Entomologische berichten
Dit systeem is door ons later verbeterd en staat nu bekend als de elektropenetratiegram (EPG) techniek (Tjallingii 1985, 1988, 1990, 2000, Tjallingii & Hogen Esch 1993, Prado & Tjallingii 1994, 1997). Dit stuk geeft het huidige inzicht weer in de penetratie-activiteiten van bladluizen en de belangrijke bijdrage daaraan door het EPG-onderzoek. Hier zal het al¬ leen over bladluis-EPG's gaan, die tussen soorten een grote consistentie vertonen. EPG's van andere herbivore insecten met stekende monddelen, die momenteel in toenemende In principe meet het EPG-systeem wisselende voltages in een elektrisch circuit waarin de bladluis (of een ander ste¬ kend insect) en de plant zijn opgenomen (figuur 1). De blad¬ luis is bevestigd aan een zeer dunne (10 of 20 p m) goud draadelektrode, terwijl een stevige koperelektrode in de aarde van een (opgepotte) plant is gestoken. (Planten in het veld vereisen een speciaal aangepaste systeem.) Zodra de bladluis zijn stiletten in de plant steekt wordt het circuit ge¬ sloten en ontstaan de spanningsfluctuaties (Volt) bij het meetpunt. Na versterking (standaard 50-100 keer) kunnen de signalen zichtbaar gemaakt worden met elk daarvoor ge¬ schikt apparaat vroeger een oscilloscoop of papierrecorder, tegenwoordig meestal een computermonitor en worden vastgelegd (nu volledig digitaal). Een overzicht van een EPG Tabel 1 . Golfvormcorrelaties met bladluisactiviteit en stiletpuntpo sities in het plantenweefsel. pd = potential drop Waveforms correlations with aphid activities and stylet tip positions in plant tissue, pd potential drop golfvorm fase positie activiteit wave form phase position activity A, B, C, (F) path any tissue intercellular penetration pd path any tissue intracellular puncture G xylem xylem active sap ingestion El phloem phloem saliva excretion E2 phloem phloem passive sap ingestion and salivation 1 10 Entomologische Berichten 63(5) 2003 measuring point computer analysis (amplifier) ▼ EPG signal _ i_ data acquisition i Figuur 1 Het EPG-sys teem. Zodra de bladluissti¬ letten de plant penetreren wordt het circuit gesloten en kan de fluctuerende span¬ ning bij het meetpunt (mea¬ suring point) versterkt en geregistreerd worden door een computer. Deze signalen worden later geanalyseerd. The EPG-system. As soon as the aphid penetrates the plant, the circuit is closed and the fluctuating voltage at the measuring point is amplified and recorded in a computer. Signals are ana¬ lysed later. met details van enkele van de belangrijkste golfvormen is te zien in figuur 2, terwijl in tabel 1 de bijbehorende weefsello caties van de stiletpunt en stiletpenetratie-activiteiten zijn weergegeven. De belangrijkste golfvormcorrelaties zijn nu weliswaar experimenteel opgehelderd, maar verder onder¬ zoek hiernaar wordt momenteel nog voortgezet. De span¬ ningsfluctuaties in het EPG worden veroorzaakt door de fluctuerende elektrische weerstand van de bladluis, met na¬ me door het openen en sluiten van een klep in respectieve¬ lijk het voedsel en speekselkanaal. Zulke fluctuaties worden aangeduid als de weerstandscomponent (R-component) in het EPG. Anderzijds worden er ook fluctuerende voltages ge¬ genereerd in het systeem, bijvoorbeeld door de membraan potentialen van plantencellen die deel uitmaken van het cir¬ cuit zodra de stiletpunt het plasmalemma van een cel pene¬ treert. Dit soort fluctuaties worden aangeduid als de elektro¬ motorische krachtcomponent (emk-component) in het EPG. Het originele systeem dat McLean & Kinsey (1964) introdu¬ ceerden meet uitsluitend de R-component van het EPG, ter¬ wijl in het huidige EPG-systeem beide componenten geme¬ ten worden (Tjallingii 2000). De EPG-golfvormen zijn gekarakteriseerd in termen van amplitude (Volt), frequentie (Hertz), voltageniveau (Volt) en belangrijkste elektrische origine (R of emk). Ze worden aan¬ geduid met een letter, alfabetisch, en min of meer naar volg¬ orde van voorkomen in de tijd. Voor het gemak zijn deze golfvormen gegroepeerd in drie 'fasen', overeenkomend met een activiteit of weefsel: (stilet)pad-, xyleem en floëemfase (figuren 2 en 3). De padfase reflecteert mechanische pene¬ tratie van de stiletten door het weefsel, van epidermis tot xyleem en floëem. Stiletpad-activiteiten Het EPG van het stiletpad in planten werd onderzocht in combinatie met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), hetgeen een veel betere beeldresolutie geeft dan lichtmicro scopie. Figuur 3 laat een TEM-reconstructie zien van een bladdoorsnede met het complete stiletpad, van epidermis door het mesofyl tot in een vaatbundel (Tjallingii & Hogen Esch 1993). Stylectomie (snelle stiletamputatie) vond plaats tijdens de eerste floëemfase (El/E2-golfvorm) die deze blad¬ luis vertoonde. De stiletweg bleek veel zijtakken te hebben waaruit de stiletten zich teruggetrokken hadden omdat het geschikte doel blijkbaar niet bereikt was. De stiletten waren daarbij ook door het vaatbundelweefsel gegaan en hadden het xyleem twee keer aangeprikt (golfvorm G), maar de eer¬ ste floëemfase heeft uiteindelijk pas plaatsgevonden nadat de stiletten zich geheel uit de vaatbundel hadden terugge¬ trokken en daarin opnieuw gepenetreerd waren tot in het zeefvat waarin de stiletpunt te zien is (figuur 3). Voorafgaand aan de stiletpenetratie wordt enig gelerend (geleivormend) speeksel afgescheiden op de epidermis van het blad, de zogenaamde 'salivary flange' (nauwelijks zicht¬ baar in figuur 3). In het EPG wordt het eerste signaal echter Kader 1. Correlatie van de pd-golfvorm in het EPG met een intracellulaire stiletpunctie Het bladluisEPG van plantpenetraties vertoont veelvuldig de 'po¬ tential drop' (pd-golfvorm) terwijl die in dieetpenetraties ('kunst floëemsap') geheel ontbreekt. Na toevoeging aan het dieet van geï¬ soleerde plantenprotoplasten (losse mesofylcellen uit weefsel waarvan het celwandmateriaal enzymatisch is verwijderd) werden de pd's echter ook in dieetpenetraties zichtbaar. Bovendien kwam het pd-voltage (Y-as in figuur 2 [kader linksonder] en in figuur 5 [EPG]) van protoplasten en van de complete plant overeen met lite ratuurwaarden van het membraanpotentiaal van plantencellen (-100 tot -200 mV). De bladluistiletten zijn in de EPG-opzet dus een soort zelf-penetrerende electroden waarmee de extra en in¬ tracellulaire potentiaal in de plant gemeten kan worden (met inachtneming van enkele correcties). Entomologische Berichten 63(5) 2003 1 1 1 OVERVIEW 1 np F probe probe ■V Yk, np r-J >ath path probe y**tï path xylem pa 1 h Fl E2 th phloem path phloem DEI rAILS n a t h Yvlpm phloem (sieve element) 1 ^jy^iv 15 sec Ig , , , § sec El Sr' ■ 5 sec E2 I 5 sec W(TI|Wp Figuur 2. Het EPG. Boven: 1-uursoverzicht met belangrijkste golfvormen. Onder: golfvormen gegroepeerd in de belangrijkste gedragsfasen. Golfvor men A, B, C en pd vormen samen de stiletpadfase (path). De xyleemfase (xylem) heeft alleen golfvorm G, de floëemfase (phloem) heeft golfvormen El en E2 (eerste floëemfase alleen El). Probe = periode van stiletpenetratie, np = non-penetratie. The EPG. Top: a 1 -hour overview with the major waveforms. Bottom: details of the three main phases (path, xylem, and phloem phase) grouped into the most important wave forms. Waveforms A, B, C and pd together form the stylet path phase. The xylem phase has only waveform G, the phloem phase has waveforms El and E2 (first phloem phase has only El). Probe = period of stylet penetration, np = non-penetration. pas zichtbaar als er elektrisch contact is tussen de vloeistof in de styletkanalen (figuur 4) en de intercellulaire vloeistof in de plant. Deze beide vloeistoffen bevatten geïoniseerde zou¬ ten die geleidend zijn. Op het moment dat de stiletten door de niet-geleidende was op de cuticula van de plant breken wordt het circuit gesloten en wordt de eerste golfvorm A zichtbaar (tabel 1); dit is pas na afscheiding van de 'salivary Kader 2. Virustransmissie door bladluizen De ernstigste economische schade door bladluizen wordt veroor¬ zaakt door de overdracht van plantenvirussen. De belangrijkste door bladluizen overgebrachte virussen zijn in twee groepen te on¬ derscheiden: die met een persistente en die met een niet-persisten te overdracht (ook is er nog een groep met een 'semi-persistente' overdracht, die van minder belang is). De persisente virussen zijn 'circulatief': de virusdeeltjes worden via de darm naar de hemolymfe (het 'bloed') vervoerd en dan naar de speekselklier. Via het speeksel worden dan nieuwe planten geïn¬ fecteerd. Door 'opslag' in de hemolymfe (soms met, soms zonder vermeerdering aldaar: 'propagatief' respectievelijk 'non-propaga tief ') kan een bladluis lang infectieus blijven en heeft de vervelling bij een juveniel individu geen verlies van besmettelijkheid tot ge¬ volg (vandaar: persistent). De overdracht van persistente virussen vindt tijdens floëempenetraties plaats want (toevallig?) zijn de per¬ sistentie virussen floëemgebonden. Ze verspreiden zich systemisch, maar niet of nauwelijks buiten het floëem, de zeefvaten en begelei¬ dende cellen. Waarschijnlijk speelt hun relatieve plasmadesma 1 12 flange'. Spoedig volgt dan golfvorm B, een langzame golf met hoge amplitude (figuur 2, path, vakje 1 linksonder). Elke B-golf reflecteert de excretie van een 'portie' gelerend sche despeeksel in de ruimte die de stiletpunt mechanisch gemaakt heeft door de (secundaire) celwandvezels uit elkaar te duwen. Het speeksel is vloeibaar als het de stiletpunt ver¬ laat, maar blijkt in minder dan een seconde te geleren onder tale isolatie van het overige weefsel daarbij een belangrijke rol. De non-persistente virussen zijn 'non-circulatief': de virusdeel¬ tjes worden niet door de darmwand getransporteerd. De binding ('opslag') vindt plaats aan de binnenwand van het stiletkanaal. Met name het gefuseerde deel van de beide stiletkanalen aan de punt van de maxillaire stiletten lijkt hierbij van bijzonder belang (figuur 5). Dit is maar een klein oppervlak en als een bladluis een gezonde plant aanprikt worden deze virusdeeltjes door de speekselsecretie tijdens subfase II1 losgemaakt en in een cel geïnjecteerd. Na enke¬ le puncties is daarmee de voorraad uitgeput en heeft het individu zijn besmettelijkheid verloren (vandaar: non-persistent). Boven¬ dien, als een infectief juveniel individu vervelt en ook de stiletten door nieuwe vervangt gaat de besmettelijkheid verloren. Non persistente virussen worden in de plant gebracht tijdens de eerste pd's, vaak al binnen tien seconden, dus in de epidermis of buiten¬ ste mesofylcellen. Vandaar wordt het virus van cel tot cel verspreid via de plasmadesmata. Entomologische Berichten 63(5) 2003 100 pm Figuur 3. TEM-reconstructie van een dwars¬ doorsnede van een Vicia fabablad met Aphis /ubue-stiletten. Stiletweg met lege zijtakken (al¬ leen speeksel, geel). Slechts een tak bevat de stiletten zelf (rode lijn). Stiletten (rood) eindigen in een zeefvatcel (floëemfase, groen), twee zij¬ takken eindigen in het xyleem (xyleemfase, blauw). De feitelijk stiletweg (padfase) is uitslui¬ tend intercellulair. Centraal is de vaatbundel te zien (bruine, groene en blauwe cellen). TEM-reconstruction of a cross section of a Vicia faba -leaf penetrated by Aphis fabae-sty/eîs. The track shows many empty branches (saliva only, yellow). The branch containing the stylets (red) ends in a phloem sieve element (phloem phase, green), two other branches end in the xylem (xy lem phase, blue). The track formation (path phase) is exclusively intercellular. The vascular bundle is visible in the centre (brown, green and blue cells). invloed van de zuurstof in de intercellulaire vloeistof (Miles 1999). TUssen twee opeenvolgende B pieken komt een sig¬ naal voor met een hogere frequentie en een lagere amplitu¬ de (figuur 2.). Dit reflecteert de mechanische stiletactiviteit om ruimte te maken in de celwand voor de speekseluitschei ding van de volgende B-golf. Op deze manier bestaat de pad¬ fase uit een cyclische activiteit van speekselsecretie en me¬ chanische penetratie. Deze gang van zaken kon worden ge¬ reconstrueerd door stiletpenetraties door een (Parafilm™-) membraan in vloeistof ('kunstfloëemsap') lichtmicroscopisch te observeren tijdens EPG-registratie. De cyclische uitschei¬ ding en het geleren van speeksel in afwisseling met mecha¬ nische stiletactiviteit is dan microscopisch goed te zien en te correleren met EPG-golfvormen. Op basis van de gelijkvor¬ migheid van het EPG in dieet (op dit punt) en plant is dan de plantsituatie af te leiden, gesteund door TEM-beelden van plantpenetraties: de stiletten penetreren tussen de cellen door via de secundaire celwand, onder continue afscheiding van het gelerend speeksel dat zodoende de zogenaamde speekselschede rond de stiletten vormt (figuur 4). Naarmate de stiletweg vordert nemen de amplitudes van de B-golven af zonder dat duidelijk is waarom terwijl ertussen steeds meer onregelmatige signaalcomponenten ver¬ schijnen: golfvorm C, waarvan voorals¬ nog onbekend is wat ze vertegenwoordi¬ gen. In het EPG is vaak onduidelijk waar golfvorm A overgaat in B en waar B over¬ gaat in C, zodat bij signaalanalyse deze drie golfvormen worden samengenomen als 'pad' (figuur 2, tabel 1). Figuur 4. TEM-beeld van de intracellulaire positie van de stiletweg. De maxillaire stiletten (mx) omvatten het voedselkanaal (f) en het speekselkanaal (s), 'gezekerd' door haakvormige lijsten op de twee stiletten. De mandibulaire (md) kanalen bevatten neuronen voor mechanoreceptie bij de stiletpunt. In de padfase is gelerend speeksel (ss) afgezet tussen de twee mesofylcellen, waarvan de vacuolen (vl en v2) en organeilen te zien zijn. De stiletten penetreerden het secondaire celwand materiaal, niet de middenlamel (pijlen). Electron micrograph of the intercellular path position of the stylets. The maxillary stylets (mx) include the food canal (f) and the salivary canal (s), both locked by the hooked ridges of the two stylets. Each mandibular stylet (md) contains a neural canal for mechanoreception of the tip. During the path phase gelling sheath material (ss) was excreted between the two mesophyll cells, of which the vacu¬ oles (vl and v2) and organelles can be seen. The stylets penetrated the material of the secondary cell wall, not the central lamella (arrows). Gedurende de padfase wordt het signaal regelmatig onderbroken door korte peri¬ oden met een 50-100 mV lagere potenti¬ aal, de zogenaamde 'potential drops' (pd, figuur 2). De pd weerspiegelt een in¬ tracellulaire stiletpunctie van een plan tencel (zie kader 1). Deze puncties heb¬ ben normaliter een duur van circa vijf seconden, waarna de stiletten zich weer uit de cel terugtrekken en hun intercellu¬ laire weg vervolgen. In TEM-beelden zijn de sporen van puncties in bijna elke cel langs het stiletpad waargenomen. Som¬ mige cellen worden zelfs vaker aange¬ prikt, floëemcellen in het bijzonder. Er wordt tijdens de puncties in cellen nau¬ welijks enig schedespeeksel uitgeschei Entomologische Berichten 63(5) 2003 113 den, maar waarschijnlijk wel enig waterig niet-gelerend speeksel ten tijde van de eerste subfase in het EPG van de pd (figuur 5, subfase II1, vakje 1 links; Martin et al. 1997). De complete pd-golfvorm heeft drie fasen waarvan alleen de hier genoemde fase II intracellulair is met zijn drie subfasen. Tijdens de derde subfase (figuur 5, II-3, vakje 1 rechts) neemt de bladluis een klein sapmonster op dat waarschijnlijk naar het smaakorgaan in de keelholte (pharynx) getransporteerd wordt (Wensler & Filshi, 1969) en mogelijk dient voor de waardplantselectie. Dat er opname en afgifte plaatsvindt bleek uit het feit dat de signalen van de pd-subfases gerela¬ teerd zijn met de transmissie van niet-persistente plantenvi russen (figuur 5, Martin et al. 1997). Gedurende subfase II1 worden virusdeeltjes (virionen) in de cel geïnjecteerd met het waterig speeksel (virusinoculatie), terwijl gedurende subfase II-3 virionen worden opgenomen met het sapmon¬ ster (virusacquisitie; zie ook kader 2). Uit TEM-beelden bleek dat plantencellen de stiletpuncties goed overleven, hetgeen cruciaal is voor het ingebrachte virus. De minimale tijdsduur van een padfase voorafgaand aan een xyleem of floëemfase is 15-20 minuten. Dat is dus de tijd die minimaal nodig is om de afstand tussen epidermis en vaatbundelweefsels van kruidachtige planten te overbrug¬ gen. De werkelijke tijd is echter vaak langer omdat het berei¬ ken van bijvoorbeeld een floëemvat lang niet altijd tot een floëemfase in het gedrag leidt, dat wil zeggen tot golfvormen El en E2. In het voorbeeld van figuur 3 werd het merendeel van de floëemvaten in de vaatbundel al aangeprikt vóór de eerste floëemfase, en die trad pas op ruim vier uur nadat de stiletten in de epidermis werden ingestoken en zeker vijf uur nadat de bladluis op deze waardplant werd gezet. De eerdere zeefvatpuncties hebben in het EPG waarschijnlijk alleen een pd-golfvorm veroorzaakt maar geen floëemfasegolfvormen. Een floëemfase impliceert dus een zeefvatpositie van de sti letpunt, maar omgekeerd betekent niet elke zeefvatpositie een floëemfase in het penetratiegedrag. In het algemeen blijkt dat, afhankelijk van de waardplant-bladluiscombinatie, een gemiddelde duur van twee tot zeven uur nodig is voor het begin van de eerste floëemfase. Xyleemfase Een verrassende ontdekking was het bestaan van een xy¬ leemfase (Spiller et al. 1990) bij bladluizen die verondersteld werden zich uitsluitend met floëemsap te voeden. De xyleem¬ fase bestaat alleen uit de golfvorm G (figuur 2). Stylectomie tijdens G gevolgd door TEM liet een stiletpuntpositie in het xyleem zien. Gedurende de xyleemfase wordt het sap ver¬ moedelijk actief opgezogen, omdat er meestal een negatieve hydrostatische druk heerst in de xyleemvaten die het gebruik van de zuigpomp noodzakelijk lijkt te maken. De zeer regel¬ matige hoge amplitude van de G-golfvorm wordt niet door de elektrische spieractiviteit zelf veroorzaakt maar door de daarmee samenhangende fluctuaties van de vloeistofstroom in het voedselkanaal, zogenaamde stromingspotentialen (emf component). Bladluizen vertonen frequent 'xyleemdrinkge drag' als ze enige tijd zonder plant en onder droge condities hebben verkeerd, waarschijnlijk om hun waterbalans weer in evenwicht te brengen. Heeft een bladluis geen dorst, dan ko¬ men er geen xyleemfasen voor in de penetraties. pd 11-1. inoculation / intracellular salivation pd 11-3, acquisition / intracellular ingestion □ cell wall stylet ■■ sheath saliva EZZ1 watery saliva I I cytoplasme — plasmalemma »virions Figuur 5. 'Potential drop' met EPG-subfasen en hun relaties met speekselsecretie en sapopname, zoals bleek uit non-persistente virustransmissie. Subfase 11-2 is onbekend. Voedsel en speekselkanaal zijn bij de punt gefuseerd. In dit deel hechten virionen (virusdeeltjes) aan de stiletwand (rechts) of worden ze door speeksel losgemaakt (links). The potential drop with EPG sub-phases and their corresponding salivation and ingestion relations as inferred from non-persistent virus transmission. Sub-phase 11-2 is unknown. Food and saliva canals are fused near the stylet tip. In this area virions (virus particles) may attach to the stylet wall (right) or release by saliva (left). 1 14 Entomologische Berichten 63(5)'2003 Het uiteindelijke doel van de stiletpenetratie is de floëemvoe ding: sapopname uit de zeefvaten. Net als de xyleemvaten bevinden de floëemvaten zich in de vaatbundel, maar in tegenstelling tot xyleemvaten bestaan zeefvaten uit levende cellen terwijl een functioneel xyleemvat geen levende proto¬ plast bevat. Gedurende de floëemfase komen er twee EPG golfvormen voor, eerst El en dan na circa een minuut golf vorm E2 (figuur 2, tweede floëemfase, en figuur 6); soms komt alleen El voor (zie figuur 2, eerste floëemfase). De hui¬ dige opvatting is dat tijdens El waterig speeksel in het zeef vat wordt geïnjecteerd, mogelijk om floëemwondreacties (coagulatie van eiwitten; Knoblauch & Van Bel 1998) tegen te gaan. Tijdens E2 vindt vervolgens onder constante toevoe¬ ging van waterig speeksel passieve fioëemsapopname plaats. Continue fioëemsapopname (E2) uit een enkel zeefvat is uren tot vele dagen (maximaal tien dagen) waargenomen. Een duur langer dan 10-15 minuten wordt vaak als citerium voor 'zeefvatacceptatie' gezien. Overigens begint een El -periode altijd als een pd-golfvorm met subfasen II1 en 1 1-2 . Alleen subfase 11-3 is hierbij vaak minder duidelijk. Onbeantwoord blijft de vraag wat bepaalt of een zeefvatpunctie al dan niet van de initiële pd-activiteit overgaat in El en vervolgens al of niet overgaat in E2. Open vragen en verder onderzoek Aansluitend op het voorgaande zijn er nog veel vragen open over de penetratie-activiteit van bladluizen. Ondanks de vrij gedetailleerde kennis die we nu verkregen hebben zijn er misschien zelfs wel meer vragen dan toen we van start gin¬ gen. Een oude vraag die nog steeds niet, of niet volledig, beantwoord kan worden is hoe bladluizen hun waardplant selecteren. Eigenlijk is dat ook bij de bijtende herbivore in¬ secten vaak nog vrij vaag. Hoewel er voor sommige soorten 'sleutelprikkels' lijken te zijn in de vorm van de aan of afwe¬ zigheid van bepaalde secundaire plantenstoffen, lijkt voor andere soorten een subtiele combinatie van belang. Zo is er van veel Brassicaceae-specialisten bekend dat de aanwezig¬ heid van zogenaamde glucosinolaten van belang is. Dat geldt ook voor de melige koolluis (Brevicoryne brassicae Linnaeus) (Gabrys & Tjallingii 2002). Het is echter niet uit te sluiten dat alleen sommige glucosinolaten daarbij een stimulerende, terwijl andere glucosinolaten mogelijk een inhiberende rol hebben. Met onze huidige kennis van het penetratiegedrag lijkt het duidelijk maar niet 'bewezen' dat de melige kool¬ luis glucosinolaten proeft tijdens de sapopname gedurende de intracellulaire puncties (subfase II-3 van de pd). Of de glucosinolaten alleen tijdens deze intracellulaire puncties worden geproefd of dat er tijdens de padfase ook sapmon sters uit de intercellulaire vloeistof opgezogen worden om deze stoffen waar te nemen is niet bekend. Voor sapbemon stering tijdens golfvorm C zijn geen aanwijzingen, maar golfvorm C is in feite nog een grote hoop met onbekende elementen. Alleen golfvormen B, pd, en in mindere mate golfvorm A zijn duidelijke elementen in de padfase. Interes¬ sant in dit verband is dat in de padfase bij witte vlieg (Ho moptera, Aleurodidae; Janssen et al. 1989) geen celpuncties (pd's) voorkomen. Sporadisch komen wel pd's voor met een E2 El. salivation into sieve element E2, ingestion from sieve element. I I cell wall ■■ stylet ■■ sheath saliva 1 _ I watery saliva I I plant sap — plasmalemma • virion Figuur 6 Floëemfase-golfvormen El en E2 en hun relaties met speekselsecretie en sapopname, zoals bleek uit persistente virustransmissie. Tijdens El wordt speeksel met virionen (uit de speekselklier) in het zeefvat geïnjecteerd (links) omdat de klep (niet zichtbaar) in het voedselkanaal (pharynx) gesloten is. Tijdens E2 is de klep open zodat floëemsap met virionen het kanaal worden ingeperst door de hoge druk in het zeefvat (rechts). Het E2 speeksel gaat direct het kanaal in en komt niet in de plant. Phloem phase wave forms El and E2 and their corresponding salivation and ingestion relations as inferred from persistent virus transmission. During El saliva with virions are injected into the sieve tube (left) because the cibarial valve (not visible) is closed. During E2 the valve is open, so that the sap with virions is forced into the stylet canal by the pressure in the sieve tube (right). The E2 saliva goes directly into the canal and will not reach the plant. Entomologische Berichten 63(5) 2003 115 mogelijke floëemrelatie. Veel soorten witte vliegen zijn zeer monofaag (in tegenstelling tot onze plaagsoorten) en zullen hun waardplant waarschijnlijk al herkennen voor de floëem fase. Golfvorm C moet dus nog verder 'onder de loupe'. Een andere 'klassieke' vraag is hoe bladluizen het floëem vinden. Er zijn allerlei gradiënten verondersteld die de stilet¬ ten maar hoeven te volgen om bij het floëem te komen, bij¬ voorbeeld een druk-, pH of suikergradiënt. Het blijkt echter dat 'gradiënt' in de literatuur het meest wordt opgevat als een concentratieverschil tussen de inhoud van bijvoorbeeld mesofylcellen ten opzichte van vaatbundel of zeefvatcellen. Er is dus niet een van cel tot cel geleidelijk veranderende concentratie, en daardoor dus niet een te volgen gradiënt. Met deze informatie zou voor bladluizen een plausibele al¬ ternatieve hypothese kunnen zijn dat het opsporen van het floëem een willekeurig proces is waarbij van elke cel langs de stiletweg door middel van een punctie wordt vastgesteld of het een floëemcel is of niet. De druk, de pH of het suiker¬ gehalte en dergelijke blijken na een celpunctie (pd). De ini¬ tiële richting is altijd dezelfde: loodrecht op het bladopper vlak. Opnieuw verstoort de witte vlieg de redenatie echter, want deze insecten kunnen het floëem vinden zonder punc¬ ties. De vraag blijft dus vooralsnog onbeantwoord. Plantenfysiologen hebben recent aangetoond dat coagu latie van floëemeiwitten binnen enkele minuten optreedt in een zeefvat dat mechanisch verwond raakt (Knoblauch & Van Bel 1998). Hierdoor raken de zeefplaten tussen de zeef vaten verstopt en vindt in de volgende uren en dagen een meer volledige afsluiting met callose plaats. De vraag is hoe bladluizen deze wondreacties kunnen voorkomen om zich ongehinderd met het floëemsap te voeden. Dat het El -speek¬ sel daarbij een rol zou kunnen spelen ligt voor de hand, de vraag is alleen hoe? Ook hier ligt nog een breed onderzoeks¬ veld open. Tenslotte een meer ecologisch probleem: bladluizen zijn onder andere schadelijk omdat ze groeistoornissen en 'toxi¬ sche' effecten in de plant (kunnen) veroorzaken. Het blijkt steeds meer dat behalve groeistoornissen er ook tal van an¬ dere effecten in de plant worden geïnduceerd: systemische resistentie, productie van vluchtige stoffen die in andere planten resistentie kunnen veroorzaken ('talking plants') of die natuurlijke vijanden van de belager aantrekken ('cry for help'). Het speeksel dat de bladluis in de plant injecteert lijkt hierbij een cruciale rol te spelen. Eenzelfde plant kan per bladluissoort totaal anders reageren. Uit onze huidige EPG kennis blijkt dat er (ten minste) vier episoden van speeksel secretie zijn in het penetratiegedrag: 1) golfvorm B, gelerend speeksel intercellulair, 2) golfvorm pd (subfase II1), waterig speeksel, intracellulair, 3) golfvorm El, waterig speeksel in het zeefvat, en 4) golfvorm E2, waterig speeksel dat direct wordt opgenomen en met het floëemsap wordt gemengd. Bovendien bezitten bladluizen twee speekselklieren met elk een groot aantal verschillende uitscheidingscellen. Hoewel er steeds geavanceerdere technieken komen voor bioche¬ misch onderzoek naar verschillende eiwitten zal het bemon¬ steren en ontrafelen van de verschillende speekselcompo nenten niet eenvoudig zijn, maar wel essentieel om de diver¬ siteit en specificiteit van de geïnduceerde plantreacties te kunnen begrijpen. Literatuur Gabrys B. & Tjallingii WF 2002. The role of sinigrin in hostplant re cognation by aphids during initial plant penetration. Entomo logia Experimentalis et Applicata 1 04: 89-93. Janssen JAM, Tjallingii WF & Lenteren JC van 1989. Electrical recor¬ ding and ultrastructure of stylet penetration by the greenhouse whitefly. Entomologia Experimentalis et Applicata 52: 69-81. Knoblauch M & Van Bel AJE 1998. Sieve tubes in action. The Plant Cell 10: 35-50. Martin B, Collar JL, Tjallingii WF & Fereres A 1997. Intracellular in¬ gestion and salivation by aphids may cause acquisition and inoculation of non-persistently transmitted plant viruses. Jour¬ nal of General Virology 78: 2701-2705. McLean DL & Kinsey MG 1964. A technique for electronically recor¬ ding of aphid feeding and salivation. Nature 202: 1358-1359. Miles PW 1999. Aphid saliva. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society 74: 41-85. Picket J, Wadhams LJ, Woodcock CM & Hardy J 1992. The chemical ecology of aphids. Annual Review of Entomology 37: 67-90. Pollard DG 1973. Plant penetration by feeding aphids (Hemiptera: Aphidoidea): a review. Bulletin of Entomological Research 62: 631-714. Prado E & Tjallingii WF 1994. Aphid activities during sieve element punctures. Entomologia Experimentalis et Applicata 72: 157 165. Prado E & Tjallingii WF 1997. Effects of previous plant infestation on sieve element acceptance by two aphids. Entomologia Experi¬ mentalis et Applicata 82: 189-200. Spiller NJ, Koenders L & Tjallingii WF 1990. Xylem ingestion by aphids a strategy for maintaining water balance. Entomologia Experimentalis et Applicata 55: 101-104. Tjallingii WF 1985. Stylet penetration activities by aphids. Thesis, Agricultural University, Wageningen. Tjallingii WF 1988. Electrical recording of stylet penetration activi¬ ties. In: Aphids, their biology, natural enemies and control. Volume 2B (Minks AK & Harrewijn P eds): 95-108. Elsevier. Tjallingii WF 1990. Continuous recording of stylet penetration activi¬ ties by aphids. In: Aphid-plant genotype interactions. (Campbell RK & Eikenbary RD eds): 89-99. Elsevier. Tjallingii WF 2000. Comparison of AC and DC systems for electronic monitoring of stylet penetration activities by homopterans. In: Principles and applications of electronic monitoring and other techniques in the study of homopteran feeding behavior (Walker GP & Backus EA eds): 41-69. Thomas Say Publications in Ento¬ mology, Entomological Society of America. Tjallingii WF & Hogen Esch T 1993. Fine structure of the stylet route in plant tissues by some aphids. Physiological Entomology 18: 317-328. Wensler RJD & Filshi KB 1969. Gustatory sense organs in the food canal of aphids. Journal of Morphology 129: 473-492. Geaccepteerd 14 april 2003. Summary Stylet penetration by aphids electrical penetration graph signals from green depths Stylet penetration by aphids can be studied well by the electrical penetration graph (EPG) technique, a recording system which in¬ corporates both plant and insect in an electrical circuit. It appears that especially the insect activities characteristic of plant penetra¬ tion as well as the tissue positions of the aphid's stylets in the plant are measured by the EPG-system. Only the movement limita¬ tions of the insect, by tethering it to the thin electrode, influence the behaviour somewhat. A large number of details of plant-aphid interactions during stylet penetration has been elucidated by EPG studies, but this has possibly aroused an even larger number of questions on what goes on in the depth of the plant tissues. 116 Entomologische Berichten 63(5) 2003 Gallen en schimmeltumtjes Galvormers komen binnen tenminste zeven in¬ sectenorden voor. De waardpiantspectra zijn echter heel verschillend: terwijl van galmuggen binnen praktisch alle plantenfamilies gallen be¬ kend zijn is de verspreiding van bijvoorbeeld galwespen of galvormende bladluizen slechts tot een paar families beperkt. Binnen de Cecidomyiidae, waartoe de galvor¬ mende muggen behoren, komt ook een breed scala aan voedingswijzen voor. Behalve de oor¬ spronkelijke vertegenwoordigers die van schim¬ mels leven zijn er uiteraard de bekende galmug¬ gen, en ook galvormers die weer in symbiose met schimmels leven. De verschillende evolutie scenario’s van voedingswijzen worden bespro¬ ken en op twee associaties tussen galmug, waardplant en schimmel wordt nader ingegaan. Entomologische Berichten 63(5): 1 17-122 Hans Roskam Sectie Evolutiebiologie Instituut Biologie Universiteit Leiden (IBL) Trefwoorden: Diptera, Cecidomyiidae, Asphondylia, Lasioptera, galmuggen, voedselkeuze, waardplantassociatie, symbiose, ambrosiagallen Wat zijn galmsecten? Galinsecten houden er binnen de planteneters een zeer spe¬ cialistische levenswijze op na: zij bewerken hun waardplan ten dusdanig dat deze bijzonder en vooral eiwitrijk voed¬ sel voor hen produceren. Bovendien leven de larven inge kapseld in de gallen waardoor de waardplant ze bescher¬ ming biedt. Galwespen en galvormende bladwespen prikken met hun legboor in het plantenweefsel en zetten zo de eie¬ ren af. Vaak gaat een druppeltje vloeistof mee waarmee de galvorming begint. Galmuggen doen het anders: zij hebben doorgaans een soepele legbuis waarmee eieren op de plant of tussen knopschubben worden gelegd. Van galvorming door het eileggende vrouwtje is hier geen sprake. De jonge larfjes bijten de waardplantcellen aan en kruipen de plant binnen. Soms worden ook beschadigingen die door eerdere planteneters zijn veroorzaakt gebruikt om in het planten¬ weefsel door te dringen. De larven ontwikkelen zich niet al¬ leen in de planten maar prikkelen deze tot het vormen van gezwellen, of gallen. Omdat zich in die gallen zogenaamde voedingsweefsels met snel delende kernen bevinden hebben ze een voor planten zeer hoog eiwitgehalte. Er bestaat een grote rijkdom aan galvormen. Sommige gallen zijn eenvoudige plooiingen van een bladrand, maar andere zijn heel gecompliceerd gebouwd. Dikke lagen van steencellen kunnen de larf tegen belagers beschermen. Soms hebben gallen zelfs een deurtje dat openklapt als het volwassen insect naar buiten komt. Probeer zo'n 'dienstbe¬ toon' van de waardplant maar eens volgens Darwin via vari¬ atie en selectie te verklaren! De kunstig gevormde bescher¬ mingslagen helpen trouwens het galinsect niet echt. Galin¬ secten worden doorgaans zwaar geparasiteerd en situaties waar zo'n 95% van de gallen niet de galvormer maar een van zijn parasieten oplevert zijn zeker geen uitzondering. Het blijft tevens verbazingwekkend dat praktisch alle celtypen die een plant in staat is te maken ook door een galinsect kunnen worden gestimuleerd. Voor morfogenetici, die de differentiatie van plantenweefsels bestuderen, een intrige¬ rend studieobject. Galinsecten weten dus hun waardplan ten uitermate listig te manipuleren. Zo'n fijnafstemming tus¬ sen galinsect en waardplant heeft ook een prijs: het over¬ grote deel van de soorten is slechts in staat om in bepaalde delen van een paar plantensoorten gallen te maken. Dat heeft voor een onderzoeker zeer aantrekkelijke kanten, want als je onderzoek doet naar soortvormingspatronen kun je nogal eens situaties aantreffen waarin co-speciatie heeft plaatsgevonden. De stamboom van de waardplant is in veel opzichten dan gelijkvormig aan die van het galinsect: evolu¬ tionair verwante galinsecten zitten op verwante planten¬ soorten en worden belaagd door een waaier van sluipwes¬ pen, waarvan de verwantschapspatronen op hun beurt ook weer sterk op die van hun gastheren, de galinsecten, lijken. Zo was het mogelijk om een cladogram of verwantschapshy pothese voor berken te maken doordat eerder zo'n hypothe¬ se voor de berkenzaadgalmug Semudobia was opgesteld (Roskam 1985). Entomologische Berichten 63(5) 2003 117 GALL INDUCERS direct Acari Diptera phytophages plant sap feeders f Thysanoptera 1 Homoptera Heteroptera Coleoptera Hymenoptera Hymenoptera Lepidoptera Diptera { zoophages c=> parasitoids =i> Hymenoptera j Phytoptidae Cecidomyiidae Phloeothripidae Adelgidae Eriosomatidae Psyllidae Coccidae Tingidae Curculionidae Tenthredinidae Cephidae Gelechiidae Tephritidae Agromyzidae Cynipidae Chalcidoidea Figuur I . Evolutionaire routes van voedingwijzen bij galinsecten inclusief galmijten. De directe rou¬ tes hebben geresulteerd in galvor mers met een brede verspreiding over de bloemplanten, de indirecte routes leverden galvormers op met beperkte waardplantspectra. Evolutionary routes of feeding mo¬ des in gall inducers (both insects and mites). The direct routes resul¬ ted in gall-making groups over a wide range of flowering plants, whereas indirect routes resulted in gall-making groups with restricted host plant ranges. Gallen komen voor bij zeer verschillende insectengroe pen: we kennen naast muggen en galwespgallen ook gallen die door bladluizen, kevers, bladwespen en vlinders worden veroorzaakt. Voor de volledigheid: zelfs onder schimmels en virussen komen de nodige galverwekkers voor denk aan wortelknolletjes en heksenbezems. Galmijten (geen insec¬ ten) en galmuggen zijn echter het talrijkst en hebben een grote verscheidenheid aan waardplanten. Galwespen en gal vormende bladwespen blijven beperkt tot slechts een paar plantenfamilies. Voor dit verschil in radiatiepatronen is een historische verklaring mogelijk. Als de voorouder van een bepaalde groep van galinsecten een primitieve of oorspron¬ kelijke, fungivore, voedingswijze heeft, of fungivore vertegen¬ woordigers nog steeds binnen zo'n groep voorkomen, dan blijken dergelijke galinsecten een breed waardplantspectrum te vertonen. Zij zijn lang (c. 50 miljoen jaar) geleden als het ware samen met de bloemplanten geëvolueerd. Stammen anderzijds galinsecten, zoals galwespen, van een voorouder af die zelf al een moderne of afgeleide voedingswijze had dan is het vermogen om gallen te vormen kennelijk pas laat in de evolutie tot stand gekomen, toen de radiatie van de bloemplanten grotendeels al zijn beslag had gekregen (zo'n 10 miljoen jaar geleden, figuur 1). Galwespen stammen af van sluipwespen. Zij komen bijvoorbeeld vooral op eiken en roosachtigen voor. Galvormende bladwespen, afkomstig van bladvretende bladwespen, vind je weer vaak op wilgen. Ei¬ genlijk behoren alle voorouders van kleinere galvormende groepen tot insecten met afgeleide voedingswijzen: sapzui gers bij wantsen en bladluizen, en bladmineerders bij vlin¬ ders (Dreger-Jauffret & Shorthouse 1992, Roskam 1992). Galmuggen De familie van de galmuggen, of Cecidomyiidae, orde Dipte¬ ra, bestaat slechts ten dele uit echte galvormers. Traditioneel worden drie subfamilies onderscheiden waarvan slechts een, de Cecidomyiinae en tevens de meest geavanceerde, galvor¬ mers herbergt. Binnen de Cecidomyiinae komen nog fungi¬ vore en prederende vertegenwoordigers voor, maar de over¬ grote meerderheid maakt gallen. Wel is het weer zo dat de fungivore soorten, zoals te verwachten valt, de meeste oor¬ spronkelijke kenmerken bezitten. Alle rovers worden tot twee verwante tribi gerekend. Hoewel de adulten van roofmuggen er heel gewoon uitzien kun je de larven gemakkelijk herken¬ nen aan hun lange antennen. Galinsecten, zowel muggen als wespen, kennen inquilinen of voedselparasieten. Systema¬ tisch behoren inquilinen tot galinsecten, maar contradictio in terminis ze hebben het vermogen om gallen te vormen verloren. Inquilinen leven van het galweefsel dat door acti¬ viteiten van andere galinsecten is ontstaan. Soms heeft de echte galvormer daar geen last van, maar in andere gevallen groeit de inquiline sneller dan het galinsect en gaat de laat¬ ste dood of wordt het uiteindelijk door de inquiline opge¬ peuzeld. Hoe ontstaan muggengallen? Om dit te begrijpen moeten we de voedingswijze van de Cecidomyiiden nader bekijken. De larven van Cecidomyiiden (ik gebruik met nadruk niet de Nederlandse naam 'galmuggen' omdat in dit verhaal de niet galvormende vertegenwoordigers minstens zo essentieel zijn) hebben doorgaans sterk gereduceerde zuigende mond delen. Zij bijten een cel van plant, schimmel, of andere larf aan en zuigen deze leeg. Het merkwaardige is dat het opge¬ zogen voedsel na enige tijd samen met verteringsenzymen wordt uitgespuugd en vervolgens buiten de larf een soort van voorvertering doormaakt. Na enige tijd wordt zo'n half verteerd druppeltje weer opgezogen en verder verteerd. We noemen dit extra-intestinale vertering vertering buiten de darm dus (Mamaev 1975, Roskam 1992). Injecteert een gal muglarf half afgebroken eiwitten terug in een waardplant dan reageert de waardplant met tumorvorming: de bekende plantengal. De differentiaties van galweefsel (zoals de eerder genoemde steencellen) kunnen het gevolg zijn van het varië¬ ren van de samenstelling van het halfverteerde voedsel door het insect, of van diffusiegradiënten binnen de gal. Hier moet echter nog uitvoerig onderzoek aan gedaan worden. Hoewel de overstap van schimmelhyfen naar plantencellen gecom¬ pliceerd is is de overheersende mening bij specialisten toch dat deze overstap een aantal keren in de evolutie moet zijn 118 Entomologische Berichten 63(5) 2003 gemaakt. Aan de basis van iedere hoofdcategorie bin¬ nen de Cecidomyiiden staan fungivore taxa (figuur 2). Vanuit fungivore clades (takken van het cladogram) hebben zich bij clade 10 predatormuggen ontwikkeld en bij de clades 6 en 12, in totaal verschillende groe¬ pen dus, de echte galvormers. Volgens deze hypothe¬ se evolueerden ambrosiamuggen uit galvormende muggen bij de clades 7 en 13. De ambrosiamuggen van de Alycaulini en Lasiopterini zijn nauwer verwant aan de fungivore Oligotrophini, terwijl de ambrosia¬ muggen van de Schizomyiini en Asphondyliini nau¬ wer verwant zijn aan de fungivore Cecidomyiini. n ~ Cecidomyiinae Lasiopteridi Ceeidomyiidi (1705) (2060) Ambrosiagallen: schimmeltuintjes in plaats van voedingscellen We hebben het eerder over de kieskeurigheid van galinsecten gehad: Door de hoge mate van fysiologi¬ sche fijnafstemming tussen galinsect en waardplant zijn dergelijke associaties bijzonder hecht. Galinsec¬ ten kunnen heel slecht op andere waardplanten overstappen. Met dit in het achterhoofd is het denk¬ baar dat de overstap van de oorspronkelijk fungivore naar een fytofage voedingswijze moeilijk is geweest. Rottend, door schimmels en bacteriën als het ware voorverteerd plantenweefsel laat zich nu eenmaal gemakkelijker verteren dan gezond weefsel. Als er bovendien associaties tussen planten en insecten voorkomen waarbij schimmels een intermediaire rol spelen dan herinnert zo'n situatie aan de oorspron¬ kelijke fungivore voedingswijze. Net zoals mieren en termieten zijn er galmuggen die er schimmeltuintjes op nahouden: de galmugvrouwtjes hebben op hun legbuis ingenieuze aanpassingen waarmee ze in staat zijn tegelijkertijd met de eieren schimmelspo¬ ren of schimmelhyfen op de nieuwe waardplant af * te zetten. De schimmels trekken samen op met de jonge gal muglarven en bekleden uiteindelijk de binnenwand van de gal. In deze gallen ontbreekt doorgaans de laag van gediffe¬ rentieerde voedingscellen; de larven zuigen de schimmel¬ hyfen leeg en komen zo aan de bouwstoffen die eerder door de schimmel aan de waardplant zijn onttrokken (Rohfritsch 1992, 1997). Neger (1908, 1913) ontdekte dit verschijnsel eerst bij kevers en later bij galmuggen. Van hem komt de term ambrosia, naar de godenspijs in de Griekse mythologie. Ook was hij de eerste die de schimmel op naam bracht. Galmuggen die met schimmels en waardplanten in sym¬ biose leven blijken vooral onder warmere klimaatomstandig¬ heden aanmerkelijk bredere waardplantspectra te hebben dan de echte galmuggen. Kennelijk maakt de schimmel als intermediair de galmug veel minder kieskeurig. Dit heeft een groot voordeel. Immers, gewone galmuggen ontwikkelen zich in hoge mate gesynchroniseerd met hun waardplant. Zij kunnen daardoor maar een of hooguit twee generaties per jaar produceren. Ambrosiamuggen wisselen, net als bladlui¬ zen, van waardplant en maken zo vele generaties per jaar. De verschillende waardplanten zijn meestal niet verwant (Orphanides 1975, Yukawa 1980, Gagné & Hawkins 1983, Yukawa & Ohsaki 1988). Eerder is aannemelijk gemaakt dat het vermogen om ambrosiagallen te veroorzaken minstens twee maal binnen de galmuggen is ontstaan. De symbiose met zowel een schim¬ mel als een groene plant komt binnen verschillende afstam fungivoor predator plantengal ambrosiagal Figuur 2. Afstammingshypothese voor de Cecidomyiidae (Gagné 1994, Roskam in druk). Verschillend gekleurde takken van het cladogram geven de verschillende voe¬ dingswijzen aan. Hissen haakjes staan de aantallen beschreven soorten (Skuhravà 1986). Catotrichinae is een recent beschreven kleine subfamilie, waarmee het moge¬ lijk werd om de Lestremiinae als monofyletisch te beschouwen (Jaschhof 2000). Phylogenetic hypothesis for Cecidomyiidae (Gagné 1994, Roskam in press). Different¬ ly coloured clades indicate the various feeding modes. Species numbers between brackets follow Skuhravà (1986). Catotrichinae are a recently erected small subfamily, rendering Lestremiinae monophyletic (Jaschhof 2000). mingslijnen bij galmuggen verschillend tot stand. Ik wil dit aan de hand van twee galmuggenera nader toelichten, na¬ melijk Lasioptera als vertegenwoordiger van de Lasiopterini en Asphondylia als representant van de Asphondyliini. Lasioptera Lasioptera is een groot genus met zo'n 90 beschreven soor¬ ten in het Euraziatische gebied en ongeveer 35 soorten in Noord-Amerika. De larven verpoppen in gallen. Doorgaans worden de gallen in stengels van waardplanten gemaakt en is er sprake van een schimmelsymbiont. Docters van Leeu¬ wen (1982) noemt voor Nederland slechts drie soorten die gallen maken op braam, populier en schermbloemigen. Lasio¬ ptera rubi (Schrank), bekend van stengelgallen op braam, kan ook schade veroorzaken op kruisbes en zwarte bes (Bar¬ nes 1948). Bramen horen tot de roosachtigen (Rosaceae), zwarte bessen en kruisbessen tot de ribesachtigen (Grossu lariaceae). Dit past in de eerdere bewering dat ambrosia¬ muggen veel bredere waardplantspectra hebben dan galmug¬ gen. Overigens kun je bramen met zwarte bessen kruisen, dus genetisch en fytochemisch zal het verschil tussen deze waardplanten niet zo groot zijn. Lasioptera carophila Löw en Kiefferia pimpinellae Loew (= K. pericarpiicola (Bremi); deze laatste behoort ook tot de Lasiopterini) worden als plaag van karwij en peen gemeld (Barnes 1946). "hA/ee andere soor¬ ten (in Docters van Leeuwen (1982) onder Thomasiella, nu een synoniem van Lasioptera) maken stengelgallen op riet. Entomologische Berichten 63(5) 2003 119 Omdat riet veel voor dakbedekking werd gebruikt is veel onderzoek naar de schade van L. arundinis Schiner gedaan (Skuhravâ & Skuhravy 1981, 1992, Rohfritsch 1997). Lasioptera-soorten zetten de eieren samen met de schim¬ mel op stengels van de waardplant af. Soms wordt in gangen en op vraatplekken van andere insecten gelegd. De legbuis is in uitgestrekte toestand even lang als de rest van het vrouw¬ tje (c. 2 mm) en vanwege de grote buigzaamheid kan deze niet in de waardplant worden geprikt. Aan de basis en vlak voor het uiteinde van de legbuis bevinden zich twee plekjes met merkwaardige borstel en lepelvormige zintuigjes waar¬ mee het vrouwtje schimmelsporen verzamelt door het door schimmelplekjes op het waardplantoppervlak heen af te tas¬ ten (Tastâs-Duque & Sylvén 1989, figuur 3a-d). Hoewel spo Figuur 3. Legbuizen van ambrosiamuggen. Romeinse cijfers geven de achterlijfssegmenten aan. a-f is Lasioptera rubi (Schrank), a. Legbuis in uitgestulpte toestand, b. Detail van achterlijfssegment VIII met porieloze zintuigborstels. c. Detail van segment X met drie typen zintuigborstels. d. Porie zintuigborstel. e. Zintuigborstel met terminale porie (p). f. Lepel¬ vormige zintuigborstel met spleet (s) en porie (p). g. Achterlijf van Asphon dylia sarothamni (Loew) met ingetrokken naaldvormige legbuis. Let op het verlengde sterniet van segment VII met daarboven, gestippeld, het mycangium. d-f naar Thstas-Duque & Sylvén (1989). Ambrosia midge ovipositors. Roman numerals indicate abdominal seg¬ ments. a-f refers to Lasioptera rubi (Schrank), a. Exposed ovipositor, b Detail of abdominal segment VII with non-porous bristles, c. Detail of segment X with three différend kinds of sensory bristles, d Non-porous bristle, e. Uniporous bristle with terminal pore (p).f. Scoop-like sensilla with slit (s) and pore (p). g Asphondylia sarothamni (Loew), abdomen with intruded needle-shaped ovipositor. Note the enlarged s terni te VII co¬ vering the mygangium (stippled), d-f after Tastâs-Duque & Sylvén (1989). ■ — — a ren van tenminste vier verschillende schimmels voorkomen verzamelt de mug slechts de sporen van schimmels die tot de symbiose behoren. Hoe het selectieproces werkt is onbe¬ kend. Vermoedelijk correspondeert de lengte van de borstel¬ tjes en lepeltjes met die van de geschikte sporen. De sporen verhuizen van de lepeltjes naar twee mycangia, zakjes die zich ter weerszijden van het oviduct bevinden. Tegelijkertijd met de eieren worden de schimmelsporen op de waardplant afgezet (Rohfritsch 1997). De sporen zijn ongeslachtelijke conidiosporen van een Macrophomaachtige coelomyceet. De symbiose tussen galmug en schimmel doet aan die tus¬ sen vijgen en vijgenwespen (Agaonidae) denken. Ook de vijgenwespjes verzamelen actief het stuifmeel van de vijgen bloemen, dat ze in speciale gleuven op hun borststuk stop¬ pen om het er later weer uit te halen en de stijlen van de vol¬ gende generatie vijgenbloemen te bevruchten. 