title: Des réservoirs environnementaux à la persistance dans les voies respiratoires des patients : versatilité, interactions et adaptation des pathogènes opportunistes émergents au cours de la mucoviscidose. Médecine humaine et pathologie. Université Montpellier, 2021. Français. &#x27E8;NNT : 2021MONTG058&#x27E9;. &#x27E8;tel-03909870&#x27E9;
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  Sample processing for exoproteome, proteome extraction and proteomic analysis Incubation was carried out at 37°C for 48 h for mono- and co-culture in tryptic soy broth of Ax and Pa. (i) For the exoproteome extraction, 9 ml of the supernatant were transferred into a new 15 ml tube. Proteins were precipitated by adding 2.5 ml of 50% cold TCA (trichloroacetic acid). After an incubation of 10 min at 4°C, the precipitated material was recovered by centrifugation at 7000 g for 15 min. The proteins in the resulting pellets were then dissolved in 30 μL of LDS 1X (Lithium dodecyl sulfate) sample buffer (InvitrogenTM) supplemented with βmercaptoethanol. (ii) For the proteome extraction, the pellet obtained after the first centrifugation was resuspended in 1 ml of PBS 1X and transferred into a new microcentrifuge tube before being centrifuged at 10000 g for 3 min. The resulting pellets were dissolved in 100 μL LDS 1X supplemented with β-mercaptoethanol. Samples were then incubated for 10 min at 90°C in a thermomixer (Eppendorf) and sonicated for 5 min in an ultrasonic water bath (VWR ultrasonic cleaner) before being transferred into 2 mL Screw Cap microtubes (Sarstedt) containing 200 mg of a bead mixture of silica beads 0.1 mm and glass beads of 0.5 and 0.1 mm. Cell disruption was performed with a Precellys Evolution instrument (Bertin Technologies) operated at 10000 rpm for 10 cycles of 30 seconds, with 30 seconds of pause between each cycle. After lysis, samples were transferred into new microcentrifuge tubes. Samples from (i) and (ii) were incubated for 10 min at 99°C and loaded on NuPAGE® Novex 4–12% Bis-Tris gels (InvitrogenTM) that were run for 5 min at 200 V using NuPAGE® MES (InvitrogenTM) as the running buffer. After Coomassie SimplyBlue SafeStain (ThermoFisher Scientific) and destaining with ultra-pure water, the polyacrylamide bands corresponding to each sample were excised. The resulting polyacrylamide gel pieces were first reduced with DTT, alkylated with iodoacetamide and then proteolyzed with Trypsin (Roche) in the presence of 0.01% ProteaseMAX surfactant (Promega) for 1h at 50°C as previously described by Hartmann et al. (2014). The resulting peptide pools were extracted from the gel bands and acidified with 0.5% TFA (trifluoroacetic acid) final concentration prior to nanoLC-MS/MS analysis.
  
  NanoLC-MS/MS analysis
  
  The resulting peptides were analysed with an ESI!Q Exactive HF mass spectrometer (ThermoFisher Scientific) coupled to an Ultimate 3000 Nano LC System (ThermoFisher Scientific). A volume of 2#μl of peptides was injected onto a reverse phase Acclaim PepMap 100 C18 column (3#μm, 100#Å, 75#μm id × 500#mm) and resolved at a flow rate of 0.2#μl/min with a 90#min gradient of CH3CN (4% to 40%) in the presence of 0.1% HCOOH. The tandem mass spectrometer was operated with a top!20 strategy in data!dependent mode. Peptide molecular ions with double or triple positive charges were selected for fragmentation with a dynamic exclusion of 10#s as previously described (Klein et al., 2016). MS/MS interpretation and label-free protein quantification
  
  Tandem mass spectrometry spectra were interpreted using the MASCOT Daemon 2.6.0 software (Matrix Science) with the total sequenced and annotated genomes of Achromobacter xylosoxidans Ax 200 and Pseudomonas aeruginosa Pa II.17 with the following parameters: full-trypsin specificity, a maximum of one missed cleavage, a mass tolerance of 5 ppm on the parent ion and 0.02 Da on the MS/MS analysis. Modifications taken into account were carbamidomethylated cysteine as static modification and oxidized methionine as dynamic modification. Peptide matches with a MASCOT peptide score below a P-value of 0.05 were considered. Proteins were quantified based on their spectral counts. The Normalized Spectral Abundance Factor (NSAF) was calculated by dividing the spectral count for each observed protein by the polypeptide theoretical mass in kDa, and expressed in percentage after dividing by the sum of all values as described previously (Christie-Oleza et al., 2012). Additional results
  
  First, we tested four pairs of strains, Ax 200–Pa II.17, Ax 200 –Pa I.31, Ax 198-Pa II.17 and Ax 198-Pa I.31, for competitive heterogeneity. Among the bacterial cultures tested, we only selected the Pa II.17 monoculture and the associated Pa II.17-Ax 200 co-culture because the protein attribution rates that matched to the total spectrum number of the culture were correct (18 to 53%). It is considered that a good attribution rate is above 30% and a bad attribution rate below 10%. The other pairs of strains had low attribution rate, potentially due to contamination in the culture. Proteins associated with virulence factors, motility, biofilm formation or Quorum Sensing were selected for a comparison of the relative abundance of Pa proteins in the proteome and exoproteome of Pa monoculture compared with Pa-Ax co-cultures, that was represented 159 by heatmaps (Figure 18 and 19). We also have doubts about the possible contamination of the cultures of our selected pair of strains. Therefore, we will not discuss the results in another part of the thesis.
  
  Figure 18: Comparison of NSAF (Normalized Spectral Abundance Factor) between exoproteome of Pa II.17 monoculture (the first three columns) and exoproteome of Pa II.17/Ax 200 co-culture (the last three columns) for proteins associated with virulence factors, motility, biofilm formation or Quorum Sensing. Each culture was performed in triplicate. In grey, absence of the protein (NSAF = 0). Red gradient, NSAF > 0 to > 0.006. The red lines are the selection of proteins of interest involved in the mechanisms studied. Each protein shown on the right has a significantly different expression / NSAF between mono- and co-culture when protein is produced (P-value < 0.05). In the Pa II.17-Ax 200 co-culture exoproteome, a decrease is observed in the protein abundance of certain virulence factors such as the exoenzymes S and T but also PcrV which is a protein of the type III secretion system (Figure 18). In the co-culture, we also observed an absence of a significant number of proteins involved in fimbriae (FimU, PilE, PilF, PilO, PilV, PilW, PilX). Fimbriae have an important role in the early stages of biofilm formation (Figure 18). For motility, we observed proteins whose abundance is higher in co-culture than in Pa monoculture (FlgL and B-type flagellar hook protein) but also proteins that are less abundant in co-culture
  
  Figure 19: Comparison of NSAF (Normalized Spectral Abundance Factor) between proteome of Pa II.17 mono-culture (the first three columns) and proteome of Pa II.17/Ax 200 co-culture (the last three columns) for proteins associated with virulence factors, motility, biofilm formation or Quorum Sensing. Each culture was performed in triplicate. In grey, absence of the protein (NSAF = 0). Blue gradient, NSAF > 0 to > 0.006. The red lines are the selection of proteins of interest involved in the mechanisms studied Each protein shown on the right has a significantly different expression / NSAF between monoand co-culture when protein is produced (P-value < 0.05). 161 (FliM and flagellar M ring protein). An increase in one pyochelin receptor protein (siderophore) and Quorum Sensing (PqsD) is observed in the Pa-Ax coculture compared to Pa alone (Figure 18). Interestingly, several proteins involved in biofilm formation (PslB, PslD, PslE and PslF) are absent from the co-culture proteome (Figure 19). These observations can be correlated with the absence of proteins involved in fimbriae. In the co-culture, we mainly observed an absence of proteins involved in motility (MotA, FliG, FliM, FliN, FliS) and in the virulence of Pa with the type III (8 proteins) and type VI (6 proteins) secretion systems (Figure 19). Currently, for these preliminary results, we could see that the presence of Ax in the bacterial co-culture with Pa would have an influence on the adhesion of the latter bacterium and its biofilm formation compared to the monoculture of Pa. These results correlate with the overall decrease in biofilm formation observed in the previous study (Article 4). We also observed a trend of decreased motility of Pa and some virulence factors during co-culture. This could be correlated with the decrease in virulence of Pa during Pa-Ax co-balneation with zebrafish embryos (Article 5). Finally, we did not observe anything conclusive for proteins involved in Pa pyocyanin and we observed only one protein with a difference between mono- and coculture for siderophores and Quorum Sensing. The proteomics study is ongoing with pure samples of bacteria.! Cette étude a permis l’exploration de la capacité de compétition d’une souche d’Ax envers Pa, suite à des résultats préliminaires présentés dans l’article 4. La baisse globale des pigments produits par Pa sur un tapis bactérien d’Ax était un changement phénotypique observé à l’œil nu (Menetrey et al. 2020). Nous avons voulu compléter ce résultat en dosant les sidérophores (incluant la pyoverdine) et la pyocyanine de Pa. Lors de la co-culture Pa II.17/ Ax 200, nous n’avons pas pu déterminer le taux de sidérophores produits par chaque bactérie mais une réduction globale de la production de sidérophores a été observée. Cependant, nous avons pu montrer pour la première fois une production de sidérophores par des souches d’Ax d’origine clinique, résultats qui n’avaient été observés que pour des souches environnementales (Moretti et al. 2008, Sayyed et al. 2019). Toutefois, des études incluant une analyse des séquences génomiques de souches d’Ax d’origine clinique ont décrit la présence de gènes codant pour des sidérophores, observation en accord avec nos résultats (Li et al. 2013, Khademi et al. 2021). De manière intéressante, nous avons remarqué que les souches d’Ax isolées d’épisodes tardifs d’infection et isolées presque 5 ans après les premières souches testées pour ce même patient ne produisaient plus de sidérophores. Ceci pourrait être un trait adaptatif de la bactérie afin de persister dans son hôte (Cullen et McClean. 2015) comme cela a été démontré avec la perte de la capacité à produire de la pyoverdine décrite pour Pa (Hogardt et Heesemann. 2010). La baisse significative de la production de pyocyanine par Pa en co-culture avec une souche d’Ax a été observée par rapport à sa culture seule. Cependant, cette diminution n’a pas été observée avec l’autre souche d’Ax utilisée pour observer si une hétérogénéité intra-échantillon de compétition était présente. Nous observons donc cette hétérogénéité pour des souches de même ST, comme il avait été observé précédemment lors des tests sur la sensibilité aux antibiotiques et les capacités de compétition influençant la croissance en culture liquide (Dupont et al. 2017, Menetrey et al. 2020). La pyocyanine a un rôle majeur dans la mortalité de C. elegans (Lau et al. 2004, Cezairliyan et al. 2013). En effet, Pa a montré une forte virulence dans ce modèle avec une TD50 (temps requis pour tuer 50% de la population de nématode) de 4 jours. Lors de la mise en contact du nématode avec Ax avant placement sur tapis bactérien de Pa, aucun changement de la virulence de Pa n’a été observé, et ce, malgré la baisse significative de la production de pyocyanine observée pour la co-culture liquide Pa - Ax. L’hypothèse serait que les conditions retenues pour nos expériences n’aient pas été capables de mettre en évidence l’effet d’une potentielle interaction. Un tapis bactérien constitué d’une co-culture de Pa - Ax 163 pourrait être utilisé afin de compléter les tests réalisés comme cela a déjà été fait dans une étude, où ils ont pu observer une augmentation de la virulence de paires de souches d’Aeromonas dans le modèle C. elegans par rapport à une monoculture (Mosser et al. 2015). Les auteurs d’une étude récente ont mis en contact C. elegans avec des mono- et co-cultures de bactéries es puis ils ont broyé les nématodes afin d’observer la quantité de bactéries ayant pu coloniser leurs intestins (Ortiz et al. 2021). Dans certains cas de co-cultures, ils se sont aperçus que les bactéries colonisaient moins les intestins des vers par rapport aux monocultures, suggérant que des interactions entre ces bactéries ont eu un rôle dans la diminution de la colonisation du nématode (Ortiz et al. 2021). Ce type d’expérience pourrait également être faite pour notre paire Pa/Ax. Dans le modèle d’embryons de poissons zèbre, la souche d’Ax a eu un effet significatif sur la virulence de Pa. Alors que la mortalité des embryons en balnéation avec Pa était de 100% après 20 heures, elle n’était plus que de 50% en co-balnéation Pa - Ax. Cette co-balnéation directe entre Pa et Ax pourraient être une explication de l’influence d’Ax sur la virulence de Pa, en modulant la sécrétion des produits toxiques de ce dernier, par rapport à l’expérience sur C. elegans où durant laquelle les vers étaient successivement mis en présence d’Ax puis de Pa. La question de l'impact d'Ax sur les systèmes de Quorum Sensing de Pa reste à élucider, sachant qu’ils régulent la production des facteurs de virulence ainsi que la motilité et la formation de biofilm de Pa. Les lactonases produites par Burkholderia cepacia, YtnP et Y2-aiiA, ont une activité de Quorum Quenching, inhibant les trois systèmes QS de Pa et réduisant ainsi sa virulence et la formation de biofilm (Malesevic et al. 2020). Il est envisageable qu'Ax produise également de telles molécules ayant une activité de Quorum Quenching. Des études de RNA-seq ou de protéomique pourraient compléter les résultats observés. L’approche protéomique a débuté et des résultats préliminaires montrent la diminution de l’abondance de certaines protéines impliquées dans la motilité, le biofilm et la virulence de Pa en co-culture avec Ax, par rapport à sa monoculture. Cependant, des contrôles sont en cours de réalisation afin de confirmer ces résultats. DISCUSSION GÉNÉRALE Des bactéries opportunistes émergentes moins prévalentes lors d’infections chez des patients CF mais capable de persister chez l’hôte CF et d’avoir un rôle délétère sur la fonction pulmonaire
  
  Différentes bactéries ont la capacité de coloniser les voies respiratoires des patients CF au niveau pulmonaire et présentent également la compétence de persister chez l’hôte. Les plus décrites sont Pa, S. aureus et H. infuenzae, dont la prévalence chez les patients français est de 17 à 60% (Registre français de la mucoviscidose - Bilan des données, 2019). D’autres bactéries émergentes ou non ont également cette capacité de colonisation. Il s’agit d’Ax, Sm, Bcc et les mycobactéries atypiques, dont la prévalence est de 2,2 à 10,4% (Registre français de la mucoviscidose - Bilan des données, 2019). Même si l’impact clinique d’Ax et Sm est encore débattu pour lors de l’infection d’un patient, toutes ces bactéries sont considérées par les cliniciens et traitées lors d’épisodes de dégradation clinique sans autre cause évidente identifiée (Abbot et Peleg. 2015). Cependant, des bactéries peu décrites dans la littérature ont également cette capacité de persistance dans le tractus respiratoire des patients CF. Elles appartiennent aux genres Bordetella, Pandoraea, Inquilinus et Ralstonia (Atkinston et al. 2006, LiPuma et al. 2010, Sibley et Surette. 2011, Mahenthiralingam. 2014, Degand et al. 2015, Dupont et al. 2017). La plupart de ces bactéries présente une résistance importante voire une multi-résistance aux antibiotiques tel que nous l’avons démontré dans notre travail pour Bordetella de génogroupe 2 décrit pour la première fois dans l’infection chronique des voies respiratoires de patients CF (Menetrey et al. 2021). De plus, une augmentation des exacerbations a été observée lors de la présence de plusieurs de ces bactéries dans les voies respiratoires de patients, notamment pour les genres méconnus comme Bordetella ou Pandoraea (Bos et al. 2011, Brady et al. 2014, Dupont et al. 2017, Menetrey et al. 2021). Les espèces de Pandoraea par exemple sont également considérées comme des agents pathogènes émergents et l’infection par ces bactéries peut provoquer une augmentation de la production du taux d'anticorps et un déclin de la fonction pulmonaire chez les patients CF (Jørgensen et al. 2003, Mahenthiralingam. 2014, Degand et al. 2015, Martina et al. 2017). Parmi ces différentes bactéries, nos travaux ont plus particulièrement porté sur celles des genres Bordetella, Achromobacter et Stenotrophomonas et, de manière générale, nos résultats expérimentaux mais aussi les données issues des synthèses bibliographiques réalisées montrent 166 que les bactéries moins fréquemment identifiées (Sm, Ax) voire identifiées chez un pourcentage plus faibles de patients CF (Bordetella) doivent continuer à faire l’objet d’études afin de préciser leur rôle pathogène mais aussi leurs caractéristiques spécifiques au cours de la mucoviscidose (capacités adaptatives et d’interactions avec les autres microorganismes présents dans la niche pulmonaire des patients). De plus, la co-colonisation de ces pathogènes émergents avec des pathogènes connus comme Pa est fréquente (Degand et al. 2015) et doit être étudiée afin d’évaluer les conséquences de certaines associations bactériennes sur l’état clinique du patient par rapport à une colonisation bactérienne unique. Les réservoirs bactériens environnementaux, une source de contamination pour les patients CF, justifiant l’élaboration de recommandations d’hygiène spécifiques basées sur des études scientifiques Chaque pays a ses propres recommandations d’hygiènes pour guider les patients CF dans leur quotidien mais peu d’études ont été menées sur l’efficacité réelle de ses recommandations pour diminuer l’exposition des patients à ces bactéries. Les réservoirs de pathogènes opportunistes majeurs dans la mucoviscidose ne sont pas connus dans l’environnement domestique des patients. Lors d’une précédente étude au laboratoire, les résultats des prélèvements aux domiciles de patients CF ont indiqué que les bactéries du genre Achromobacter étaient isolées majoritairement (82%) dans des zones humides (Dupont et al. 2018), zones déjà ciblées par quelques études recherchant Pa ou des Ma (Schelstraete et al. 2008, Thomson et al. 2013, Purdy-Gibson et al. 2015). Le projet PatHome se poursuit afin d’identifier, aux domiciles d’un effectif plus important de patients, quels types de zones humides sont les réservoirs bactériens principaux à cibler dans le cadre de l’élaboration de recommandations basées sur des résultats expérimentaux. Les résultats obtenus permettront, à terme, de préciser les recommandations d’hygiène de l’environnement domestique des patients (lieux à traiter, méthode et fréquence de décontamination,...) afin de limiter l’exposition des patients CF aux bactéries pathogènes d’origine environnementale, particulièrement aux bactéries émergentes dans ce contexte. Actuellement, les résultats préliminaires du projet PatHome ont permis de déterminer certaines zones à forte concentration bactérienne. Les siphons sont les lieux où la concentration bactérienne de pathogènes émergents est la plus importante, résultats confirmant ceux d’autres études au cours desquelles Pa, Sm et Ax avaient déjà été isolés, mais de façon individuelle, l’originalité de notre étude est donc que nous avons recherché la présence de ces trois bactéries 167 trois bactéries dans chaque prélèvement, incluant également les Ma (Doring et al. 1996, Denton et al. 1998, Schaelstraete et al. 2008, Amoureux et al. 2013, Purdy-Gibson et al. 2015). Plus précisément, nous avons majoritairement isolé : i) les souches de Sm à partir des échantillons provenant des siphons des cuisines (lieu majoritaire d’isolement de Sm et décrit pour la première fois) suivi de ceux des douches des patients, ii) les souches d’Ax et de Ma dans les salles de bains (siphons des douches et des lavabos) et l’eau des toilettes, iii) enfin, les souches de Pa ont été isolées le plus fréquemment à partir des lave-linges (tambours et joints), ce qui n’avait jamais été décrit. Cependant, notre effectif de patients inclus dans l’étude est encore trop faible avec 7 patients/domiciles et 11 campagnes de prélèvements (1 à 3 campagnes par domicile) comparé aux résultats déjà publiés dans la littérature. L’étude de Regnath et al., Schaelstraete et al., avaient inclus 102 et 50 patients/domiciles respectivement quand celle de Purdy Gibson et al., en avait inclus 15 avec 3 à 8 campagnes par domicile (Regnath et al. 2004, Schaelstraete et al. 2008, Purdy-Gibson et al. 2015 Par contre, leur recherche était seulement focalisée sur Pa. De plus, dans notre étude nous avons toujours effectué un génotypage de nos souches suivi d’une comparaison des profils génomiques si les souches étaient de génotype similaire, ce qui avait seulement été fait dans l’étude de Schalstraete et al. (Schaelstraete et al. 2008). Enfin, nous avions dans notre étude une prévalence supérieure de souches de Pa isolées, avec 86% des domiciles colonisés, contre 29, 36 et 73% pour ces trois études (Regnath et al. 2004, Schaelstraete et al. 2008, Purdy-Gibson et al. 2015). Connaissant les réservoirs domestiques des pathogènes opportunistes, l’intérêt est de donner aux patients l’information sur les zones à traiter en priorité, afin de réduire l’exposition à ces bactéries. En effet, nous avons pu observer des transmissions de bactéries entre l’environnement domestique et les voies respiratoires pour 4 des 7 patients inclus à ce jour. Une souche d’A. mucicolens provenant d’un siphon de lavabo de salle de bain et deux souches de Sm provenant du siphon de la cuisine et d’un lave-linge étaient impliquées. Peu d’études ont jusqu’alors comparé les souches isolées de l’environnement domestique des patients CF et celles colonisant leurs poumons. Ces études portaient sur des souches de Pa et de Ma isolées de la salle de bain des patients et il a été démontré que le génotype et le profil génomique était similaire pour 18 à 35% des souches cliniques et environnementales, contre 57% toutes bactéries confondues pour notre étude (Reuter et al. 2002, Schelstraete et al. 2008, Falkinham et al. 2011, Thomson et al. 2013). Pour la première fois, nous avons pu observer une transmission d’Ax et Sm de l’environnement domestique à des patients CF mais nous ne pouvons pas affirmer avec une certitude totale si la transmission de la bactérie s’est effectuée de l’environnement au patient ou du patient à l’environnement. Néanmoins, pour une patiente 168 ayant présenté pour la première fois A. mucicolens dans ses voies respiratoires 10 jours suivant un emménagement et la bactérie ayant été retrouvé dans le siphon de celle-ci 16 jours après celui-ci, nous parait limiter l’hypothèse d’une contamination massive de l’environnement domestique par le patient. Pour tenter de gommer ce biais de contamination initiale du patient ou de l’environnement, nous suivons ac un enfant de manière longitudinale pour lequel des prélèvements environnementaux ont été effectués avant l’emménagement dans un nouveau domicile. Au cours de nos différentes études, le cas du patient A (parties 3 et 4) était l’un des plus intéressants. En effet, ce patient est colonisé chroniquement au niveau pulmonaire par Ax depuis plus de 10 ans, et a été colonisé sporadiquement par trois génotypes de Pa à trois reprises en 2010 et 2012 sans que ceux-ci ne persistent dans ses voies respiratoires. Lors des différentes campagnes en 2015 et 2020 au domicile de ce patient, nous avons identifié un génotype de Pa identique en PFGE que celui ayant colonisé ce patient en 2010 (patient 3, partie 2). Au cours de nos différents travaux (Article 4 et 5), nous avons montré que les souches d’Ax colonisant ce patient avaient une capacité d’inhibition de croissance et de virulence des souches de Pa que ce soit celles isolées des voies respiratoires du patient ou du domicile de celui-ci. De plus, cette souche de Pa ayant colonisé le patient en 2010 persiste dans plusieurs zones (salle de bain et cuisine) de son domicile depuis 10 ans et n’a pourtant pas re-contaminé ce patient. Ceci suggère que la colonisation chronique par Ax pourrait contribuer à l’éradication de Pa lors des épisodes de contamination de ce patient. L’étude comparative de ces souches de Pa (ST27) entre la colonisation sporadique des voies respiratoires du patient et la persistance dans son environnement doit être approfondie surtout du fait que les souches environnementales ont présenté des microévolutions génomiques au cours du temps (partie 2). Cette persistance de Pa durant plusieurs années, incluant l’observation de microévolutions au cours du temps, a déjà été rapportée lors de la colonisation de réseaux d’eau hospitaliers (eau et siphon de lavabo de chambres d’hôpital, conduits d’eaux dans un centre de soins dentaires) (Abdouchakour et al. 2015, 2018). Après avoir observé que les siphons et certaines autres zones humides de l’environnement domestique étaient fortement contaminés et que des transmissions environnement-patient étaient possibles, le moyen le plus efficace pour éviter ces transferts de bactéries est l’utilisation de biocides. Sur la base des résultats obtenus pour les bactéries de l’environnement domestique des patients, nous avons proposé en particulier de détartrer les siphons à l’aide de vinaigre blanc 169 ménager diluer ou de produit de type Destop durant une nuit puis de désinfecter avec de l’eau de Javel à 0,5% de chlore actif la nuit suivante. Lors d’une seconde campagne de prélèvement chez les patients, les bactéries à éradiquer n’étaient plus présentes dans les lieux de colonisation initiale prouvant l’efficacité de la stratégie proposée. Nous conseillons également aux patients de traiter leurs siphons à l’eau de Javel deux fois par semaine, sur la base des résultats de précédentes études qui ont montré l’efficacité de ce produit durant les 3 jours suivant le traitement, avec des concentrations de chlore actif similaire à nos recommandations (Buchan et al. 2019, Jones et al. 2020). Des produits moussants pourraient également être une alternative, leur efficacité et leur temps d’action dans le siphon étant significativement plus importants qu’un même produit sous forme liquide (Buchan et al. 2019, Jones et al. 2020). De plus, le peroxyde d’hydrogène à 3,13% pourrait aussi remplacer l’eau de Javel, évitant les vapeurs et les odeurs de celle-ci durant son utilisation et ayant une efficacité de désinfection similaire voire meilleure que l’eau de Javel (Buchan et al. 2019, Jones et al. 2020). Notre étude s’est focalisée sur le domicile des patients, lieu où ils sont le plus présents et où une importante contamination des zones humides par des bactéries pathogènes opportunistes a été démontrée. Cependant, nous ne devons pas exclure les autres lieux où les patients peuvent être exposés aux bactéries tels que le lieu de travail, les établissements sportifs ou les écoles qui devront faire l’objet d’études spécifiques.
  
  Les interactions bactériennes, un processus complexe dont les mécanismes doivent encore être élucidés
  
  Les bactéries interagissent entre elles, quel que soit l’environnement où elles se situent (naturels, urbains, humain). Ces interactions sont multiples (Hotterbeekx et al. 2017, Menetrey et al. 2020) et peuvent être bénéfiques aux deux bactéries (DeLeon et al. 2014, Orazi and O’Toole. 2017, Camus et al. 2020), favorables à l’une des deux bactéries uniquement (Trizna et al. 2020) voire défavorables à l’une voire aux deux bactéries suite à la compétition s’établissant entre elles (Baldan et al. 2014, Radlinsky et al. 2017, Bisht et al. 2020, Menetrey et al. 2020). Une des raisons de ce dernier comportement est la compétition pour les nutriments dans un espace restreint afin que la bactérie continue à croitre. La mucoviscidose est un modèle pour ce type d’études sachant que la colonisation bactérienne s’établit dans un espace restreint, hétérogène et soumis à de nombreuses pressions de sélection variables au cours du temps et selon la localisation anatomique, dans lequel les nutriments peuvent être peu accessibles 170 (LaRosa et al. 2019). Ces interactions pourraient moduler la composition globale du microbiote pulmonaire chez les patients CF et être une des raisons l’abondance relative élevée de certaines espèces bactériennes (Granchelli et al. 2018, Blanchard et Waters. 2019, Jean-Pierre et al. 2021). La formation de biofilm par les bactéries est primordiale pour leur survie et leur persistance dans l’hôte (Murray et al. 2007, Hoiby et al. 2010) et des biofilms multi-espèces se forment dans le tractus respiratoire des patients CF, favorisant les possibilités d’interactions bactériennes (O’Brien and Fothergill. 2017, Trizna et al. 2020). Les études des interactions bactériennes en contexte CF sont récentes et ont d’abord porté sur les bactéries les plus fréquemment isolées des expectorations des patients CF, Pa et S. aureus. Des interactions ont également été observées entre bactéries du microbiote oro-pharyngé et Pa contribuant positivement à la virulence de ce dernier (Whiley et al. 2014, 2015). L’existence de telles interactions in vivo est hautement probable car avant de coloniser les voies respiratoires inférieures, Pa doit transiter par les voies respiratoires supérieures. Lors des tests de compétitions bactériennes entre souches d’origine CF, les souches de Pa ont majoritairement montré leur capacité inhibitrice sur la croissance d’autres bactéries tels que S. aureus, Bcc ou Sm (Costello et al. 2014, Pernet et al. 2014, Smalley et al. 2015, Hotterbeekx et al. 2017, Menetrey et al, 2020). Cependant, de manière plus rare et dépendante des conditions environnementales, les souches de Pa peuvent également être inhibées par une autre bactérie. Des souches de streptocoques oraux en présence de nitrite peuvent inhiber la croissance de souches de Pa (Scoffield et Wu. 2015). Il a été observé des résultats similaires avec des souches de Sm présentant la capacité d’inhiber la croissance de Pa par le biais du T4SS (Nas et al. 2019, 2021). Au cours de nos études, nous avons pu observer la même tendance avec des souches de Pa pour lesquelles plus d’interactions étaient détectées que pour les autres bactéries. En effet, 38,5% des paires de souches contenant un Pa présentaient au moins une interaction, et Pa était en majorité le compétiteur c’est-à-dire qu’il inhibait les autres espèces (Menetrey et al. 2020).