['C', ' ', 'VoL.', '15,', '1995', 'PHOSPHOPROTEIN', 'INVOLVED', 'IN', 'PDGF', 'INDUCTION', 'OF', 'MCP-I', '319', ' ', 'vw', ':', 'bei', '+', 'thes', '+', 'P', 'Probef', '11', '|', 'sos', '|', '305', '   ', 'PDGF', 'P', '=', 'Probe]', 'ti!', '+', 'FP', '=m', '+', 'P', 'I', 'sps_', '|', 'o7', 'os', 'a', '~', '+', '_', '=', '-+', 'Po', 'mem', '+', 'Pm', '+', '|', '3p7', '|', '3011)', '[sp2sp101', 'im', '+', 'Pm', '+', 'Poe', '+', 'f', '305', 'To', 'mut', '|', 'FIG.', '5.', 'PDGF', 'inducible', 'binding', 'to', 'elements', 'EH', 'and', 'III', 'requires', 'at', 'least', '15', 'and', '8', 'nucleotides,', 'respectively.', '(Top)', 'Schematic', 'diagram', 'of', '240-bp', 'MCP-1', 'enhancer', 'fragment.', 'Position', '|', 'is', 'at', 'the', '5’', 'end', 'of', 'the', 'fragment.', 'The', 'relative', 'positions', 'of', 'the', 'four', 'elements', 'with', 'respect', 'to', 'the', 'nonoverlapping', '97-', 'and', '143-bp', 'subfragments', 'are', 'shown.', 'Shaded', 'ovals', 'denote', 'the', 'probes', 'used', 'in', 'these', 'experiments.', '(Center)', 'Radiolabeled', 'double-stranded', 'oligonucleotide', 'probes', 'corresponding', 'to', 'full-length', 'element', 'Il', 'and', 'five', 'truncated', 'derivatives', 'of', 'clement', 'IE', 'were', 'used', 'in', 'mobility', 'shift', 'assays', 'with', '15', 'ug', 'of', 'nuclear', 'extracts', 'prepared', 'from', 'quiescent', 'fibroblasts', '(—)', 'or', 'fibroblasts', 'treated', 'with', 'the', 'B:B', 'isoform', 'of', 'PDGF', '(30', 'ng/ml)', 'for', '1.75', 'h', '(+),', 'Probe', '5DS', 'is', 'a', 'truncation', 'of', 'element', 'II', 'containing', 'a', '3-nucleatide', 'deletion', 'at', 'the', '5’', 'end', 'af', 'element', 'IL', 'Probes', '3D5,', '3D7,', 'and', '3D11', 'are', 'truncations', 'of', 'element', '[1]', 'containing', 'deletions', 'of', '3,', '7,', 'and', '11', 'nucleotides,', 'respectively,', 'at', 'the', '3’', 'end', 'of', 'element', 'IL.', 'Probe', 'SD2/3D10', 'is', 'a', 'truncation', 'of', 'element', 'II', 'containing', 'a', '2-nucleotide', 'deletion', 'at', 'the', '5’', 'end', 'and', 'a', '10-nuclentide', 'deletion', 'at', 'the', '3°', 'end', 'of', 'element', 'IT.', 'P', 'denotes', 'probe', 'alone.', '(Bottom)', 'Radiolabelled', 'double-stranded', 'oligonucleotide', 'probes', 'corresponding', 'to', 'full-length', 'element', 'IL,', 'three', 'truncated', 'derivatives', 'of', 'element', 'III,', 'and', 'an', '8-base', 'mutation', 'of', 'element', 'IfI', 'were', 'used', 'in', 'mobility', 'shift', 'assays', 'with', '10', 'pg', 'of', 'nuclear', 'extracts', 'prepared', 'from', 'quiescent', 'fibroblasts', '(—)', 'or', 'fibroblasts', 'treated', 'with', 'the', 'B:B', 'isoform', 'of', 'PDGF', '(30', 'ng/ml)', 'for', '1.75', 'h', '(+),', 'Probes', '5DS5', 'and', '$D8', 'are', 'truncations', 'of', 'element', '{11', 'containing', '5-', 'and', '8-nucleotide', 'deletions,', 'respectively,', 'at', 'the', '5’', 'end', 'of', 'element', 'II].', 'Probe', '3D5', 'is', 'a', 'truncation', 'of', 'element', 'III', 'containing', 'a', '5-nucleotide', 'deletion', 'at', 'the', '3‘', 'end', 'of', 'element', 'IIE.', 'The', 'mut', 'probe', 'contains', 'an', '8-nucleatide', 'internal', 'mutation', 'of', 'clement', 'Il]', '(GCLGCAGG', 'changed', 'lo', 'TAGTACTT', 'at', 'positions', '12', 'to', '19', 'of', 'the', 'mutant', 'relative', 'to', 'the', '5’', 'end', 'of', 'clement', 'ILI),', 'P', 'denotes', 'probe', 'alone.', '3).', 'In', 'contrast', 'to', 'the', 'footprint', 'analysis,', 'PDGF-inducible', 'bind-', 'ing', 'to', 'element', 'II]', 'is', 'seen', 'in', 'mobility', 'shift', 'assays', '(compare', 'Fig.', '2,', 'lanes', '3', 'and', '4,', '6', 'and', '7,', 'and', '9', 'and', '10,', 'with', 'binding', 'to', 'element', 'II', 'in', 'Fig.', '3).', 'One', 'explanation', 'for', 'this', 'apparent', 'discrepancy', 'comes', 'from', 'determining', 'differences', 'in', '“on”', 'rates', 'of', 'binding', 'to', 'element', 'HI', 'between', 'quiescent', 'and', 'PDGF-treated', 'nuclear', 'extracts.', 'PDGF-treated', 'nuclear', 'extracts', 'have', 'significantly', 'greater', 'on', 'rates', 'of', 'binding', 'to', 'element', 'IIT', 'than', 'nuclear', 'extracts', 'from', 'quiescent', 'fibroblasts', '(data', 'not', 'shown).', 'For', 'footprint', 'analysis,', 'larger', 'amounts', 'of', 'each', 'nuclear', 'extract', 'were', 'added', 'for', 'longer', 'binding', 'incubations,', 'thereby', 'obscuring', 'the', 'differences', 'in', 'rates', 'of', 'protein', 'binding', 'to', 'element', 'II.', 'Elements', 'I', 'and', 'IV', 'are', 'related', 'to', 'each', 'other', 'and', 'bind', 'one', 'or', 'more', 'forms', 'of', 'the', 'transcription', 'factor', 'NF-«B.', 'In', 'mobility', 'shift', 'assays,', 'oligonucleotides', 'corresponding', 'to', 'elements', 'I', 'and', 'IV', 'compete', 'for', 'binding', 'to', 'themselves', 'and', 'each', 'other', '(Fig.', '4A', 'and', 'D).', 'Oligonucleotides', 'containing', 'two', 'different', 'NF-«B-binding', 'sequences', '(designated', 'NF1', 'and', 'NF2', '[Fig.', '4])', 'also', 'compete', 'for', 'binding', 'to', 'elements', 'I', 'and', 'EV.', 'Polyclonal', 'antibodies', 'specific', 'for', 'the', 'p50', 'and', 'p65', 'subunits', 'of', 'NF-«B', 'supershift', 'several', 'of', 'the', 'complexes', 'which', 'bind', 'elements', 'I', 'and', 'IV', '(Fig.', '4A', 'and', 'D).', 'Specificity', 'of', 'antibody', 'supertshifts', 'is', 'demonstrated', 'by', 'removal', 'of', 'supershifts', 'with', 'addition', 'of', 'peptides', 'used', 'in', 'generation', 'of', 'the', 'antibodies', '(Fig.', '4A', 'and', 'D,', 'upper', 'two', 'arrows).', 'Interest-', 'ingly,', 'neither', 'element', 'I', 'nor', 'NF-«B-related', 'oligonucleotides', 'compete', 'for', 'specific', 'binding', 'of', 'a', 'noninducible', 'complex', 'to', 'element', 'IV', '(Fig.', '4D,', 'bottom', 'arrow).', 'Elements', 'II', 'and', '[if', 'are', 'novel', 'binding', 'sequences', 'and', 'require', 'at', 'least', '15', 'and', '18', 'nucleotides,', 'respectively,', 'for', 'PDGF-indue-', 'ible', 'binding', 'to', 'occur.', 'Only', 'oligonucleotides', 'corresponding', 'to', 'the', 'shift', 'probes', 'themselves', 'compete', 'for', 'binding', 'to', 'elements', 'IL', 'and', 'III.', 'No', 'competition', 'was', 'observed', 'with', 'oligonucleotides', '(i)', 'corresponding', 'to', 'element', 'IV', 'or', '(ii)', 'containing', 'two', 'distinct', 'NF-«B-binding', 'sites', '(Fig.', '4B', 'and', 'C).', 'Oligonucleotides', 'corre-', 'sponding', 'to', 'element', '|', 'are', 'also', 'unable', 'to', 'compete', 'with', 'binding', 'to', 'elements', 'II', 'and', 'III', '(data', 'not', 'shown).', 'No', 'supershifts', 'were', ' ', 'observed', 'with', 'anti-p50', 'or', 'anti-p65', 'antisera', '(Fig.', '4B', 'and', 'C).', 'Further', 'experiments', 'focused', 'on', 'elements', 'IT', 'and', 'III.', 'Steric', 'hindrance', 'of', 'DNase', 'I', 'activity', 'by', 'proteins', 'binding', 'specifically', 'to', 'DNA', 'in', 'footprinting', 'reactions', 'is', 'known', 'to', 'result', 'in', 'overestimation', 'of', 'the', 'true', 'size', 'of', 'protein-binding', 'sequences.', 'Mobility', 'shift', 'assays', 'using', 'several', 'deletion', 'probes', 'of', 'elements', 'IL', 'and', '11]', 'were', 'therefore', 'used', 'ta', 'more', 'precisely', 'delineate', 'the', 'sequences', 'within', 'elements', 'II', '(which', 'footprints', 'as', 'a', '27-mer)', 'and', 'II', '(which', 'footprints', 'as', 'a', '28-mer)', 'required', 'for', 'PDGF-', 'inducible', 'binding.', 'Deletions', 'of', 'up', 'to', '7', 'nucleotides', 'at', 'the', '3’', 'end', 'of', 'element', 'II', 'do', 'not', 'alter', 'PDGF-inducibie', 'binding', '(Fig.', '5,', 'center).', 'In', 'contrast,', 'deletion', 'of', 'a', 'S-nucleotide', 'CCTTT', 'se-', 'quence', 'at', 'the', '5’', 'end', 'of', 'element', 'I,', 'or', '11', 'nucleotides', 'at', 'the', '3’', 'end', 'of', 'clement', 'I],', 'eliminates', 'PDGF-inducible', 'binding', '(Fig.', '5,', 'center).', 'These', 'data', 'suggest', 'that', 'PDGF-inducible', 'binding', 'to', 'element', '[I', 'requires', 'some', 'portion', 'of', 'the', '5’', 'CCTYT', 'sequence.', 'By', 'using', 'a', 'probe', 'with', 'smaller', "5'", 'and', '3’', 'deletions,', 'PDGF-', 'inducible', 'binding', 'to', 'element', 'If', 'is', 'shown', 'to', 'require', 'at', 'least', '15', 'ucleotides', '(Fig.', '5,', 'center;', 'compare', 'binding', 'ta', 'probe', '5D2/', 'D10,', 'a', '15-mer,', 'with', 'binding', 'to', 'unaltered', 'element', 'II', 'probe).', 'Deletion', 'of', '8', 'nucleotides', 'at', 'the', '5’', 'end', 'of', 'element', 'III,', 'or', '5', 'nucleotides', 'at', 'the', '3’', 'end', 'of', 'element', 'III,', 'eliminates', 'PDGF-', 'inducible', 'binding', 'to', 'element', 'IL', '(Fig.', '5,', 'bottom).', 'Deletion', 'of', '5', 'nucleotides', 'at', 'the', '5‘', 'end', 'of', 'element', 'ITT', 'reduces,', 'but', 'does', 'not', 'climinate,', 'PDGF-inducible', 'binding', 'to', 'element', 'IIE', '(Fig.', '5,', 'bot-', 'tom).', 'These', 'data', 'demonstrate', 'that', 'PDGF-inducible', 'binding', 'to', 'element', 'TI', 'is', 'diminished', 'or', 'eliminated', 'by', '5-nucleotide', 'dele-', 'tions', 'at', 'the', '5’', 'or', '3’', 'ends', 'of', 'element', 'ILL,', 'suggesting', 'that', 'PDGF-', 'inducible', 'binding', 'to', 'element', 'IIT', 'requires', 'at', 'least', '18', 'nucleo-', 'tides.', 'PDGF-inducible', 'binding', 'to', 'element', 'IU', 'is', 'alsa', 'iminated', 'by', 'an', '&-base', 'mutation', 'within', 'element', 'HI', '(Fig.', '5,', 'bottom).', '.', 'Sequence', 'comparison', 'revealed', 'no', 'known', 'transcription', 'fac-', 'tor-binding', 'sequences', 'closely', 'matching', 'the', 'minimal]', 'sizes', 'of', 'elements', 'II', 'and', '[I', 'determined', 'in', 'Fig.', '5.', 'In', 'particular,', 'neither', 'element', 'contains', 'sis-inducible', 'factor-binding', 'sequences', '(51).', 'we', ' ', ' ', 'o', ' ', '50673118']