Kommissionens förordning (EU) 2016/266 av den 7 december 2015 om ändring, för anpassning till den tekniska utvecklingen, av förordning (EG) nr 440/2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (Text av betydelse för EES)
Dit wordt ook wel de relatieve groeisnelheid genoemd (12). (b) Opbrengst: deze responsvariabele wordt berekend op basis van de verandering in het aantal schijfjes en daarnaast op basis van de verandering in een andere meetparameter (totaaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of versgewicht) in de controles en elke dosisgroep tot het eind van de test. 51. Er moet worden opgemerkt dat de met behulp van deze twee responsvariabelen berekende waarden voor de toxiciteit niet vergelijkbaar zijn en bij gebruik van de resultaten van de test moet met dit verschil rekening worden gehouden. Vanwege de mathematische grondslagen van de respectieve benaderingen zullen ECx -waarden op basis van de gemiddelde specifieke groeisnelheid (ErCx) in het algemeen hoger zijn dan resultaten op basis van de opbrengst (EyCx) als de testomstandigheden van deze testmethode worden aangehouden. Dit moet niet worden geïnterpreteerd als een verschil in gevoeligheid tussen de twee responsvariabelen, maar zuiver als een mathematisch verschil tussen de waarden. Het begrip gemiddelde specifieke groeisnelheid is gebaseerd op het algemene exponentiële groeipatroon van eendenkroos in niet-beperkte culturen, waarbij de toxiciteit wordt geschat op basis van de effecten op de groeisnelheid, zonder dat deze afhankelijk is van het absolute niveau van de specifieke groeisnelheid van de controle, van de helling van de concentratie-responscurve of van de duur van de test. De resultaten op basis van de responsvariabele opbrengst zijn daarentegen afhankelijk van al deze andere variabelen. De EyCx is afhankelijk van de specifieke groeisnelheid van de bij elke test gebruikte eendenkroossoort en van de maximale specifieke groeisnelheid die van soort tot soort en zelfs van kloon tot kloon kan verschillen. Deze responsvariabele moet niet worden gebruikt voor een vergelijking tussen eendenkroossoorten of zelfs verschillende klonen qua gevoeligheid voor toxische stoffen. De wetenschap geeft weliswaar de voorkeur aan het gebruik van de gemiddelde specifieke groeisnelheid om de toxiciteit te schatten, maar in deze testmethode wordt ook de schatting van de toxiciteit op basis van de opbrengst opgenomen om te voldoen aan de vereisten in de huidige regelgeving in bepaalde landen. 52. De toxiciteit moet worden geschat op basis van het aantal schijfjes en daarnaast één andere meetvariabele (totaaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of versgewicht), omdat sommige stoffen mogelijk een veel grotere invloed hebben op andere meetvariabelen dan het aantal schijfjes. Dit effect zou niet worden gedetecteerd als alleen naar het aantal schijfjes wordt gekeken. 53.  Er wordt een tabel gemaakt met het aantal schijfjes en een andere geregistreerde meetvariabele, d. w. z. het totaaloppervlak van de schijfjes, het drooggewicht of het versgewicht, alsmede de concentraties van de teststof op elk meettijdstip. Bij de latere gegevensanalyse, bijvoorbeeld om de LOEC, de NOEC of de ECx te bepalen, moet worden uitgegaan van de waarden voor de afzonderlijke replicaten en niet van de berekende gemiddelden voor elke dosisgroep. Gemiddelde specifieke groeisnelheid 54. De gemiddelde specifieke groeisnelheid voor een bepaalde periode wordt voor elk controlereplicaat en elk dosisreplicaat met de volgende vergelijking berekend als de logaritmische toename van de groeivariabelen — het aantal schijfjes en één andere meetvariabele (totaaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of versgewicht): waarbij — : μi-j : de gemiddelde specifieke groeisnelheid van tijdstip i tot tijdstip j; — : Ni : de gemiddelde specifieke groeisnelheid van tijdstip i tot tijdstip j; — : Nj : de meetvariabele in het test- of controlevat op tijdstip j; — : t : de periode van tijdstip i tot tijdstip j. Voor elke dosisgroep en controlegroep wordt een gemiddelde waarde voor de groeisnelheid berekend en een waarde voor de variantie. 55. De gemiddelde specifieke groeisnelheid moet voor de volledige testperiode worden berekend (tijdstip „i” in bovenstaande formule is het begin van de test en tijdstip „j” is het einde van de test). Voor elke testconcentratie en controle wordt een gemiddelde waarde voor de gemiddelde specifieke groeisnelheid berekend en een waarde voor de variantie. Daarnaast moet de partiële groeisnelheid worden bepaald om effecten van de teststof gedurende de blootstellingsperiode te evalueren (bijvoorbeeld door inspectie van de log-getransformeerde groeicurven). Aanzienlijke verschillen tussen de partiële groeisnelheid en de gemiddelde groeisnelheid wijzen erop dat de groei niet voortdurend exponentieel is en dat de groeicurven grondig moeten worden bestudeerd. In dit geval zou het een behoedzame aanpak zijn om de specifieke groeisnelheden van behandelde culturen gedurende de periode van maximale remming te vergelijken met die van controles gedurende dezelfde periode. 56. De procentuele remming van de groeisnelheid (Ir) kan dan voor elke testconcentratie (dosisgroep) worden berekend met de volgende formule: waarbij — : %Ir : procentuele remming van de gemiddelde specifieke groeisnelheid; — : μC : gemiddelde waarde van μ in de controlegroep — : μT : gemiddelde waarde van μ in de dosisgroep Opbrengst 57.  De effecten op de opbrengst worden bepaald op basis van twee meetvariabelen, het aantal schijfjes en één andere meetvariabele (totaaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of versgewicht) in elk testvat aan het begin en aan het eind van de test. Voor het drooggewicht of het versgewicht wordt de biomassa aan het begin bepaald op basis van een schijfjesmonster genomen uit de batch die voor het beënten van de testvaten wordt gebruikt (zie punt 20). Voor elke testconcentratie en controle wordt een gemiddelde waarde voor de opbrengst berekend en een waarde voor de variantie. De gemiddelde procentuele remming van de opbrengst (%Iy) kan voor elke dosisgroep als volgt worden berekend: waarbij — : % Iy : procentuele remming van de opbrengst; — : bC : biomassa aan het eind minus biomassa aan het begin in de controlegroep; — : bT : biomassa aan het eind minus biomassa aan het begin in de dosisgroep. Uitzetting van de groeicurven 58. Uitzetting van de gemiddelde procentuele remming van de responsvariabele (Ir, of Iy, berekend volgens punt 56 of 57) tegen de logaritme van de concentratie van de teststof levert concentratie-responscurven op. Schatting van de ECx 59. De ECx (bv. EC50) moet worden geschat op basis van zowel de gemiddelde specifieke groeisnelheid (ErCx) als de opbrengst (EyCx), in beide gevallen op basis van het aantal schijfjes en één andere meetvariabele (totaaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of versgewicht). De reden hiervoor is dat sommige teststoffen het aantal schijfjes anders beïnvloeden dan andere meetvariabelen. De gewenste toxiciteitsparameters zijn derhalve vier ECx-waarden voor elk berekend remmingsniveau x: ErCx (aantal schijfjes); ErCx (totaaloppervlak schijfjes, drooggewicht of versgewicht); EyCx (aantal schijfjes); en EyCx (totaaloppervlak schijfjes, drooggewicht of versgewicht). Statistische procedures 60. Het is de bedoeling om met behulp van regressieanalyse een kwantitatieve concentratie-responsrelatie te verkrijgen. Het is mogelijk een gewogen lineaire regressie te gebruiken nadat op de responsgegevens een lineariserende transformatie is uitgevoerd, bijvoorbeeld naar probit-, logit- of Weibull-eenheden (13), maar de voorkeur wordt gegeven aan niet-lineaire regressieprocedures, die beter omgaan met onvermijdelijke onregelmatigheden in gegevens en afwijkingen van uniforme verdelingen. In de buurt van het nulpunt of totale remming kunnen dergelijke onregelmatigheden door de transformatie worden uitvergroot en kunnen ze de analyse storen (13). Er moet worden opgemerkt dat standaardanalysemethoden met probit-, logit- of Weibull-transformaties bedoeld zijn voor gebruik bij een binaire respons (bv.  sterfte of overleven) en moeten worden aangepast om voor groeisnelheid- of opbrengstdata te kunnen worden gebruikt. Specifieke procedures voor de bepaling van ECx-waarden uit continue data zijn te vinden in (14), (15) en (16). 61. Voor elke te analyseren responsvariabele wordt de concentratie-responsrelatie gebruikt voor de berekening van puntschattingen van ECx-waarden. Waar mogelijk moeten voor elke schatting de 95 %-betrouwbaarheidsgrenzen worden bepaald. De kwaliteit van de fitting van de responsgegevens op het regressiemodel moet grafisch of statistisch worden bepaald. De regressieanalyse moet met responsen van individuele replicaten worden uitgevoerd en niet met gemiddelden van dosisgroepen. 62. Als de beschikbare regressiemodellen/methoden niet geschikt zijn voor de gegevens, kunnen de EC50 en de betrouwbaarheidsgrenzen ook worden bepaald met behulp van lineaire interpolatie met bootstrapping (17). 63. Voor de bepaling van de LOEC en daaruit de NOEC moeten de gemiddelden van de dosisgroepen worden vergeleken met behulp van variantieanalyse-technieken (ANOVA). Het gemiddelde voor elke concentratie moet dan worden vergeleken met het gemiddelde van de controlegroep met behulp van een geschikte methode voor meervoudige vergelijking of trendtoets. Hiervoor kan de Dunnett- of Williams-toets geschikt zijn (18) (19) (20) (21). Er moet worden bepaald of de ANOVA-aanname van homogeniteit van variantie opgaat. Deze bepaling kan grafisch worden uitgevoerd of met een formele toets (22). Hiervoor kan de Levene- of Bartlett-toets worden gebruikt. Wanneer de aanname van homogeniteit van variantie niet opgaat, kan dit soms worden gecorrigeerd door logaritmische transformatie van de gegevens. Als de heterogeniteit van variantie extreem is en niet door transformatie kan worden gecorrigeerd, moet een analyse met methoden als de stap-omlaag-trendtoets van Jonckheere worden overwogen. Aanvullende richtsnoeren voor het bepalen van de NOEC zijn te vinden in (16). 64. Recente wetenschappelijke ontwikkelingen hebben geleid tot een aanbeveling om het begrip NOEC niet langer te gebruiken en te vervangen door op regressie gebaseerde puntschattingen van ECx. Voor deze Lemna-test is geen geschikte waarde voor x vastgesteld. Een interval van 10 tot 20 % lijkt geschikt (afhankelijk van de gekozen responsvariabele) en bij voorkeur moeten zowel de EC10 als de EC20 worden gerapporteerd. Rapportage 65. In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opgenomen:   Teststof: — fysische aard en fysisch-chemische eigenschappen, waaronder de oplosbaarheidsgrens in water; — chemische identificatiegegevens (bv. CAS-nummer), waaronder de zuiverheid (verontreinigingen). Geteste soort: — wetenschappelijke naam, kloon (indien bekend) en herkomst.  Testomstandigheden: — gebruikte testprocedure (statisch, semistatisch of doorstroom); — begindatum en duur van de test; — testmedium; — beschrijving van de testopzet: testvaten en deksels, volume van de oplossingen, aantal kolonies en schijfjes per testvat aan het begin van de test; — testconcentraties (nominaal en gemeten, indien van toepassing) en aantal replicaten per concentratie; — wijze van bereiding van de stam- en testoplossingen met vermelding van het gebruik van eventuele oplosmiddelen of dispergeermiddelen; — temperatuur tijdens de test; — lichtbron, lichtintensiteit en homogeniteit van het licht; — pH-waarden van de test- en controlemedia; — concentraties van de teststof en de analysemethode met relevante kwaliteitsborgingsgegevens (valideringsstudies, standaarddeviaties of betrouwbaarheidsgrenzen van analyses); — methoden voor de bepaling van het aantal schijfjes en andere meetvariabelen (bv. drooggewicht, versgewicht of oppervlak schijfjes); — alle afwijkingen van deze testmethode. Resultaten: — de ruwe data: het aantal schijfjes en andere meetvariabelen in elk test- en controlevat bij elke observatie en op elk analysetijdstip; — de gemiddelden en standaarddeviaties voor elke meetvariabele; — de groeicurven voor elke concentratie (aanbevolen met log-getransformeerde meetvariabele; zie punt 55); — de verdubbelingstijd/groeisnelheid in de controle op basis van het aantal schijfjes; — de berekende responsvariabelen voor elk dosisreplicaat, met het gemiddelde en de variatiecoëfficiënt voor de replicaten; — een grafische weergave van de concentratie-effectrelatie; — schattingen van de toxiciteit voor responsvariabelen, zoals EC50, EC10, EC20 en de bijbehorende betrouwbaarheidsintervallen. De LOEC en/of de NOEC, indien deze zijn berekend, en de voor de bepaling daarvan gebruikte statistische methoden; — als ANOVA is gebruikt, de grootte van het effect dat kan worden gedetecteerd (bv. het minst significante verschil); — een eventuele stimulering van de groei, als deze bij een behandeling is geconstateerd; — eventuele zichtbare tekenen van fytotoxiciteit en observaties aan de testoplossingen; — bespreking van de resultaten, met inbegrip van eventuele beïnvloeding van de resultaten van de test die een gevolg is van afwijkingen van deze testmethode. LITERATUUR (1) ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11. 05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA. (2) US EPA — United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850. 4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp. , „Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp. 8pp. (3) AFNOR — Association Française de Normalisation. (1996).  XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp. (4) SSI — Swedish Standards Institute. (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. 15pp. (in het Zweeds). (5) Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37 — 120 pp. (6) Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145. (7) Sims I. , Whitehouse P. and Lacey R. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency. (8) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. (9) International Organisation for Standardisation. ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) — Duckweed Growth Inhibition Test. (10) Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L. ). Environmental Research Laboratory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3- September 1977. (11) Lockhart W. L. , Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353 — 359. (12) Huebert, D. B. and Shay J. M. (1993) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481-483. (13) Christensen, E. R. ,, Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713-718. (14) Nyholm, N. Sørensen, P. S. , Kusk, K. O. and Christensen, E. R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167. (15) Bruce R. D. and Versteeg D. J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494. (16) OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. (17) Norberg-King T. J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN. (18) Dunnett, C. W.  (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. , 50, 1096-1121. (19) Dunnett, C. W. (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491. (20) Williams, D. A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117. (21) Williams, D. A. (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 519-531. (22) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96. Aanhangsel 1 Definities In de context van deze testmethode worden de volgende definities en afkortingen gebruikt: Biomassa : het drooggewicht van het levende materiaal in een populatie. Bij deze test worden meestal vervangende eenheden voor biomassa gemeten, zoals aantal schijfjes of schijfoppervlak, en ook deze eenheden kunnen bij gebruik van de term „biomassa” worden bedoeld. Chemische stof : een stof of een mengsel. Chlorose : gele verkleuring van schijfweefsel. Kloon : een organisme of cel, door ongeslachtelijke voortplanting ontstaan uit één individu. Individuen uit één kloon zijn derhalve genetisch identiek. Kolonie : een combinatie van aan elkaar vastzittende moeder- en dochterschijfjes (meestal 2 tot 4). Soms ook plant genoemd. ECx : de concentratie van de in het testmedium opgeloste teststof die binnen een bepaalde blootstellingsperiode (die expliciet moet worden vermeld als deze afwijkt van de volledige of normale duur van de test) leidt tot een afname van de groei van Lemna met x % (bv. 50 %). Om ondubbelzinnig aan te geven of een EC-waarde gebaseerd is op de groeisnelheid of de opbrengst, worden de symbolen „ErC” voor de groeisnelheid en „EyC” voor de opbrengst gebruikt, gevolgd door de gebruikte meetvariabele, bv. ErC (aantal schijfjes). Doorstroomtest : een test waarbij de testoplossing continu wordt ververst. Schijfje : een individuele „bladachtige” structuur van een eendenkroosplant. Het is de kleinste eenheid (d. w. z. individu) die zich kan voortplanten. Gebocheldheid : schijfjes die er gebocheld of gezwollen uitzien. Groei : een toename van de meetvariabele, bv. aantal schijfjes, drooggewicht, natgewicht of schijfoppervlak, gedurende de testperiode. Groeisnelheid : (gemiddelde specifieke groeisnelheid): de logaritmische toename van de biomassa gedurende de blootstellingsperiode.  LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) : de laagste geteste concentratie waarbij wordt waargenomen dat de stof binnen een bepaalde blootstellingstijd in vergelijking met de controle tot een statistisch significante afname van de groei (p < 0,05) leidt. Alle testconcentraties boven de LOEC moeten een schadelijk effect hebben dat ten minste gelijk is aan het bij de LOEC waargenomen effect. Wanneer niet aan deze twee voorwaarden kan worden voldaan, moet een volledige toelichting worden gegeven op de wijze waarop de LOEC (en dus de NOEC) is bepaald. Meetvariabelen : alle soorten variabelen die gemeten worden om aan de hand van een of meer verschillende responsvariabelen het eindpunt van de test te beschrijven. Bij deze methode zijn aantal schijfjes, schijfoppervlak, versgewicht en drooggewicht meetvariabelen. Monocultuur : een cultuur met één plantensoort. Necrose : sterfte van schijfjesweefsel (dat daardoor wit of met water doordrenkt wordt). NOEC (No Observed Effect Concentration) : de testconcentratie die direct onder de LOEC ligt. Fenotype : de waarneembare kenmerken van een organisme die door de interactie van de genen met het milieu worden bepaald. Responsvariabelen : variabelen voor de geschatte toxiciteit die met uiteenlopende berekeningsmethoden wordt afgeleid uit gemeten variabelen die de biomassa beschrijven. Voor deze testmethode worden de responsvariabelen groeisnelheid en opbrengst afgeleid uit meetvariabelen zoals aantal schijfjes, schijfoppervlak, versgewicht of drooggewicht. Semi-statische test (met verversing) : een test waarbij de testoplossing op specifieke tijdstippen gedurende de test periodiek wordt ververst. Statische test : een testmethode waarbij de testoplossing gedurende de test niet wordt ververst. Teststof : alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels. Testeindpunt : de algemene factor die volgens het doel van de test door de teststof zal worden veranderd in vergelijking met de controle. Het eindpunt van deze testmethode is groeiremming, die kan worden uitgedrukt door verschillende responsvariabelen die op een of meer meetvariabelen gebaseerd zijn. Groeimedium : het volledige kunstmatige groeimedium waarin de testplanten gedurende de blootstelling aan de teststof groeien. De teststof wordt normaal gesproken in het medium opgelost. Opbrengst : de waarde van een meetvariabele om de biomassa uit te drukken aan het eind van de blootstellingstijd, verminderd met de waarde van de meetvariabele aan het begin van de blootstellingstijd. Aanhangsel 2 Beschrijving van Lemna spp. De meestal als „eendenkroos” aangeduide waterplant, Lemna spp. , behoort tot de familie Lemnaceae, die een aantal wereldwijd voorkomende soorten in vier geslachten omvat. Hun uiterlijk en taxonomie is uitgebreid beschreven (1) (2).  Lemna gibba en L. minor zijn soorten die representatief zijn voor gematigde zones en worden vaak voor toxiciteitstests gebruikt. Beide soorten hebben een drijvende of in het water ondergedompelde bladachtige stengel (schijfje) en uit het midden van de onderkant van elk schijfje steekt een heel dunne wortel. Lemna spp. heeft zelden bloemen en de voortplanting verloopt ongeslachtelijk door het maken van nieuwe schijfjes (3). De jongere planten zijn meestal bleker dan de oudere, hebben kortere wortels en bestaan uit twee of drie schijfjes die niet even groot zijn. Doordat Lemna klein is, een eenvoudige structuur heeft, zich ongeslachtelijk voortplant en een korte generatietijd heeft, zijn planten van dit geslacht heel geschikt voor laboratoriumproeven (4) (5). Omdat de gevoeligheid waarschijnlijk van soort tot soort verschilt, mag de gevoeligheid alleen binnen één soort worden vergeleken. Voorbeelden van Lemna-soorten die voor tests zijn gebruikt: soortenreferentie   Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University. Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem. , 29: 935-941. Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850. 4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp. , „Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp. 8pp. Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp. Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in het Zweeds). Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742. United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850. 4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp. , „Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp. 8pp. Lemna paucicostata : Nasu, Y. , Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol. , 10:1959-1969. Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf. , 5:87-96. Lemna trisulca : Huebert, D. B. , Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ.  Toxicol. and Chem. , 12:481- 483. Lemna valdiviana : Hutchinson, T. C. , Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh. -Int. Ver. Limnol. , 19:2102-2111. Bronnen van Lemna-soorten University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria Department of Botany, University of Toronto Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2 Tel:. +1-416-978-3641 Fax:+1-416-978-5878 e-mail: jacreman@botany. utoronto. ca North Carolina State University Forestry Dept Duckweed Culture Collection Campus Box 8002 Raleigh, NC 27695-8002 Verenigde Staten Telefoon 001 (919) 515-7572 astomp@unity. ncsu. edu Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University SE-106 91 STOCKHOLM ZWEDEN Tel:. +46 8 674 7240 Fax +46 8 674 7636 Federal Environmental Agency (UBA) FG III 3. 4 Schichauweg 58 12307 Berlijn Duitsland e-mail: lemna@uba. de LITERATUUR (1) Hillman, W. S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287. (2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Switzerland. (3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo. (4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14. (5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7-22. Aanhangsel 3 Bewaring van stamculturen Stamculturen kunnen bij lage temperatuur (4-10 °C) geruime tijd gebruiksklaar worden bewaard. Voor Lemna kan hetzelfde groeimedium worden gebruikt als voor de test, maar voor stamculturen kan een ander nutriëntrijk medium worden gebruikt. Periodiek wordt een aantal jonge, lichtgroene planten met een aseptische techniek overgezet naar nieuwe kweekvaten met vers medium. Onder de hier voorgestelde koele omstandigheden kan tot drie maanden worden gewacht voordat een nieuwe subcultuur wordt gemaakt. Er moeten chemisch zuivere (met zuur gewassen) en steriele glazen kweekvaten worden gebruikt en aseptische behandelingstechnieken worden toegepast. Bij verontreiniging van de stamcultuur, bv. met algen of schimmels, moeten maatregelen worden genomen om de verontreinigende organismen te verwijderen. Bij algen en de meeste andere verontreinigende organismen kan dit gebeuren door oppervlaktesterilisatie. Er wordt een monster van het verontreinigde plantenmateriaal genomen en de wortels worden afgeknipt. Het materiaal wordt krachtig geschud in schoon water en daarna gedurende 30 seconden tot 5 minuten ondergedompeld in 0,5 % (v/v) natriumhypochlorietoplossing.  Vervolgens wordt het plantenmateriaal afgespoeld met steriel water en in een aantal porties overgebracht in kweekvaten met vers groeimedium. Veel schijfjes zullen door deze behandeling afsterven, vooral als er een lange blootstellingstijd wordt gebruikt, maar meestal zullen sommige van de overlevende schijfjes vrij van verontreiniging zijn. Deze kunnen dan worden gebruikt om nieuwe culturen te beënten. Aanhangsel 4 Media Voor L. minor and L. gibba worden verschillende groeimedia aanbevolen. Voor L. minor wordt een gewijzigde versie van een medium van het SIS (Zweeds instituut voor normalisatie) aanbevolen, terwijl voor L. gibba het medium 20X-AAP wordt aanbevolen. Voor beide media is de samenstelling hieronder vermeld. Bij de bereiding van deze media moeten reagentia van p. a. -kwaliteit en gedeïoniseerd water worden gebruikt. Groeimedium voor Lemna van het SIS — De stamoplossingen I-V worden in de autoclaaf (15 minuten bij 120 °C) of door membraanfiltratie (poriediameter ongeveer 0,2 μm) gesteriliseerd. — Stamoplossing VI (en facultatief VII) worden alleen door membraanfiltratie gesteriliseerd; deze mogen niet in de autoclaaf worden behandeld. — De steriele stamoplossingen moeten koel en in het donker worden bewaard. De stamoplossingen I-V moeten binnen zes maanden worden gebruikt, terwijl stamoplossing VI (en facultatief VII) ten hoogste één maand kunnen worden bewaard. Stamoplossing nr. Stof Concentratie in stamoplossing (g/l) Concentratie in bereid medium (mg/·l) Bereid medium         Element Concentratie (mg/·l) I NaNO3 8,50 85 Na; N 32; 14 KH2PO4 1,34 13,4 K; P 6,0; 2,4 II MgSO4 · 7H2O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 III CaCl2 · 2H2O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 IV Na2CO3 4,0 20 C 2,3 V H3BO3 1,0 1,00 B 0,17 MnCl2 · 4H2O 0,20 0,20 Mn 0,056 Na2MoO4 · 2H2O 0,010 0,010 Mo 0,0040 ZnSO4 · 7H2O 0,050 0,050 Zn 0,011 CuSO4 · 5H2O 0,0050 0,0050 Cu 0,0013 Co(NO3)2 · 6H2O 0,010 0,010 Co 0,0020 VI FeCl3 · 6H2O 0,17 0,84 Fe 0,17 Na2-EDTA 2H2O 0,28 1,4 — — VII MOPS (buffer) 490 490 — — Voor de bereiding van één liter SIS-medium wordt aan 900 ml gedeïoniseerd water toegevoegd: — 10 ml stamoplossing I — 5 ml stamoplossing II — 5 ml stamoplossing III — 5 ml stamoplossing IV — 1 ml stamoplossing V — 5 ml stamoplossing VI — 1 ml stamoplossing VII (facultatief) Noot: Stamoplossing VII (MOPS-buffer) kan voor bepaalde teststoffen nodig zijn (zie punt 11).  De pH wordt met 0,1 M of 1 M HCl of NaOH op 6,5 ± 0,2 gebracht en het volume wordt met gedeïoniseerd water aangevuld tot 1 liter. Groeimedium 20X-AAP De stamoplossingen worden bereid in steriel gedestilleerd of gedeïoniseerd water. De steriele stamoplossingen moeten koel en in het donker worden bewaard. Onder deze omstandigheden kunnen de stamoplossingen ten minste 6-8 weken worden bewaard. Voor het medium 20X-AAP worden vijf nutriënt-stamoplossingen gemaakt (A1, A2, A3, B en C), waarbij p. a. reagentia worden gebruikt. Voor de bereiding van het groeimedium wordt 20 ml van elke nutriënt-stamoplossing toegevoegd aan ongeveer 850 ml gedeïoniseerd water. De pH wordt met 0,1 M of 1 M HCl of NaOH op 7,5 ± 0,1 gebracht en het volume wordt met gedeïoniseerd water aangevuld tot 1 liter. Vervolgens wordt het medium over een (ongeveer) 0,2 μm membraanfilter in een steriele fles gefiltreerd. Het groeimedium voor de test moet 1-2 dagen vóór gebruik worden bereid, zodat de pH kan stabiliseren. De pH van het groeimedium moet vóór gebruik worden gecontroleerd en indien nodig met 0,1 M of 1 M HCl of NaOH worden bijgesteld, zoals hierboven is beschreven. Stamoplossing nr. Stof Concentratie in stamoplossing (g/ · l) (7) Concentratie in bereid medium (mg/ · l) (7) Bereid medium         Element Concentratie (mg/ · l) (7) A1 NaNO3 26 510 Na;N 190;84 MgCl2 · 6H2O 12 240 Mg 58,08 CaCl2 · 2H2O 4,4 90 Ca 24,04 A2 MgSO4 · 7H2O 15 290 S 38,22 A3 K2HPO4 · 3H2 · O 1,4 30 K;P 9,4;3,7 B H3BO3 0,19 3,7 B 0,65 MnCl2 · 4H2O 0,42 8,3 Mn 2,3 FeCl3 · 6H2O 0,16 3,2 Fe 0,66 Na2EDTA · 2H2O 0,30 6,0 — — ZnCl2 3,3 mg/l 66 μg/l Zn 31 μg/l CoCl2 · 6H2O 1,4 mg/l 29 μg/l Co 7,1 μg/l Na2MoO4 · 2H2O 7,3 mg/l 145 μg/l Mo 58 μg/l CuCl2 · 2H2O 0,012 mg/l 0,24 μg/l Cu 0,080 μg/l C NaHCO3 15 300 Na;C 220; 43 STEINBERG-medium (volgens ISO 20079) Concentraties en stamoplossingen Het gewijzigde Steinberg-medium wordt in ISO 20079 alleen voor Lemna minor gebruikt (aangezien daar alleen Lemna minor wordt toegestaan), maar uit tests is gebleken dat ook met Lemna gibba goede resultaten te verkrijgen zijn. Bij de bereiding van het medium moeten chemische stoffen van reagens- of p. a. -kwaliteit en gedeïoniseerd water worden gebruikt.  Het nutriëntmedium wordt bereid uit stamoplossingen of het 10-voudig geconcentreerde medium, dat een maximale concentratie van het medium mogelijk maakt zonder dat er een neerslag ontstaat. Tabel 1 pH-gestabiliseerd STEINBERG-medium (gewijzigd volgens Altenburger) Component Voedingsmedium Macro-elementen mol. gewicht mg/l mmol/l KNO3 101,12 350,00 3,46 Ca(NO3)2 · 4H2O 236,15 295,00 1,25 KH2PO4 136,09 90,00 0,66 K2HPO4 174,18 12,60 0,072 MgSO4 · 7H2O 246,37 100,00 0,41 Micro-elementen mol. gewicht μg/l μmol/l H3BO3 61,83 120,00 1,94 ZnSO4 · 7H2O 287,43 180,00 0,63 Na2MoO4 · 2H2O 241,92 44,00 0,18 MnCl2 · 4H2O 197,84 180,00 0,91 FeCl3 · 6H2O 270,21 760,00 2,81 Dinatrium-EDTA, dihydraat 372,24 1 500,00 4,03 Tabel 2 Stamoplossingen (macro-elementen) 1. Macro-elementen (50-voudig geconcentreerd) g/l Stamoplossing 1: KNO3 17,50 KH2PO4 4,5 K2HPO4 0,63 Stamoplossing 2: MgSO4 · 7H2O 5,00 Stamoplossing 3: Ca(NO3)2 · 4H2O 14,75 Tabel 3 Stamoplossingen (micro-elementen) 2. Macro-elementen (1 000-voudig geconcentreerd) mg/l Stamoplossing 4: H3BO3 120,0 Stamoplossing 5: ZnSO4 · 7H2O 180,0 Stamoplossing 6: Na2MoO4 · 2H2O 44,0 Stamoplossing 7: MnCl2 · 4H2O 180,0 Stamoplossing 8: FeCl3 · 6H2O 760,00 Dinatrium-EDTA, dihydraat 1 500,00 — De stamoplossingen 2 en 3 en (apart) 4 tot en met 7 kunnen worden gecombineerd (rekening houdend met de vereiste concentraties). — Om de stamoplossingen langer te kunnen bewaren kunnen ze 20 minuten bij 121 °C in een autoclaaf worden behandeld of steriel worden gefiltreerd (0,2 μm). Voor stamoplossing 8 wordt steriele filtratie (0,2 μm) sterk aanbevolen. Bereiding van het (gewijzigde) STEINBERG-medium in de uiteindelijke concentratie — Voeg 20 ml van de stamoplossingen 1, 2 en 3 (zie tabel 2) toe aan ongeveer 900 ml gedeïoniseerd water om neerslaan te voorkomen. — Voeg 1,0 ml van de stamoplossingen 4, 5, 6, 7 en 8 toe (zie tabel 3). — De pH moet nu 5,5 ± 0,2 zijn (eventueel aanpassen met een minimaal volume verdund NaOH of HCl). — Vul met water aan tot 1 000 ml. — Als de stamoplossingen gesteriliseerd zijn en er geschikt water wordt gebruikt, is verdere sterilisatie niet nodig. Als de sterilisatie met het uiteindelijke medium wordt uitgevoerd, moet stamoplossing 8 na de behandeling in de autoclaaf (20 minuten bij 121 °C) worden toegevoegd. Bereiding van het 10-voudig geconcentreerde (gewijzigde) STEINBERG-medium om tijdelijk te bewaren — Voeg 20 ml van de stamoplossingen 1, 2 en 3 (zie tabel 2) toe aan ongeveer 30 ml gedeïoniseerd water om neerslaan te voorkomen.  — Voeg 1,0 ml van de stamoplossingen 4, 5, 6, 7 en 8 toe (zie tabel 3). Vul met water aan tot 100 ml. — Als de stamoplossingen gesteriliseerd zijn en er geschikt water wordt gebruikt, is verdere sterilisatie niet nodig. Als de sterilisatie met het uiteindelijke medium wordt uitgevoerd, moet stamoplossing 8 na de behandeling in de autoclaaf (20 minuten bij 121 °C) worden toegevoegd. — De pH van het medium (uiteindelijke concentratie) moet 5,5 ± 0,2 zijn. ” (6) de volgende hoofdstukken C. 31 tot C. 46 worden toegevoegd:„C. 31. TEST MET TERRESTRISCHE PLANTEN: OPKOMST EN GROEI VAN ZAAILINGEN INLEIDING 1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 208 (2006) van de OESO. Testmethoden worden periodiek herzien in het licht van de wetenschappelijke vooruitgang en om aan de regelgeving te kunnen blijven voldoen. Deze bijgewerkte testmethode is bedoeld om de potentiële effecten van chemische stoffen op de opkomst en groei van zaailingen te bepalen. De methode als zodanig heeft geen betrekking op chronische effecten en effecten op de voortplanting (d. w. z. zaadzetting, bloemvorming, vruchtrijping). De blootstellingsomstandigheden en de eigenschappen van de chemische stof zijn bepalende factoren bij het kiezen van de juiste testmethoden (bij het testen van metalen/metaalverbindingen moet bijvoorbeeld rekening worden gehouden met effecten van de pH en de desbetreffende tegenionen (1). Deze testmethode heeft geen betrekking op planten die aan dampen van chemische stoffen worden blootgesteld. De testmethode is geschikt voor het testen van algemene chemische stoffen, biociden en gewasbeschermingsmiddelen (ook bekend als plantenbeschermingsmiddelen of pesticiden). De methode is ontwikkeld op basis van bestaande methoden (2) (3) (4) (5) (6) (7). Ook andere literatuur over plantentests is in aanmerking genomen (8) (9) (10). De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1. PRINCIPE VAN DE TEST 2. Met de test worden de effecten op de opkomst van zaailingen en de vroege groei van hogere planten bepaald na blootstelling aan de teststof in de grond (of een geschikte grondmatrix). Zaden worden in contact gebracht met grond die is behandeld met de teststof, en worden 14 tot 21 dagen na opkomst van 50 % van de zaailingen in de controlegroep op effecten onderzocht. De gemeten eindpunten zijn visuele vaststelling van de zaailingenopkomst, het drooggewicht van de scheuten (of versgewicht van de scheuten) en in bepaalde gevallen de hoogte van de scheuten, alsook een beoordeling van zichtbare schadelijke effecten op verschillende delen van de plant.  Deze metingen en observaties worden vergeleken met die gedaan aan onbehandelde controleplanten. 3. Afhankelijk van de verwachte blootstellingsroute wordt de teststof hetzij opgenomen in de grond (of eventueel een kunstmatige grondmatrix) of aangebracht op het oppervlak van de grond. Voor opname in de grond wordt een grote hoeveelheid grond behandeld. Deze wordt vervolgens in potten gedaan, waarna zaden van de betreffende plant in de grond worden geplant. Aanbrenging op het oppervlak gebeurt op grond in potten waarin de zaden al zijn geplant. De testeenheden (controlepotten en potten met behandelde grond, plus zaden) worden vervolgens onder omstandigheden geplaatst die bevorderlijk zijn voor de kieming/groei van de planten. 4. De test kan worden opgezet met het doel de dosis-responscurve te bepalen of kan in één concentratie/dosering worden uitgevoerd als een limiettest, naargelang van het doel van het onderzoek. Als de resultaten van de test met één concentratie/dosering een bepaald toxiciteitsniveau overschrijden (bv. wanneer er effecten groter dan x % worden waargenomen), kan een bereikbepalingstest worden uitgevoerd om de boven- en ondergrens voor de toxiciteit te bepalen, gevolgd door een test met meerdere concentraties/doseringen om een dosis-responscurve te verkrijgen. Er wordt een passende statistische analyse uitgevoerd om de effectieve concentratie ECx of de effectieve toepassingsdosering ERx (bv. EC25, ER25, EC50, ER50) voor de meest gevoelige gemeten parameter(s) te verkrijgen. Bij deze test kunnen ook de concentratie zonder waargenomen effect (NOEC) en de laagste concentratie met waargenomen effect (LOEC) worden berekend. INFORMATIE OVER DE TESTSTOF 5. De volgende informatie is nuttig voor het vaststellen van de verwachte route van blootstelling aan de chemische stof en het ontwerpen van de test: structuurformule, zuiverheid, wateroplosbaarheid, oplosbaarheid in organische oplosmiddelen, 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt, sorptiegedrag van de grond, dampspanning, chemische stabiliteit in water en licht, en biologische afbreekbaarheid. GELDIGHEID VAN DE TEST 6. Voor een geldige test moet in de controles aan de volgende prestatiecriteria worden voldaan: — ten minste 70 % van de zaailingen moet opkomen; — de zaailingen mogen geen zichtbare tekenen van fytotoxische effecten vertonen (bv. chlorose, necrose, verwelking, blad- en stengelmisvormingen) en de planten mogen alleen de variatie in groei en uiterlijk vertonen die voor die specifieke soort normaal is; — de gemiddelde overleving van opgekomen controlezaailingen aan het eind van de onderzoeksperiode moet minstens 90 % zijn; — de omgevingsomstandigheden voor alle planten van een bepaalde soort moeten identiek zijn en de groeimedia moeten dezelfde hoeveelheid grondmatrix, hulpmedium of substraat bevatten uit dezelfde bron.  REFERENTIESTOF 7. Met regelmatige tussenpozen kan een referentiestof worden getest om te verifiëren dat de prestaties van de test, de respons van de betreffende testplanten en de testomstandigheden niet beduidend zijn veranderd in de loop van de tijd. De prestaties van het testsysteem in een bepaald laboratorium kunnen ook worden beoordeeld aan de hand van historische metingen van de biomassa of groei van controleplanten, en op deze manier kan de kwaliteit binnen een laboratorium worden bewaakt. BESCHRIJVING VAN DE METHODE Natuurlijke grond — kunstmatig substraat 8. Planten kunnen in potten worden gekweekt in zanderige leemgrond, lemige zandgrond of zanderige kleileemgrond die ten hoogste 1,5 % organische koolstof bevat (circa 3 % organisch materiaal). In de handel verkrijgbare potgrond of een kunstmatig grondmengsel met ten hoogste 1,5 % organische koolstof kan eveneens worden gebruikt. Kleigrond is niet geschikt indien van de teststof bekend is dat deze een hoge affiniteit voor klei heeft. Bodemgrond moet gezeefd worden over een zeef met mazen van 2 mm om de grond te homogeniseren en grove korrels te verwijderen. Van de uiteindelijk bereide grond moeten de soort, de textuur, het percentage organische koolstof, de pH, het zoutgehalte en de elektrische geleidbaarheid worden gerapporteerd. De grond moet worden ingedeeld volgens een standaardclassificatiediagram (11). Om het effect van bodempathogenen te beperken kan de grond gepasteuriseerd worden of met hitte worden behandeld. 9. Het gebruik van natuurlijke grond kan de interpretatie van de resultaten bemoeilijken en de variabiliteit ervan vergroten door variërende fysisch-chemische eigenschappen en microbiële populaties. Deze variabelen zijn van invloed op het vochtvasthoudend vermogen, het vermogen om chemische stoffen te binden, de luchtdoorlatendheid en het gehalte aan nutriënten en spoorelementen. Naast de variaties in fysische factoren zullen er ook variaties in chemische eigenschappen zijn, zoals de pH en redoxpotentiaal, die invloed kunnen hebben op de biologische beschikbaarheid van de teststof (12) (13) (14). 10. Kunstmatige substraten worden doorgaans niet voor het testen van gewasbeschermingsmiddelen gebruikt; ze kunnen wel van nut zijn voor het testen van algemene chemische stoffen of wanneer het wenselijk is de variabiliteit die kenmerkend is voor natuurlijke grond te minimaliseren en de vergelijkbaarheid van de testresultaten te vergroten. Substraten dienen uit inerte materialen te bestaan die minimale interactie met de teststof, het als drager fungerende oplosmiddel, of beide, vertonen. Zuurgewassen kwartszand, minerale wol en glaskorrels (bv.  0,35 tot 0,85 mm in diameter) zijn geschikte inerte materialen die de teststof (15) nauwelijks absorberen, zodat de stof maximaal beschikbaar is voor opname door de zaailing via de wortel. Ongeschikte substraten zijn onder meer vermiculiet, perliet en andere sterk absorberende materialen. Er moeten nutriënten voor de groei van de plant worden toegevoegd om stress door nutriëntentekorten te voorkomen, en waar mogelijk moet dit worden beoordeeld door middel van biochemische analyses of visuele beoordeling van controleplanten. Criteria voor het selecteren van soorten voor de test 11. De selectie van soorten moet redelijk breed zijn, bv. wat betreft taxonomische diversiteit in het plantenrijk, verspreiding, abundantie, soortspecifieke levenscycluskenmerken en habitat, zodat uiteenlopende responsen worden verkregen (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Bij de selectie moeten de volgende kenmerken in aanmerking worden genomen: — de soort heeft uniforme zaden die gemakkelijk verkrijgbaar zijn bij een of meer betrouwbare standaard zaadbronnen en vertoont consistente, betrouwbare en gelijkmatige kieming en een gelijkvormige groei van de zaailingen. — de plant leent zich voor laboratoriumtests en kan betrouwbare resultaten opleveren die reproduceerbaar zijn binnen één testfaciliteit en tussen verschillende testfaciliteiten; — de gevoeligheid van de geteste soort is in overeenstemming met de respons van planten die worden aangetroffen in de omgeving die blootstaat aan de chemische stof; — ze zijn in enige mate gebruikt in eerdere toxiciteitstests, en uit hun gebruik in bijvoorbeeld herbicide-bioassays, screening op zware metalen, tests op zout- of mineralenstress of allelopathiestudies is gebleken dat ze gevoelig zijn voor een grote verscheidenheid van stressoren; — ze kunnen groeien onder de groeiomstandigheden van de testmethode; — ze voldoen aan de geldigheidscriteria van de test. Aanhangsel 2 bevat een beperkte lijst van soorten die van oudsher het meest worden gebruikt, en aanhangsel 3 een lijst van mogelijke niet-gewassoorten. 12. Hoeveel soorten er getest moeten worden hangt af van de toepasselijke wettelijke voorschriften, en daarom wordt dit niet gespecificeerd in deze testmethode. Aanbrenging van de teststof 13. De chemische stof moet in een geschikte drager (bv. water, aceton, ethanol, polyethyleenglycol, Arabische gom, zand) worden aangebracht. Ook mengsels (geformuleerde producten of formuleringen) met werkzame en diverse toevoegingsstoffen kunnen getest worden. Verwerking in grond/kunstmatig substraat 14. Chemische stoffen die in water oplosbaar of suspendeerbaar zijn, worden aan water toegevoegd waarna de oplossing met een geschikt mengapparaat wordt vermengd met grond.  Dit type test kan geschikt zijn als de blootstelling via grond of poriënwater plaatsvindt en er bezorgdheid is over opname via de wortels. Het watervasthoudend vermogen van de grond mag niet worden overschreden door de toevoeging van de teststof. Voor elke testconcentratie moet hetzelfde volume water worden toegevoegd, maar om klontering van de grond tot agglomeraten te voorkomen mag dit volume niet te groot zijn. 15. Slecht in water oplosbare stoffen water moeten in een geschikt vluchtig oplosmiddel (bv. aceton, ethanol) worden opgelost en met zand worden vermengd. Het oplosmiddel kan dan met een luchtstroom onder voortdurend mengen uit het zand worden verwijderd. Het behandelde zand wordt vermengd met de experimentele grond. Aan een tweede controle worden alleen zand en oplosmiddel toegevoegd. Er worden gelijke hoeveelheden zand, behandeld met oplosmiddel dat weer verwijderd is, aan alle dosisniveaus en de tweede controle toegevoegd. Voor vaste, onoplosbare teststoffen worden droge grond en de chemische stof in een geschikt mengapparaat vermengd. Hierna wordt de grond in potten gedaan en worden de zaden direct gezaaid. 16. Wanneer in plaats van grond een kunstmatig substraat wordt gebruikt, kunnen wateroplosbare stoffen vlak voor de test in de nutriëntenoplossing worden opgelost. Stoffen die onoplosbaar zijn in water, maar die in water kunnen worden gesuspendeerd door een oplosmiddel als drager te gebruiken, moeten met de drager aan de nutriëntenoplossing worden toegevoegd. Niet in water oplosbare chemische stoffen waarvoor geen niet-toxische wateroplosbare drager beschikbaar is, moeten in een geschikt vluchtig oplosmiddel worden opgelost. De oplossing wordt vermengd met zand of glaskorrels en vervolgens in een rotatieverdamper verdampt, waardoor een gelijkmatige laag van de stof achterblijft op het zand of de korrels. Voordat de potten worden gevuld moet een gewogen deel van de korrels met hetzelfde organische oplosmiddel worden geëxtraheerd en het gehalte aan chemische stof worden bepaald. Aanbrenging op het oppervlak 17. Voor gewasbeschermingsmiddelen wordt de teststof vaak aangebracht door het grondoppervlak te bespuiten met de testoplossing. Alle apparatuur die bij het uitvoeren van de tests wordt gebruikt, met inbegrip van apparatuur voor de bereiding en toediening van de chemische stof, moet een zodanige kwaliteit en capaciteit hebben dat de tests op een nauwkeurige wijze kunnen worden uitgevoerd en een reproduceerbare bedekking wordt verkregen. De bedekking moet voor alle grondoppervlakken hetzelfde zijn. Omstandigheden waarbij stoffen aan apparatuur kunnen adsorberen of ermee kunnen reageren moeten worden vermeden (bv.  het gebruik van plastic slangen bij lipofiele chemische stoffen of stalen onderdelen en elementen). De manier waarop de teststof op het grondoppervlak wordt gespoten is een nabootsing van typische spuittanktoepassingen. De spuitvolumes moeten in het algemeen overeenkomen met die in de normale landbouwpraktijk en dienen gerapporteerd te worden (hoeveelheid water enz. ). Er moet een type straalpijp worden gekozen dat een gelijkmatige bedekking van het grondoppervlak geeft. Wanneer oplosmiddelen en dragers worden gebruikt, moet een tweede groep van controleplanten worden opgezet die alleen oplosmiddel/drager krijgen. Dit is niet nodig voor gewasbeschermingsmiddelen die als formuleringen worden getest. Verificatie van de concentratie/dosering van de teststof 18. De toegepaste concentraties/doseringen moeten op passende wijze geverifieerd worden. Voor oplosbare chemische stoffen kan verificatie van alle testconcentraties/-doseringen plaatsvinden door de hoogste in de test gebruikte concentratie testoplossing te analyseren waarbij de verdere verdunning wordt gedocumenteeerd en er gekalibreerde toepassingsapparatuur wordt gebruikt (bv. gekalibreerd analytisch glaswerk, kalibratie van spuitapparatuur). Voor onoplosbare chemische stoffen moet bij de verificatie het gewicht van de aan de grond toegevoegde teststof worden vermeld. Een analyse van de grond kan nodig zijn indien de homogeniteit moet worden aangetoond. PROCEDURE Testopzet 19. Zaden van dezelfde soort worden in potten geplant. Hoeveel zaden er per pot worden geplant is afhankelijk van de soort, grootte van de potten en duur van de test. Het aantal planten per pot moet zodanig zijn dat de groeiomstandigheden adequaat zijn en de potten in de loop van de test niet overvol raken. De maximale plantdichtheid is ongeveer 3-10 zaden per 100 cm2, afhankelijk van de grootte van de zaden. Voorbeelden van aanbevolen aantallen zijn: voor maïs, soja, tomaat, komkommer en suikerbiet 1 à 2 planten per pot van 15 cm, voor koolzaad en erwt 3 planten per pot van 15 cm, en voor ui, tarwe en andere soorten met kleine zaden 5 à 10 planten per pot van 15 cm. Het aantal zaden en replicaatpotten (een replicaat is gedefinieerd als een pot; planten in dezelfde pot zijn dus geen replicaten) moet optimale statistische analyse mogelijk maken (21). Er moet worden opgemerkt dat de variabiliteit groter zal zijn voor soorten waarbij een kleiner aantal grote zaden per pot (replicaat) wordt gebruikt dan voor soorten waarbij per pot een groter aantal kleine zaden kan worden gebruikt. Deze variabiliteit kan worden beperkt door in elke pot evenveel zaden te planten. 20.  Het gebruik van controlegroepen moet waarborgen dat de waargenomen effecten samenhangen met of zijn toe te schrijven aan blootstelling aan de teststof. De controlegroep dient in elk opzicht identiek te zijn aan de testgroep, behalve wat betreft blootstelling aan de teststof. Binnen een test moeten alle planten, ook de controles, afkomstig zijn uit dezelfde bron. Voor vertekening te voorkomen moeten de test- en controlepotten willekeurig worden ingedeeld. 21. Zaden omhuld met een dunne laag insecticide of fungicide (d. w. z. gecoate zaden) moeten worden vermeden. Het gebruik van bepaalde niet-systemische contactfungiciden (bv. captan, thiram) wordt door sommige regelgevende instanties echter wel toegestaan (22). Bij bezorgdheid over zaadoverdraagbare pathogenen kunnen de zaden kort in een oplossing met een lage concentratie (5 %) natriumhypochloriet worden geweekt, gevolgd door grondig spoelen onder stromend water en drogen. Herstelbehandeling met een ander gewasbeschermingsmiddel is niet toegestaan. Testomstandigheden 22. De testomstandigheden moeten de omstandigheden die vereist zijn voor normale groei van de geteste soorten en variëteiten benaderen (aanhangsel 4 bevat voorbeelden van testomstandigheden). De opkomende planten moeten volgens goede tuinbouwpraktijken in klimaatkamers, fytotrons of kassen worden gekweekt. Bij het gebruik van kweekfaciliteiten omvatten deze praktijken meestal het reguleren en voldoende frequent (bv. dagelijks) registreren van de temperatuur, vochtigheid, koolstofdioxideconcentratie, licht (intensiteit, golflengte, fotosynthetisch actieve straling) en lichtperiode, manier van bewatering enz. om een goede groei te waarborgen, die wordt afgelezen aan de controleplanten van die specifieke soort. De kastemperatuur moet gereguleerd worden met ventilatie-, verwarmings- en/of koelingssystemen. Voor in kassen uitgevoerde tests worden in het algemeen de volgende omstandigheden aanbevolen: — temperatuur: 22 °C ± 10 °C; — vochtigheid: 70 % ± 25 %; — fotoperiode: minimaal 16 uur licht — lichtintensiteit: 350 ± 50 μE/m2/s. Extra verlichting kan nodig zijn als de intensiteit lager wordt dan 200 μE/m2/s, in het golflengtebereik 400-700 nm, behalve voor bepaalde soorten die minder licht nodig hebben. Tijdens het onderzoek moeten de omgevingsomstandigheden worden gemonitord en gerapporteerd. De planten worden in niet-poreuze plastic of glazen potten gekweekt, met onder de pot een bak of schotel. De potten kunnen periodiek worden verplaatst om de variabiliteit in de groei van de planten (door verschillen in testomstandigheden binnen de kweekfaciliteit) te minimaliseren. De potten moeten groot genoeg zijn om normale groei mogelijk te maken. 23. Er kunnen extra nutriënten aan de grond worden toegevoegd voor zover dat nodig is om een goede groeikracht te behouden.  Of en op welk moment dit moet gebeuren kan worden beoordeeld door observatie van de controleplanten. Het wordt aanbevolen de planten van onderaf te bewateren (bv. gebruikmakend van pitten van glasvezels). In eerste instantie mag wel van bovenaf worden bewaterd om de zaadkieming te stimuleren en om op het oppervlak aangebrachte teststof sneller in de grond te laten dringen. 24. De specifieke kweekomstandigheden dienen te worden afgestemd op de geteste soort en de onderzochte teststof. Controle- en behandelde planten moeten onder dezelfde omgevingsomstandigheden worden gehouden, waarbij wel passende maatregelen moeten worden genomen om (bv. bij een vluchtige teststof) kruisblootstelling tussen verschillende behandelingen en van controles aan de teststof te voorkomen. Tests met één concentratie/dosering 25. Om te bepalen welke concentratie/dosering van de chemische stof geschikt is voor het uitvoeren van een test met één concentratie of dosering (challenge test/limiettest), moet rekening worden gehouden met een aantal factoren. Voor algemene chemische stoffen zijn onder meer de fysisch-chemische eigenschappen van belang. Voor gewasbeschermingsmiddelen moet gekeken worden naar de fysisch-chemische eigenschappen en het gebruikspatroon van de chemische stof, de maximale concentratie of toepassingsdosering, het aantal toepassingen per seizoen en/of de persistentie van de teststof. Om vast te stellen of een algemene chemische stof fytotoxische eigenschappen heeft, kan het zinvol zijn om bij de maximale concentratie van 1 000 mg/kg droge grond te testen. Bereikbepalingstest 26. Indien nodig kan een bereikbepalingstest worden uitgevoerd om een indicatie te krijgen van de concentraties/doseringen die in het definitieve dosis-responsonderzoek moeten worden getest. De testconcentraties/-doseringen voor een bereikbepalingstest moeten ruim uit elkaar liggen (bv. 0,1, 1,0, 10, 100 en 1 000 mg/kg droge grond). Voor gewasbeschermingsmiddelen kunnen de concentraties/doseringen gebaseerd worden op de aanbevolen of maximale concentratie of toepassingsdosering, bv. 1/100, 1/10, 1/1 van de aanbevolen/maximale concentratie of toepassingsdosering. Tests met meerdere concentraties/doseringen 27. Een test met meerdere concentraties/doseringen wordt uitgevoerd om een dosis-responsrelatie vast te stellen en een ECx of ERx-waarde te bepalen voor opkomst, biomassa en/of zichtbare effecten, in vergelijking met niet-blootgestelde controles, zoals vereist door regelgevende instanties. 28. Het aantal en de onderlinge afstand van de concentraties of doseringen moeten zodanig zijn dat een betrouwbare dosis-responsrelatie en regressievergelijking worden verkregen en de ECx. of ERx. kan worden geschat. De gekozen concentraties/doseringen moeten de te bepalen ECx of ERxwaarden omvatten. Als bijvoorbeeld een EC50-waarde moet worden bepaald, is het wenselijk de test uit te voeren met doseringen die 20 tot 80 % effect veroorzaken.  Om dit te bereiken worden bij voorkeur ten minste vijf testconcentraties/-doseringen gebruikt in een meetkundige reeks met een reden van ten hoogste 3, plus een onbehandelde controle. Voor elke dosisgroep en de controlegroep moet het aantal replicaten ten minste vier zijn en het totale aantal zaden ten minste 20. Bij bepaalde planten met een laag kiemingspercentage of een variabel groeigedrag zijn wellicht meer replicaten nodig om de statistische power te vergroten. Als een groter aantal testconcentraties/-doseringen wordt gebruikt, kan met minder replicaten worden volstaan. Als schatting van de NOEC nodig is, zijn mogelijk meer replicaten nodig om de gewenste statistische power te verkrijgen (23). Observaties 29. Gedurende de observatieperiode, d. w. z. 14 tot 21 dagen na opkomst van 50 % van de controleplanten (dit kunnen ook oplosmiddelcontroles zijn), worden de planten regelmatig geobserveerd (ten minste wekelijks en zo mogelijk dagelijks) op opkomst, zichtbare tekenen van fytotoxiciteit en sterfte. Aan het eind van de test moeten het opkomstpercentage en de biomassa van overlevende planten worden geregistreerd, alsook zichtbare schadelijke effecten op verschillende delen van de plant. Het kan hierbij gaan om een afwijkend uiterlijk van de opgekomen zaailingen, dwerggroei, chlorose, verkleuring, sterfte en effecten op de ontwikkeling van de plant. De biomassa aan het eind kan gemeten worden als het uiteindelijke gemiddelde drooggewicht van de scheuten, door de scheuten vanaf het grondoppervlak te oogsten en tot een constant gewicht te drogen bij 60 °C. De biomassa aan het eind kan ook gemeten worden als het versgewicht van de scheuten. De hoogte van de scheuten kan een ander eindpunt zijn als de regelgeving dat vereist. Er moet een uniform scoringssysteem voor zichtbare schade worden gebruikt om de waarneembare toxische reponsen te evalueren. Voorbeelden van kwalitatieve en kwantitatieve visuele beoordelingen zijn te vinden in literatuur (23) (24). GEGEVENS EN RAPPORTAGE Statistische analyse Test met één concentratie/dosering 30. De gegevens voor elke plantensoort moeten met behulp van een passende statistische methode worden geanalyseerd (21). Het niveau van het effect bij de testconcentratie/dosering, of de waarneming dat een bepaald effect niet wordt bereikt bij de testconcentratie/dosering, moet gerapporteerd worden (bv. < x% effect waargenomen bij y concentratie of dosering). Test met meerdere concentraties/doseringen 31. Er wordt een dosis-responsrelatie vastgesteld in de vorm van een regressievergelijking. Er kunnen verschillende modellen worden gebruikt. Voor het schatten van ECx of ERx (bv.  EC25, ER25, EC50, ER50) en de bijbehorende betrouwbaarheidsgrenzen voor de opkomst van zaailingen als een binaire respons kunnen de logit-, probit-, Weibull-, Spearman-Karber-, getrimde Spearman-Karber-methode enz. geschikt zijn. Voor de groei van de zaailingen (gewicht en hoogte) als continue eindpunten kunnen de ECx of ERx en de bijbehorende betrouwbaarheidsgrenzen worden geschat door middel van geschikte regressieanalyse (bv. niet-lineaire regressieanalyse volgens Bruce-Versteeg (25)). Waar mogelijk moet de R2 0,7 of hoger zijn voor de meest gevoelige soort en moeten de gebruikte testconcentraties/-doseringen het gebied tussen 20 % tot 80 % effect omvatten. Als de NOEC moet worden geschat, worden bij voorkeur krachtige statistische tests toegepast die gekozen worden op basis van gegevensverdeling (21) (26). Testverslag 32. Het testverslag moet de onderzoeksresultaten bevatten, alsook een gedetailleerde beschrijving van de testomstandigheden, een diepgaande bespreking van de resultaten, analyse van de meetgegevens en de uit de analyse getrokken conclusies. Een overzichtstabel en een samenvatting van de resultaten zijn eveneens vereist. In het testverslag moet informatie worden opgenomen:   Teststof: — chemische idententificatiegegevens, relevante eigenschappen van de geteste chemische stof (bv. log Pow, oplosbaarheid in water, dampspanning en informatie over het lot en het gedrag in het milieu, indien beschikbaar); — details over de bereiding van de testoplossing en verificatie van testconcentraties zoals beschreven in punt 18. Geteste soort: — gegevens over het testorganisme: soort/variëteit, plantenfamilies, wetenschappelijke en gewone naam, bron en geschiedenis van het zaad, zo gedetailleerd mogelijk (d. w. z. naam van de leverancier, kiemingspercentage, grootte van de zaden klasse, partij- of lotnummer, jaar of groeiseizoen waarin het zaad werd geoogst, datum van beoordeling van kieming), levensvatbaarheid, enz. ; — aantal geteste mono- en dicotyle soorten; — motivering van de keuze van de soort; — beschrijving van de bewaring, behandeling en instandhouding van het zaad. Testomstandigheden: — testfaciliteit (bv. klimaatkast, fytotron en kas); — beschrijving van het testsysteem (bv. afmetingen en materiaal van de potten en hoeveelheden grond); — kenmerken van de grond (textuur of soort grond: korrelgrootteverdeling en indeling, fysische en chemische eigenschappen met inbegrip van % organisch materiaal, % organische koolstof en pH); — bereiding van grond/substraat (bv. grond, kunstmatige grond, zand e. a. ) voorafgaand aan test; — beschrijving van het voedingsmedium, indien gebruikt; — aanbrenging van de teststof: beschrijving van de aanbrengingsmethode, beschrijving van apparatuur, blootstellingsdoseringen en -volumes met inbegrip van chemische verificatie, beschrijving van de kalibratiemethode en beschrijving van omgevingsomstandigheden tijdens de aanbrenging; — groeiomstandigheden: lichtintensiteit (bv.  fotosynthetisch actieve straling (PAR)), fotoperiode, max/min temperaturen, bewateringsschema en — methode, — aantal zaden per pot, aantal planten per dosis, aantal replicaten (potten) per blootstellingsdosering; — soort en aantal controles (negatieve en/of positieve controles, oplosmiddelcontrole indien gebruikt); — duur van de test. Resultaten: — tabel met alle eindpunten voor elk replicaat, testconcentratie/dosering en soort; — aantal en percentage opgekomen planten in vergelijking met controles; — gemeten biomassa (drooggewicht of versgewicht van scheuten) van de planten uitgedrukt als percentage van de controles; — scheuthoogte van de planten als percentage van de controles, indien gemeten; — percentage zichtbare schade en een kwalitatieve en kwantitatieve beschrijving van zichtbare schade (chlorose necrose, verweking, blad- en stengelmisvorming, alsook eventuele afwezigheid van effecten) door de teststof in vergelijking met controleplanten; — beschrijving van de waarderingsschaal gebruikt voor het beoordelen van zichtbare schade, indien visuele waarderingen worden opgegeven; — voor onderzoeken met één dosering moet het percentage schade worden vermeld; — ECx of ERx (bv. EC50, ER50, EC25, ER25)-waarden en bijbehorende betrouwbaarheidsgrenzen. Als regressieanalyse is uitgevoerd moeten de standaardfout voor de regressievergelijking en de standaardfout voor individuele parameterschattingen (helling, snijpunt met de y-as) worden opgegeven; — NOEC (en LOEC) indien berekend; — beschrijving van de gebruikte statistische procedures en aannames; — grafische weergave van deze gegevens en de dosis-responsrelatie voor de geteste soort. Afwijkingen van de in deze testmethode beschreven procedures en eventuele ongebruikelijke gebeurtenissen tijdens de test. LITERATUUR (1) Schrader G. , Metge K. , and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193. (2) International Organisation of Standards. (1993). ISO 11269-1 Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora — Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. (3) International Organisation of Standards. (1995). ISO 11269-2 Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora — Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants. (4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) U. S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158. 540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. (6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850. 4000: Background — Non-target Plant Testing; — 850. 4025: Target Area Phytotoxicity; — 850. 4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.  4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850. 4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850. 4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) Boutin, C. , Freemark, K. E. and Keddy, C. J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No. 145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada. (9) Forster, R. , Heimbach, U. , Kula, C. , and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms — A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48. (10) Hale, B. , Hall, J. C. , Solomon, K. , and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada. (11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). (12) Audus, L. J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L. J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, pp. 163-206. (13) Beall, M. L. , Jr. and Nash, R. G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575. (14) Beetsman, G. D. , Kenney, D. R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250. (15) U. S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4. 07, Seedling Growth, 14 pp. , FDA, Washington, DC. (16) McKelvey, R. A. , Wright, J. P. , Honegger, J. L. and Warren, L. W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174 (17) Boutin, C. ; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Comité risicobeoordeling Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369. (18) Boutin, C. , and Rogers, C. A. (2000).  Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides — An analysis with two databases. Ecotoxicology vol. 9(4):255-271. (19) Boutin, C. and Harper, J. L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271. (20) Boutin, C. , Lee, H. -B. , Peart, T. E. , Batchelor, S. P. and Maguire, R. J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541. (21) OECD (2006). Draft Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. (22) Hatzios, K. K. and Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63. (23) Hamill, P. B. , Marriage, P. B. and G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389. (24) Frans, R. E. and Talbert, R. E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed. ) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23. (25) Bruce, R. D. and Versteeg, D. J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485-1492. (26) Hoofdstuk C. 33 van deze bijlage: Voortplantingstest met regenwormen (Eisenia fetida/Eisenia andrei). Aanhangsel 1 Definities Werkzaam bestanddeel (of werkzame stof) : een materiaal bedoeld om een specifiek biologisch effect teweeg te brengen (bv. ter bestrijding van insecten, plantenziekten of onkruid in het behandelde gebied), ook bekend als werkzaam bestanddeel van de technisch zuivere stof). Chemische stof : een stof of een mengsel. Gewasbeschermingsmiddelen of pesticiden : materialen met een specifieke biologische activiteit die doelbewust worden gebruikt om gewassen te beschermen tegen plagen (bv. schimmelziekten, insecten en concurrerende planten). ECx — concentratie voor x % effect, of ERx — dosering voor x % effect : de concentratie of dosering die in vergelijking met de controle een ongewenste verandering in het eindpunt van de test veroorzaakt van x % (25 % of 50 % afname van de opkomst van zaailingen, het scheutgewicht of het uiteindelijke aantal aanwezige planten, of toename van zichtbare schade correspondeert bijvoorbeeld respectievelijk met een EC25/ER25 of EC50/ER50).  Opkomst : het boven de grond verschijnen van het coleoptiel of de zaadlob. Formulering : het in de handel verkrijgbare geformuleerde product dat de werkzame stof ( werkzame bestanddeel) bevat; ook bekend als „eindpreparaat” (8) of „voor het typische eindgebruik bestemde product”. LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) : de laagste concentratie teststof waarbij effect werd waargenomen. In deze test heeft de concentratie die overeenkomt met de LOEC een statistisch significant effect (p < 0,05) binnen een bepaalde blootstellingsperiode, in vergelijking met de controle, en is deze concentratie hoger dan de NOEC-waarde. Niet-doelwitplanten : die planten die zich buiten het gebied van de doelplanten bevinden. Voor gewasbeschermingsmiddelen zijn dit meestal planten buiten het behandelingsgebied. NOEC (No Observed Effect Concentration) : de hoogste concentratie teststof waarbij geen effect werd waargenomen. In deze test heeft de concentratie die overeenkomt met de NOEC geen statistisch significant effect (p < 0,05) binnen een bepaalde blootstellingsperiode in vergelijking met de controle. Fytoxicity : schadelijke afwijkingen (vastgesteld door metingen en visuele beoordeling) van het normale beeld van opkomst en groei van planten als reactie op een bepaalde chemische stof. Replicaat : de experimentele eenheid die representatief is voor een controlegroep en/of dosisgroep. In deze onderzoeken wordt de pot gedefinieerd als replicaat. Visuele beoordeling : waardering van zichtbare schade op basis van waarnemingen van de plantstand, groeikracht, misvormingen, chlorose, necrose en het algehele uiterlijk in vergelijking met een controle. Teststof : alle volgens deze testmethode geteste stoffen of mengsels. Aanhangsel 2 Lijst van soorten die van oudsher bij plantentests worden gebruikt Familie Soort Gewone namen DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Wortel Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus Zonnebloem Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa sla Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Witte mosterd Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis Paksoi Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Koolzaad Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Kool Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Meiraap/stoppelknol Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Tuinkerszaad Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Radijs Chenopodiaceae Beta vulgaris Suikerbieten Cucurbitaceae Cucumis sativus Komkommer Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G.  soja) Soja Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Mungbonen Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Stamboon, prinsessenboon, tuinboon Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Erwt Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum Fenegriek Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Rolklaver Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Rode klaver Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Wikken Linaceae Linum usitatissimum Vlas Polygonaceae Fagopyrum esculentum Boekweit Solanaceae Solanum lycopersicon Tomaat MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Uien Poaceae (Gramineae) Avena sativa Haver Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Gerst Poaceae (Gramineae) Lolium perenne Perennial ryegrass Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Rijst Poaceae (Gramineae) Secale cereale Rogge Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Graansorgho, kafferkoren Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Tarwe Poaceae (Gramineae) Zea mays Maïs Aanhangsel 3 Lijst van mogelijke niet-gewassoorten Mogelijke soorten voor toxiciteitstests met planten volgens de OESO Opmerking: De volgende tabel bevat informatie over 52 niet-gewassoorten (literatuur is tussen haakjes vermeld voor alle gegevens) De vermelde opkomstpercentages zijn afkomstig uit gepubliceerde literatuur en zijn uitsluitend als indicatie bedoeld. Persoonlijke ervaringen kunnen variëren naargelang van de zaadbron en andere factoren.  FAMILIE Soort Botanische naam (gewone Nederlandse naam) Levensduur (9) en habitat Zaadgewicht (mg) Fotoperiode voor kieming of groei (10) Plantdiepte (mm) (11) Kiemtijd (dagen) (12) Speciale behandelingen (13) Toxiciteitstest (14) Zaadleveranciers (15) Andere referenties (16) APIACEAE Torilis japónica (heggendoornzaad) E, T verstoorde terreinen, hagen, weiden (16, 19) 1,7 - 1,9 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) koude stratificatie (7, 14, 18, 19) rijping kan nodig zijn (19) kieming geremd in het donker (1, 19) geen speciale behandelingen (5) POST (5) ASTERACEAE Bellis perennis (madeliefje) M grasland, akkers, vaak gemaaide grasgrond (16, 19) 0,09-0,17 (4, 19) L = D (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) kieming niet beïnvloed door bestraling (18, 19) geen speciale behandelingen (4, 14) POST (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (korenbloem) A akkers, bermen, open habitats (16) 4,1-4,9 (4, 14) L = D (14) 0-3 (2, 4, 14) 14-21 (100 %) (14) geen speciale behandelingen (2, 4) POST (2,4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (knoopkruid) M akkers, bermen, open habitats (16, 19) 2,4-2,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) rijping kan nodig zijn (18, 19) kieming geremd in het donker (19) geen speciale behandelingen (5, 14, 26) POST (5, 22, 26) A Inula helenium Griekse alant M vochtige, verstoorde terreinen (16) 1 - 1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) geen speciale behandelingen (4) POST (4) A, F Leontodon hispidus (leeuwentand) M akkers, bermen, open habitats (16 19) 0,85-1,2 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) kieming geremd in het donker (17, 18, 19) geen speciale behandelingen (5, 23) POST (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (rudbeckia) T, M verstoorde terreinen (16) 0,3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) geen speciale behandelingen (4, 14, 33) POST (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis Canadese guldenroede M weide, open terreinen (16) 0,06-0,08 (4, 14) L = D (11) 0 (4) 14-21 (11) 1:1 vermengen met zand en 24 uur weken in 500 ppm GA (11) geen speciale behandelingen (4) POST (4) E, F Xanthium pensylvanicum — A akkers, open habitats (16) 25-61 (14, 29) 0 (1) 5 (29) kieming mogelijk geremd in het donker (1) 12 uur weken in warm water (29) PRE en POST (31) A Xanthium spinosum (stekelnoot) A open habitats (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 (6) scarificatie (14) geen speciale behandelingen (6) PRE en POST (6) A Xanthium strumarium (Iate stekelnoot) A akkers, open habitats (16) 67,4 (14) L = D (14) 10-20 (6, 21) geen speciale behandelingen (6, 14, 21) PRE en POST (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (pinksterbloem) M akkers, bermen, vaak gemaaide grasvelden (16 19) 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) kieming geremd in het donker (18, 19) geen speciale behandelingen (5, 14, 22) POST (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (echte koekoeksbloem) M (16) 0,21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) rijping kan nodig zijn (18) geen speciale behandelingen (5, 14, 15, 22-26) POST (5, 15, 22-26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (ganzenvoet) A akkerranden, verstoorde terreinen (16 19) 0,7 - 1,5 (14, 19, 34) L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) behandeling verschilt afhankelijk van de zaadkleur (19) kiemrust bij droge opslag (19) kieming geremd in het donker (1, 18, 19) koude stratificatie (18) geen speciale behandeling (14, 34) PRE en POST (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (sint-janskruid) M akkers, bouwland, open habitats (16 19) 0,1-0,23 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) kieming geremd in het donker (1, 18, 19) geen speciale behandelingen (5, 14, 15, 25, 27) POST (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea — A bermen, open habitats, maïsvelden (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10-20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) kieming niet beïnvloed door bestraling (1) geen speciale behandelingen (6, 21) PRE en POST (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus — M bouwland, weiden, bermen (16, 30) 0,2 (14) L = D (14) 0 (1) 10-20 (6, 10) 12 (91 %) (10) kieming geremd in het donker (1) geen speciale behandelingen (6, 10, 14) PRE en POST (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (rolklaver) M grassige gebieden, bermen, open habitats (16, 19) 1-1,67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) scarificatie (14, 19) kieming niet beïnvloed door bestraling (18, 19) geen speciale behandelingen (23, 25) POST (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia — A natte bossen (16) 23-28 (9) L = D (14) L > D (9) 10-20 (6,9) zaden 24 uur in water weken (9) scarificatie (14) zaadlevensvatbaarheid zaad verschilt afhankelijk van de kleur (1) geen speciale behandelingen (6) POST (6,9) A Sesbania exaltata — A alluviale grond (16) 11-13 (9, 14) L > D (9) 10-20 (9, 21) zaden 24 uur in water weken (9) kieming niet beïnvloed door bestraling (1) geen speciale behandelingen (21) PRE en POST (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (rode klaver) M akkers, bermen, bouwland (16, 19) 1,4 - 1,7 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) scarificatie (14, 18) rijping kan nodig zijn (19) kieming niet beïnvloed door bestraling (1, 19) geen speciale behandelingen (5) POST (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (hartgespan) M open terreinen (16) 0,75-1,0 (4, 14) L = D (14) 0 (4) geen speciale behandelingen (4, 14) POST (4) F Mentha spicata (aarmunt) M vochtige gebieden (16) 2,21 (4) 0 (4) geen speciale behandelingen (4) POST (4) F Nepeta cataria (kattenkruid) M verstoorde terreinen (16) 0,54 (4, 14) L = D (14) 0 (4) geen speciale behandelingen (2, 4, 14) POST (2,4) F Prunella vulgaris (brunel) M akkers, grassige