịch.
+ Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh
mạch…
+ Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc
trưng.
+ Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những người bị
tiêu hóa kém…
Trong nông nghiệp : Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu
đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.
Trong kỹ nghệ phim ảnh : Protease từ vi khuẩn được dùng để tái sinh các
nguyên liệu như phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp
nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các
loại phim và giấy ảnh quý.
2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.
2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
2.3.1.1 Phân loại
2.3.1.2 Đặc điểm
Hình thái
Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển
rất mạnh (chiều ngang 5 – 7 m), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm
đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty.
Điều kiện phát triển :
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử : 45%.
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme : 55 - 58%.
Độ ẩm không khí : 85 -95%.
pH môi trường : 5,5 - 6,5.
Nhiệt độ nuôi cấy : 27 - 30C.
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt.
Để thu nhận chế phẩm protease từ vi sinh vật cũng như các enzyme khác có thể
dùng hai phương pháp nuôi cấy : phương pháp bề mặt và phương pháp bề sâu. Phương
pháp bề mặt thường dùng để nuôi cấy nấm mốc, phương pháp bề sâu thường dùng đối
với vi khuẩn.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật đã được
nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX. Lượng
enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với phương
pháp nuôi cấy chìm. Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những
nguyên liệu có nguồn gốc thực vật như cám mì, cám gạo, gạo, ngô…Khi nuôi cấy vi
sinh vật để thu nhận protease, người ta cho thêm bột đậu xanh hoặc bột đậu nành như
những cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của protease.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng
phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi
cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:
+ Nhiệt độ tăng rất chậm.
+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.
+ Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.
+ Khối môi trường còn rời rạc.
+ Enzym mới bắt đầu được hình thành.
Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt. Tuyệt đối
không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt.
Giai đoạn 2. Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ. Trong giai đoạn này
có những thay đổi cơ bản sau:
+ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển
rất mạnh. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi
trường, trong lòng môi trường.
+ Môi trường được kết lại khá chặt.
+ Độ ẩm môi trường giảm dần.
+ Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC.
+ Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của
nấm sợi.
+ Các loại enzym được hình thành và enzym nào có cơ chất cảm ứng trội
hơn sẽ được tạo ra nhiều hơn.
+ Lượng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai
đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng
29-30oC là tốt nhất.
Giai đoạn 3. Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có
một số thay đổi cơ bản như sau:
+ Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng
sẽ chậm lại.
+ Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí
môi trường xuống còn 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ. Nhiệt
độ nuôi duy trì ở 30C. Trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng
enzym sẽ giảm. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất
cần thiết.
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme. Chế phẩm này
được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn chứa
sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường). Người ta
thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm
enzyme thô không mất hoạt tính nhanh.
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử enzyme protease
2.5.1 Trích ly enzyme
Toàn bộ khối lượng chế phẩm enzyme thô đã sấy được đem đi nghiền nhỏ.
Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần
của chế phẩm thô. Khi thành tế bào bị phá vỡ, các enzyme ngoại bào và cả enzyme nội
bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào.
Các loại enzyme thủy phân hòa tan trong nước nên sau khi nghiền mịn, người
ta dùng nước, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, acetone).
Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này cho kết quả tốt và
dễ được dùng rộng rãi trong sản xuất. Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể
chiết được lượng enzyme trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất
không tan. Nước thường dùng khuyếch tán ở nhiệt độ 25 – 28C. (Lương Đức Phẩm,1998)
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly :
Tỷ lệ nước trích
Chế phẩm đã sấy khô cần nhiều nước để trích ly enzyme hơn chế phẩm
ẩm, tỷ lệ nước trên chế phẩm khác nhau sẽ trích được lượng enzyme khác nhau.
Lượng nước dùng để trích ly gấp từ 2 – 3,5 lần so với lượng chế phẩm nấm mốc.
Thời gian trích
Enzyme thủy phân dễ tan trong nước, thời gian trích ly càng lâu càng có
khả năng trích được nhiều enzyme hơn nhưng làm tăng lượng tạp chất trong dịch chiết
và giảm hoạt tính riêng của enzyme. Thời gian trích ly thích hợp khoảng 30 – 40 phút.
Nhiệt độ trích
Nhiệt độ trích ly càng tăng thì vận tốc trích ly càng tăng nhưng làm giảm
hoạt tính enzyme nên kéo theo giảm hoạt tính riêng của dịch enzyme. Nhiệt độ trích ly
tối thích là 20 – 30C.
Để tăng cường khả năng thu enzyme, chế phẩm được đánh tơi trước khi trích
để đạt được kích thước hạt 1 – 5 mm. Ngoài ra trong công nghiệp, thường dùng hệ
thống trích ly liên tục gồm nhiều thùng chứa chế phẩm nấm mốc, trong mỗi thùng sẽ
Sản phẩm enzyme
tinh khiết
trích được nhiều lần. Cách làm này giúp tăng hiệu suất thu enzyme, tăng chất khô và
hàm lượng enzyme trong dịch chiết thu được.
2.5.2 Quá trình tủa
Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô, vì trong đó còn chứa
nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Dung dịch enzyme thô
thường chứa một lượng enzyme không nhiều, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì
thế việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi những vật chất này.
Để làm được điều đó người ta phải tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác
nhân gây kết tủa. Tủa là phương pháp cô đặc enzyme hữu dụng và là bước ban đầu
trong tinh sạch enzyme. Bằng cách này người ta loại được một số protein tạp ở giai
đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme.
Nguyên tắc :
Enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung
môi.
Ở phân tử enzyme, các gốc ưa nước và kỵ nước thường nằm trên bề mặt.
Chúng quyết định mức độ hòa tan của enzyme ở những loại dung môi khác nhau.
Trong đó, các nhóm kỵ nước có xu hướng nằm trong lòng phân tử protein, một phần
không nhỏ nhóm này nằm trên bề mặt protein và có khả năng tiếp xúc với dung môi,
các nhóm này sẽ cùng với nhóm tích điện và các nhóm lưỡng cực khác có vai trò quyết
định đến tính chất enzyme.
Độ hòa tan của enzyme được coi là kết quả của tương tác lưỡng cực của chất
hòa tan với nước và tương tác ion của chúng với muối có trong dung dịch tạo thành
màng nước bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrate. Nếu loại bỏ các tương tác
này, các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau để tạo thành khối lớn, tách khỏi dung
dịch, thường gọi là tủa protein.
Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa, protein lại có
thể ở dạng tan (dung dịch keo) bền như trước thì được gọi là kết tủa thuận nghịch,
hoặc mất khả năng này gọi là kết tủa không thuận nghịch.
Những phản ứng kết tủa thuận nghịch protein
a) Kết tủa bằng muối
Khi cho thêm muối (amonium sulfate) vào dung dịch protein, các phân tử
muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nước khỏi protein,
do vậy các phân tử protein có khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại.
Khi cho một lượng muối đủ lớn vào thì protein sẽ bắt đầu tủa. Nếu quá trình
này thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính.
Sau đó thu protein bằng cách ly tâm và hòa tan vào dung dịch đệm có nồng độ muối
thấp.
Phương pháp này thường được sử dụng để tách chiết protein hòa tan. Nó
cũng được sử dụng để thu phân đoạn các protein khác nhau trong hỗn hợp, vì các phân
tử protein lớn có khuynh hướng kết tủa trước, các phân tử nhỏ hơn vẫn còn nằm trong
dung dịch. Vì thế chúng ta có thể tìm ra điều kiện mà có thể thu protein ta đang nghiên
cứu nhiều nhất trong hỗn hợp nhiều protein nhờ phân tích các đoạn ở nồng độ muối
khác nhau.
Như vậy với quá trình này ta có thể thu được protein mong muốn một cách
tinh sạch hơn.
b) Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một
trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung những phân tử dung môi
có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulfoxid) có thể ổn định các tương tác
giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của
protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (acetone,
ethanol) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường. Do đó độ hòa
tan của các phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do làm giảm hằng số điện môi
hiện hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan
trong nước (như acetone) vào dung dịch chứa protein.
Sự kết tủa bằng acetone hoặc ethanol 960
có nhiều thuận lợi do tương đối rẻ,
có sẵn dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzyme. Do
nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme
bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió.
Có thể xảy ra hiện tượng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung
môi hữu cơ. Nguyên nhân là do, khi hằng số điện môi giảm, phân tử protein có thể tự
tháo gỡ và trở thành dạng không hoạt động, trong khi đó các gốc kỵ nước lại tiếp xúc
với dung môi. Hiện tượng này xảy ra khi tiến hành tủa ở nhiệt độ phòng. Khi tiến hành
kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ, ta bắt
buộc phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme.
Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt dung môi hữu cơ thường
mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ.
Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 –
100
C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định
bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch
enzyme.
2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký
Sắc ký sinh học là phương pháp nhẹ nhàng để tinh sạch các phân tử sinh
học, đặc biệt là protein mà vẫn duy trì hoạt tính của chúng. Các kỹ thuật sắc ký tinh
sạch protein dựa vào các đặc tính vật lý của chúng.
Bảng 2.1 : Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính vật lý của protein
Đặc tính Kỹ thuật
Điện tích Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography)
Sự phân cực o Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography)
o Sắc ký giấy.
o Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography)
o Sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction
Chromatography – HIC)
Kích thước Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography)
Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của ligand)
Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography)
Hơn 40 năm qua kể từ khi việc đưa vào thị trường sản phẩm thương mại
SephadexTM, kỹ thuật sắc ký lọc gel đã đóng một vai trò quan trọng trong việc tinh
sạch enzyme, polysaccharide, nucleic acid, protein và các đại phân tử sinh học khác.
Nguyên tắc :
Lọc gel là phương pháp đơn giản nhất trong tất cả các loại sắc ký. Kỹ thuật
này dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng khác nhau bằng cách cho
chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel
sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển
bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp (thôi) ra khỏi cột sớm
hơn các phân tử nhỏ. Kỹ thuật này có thể áp dụng theo hai cách :
a) Phân tách nhóm (Group separations)
Các thành phần của một mẫu được phân tách thành hai nhóm chính theo
phạm vi kích thước. Sự phân tách nhóm được sử dụng để loại các phân tử lớn hay các
phân tử tạp chất nhỏ (như đỏ phenol khỏi dịch nuôi cấy) hoặc để loại muối hoặc trao
đổi đệm.
b) Phân đoạn các phân tử sinh học với độ phân giải cao (High resolution
fractionation of biomolecules)
Các thành phần của cùng một mẫu được phân tách theo sự khác biệt về kích
thước phân tử của chúng. Phân tách với độ phân giải cao có thể được dùng để cô lập
một hoặc nhiều thành phần, để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, để xác
định trọng lượng phân tử hoặc để phân tích sự phân bố theo trọng lượng phân tử.
ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel
a) ưu điểm
Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh
học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác
động (cofactor) và các điều kiện môi trường khắc nghiệt.
Sự phân tách có thể được thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các
cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cường độ
ion cao hoặc thấp, ở 370
C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí
nghiệm.
Kỹ thuật này cho phép thu lại lượng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và
dễ dàng khử muối.
b) Nhược điểm
- Chậm (tốc độ thấp = thời gian dài)
- Yêu cầu các cột có kích thước lớn tương đối so với lượng mẫu.
- Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, thường khó
đạt được sản phẩm tinh khiết hoàn toàn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thường được sử
dụng với những kỹ thuật khác nhau như sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ.
Một số thông số vật lý của phương pháp
Giới hạn tách (Exclusion Limit-EL) : Là khối lượng phân tử (MW) nhỏ nhất
không chui vào bên trong hạt gel, như vậy tất cả chúng sẽ bị thổi cùng một lượt ra khỏi
cột. Thí dụ G-50 có giới hạn tách 30.000 Da, có nghĩa là các phân tử lớn hơn 30.000
Da đều không chui vào hạt gel.
Phạm vi tách (Fraction Range-FR) : Thí dụ Sephadex G-50 có giới hạn tách
từ 1.500-30.000 Da, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ được
phân tách dễ dàng bởi Sephadex G-50.
Độ ngậm nước (Water Regain-WR) : Là trọng lượng nước mà 1g bột gel khô
hút nước. Thí dụ G-50 có WR là 5 0,3 g. Giá trị này chưa tính đến lượng nước bao
quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích cột.
Thể tích nền : Là thể tích cuối cùng mà 1g bột gel khô hấp thụ khi trương nở
trong nước. G-50 có thể tích nền 9-11 ml/g gel khô.
Hạt gel : hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thước hạt xác định bằng mesh
hoặc đường kính hạt theo m. Hạt có kích thước lớn (50-100 mesh, 100-300 m) cho
tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhưng kết quả tách thấp. Ngược lại những hạt mịn (400
mesh, 10-40 m) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thường
người ta chọn hạt gel có kích thước 100-200 mesh, 50-150 m.
Thể tích trống : Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột xác
định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Da.
Thể tích thổi : Là thể tích đệm cần thiết để rửa thổi chất cần tách ra khỏi cột.
Phân tách bằng sắc ký lọc gel
Để phân tách, môi trường lọc gel được nhồi trong cột để tạo nền nhồi. Môi
trường này là một chất nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, loại hạt này được chọn vì tính ổn
định về vật lý và hóa học của chúng, và tính trơ (thiếu các đặc tính hấp phụ và phản
ứng).
Nền nhồi được cân bằng bằng dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các lỗ
của chất nền và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong các lỗ đôi khi được
xem như phase tĩnh và chất lỏng này ở trạng thái cân bằng với chất lỏng bên ngoài các
hạt, được xem như phase động. Cần lưu ý rằng, mẫu được giải hấp một cách đồng nhất
(isocraticlly), nghĩa là không cần sử dụng các loại đệm khác nhau trong quá trình phân
tách. Tuy nhiên, bước rửa giải dùng loại đệm đang chạy thường bao gồm ở thời điểm
kết thúc của quá trình phân tách, làm cho việc loại bỏ bất kỳ loại phân tử nào còn lưu
trong cột được dễ dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp.
Quá trình lọc gel
1. Các hạt hình cầu của môi trường lọc gel được nhồi trong cột.
2. Mẫu được nạp vào cột.
3. Dung dịch đệm (phase động) và mẫu di chuyển qua cột. Các phân tử
khuếch tán trong và ngoài các lỗ của chất nền (cũng được miêu tả như quá trình phân
đoạn mẫu giữa phase động và phase tĩnh). Các phân tử nhỏ hơn di chuyển vào sâu
trong chất nền hơn và do đó lưu lại trong cột lâu hơn.
4. Khi dung dịch đệm di chuyển liên tục qua cột, các phân tử lớn hơn kích
thước lỗ gel không thể khuyếch tán vào trong các lỗ và di chuyển qua cột. Các phân tử
nhỏ hơn khuyếch tán vào trong lỗ gel và bị trì hoãn trong quá trình di chuyển xuống
dưới đáy cột.
5. Các phân tử lớn rời cột trước nhất sau đó là các phân tử nhỏ hơn theo trình
tự kích thước của chúng. Quá trình phân tách hoàn toàn xảy ra khi một lượng dung
môi bằng tổng thể tích cột (tương đương với thể tích nền nhồi) di chuyển qua môi
trường lọc gel.
2.5.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện di
SDS – PAGE
Sau khi qua các bước ly trích và tinh sạch, người ta thường kiểm tra lại độ tinh
sạch của protein nhờ kỹ thuật điện di. Nhờ kỹ thuật này ta còn có thể xác định trọng
lượng phân tử và độ tinh sạch của chúng.
Điện di trên gel là tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, protein) bằng cách
cho đi qua chất nền là gel trong một điện trường.
Kĩ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis) là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của
SDS.
Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử
acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa được xúc tác
bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS); N, N ,N’, N’ - tetramethylenediamine
(TEMED).
Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích thước
của lỗ gel.Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử
sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide :
nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích
thước lớn và ngược lại.
SDS là tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ
thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là
mercaptoethanol.Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2,3,4 được biến đổi
thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó,
sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những
phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi
đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử
tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển
về cực âm của điện trường.
Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một
thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác
nhau đã biết.
Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự
phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên
tục (discontinuous gel). Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp:
Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên) : các protein trong mẫu được dồn lại
và tạo một lớp băng mỏng.
Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới) : tạo ra các băng protein có
trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu.
Hai lớp gel này được phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide
và vị trí.
Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng
lượng phân tử từ 10.000-200.000 daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn
hơn 200.000 daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide hơn 2,5%.
MỤC LỤC
Bìa ..................................................................................................................................... i
Trang tựa .......................................................................................................................... ii vi
Lời cảm tạ ...................................................................................................................... iii
Tóm tắt khóa luận ........................................................................................................... iv
Mục lục ............................................................................................................................ v
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... viii
Danh sách các bảng ........................................................................................................ ix
Danh sách các hình và đồ thị .......................................................................................... xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Mục đích nghiên cứu ................................................................................................. 2
1.3 Yêu cầu ...................................................................................................................... 2
2.1 Khái quát chung về enzyme ...................................................................................... 3
2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme ........................................................... 3
2.1.2 Định nghĩa về enzyme ............................................................................................ 5
2.1.3 Phân loại enzyme .................................................................................................... 6
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme ........................ 7
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme ................................................................................................. 7
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme ......................................... 7
2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống .......................................... 9
2.1.5.1 Nguồn thu nhận ................................................................................................... 9
2.1.5.2 Vai trò ................................................................................................................ 11
2.2 Khái quát chung về enzyme protease ...................................................................... 11
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease ................................................................................ 11
2.2.2 Lược sử phát triển các enzyme protease .............................................................. 12
2.2.2.1 Protease từ động vật .......................................................................................... 12
2.2.2.2 Protease từ thực vật ........................................................................................... 12
2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật ........................................................................................ 13
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease......................................................................... 13
2.2.3.1 Từ động vật ........................................................................................................ 13
2.2.3.2 Từ thực vật ......................................................................................................... 13
2.2.3.3 Từ vi sinh vật ..................................................................................................... 14
2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease ............................................................................ 14
2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ...................................... 15
2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................... 15
2.3.1.1 Phân loại ........................................................................................................... 15
2.3.1.2 Đặc điểm ............................................................................................................ 15
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt ................................ 16
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử enzyme protease ................................. 18
2.5.1 Trích ly enzyme .................................................................................................... 19
2.5.2 Quá trình tủa ........................................................................................................ 20
2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký ....................................................... 22
2.5.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện di SDS –
PAGE ............................................................................................................................. 27
PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP ................................................................ 29
3.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................................. 29
3.2 Vật liệu .................................................................................................................... 29
3.2.1 Chế phẩm enzyme thô .......................................................................................... 29
3.2.2 Hóa chất ................................................................................................................ 29 vii
3.2.3 Thiết bị .................................................................................................................. 29
3.3 Phương pháp thí nghiệm .......................................................................................... 30
3.3.1 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 30
3.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme của dịch chiết enzyme
thô .................................................................................................................................. 30
3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ưu để tủa
enzyme protease ............................................................................................................ 36
3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của protease .... 37
3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel...................................... 37
3.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lượng phân tử enzyme bằng phương pháp điện
di SDS – PAGE ............................................................................................................. 41
3.4 Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 44
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.......................................................................... 45
4.1 Hàm lượng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô ................................................ 45
4.2 Nồng độ muối (NH4)2SO4 tối ưu cho việc tủa protease .......................................... 45
4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 46
4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 48
4.3 Tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa protease ..................................................................... 49
4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 49
4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 51
4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 960
và tủa bằng muối (NH4)2SO4 .................... 53
4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease...................... 54
4.5.1 pH tối ưu ............................................................................................................... 54
4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae ........................................................ 54
4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki .................................................... 54
4.5.2 Nhiệt độ tối ưu ...................................................................................................... 55
4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ..................................................................... 55
4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................ 56
4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel ................................................................................... 56
4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae ................................................................................... 57
4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki .............................................................................. 59
4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc
Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki ................................................................. 62
4.7.1 Tủa protease bằng muối ........................................................................................ 62
4.7.2 Tủa protease bằng cồn .......................................................................................... 62
4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phương pháp điện di trên gel SDS –
PAGE ............................................................................................................................. 63
PHẦN 5 : KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 67
5.1 Kết luận.................................................................................................................... 67
5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................................... 67
5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki ................................................................ 67
5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki .......................... 68
5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 69
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 70
Đánh giá :
0
- 5973 lần xem

Content-Encoding: gzip

Server: LiteSpeed

Cache-Control: no-cache, must-revalidate, post-check=0, pre-check=0

Content-Language: vi

Set-Cookie: cnsh24h_sid=77f0f1f3b742ec47bfac146dc95b926e; expires=Fri, 21-Aug-2015 10:11:17 GMT; path=/dien-dan; domain=.congnghesinhhoc24h.com; HttpOnly