[' ', ' ', 'CYTOTOXICITY', 'ASSESSMENT', 'OF', 'CIGARETTE', 'SMOKE', '181', 'smoke', 'and', 'culture', 'medium', 'at', 'an', 'approximate', 'rate', 'of', 'seven', 'cycles', 'per', 'minute.', 'Neutral', 'Red', 'Cytotoxicity', 'Assay', 'The', 'neutral', 'red', 'cytotoxicity', 'assay', 'determines', 'the', 'viability', 'of', 'a', 'cell', 'pop-', 'ulation', 'to', 'take', 'up', 'the', 'neutral', 'red', 'dye', 'in', 'cellular', 'lysosomes', 'in', 'an', 'energy', 'requiring', 'process.', 'Chemicals', 'utilized', 'in', 'the', 'neutral', 'red', 'cytotoxicity', 'assay', 'consisted', 'of', 'a', 'stock', 'solution', 'of', 'neutral', 'red', 'obtainable', 'from', 'Sigma', 'Chemical', '(St.', 'Louis,', 'MO,', 'USA)', '(Catalog', 'number', 'N2889).', 'The', 'wash/fix', 'solution', 'was', 'made', 'by', 'adding', '10', 'mL', 'formalin', 'to', '1', 'L', 'deionized', 'water.', 'The', 'solvent', 'for', 'extracting', 'the', 'neutral', 'red', 'taken', 'up', 'into', 'cells', 'was', 'made', 'by', 'adding', '10', 'mL', 'of', 'glacial', 'acetic', 'acid', 'to', '1', 'L', 'of', 'a', '50%', 'ethanol', 'solution.', 'The', 'neutral', 'red', 'assay', 'was', 'modified', 'from', 'a', 'method', 'described', 'by', 'Borenfreund', 'and', 'Puerner', '[11]', 'and', 'is', 'briefly', 'described', 'as', 'follows:', 'Cells', 'were', 'plated', 'out', 'into', 'T75', 'tissue', 'culture', 'flasks', 'at', 'a', 'density', 'of', '500,000', 'cells', 'per', 'flask.', 'Each', 'flask', 'contained', '20', 'mL', 'of', 'medium', 'supplemented', 'with', '1', 'M', 'Hepes', '(N-[2-hydroxyethyl]piperazirie-N’-(2-ethanesulfonic', 'acid])', 'buffer', 'to', 'give', 'a', 'final', 'concentration', 'of', 'Hepes', 'in', 'the', 'medium', 'of', '25', 'mM.', 'Cells', 'were', 'maintained', 'for.', 'approximately', '24', 'h', 'in', 'a', 'tissue', 'cul-', 'ture', 'incubator', 'at', '37°C', 'prior', 'to', 'and', 'after', 'exposure', 'to', 'mainstream', 'or', 'sidestream', 'cigarette', 'smoke.', 'Tissue', 'culture', 'medium', 'was', 'not', 'changed', 'after', 'cigarette', 'smoke', 'exposures.', 'The', 'cells', 'were', 'then', 'washed', 'gently', 'with', '20', 'mL', 'of', 'Hank’s', 'balanced', 'salt', 'solution', 'without', 'phenol', 'red', '(JRH', 'Biosciences,', 'Lenexa,', 'KS,', 'USA).', 'After', 'the', 'salt', 'solution', 'wash', 'was', 'removed,', '20', 'mL', 'of', 'a', 'working', 'solution', 'of', 'neutral', 'red', '(1.5', 'mL', 'of', 'neutral', 'red', 'stock', 'solution', 'to', '100', 'mL', 'of', "Ham's", 'F-12', 'or', 'Kaign’s', 'modified', 'F-12', 'tis-', 'sue', 'culture', 'medium', 'without', 'serum)', 'was', 'added', 'to', 'the', 'cells', 'in', 'the', 'tissue', 'culture', 'flash', 'and', 'incubated', 'for', '3', 'h', 'in', 'a', 'tissue', 'culture', 'incubator.', 'The', 'neutral', 'red', 'solution', 'was', 'then', 'aspirated', 'and', 'the', 'cells', 'were', 'quickly', 'fixed', 'with', '20', 'mL', 'of', 'the', 'wash/fix', 'solution.', 'The', 'wash/fix', 'solution', 'was', 'aspi-', 'rated', 'off', 'and', 'the', 'neutral', 'red', 'was', 'extracted', 'from', 'the', 'cells', 'by', 'adding', '20', 'mL', 'of', 'the', 'neutral', 'red', 'extraction', 'solvent', 'solution.', 'Aliquots', 'of', 'the', 'neutral', 'red', 'solution', 'from', 'each', 'flask', 'were', 'read', 'in', 'a', 'spectrophotometer', 'at', '540', 'nm', 'andthe', 'absorbance', 'recorded.', '~', 'Statistical', 'Analyses', 'Concentration-response', 'curves', 'were', 'compared', 'with', 'ANOVA', 'using', 'a', 'Scheffe’s', 'comparison', 'test', '[18]', 'at', 'a', '95%', 'confidence', 'level.', 'In', 'addition,', 'linear', 'regression', 'lines', 'of', 'probit', 'versus', 'the', 'log', 'concentration', 'were', 'con-', 'structed', 'from', 'the', 'concentration—response', 'curves', '[19-21].', 'The', 'regres-', 'sion', 'lines', 'were', 'used', 'to', 'calculate', 'EC,,', 'values', '(i.e.,', 'the', 'concentration', 'of', 'cigarette', 'smoke', 'required', 'to', 'elicit', 'a', '50%', 'decrease', 'in', 'the', 'neutral', 'red', 'response).', ' ', '9Z6L', 'BITES', ' ']