['heterologous', 'ORF', 'of', 'the', 'same', 'size,', 'or', 'deleted,', 'it', 'was', 'almost', 'uniformly', 'skipped;', 'i.e.,', 'P4-', 'generated', 'pre-mRNAs', 'were', 'spliced', 'from', 'the', 'large', 'intron', 'donor', 'to', 'a', 'small', 'intron', 'acceptor.', 'The', 'exon', 'skipped', 'product', 'was', 'identified', 'by', 'Northern', 'analysis', 'and', 'an', 'RT-PCR', 'product', 'sequenced', 'to', 'identify', 'the', 'splice', 'junction.', 'We', 'detect', 'no', 'exon', 'skipped', 'product', 'from', 'wild-type', 'MVM.', '@', 'Skipping', 'in', 'response', 'to', 'exon', 'sequence', 'alteration', 'is', 'net', 'overcome', 'by', 'improvement', 'of', 'the', 'upstream', '(Py)n', 'tract.', 'This', 'is', 'in', 'contrast', 'to', 'the', 'effect', 'of', 'such', 'improvement', 'on', 'exon', 'skipping', 'due', 'to', 'small', 'intron', 'donor', 'deletion,', 'as', 'described', 'above.', 'Improvements', 'of', 'both', 'large', 'intron', 'donor', 'and', 'the', 'complete', '3’', 'splice', 'site', 'are', 'also', 'unable', 'to', 'overcome', 'exon', 'skipping', 'due', 'to', 'exon', 'sequence', 'alterations.', 'B.', 'Experimental', 'Design', 'and', 'Procedures', 'B.1.', 'Specific', 'Aim', '1:', 'Characterization', 'of', 'how', 'downstream', 'small', 'intron', 'sequences', 'facilitate', 'efficient', 'excision', 'of', 'the', 'upstream', 'large', 'intron', 'from', 'MVM', 'P4-generated', 'pre-mRNA', 'Efficient', 'excision', 'of', 'the', 'large', 'intron', 'from', 'MVM', 'P4-generated', 'pre-mRNA', 'is', 'dependent', 'upon', 'at', 'least', 'the', 'initial', 'presence', 'of', 'the', 'downstream', 'small', 'intron,', 'and', 'untypically,', 'elements', 'within', 'both', 'the', 'small', 'intron', 'donor', 'and', 'acceptor', 'sites', 'are', 'required.', 'Analyses', 'of', 'splicing', 'directly', 'upstream', 'of', 'internal', 'exons', 'in', 'multi-exon', 'pre-mRNAs', 'have', 'previously', 'shown', 'that', 'a', 'strong', 'downstream', 'donor', 'site', 'is', 'typically', 'sufficient', 'to', 'facilitate', 'upstream', 'splicing', '(13).', 'It', 'is', 'likely', 'that', 'the', 'facilitating', 'determinant', 'in', 'the', 'MVM', 'small', 'intron', 'may', 'be', 'more', 'complex', 'because', 'of', 'its', 'small', 'size', 'and', 'overlapping', 'nature,', 'which', 'may', 'engage', 'the', 'spliceosome', 'differently', 'than', 'larger', 'introns,', 'as', 'has', 'been', 'previously', 'suggested', '(26).', 'When', 'both', 'small', 'intron', 'donors', 'are', 'deleted,', 'P4-generated', 'pre-mRNAs', 'predominantly', 'skip', 'the', 'NS2-specific', 'exon;', 'the', 'large', 'intron', 'donor', 'at', 'nt', '514', 'is', 'joined', 'to', 'a', 'small', 'intron', 'acceptor.', 'This', 'exon', 'skipping', 'can', 'be', 'fully', 'suppressed', 'by', 'improvement', 'of', 'the', 'large', 'intron', '(Py)n', 'tract.', 'These', 'results', 'are', 'fully', 'consistent', 'with', 'current', 'models', 'of', 'exon', 'definition', '(26),', 'and', 'further', 'support', 'the', 'model', 'that', 'the', 'downstream', 'donors', 'somehow', 'facilitate', 'binding', 'of', 'essential', 'factors', '(most', 'likely', 'U2AF', 'or', 'PBP)', 'to', 'the', 'upstream', 'intron', '3’', 'splice', 'site.', 'We', 'will', 'pursue', 'how', 'the', 'small', 'intron', 'facilitates', 'excision', 'of', 'the', 'large', 'intron', 'both', 'genetically', 'and', 'biochemically.', 'B.1.a.', 'Genetic', 'characterization', 'As', 'discussed,', 'when', 'the', 'polypyrimidine', 'tract', '[(Py)n]', 'within', 'the', '3’', 'splice', 'site', 'of', 'the', 'upstream', 'large', 'intron', 'is', 'improved,', 'the', 'downstream', 'small', 'intron', 'is', 'no', 'longer', 'required', 'for', 'its', 'efficient', 'excision.', 'One', 'small', 'intron', 'element', 'required', 'for', 'efficient', 'excision', 'of', 'the', 'upstream', 'large', 'intron', 'is', 'the', 'small', 'intron', '(Py}n', 'tract', 'and', 'branch', 'point.', 'These', 'sequences', 'may', 'facilitate', 'efficient', 'excision', 'of', 'the', 'upstream', 'large', 'intron', 'because', 'either', 'a)', 'binding', 'of', 'factors', '(most', 'likely', 'U2AF,', 'but', 'perhaps', 'U2', 'itself)', 'to', 'the', 'small', 'intron', '3’', '(Py)n', 'tract', 'compensates', 'for', 'poor', 'binding', 'of', 'these', 'factors', 'to', 'the', 'upstream', 'large', 'intron', '3’', 'splice', 'site', 'during', 'the', 'splicing', 'process,', 'or', 'b)', 'that', 'U2AF', 'binding', 'to', 'the', 'small', 'intron', 'stabilizes', 'binding', 'of', 'U2', 'to', 'the', '3’', 'splice', 'site', 'of', 'the', 'large', 'intron.', 'Alternatively,', 'c)', 'binding', 'of', 'factors', 'to', 'the', 'small', 'intron', '3’', 'splice', 'site', 'may', 'be', 'required', 'merely', 'for', 'stable', 'binding', 'of', 'factors', 'to', 'the', 'small', 'intron', 'donors,', 'which', 'in', 'turn', 'stabilze', 'binding', 'to', 'upstream', '3’', 'splice', 'site', 'sequences.', 'We', 'will', 'first', 'attempt', 'to', 'resolve', 'these', 'alternatives', 'genetically.', 'If', 'binding', 'of', 'U2AF', 'to', 'the', 'small', 'intron', '(Py)n', 'tract', 'can', 'recruit', 'U2ZsnRNP', 'to', 'the', 'large', 'intron,', 'binding', 'of', 'U2AF', 'to', 'the', 'large', 'intron', '(Py)n', 'tract', 'may', 'be', 'unnecessary.', 'These', 'sequences', 'may', 'then', 'be', 'dispensable', 'for', 'efficient', 'excision', 'of', 'the', 'large', 'intron', 'in', 'the', 'presence', 'of', 'the', 'small', 'intron', '-', 'but', 'still', 'be', 'required', 'in', 'the', 'absence', 'of', 'small', 'intron', 'sequences.', 'We', 'have', 'constructed', 'mutants', 'in', 'which', 'the', 'large', 'intron', '(Py)n', 'tract', 'has', 'been', 'completely', 'abolished', 'by', 'site-directed', 'mutagenesis,', 'both', 'in', 'the', 'presence', 'or', 'absence', 'of', 'the', 'small', 'intron.', 'If', 'excision', 'of', 'the', '(Py}n-minus', 'large', 'intron', 'is', 'dependent', 'upon,', 'but', 'fully', 'complemented', 'by', 'the', 'downstream', 'small', 'intron,', 'it', 'suggests', 'that', 'U2', 'binding', 'to', 'the', 'large', 'intron', 'is', 'either', 'independent', 'of', 'U2AF,', 'or', 'recruited', 'by', 'U2AF', 'binding', 'to', 'the', 'small', 'intron', '(Py}n.', 'This', 'would', 'further', 'predict', 'that', 'alterations', 'specifically', 'in', 'the', 'small', 'intron', '(Py)n', 'would', 'fail', 'to', 'sustain', 'excision', 'of', 'the', '(Py)-minus', 'large', 'intron.', 'We', 'will', 'proceed', 'to', 'identify', 'those', 'signals', 'within', 'the', 'small', 'intron', 'that', 'complement', 'such', 'a', 'large', 'intron', '(Py)-minus', 'mutation', 'by', 'combining', 'the', '(Py)n-minus', 'large', 'intron', 'mutation', 'with', 'mutations', 'that', 'specifically', 'alter', 'only', 'the', 'small', 'intron', '(Py)n', 'tract,', 'the', 'branch', 'point,', 'or', 'both.', 'If', 'only', '(Py)n', 'tract', 'mutations', 'prevent', 'excision', 'of', 'the', '(Py)n-minus', 'large', 'intron,', 'it', 'is', 'then', 'likely', 'that', 'U2AF', 'binding', 'to', 'the', 'small', 'intron', 'can', 'recruit', 'U2', 'to', 'the', 'large', 'intron', 'branch', 'point', 'and', 'effect', 'excision.', 'If', 'the', '(Py)n-minus', '!arge', 'intron', 'is', 'not', 'excised', 'in', 'the', 'presence', 'of', 'the', 'small', 'intron', 'it', 'is', 'likely', 'that', 'U2AF', 'binding', 'to', 'the', 'large', 'intron', 'is', 'still', 'required,', 'and', 'implies', 'that', 'U2AF', 'and/or', 'U2', 'binding', 'to', 'the', 'small', '3b', ' ', '50697422']