1. Domaine d'application
      Cette méthode permet la détermination de la teneur en vitamine B 2 dans les denrées et boissons destinées à l'homme.
   Le taux moyen de recouvrement de cette méthode est toujours supérieur à 90 %, quel que soit l'aliment analysé, sauf pour les aliments contenant du chocolat. Lorsque le taux moyen de recouvrement est inférieur à 90 %, le déterminer pour chaque analyse et rendre un résultat corrigé.

 2. Définition
      La teneur en vitamine B 2 est le résultat, exprimé en mg/100 g, mg/100 ml ou mg/l de produit tel quel, obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Conventionnellement, ce résultat est exprimé en riboflavine base.

 3. Principe
      Extraction de la vitamine B 2 (riboflavine) par hydrolyses acide et enzymatique et dosage de ce composé par fluorométrie après isolement par chromatographie liquide haute performance en phase inverse.

 4. Réactifs
      Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée est de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.

 4.1. Solution d'acide chlorhydrique à environ 0,1 mol/l.

 4.2. Solution d'acétate de sodium à 2,5 mol/l.

 4.3. -amylase.

 4.4. Takadiastase.

 4.5. Méthanol (qualité pour chromatographie).

 4.6. Solution d'acétate de sodium à 0,05 mol/l.

 4.7. Vitamine B 2 (riboflavine) C17 H20 N4 O6.

 4.8. Solution d'acide acétique à 0,02 mol/l.

 4.9. Solution mère de vitamine B 2 (PM = 376,4) à 0,1 mg/ml. Peser exactement environ 50 mg de riboflavine dans un erlenmeyer de 500 ml. Ajouter 400 ml d'acide acétique (4.8). Agiter à l'aide d'un agitateur magnétique chauffant jusqu'à dissolution de la vitamine B 2 (environ 1 heure). Refroidir la solution et amener le pH à 4,5 avec la solution d'acétate de sodium (4.2). Transvaser dans une fiole jaugée de 500 ml et ajuster avec de l'eau distillée.

 5. Appareillage
      Toutes les opérations analytiques doivent être réalisées avec de la verrerie brune ou, à défaut, à l'abri de la lumière solaire directe.

 5.1. Mixeur-broyeur.

 5.2. Bain d'eau.

 5.3. pH-mètre.

 5.4. Etuve à 37  3 °C.

 5.5. Agitateur magnétique chauffant.

 5.6. Membrane d'acétate de cellulose 0,45 micro m.

 5.7. Appareil de chromatographie liquide haute performance avec détection par fluorimétrie.

 5.8. Colonne contenant une phase inverse greffée de type octadécylsilane (5 micro m, longueur 15 à 30 cm et diamètre intérieur 4 mm) ou une phase inverse greffée de type octylsilane (5 micro m, longueur 15 à 30 cm et diamètre intérieur 4 mm), traitée pour la séparation des composés basiques.

6. Mode opératoire
   6.1. Préparation de l'échantillon pour essai.
   Homogénéiser l'échantillon après l'avoir broyé finement (si nécessaire). Peser exactement environ M grammes (ou millilitres) d'échantillon dans un erlenmeyer de 250 ml (M de l'ordre de 5 grammes pour un échantillon contenant approximativement 0,8 mg/100 g de vitamine B 2). Ajouter 65 ml de la solution d'acide chlorhydrique (4.1) et mettre au bain d'eau à 100 °C pendant trente minutes. Refroidir et ajuster à pH 4,5 par addition de solution d'acétate de sodium (4.2). Ajouter ensuite 50 mg de -amylase et 500 mg de takadiastase (4.4). Agiter. Mettre à l'étuve à 37 °C pendant une nuit. Transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de 125 ml et ajuster avec de l'eau distillée. Filtrer le surnageant (solution à injecter dans le chromatographe).

 6.2. Préparation des témoins.
   Faire une dilution au 1/20 avec de l'eau distillée à partir de la solution mère (4.9). Puis faire trois dilutions au 1/25, 1/10 et 1/5 à partir de la solution précédente. Filtrer chaque solution témoin sur une membrane d'acétate de cellulose (5.6) (solutions témoins à injecter dans le chromatographe contenant respectivement 0,20 micro g/ml, 0,50 micro g/ml et 1,00 micro g/ml de riboflavine).

 6.3. Conditions chromatographiques.
   Phase mobile : mélange 30:70 (v/v) de méthanol (4.5) et de solution d'acétate de sodium (4.6) (ces proportions peuvent éventuellement être modifiées si nécessaire).
   Débit de la phase mobile : 0,7 à 1 ml par minute.
   Détection par fluorescence : longueur d'onde d'excitation :

 422 nm ; longueur d'onde d'émission : 522 nm.
   Volume injecté : 20 micro l à 100 micro l.

 6.4. Taux de recouvrement.
   Pour l'aliment étudié, peser exactement deux séries de deux échantillons. Analyser selon le mode opératoire (6.1) les deux échantillons de la première série (échantillons 1 et 2). Dans les deux échantillons de la deuxième série (échantillons 3 et 4), ajouter une certaine quantité de riboflavine avant de procéder à l'hydrolyse acide, puis procéder à l'analyse selon (6.1). Le taux de recouvrement moyen de la méthode (t) est donné par la relation

 t =  2 (x3 + x4) - (x1/M1 + x2/M2) (M3 + M4) 

 4z

 dans laquelle :

 M1, M2, M3 et M4 sont les masses (en g) des prises d'essai des différents échantillons, x1, x2, x3 et x4 sont les quantités de vitamine, exprimées en micro g/ml de riboflavine, dans les différentes solutions injectées,

 et z est la quantité de riboflavine ajoutée (en micro g/ml) présente dans les solutions injectées pour les échantillons 3 et 4.
   Nota. - Le taux moyen de recouvrement de cette méthode est toujours supérieur à 90 %, quel que soit l'aliment analysé, sauf pour les aliments contenant du chocolat. Dans ce dernier cas, le taux de recouvrement est beaucoup plus faible et doit être déterminé pour chaque analyse. Il est possible d'utiliser HCl 0,5 N pour l'hydrolyse.

 7. Expression des résultats
   7.1. Mode de calcul et formule.
   Soit x la quantité de vitamine B 2 (riboflavine) (exprimée en micro g) contenue dans 1 ml de la solution injectée dans le chromatographe (valeur obtenue à l'aide de la courbe d'étalonnage) et M la prise d'essai (en g). La teneur en vitamine de l'échantillon à analyser (exprimée en mg de riboflavine pour 100 g ou pour 100 ml) est donnée par la relation :
 12,5 x 

 M

 7.2. Fidélité.
   Un essai interlaboratoire organisé par la commission générale d'unification des méthodes d'analyses a été réalisé par 11 laboratoires. Les résultats statistiques présentés dans le tableau en annexe ont été déterminés selon la norme NF ISO 5725.

 7.2.1. Répétabilité.
         La différence absolue entre deux résultats d'essais individuels et indépendants, obtenus dans le même laboratoire, par le même opérateur utilisant le même appareillage et dans un court intervalle de temps, ne doit pas être supérieure aux valeurs de répétabilité mentionnées dans le tableau de résultats statistiques en annexe.

 7.2.2. Reproductibilité.
         La différence absolue entre deux résultats d'essais individuels obtenus dans des laboratoires différents, par des opérateurs différents, utilisant des appareillages différents, ne doit pas être supérieure aux valeurs de reproductibilité mentionnées dans le tableau de résultats statistiques suivant.

 8. Résultats statistiques de l'essai interlaboratoire
   Tableau non reproduit
   A E : aliment entéral ; P P : petit pot pour bébé ; B C : barres de céréales ; F F : farine de fruits ; P C :

 poudre chocolatée ; L P : lait en poudre ; CE : céréales ; LEV :

 levure ; C A : complément alimentaire.