None
7.   Hoewel er tussen de verschillende laboratoria enige variatie was in de gebruikte dosis TP om antiandrogenen in het Hershberger Bioassay-valideringsprogramma van de OESO te detecteren (0,2 versus 0,4 mg/kg/d, subcutane injectie), was er weinig verschil tussen deze twee protocolvarianten in het vermogen om zwakke of sterke antiandrogene activiteit te detecteren. Het is evenwel duidelijk dat de dosis TP niet zo hoog mag zijn dat de effecten van zwakke androgeenreceptor (AR)-antagonisten worden geblokkeerd of zo laag dat de androgene weefsels een geringe groeirespons vertonen, zelfs zonder gelijktijdige toediening van antiandrogenen.
 8.   De groeirespons van de individuele androgeenafhankelijke weefsels is niet geheel van androgene oorsprong; stoffen anders dan androgeenagonisten kunnen ook het gewicht van bepaalde weefsels veranderen. Maar de groeirespons van verschillende weefsels tegelijkertijd vormt bewijs voor een meer androgeenspecifiek mechanisme. Zo kunnen hoge doses van krachtige oestrogenen het gewicht van de zaadblaasjes verhogen, zonder dat de andere androgeenafhankelijke weefsels in de bepaling op soortgelijke wijze reageren. Antiandrogene stoffen kunnen als androgeenreceptorantagonist of 5α-reductaseremmer fungeren. 5α-reductaseremmers hebben een variabel effect omdat de omzetting in het krachtigere dihydrotestosteron per weefsel verschilt. Antiandrogenen die 5α reductase remmen, zoals finasteride, hebben een meer uitgesproken effect in de ventrale prostaat dan andere weefsels in vergelijking met een krachtige AR-antagonist, zoals flutamide. Dit verschil in weefselrespons kan worden gebruikt om te differentiëren tussen door AR en 5α — reductase gemedieerde werkingsmechanismen. Daarnaast is de androgeenreceptor evolutionair gerelateerd aan de receptor van andere steroïdhormonen; sommige andere hormonen kunnen zich bij toediening in hoge, suprafysiologische doseringen binden aan TP en de groeibevorderende effecten ervan antagoneren (13). Bovendien is het plausibel dat een verhoogd steroïdmetabolisme en een daaropvolgende verlaging van het serumtestosteron de groei van androgeenafhankelijke weefsels kan verminderen. Daarom moet een positief resultaat van de Hershberger-bioassay normaliter worden beoordeeld op basis van gewicht van bewijs, zoals uit bepalingen in vitro, zoals de AR- en estrogeenreceptor (ER)-bindingsassays en corresponderende transcriptionele activatieassays, of uit andere bepalingen in vivo die soortgelijke androgene doelweefsels onderzoeken, zoals de male pubertal assay, 15-day intact adult male assay, of 28-day of 90-day repeat dose studies.
 9.   De ervaring leert dat xenobiotische androgenen zeldzamer zijn dan xenobiotische antiandrogenen. De verwachting is dan dat de Hershberger-bioassay het meest wordt gebruikt voor de screening op antiandrogenen. Niettemin kan de procedure om op androgenen te testen eventueel worden aanbevolen voor steroïde of steroïd-achtige stoffen of voor stoffen waarvoor een indicatie van een mogelijk androgeen effect verkregen is uit methoden in niveau 1 of 2 van het conceptuele kader (aanhangsel 2). Zo ook kunnen bij bepalingen in niveau 5 bijwerkingen in samenhang met (anti)androgene profielen worden waargenomen, waardoor het nodig is om te beoordelen of een stof via een endrocrien werkingsmechanisme werkt.
10.   Erkend wordt dat alle procedures waarbij dieren worden gebruikt, aan de plaatselijke normen voor de verzorging van dieren moeten voldoen; de hieronder beschreven zorg en behandeling zijn minimale normen en zijn ondergeschikt aan lokale regelgeving zoals Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (26). De OESO heeft nadere richtsnoeren voor de humane behandeling van dieren opgesteld (17).
11.   Zoals geldt voor elke bioassay bij proefdieren, moet de noodzaak van de uitvoering van dit onderzoek zorgvuldig worden overwogen. In basis kunnen er twee redenen voor een dergelijk besluit zijn:






—


hoge potentiële blootstelling (niveau 1 van het conceptueel kader) of aanwijzingen voor (anti)androgeniteit in bepalingen in vitro (niveau 2) die onderzoek rechtvaardigen of dergelijke effecten ook in vivo kunnen optreden,










—


effecten die passen bij (anti)androgeniteit bij niveau 4- of 5-tests in vivo die onderzoek naar het specifieke werkingsmechanisme rechtvaardigen, bijvoorbeeld om vast te stellen of de effecten het gevolg waren van een (anti)androgeen mechanisme.
12.   De in deze testmethode gebruikte definities staan in aanhangsel 1.
 PRINCIPE VAN DE TEST
13.   De Hershberger-bioassay verkrijgt haar gevoeligheid door mannetjesdieren te gebruiken met minimale androgeenproductie. Dit wordt bereikt door gebruik van gecastreerde mannetjesdieren mits voldoende tijd na castratie wordt gelaten zodat de doelweefsels kunnen afnemen naar een minimaal en uniform baselinegewicht. Als dan bij screening op mogelijke androgene activiteit er lage endogene concentraties circulerende androgenen zijn, wordt de hypothalamus-hypofyse-gonadeas weerhouden om te compenseren via een terugkoppelingsmechanisme, is het vermogen van de weefsels om te reageren maximaal, en is de variabiliteit in weefselgewicht bij aanvang minimaal. Bij screening op mogelijke antiandrogene activiteit kan een consistente toename in weefselgewicht worden bereikt als de weefsels worden gestimuleerd door een referentieandrogeen. Daarom vereist de Hershberger-bioassay slechts 6 dieren per dosisgroep terwijl andere bepalingen met intacte puberale of volwassen mannetjesdieren vaak 15 mannetjesdieren per dosisgroep gebruiken.
14.   Castratie van peripuberale mannetjesratten moet op passende wijze plaatsvinden met goedgekeurde anesthetica en aseptische techniek. Gedurende de eerste paar dagen na chirurgie moeten pijnstillers worden toegediend om postchirurgische pijn te elimineren. Castratie verhoogt de precisie waarmee de bepaling zwakke androgenen en antiandrogenen detecteert door compensatoire endocriene terugkoppelingsmechanismen te elimineren die in het intacte dier aanwezig zijn en die de effecten van toegediende androgenen en antiandrogenen kunnen afzwakken, en door de grote interindividuele variabiliteit in het serumtestosteron te elimineren. Daardoor wordt het aantal benodigde dieren voor screening op deze endocriene activiteiten door castratie verminderd.
 15.   Bij screening op mogelijke androgene activiteit wordt de teststof dagelijks via een maagsonde of subcutane (sc) injectie toegediend gedurende een periode van tien opeenvolgende dagen. Teststoffen worden toegediend aan minimaal twee behandelingsgroepen met proefdieren met één doseringsniveau per groep. Ongeveer 24 uur na de laatste dosis wordt obductie verricht op de dieren. Een statistisch significante verhoging in twee of meer doelorgaangewichten in de teststofgroep in vergelijking met de mediumcontrolegroep wijst erop dat de teststof positief is voor mogelijk androgene activiteit (zie paragraaf 60). Androgenen zoals trenbolon waarbij 5α-reductie niet kan plaatsvinden, hebben een meer uitgesproken effect op de LABC en GP dan TP, maar alle weefsels moeten meer groei vertonen.
16.   Bij de screening op mogelijke antiandrogene activiteit wordt de teststof dagelijks toegediend via maagsonde of subcutane injectie gedurende een periode van tien opeenvolgende dagen samen met dagelijkse doses TP (0,2 of 0,4 mg/kg/d) per sc injectie. In het valideringsprogramma is vastgesteld dat hetzij 0,2 hetzij 0,4 mg/kg/d TP gebruikt kan worden, omdat beide effectief waren voor het detecteren van antiandrogenen; daarom moet voor de bepaling slechts één dosis worden geselecteerd. Trapsgewijs stijgende doses van de teststof worden toegediend aan minimaal drie behandelingsgroepen met proefdieren met één dosisniveau per groep. Ongeveer 24 uur na de laatste dosis wordt obductie verricht op de dieren. Een statistisch significante afname in twee of meer doelorgaangewichten in de groepen met de teststof en TP in vergelijking met de controlegroep met TP alleen wijst erop dat de teststof positief is voor mogelijke antiandrogene activiteit (zie paragraaf 61).
 BESCHRIJVING VAN DE METHODE

Selectie van diersoort en stam

17.   Sinds de jaren 1930 wordt de rat standaard gebruikt in de Hershberger-bioassay. Hoewel het biologisch plausibel is dat zowel de rat als de muis soortgelijke responsen zouden vertonen, is op basis van 70 jaar ervaring met het rattenmodel de rat de geprefereerde diersoort voor de Hershberger-bioassay. Daarnaast, omdat gegevens uit de Hershberger-bioassay aan de basis kunnen staan van een langdurig multigenerationeel onderzoek, is het op deze manier mogelijk om dieren uit dezelfde diersoort, stam en bron te gebruiken in beide studies.
18.   In dit protocol kunnen laboratoria de in de bepaling te gebruiken rattenstam selecteren, welke over het algemeen de stam moet zijn die meestal door het deelnemende laboratorium wordt gebruikt. Veel in het laboratorium gebruikte rattenstammen kunnen worden gebruikt; maar stammen die aanmerkelijk later dan na 42 dagen volwassen worden mogen niet worden gebruikt omdat bij castratie van deze mannetjesdieren op een leeftijd van 42 dagen mogelijk niet het gewicht van de glans penis gemeten kan worden, wat alleen kan worden gedaan nadat de voorhuid van de penisschacht teruggetrokken is. Daarom mogen stammen die zijn verkregen uit de Fisher 344-rat, niet worden gebruikt, behalve in uitzonderlijke gevallen. De Fisher 344-rat heeft een ander tijdsverloop van de seksuele ontwikkeling dan andere vaker gebruikte stammen zoals Sprague Dawley- of Wistar-stammen (16). Als een dergelijke stam gebruikt gaat worden, moet het laboratorium deze op iets hogere leeftijd castreren en de gevoeligheid van de te gebruiken stam kunnen aantonen. Het laboratorium moet een heldere motivering voor de keuze van de rattenstam kunnen geven. Waar de screeningstest vooraf kan gaan aan een onderzoek met herhaalde orale doses, een voortplantings- en ontwikkelingsonderzoek, of een langdurig onderzoek, moeten in alle onderzoeken bij voorkeur dieren uit dezelfde stam en bron worden gebruikt.
 Huisvestings- en voedingsomstandigheden

19.   Alle procedures moeten in overeenstemming zijn met alle plaatselijke normen voor de verzorging van proefdieren. Deze beschrijvingen van de verzorging en behandeling zijn minimumnormen, die ondergeschikt zijn aan striktere lokale regelgeving zoals Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (26). De temperatuur in de proefdierruimte dient 22 °C te zijn (met een spreiding van ± 3 °C). De relatieve luchtvochtigheid moet minimaal 30 % zijn en bij voorkeur niet hoger zijn dan 70 %, behalve bij reiniging van de ruimte. Er moet worden gestreefd naar een relatieve vochtigheid van 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht, met een dagelijkse lichtcyclus van 12 uur licht en 12 uur donker.
20.   De dieren samen onderbrengen is te verkiezen boven isolatie gezien de jonge leeftijd van de dieren en het feit dat de ratten sociale dieren zijn. Met twee of drie dieren per kooi wordt overbevolking en daarmee samenhangende stress voorkomen die de hormonale controle van de ontwikkeling van de weefsels van de secundaire geslachtsorganen kan verstoren. De kooien worden grondig gereinigd om eventuele verontreinigingen te verwijderen en zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. Met kooien van adequate omvang (~2 000 vierkante centimeter) wordt overbevolking voorkomen.
21.   Elk dier moet door middel van een humane methode individueel geïdentificeerd worden (bv. oormerk of identificatieplaatje). De identificatiemethode moet worden vastgelegd.
 22.   Proefdiervoer en drinkwater moeten ad libitum worden verstrekt. Laboratoria die de Hershberger-bioassay uitvoeren moeten het laboratoriumvoer gebruiken dat zij normaliter in hun onderzoek van stoffen gebruiken. In de valideringsstudies van de bioassay werden geen effecten of variabiliteit waargenomen die aan het voer waren toe te schrijven. Het gebruikte voer wordt vastgelegd en een monster van het laboratoriumvoer moet worden bewaard voor eventuele analyse in de toekomst.
Prestatiecriteria voor androgeenafhankelijk orgaangewicht

23.   Tijdens de valideringsstudie waren er geen aanwijzingen dat de afname van het lichaamsgewicht van invloed was op toename of afname van de groei van het gewicht van doelweefsels (d.w.z. die in dit onderzoek gewogen moeten worden)).
24.   Bij de verschillende rattenstammen die met succes in het valideringsprogramma zijn gebruikt, is het androgeenafhankelijke orgaangewicht bij de zwaardere rattenstammen hoger dan bij de lichtere stammen. Daarom wordt in de prestatiecriteria van de Hershberger-bioassay geen absoluut verwacht orgaangewicht genoemd voor positieve en negatieve controles.
25.   Omdat het Variatiecoëfficiënt (CV) van een weefsel een omgekeerde evenredigheid vertoont met statistisch onderscheidingsvermogen, zijn de prestatiecriteria voor de Hershberger-bioassay gebaseerd op maximale CV-waarden voor elk weefsel (tabel 1). De CV's zijn verkregen uit de OESO-valideringsstudies. In het geval van negatieve resultaten moeten laboratoria de CV's voor de controlegroep en de met de hoge doses behandelde groep onderzoeken om vast te stellen of de maximale CV-prestatiecriteria overschreden zijn.
26.   Het onderzoek wordt herhaald als: 1) drie of meer van de tien mogelijke individuele CV's in de controlegroep en de met de hoge doses behandelde groep de maxima te boven gaan die voor agonisten- en antagonistenstudies zijn vastgesteld in tabel 1, en 2) minstens twee doelweefsels marginaal insignificant zijn, dat wil zeggen p-waarden tussen 0,05 en 0,10.
Tabel 1


Maximaal toegestane CV's vastgesteld voor doelweefsels van secundaire geslachtsorganen voor het castraatmodel in de OESO-valideringsstudies
 (12).
 Weefsel


Antiandrogene effecten


Androgene effecten




Zaadblaasjes


40 %


40 %




Ventrale prostaat


40 %


45 %




LABC


20 %


30 %




Cowperse klieren


35 %


55 %




Glans penis


17 %


22 %




PROCEDURE

Naleving van de wet en laboratoriumverificatie

27.   In tegenstelling tot de Uterotrofe bepaling (hoofdstuk B.54 van deze bijlage), hoeft de competentie van een laboratorium voor de Hershberger-assay niet voor aanvang van het onderzoek te worden aangetoond, omdat positieve (testosteronpropionaat en flutamide) en negatieve controles tegelijkertijd plaatsvinden als integraal onderdeel van de bepaling.
Aantal en toestand van de dieren

28.   Elke behandelings- en controlegroep moet minimaal 6 dieren omvatten. Dit geldt voor zowel de androgene als de antiandrogene protocols.
Castratie

29.   Na ontvangst van de dieren moet er een eerste acclimatisatieperiode van enkele dagen worden ingeruimd om er zeker van te zijn dat de dieren gezond zijn en gedijen. Omdat bij dieren die voor een leeftijd van 42 dagen of postnatale dag (pnd) 42 de voorhuid mogelijk niet is teruggetrokken, moeten dieren worden gecastreerd op pnd 42 of later, niet daarvoor. De dieren worden onder anesthesie gecastreerd door een incisie in het scrotum aan te brengen en beide testes en epididymides te verwijderen waarbij bloedvaten en zaadbuisjes worden afgebonden. Na bevestiging dat er geen bloeding optreedt, kan het scrotum met hechtingen of autoclips worden gesloten. Dieren moeten de eerste dagen na chirurgie met pijnstillers worden behandeld om postchirurgische pijn te verlichten. Als gecastreerde dieren van een dierleverancier worden betrokken, moeten de leeftijd van de dieren en het stadium van de seksuele rijping door de leverancier worden gegarandeerd.
 Acclimatisatie na castratie

30.   Acclimatisatie van de dieren aan de laboratoriumomstandigheden moet worden voortgezet zodat het doelweefselgewicht minimaal zeven dagen na castratie kan afnemen. De dieren moeten dagelijks worden geobserveerd, en alle dieren met aanwijzingen van ziekte of lichamelijke afwijkingen moeten worden verwijderd. Behandeling en instelling van de toediening (in onderzoek) kan dus beginnen vanaf een leeftijd van pnd 49 dagen, maar niet later dan pnd 60. De leeftijd bij obductie mag niet hoger zijn dan pnd 70. Met deze flexibiliteit kan een laboratorium het werk aan het experiment efficiënt plannen.
Lichaamsgewicht en groeprandomisatie

31.   Verschillen in individueel lichaamsgewicht zijn een bron van variabiliteit in weefselgewicht zowel binnen als tussen groepen dieren. Toenemende variabiliteit in weefselgewicht leidt tot een hogere variatiecoëfficiënt (CV) en vermindert het statistisch onderscheidingsvermogen van de bepaling (soms de gevoeligheid van de bepaling genoemd). Daarom moeten variaties in lichaamsgewicht zowel experimenteel als statistisch gereguleerd worden.
32.   Experimentele regulering houdt in het bereiken van geringe variaties in lichaamsgewicht binnen en tussen de onderzoeksgroepen. In de eerste plaats moeten ongebruikelijk kleine of grote dieren worden vermeden en niet in de onderzoekscohort worden opgenomen. Bij aanvang van het onderzoek moet de gewichtvariatie van de gebruikte dieren niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht zijn (bv. 175 g ± 35 g voor gecastreerde peripuberale ratten). Ten tweede moeten dieren worden toegewezen aan (controle- en behandel-) groepen via gerandomiseerde gewichtsverdeling, zodat het gemiddelde lichaamsgewicht van elke groep niet statistisch afwijkt van alle andere groepen. De toegepaste blokrandomisatieprocedure moet worden vastgelegd.
33.   Omdat toxiciteit het lichaamsgewicht van de behandelde groep ten opzichte van de controlegroep kan verminderen, moet het lichaamsgewicht op de eerste dag van de toediening van de teststof worden gebruikt als statistische covariabele, niet het lichaamsgewicht bij obductie.
 Dosering

34.   Om vast te stellen of de teststof in vivo een androgene werking kan hebben, zijn twee dosisgroepen van de teststof plus positieve en medium (negatieve) controles (zie paragraaf 43) normaliter voldoende, en daarom geniet deze opzet de voorkeur uit het oogpunt van dierwelzijn. Als het doel is om een dosisresponscurve te verkrijgen of naar lagere doses te extrapoleren, zijn minstens 3 dosisgroepen nodig. Als informatie naast identificatie van androgene activiteit (zoals een schatting van de potentie) nodig is, moet een ander dosisregime worden overwogen. Om te testen op antiandrogenen wordt de teststof samen toegediend met een referentieandrogeenagonist. Er moeten minimaal 3 testgroepen met verschillende doses van de teststof en een positieve en negatieve controle worden gebruikt (zie paragraaf 44). Afgezien van de toediening van de teststof worden de dieren in de controlegroep op identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen. Indien bij de toediening van de teststof van een medium gebruik wordt gemaakt, dient dit aan de controlegroep in het hoogste gebruikte volume toegediend te worden.
 35.   De dosisniveaus moeten worden voorgesteld en gekozen in het licht van de bestaande gegevens over toxiciteit en (toxico)kinetica van de teststof en verwante stoffen. Bij het hoogste dosisniveau moet in de eerste plaats rekening worden gehouden met de LD50 en/of informatie over acute toxiciteit om overlijden, ernstig lijden of stress voor de dieren te voorkomen (17) (18) (19) (20) en, in de tweede plaats, met de beschikbare informatie over de doses die in de subchronische en chronische studies gebruikt zijn. In het algemeen zou de hoogste dosis geen verlaging van het uiteindelijke lichaamsgewicht van de dieren van meer dan 10 % van het controlegewicht moeten veroorzaken. De hoogste dosis moet zijn hetzij 1) de hoogste dosis die overleving van het dier waarborgt en die geen aanzienlijke toxiciteit of stress aan de dieren geeft na 10 opeenvolgende dagen van toediening tot een maximale dosis van 1 000 mg/kg/dag (zie paragraaf 36) of 2) een dosis die (anti)androgene effecten opwekt, afhankelijk van welke lager is. Bij screening zijn grote intervallen, bijvoorbeeld een half log eenheden (overeenkomend met een dosisprogressie van 3,2) of zelfs één log eenheden, tussen toedieningen aanvaardbaar. Als er geen bruikbare gegevens beschikbaar zijn, kan een bereikbepalingonderzoek worden uitgevoerd (zie paragraaf 37) om de te gebruiken doses te helpen bepalen.
Maximale dosis

36.   Als een test bij de maximale dosis van 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag en een lagere dosis met de voor dit onderzoek voorgeschreven procedures geen statistisch significante verandering in het gewicht van de geslachtsorganen geeft, dan kunnen overige dosisniveaus onnodig worden geacht. De maximale dosis is van toepassing, behalve wanneer op grond van gegevens over blootstelling bij de mens een hoger dosisniveau nodig wordt geacht.
 Overwegingen voor bereikbepaling

37.   Waar nodig kan een preliminair bereikbepalingsonderzoek plaatsvinden met enkele dieren om de geschikte dosisgroepen te selecteren [aan de hand van methoden voor testen op acute toxiciteit (hoofdstukken B.1 bis, B.1 tris van deze bijlage (27), OESO TG 425 (19))]. De doelstelling in het geval van de Hershberger-bioassay is om doses te selecteren waarbij de dieren overleven en die geen aanmerkelijke toxiciteit of stress aan de dieren veroorzaken na tien opeenvolgende dagen van toediening van de stof tot een maximale dosis van 1 000 mg/kg/d zoals opgemerkt in paragrafen 35 en 36. Hierbij kan een OESO-leidraad (17) worden gebruikt waarin de klinische tekenen worden gedefinieerd die wijzen op toxiciteit of stress voor de dieren. Waar mogelijk kunnen binnen dit bereikbepalingsonderzoek na tien dagen toediening de doelweefsels worden uitgesneden en gewogen, ongeveer 24 uur na toediening van de laatste dosis. Deze gegevens kunnen dan worden gebruikt om te helpen bij het selecteren van de dosis in het hoofdonderzoek.
Referentiestoffen en medium

38.   De referentieandrogeenagonist moet zijn testosteronpropionaat (TP), CAS nr 57-82-5. De referentie-TP-dosering kan zijn hetzij 0,2 mg/kg-lg/d of 0,.4 mg/kg-lg/d. De referentieandrogeenantagonist moet zijn flutamide (FT), CAS nr 1311-84-7. De referentie-FT-dosering moet zijn 3 mg/kg-lg/d, en FT moet gelijktijdig worden toegediend met de referentie-TP-dosering.
 39.   Het wordt aanbevolen waar mogelijk eerst het gebruik van een waterig(e) oplosmiddel/suspensie te overwegen. Maar omdat veel androgeenliganden of hun metabole precursors over het algemeen hydrofoob zijn, is de meest gangbare benadering om een oplossing/suspensie in olie te gebruiken (bv. maïs-, pinda-, sesam- of olijfolie). Teststoffen kunnen worden opgelost in een minimale hoeveelheid 95 % ethanol of andere geschikte oplosmiddelen en verdund tot de uiteindelijke werkconcentraties in het testmedium. De toxische eigenschappen van het oplosmiddel moeten bekend zijn, en moeten in een aparte controlegroep met alleen oplosmiddel worden getest. Als de teststof stabiel wordt geacht, kan voorzichtige verwarming en krachtig schudden worden gebruikt om te helpen bij het oplossen van de teststof. De stabiliteit van de teststof in het medium moet worden bepaald. Als de teststof gedurende het onderzoek stabiel is, kan één beginaliquot van de teststof worden bereid, en kunnen de gespecificeerde oplossingen dagelijks worden bereid, waarbij vervuiling en morsen van de monsters wordt vermeden.
Toediening van de doses

40.   TP moet worden toegediend door subcutane injectie en FT via maagsonde.
41.   De teststof wordt toegediend via maagsonde of subcutane injectie. Bij het kiezen van de toedieningsroute moet rekening worden gehouden met dierwelzijn en de fysische/chemische eigenschappen van de teststof. Daarnaast moet rekening worden gehouden met toxicologische aspecten zoals de relevantie van de humane route van blootstelling aan de stof (bv. maagsonde voor modelingestie, subcutane injectie voor modelinhalatie of dermale absorptie) en bestaande toxicologische informatie en gegevens over metablisme en kinetiek (bv. noodzaak om first-passmetabolisme te voorkomen, betere effectiviteit via een bepaalde route) voordat uitvoerige en langdurige tests worden gestart als positieve resultaten met injectie worden verkregen.
 42.   De dieren moeten gedurende tien opeenvolgende dagen met intervallen van ongeveer 24 uur op dezelfde manier en op hetzelfde tijdstip een dosis ontvangen. Het dosisniveau moet dagelijks worden aangepast op basis van gelijktijdig verrichte meting van het lichaamsgewicht. Het volume van de dosis en de tijd waarop deze is toegediend moet op elke blootstellingsdag worden vastgelegd. Er moet voor worden gezorgd dat de maximale dosis die in paragraaf 35 is beschreven niet wordt overschreven om zo een zinvolle interpretatie van de gegevens mogelijk te maken. Vermindering van lichaamsgewicht, klinische tekenen, en andere bevindingen moeten in dit opzicht grondig worden beoordeeld. Bij voeding via een orale maagsonde moet een geschikte buis of intubatiecanule worden gebruikt. Het maximale volume dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. De lokale richtlijnen voor dierverzorging moeten worden gevolgd, maar het volume mag niet hoger zijn dan 5 ml/kg lichaamsgewicht, behalve in het geval van oplossingen in water waarbij 10 ml/kg lichaamsgewicht aangehouden kan worden. Voor subcutane injecties moeten de doses worden toegediend in het dorsoscapulaire en of lumbale gebied via een steriele naald (bv. 23- of 25-gauge) en een tuberculinespuit. Het scheren van de injectieplaats is facultatief. Elk(e) verlies of lekkage op de injectieplaats of onvolledige toediening moet worden vastgelegd. Het totale per rat geïnjecteerde volume per dag mag niet hoger zijn dan 0,5 ml/kg lichaamsgewicht.
Specifieke procedures voor androgeenagonisten

43.   Voor de androgeenagonisttest is het medium de negatieve controle, de met TP behandelde groep is de positieve controle. Biologische activiteit die past bij androgeenagonisten wordt getest door toediening van een teststof aan behandelingsgroepen in geselecteerde doses gedurende 10 opeenvolgende dagen. Het gewicht van de vijf weefsels van secundaire geslachtsorganen uit de teststofgroepen wordt vergeleken met de mediumgroep op statistisch significante gewichtstoenames.
 Specifieke procedures voor androgeenantagonisten en 5α-reductaseremmers

44.   Voor de androgeenantagonisten- en 5α-reductaseremmerstest is de met TP behandelde groep de negatieve controle, en de groep met gelijktijdige toediening van referentiedoses TP en FT de positieve controle. Er wordt getest op biologische activiteit die past bij androgeenantagonisten en 5α-reductaseremmers door toediening van een referentiedosis TP en toediening van de teststof gedurende 10 opeenvolgende dagen. Het gewicht van de vijf weefsels uit secundaire geslachtsorganen uit de groepen met TP en teststof worden vergeleken met de referentiegroep met alleen TP op statistisch significante gewichtsafnames.
WAARNEMINGEN

Klinische waarnemingen

45.   Minstens eenmaal per dag, en vaker als er tekenen van toxiciteit worden waargenomen, moeten algemene klinische waarnemingen worden gedaan. De waarnemingen worden bij voorkeur elke dag op het/dezelfde tijdstip(pen) verricht waarbij rekening wordt gehouden met de periode met verwachte piekeffecten na toediening. Alle dieren moeten worden geobserveerd op mortaliteit, morbiditeit, en algemene klinische tekenen zoals veranderingen in gedrag, huid, vacht, ogen, slijmvliezen, uitscheidingen en afscheidingen en autonome activiteiten (zoals traanvorming, rechtopstaan van het haar, pupilgrootte, ongebruikelijk ademhalingspatroon).
46.   Elk dood aangetroffen dier moet worden verwijderd en afgevoerd zonder verdere gegevensanalyse. Alle mortaliteit van dieren vóór obductie moet in het onderzoeksverslag worden opgenomen samen met een eventuele kennelijke reden voor de mortaliteit.. Stervende dieren moeten op humane wijze worden gedood. Alle stervende en gedode dieren moeten worden opgenomen in het onderzoeksverslag met de kennelijke redenen voor de morbiditeit.
Lichaamsgewicht en consumptie van voer

47.   Alle dieren moeten dagelijks worden gewogen op 0,1 g nauwkeurig, te beginnen vlak voor de behandeling start, d.w.z. wanneer de dieren over de groepen worden verdeeld. Eventueel kan de hoeveelheid voer die tijdens de behandelperiode geconsumeerd wordt, per kooi gemeten worden door de voerbak te wegen. De voerconsumptiegegevens moeten worden genoteerd in gram per rat per dag.
 Sectie en meting van weefsel- en orgaangewicht

48.   Ongeveer 24 uur na de laatste toediening van de teststof moeten de ratten worden gedood met aftappen van bloed volgens normale procedures van het uitvoerende laboratorium, en obductie worden verricht. De wijze van humaan doden moet in het laboratoriumrapport worden vermeld.
49.   Idealiter moet de volgorde van obductie worden gerandomiseerd tussen de groepen om opeenvolgende stijgende of dalende doses te vermijden, wat de gegevens zou kunnen beïnvloeden. Alle bevindingen bij obductie, met name pathologische veranderingen/zichtbare laesies moeten worden opgemerkt en gerapporteerd.
 50.   De vijf androgeenafhankelijke weefsels (VP, SV, LABC, COW, GP) moeten worden gewogen. Deze weefsels moeten worden uitgesneden, waarbij aanliggend weefsel en vet zorgvuldig worden weggesneden, en hun verse (niet gefixeerde) gewicht wordt vastgesteld. Elk weefsel moet met grote zorg worden behandeld om verlies van vocht en uitdroging te voorkomen, wat aanmerkelijke fouten en variabiliteit kan veroorzaken doordat het vastgelegde gewicht lager is. Verschillende weefsels kunnen heel klein of moeilijk te ontleden zijn, en dit zal tot variabiliteit leiden. Daarom is het belangrijk dat de personen die de sectie op de weefsels van de secundaire geslachtsorganen verrichten bekend zijn met de standaard sectieprocedures voor deze weefsels. Een standard operating procedure (SOP)-gids voor sectie is beschikbaar bij de OESO (21). Met zorgvuldige training volgens de SOP-gids wordt mogelijke variabiliteit in het onderzoek tot een minimum beperkt. Idealiter is steeds dezelfde prosector verantwoordelijk voor de sectie van een bepaald weefsel om interindividuele verschillen in de verwerking van weefsels te elimineren. Als dat niet mogelijk is, moet de obductie zo worden ingericht dat elke prosector sectie verricht op een bepaald weefsel uit alle behandelingsgroepen in plaats van dat één persoon sectie verricht op alle weefsels uit een controlegroep, terwijl iemand anders verantwoordelijk is voor de behandelde groepen. Alle secundaire geslachtsweefsels moeten zonder droogdeppen worden gewogen, afgerond op 0,1 mg, en het gewicht wordt voor elk dier vastgelegd.
51.   Sommige weefsels kunnen heel klein zijn waardoor sectie moeilijk te verrichten is, en dit zal tot variabiliteit leiden. In het verleden is gebleken dat variatiecoëfficiënten (CV's) kunnen verschillen als gevolg van verschillen in vaardigheid van het laboratorium. In enkele gevallen zijn bij een bepaald laboratorium grote verschillen in het absolute gewicht van de weefsels zoals de VP en COWS waargenomen.
 52.   Meting van gewicht van lever, nieren paarsgewijs, en bijnieren paarsgewijs, is facultatief. Ook hier moeten weefsels worden ontdaan van aanliggend bindweefsel en vet. Het gewogen levergewicht moet worden vastgelegd, afgerond op 0,1 g, en de nieren en bijnieren moeten paarsgewijs worden gewogen en afgerond op 0,1 mg. De lever, nieren en bijnieren worden niet alleen door androgenen beïnvloed; ze leveren ook bruikbare indices op van systemische toxiciteit.
53.   Meting van luteïniserend hormoon (LH), follikelstimulerend hormoon (FSH) en testosteron (T) in het serum is facultatief. Serum T-concentraties zijn nuttig voor het vaststellen of de teststof metabolisme van testosteron door de lever induceert waardoor de serumconcentraties dalen. Zonder de T-gegevens zou zo'n effect kunnen lijken plaats te vinden via een antiandrogeen mechanisme. De LH-concentraties geven informatie over het vermogen van een antiandrogeen om niet alleen het orgaangewicht te verminderen, maar ook de hypothalamus-hypofysefunctie te beïnvloeden, wat in langetermijnstudies testistumoren kan induceren. FSH is een belangrijk hormoon voor de spermatogenese. Serum-T4 en -T3 zijn ook optionele metingen die nuttige aanvullende informatie kunnen geven over het vermogen om de homeostase van het thyroïdhormoon te verstoren. Als hormoonmetingen gedaan worden, moeten de ratten vóór obductie onder narcose worden gebracht en wordt bloed met een hartpunctie afgenomen; de wijze van verdoving moet zorgvuldig worden gekozen zodat deze de hormoonmeting niet beïnvloedt. De methode van serumbereiding, de herkomst van de radio-immunoassay of andere sets voor meting, de analystische procedures, en de resultaten moeten worden vastgelegd. LH-concentraties worden vermeld als ng per ml serum, en T moet ook worden vermeld als ng per ml serum.
 54.   Sectie op de weefsels wordt als volgt beschreven met een gedetailleerde sectiegids met foto's, gepubliceerd als aanvullend materiaal in het kader van het valideringsprogramma (21). Een sectievideo is ook beschikbaar op de webpagina van de Korea Food and Drug Administration (22).
—


Stel met de buikzijde van het dier omhoog vast of de voorhuid van de penis is losgekomen van de glans penis. Zo ja, trek de voorhuid dan terug en verwijder de glans penis, weeg deze (afronden op 0,1 mg), en noteer het gewicht.
—


Open de buikhuid en -wand, waardoor de ingewanden worden blootgelegd. Als de optionele organen gewogen worden, verwijder de lever dan en weeg deze, rond af op 0,1 g, verwijder de maag en darmen, verwijder en weeg paarsgewijs de nieren en bijnieren, rond af op 0,1 mg. Met deze sectie wordt de blaas blootgelegd en kan worden begonnen met de sectie van de gewenste secundaire geslachtsweefsels.
—


Voor sectie van de VP wordt de blaas van de ventrale spierlaag losgemaakt door het bindweefsel langs de middellijn door te snijden. Schuif de blaas in anterieure richting opzij naar de zaadblaasjes (SV), waardoor de linker- en rechterlobben van de ventrale prostaat (bedekt door een vetlaag) zichtbaar worden. Verwijder voorzichtig het vet van de rechter- en linkerlobben van de VP. Trek voorzichtig de rechter VP-lob van de urethra af en snijd de lob van de urethra los. Terwijl de rechter VP-lob nog wordt vastgehouden, wordt voorzichtig de linker VP-lob van de urethra afgetrokken en losgesneden; weeg en rond af op 0,1 mg en noteer het gewicht.
 —


Voor sectie van de SVCG wordt de blaas in caudale richting verschoven, waardoor de vas deferens en rechter- en linkerlobben van de zaadblaasjes plus coagulans uitscheidende klieren (SVCG) zichtbaar worden. Voorkom lekkage van vocht door een hemostaatklem aan de basis van de SVCGs te plaatsen, waar de vas deferens samenkomt met de urethra. Snijd voorzichtig de SVCGs los, met de hemostaat op zijn plaats, verwijder vet en adnexa, leg in een getarreerde weger, verwijder de hemostaat, weeg en rond af op 0,1 mg, en noteer het gewicht.
—


Voor sectie van de m. levator ani plus bulbocavernosus (LABC) worden de spieren en de basis van de penis blootgelegd. De LA-spieren liggen rond de colon, terwijl de anterieure LA- en BC-spieren aan de bulbus penis gehecht zijn. De huid en adnexa van het perianale gebied vanaf de basis van de penis tot het anterieure uiteinde van de anus worden verwijderd. De BC-spieren worden een voor een van de bulbus penis en weefsels losgemaakt. De colon wordt doorgesneden en de volledige LABC kan worden uitgesneden en verwijderd. De LABC moet worden ontdaan van vet en adnexa, gewogen met afronding op 0,1 mg, en het gewicht moet worden genoteerd.
—


Na verwijdering van de LABC zijn de ronde Cowperse of bulbo-urethrale klieren (COW) zichtbaar aan de basis van, en enigszins dorsaal van, de bulbus penis. Zorgvuldige sectie is geboden om te voorkomen dat het dunne kapsel wordt doorgeprikt om zo vochtlekkage te vermijden. Weeg de COW paarsgewijs, rond af op 0,1 mg, en noteer het gewicht.
—


Daarnaast moet eventueel verlies van vocht uit een klier tijdens obductie en sectie worden genoteerd.
 55.   Als de beoordeling van elke stof de obductie van meer dieren vereist dan voor één dag redelijk is, kan het begin van het onderzoek over twee opeenvolgende dagen worden verspreid, waardoor obductie en verwante werkzaamheden ook over twee dagen worden verspreid. Als de werkzaamheden zo worden gespreid, moet per dag de helft van de dieren per behandelingsgroep worden verwerkt.
56.   Na obductie moeten de karkassen op passende wijze worden afgevoerd.
RAPPORTAGE

Gegevens

57.   Gegevens moeten individueel worden gemeld (te weten lichaamsgewicht, gewicht secundaire geslachtsweefsels, optionele metingen en andere responsen en waarnemingen) en voor elke groep dieren (gemiddelden en standaarddeviaties van alle verrichte metingen). De gegevens moeten in tabelvorm worden samengevat. De gegevens moeten het aantal dieren laten zien aan het begin van de test, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of met tekenen van toxiciteit, een omschrijving van de waargenomen tekenen van toxiciteit, waaronder tijd van begin, duur en ernst.
58.   Een eindrapport moet het volgende bevatten:

Testinstelling:







—


naam instelling, locatie,










—


onderzoeksleider en andere medewerkers en hun verantwoordelijkheden met betrekking tot het onderzoek,










—


begin- en einddatum van het onderzoek, te weten de eerste dag van toediening van de teststof resp. laatste dag van obductie.
Teststof:







—


herkomst, partij/chargenummer, identiteit, zuiverheid, volledig adres van leverancier en kenmerken van de teststof,










—


fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische eigenschappen,










—


opslagomstandigheden en methode en frequentie van bereiding van verdunning,










—


alle gegenereerde gegevens over stabiliteit,










—


alle analyses van doseeroplossingen/suspensies.
Medium:







—


kenmerken van het medium (identiteit, leverancier en partijnummer),










—


motivering van de keuze van het medium (wanneer dat geen water is).
 Procedures voor proefdieren en dierhouderij:







—


gebruikte diersoort/stam en motivering van de keuze,










—


herkomst of leverancier van dieren, inclusief volledig adres,










—


aantal en leeftijd van geleverde dieren,










—


huisvesting (temperatuur, verlichting enz.),










—


voer (naam, type, leverancier, partijnummer, inhoud en indien bekend, concentraties fyto-oestrogenen),










—


strooisel (naam, type, leverancier, samenstelling),










—


omstandigheden in de kooi en aantal dieren per kooi.
Testomstandigheden:







—


leeftijd bij castratie en duur van acclimatisatie na castratie,










—


individueel gewicht van de dieren bij aanvang van het onderzoek (afgerond op 0,1 g),










—


randomisatieproces en een vastlegging van de toewijzing aan medium, referentie, teststofgroepen, en kooien,










—


gemiddelde en standaarddeviatie van lichaamsgewicht voor elke groep voor elke weegdag in het onderzoek,










—


motivering van de keuze van de dosis,










—


Toedieningsroute van teststof en motivering van keuze van de blootstellingsweg,










—


indien een bepaling voor antiandrogeniteit, de TP-behandeling (dosis en volume),










—


behandeling met teststof (dosis en volume),










—


tijdstip van toediening,










—


obductieprocedures, inclusief wijze van aftappen van bloed en eventuele narcose,










—


Indien serumanalyses worden verricht, moeten details van de methode worden gegeven. Bijvoorbeeld, als RIA wordt gebruikt, moet de RIA-procedure, herkomst van RIA-sets, vervaldata van sets, procedure voor scintillatietelling, en standaardisatie worden vermeld.
Resultaten:







—


Dagelijkse observaties voor elk dier tijdens toediening, waaronder:










—


lichaamsgewicht (afgerond op 0,1 g),










—


klinische tekenen (indien aanwezig),










—


eventuele meting van of opmerking over voerconsumptie.
 —


Observaties bij obductie voor elk dier, waaronder:










—


datum obductie,










—


behandelingsgroep van het dier,










—


dier-ID,










—


prosector,










—


tijdstip dat necropsie en sectie wordt verricht,










—


leeftijd dier,










—


uiteindelijk lichaamsgewicht bij obductie, met opmerking van eventuele statistisch significante toename of afname,










—


volgorde van aftappen van bloed en sectie bij obductie,










—


gewicht van de vijf androgeenafhankelijke doelweefsels:










—


ventrale prostaat (afgerond op 0,1 mg),










—


zaadblaasjes plus coagulans uitscheidende klieren, inclusief vocht (paarsgewijs, afgerond op 0,1 mg),










—


m levator ani plus bulbocavernosuscomplex (afgerond op 0,1 mg),










—


Cowperse klieren (vers gewicht — paarsgewijs, afgerond op 0,1 mg),










—


glans penis (vers gewicht afgerond op 0,1 mg),










—


gewicht van optionele weefsels, indien verricht:










—


lever (afgerond op 0,1 g),










—


nieren (paarsgewijs, afgerond op 0,1 mg),










—


bijnieren (paarsgewijs, afgerond op 0,1 mg),










—


algemene opmerkingen.
—


Analyses van serumhormonen, indien verricht:






—


serum-LH (facultatief — ng per ml serum), en










—


serum-T (facultatief — ng per ml serum), en














—


algemene opmerkingen.
Samenvatting van gegevens

Gegevens moeten worden samengevat in tabelvorm met steekproefgrootte voor elke groep, gemiddelde van de waarde, en de standaardfout of standaarddeviatie. Tabellen moeten lichaamsgewicht bij obductie, veranderingen in lichaamsgewicht vanaf begin van toediening tot obductie, gewicht secundaire geslachtsdoelweefsels, en eventuele optionele orgaangewichten bevatten.
Bespreking van de resultaten.
 Analyse van resultaten

59.   Het lichaams- en orgaangewicht bij obductie moeten statistisch worden geanalyseerd op kenmerken zoals homogeniteit van variantie met passende datatransformaties waar nodig. Behandelingsgroepen moeten worden vergeleken met een controlegroep aan de hand van technieken als ANOVA gevolgd door paarsgewijze vergelijkingen (bv. eenzijdige Dunnett-test) en het criterium voor statistisch verschil, bijvoorbeeld p ≤ 0,05. Groepen die statistische significantie bereiken moeten worden geïdentificeerd. Maar „relatief orgaangewicht” moet worden vermeden vanwege de ongeldige statistische aannamen die aan deze gegevensbewerking ten grondslag liggen.
60.   Voor androgeenagonisme moet de controle de testgroep met alleen medium zijn. De kenmerken van het werkingsmechanisme van de teststof kunnen tot verschillende relatieve responsen in weefsels leiden, bijvoorbeeld trenbolon, waarbij 5α-reductie niet mogelijk is, heeft een meer uitgesproken effect op het LABC en GP dan TP. Een statistisch significante verhoging (p≤ 0,05) in het gewicht van twee of meer van de vijf androgeenafhankelijke doelweefsels (VP, LABC, GP, CG en SVCG) moet worden beschouwd als een positief androgeenagonistresultaat, en alle doelweefsels moeten enige mate van groeitoename vertonen. Een gecombineerde beoordeling van de respons van de weefsels van alle secundaire geslachtsorganen (ASO) kan worden bereikt met passende multivariabele gegevensanalyse. Dit kan de analyse verbeteren, vooral in gevallen waar slechts één weefsel een statistisch significante respons vertoont.
 61.   Voor androgeenantagonisme moet de controle de testgroep met het referentieandrogeen (alleen testosteronpropionaat) zijn. De kenmerken van het werkingsmechanisme van een teststof kunnen tot een verschillende relatieve respons in weefsels leiden; zo hebben 5α-reductaseremmers als finasteride een meer uitgesproken effect op de ventrale prostaat dan andere weefsels in vergelijking met krachtige AR-antagonisten, zoals flutamide. Een statistisch significante verlaging (p≤ 0,05) in het weefselgewicht van twee of meer van de vijf androgeenafhankelijke doelweefsels (VP, LABC, GP, CG en SVCG) wordt beschouwd als een positief androgeenantagonistresultaat, en alle doelweefsels moeten enige mate van groeiafname vertonen. Een gecombineerde beoordeling van alle ASO-weefselresponsen kan worden bereikt met passende multivariabele gegevensanalyse. Dit kan de analyse verbeteren, vooral in gevallen waar slechts één weefsel een statistisch significante respons vertoont.
 62.   De gegevens moeten worden samengevat in tabelvorm met gemiddelde, standaardfout (standaarddeviatie zou ook acceptabel zijn) en steekproefgrootte voor elke groep. Ook individuele datatabellen moet worden toegevoegd. De individuele waarden, gemiddelden, SE (SD) en CV-waarden voor de controlegegevens moeten worden geverifieerd om vast te stellen of ze aan aanvaardbare criteria voldoen voor consistentie met verwachte historische waarden. Aan de hand van CV's die de CV-waarden in tabel 1 (zie paragraaf 25 en 26) voor elk orgaangewicht te boven gaan, moeten worden vastgesteld of er fouten zijn in het vastleggen of invoeren van gegevens, dan wel of het laboratorium een accurate sectie van androgeenafhankelijke weefsels nog niet beheerst en aanvullende training/oefening gerechtvaardigd is. Over het algemeen zijn CV's (de standaarddeviatie gedeeld door het gemiddelde orgaangewicht) van lab tot lab en van onderzoek tot onderzoek reproduceerbaar. De gepresenteerde gegevens moeten ten minste bevatten: ventrale prostaat, zaadblaasje, m levator ani plus bulbocavernosus, Cowperse klieren, glans penis, lever, en lichaamsgewicht en verandering in lichaamsgewicht vanaf begin van toediening tot obductie. Gegevens kunnen ook worden gepresenteerd na aanpassing voor covariantie voor lichaamsgewicht, maar dit moet niet in de plaats komen van het presenteren van de onaangepaste gegevens. Daarnaast, als het loskomen van de voorhuid (preputial separation — PPS) niet in een van de groepen optreedt, moet de incidentie van PPS worden vastgelegd en statistisch vergeleken met de controlegroep aan de hand van de Fisher Exact test.
63.   Bij controle op juistheid van de ingegeven computergegevens door vergelijking met de oorspronkelijke gegevensformulieren, moeten waarden voor orgaangewicht die niet biologisch plausibel zijn of met meer dan drie standaarddeviaties van het gemiddelde van die behandelingsgroep afwijken, zorgvuldig worden onderzocht en mogelijk worden genegeerd, omdat het waarschijnlijk fouten in de vastlegging zijn.
 64.   Vergelijking van onderzoeksresultaten met OESO-waarden (in tabel 1) is vaak een belangrijke stap in het interpreteren van de validiteit van de onderzoeksresultaten. In het laboratorium moeten historische gegevens voor mediumcontrolegroepen worden bijgehouden. Historische gegevens voor responsen op positieve referentiestoffen, zoals TP en FT, moeten eveneens in het laboratorium worden bijgehouden. Laboratoria kunnen ook periodiek de respons op bekende zwakke androgeenagonisten en -antagonisten testen en deze gegevens bijhouden. Deze gegevens kunnen worden vergeleken met beschikbare OESO-gegevens om ervoor te zorgen dat de methoden in het laboratorium voldoende statistisch(e) precisie en onderscheidingvermogen opleveren.
Aanhangsel 1
DEFINITIES






 



Androgeen is een term waarmee een positieve invloed op de groei van androgeenafhankelijke weefsels wordt beschreven.
Antiandrogeen is het vermogen van een stof om in een zoogdierorganisme de werking van TP te onderdrukken.
Stof betekent een stof of mengsel.
Geboortedatum is postnatale dag 0.
Dosis: de toegediende hoeveelheid teststof. Voor de Hershberger-bioassay wordt de dosis uitgedrukt als gewicht van de teststof per eenheid lichaamsgewicht van het proefdier per dag (bv. mg/kg lichaamsgewicht/dag).
Dosering is een algemene term die de dosis, de frequentie en de duur van de toediening omvat.
Stervend wil zeggen een dier dat op het punt van overlijden staat.
Postnatale dag x is de x'e levensdag na de geboortedag.
Gevoeligheid is het vermogen van de testmethode om correct stoffen te identificeren die de eigenschap hebben waarop wordt getest.
Specificiteit is het vermogen van een testmethode om correct stoffen te identificeren die niet de eigenschap hebben waarop wordt getest.
Teststof betekentalle volgens deze testmethode geteste stoffen of mengsels.
Validering is een wetenschappelijke methode die erop gericht is om de operationele vereisten en beperkingen van een testmethode te beschrijven en de betrouwbaarheid en relevantie ervan voor een bepaald doel aan te tonen.
 Aanhangsel 2


OPMERKINGEN BIJ HET KADER







Opmerking 1:



het is mogelijk om op alle niveaus in- en uit te stappen. Dit hangt af van de soort informatie waaraan behoefte bestaat voor gevaar- en risicobeoordelingsdoeleinden.
Opmerking 2:



in niveau 5 moet de ecotoxicologie eindpunten omvatten die duiden op mechanismen van schadelijke effecten en potentiële schade voor de populatie.
Opmerking 3:



als een multimodaal model enkele van de testen met een enkel eindpunt omvat, vervangt dat model het gebruik van deze testen met een enkel eindpunt.
Opmerking 4:



de beoordeling van elke stof moet per geval plaatsvinden, rekening houdend met alle beschikbare informatie en de functie van de niveaus van het kader.
Opmerking 5:



het kader moet op dit moment niet worden beschouwd als alomvattend. Op niveaus 3, 4 en 5 voorziet het kader in testen die al beschikbaar zijn of waarvan de validering nog loopt. De laatstgenoemde testen zijn daarom als voorlopig opgenomen. Na de ontwikkeling en validering ervan worden deze testen formeel toegevoegd aan het kader.
Opmerking 6:



niveau 5 moet niet worden beschouwd als een niveau dat alleen beslissende testen omvat. Tests die in dat niveau zijn opgenomen worden geacht aan de algehele beoordeling van gevaar en risico bij te dragen.
LITERATUUR









1.
OESO (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10-11 maart 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.
2.
Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. Academic Press, NY.
3.
Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and antiandrogenic activity in castrate-immature male rats. In: Current Protocols in Toxicology 16.9.1-16.9.15. J Wiley and Sons Inc.
4.
 OESO (2006). Final OECD report of the initial work towards the validation of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testosterone propionate and antiandrogenic effects of flutamide. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 62. ENV/JM/MONO(2006)30.
5.
OESO (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5α-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Laboratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 86. ENV/JM/MONO(2008)3.
6.
OESO (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 73. ENV/JM/MONO(2007)20.
7.
Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269.
8.
Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E (2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671-8.
9.
Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. Biochem J26:413-422.
10.
Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J26:1306-1314.
11.
Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp Therap 99:38-44.
12.
