title: Western blot
text: De western blot is een analytische techniek in de moleculaire biologie en biochemie waarmee men heel specifiek de aanwezigheid van een bepaald eiwit in een complex eiwitmengsel kan aantonen. Het is een detectiemethode die vaak gebruikt wordt om één of verschillende eiwitten in een monster – zoals een cellysaat of weefselextract – te visualiseren en te onderscheiden. Het is een standaardtechniek in biochemische laboratoria.
  
  Het uitvoeren van een western blot gaat volgens een vast aantal stappen. Eerst worden de eiwitten in het mengsel op grootte gescheiden door middel van gelelektroforese (veelal SDS-PAGE). Dan worden de gescheiden eiwitten van de gel 'overgebracht' naar een membraan van nitrocellulose of pvdf waar ze vervolgens aan hechten (blotting). Ten slotte wordt dit membraan geweekt in een oplossing met gelabelde antilichamen die specifiek aan het eiwit van interesse binden. De gelabelde antilichamen kunnen zichtbaar gemaakt worden, bijvoorbeeld via fluorescentie.
  
  De western blot is zeer gevoelig: het kan 1 nanogram of zelfs minder van een specifiek eiwit aantonen. Hoewel men door de dikte van de band een idee kan krijgen van de hoeveelheid eiwit in het sample, zijn western blots meestal ongeschikt om een precieze kwantificatie van het aangetoonde eiwit in kwestie te geven. Daarvoor wordt vaak gebruik gemaakt van een verwante techniek, de ELISA.
  
  Geschiedenis
  De naam van het vlekkenproces ("Western Blot") komt van de Engelse woord voor vlek en van het Engelse woord voor vloeipapier, dat een identieke indruk van het origineel geeft. Western blotting is ontwikkeld als een naamspel, gebaseerd op de zogenaamde Southern blot, een soortgelijke methode voor het opsporen van specifieke DNA-sequenties. Edwin Southern wordt beschouwd als de uitvinder van de vlekkentechniek. In 1975 ontwikkelde hij een methode voor de scheiding van DNA-fragmenten en de daaropvolgende hybridisatie, Southern blot genaamd. De overeenkomstige scheiding van RNA-fragmenten werd Northern blot genoemd naar zijn naam. Daarom werd het eiwitvlekken met SDS Western Blot genoemd. De Far-Western blot is ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties te onderzoeken. Als combinatie van de Western en de Southern blot werd de Southwestern blot ontwikkeld voor de detectie van DNA-eiwit interacties, net als de Northwestern blot voor de detectie van RNA-eiwit interacties.
  
  Werking
  
  Elektroforetische scheiding van eiwitten
  
  In de eerste stap wordt het eiwitmengsel door middel van gel-elektroforese in afzonderlijke eiwitbanden gescheiden in een dragermatrix (SDS-PAGE, Native-PAGE, isoëlektrische focussering, 2D-gel-elektroforese), afhankelijk van de grootte van het eiwit, de lading of andere eigenschappen.
  
  Het overbrengen van eiwitten naar een membraan
  De afgescheiden eiwitbanden worden vervolgens overgebracht van de gel naar een vast draagmembraan (nitrocellulose, nylon of PVDF) voor de Western blot. Dit proces wordt blotting maken genoemd. Daar worden ze geblokkeerd met melk (of andere blokkerende middelen) om niet-specifieke antilichaambinding te voorkomen, en vervolgens gekleurd met antilichamen die specifiek zijn voor het doeleiwit.
  
  Detectie van eiwitten na het blotten
  
  Indirect via antilichamen
  Het eiwit waarin men geïnteresseerd is kan gedetecteerd worden met een voor dat eiwit specifiek antilichaam. Om dit specifiek gebonden antilichaam zichtbaar te maken wordt na incubatie met dit eerste antilichaam de blot behandeld met een tweede antilichaam dat bindt aan het eerste antilichaam. Dit tweede antilichaam is gelabeld zodat men precies kan zien waar het eerste antilichaam gebonden heeft en het eiwit zich dus bevindt.
  
  Direct met kleurstoffen of autoradiografie
  Na blotten kan de membraan ook gekleurd worden met specifieke kleurstoffen zoals Ponceau-S om alle overgebrachte eiwitten zichtbaar te maken.
  Indien de eiwitten zelf gelabeld zijn, bijvoorbeeld met radioactief zwavel, kunnen ze na blotten zichtbaar worden gemaakt met een autoradiogram.
  
  Zie ook
   ELISA
   SDS-PAGE
  
  Referenties
  
  Biochemie
  Eiwitchemie