['653', 'eae', '”', '+', '369', 'IRARHRRNVDRVSIGSYR', 'coon', '§-turn', 'nascent', 'helix', 'PLASMA', 'MEMBRANE', 'Figure', '8.', 'Individual', 'residues', 'involved', 'in', 'basolateral', 'targeting', 'and', 'possible', 'secondary', 'structure', 'of', 'the', '17-residue', 'basolateral', 'sorting', 'signal', 'of', 'the', 'plgR.', 'The', '17', 'cytoplasmic', 'residues', 'of', 'the', 'basolateral', 'sorting', 'signal', 'of', 'the', 'plgR', 'is', 'depicted.', 'Based', 'on', 'the', 'mutational', 'anal', '-', 'ysis', 'used', 'in', 'this', 'study,', 'the', 'most', 'important', 'amino', 'acids', 'involved', 'in', 'polarized', 'sorting', 'of', 'the', 'plgR', 'to', 'the', 'basolateral', 'surface', 'of', 'MDCK', 'cells', 'are', 'indicated', 'by', 'a', 'star.', 'The', 'less', 'important', 'residues', 'are', 'marked', 'by', 'a', 'diamond.', 'The', 'residues', 'shown', 'by', 'two-dimensional', 'NMR', 'to', 'adopt', 'a', '8-turn', 'in', 'solution', 'are', 'indicated', 'by', 'a', 'black', 'bar', 'and', 'the', 'residues', 'that', 'tend', '1o', 'form', 'a', 'nascent', 'helix', 'are', 'indicated', 'by', 'a', 'cross-', 'hatched', 'bar.', ' ', 'that', 'this', 'residue', 'plays', 'a', 'role', 'in', 'basolateral', 'sorting.', 'Previ-', 'ously', 'we', 'found', 'that', 'basolateral', 'sorting', 'was', 'not', 'affected', 'upon', 'mutating', 'Y668', 'to', 'Cys', 'in', 'the', 'full-length', 'plgR', '(Okamoto', 'ctal.,', '1992).', 'In', 'contrast,', 'as', 'mentioned', 'above', 'alanine', 'substi-', 'tution', 'of', 'Y668', 'partially', 'diminished', 'basolateral', 'targeting.', 'It', 'is', 'possible', 'that', 'the', 'Ala', 'substitution', 'at', 'position', '668', 'disrupted', 'the', 'basolateral', 'sorting', 'signal,', 'whereas', 'the', 'Cys', 'substitution', 'did', 'not.', 'In', 'addition,', 'unlike', 'the', 'quantitative', 'basolateral', 'deliv-', 'cry', 'assay', 'applied', 'in', 'this', 'study,', 'the', 'assay', 'used', 'to', 'determine', 'basolateral', 'targeting', 'of', 'the', 'mutant', 'Y668', 'to', 'Cys', '(Okamoto', 'etal.,', '1992)', 'was', 'less', 'quantitative', 'and', 'most', 'likely', 'not', 'as', 'sen-', 'sitive', 'in', 'detecting', 'small', 'changes', 'in', 'basolateral', 'targeting.', 'In', 'contrast', 'to', 'the', 'truncation', 'results', '(Fig.', '3),', 'substitutions', 'of', '1665', 'and', '$664', 'and', 'Ala', 'did', 'not', 'alter', 'basolateral', 'sorting,', 'so', 'the', 'role', 'of', 'these', 'residues', 'was', 'unclear.', 'One', 'possibility', 'is', 'that', 'they', 'are', 'important,', 'but', 'the', 'basolateral', 'signal', 'could', 'tolerate', 'an', 'Ala', 'at', 'these', 'positions.', 'However,', 'even', 'though', 'truncation', 'of', 'these', 'residues', 'had', 'an', 'effect', 'on', 'targeting,', 'one', 'cannot', 'exclude', 'the', 'possibility', 'that', 'factors', 'other', 'than', 'the', 'truncated', 'residues', 'contributed', 'to', 'the', 'altered', 'phenotype.', 'For', 'example,', 'at', 'neutral', 'pH', 'the', 'COOH-terminal', 'carboxyl', 'group', 'bears', 'a', 'negative', 'charge.', 'Progressive', 'truncation', 'of', 'residues', 'from', 'the', 'COOH', 'terminus', 'changes', 'the', 'proximity', 'of', 'the', 'charged', 'moiety', 'to', 'possible', 'sorting', 'determinants', 'residing', 'in', 'the', 'non-truncated', 'part', 'of', 'the', 'tail.', 'Consequently,', 'the', 'struc-', 'ture', 'of', 'the', 'nontruncated', 'region', '(and', 'the', 'sorting', 'signal)', 'might', 'be', 'disturbed.', 'The', 'negative', 'charge', 'may', 'also', 'interfere', 'with', 'in-', 'teractions', 'between', 'the', 'basolateral', 'sorting', 'machinery', 'and', 'a', 'sorting', 'signal', 'possibly', 'located', 'in', 'the', 'non-truncated', 'region.', 'In', 'both', 'cases,', 'a', 'mutant', 'receptor', 'with', 'impaired', 'basolateral', 'sorting', 'activity', 'might', 'be', 'observed', 'even', 'though', 'the', 'truncated', 'residues', 'are', 'not', 'part', 'of', 'the', 'actual', 'sorting', 'signal.', 'To', 'resolve', 'the', 'apparent', 'contradiction', 'between', 'the', 'Ala', 'mu-', 'tations', 'and', 'truncations', 'at', 'residues', '$664', 'and', '1665,', 'we', 'indi-', 'vidually', 'deleted', 'these', 'residues.', 'We', 'made', 'these', 'in', 'the', 'context', 'of', 'the', 'full-length', 'plgR', 'to', 'avoid', 'possible', 'complications', 'from', 'moving', 'the', 'charged', 'C-terminus', 'too', 'close', 'to', 'the', 'putative', 'sig-', 'nal.', 'Also', 'we', 'reasoned', 'that', 'the', 'structure', 'of', 'the', 'signal', 'in', 'the', 'context', 'of', 'the', 'full-length', 'tail', 'might', 'be', 'more', 'resistant', 'to', 'a', 'non-specific', 'destabilization', 'due', 'to', 'removal', 'of', 'a', 'residue.', 'In', 'both', 'cases', 'these', 'deletions', 'did', 'not', 'disrupt', 'basolateral', 'sorting.', 'Unlike', 'Ala', 'mutations,', 'internal', 'deletions', 'might', 'be', 'expected', 'to', 'have', 'a', 'high', 'propensity', 'to', 'disrupt', 'structure,', 'even', 'if', 'the', 'deleted', 'residues', 'are', 'not', 'truly', 'part', 'of', 'the', 'signal.', 'The', 'finding', ' ', ' ', 'The', 'Journal', 'of', 'Cell', 'Biology,', 'Volume', '123,', '1993', 'that', 'the', 'deletions', 'of', '$664', 'or', '1665', 'did', 'not', 'alter', 'ba.', 'sorting', 'therefore', 'can', 'be', 'taken', 'as', 'particularly', 'strong', 'ev', 'that', 'these', 'residues', 'are', 'not', 'part', 'of', 'the', 'basolateral', 'signa', 'conclusion,', 'the', 'preponderance', 'of', 'data', '(from', 'Ala', 'mutatic', 'and', 'internal', 'deletions)', 'suggests', 'that', 'these', 'residues', 'are', 'no.', 'part', 'of', 'the', 'signal.', 'The', 'effects', 'of', 'truncations', 'at', 'these', 'residues', 'are', 'most', 'likely', 'due', 'to', 'secondary', 'effects', 'of', 'the', 'truncations.', 'fe', 'then', 'analyzed', 'the', 'region', 'from', '656', 'to', '663,', 'primarily', 'by', 'alanine', 'scanning', 'mutagenesis.', 'The', 'alanine', 'mutations', 'that', 'yielded', 'the', 'largest', 'in', 'basolateral', 'sorting', 'were', 'at', 'H656,', 'R657,', 'and', 'V660', '(see', 'Fig.', '4),', 'and', 'we', 'conclude', 'that', 'these', 'residues', 'are', 'particularly', 'important', 'for', 'basolateral', 'sorting.', 'Alanine', 'mutations', 'at', 'R655', 'and', 'Y668', 'had', 'smailer', 'effects', 'on', 'baso-', 'ateral', 'sorting', '(Fig.', '4),', 'suggesting', 'that', 'these', 'residues', 'play', 'a', 'lesser', 'role', 'in', 'this', 'process.', 'Obviously,', 'one', 'should', 'keep', 'in', 'mind', 'that', 'alanine', 'scanning', 'only', 'examines', 'the', 'ability', 'of', 'these', 'positions', 'to', 'tolerate', 'this', 'particular', 'substitution.', 'Neverthe-', 'less,', 'alanine', 'scanning', 'is', 'widely', 'accepted', 'as', 'a', 'useful', 'ap-', 'proach', 'to', 'identify', 'functionally', 'important', 'residues.', 'Basolateral', 'targeting', 'seems', 'to', 'be', 'dependent', 'on', 'the', 'posi-', 'tively', 'charged', 'segment', 'RHR655-657.', 'The', 'importance', 'of', 'po-', 'ar', 'and', 'charged', 'residues', 'has', 'also', 'been', 'suggested', 'in', 'previous', 'studies', 'on', 'internalization', 'and', 'basolateral', 'targeting', 'signals', '(Ktistakis', 'et', 'al.,', '1990;', 'Trowbridge,', '1991;', 'Le', 'Bivic', 'et', 'al.,', '991;', 'Matter', 'et', 'al.,', '1992).', 'Interestingly,', 'this', 'positively', 'charged', 'cluster', 'is', 'located', 'only', 'two', 'residues', 'away', 'from', 'the', 'transmembrane', 'region', 'of', 'the', 'molecule.', 'In', 'a', 'previous', 'study,', 'the', 'transferrin', 'receptor', 'internalization', 'signal', 'YXRF', 'was', 'shown', 'to', 'retain', 'its', 'activity', 'only', 'when', 'separated', 'by', 'at', 'least', 'seven', 'residues', 'from', 'the', 'transmembrane', 'region', '(Collawn', 'et', 'al.,', '1990).', 'Our', 'study', 'suggests', 'that', 'the', 'cytoplasmic', 'residues', 'RHR655-657', 'can', 'be', 'quite', 'close', 'to', 'the', 'plasma', 'membrane', 'and', 'still', 'mediate', 'basolateral', 'sorting', 'of', 'the', 'plgR.', 'Negatively', 'charged', 'phosphatidylserine', 'molecules', 'are', 'con-', 'centrated', 'in', 'the', 'cytoplasmic', 'leaflet', 'of', 'the', 'plasma', 'membrane', '(Alberts', 'et', 'al.,', '1989},', 'and', 'presumably', 'also', 'in', 'the', 'Golgi.', 'The', 'juxtamembrane', 'positively', 'charged', 'cytoplasmic', 'residues', 'may', 'serve', 'to', 'shield', 'the', 'sorting', 'determinant', 'from', 'this', 'nega-', 'tively', 'charged', 'surface', 'and', 'thereby', 'facilitate', 'sorting.', 'Alterna-', 'tively,', 'the', 'positively', 'charged', 'residues', 'may', 'directly', 'interact', 'with', 'components', 'of', 'the', 'basolateral', 'sorting', 'machinery.', 'Re-', 'cent', 'observations', 'proposed', 'that', 'heterotrimeric', 'G,', 'proteins', 'play', 'a', 'role', 'in', 'targeting', 'from', 'the', 'TGN', 'to', 'the', 'basolateral', 'sur-', 'face', '(Stow', 'et', 'al.,', '1991;', 'Bomsel', 'and', 'Mostov,', '1992;', 'Pim-', 'plikar', 'and', 'Simons,', '1993).', 'This', 'class', 'of', 'G', 'proteins', 'is', 'known', 'to', 'be', 'activated', 'by', 'positively', 'charged', 'peptides,', 'such', 'as', 'the', 'wasp', 'venom', 'mastoparan.', 'An', 'intriguing', 'possibility', 'is', 'that', 'the', 'juxtamembrane', 'basic', 'residues', 'of', 'the', 'basolateral', 'sorting', 'sig-', 'nal', 'of', 'the', 'pIgR', 'interact', 'with', 'a', 'G,', 'protein.', 'Are', 'there', 'homologues', 'of', 'the', 'plgR', 'basolateral', 'targeting', 'signal', 'in', 'other', 'proteins?', 'In', 'a', 'recent', 'study,', 'alignment', 'of', 'a', '13-amino', 'acid', 'sequence', 'implicated', 'in', 'basolateral', 'sorting', 'of', 'the', 'LDLR', 'with', 'the', '17-mer', 'sequence', 'in', 'the', 'pIgR', 'revealed', 'five', 'consensus', 'residues:', 'H/R819,', 'S/N820,', 'D822,', 'T/S825,', '$828', 'in', 'the', 'LDLR', 'aligned', 'with', 'residues', 'R658,', 'N659,', 'D661,', 'S664,', 'S667', 'in', 'the', 'plgR', '(Yokode', 'et', 'al.,', '1992).', 'Residue', 'V660,', 'which', 'functions', 'in', 'basolateral', 'sorting', 'of', 'the', 'plgR,', 'aligns', 'with', 'Q821', 'in', 'the', 'LDLR,', 'pointing', 'toa', 'lack', 'of', 'residue', 'conser-', 'vation', 'at', 'the', 'indicated', 'position', 'for', 'these', 'two', 'receptors.', 'How-', 'ever,', 'to', 'test', 'the', 'possibility', 'that', 'glutamine', 'may', 'still', 'substitute', 'for', 'valine', 'in', 'the', 'sorting', 'determinant', 'of', 'the', 'plgR,', 'we', 'mutated', 'V660', 'to', 'glutamine', 'in', 'the', 'context', 'of', 'the', 'truncated', 'T670-stop', 'mutant.', 'The', 'mutant', 'receptor', 'V660-Q', 'showed', 'impaired', ' ', ' ', '1158']