['394', 'concentrations:', 'of', '0.1,', '1.0,', 'and', '10:', 'mg/m?', 'for', '90', 'days', 'fol-', 'lowed', 'by,', '90', 'days', 'of:', 'revovery.', 'Two', 'sensitive', 'biological', 'markers', 'for', 'genotoxicity,', 'chromosomal', 'aberrations', 'in', 'pul-', 'monary:', 'alvcolar,', 'macrophages.', '(PAM)', 'and', 'DNA', 'adduct', 'formation', 'in', 'major', 'target', 'and/nontarget', 'organs,', 'were', 'ana-', 'lyzed', 'after', '28', 'and', '90', 'days:and', 'after.', 'the:', 'recovery:', 'period.', 'The', 'results', 'of', 'the', '90-day', 'study', 'confirm', 'the', 'existence', 'ofa', 'no-observed-eflect-level', '(NOEL)', 'of', 'ati', 'least', '1.0:mg/m>*', 'for', 'DNA', 'adduct', 'formation', 'andla,', 'NOEL', 'of', 'at', 'Icast', '10:mg/m?', 'for', 'the', 'induction', 'of', 'chromosomal', 'aberration', 'in', 'PAMS', 'even,', 'in', 'the', 'extended', 'exposure', 'duration', 'of', '90', 'days.', 'MATERIALS', 'AND:', 'METHODS', 'Materials.', 'Calf', 'spleen', 'phosphodicsterase', '(2', "U/mg)'was", 'obtained', 'from', 'Bochringer-Mannheim:', '(Indianapolis;.', '[N)}:.', 'Micrococcal', 'nuclease', '(100-', '200', "'U/mg)", 'and', 'nuclease', 'P1i(255iUymg)', 'were', 'from', 'Sigma((St.', 'Louis,', 'MO),', 'T,', 'polynucleotide', 'Kinase', 'was', 'from', 'GIBCO-BRL', '(Gaithersburg:', 'MD),', 'and', '[y-?', 'P]ATP', '(3000', 'Ci/mmol)', 'was.from', 'New', 'England', 'Nuclear', '(Wilming-', 'ton,', 'DE).', 'Polycthylencimine', 'cellulose', '(PEI-cellulose)', 'coated.', 'thin-layer', 'chromatographic', '(TLC):', 'sheets.', '(Machery.', 'Nagel):', 'were', 'purchased', 'from', 'Brinkmann', 'Scientific', '(Westbury,', 'NY).', 'The', 'LR4F', 'reference', 'cigarettes', '(0.8', 'me-nicotine', 'and', '11.5', 'mg', 'tar.per', 'cigarette):', 'were', 'obtained', 'from', 'the', 'Tobacco', 'and', 'Health', 'Research', 'Institute,', 'Lexington,', 'KY.', 'Experimental', 'animals.', 'Details', 'on', 'experimental', 'animals', 'have', 'been', 're-', 'ported!', 'elsewhere', '(Coggins', 'ef', 'al.', '1993);', 'Briefly.', '5-week-old.', 'male', 'Sprague-Dawley', 'rats', '(Charles', 'Riven,', 'Raleigh,', 'NC)', 'were', 'acclimated', 'for', '2', 'weeks', 'prior', 'to', 'exposure', 'in', '2.M3', '‘stainless', 'steel', 'inhalation', 'chambers.', 'The', 'animal', 'rooms', 'had', 'controlled', 'lighting', '(12:Hr', 'dark.and', '12', 'hriight),', 'tempera-', 'ture', '(20-24°C);', 'and', 'Humidity', '(40-60%', 'relative', ':Humidity),;', 'Animals', 'were', 'allowed', "unrestricted'access", 'to', 'feed', '(Purina', 'Rodent', 'Chow', '5002)', ':and', 'dis-', 'tilled', 'water,', 'exceptiduring', 'the', 'smoke:exposures.', 'The', 'animals:were', 'housed', 'and', 'cared', 'for', 'in.accordance', 'with.the', 'Animal', 'Welfare', 'Act', 'of', '1970.', 'and', 'amendments', '(Public', 'Law', '91-579),', 'as:', 'set', 'forth', 'in', 'CFR', 'Title', '9,', 'Part:', '3.', 'Subpart', 'F.', 'Sinoke', 'generation', 'and', 'exposure', 'conditions.', 'Smoke', 'generation', 'andiex-', 'posure', 'conditions', 'have', 'Been:described', 'previously', '(Coggins', 'et', "al',", '1993).', 'Briefly,', 'smoke', 'was', 'generated', 'from', '[R4F', 'research', 'cigarettes', 'with', 'a', '30-port', 'AMESA', 'generator', '(CH', 'Technologies,', 'Westwood,', 'NJ)', 'fitted', 'with.analumi-', 'num', 'cone', 'for', 'collection', 'of', 'sidestream', 'smoke.', 'Cigarettes', 'were', 'smoked', 'according', 'to', 'the:', 'Federal', 'Trade', 'Commission', 'method', '{a:35-ml!puff', 'ofi2', 'sec', 'duration,', 'once.', 'per', 'minute)', 'except', 'that!', 'instead', "of'a", 'fixed', 'butt', 'length,', 'a', 'fixed', 'number', 'of', 'puffs.', '(7)', 'was', 'taken:', "(Baumgartner'and", 'Coggins,,', '1980;', 'Ayres.et', 'al:,', '1990)..Mainstream', 'smoke', 'was', 'exhausted', 'and', 'discarded', 'and', 'the', 'sidestream', 'smoke', 'was', 'drawn', 'into', 'a', 'common', 'plenum.', 'Differenti', 'amounts', 'of', 'aged', 'and', 'diluted', 'sidestream', 'smoke', 'were', 'provided', 'for', 'each', 'chamber', 'and', 'mixed', 'with.', 'dilution', 'air', 'drawn', 'from', 'the', 'animal.', 'room', 'through', 'HEPA', 'filters.', 'Target', 'concenttations:', 'for', 'suspendéd!', 'particulates', 'were', '0,.0.1,', '1,', 'and!', '10', 'mg/m?:', 'Exposures', 'were', 'for:', '6-hr', 'per', 'day,', '5.', 'days.a', 'week', 'for', '13', 'weeks', '(total!', 'of:65', 'exposures).', 'Dermal', 'absorption', 'and', 'oral', 'ingestion', 'of', 'particulates', 'after', 'preening', 'were', '‘minimized', 'by', 'the', 'use', 'of', 'nose-', 'only', 'restraint', 'tubes:inside.the', 'chambers.', 'Experimental.', 'design.', 'Rats', 'were', 'divided', 'into', 'four', 'exposure', 'groups:', 'sham,', 'low.(0:1', 'mg', 'TPM/m*),', 'medium', '(1.0', 'mg', 'TPM/m?),', 'and', 'high', '(10.0', 'mg.', 'TPM/m>)exposures:', 'For', 'DNA', 'adduct', 'analysis;', 'each', 'group', 'contained', '{5-male', 'animals.', 'Five', 'animals', 'in', 'each', 'group', 'were', 'killed', 'after', '28', 'and', '90', 'days', 'of', 'exposure', 'for.', 'DNA', 'adduct', 'analysis.', 'The', 'remaining', '5,animals:in', 'each', 'group', 'were', 'kept', 'fora', 'further', '90', 'days', 'without', 'smoke', 'exposure', 'for', 'the', 'reversibility.', 'study:', 'For', 'chromosomal', 'aberrations', 'in', 'PAM.', '5-animals:in', 'each', 'exposure', 'group', 'were', 'killed', "after'28", 'and', '90', 'daysiof', 'exposure.', 'No:', 'reversibility-study.', 'was', 'conducted.', 'for', 'chromosomal', 'aberrations', 'in', 'PAM.”', 'LEE', 'ER', 'AG.', 'DNA', 'isolation.', 'VNA-', 'was', 'isolated', 'and', 'purified', 'as.', 'described', 'previously:', '(Lee', "cf'al’,", '1992).', 'Briefly,', 'wholé', 'tung,', 'heart!', 'liver,', 'larynx,', 'and.', 'bladder', 'samples', 'were', 'homogenived,', 'centrifuged,', 'and', 'tlie-supernatant', 'extracts', 'dis-', 'carded.', 'Pellets.', 'were', 'resuspended', 'and', 'DNA', 'was', 'isolated', 'ona', 'Genepure', '341', 'nucteic', 'avid', 'purification', 'system', '(Applicd', 'Brosystem,', 'Ing:', 'Foster', 'City;', 'CA):by.', 'solvent', 'extraction', 'and', 'enzymatic', 'digestion', 'of', 'protein', 'and', 'RNA.', 'The', 'DNA:', 'concentration', 'was', 'estimated', 'spectrophotomcettically', 'prior', 'to', 'analysis', '(ll', 'Ajg)', '7', 'SO', 'ag', 'DNA/ml))', 'Absorbance', 'ratios', '(260/280)', 'ofall', 'DNA.', 'samples', 'ranged', 'from', '1.60', '1.8:', '3°', 'p_postlabeling', 'assay.', 'Vive', 'micrograms', 'of', 'DNA:', 'was', 'digested', 'to', '3', 'nucleotides', 'by:', 'incubation', 'at', '37°C', 'for', '3.5', 'hr', 'in', 'a', 'total', 'volume:of', '10.', 'at', 'containing', '0.6-U.', 'of', 'microvoccal.', 'nuclease', 'and', '5.0', 'yg-of', 'splecn', 'phospho-', 'diesterasc.', 'Addicted', 'nucleotides', 'were', 'enriched', 'by.', 'the', 'nuclease', 'Pl', 'proce-', 'dure', '(Reddy.and', 'Randcrath,', '1986)', 'ionby-butanolicxtraction', '(Gupta,', '1985)', 'and', 'samples.were', 'then', '[(5-’P]', 'phosphorylated!', 'at', '37°C', 'using', '75', 'wi', 'of', '{y-2PIATP', '‘with', 'a', 'specific', 'activity', 'of', '~', '3000', 'Ci/mmol', 'and', '4.5', 'U', 'of', 'T,', 'polynucleotide', 'kinase:(Lec:er', 'al.', '1992).', 'ATP', 'excess:', 'was', 'confirmed', 'by,', 'one-dimensional!', 'separation', 'of', 'normal', 'nucleotides.', 'from', 'unreacted', '[2P]ATP', 'in', 'PEl-cellulose', 'TLC', 'using', '0.28', 'ammonium', 'phasphate/0.05', 'Mm', 'sodium', 'phosphate,', 'plill6.6.', 'Resolution', 'of', 'the', '2p.lhbeled', 'adducts', 'was', 'carried', 'out', 'as', 'previously', 'described', '(Gupta', '¢', 'al,', '1982)', 'with', '4', 'pe', 'of', 'DNA:', 'applied', 'on', 'PEI-cellulose', 'TLC', 'sheets', 'using-the', 'following', 'solvents:', 'Dt,', '110', 'M', 'sodium', 'phosphate,', 'pH', '6.0', '(overnight', 'onto.a', 'wick);', 'D3,', "5:3'M", 'lithium', 'formate;', '8.5°M', 'urea,', 'pH3:5:', 'D4,', '1.2', 'm', 'lithium', 'chloride.', '$.5', 'M', 'urea,', '0.5', 'M', 'Tris.', 'base,', 'pH', '8.0', '(onto-a', 'wick);', 'D5,', '1.7.M', 'sodium', 'phosphate,', 'pH', '6.0:', '(overnightionto', 'a', 'wick).', 'Quantification', 'of', 'DNA', 'adducts.', 'The', 'specific', 'activity.of', 'each', 'batch', 'of', '(P]ATP', 'was', 'determined', 'by', 'measuring', 'the', 'kinase-catalyzed', 'incorpora-', 'tion', 'of', 'radioactivity.into:10', 'pmol', 'of', '2’-deoxyadenosine', '3-monophosphate', '(dAp)', '(Reddy', 'and', 'Randerath,', "1'986).", 'Values', 'ofispecific', 'activity.', 'fell', 'within:', 'the', 'range', 'of', '1.5.to', '2.5', 'X', '10°', 'cpm/pmol.', 'TLC', 'plates', 'were', 'wrapped', 'in', 'Mylar', 'plastic', 'and', 'scanned', 'for', '8-hr', 'using', 'the', 'AMIBIS', 'radioanaltic', 'imaging', 'sys~', 'tem', "(AMBIS'Systems..inc.,", 'San', 'Diego.', 'CA)', 'under', 'an', 'argon', 'atmosphere.', 'The', 'counting', 'efficiency:', 'averaged', 'approximately:', '20%;', 'a', '3.2.x', '3.2-mm', 'resolution:', 'plate:', 'was', 'used.', 'The:', 'use', 'of', 'the', 'AMBIS', 'radioanalytic', 'imaging', 'system', 'in', 'two-dimensional', 'TLC', 'and', 'in', '“p.postlabeling.', 'assay', 'of', 'DNA', 'adducts-has', 'been', 'previously.', 'reported', '(Hook', 'e7', 'al’,', '1990,', 'Turteltaub:cr', 'al,', '1990;', 'Lee.', 'ef', 'al:,.', '1992).', 'The:', 'adduct:', 'maps', 'comparing’', 'the', 'conventional', 'autoradiography.', 'and|AMBIS.', 'scanning', 'are', 'shown', 'in', 'Fig:', '|.', 'Relative', 'adt', 'duct', 'labeling', '(RAL)', 'values', 'were', 'calculated', 'by:', '_', 'cpm', 'in', 'adduct', 'nucleotides', 'sp.acti(ATP):', 'x', 'pmol', 'dNp', 'applied', 'to', 'TLE', ' ', 'RAL.', 'In', 'vitro.', 'modification.', 'of', 'DNA.', 'with', 'cigarette', 'smoke:', 'condensate', '(CSC).', 'In', 'order', 'toprepare', 'the', 'DNA-CSC', 'adduct', 'tobe', 'used', 'as', 'a', 'positive', 'control,', '1', 'mg-of', 'lung', 'DNA', 'isolated', 'from', 'Sprague-Dawley', 'rats', 'was', 'treated', 'with', "5'mg", '(in', '500', '1', 'of', 'DMSO):', 'of', 'CSC', 'from', 'Kentucky', 'Reference', 'I', 'R4F', 'cigarettes', "in'the", 'presence', 'of', 'an', 'S9', 'metabolic', 'activation', 'system', '(Ames', 'et', 'al’.', '1975).', 'The', '$9:concentration', 'was', '5%', '(v/v)', 'and', "5.0'ml", 'of', 'the', "S9'mix", 'was', 'added', 'to', 'the', 'reaction', 'tube.', 'The', 'reaction', 'mixture', 'was', 'incubated', 'for', 'Shr', 'at', '37°C.', 'DNA.', 'was', 'extracted', 'with', 'the', 'ABI', 'Genepure.', 'Extractor.', 'In', 'vive', 'modification', 'of', 'DNA', 'with', 'benzojalpyrene', '(Bia|P):.', 'Female', 'B6C3F', 'IL', 'mice', "were'given", 'a', 'single', 'ip', 'dose', 'of', '40', 'or', '60', 'me/kg.of', 'Bia]P', 'in', '0.1', 'ml', 'of', 'DMSO/corn', 'oil', '(50/50;', 'v/v):', 'Livers', 'were', 'collected', '43', 'hrafter', 'B[a]P', 'administration:', 'DNA’', 'was', 'extracted', 'by', 'the', 'Genepure', 'Extractor', 'and', 'iused!', 'as‘aisource', 'of', 'standard', 'DNA-B[a]P', 'adducts:', 'Pulmonary', 'alveolar', 'macrophage', 'isolation', 'and', 'analysis', 'of', 'chromosomal.', 'aberration.', 'Designated', 'animals', 'were.', 'injected', 'ip', 'with', 'colchicine', '(6', 'mg/', 'kg,', "12'mg", 'colchicine/ml', "Hank's", "balanced'salt", 'solution', '(HBSS)', 'stock', 'solu-', 'tion).atithe', 'end', 'ofithe', '28-', 'and', '90-day', 'time', 'points', 'in', 'the', 'study:.Four', 'hours', 'later', 'animals', 'were', 'killed', 'by', 'asphyxiation', 'with', '70%', 'carbon', 'dioxide', '(CO,)', 'and', 'the', 'tracheas', 'were:cannulated', 'with:', '14G', 'iv.', 'catheters.', 'The', 'lungs', 'and', 'o', 'y', '202', 'Teeslenp', 'ey']