None
L_2014247NL.01000101.xml











21.8.2014   


NL


Publicatieblad van de Europese Unie


L 247/1





VERORDENING (EU) Nr. 900/2014 VAN DE COMMISSIE
van 15 juli 2014
tot wijziging, in verband met de aanpassing ervan aan de technische vooruitgang, van Verordening (EG) nr. 440/2008 houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH)
(Voor de EER relevante tekst)
DE EUROPESE COMMISSIE,
Gezien het Verdrag betreffende de werking van de Europese Unie,
Gezien Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad van 18 december 2006 inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (Reach), tot oprichting van een Europees Agentschap voor chemische stoffen, houdende wijziging van Richtlijn 1999/45/EG en houdende intrekking van Verordening (EEG) nr. 793/93 van de Raad en Verordening (EG) nr. 1488/94 van de Commissie alsmede Richtlijn 76/769/EEG van de Raad en de Richtlijnen 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG en 2000/21/EG van de Commissie (1), en met name artikel 13, lid 2,
Overwegende hetgeen volgt:






(1)


Verordening (EG) nr. 440/2008 van de Commissie (2) bevat de testmethoden voor de bepaling van de fysisch-chemische eigenschappen, de toxiciteit en de ecotoxiciteit van chemische stoffen die worden toegepast voor de uitvoering van Verordening (EG) nr. 1907/2006.
(2)


Verordening (EG) nr. 440/2008 moet worden bijgewerkt om daarin met prioriteit nieuwe en bijgewerkte, recentelijk door de OESO goedgekeurde testmethoden op te nemen teneinde rekening te houden met de technische vooruitgang en overeenkomstig Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad (3) tot een verlaging van het aantal proefdieren te komen. De belanghebbenden zijn over dit voorstel geraadpleegd.
 (3)


Deze aanpassing aan de technische vooruitgang betreft zes nieuwe testmethoden voor de bepaling van de toxiciteit en andere gezondheidseffecten, waaronder een onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit, een uitgebreid onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie, een in-vivogenmutatietest met transgene knaagdieren, een in-vitrotest om de effecten op de synthese van steroïde hormonen te beoordelen en twee in-vivomethoden voor de beoordeling van oestrogene en (anti)androgene effecten.
(4)


Verordening (EG) nr. 440/2008 moet daarom dienovereenkomstig worden gewijzigd.
(5)


De in deze verordening vervatte maatregelen zijn in overeenstemming met het advies van het bij artikel 133 van Verordening (EG) nr. 1907/2006 ingestelde comité,




HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:
Artikel 1
De bijlage bij Verordening (EG) nr. 440/2008 wordt overeenkomstig de bijlage bij deze verordening gewijzigd.
Artikel 2
Deze verordening treedt in werking op de derde dag na die van de bekendmaking ervan in het Publicatieblad van de Europese Unie.
Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke lidstaat.
Gedaan te Brussel, 15 juli 2014.
Voor de Commissie


De voorzitter

José Manuel BARROSO




(1)  PB L 396 van 30.12.2006, blz. 1.
(2)  Verordening (EG) nr. 440/2008 van de Commissie van 30 mei 2008 houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH) (PB L 142 van 31.5.2008, blz. 1).
(3)  Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (PB L 276 van 20.10.2010, blz. 33).
 BIJLAGE
De bijlage bij Verordening (EG) nr. 440/2008 wordt als volgt gewijzigd:
De volgende hoofdstukken B.53, B.54, B.55, B.56, B.57 en B.58 worden toegevoegd:

„B.53.   ONDERZOEK NAAR ONTWIKKELINGSNEUROTOXICITEIT

INLEIDING
1.   Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 426 (2007) van de OESO. In juni 1995 boog een werkgroep inzake reproductie- en ontwikkelingstoxiciteit van de OESO in Kopenhagen zich over de noodzaak om de bestaande OESO-testrichtlijnen voor reproductie- en ontwikkelingstoxiciteit bij te werken en over de ontwikkeling van nieuwe richtsnoeren voor nog niet behandelde eindpunten (1). De werkgroep deed de aanbeveling een testrichtlijn voor ontwikkelingsneurotoxiciteit te schrijven uitgaande van een Amerikaanse EPA-richtlijn, die inmiddels is herzien (2). In juni 1996 werd in Kopenhagen een tweede raadplegingsbijeenkomst gehouden om het Secretariaat een leidraad te bieden voor de opzet van een nieuwe testrichtlijn voor ontwikkelingsneurotoxiciteit, met inbegrip van de hoofdelementen, bv. details over de keuze van de diersoort, toedieningsperiode, testperiode, te beoordelen eindpunten en criteria voor de evaluatie van de resultaten. In 1998 werd een Amerikaanse richtlijn over risicobeoordeling van neurotoxiciteit gepubliceerd (3). In oktober 2000 vonden back-to-back een OESO-raadplegingsbijeenkomst met deskundigen en een workshop van het Risk Science Institute van het ILSI plaats en in 2005 vond in Tokio een raadplegingsbijeenkomst met deskundigen plaats. Deze bijeenkomsten vonden plaats om de wetenschappelijke en technische problemen in verband met de huidige testrichtlijn te bespreken en de aanbevelingen van de bijeenkomsten (4)(5)(6)(7) werden bij de ontwikkeling van deze testmethode in aanmerking genomen. Aanvullende informatie over de uitvoering, interpretatie en de voor deze testmethode gebruikte terminologie is te vinden in de OESO-leidraden nr. 43: „Reproductive Toxicity Testing and Assessment” (8) en nr. 20: „Neurotoxicity Testing” (9).
 INLEIDENDE OVERWEGINGEN
2.   Van een aantal stoffen is bekend dat ze ontwikkelingsneurotoxische effecten bij de mens en andere soorten veroorzaken (10)(11)(12)(13). Voor het beoordelen en evalueren van de toxische kenmerken van een stof kan het nodig zijn om de potentiële ontwikkelingsneurotoxiciteit te bepalen. Onderzoeken naar ontwikkelingsneurotoxiciteit zijn bedoeld om gegevens, waaronder dosis-responskarakteriseringen, te verkrijgen over de potentiële functionele en morfologische effecten op het ontwikkelende zenuwstelsel van de nakomelingen die kunnen ontstaan door blootstelling in utero en in het begin van hun leven.
3.   Een onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit kan als een apart onderzoek worden uitgevoerd, worden opgenomen in een onderzoek naar reproductietoxiciteit en/of neurotoxiciteit bij volwassenen (bv. testmethoden B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)) of worden toegevoegd aan een onderzoek naar prenatale-ontwikkelingstoxiciteit (bv. testmethode B.31 (17)). Wanneer het onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit wordt opgenomen in of toegevoegd aan een ander onderzoek, is het absoluut noodzakelijk dat de integriteit van beide onderzoekstypen behouden blijft. Alle testen moeten voldoen aan de toepasselijke wetgeving of richtlijnen van de overheid of de instelling voor het gebruik van proefdieren in onderzoek (bv. 18).
4.   Het testlaboratorium moet vóór uitvoering van het onderzoek alle beschikbare informatie over de teststof bestuderen. Deze informatie betreft de identiteit en structuur van de stof; de fysisch-chemische eigenschappen ervan; de resultaten van eventuele andere in-vitro- of in-vivotoxiciteitstesten met de stof; toxicologische gegevens over qua structuur verwante stoffen, en het/de verwachte vorm(en) van gebruik van de stof. Deze informatie is noodzakelijk om alle betrokkenen ervan te verzekeren dat de test relevant is voor de bescherming van de gezondheid van de mens en helpt bij het kiezen van een geschikte aanvangsdosis.
 PRINCIPE VAN DE TEST
5.   De teststof wordt aan dieren toegediend tijdens de dracht en de zoogperiode. Om de effecten bij drachtige en zogende vrouwtjes te beoordelen, worden moederdieren getest. Dit kan ook vergelijkende informatie geven (moederdieren versus nakomelingen). Voor beoordeling van de neurotoxiciteit worden willekeurig nakomelingen uit nesten gekozen. De beoordeling bestaat uit observaties om macroscopische neurologische en gedragsafwijkingen te detecteren, waaronder de beoordeling van de lichamelijke ontwikkeling, ontogenie van het gedrag, motorische activiteit, motorische en sensorische functie, en het leervermogen en geheugen; alsmede de beoordeling van het hersengewicht en de neuropathologie tijdens de postnatale ontwikkeling en volwassenheid.
6.   Als de testmethode wordt uitgevoerd als een apart onderzoek, kunnen aanvullende beschikbare dieren in elke groep worden gebruikt voor specifieke neurogedrags-, neuropathologische, neurochemische of elektrofysiologische procedures die ter ondersteuning kunnen dienen van de gegevens die zijn verkregen van de door deze testmethode aanbevolen onderzoeken (16)(19)(20)(21). De aanvullende procedures kunnen vooral nuttig zijn als empirische waarnemingen, verwachte effecten of het werkingsmechanisme duiden op een bepaald type neurotoxiciteit. Deze aanvullende procedures kunnen zowel bij de moederdieren als bij de jongen worden gebruikt. Daarnaast kunnen ook ex-vivo- of in-vivoprocedures worden gebruikt, mits deze procedures niet de integriteit van de in-vivoprocedures doen veranderen.
 VOORBEREIDINGEN VOOR DE TEST

Keuze van de diersoort

7.   De testsoort die de voorkeur verdient is de rat; andere soorten kunnen in voorkomende gevallen worden gebruikt. Merk echter op dat de in deze testmethode vermelde dracht- en postnatale dagen specifiek zijn voor vaak gebruikte rattenstammen en dat er vergelijkbare dagen moeten worden gekozen als een andere soort of ongebruikelijke stam wordt gebruikt. Het gebruik van een andere soort moet worden gemotiveerd aan de hand van toxicologische, farmacokinetische en/of andere gegevens. In de motivering moet de beschikbaarheid van soortspecifieke postnatale neurogedrags- en neuropathologische beoordelingen aan de orde komen. Als een eerdere test aanleiding gaf tot bezorgdheid, moet de in die test gebruikte soort/stam worden overwogen. Omdat verschillende rattenstammen verschillende prestatiekenmerken vertonen, moeten er aanwijzingen zijn dat de vruchtbaarheid en het responsvermogen van de gekozen stam toereikend zijn. De betrouwbaarheid en gevoeligheid van andere soorten voor de detectie van ontwikkelingsneurotoxiciteit moeten worden gedocumenteerd.
 Huisvestings- en voedingsomstandigheden

8.   De temperatuur in de proefdierruimte moet 22 °C (± 3 °C) zijn. Hoewel de relatieve luchtvochtigheid ten minste 30 % moet bedragen en, behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte, bij voorkeur niet hoger mag zijn dan 70 %, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Het is ook mogelijk de lichtcyclus vóór het paren en gedurende de duur van het onderzoek om te draaien, zodat de beoordelingen van functie- en gedragseindpunten tijdens de donkere periode (onder rood licht) kunnen worden uitgevoerd, d.w.z. als de dieren normaliter actief zijn (22). Veranderingen van de licht-donkercyclus dienen vergezeld te gaan van een passende acclimatiseringstijd om de dieren aan de nieuwe cyclus te laten wennen. Als voeding mag het gewone proefdiervoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. Het soort voeding en het soort water moeten worden gerapporteerd en beide moeten worden geanalyseerd op onzuiverheden.
 9.   De dieren kunnen elk apart of in kleine groepen van hetzelfde geslacht worden ondergebracht. Het paren moet plaatsvinden in kooien die voor dat doel geschikt zijn. Na gebleken copulatie of niet later dan dag 15 van de dracht, moeten gedekte dieren afzonderlijk in kooien worden ondergebracht, die zijn bestemd voor werpen of moederschap. De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. Als het moment van werpen nadert, moeten de gedekte vrouwtjes worden voorzien van geschikt en gedefinieerd nestmateriaal. Het is algemeen bekend dat onjuiste behandeling of stress tijdens de dracht kan leiden tot ongunstige uitkomsten, zoals prenatale sterfte en afwijkende foetale en postnatale ontwikkeling. Om verlies van de foetus als gevolg van factoren die geen verband houden met de behandeling, te voorkomen, moeten de dieren tijdens de dracht voorzichtig worden behandeld en moet stress als gevolg van externe factoren, zoals overmatig geluid van buitenaf, worden vermeden.
 Voorbereiding van de dieren

10.   Er moeten gezonde dieren worden gebruikt die aan de omstandigheden in het laboratorium hebben kunnen wennen en waarop geen eerdere proeven zijn uitgevoerd, tenzij het onderzoek is opgenomen in een ander onderzoek (zie punt 3). De kenmerken van de proefdieren qua soort, stam, herkomst, geslacht, gewicht en leeftijd worden vastgelegd. Aan elk dier moet een uniek identificatienummer worden toegekend, waarmee het gemarkeerd wordt. De dieren van alle testgroepen moeten zoveel mogelijk van gelijk gewicht en gelijke leeftijd zijn, en moeten tot de normale variëteiten van de onderzochte soort en stam behoren. Bij elk dosisniveau moeten jongvolwassen vrouwtjes worden gebruikt die nog geen jongen hebben gehad. Dekking door mannetjes met dezelfde ouders moet worden vermeden en daar moet op worden toegezien. Drachtdag (gestation day, GD) 0 is de dag waarop een vaginale prop en/of sperma worden waargenomen. Als bij een leverancier dieren zijn aangeschaft die op een bekend tijdstip zijn gedekt, moet een passende acclimatiseringstijd (bv. 2-3 dagen) in acht worden genomen. Gedekte vrouwtjes moeten op neutrale wijze worden toegewezen aan de controle- en behandelgroepen en zo gelijk mogelijk worden verdeeld over de groepen (er wordt bijvoorbeeld een gestratificeerde gerandomiseerde procedure aanbevolen voor een gelijke verdeling over alle groepen, zoals wat betreft lichaamsgewicht). Vrouwtjes die door hetzelfde mannetje zijn geïnsemineerd, moeten gelijkelijk over de groepen worden verdeeld.
 PROCEDURE

Aantal en geslacht van de dieren

11.   Elke test- en controlegroep moet een voldoende aantal drachtige vrouwtjes bevatten die worden blootgesteld aan de teststof om ervoor te zorgen dat het aantal nakomelingen dat wordt geproduceerd toereikend is voor beoordeling van de neurotoxiciteit. Bij elk dosisniveau wordt aanbevolen in totaal 20 nesten te gebruiken. Doseringsopzetten waarbij gebruik wordt gemaakt van duplo's en opeenvolgende groepen zijn toegestaan als het totaal aantal nesten per groep wordt bereikt en passende statistische modellen worden gebruikt om rekening te houden met duplo's.
12.   Op of vóór postnatale dag (PND) 4 (dag van werpen is PND 0), moet de grootte van elk nest worden aangepast door eliminatie van extra jongen door willekeurige selectie tot alle nesten een gelijke nestgrootte hebben (23). De nestgrootte mag niet groter zijn dan de gemiddelde nestgrootte voor de gebruikte knaagdierstam (8-12). Het nest moet zoveel mogelijk bestaan uit gelijke aantallen mannelijke en vrouwelijke jongen. Er dient geen selectieve eliminatie van jongen, bv. op grond van lichaamsgewicht, plaats te vinden. Na standaardisatie van de nesten (ruimen) en voorafgaand aan verder testen van functie-eindpunten, krijgen individuele jongen waarmee testen vóór of na spening uitgevoerd gaan worden, een unieke identificatie met behulp van een geschikte humane methode voor identificatie van jongen (bv. 24).
Toewijzen van dieren aan functie- en gedragstesten, bepaling hersengewicht en neuropathologische beoordelingen

13.   Met deze testmethode kunnen dieren die in utero en via het zogen zijn blootgesteld, op verscheidene manieren worden toegekend aan functie- en gedragstesten, bepaling van geslachtsrijping en hersengewicht en neuropathologische beoordeling (25). Andere testen van de neurogedragsfunctie (bv. sociaal gedrag), neurochemie of neuropathologie kunnen per geval worden toegevoegd, mits de integriteit van de oorspronkelijke vereiste testen niet in het gedrang komt.
 14.   De jongen worden gekozen uit elke dosisgroep en toegewezen aan eindpuntsbeoordelingen op of na PND 4. De selectie van de jongen moet zodanig gebeuren, dat in alle testen beide geslachten uit elk nest in elke dosisgroep zo veel mogelijk gelijk vertegenwoordigd zijn. Voor het testen van de motorische activiteit moet op alle leeftijden vóór spening hetzelfde paar van mannelijke en vrouwelijke jongen worden getest (zie punt 35). Voor alle andere testen kunnen hetzelfde paar of verschillende paren van mannelijke en vrouwelijke dieren worden toegewezen aan verschillende gedragstesten. Er moeten mogelijk verschillende jongen worden toegewezen aan testen van de cognitieve functie met gespeende dieren versus die met volwassen dieren om verstoring door de effecten van leeftijd en eerdere training in deze bepalingen te voorkomen (26)(27). Op het moment van spenen (PND 21) kunnen jongen die niet zijn geselecteerd voor onderzoek, op humane wijze worden afgevoerd. Eventuele veranderingen in toewijzing van jongen moeten worden gerapporteerd. De statistische meeteenheid moet het nest (of het moederdier) zijn en niet het jong.
 15.   De toewijzing van jongen aan de onderzoeken vóór en na spening, cognitieve testen, pathologische onderzoeken enz. kan op verschillende wijzen plaatsvinden (zie figuur 1 voor algemene opzet en aanhangsel 1 voor voorbeelden van toewijzingen). In elke dosisgroep voor onderzoeken vóór en na spening worden de volgende minimumaantallen van dieren aanbevolen:






Klinische observaties en lichaamsgewicht


Alle dieren




Gedetailleerde klinische observaties


20/geslacht (1/geslacht/nest)




Hersengewicht (na fixatie) PND 11-22


10/geslacht (1/nest)




Hersengewicht (niet gefixeerd) ~ PND 70


10/geslacht (1/nest)




Neuropathologie (immersie- of perfusiefixatie) PND 11-22


10/geslacht (1/nest)




Neuropathologie (perfusiefixatie) PND ~70


10/geslacht (1/nest)




Geslachtsrijping


20/geslacht (1/geslacht/nest)




Andere ontwikkelingsmijlpalen (facultatief)


Alle dieren




Ontogenie van het gedrag


20/geslacht (1/geslacht/nest)




Motorische activiteit


20/geslacht (1/geslacht/nest)




Motorische en sensorische functie


20/geslacht (1/geslacht/nest)




Leervermogen en geheugen


10/geslacht (1) (1/nest)





Dosering

16.   Er worden ten minste drie dosisniveaus en een gelijktijdige controlegroep gebruikt. De dosisniveaus moeten zodanig zijn verdeeld, dat een gradatie in toxische effecten wordt verkregen. Tenzij de fysisch-chemische aard of biologische eigenschappen van de stof dit beperken, moet het hoogste dosisniveau zodanig worden gekozen dat enige maternale toxiciteit optreedt (bv. klinische symptomen, verminderde gewichtstoename (niet meer dan 10 %) en/of aanwijzingen voor dosisbeperkende toxiciteit in een doelorgaan). De hoge dosis kan worden beperkt tot 1 000 mg/kg/dag lichaamsgewicht, met enkele uitzonderingen. Zo kan de verwachte blootstelling voor mensen erop wijzen dat een hoger dosisniveau moet worden gebruikt. Een andere mogelijkheid is verkennende onderzoeken of voorlopige bereikbepalingsonderzoeken uit te voeren om de hoogste te gebruiken dosering te bepalen waarbij een minimale mate van maternale toxiciteit optreedt. Als gebleken is dat de teststof toxisch is voor de ontwikkeling, hetzij in een standaard-ontwikkelingstoxiciteitsonderzoek, hetzij in een verkennend onderzoek, moet het hoogste dosisniveau de maximale dosis zijn die geen overmatige toxiciteit bij nakomelingen, of in utero dan wel neonatale sterfte of misvormingen induceert die voldoende is/zijn om een beletsel te vormen voor een betekenisvolle beoordeling van neurotoxiciteit. Het laagste dosisniveau moet erop gericht zijn geen aanwijzingen voor maternale of ontwikkelingstoxiciteit, waaronder neurotoxiciteit, te produceren. Er moet een dalende reeks dosisniveaus worden gekozen teneinde een eventuele doseringsgerelateerde respons en het laagste dosisniveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld (no-observed-adverse-effect level, NOAEL) aan te tonen, of doses nabij de detectiegrens waarmee een benchmarkdosis kan worden bepaald. Intervallen van een factor twee tot vier zijn vaak optimaal voor het vaststellen van de dalende dosisniveaus en het is vaak beter een vierde dosisgroep toe te voegen dan zeer grote intervallen (bv.  17.   De dosisniveaus moeten worden gekozen in het licht van alle bestaande toxiciteitsgegevens en aanvullende informatie over het metabolisme en de toxicokinetiek van de teststof of verwante stoffen. Aan de hand van deze informatie kan ook worden aangetoond of het doseringsschema adequaat is. Op grond van blootstellings- en farmacokinetische gegevens moet directe toediening aan jongen worden overwogen (28)(29). De voor- en nadelen moeten zorgvuldig worden overwogen alvorens onderzoeken met directe toediening uit te voeren (30).
18.   De gelijktijdige controlegroep wordt met placebo of, als bij de toediening van de teststof een medium wordt gebruikt, met medium behandeld. Alle dieren krijgen normaliter dezelfde hoeveelheid teststof of medium toegediend, op basis van lichaamsgewicht. Bij gebruik van een medium of een ander additief om toediening te vergemakkelijken, moet met de volgende factoren rekening worden gehouden: effecten op de absorptie, de distributie, het metabolisme of de retentie van de teststof; effecten op de chemische eigenschappen van de teststof die de toxische kenmerken daarvan kunnen veranderen, en effecten op de voedsel- of waterconsumptie of de voedingsstatus van de dieren. Het medium mag geen effecten teweegbrengen die de interpretatie van het onderzoek kunnen verstoren, noch mag het neurogedragstoxisch zijn of gevolgen hebben voor de voortplanting of ontwikkeling. Voor nieuwe media moet naast een mediumcontrolegroep een placebocontrolegroep worden opgenomen. De dieren in de controlegroep(en) moeten op identieke wijze worden behandeld als de testgroepdieren.
 Toediening van de doses

19.   De teststof of het medium moet worden toegediend via de weg die het meest relevant is voor mogelijke menselijke blootstelling en gebaseerd zijn op de beschikbare informatie betreffende metabolisme en distributie bij de proefdieren. De toedieningsweg zal doorgaans oraal (bv. via maagsonde, voeding, drinkwater) zijn, maar andere wegen (bv. dermaal, inhalatie) kunnen ook worden gebruikt, naargelang van de kenmerken en verwachte of bekende blootstellingsroutes bij de mens (verdere richtsnoeren staan in leidraad nr. 43 (8)). De keuze voor een bepaalde toedieningsweg moet worden gemotiveerd. De teststof moet elke dag op ongeveer hetzelfde tijdstip worden toegediend.
20.   De aan elk dier toegediende dosis moet normaliter gebaseerd zijn op het meest recente individuele lichaamsgewicht van het dier. Voorzichtigheid is echter geboden bij het aanpassen van de doses tijdens het laatste derde deel van de dracht. Als bij de behandelde moederdieren sprake is van overmatige toxiciteit, moeten die dieren op humane wijze worden gedood.
 21.   De teststof of het medium moet minimaal dagelijks worden toegediend aan gedekte vrouwtjes vanaf het moment van nidatie (GD 6) tot en met de zoogperiode (PND 21), zodat de jongen tijdens de pre- en postnatale neurologische ontwikkeling aan de teststof worden blootgesteld. De leeftijd waarop de toediening start, en de duur en frequentie van de toediening kunnen worden aangepast als er aanwijzingen zijn die een testopzet die relevanter is voor blootstellingen bij de mens, ondersteunen. De toedieningsduur moet voor andere soorten zodanig worden aangepast, dat de blootstelling plaatsvindt tijdens alle vroege perioden van de hersenontwikkeling (d.w.z. gelijkwaardig aan prenatale en vroeg-postnatale hersengroei bij de mens). De toediening kan beginnen vanaf de start van de dracht (GD 0), hoewel er rekening moet worden gehouden met mogelijk verlies van dieren vóór nidatie als gevolg van de teststof. Toediening vanaf GD 6 voorkomt dit risico, maar in dat geval worden de ontwikkelingsfasen tussen GD 0 en 6 niet behandeld. Als een laboratorium gebruikmaakt van aangeschafte dieren die op een bepaald tijdstip zijn gedekt, is het niet mogelijk om op GD 0 te starten met toedienen. GD 6 is dan een goede startdag. Het testlaboratorium moet het doseringsschema opstellen aan de hand van relevante informatie over de effecten van de teststof, eerdere ervaring en logistieke overwegingen. Dit kan verlenging van toediening na spening inhouden. Er mag niet worden toegediend op de dag waarop wordt geworpen bij de dieren die nog niet helemaal klaar zijn met werpen. In het algemeen wordt aangenomen dat blootstelling van de jongen plaatsvindt via de moedermelk. In gevallen waarin er onvoldoende aanwijzingen zijn voor voortdurende blootstelling van de nakomelingen, moet evenwel directe toediening aan jongen worden overwogen. Aanwijzingen voor voortdurende blootstelling kunnen bv. worden verkregen uit de farmacokinetiek, toxiciteit bij de nakomelingen of veranderingen in biomarkers (28).
 OBSERVATIES

Observaties bij moederdieren

22.   Alle moederdieren moeten ten minste eenmaal daags zorgvuldig geobserveerd worden met betrekking tot de gezondheidstoestand, waaronder ziekelijkheid en sterfte.
23.   Tijdens de behandelings- en observatieperioden moeten periodiek gedetailleerdere klinische observaties worden verricht (ten minste twee maal tijdens de drachttoedieningsperiode en twee maal tijdens de zoogtoedieningsperiode) met ten minste tien moederdieren per dosisniveau. De dieren moeten buiten hun kooi worden geobserveerd door getrainde technici die niet weten welke behandeling een gegeven dier heeft ondergaan, met behulp van gestandaardiseerde procedures om te zorgen voor minimale stress bij de dieren en waarnemersvertekening, en maximale interobserver-betrouwbaarheid. Indien mogelijk is het raadzaam de observaties in een bepaald onderzoek door dezelfde technicus te laten verrichten.
24.   De aanwezigheid van waargenomen verschijnselen moet worden geregistreerd. Indien mogelijk moet de ernst van de waargenomen verschijnselen eveneens geregistreerd worden. Klinische observaties moeten onder meer (maar niet alleen) bestaan uit: veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van uitscheiding, en onwillekeurige reacties (zoals traanvorming, rechtop staan van het haar, pupilgrootte, een ongewoon ademhalingspatroon en/of mondademhaling en eventuele ongewone symptomen van urineren of defecatie).
25.   Alle ongewone responsen met betrekking tot lichaamspositie, activiteit (bv. meer of minder intensieve verkenning van het standaardgebied) en coördinatie van bewegingen moeten ook worden genoteerd. Veranderingen in gang (bv. waggelen, ataxie), houding (bv. gebogen rug) en reactiviteit op vastpakken, neerzetten of andere prikkels uit de omgeving, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, convulsies, trillingen, stereotiep gedrag (bv. overmatige lichaamsverzorging, ongewone kopbewegingen, herhaaldelijk ronddraaien), bizar gedrag (bv. bijten of overmatig likken, zelfverminking, achteruitlopen, geluiden maken) of agressie moeten worden opgetekend.
26.   Symptomen van toxiciteit moeten worden opgetekend, met de dag waarop deze ontstonden, tijdstip, mate van ernst en duur.
 27.   De dieren moeten op het moment van toediening worden gewogen, en wel ten minste elke week gedurende het onderzoek, op of vlak na de dag van werpen en op PND 21 (spenen). Voor met een maagsonde uitgevoerde onderzoeken moeten de moederdieren ten minste tweemaal per week worden gewogen. Na elke bepaling van het lichaamsgewicht moeten de doses zo nodig worden aangepast. De voedselconsumptie moet tijdens de dracht en zoogperiode minimaal wekelijks worden bepaald. Indien de blootstelling via de watertoevoer verloopt, moet ten minste wekelijks de waterconsumptie worden bepaald.
Observaties bij nakomelingen

28.   Alle nakomelingen moeten ten minste dagelijks zorgvuldig geobserveerd worden op symptomen van toxiciteit en ziekelijkheid en sterfte.
29.   Tijdens de behandelings- en observatieperioden moeten gedetailleerdere klinische observaties van de nakomelingen worden verricht. De nakomelingen (ten minste één jong/geslacht/nest) moeten worden geobserveerd door getrainde technici die niet weten welke behandeling een gegeven dier heeft ondergaan met behulp van gestandaardiseerde procedures om te zorgen voor minimale vertekening en maximale interobserver-betrouwbaarheid. Indien mogelijk is het raadzaam de observaties door dezelfde technicus te laten verrichten. Minimaal moeten de in punten 24 en 25 beschreven eindpunten worden gecontroleerd, al naargelang van toepassing voor de ontwikkelingsfase die geobserveerd wordt.
30.   Alle symptomen van toxiciteit bij de nakomelingen moeten worden opgetekend, met de dag waarop deze ontstonden, tijdstip, mate van ernst en duur.
 Lichamelijke en ontwikkelingsmijlpalen

31.   Veranderingen in ontwikkelingsmijlpalen vóór spening (zoals ontvouwen van de oorschelp, openen van de ogen, doorkomen van snijtanden) hangen nauw samen met het lichaamsgewicht (30)(31). Lichaamsgewicht is mogelijk de beste indicator van lichamelijke ontwikkeling. De bepaling van ontwikkelingsmijlpalen wordt daarom alleen aanbevolen als er al aanwijzingen zijn dat deze eindpunten aanvullende informatie zullen verschaffen. De tijdstippen voor de beoordeling van deze parameters staan vermeld in tabel 1. Afhankelijk van de verwachte effecten en de resultaten van de eerste metingen kan het raadzaam zijn extra tijdstippen toe te voegen of de metingen in andere ontwikkelingsfasen te verrichten.
32.   Het is raadzaam om bij de beoordeling van de lichamelijke ontwikkeling de postcoïtale leeftijd in plaats van de postnatale leeftijd te gebruiken (33). Als jongen worden getest op de dag van spening, wordt geadviseerd dit onderzoek te doen vóór de feitelijke spening om de stress van het spenen, die een verstorend effect zou kunnen geven, te vermijden. Bovendien mogen met de jongen geen testen na spening worden gedaan gedurende de twee dagen na het spenen.
 Tabel 1


Tijdstippen van de beoordeling van lichamelijke en ontwikkelingsmijlpalen, en functie/gedragseindpunten
 (2)









Levensperiode
Eindpunten


Vóór spenen (3)



Adolescentie (3)



Jongvolwassen dieren (3)






Lichamelijke en ontwikkelingsmijlpalen





Lichaamsgewicht en klinische observaties


wekelijks (4)



ten minste om de twee weken


ten minste om de twee weken




Hersengewicht


PND 22 (5)



aan einde onderzoek




Neuropathologie


PND 22 (5)



aan einde onderzoek




Geslachtsrijping


—


wanneer van toepassing


—




Andere ontwikkelingsmijlpalen (6)



wanneer van toepassing


—


—





Functie/gedragseindpunten





Ontogenie van het gedrag


Ten minste twee metingen


 


 




Motorische activiteit (waaronder gewenning)


1-3 keer (7)



—


eenmaal




Motorische en sensorische functie


—


eenmaal


eenmaal




Leervermogen en geheugen


—


eenmaal


eenmaal




33.   Levende jongen moeten worden geteld en gesekst, bv. door visuele inspectie of meting van de anogenitale afstand (34)(35) en elk jong in een nest moet afzonderlijk worden gewogen bij de geboorte of kort daarna, ten minste wekelijks tijdens de zoogperiode en ten minste eenmaal per twee weken daarna. Bij de beoordeling van de geslachtsrijping moeten, wanneer opening van de vagina (36) of loslaten van de voorhuid (37) optreedt, de leeftijd en het lichaamsgewicht van het dier worden bepaald voor ten minste één mannetje en één vrouwtje per nest.
Ontogenie van het gedrag

34.   De ontogenie van bepaald gedrag moet worden gemeten bij ten minste één jong/geslacht/nest tijdens de passende levensperiode, waarbij op alle testdagen voor al het gedrag dat wordt beoordeeld, dezelfde jongen worden gebruikt. De meetdagen moeten gelijkelijk over die periode worden verdeeld om te bepalen of de verandering in ontogenie van dat gedrag normaal of behandelingsgerelateerd is (38). Voorbeelden van gedrag waarvan de ontogenie kan worden beoordeeld zijn: oprichtreflex, negatieve geotaxis en motorische activiteit (38)(39)(40).
 Motorische activiteit

35.   De motorische activiteit moet worden gecontroleerd (41)(42)(43)(44)(45) tijdens de levensperiode vóór spening en de volwassen levensperiode. Zie punt 32 voor testen op het moment van spenen. De testsessie moet lang genoeg zijn om gewenning binnen een sessie voor niet-behandelde controles aan te tonen. Het wordt sterk aanbevolen ter beoordeling van de ontogenie van het gedrag de motorische activiteit te bepalen. Indien gebruikt als test voor ontogenie van het gedrag, moet het testen voor alle testsessies vóór spening met dezelfde dieren plaatsvinden. Er moet vaak genoeg worden getest om de ontogenie van gewenning binnen een sessie te kunnen beoordelen (44). Hiervoor kunnen drie of meer tijdsperioden tot en met de dag van spening nodig zijn (bv. PND 13, 17, 21). Het testen van dezelfde dieren of nestgenoten moet ook plaatsvinden op volwassen leeftijd, tegen het einde van het onderzoek (bv. PND 60-70). Zo nodig kan op extra dagen getest worden. De motorische activiteit moet worden gecontroleerd met een geautomatiseerd activiteitsregistratieapparaat dat zowel toenamen als afnamen in activiteit moet kunnen detecteren (d.w.z. de door het apparaat gemeten activiteit op baseline moet niet zo laag zijn dat afnamen niet kunnen worden gedetecteerd en ook niet zo hoog dat toenamen van de activiteit niet kunnen worden gedetecteerd). Elk apparaat moet volgens standaardprocedures worden getest om de betrouwbaarheid van de werking van alle apparaten op alle dagen zo veel mogelijk te waarborgen. De behandelgroepen moeten zo evenwichtig mogelijk over de apparaten worden verdeeld. Elk dier moet apart worden getest. De behandelgroepen moeten evenwichtig worden verspreid over de testtijden om verstoring door circadiaanse activiteitritmen te vermijden. Er moet zoveel mogelijk worden gezorgd dat variaties in de testomstandigheden minimaal zijn en niet systematisch samenhangen met de behandeling. Variabelen die van invloed kunnen zijn op veel maten van gedrag, waaronder motorische activiteit, zijn geluidsniveau, grootte en vorm van de testkooi, temperatuur, relatieve vochtigheid, lichtomstandigheden, geuren, gebruik van verblijfskooi of nieuwe testkooi en afleiding uit de omgeving.
 Motorische en sensorische functie

36.   De motorische en sensorische functie moet ten minste eenmaal in de adolescentieperiode en ten minste eenmaal in de jongvolwassenperiode (bv. PND 60-70) uitvoerig worden onderzocht. Zie punt 32 voor testen op het moment van spenen. Er moet voldoende worden getest om te zorgen voor een toereikende kwantitatieve sampling van de sensorische modaliteiten (bv. somatosensorisch, vestibulair) en motorische functies (bv. kracht, coördinatie). Enkele voorbeelden van testen voor de motorische en sensorische functie zijn voetzoolreflex (46), oprichtreflex (47)(48), gewenning aan auditieve schrikreactie (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) en opgewekte potentialen (55).
 Leervermogen- en geheugentesten

37.   Na het spenen (bv. 25 ± twee dagen) en bij jongvolwassen dieren (PND 60 en ouder) moet een test van het associatieve leervermogen en geheugen worden uitgevoerd. Zie punt 32 voor testen op het moment van spenen. Voor deze twee ontwikkelingsfasen kunnen dezelfde test of aparte test(en) worden gebruikt. Enige flexibiliteit in de keuze van de test(en) voor leervermogen en geheugen bij gespeende en volwassen ratten is toegestaan. De test(en) moet(en) echter zodanig zijn opgezet dat wordt voldaan aan twee criteria. Ten eerste moet het leervermogen worden beoordeeld als een verandering over verschillende herhaalde leervermogenonderzoeken of -sessies, of, bij testen met één onderzoek, door te kijken naar een toestand die controleert op niet-associatieve effecten van de trainingservaring. Ten tweede moet(en) de test(en) naast het oorspronkelijke leervermogen (acquisitie) een maat voor het geheugen (kortetermijn- of langetermijngeheugen) omvatten, maar deze maat voor het geheugen kan niet gerapporteerd worden indien een met dezelfde test verkregen maat voor acquisitie ontbreekt. Als uit de test(en) voor het leervermogen en geheugen een effect van de teststof naar voren komt, kunnen aanvullende testen worden overwogen om alternatieve interpretaties op grond van veranderingen in sensorische, motivatie- en/of motorische capaciteiten uit te sluiten. Naast de twee bovenstaande criteria wordt geadviseerd de test voor het leervermogen en geheugen te kiezen op grond van de aangetoonde gevoeligheid ervan voor de klasse van stoffen waartoe de teststof behoort, als dergelijke informatie in de literatuur beschikbaar is. Als dergelijke informatie ontbreekt, kunnen de volgende testen worden gedaan om te voldoen aan de bovenstaande criteria: passieve vermijding (43)(56)(57), „delayed-matching-to-position” voor de volwassen rat (58) en voor de infantiele rat (59), olfactorische conditionering (43)(60), waterlabyrint van Morris (Morris water maze) (61)(62)(63), labyrint van Biel of Cincinnati (64)(65), stervormig labyrint (radial arm maze) (66), T-labyrint (43) en acquisitie en retentie van gedrag volgens een bepaald schema (schedule-controlled behaviour) (26)(67)(68). Aanvullende testen worden in de literatuur beschreven voor gespeende (26)(27) en volwassen ratten (19)(20).
 Postmortaal onderzoek

38.   De moederdieren kunnen worden geëuthanaseerd nadat de nakomelingen zijn gespeend.
39.   Neuropathologische beoordeling van de nakomelingen wordt uitgevoerd met weefsels van dieren die om humane redenen zijn gedood op PND 22 of eerder, tussen PND 11 en PND 22, en aan het einde van het onderzoek. Van nakomelingen die op PND 22 of eerder worden gedood, moet het hersenweefsel worden beoordeeld; van dieren die aan het einde worden gedood, moet weefsel van het centrale zenuwstelsel (CZS) en het perifere zenuwstelsel (PZS) worden beoordeeld. Dieren die worden gedood op PND 22 of eerder, kunnen worden gefixeerd door immersie of perfusie. Dieren die aan het einde van het onderzoek worden gedood, moeten door perfusie worden gefixeerd. Bij alle aspecten van de preparatie van de weefselmonsters, d.w.z. vanaf de persfusie van de dieren tot en met de dissectie van de weefselmonsters, weefselbewerking en kleuren van de glaasjes, moet evenwichtig te werk worden gegaan, zodat elke partij representatieve monsters van elke dosisgroep bevat. Nadere richtsnoeren over neuropathologie zijn te vinden in OESO-leidraad nr. 20 (9), zie ook (103).
 Bewerking van weefselmonsters

40.   Alle macroscopische afwijkingen die bij de obductie worden opgemerkt, moeten worden genoteerd. De weefselmonsters moeten afkomstig zijn van alle belangrijke gebieden van het zenuwstelsel. De weefselmonsters moeten worden bewaard in een geschikt fixatiemiddel en bewerkt volgens gestandaardiseerde gepubliceerde histologische protocollen (69)(70)(71)(103). Inbedding in paraffine is acceptabel voor weefsels van het CZS en PZS, maar wanneer een hogere mate van resolutie vereist is (bv. voor perifere zenuwen bij vermoeden van een perifere neuropathie en/of voor morfometrische analyse van perifere zenuwen), kan het aangewezen zijn om bij postfixatie osmium te gebruiken samen met inbedden in epoxy. Voor morfometrische analyse verzameld hersenweefsel moet bij alle dosisniveaus op hetzelfde moment in geschikte media worden ingebed om artefacten als gevolg van krimp die kan optreden bij langdurig bewaren in fixatiemiddel, te voorkomen (6).
Neuropathologisch onderzoek

41.   Het kwalitatieve onderzoek heeft tot doel:






i)


identificeren van gebieden binnen het zenuwstelsel waarbij sprake is van aanwijzingen voor neuropathologische veranderingen;










ii)


identificeren van typen neuropathologische veranderingen die het gevolg zijn van blootstelling aan de teststof, en










iii)


bepalen van de mate van ernst van de neuropathologische veranderingen.
 Representatieve histologische coupes van de weefselmonsters moeten door een goed opgeleide patholoog microscopisch worden onderzocht op aanwijzingen voor neuropathologische veranderingen. Aan alle neuropathologische veranderingen moet een subjectieve graad van ernst worden toegekend. Een hematoxyline- en eosinekleuring kan voldoende zijn voor de beoordeling van hersencoupes van dieren die op PND 22 of eerder`om humane redenen zijn gedood. Voor coupes van CZS- en PZS-weefsels van dieren die zijn gedood aan het einde van het onderzoek wordt echter een myelinekleuring (bv. luxol fast blue/cresylviolet) en een zilverkleuring (bv. Bielschowsky- of Bodiankleuring) aanbevolen. Afhankelijk van het professionele oordeel van de patholoog en de soort veranderingen dat wordt waargenomen, kunnen andere kleuringen worden beschouwd als geschikt voor de identificatie en karakterisering van bepaalde typen veranderingen (bv. glia fibrillair zuur eiwit (glial fibrillary acidic protein, GFAP) of lectinehistochemie om veranderingen in het glia en microglia te beoordelen (72), fluoro-jade om necrose te detecteren (73)(74), of voor neurodegeneratie specifieke zilverkleuringen (75)).
42.   Aangezien deze gegevens kunnen worden gebruikt bij de detectie van een behandelingsgerelateerd effect en waardevol zijn bij de interpretatie van behandelingsgerelateerde verschillen in hersengewicht of morfologie, moet morfometrische (kwantitatieve) beoordeling plaatsvinden (76)(77). Voor de morfometrische beoordeling moeten zenuwweefselmonsters worden genomen en geprepareerd. Morfometrische beoordelingen kunnen bijvoorbeeld bestaan uit lineaire of oppervlaktemetingen van specifieke hersengebieden (78). Bij lineaire of oppervlaktemetingen moeten homologe coupes worden gebruikt die zorgvuldig zijn geselecteerd op grond van betrouwbare microscopische mijlpalen (6). Stereologie kan worden gebruikt om behandelingsgerelateerde effecten op parameters, zoals volume of aantal cellen voor specifieke neuroanatomische gebieden, te identificeren (79)(80)(81)(82)(83)(84).
 43.   De hersenen moeten worden onderzocht op aanwijzingen voor behandelingsgerelateerde neuropathologische veranderingen en voor grondig onderzoek moeten geschikte monsters worden genomen van alle belangrijke hersengebieden (bv. bulbus olfactorius, hersenschors, hippocampus, basale ganglia, thalamus, hypothalamus, middenhersenen (tectum, tegmentum en hersensteel), pons, verlengde merg, kleine hersenen). Het is van belang dat voor alle dieren de coupes in hetzelfde vlak worden genomen. Bij volwassen dieren die op humane wijze worden gedood aan het einde van het onderzoek, moeten representatieve coupes van het ruggenmerg en het PZS worden verzameld. De te onderzoeken gebieden zijn onder meer het oog met de oogzenuw en het netvlies, het ruggenmerg bij de cervicale en lumbale zwellingen, de dorsale en ventrale wortelvezels, de proximale ischiaszenuw, de proximale scheenbeenzenuw (bij de knie) en de vertakkingen van de scheenbeenzenuw naar de kuitspier. De coupes van het ruggenmerg en de perifere zenuwen moeten uit zowel dwars- als lengtecoupes bestaan.
 44.   Neuropathologische beoordeling moet een onderzoek omvatten naar aanwijzingen voor ontwikkelingsschade aan het zenuwstelsel (6)(85)(86)(87)(88)(89), naast de cellulaire veranderingen (bv. neuronale vacuolisatie, degeneratie, necrose) en weefselveranderingen (bv. gliose, infiltratie van leukocyten, vorming van cysten). In dit opzicht is het van belang onderscheid te maken tussen behandelingsgerelateerde effecten en normale ontwikkelingen waarvan bekend is dat deze plaatsvinden tijdens de ontwikkelingsfase van het dier op het moment van doden (90). Belangrijke veranderingen die een indicatie zijn van een aanval op de ontwikkeling zijn bijvoorbeeld (maar zijn niet daartoe beperkt):






—


veranderingen in de macroscopische omvang of vorm van de bulbus olfactorius, de grote hersenen of de kleine hersenen,










—


veranderingen in de relatieve omvang van verscheidene hersengebieden, waaronder afnamen of toenamen van de omvang van deze gebieden als gevolg van het verlies of persistentie van normaal tijdelijke populaties van cellen of axonale projecties (bv. uitwendige kiemlaag van de kleine hersenen, hersenbalk),










—


veranderingen in proliferatie, migratie en differentiatie, zoals blijkt uit gebieden met overmatige apoptose of necrose, clusters of verspreide populaties van ectopische, gedesoriënteerde of misvormde neuronen of veranderingen in de relatieve omvang van verscheidene lagen van de corticale structuren,










—


veranderingen in myelinisatiepatronen, zoals een algemene afname van de omvang of gewijzigde kleuring van gemyeliniseerde structuren,










—


aanwijzingen voor hydrocefalus, met name vergroting van de ventrikels, stenose van het aquaduct van Sylvius en het dunner worden van de hersenhelften.
 Analyse van de dosis-responsverhouding van neuropathologische veranderingen

45.   De volgende stapsgewijze procedure wordt aanbevolen voor de kwalitatieve en kwantitatieve neuropathologische analyses. Eerst worden coupes van de hogedosisgroep vergeleken met die van de controlegroep. Als er geen aanwijzingen worden gevonden voor neuropathologische veranderingen bij dieren van de hogedosisgroep, is verdere analyse niet nodig. Als er wel aanwijzingen worden gevonden voor neuropathologische veranderingen in de hogedosisgroep, worden dieren van de middelhoge- en lagedosisgroepen onderzocht. Als onderzoek met de hogedosisgroep wordt stopgezet vanwege sterfgevallen of andere storende toxiciteit, moeten de hoge- en middelhogedosisgroepen geanalyseerd worden op neuropathologische veranderingen. Als er aanwijzingen zijn voor neurotoxiciteit in de lagedosisgroepen, moet in die groepen neuropathologische analyse worden verricht. Als er onderzoeksgerelateerde neuropathologische veranderingen worden gevonden in het kwalitatieve of kwantitatieve onderzoek, moet op grond van een beoordeling van alle dieren uit alle dosigroepen de dosisafhankelijkheid van de incidentie, frequentie en graad van ernst van de letsels of van de morfometrische veranderingen worden bepaald. Alle gebieden van de hersenen met aanwijzingen voor neuropathologische veranderingen moeten in deze beoordeling worden meegenomen. Voor elk type letsel moeten de kenmerken worden beschreven die zijn gebruikt om elke graad van ernst te definiëren, waarbij wordt aangegeven op basis waarvan elke mate van ernst zich onderscheidt. De frequentie van elk type letsel en de graad van ernst ervan moeten worden geregistreerd en een statistische analyse moet worden uitgevoerd ter beoordeling van de dosis-responsverhoudingen. Het wordt aanbevolen gecodeerde glaasjes te gebruiken (91).
GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Gegevens

46.   Gegevens moeten afzonderlijk worden gerapporteerd en in tabelvorm worden samengevat, met voor elke testgroep de typen veranderingen en het aantal moederdieren, nakomelingen per geslacht en nesten waarbij ieder type verandering voorkomt. Bij directe postnatale blootstelling van de nakomelingen moet de weg, duur en periode van blootstelling gerapporteerd worden.
 Beoordeling en interpretatie van resultaten

47.   Een onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit geeft informatie over de effecten van herhaalde blootstelling aan een stof tijdens de in-utero- en vroeg-postnatale ontwikkeling. Aangezien de nadruk wordt gelegd op zowel het eindpunt algemene toxiciteit als het eindpunt ontwikkelingsneurotoxiciteit, kan met de resultaten van het onderzoek onderscheid worden gemaakt tussen neuro-ontwikkelingseffecten die zich voordoen bij afwezigheid van algemene maternale toxiciteit, en neuro-ontwikkelingseffecten die alleen tot uitdrukking komen bij niveaus die ook toxisch zijn voor het moederdier. Vanwege de complexe onderlinge verbanden tussen onderzoeksopzet, statistische analyse en biologische significantie van de gegevens is voor een adequate interpretatie van ontwikkelingsneurotoxiciteitsgegevens het oordeel van een deskundige nodig (107)(109). Bij de interpretatie van de testresultaten moet gebruik worden gemaakt van een op bewijskracht gebaseerde aanpak (20)(92)(93)(94). Patronen van gedrags- of morfologische bevindingen, indien aanwezig, en aanwijzingen voor dosisrespons moeten worden besproken. Bij deze karakterisering moeten gegevens van alle onderzoeken die relevant zijn voor de beoordeling van ontwikkelingsneurotoxiciteit, worden meegenomen, waaronder epidemiologische onderzoeken of casereports met mensen en onderzoeken met proefdieren (bv. toxicokinetische gegevens, structuur-activiteitinformatie, gegevens uit andere toxiciteitsonderzoeken). Daartoe behoort ook het verband tussen de doses van de teststof en de aan- of afwezigheid, incidentie en de mate van eventuele neurotoxische effecten voor elk geslacht (20)(95).
 48.   Bij de beoordeling van de gegevens moet zowel de biologische als de statistische significantie worden besproken. Statistische analyse moet worden gezien als een instrument dat een leidraad geeft voor de interpretatie van gegevens, zonder dat het bepalend daarvoor is. De conclusie dat er geen sprake is van een behandelingsgerelateerd effect, mag niet louter gebaseerd zijn op het ontbreken van statistische significantie. Evenzo geldt dat de conclusie dat er wel sprake is van een behandelingsgerelateerd effect, niet louter op statistische significantie gebaseerd mag zijn. Om mogelijke vals-negatieve bevindingen en de moeilijkheden die inherent zijn aan „aantonen van een negatieve” te voorkomen, moeten beschikbare positieve en historische controlegegevens worden besproken, met name als er geen behandelingsgerelateerde effecten zijn (102)(106). De kans op vals-positieven moet worden besproken in het licht van de totale statistische beoordeling van de gegevens (96). De beoordeling moet het eventuele verband tussen waargenomen neuropathologische en gedragsveranderingen omvatten.
