[' ', 'Sodium', 'Regulation', 'of', 'Angiotensinogen', 'mRNA', 'Expression', 'in', 'Rat', 'Kidney', 'Cortex', 'and', 'Meduila', 'Julie', 'R,', 'Ingelfinger,*$', 'Richard', 'E.', 'Pratt,”', 'Kristin', 'Eilison,*', 'and', 'Victor', 'J.', 'Dzau*', '*Molecular', 'and', 'Cellular', 'Vascular', 'Research', 'Laboratory,', 'Division', 'of', 'Vascular', 'Medicine', 'and', 'ithere', ' ', 'sis,', 'Brigham', 'and', 'Women’s', 'Hospital,', 'and', '{Division', 'of', 'Nephrology,', 'The', 'Children’s', 'Hospital,', 'Harvard', 'Medical', 'School,', 'Boston,', 'Mussachusetts', '02115', 'Abstract', 'Rat', 'liver', 'angiotensinogen', 'cDNA', '(pRang', '3)', 'and', 'mouse', 'renin', 'cDNA', '(pDD-1D2)', 'were', 'used', 'to', 'identify', 'angiotensinogen', 'and', 'renin', 'mRNA', 'sequences', 'in', 'rat', 'kidney', 'cortex', 'and', 'medulla', 'in', 'rats', 'on', 'high', 'and', 'low', 'salt', 'diet.', 'Angiotensinogen', 'mRNA', 'sequences', 'were', 'present', 'in', 'renal', 'cortex', 'and', 'meduila', 'in', 'apparently', 'equal', 'proportions,', 'whereas', 'renin', 'mRNA', 'sequences', 'were', 'found', 'pri-', 'marily', 'in', 'renal', 'cortex.', 'Average', 'relative', 'signal', 'of', 'rat', 'liver', 'to', 'whole', 'kidnes', '--ngiotensinogen', 'mRNA', 'was', '100:3.', 'Densitometric', 'anaiysiz', '<{', 'Vert', '‘ern', 'blots', 'demonstrated', 'that', 'renal', 'cortical', 'an-', 'ope', 'as', 'egy', 'mQNA', 'concentrations', 'increased', '3.5-fold', '(P', 'go', 'wet', 'Vand', 'meduila,', '1.5-fold', '(P', '<', '0.005)', 'on', 'low', 'sodium', 'com-', '»', '.d', 'with', 'high', 'sodium', 'diet,', 'whereas', 'renal', 'cortex', 'renin', 'mRNA', 'levels', 'increased', '6.8-fold', '(P', '<', '0.0005).', 'Dietary', 'sodium', 'did', 'not', 'significantly', 'influence', 'liver', 'angiotensinogen', 'mRNA', 'levels.', 'These', 'findings', 'provide', 'evidence', 'for', 'sodium', 'regulation', 'of', 'renal', 'renin', 'and', 'angiotensinogen', 'MRNA', 'expressions,', 'which', 'supports', 'poten-', 'tial', 'existence', 'of', 'an', 'intrarenally', 'reguiated', 'RAS', 'and', 'suggest', 'that', 'different', 'factors', 'regulate', 'renal', 'and', 'hepatic', 'angiotensinogen.', ' ', 'Introduction', 'An', 'enlarging', 'body', 'of', 'data', 'suggests', 'that', 'multiple', 'components', 'of', 'the', 'renin-angiotensin', 'system', 'may', 'be', 'found', 'locally', 'ina', 'num-', 'ber', 'of', 'tissues.', 'The', 'presence', 'of', 'renin,', 'angiotensin', '|', '(Al),', 'and', 'ATI', 'has', 'been', 'detected', 'biochemically', 'in', 'intact', 'kidney', 'as', 'well', 'as', 'in', 'cultured', 'kidney', 'cells', '(1,', '2).', 'Whether', 'or', 'not', 'angiotensinogen', 'is', 'produced', 'in', 'the', 'kidney', 'has', 'been', 'a', 'matter', 'of', 'some', 'debate.', 'While', 'some', 'investigators,', 'using', 'biochemical', 'assays,', 'have', 're-', 'ported', 'the', 'presence', 'of', 'angiotensinogen', 'within', 'the', 'kidney,', 'others', 'have', 'not', '(3-7).', 'Furthermore,', 'the', 'sites', 'in', 'which', 'angiotensinogen', 'has', 'been', 'detected', 'have', 'also', 'varied', '(3,', '6,', '7).', 'Since', 'the', 'first', 'report', 'by', 'Page', 'that', 'angiotensinogen', 'was', 're-', 'leased', 'by', 'liver', '(8),', 'it', 'has', 'generally', 'been', 'accepted', 'that', 'the', 'cir-', 'culation-bourne', 'substrate', 'is', 'rate', 'limiting', 'in', 'the', 'production', 'of', 'angiotensins.', 'However,', 'angiotensinogen', 'expression', 'has', 'been', 're-', 'cently', 'demonstrated', 'in', 'the', 'brain', '(9-12).', 'This', 'raises', 'the', 'question', 'as', 'to', 'whether', 'local', 'angiotensin', 'production', 'is', 'more', 'dependent', 'on', 'tissue', 'angiotensinogen', 'concentration.', 'If', 'angiotensinogen', 'is', 'present', 'in', 'the', 'kidney,', 'it', 'would', 'provide', 'a', 'means', 'of', 'local', 'and', 'rapid', 'production', 'of', 'angiotensin.', 'Because', 'the', 'renin-angiotensin', ' ', 'Address', 'correspondence', 'and', 'reprint', 'requests', 'to', 'Dr.', 'Ingelfinger', 'or', 'Dr.', 'Dzau,', 'Brigham', 'and', 'Women’s', 'Hospital,', '75', 'Francis', 'Street,', 'Boston,', 'MA', '02115.', 'Revered', 'for', 'publication', '17', 'June', '1986.', '1,', 'Abbrevation', 'used', 'in', 'this', 'paper:', 'Al,', 'angiotensin', 'I.', ' ', 'J.', 'Clin.', 'Invest.', '©', 'The', 'American', 'Society', 'for', 'Clinical', 'Investigation,', 'Inc.', '0021-9738/86/11/1311/05', '$1.00', 'Volume', '78,', 'November', '(986,', '1311-1315', 'system', 'is', 'intimatel,', 'invoived', 'in', 'renal', 'autoregulation,', 'an', 'in-', 'trarenal', 'source', 'of', 'igiotensinogen', 'could', 'potentially', 'facilitate', 'alterations', 'in', 'the', 'ac:ivity', 'of', 'tie', 'system', 'in', 'local', 'areas', 'independent', 'of', 'the', 'circulating', 'r-vin—angiotensin', 'levels.', 'In', 'the', 'present', 'ir', 'vestigation', 'we', 'used', 'a', 'full', 'length', 'CDNA', 'probe', 'to', 'mouse', 'renin', 'and', 'a', '530-base', 'cDNA', 'probe', 'to', 'rat', 'liver', 'angio-', 'tensinogen', 'to', 'iden:ify', 'mRNA', 'sequences', 'encoding', 'these', 'poly-', 'peptides', 'in', 'whole', 'rat', 'kidney.', 'We', 'studied', 'the', 'regional', 'distribution', 'of', 'renin', 'and', 'angictensinogen', 'mRNAs', 'in', 'the', 'kidney', 'and', 'ex-', 'amined', 'regional', 'responses', '70', 'sodium', 'intake.', 'Our', 'results', 'indi-', 'cated', 'that', 'the', 'rat', '|.idney', 'contains', 'angiotensinogen', 'mRNA', 'se-', 'quences', 'in', 'both', 'the', 'cortex', 'and', 'medulla,', 'and', 'that', 'low', 'sodium', 'diet', 'stimulated', 'ren<|', 'angiotensinogen', 'and', 'renin', 'gene', 'expressions', 'as', 'compared', 'with', 'high-sodiu', 'm', 'diet,', 'but', 'did', 'not', 'influence', 'hepatic', 'angiotensinogen', 'mRNA', 'level.', 'Methods', 'Animals.', 'Wistar-Kyo.o', 'rats', 'aged', '16', 'wk', 'were', 'obtained', 'from', 'the', 'Charles', 'River', 'Breeding', 'Laboratories,', 'Inc.', '(Wilmington,', 'MA)', 'and', 'housed', 'in', 'our', 'animal', 'care', 'facility', '\\.ntil', 'time', 'of', 'investigation.', 'A', 'total', 'of', '28', 'rats', 'were', 'put', 'oo', 'high', 'salt', '(n', '=', '14)', 'and', 'low', 'salt', 'diets', '(n', '=', '14)', '(see', 'below).', 'Diet,', 'At', 'baseline,', '.aimals', 'were', 'fed', 'standard', 'lab', 'chow', '(Ralston', 'Purina', 'Co.,', 'St.', 'Louis,', 'MOQ),', '[or', 'low/high', 'salt', 'studies', 'they', 'were', 'fed', 'chow', '(Teklad', 'Test', 'Diets,', 'Madison,', '1),', 'containing', '0.02', 'or', '3%', 'NaCl', '(wt/wt)', 'for', '2', 'wk,', 'In', 'low', 'salt', 'animals,', 'furosemide,', '|', 'mg', 'was', 'administered', 'subcutaneously', 'on', 'days', '|-3', 'to', 'induc«:', 'salt', 'depletion.', 'To', 'verify', 'dietary', 'condition,', 'urinary', 'sodium', 'concentratio.', '(Uy,.)', 'was', 'determined', 'on', 'bladder', 'urine', 'at', 'the', 'time', 'of', 'sacrifice.', 'Plasma', 'renin', 'con', '‘entratien.', 'In', 'rats', 'on', 'high', 'and', 'low', 'salt', 'diets,', 'plasma', 'was', 'collected', 'at', 'the', 'time', 'of', 'sacrifice', 'in', 'chilled', 'EDTA', 'mbes.', 'Plasma', 'renin', 'concentration', 'was', 'assayed', 'by', 'Al', 'generation', 'on', 'incubation', 'with', 'renin-free', 'plasma', 'frm', 'nephircetomized', 'dogs', 'at', '37°C', '(pH', '7.4)', 'as', 'de-', 'scribed', '(13).', 'Tissue', 'handling.', 'Kats', 'were', 'killed', 'by', 'rapid', 'decapitation', 'using', 'a', 'guil-', 'lotine.', 'Organs', 'were', 'snap-frozen', 'in', 'liquid', 'nitrogen', 'for', 'subsequent', 'study.', 'Renal', 'tissue', 'was', 'either', 'frozen', 'whole,', 'or', 'was', 'dissected', 'within', '3', 'min.', 'Quter', 'cortex', 'and', 'inner', 'medullary', 'stripe', 'were', 'separated', 'for', 'further', 'study.', 'Because', 'the', 'outer', 'm-clullary', 'stripe', 'may', 'contain', 'cortex,', 'this', 'portion', 'was', 'not', 'studied.', 'Isolation', 'of', 'totai', 'RNA.', 'Reaai', 'tissue', 'was', 'stored', 'at', '-70°C', 'until', 'ho-', 'mogenized', 'in', '4', 'M', 'guanidine', 'itiocyanate,', '0.5%', 'Na-N-lauryl', 'sarcosine,', '25', 'mM', 'Na', 'citrate,', 'ard', '0.1', 'M', 'beta-mercaptoethanol', '(14,', '15).', 'Homogenate', '(1', 'gm', 'tissue/10', 'mi', 'beta-mercaptoethanol)', 'was', 'appiied', 'to', '5', 'mi', 'of', 'aute-', 'claved', '5.7', 'M', 'CsCl,', 'and', '25', 'm4', 'Na', 'Acetate', '(pH', '5.5).', 'Preparations', 'were', 'subjected', 'to', 'ultracencrifugation', 'in', 'a', 'Ti', '70.1', 'rotor', '(Beckman', 'Instruments', 'Inc.,', 'Fullerton,', 'CA)', 'for', '16', 'h', 'al', '20°C', 'at', '35,000', 'rpm', '(relative', 'centrifugal', 'force', '=', '8.4', ' 10*', '2’,', 'and', 'tori', 'RNA', 'resuspended', 'in', '0.2', 'M', 'Na', 'Acetate', '(pH', '5.5),', 'rocked', 'ir', 'the', 'coid', 'tor', '1', 'h,', 'and', 'then', 'ethanoi-precipitated.', 'Total', 'RNA,', 'collect:', 'by', 'centrifugation', 'and', 'dissolved', 'in', 'sterile', 'H,0,', 'was', 'quantitated', 'by', 'absorbance', 'readings', 'at', '260', 'om', '(1', 'U', '=', '40', 'ug', 'RNA).', 'Desired', 'amount', 'of', 'RNA', 'was', 'aliquoted', 'for', 'future', 'use', 'and', 'stored', 'at', '~70°C,', 'Gel', 'electrophoresis', 'and', 'jvoridization', 'studies.', 'RNA', 'was', 'lyophilized,', 'denatured', 'with', 'glyoxal,', 'and', 'applied', 'to', '1.5%', 'agarose', 'gels.', 'Denaturing', 'mixture', 'consisted', '0:', '}.2', 'M', 'glyoxal,', '50%', 'vol/vol', 'dimethyl', 'sulfoxide,', 'and', '0.01', 'M', 'NaH,PO,', '(j:HE', '7.03', '(14);', '24', 'ul', 'was', 'used', 'for', '<100', 'ug', 'RNA,', 'and', 'dngictensinogen', 'mRNA', 'in', 'Renal', 'Tissue', '1341', ' ']