1. Domaine d'application
      Cette méthode permet la détermination de la teneur en vitamine B 6 dans les denrées et boissons destinées à l'homme.

 2. Définition
      La teneur en vitamine B 6 est le résultat, exprimé en mg/100 g, mg/100 ml ou mg/l de produit tel quel, obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Conventionnellement, ce résultat est exprimé en pyridoxol base.

 3. Principe
      Hydrolyse acide de l'échantillon à analyser (s'il contient de l'amidon) puis hydrolyse enzymatique afin d'obtenir la pyridoxamine, le pyridoxal et le pyridoxol sous forme libre. Traitements par l'acide glyoxylique, en présence d'ions ferreux Fe2+ comme catalyseur, afin de transformer la pyridoxamine en pyridoxal et par le borohydrure de sodium en milieu alcalin pour transformer le pyridoxal en pyridoxol. Dosage du pyridoxol par fluorométrie après isolement de ce composé par chromatographie liquide haute performance en phase inverse par appariement d'ions.

 4. Réactifs
      Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée est de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.

 4.1. Pyridoxamine dichlorhydrate (PM = 241,1) C8H14 N2 O2 Cl2.

 4.2. Pyridoxal chlorhydrate (PM = 203,6) C8 H10 NO3 Cl.

 4.3. Pyridoxol chlorhydrate (PM = 205,6) C8 H12 NO3 Cl.

 4.4. Acide sulfurique à 0,1 mol/l.

 4.5. Solution contenant 1 g/l de pyridoxamine base (PM = 168,2) dans l'acide sulfurique à 0,1 mol/l.

 4.6. Solution contenant 1 g/l de pyridoxal base (PM = 167,2) dans l'acide sulfurique à 0,1 mol/l.

 4.7. Solution contenant 1 g/l de pyridoxol base (PM = 169,2) dans l'acide sulfurique à 0,1 mol/l.
      Les solutions (4.5), (4.6) et (4.7) se conservent quatre semaines à + 4 °C à l'abri de la lumière.

 4.8. Solution d'acétate de sodium à 2,5 mol/l.

 4.9. Solution d'acétate de sodium à 0,05 mol/l et à pH 4,5 (le pH est ajusté à 4,5 à l'aide d'acide acétique glacial).

 4.10. Solution d'acide glyoxylique à 1 mol/l et pH 4,5 (dissoudre 4,70 g d'acide glyoxylique monohydrate dans environ 30 ml d'acétate de sodium à 2,5 mol/l ; ajuster à pH 4,5 avec la solution d'acétate de sodium à 2,5 mol/l. Compléter à 50 ml avec de l'eau distillée).

 4.11. Solution à 2 g/l de sulfate ferreux anhydre dans la solution d'acétate de sodium à 0,05 mol/l et de pH 4,5.

 4.12. Phosphatase acide de pomme de terre ou de germe de blé.

 4.13. Solution d'hydroxyde de sodium à 0,2 mol/l.

 4.14. Solution de borohydrure de sodium à 0,1 mol/l dans la solution (4.13).

 4.15. Acide acétique glacial.

 4.16. Acide orthophosphorique minimum 85 %.

 4.17. Heptane sulfonate de sodium.

 4.18. Octane sulfonate de sodium.

 4.19. Dihydrophosphate de potassium.

 4.20. Acétonitrile (qualité pour chromatographie).

4.21. Acide chlorhydrique à 1 mol/l.

 5. Appareillage
      Toutes les opérations analytiques doivent être réalisées avec de la verrerie brune ou, à défaut, à l'abri de la lumière solaire directe.

 5.1. Mixeur-broyeur.

 5.2. Etuve à 37 ù 3 °C.

 5.3. Membrane d'acétate de cellulose 0,45 mm.

 5.4. Bain d'eau ou autoclave.

 5.5. Appareil de chromatographie liquide haute performance avec détection par fluorométrie.

 5.6. Colonne contenant une phase inverse greffée de type octylsilaneMerck Lichrospher 60 RP Select B granulométrie 5 mm, exemple de phase stationnaire appropriée utilisée pour l'analyse interlaboratoire.

 (5 mm, longueur 15 à 25 cm et diamètre intérieur 4 mm), traitée pour la séparation des composés basiques.

 5.7. Précolonne contenant une phase inverse greffée de type octadécylsilaneMerck RP 18, exemple de phase stationnaire appropriée utilisée pour l'analyse interlaboratoire.

 (10 mm, longueur 0,4 cm et diamètre intérieur 0,4 cm) si nécessaire.

 6. Mode opératoire
   6.1. Préparation de l'échantillon pour essai.
   Homogénéiser l'échantillon après l'avoir broyé finement. Peser exactement environ M grammes (ou millilitres) de cet échantillon dans un erlenmeyer de 100 ml (M de l'ordre de 2,5 g si la teneur en vitamine B 6 dépasse 0,20 mg/100 g, de l'ordre de 5 g si la teneur en vitamine B 6 est inférieure à cette valeur). Ajouter 25 ml de solution d'acétate de sodium (4.9), 2,5 ml de solution d'acide glyoxylique (4.10), 400 ml de solution de sulfate ferreux (4.11) et 20 mg de phosphatase acide (4.12). Laisser incuber une nuit à 37 °C. Après refroidissement du mélange réactionnel, ajuster à 50 ml dans une fiole jaugée à l'aide d'eau distillée. Après agitation, centrifuger si nécessaire et filtrer. Prélever 5 ml du filtrat, y ajouter 5 ml de solution de borohydrure de sodium (4.14). Après agitation, filtrer sur membrane acétate de cellulose (5.3) et injecter.
   En cas d'interférence chromatographique due à l'excès de borohydrure de sodium, ajouter 4,5 ml de solution de borohydrure de sodium (au lieu de 5 ml) puis, après réaction, compléter par 0,5 ml d'acide acétique glacial (le pH est ainsi ramené à 4,5).
   En cas de difficulté lors de la filtration après l'étape d'hydrolyse enzymatique, due à la présence de quantité notable d'amidon dans l'échantillon à analyser, procéder à une hydrolyse acide avant le traitement enzymatique. Ajouter pour cela 45 ml d'eau à 50 °C à l'échantillon préalablement pesé dans un erlenmeyer de 250 ml. Homogénéiser et ajouter au minimum 5 ml d'acide chlorhydrique (4.21). Bien mélanger et mettre au bain d'eau à 100 °C (ou à l'autoclave à 120 °C, si nécessaire) pendant trente minutes. Après refroidissement, ajuster à pH 4,5 par addition d'acétate de sodium (4.8). Procéder ensuite au traitement par l'acide glyoxylique (4.10) et la phosphatase acide (4.12), puis par le borohydrure de sodium (4.14) comme indiqué ci-dessus (dans ce cas, le volume du milieu réactionnel sera ensuite ajusté à 100 ml dans une fiole jaugée (et non à 50 ml, comme dans le cas général) à l'aide d'eau distillée.

 6.2. Solutions témoins de pyridoxol (à préparer extemporanément).
   Faire une dilution au 1/100 dans l'eau distillée de la solution mère de pyridoxol (4.7). Faire des dilutions de cette solution au 1/100, 1/20 et 1/10 dans l'eau distillée pour obtenir des solutions témoins respectivement à 0,10 mg/ml, 0,50 m/ml et 1,00 m/ml. Filtrer ces solutions sur membrane acétate de cellulose (5.3) et injecter.

 6.3. Conditions chromatographiques.
   Phases mobiles (au choix) :

 A
         Acétonitrile 4 % (4.20), solution de dihydrophosphate de potassium (4.19) à 0,05 mol/l contenant de l'heptane sulfonate de sodium (4.7) à 0,5.10-3 mol/l (96 %). Le pH est ajusté à 2,5 à l'aide d'acide orthophosphorique (4.16) ;

 B
         Acétonitrile 4 % (4.20), solution de dihydrophosphate de potassium (4.19) à 0,05 mol/l contenant de l'octane sulfonate de sodium (4.18) à 0,3.10-3 mol/l (96 %). Le pH est ajusté à 2,5 à l'aide d'acide orthophosphorique (4.16) ;
   Débit de la phase mobile : 0,7 à 1 ml par minute.
   Détection par fluorescence : longueur d'onde d'excitation :

 290 nm ; longueur d'onde d'émission : 395 nm.
   Volume injecté : 20 micro l à 100 micro l.

 6.4. Taux de recouvrement.
   Broyer et homogénéiser environ 30 g de l'échantillon à analyser. Les répartir en quatre séries (0, 1, 2, 3) de trois échantillons exactement pesés. Suivre le protocole habituel (6.1) pour les trois échantillons de la série 0. En ce qui concerne les autres séries d'échantillons, ajouter, avant de procéder à l'incubation à 37 °C (voir 6.1) :
   50 micro l de la solution de pyridoxamine (4.5) dans les trois échantillons de la série 1 ;
   50 micro l de la solution de pyridoxal (4.6) dans les trois échantillons de la série 2 ;
   50 micro l de la solution de pyridoxol (4.7) dans les trois échantillons de la série 3, puis suivre le protocole habituel (6.1).
   Le taux de recouvrement obtenu pour chaque échantillon d'une même série est donné par la relation :

 ti =  xi - k Mi 

zi

 dans laquelle :

 i
      représente le numéro de la série : 1 (addition de pyridoxamine), 2 (addition de pyridoxal), 3 (addition de pyridoxol) ;

 k
      la valeur moyenne, pour les trois échantillons de la série 0, du rapport entre la concentration en pyridoxol (en micro g/ml) présent dans la solution injectée dans le chromatographe et le poids (en g) de la prise d'essai de l'échantillon ;

 xi
      la concentration en pyridoxol (en micro g/ml) présent dans la solution injectée dans le chromatographe, obtenue pour les échantillons de la série i ;

 zi
      la concentration de pyridoxol (en micro g/ml) présent dans la solution injectée dans le chromatographe, résultant de la transformation des différentes formes de vitamine B 6 ajoutée, en supposant que les taux de transformation pyridoxamine/pyridoxol et pyridoxal/pyridoxol sont égaux à 100 % (z1 = 0,503 micro g/ml, z2 = 0,506 micro g/ml, z3 = 0,500 micro g/ml).
   Le taux de recouvrement de la méthode pour l'aliment étudié est la valeur moyenne obtenue à partir des neuf taux de recouvrement calculés. Il est supérieur à 90 % pour les différents aliments étudiés lors de l'analyse interlaboratoire dont les résultats sont donnés en annexe. En cas de dosage de vitamine B 6 dans des aliments de matrices différentes, le taux de recouvrement de la méthode doit être préalablement mesuré.

 7. Expression des résultats
   7.1. Mode de calcul et formule.
   Soit x la quantité de pyridoxol (exprimée en micro g) contenue dans 1 ml de la solution injectée dans le chromatographe (valeur obtenue à l'aide de la courbe des témoins) et M la prise d'essai (en g). La teneur en vitamine B 6 de l'échantillon à analyser (exprimée en mg/100 g de pyridoxol base) est donnée par la formule :
 10 x 

 M
   Nota. - Si l'échantillon à analyser est soumis initialement à une hydrolyse acide, la formule à appliquer devient :
 20 x 

 M

 7.2. Fidélité.
   Un essai interlaboratoire organisé par la commission générale d'unification des méthodes d'analyses a été réalisé par douze laboratoires. Les résultats statistiques présentés dans le tableau en annexe ont été déterminés selon la norme NF ISO 5725.

 7.2.1. Répétabilité.
         La différence absolue entre deux résultats d'essais individuels et indépendants obtenus dans le même laboratoire, par le même opérateur utilisant le même appareillage et dans un court intervalle de temps, ne doit pas être supérieure aux valeurs de répétabilité mentionnées dans le tableau de résultats statistiques en annexe.

 7.2.2. Reproductibilité.
         La différence absolue entre deux résultats d'essais individuels obtenus dans des laboratoires différents, par des opérateurs différents, utilisant des appareillages différents, ne doit pas être supérieure aux valeurs de reproductibilité mentionnées dans le tableau de résultats statistiques suivant.

 7. Résultats statistiques de l'essai interlaboratoire
   Tableau non reproduit
   P P : petit pot pour bébé ; BIS :

 biscuit ; CE B : céréale B ; LEV : levure ; A E : aliment entéral ; P C : poudre chocolatée ; CE A : céréale A ; L P : lait en poudre.