PRINCIPE 

    La détermination de l'activité anticholinestérasique des extraits benzéniques du vin ou du jus de raisin est réalisée par la méthode colorimétrique d'Hestrin. 

    L'acétylcholine réagit avec l'hydroxylamine pour former de l'acide hydroxamique qui, en présence d'ion ferrique, donne un complexe coloré en rouge. 

    En présence de la pseudo cholinestérase du sérum qui hydrolyse l'acétylcholine, cette réaction ne se produit pas. 

    En présence d'un composé organophosphoré inhibiteur de l'enzyme, l'hydrolyse de l'acétylcholine ne se produit pas et la réaction est par suite possible. 

    L'inhibition du volume précis de sérum sanguin utilisé dans la technique étant obtenue par des quantités limitées de chacun des insecticides organophosphorés, la méthode réalisée à partir d'une prise d'essai primitive de 10 ml de vin ou de jus de raisin, subdivisée en deux essais différents correspondant à l'équivalent de 4 et 2 ml de boisson, permet d'apprécier soit : 

       L'absence d'une dose supérieure à 0,05 mg/l d'insecticide          organophosphoré si la réaction est négative ; 

       La possibilité d'une dose supérieure à 0,25 mg/l d'insecticide          organophosphoré si la réaction est positive ; 

       Enfin, la teneur réelle lorsque l'insecticide est identifié          par une technique exécutée séparément. 

                              MATERIEL 

    Ampoule à décantation de 125 ml. 

    Bain-marie bouillant. 

    Tube à essai de 25 ml rodage émeri. 

    Bain-marie à 37,5° C. 

    Spectrophotomètre pour mesures dans le visible. 

                          REACTIFS NECESSAIRES 

    a) Benzène pur redistillé. 

    b) Solution tampon : 

       12,52 g de Na2, HPO6, 7 OH8 ou 16,7 g de Na2 HPO4 à 12 OH2.

       2,72 g de KH2, PO4. 

       Eau distillée Q. S. 1 litre. 

       Le pH doit être égal à 7,2. 

    c) Solution de brome : 

       0,4 ml de solution d'eau de brome saturée. 

       Eau distillée Q. S. P. 100 ml. 

    d) Solution de pseudo-cholinestérase : 

       2 ml de sérum sanguin. 

       Tampon Q. S. P. 25 ml. 

    e) Solution acétylcholine : 

       0,138 g chlorhydrate d'acétylcholine. 

       Tampon Q. S. P. 100 ml. 

    f) Solution alcaline d'hydroxylamine : 

       1. Solution de chlorhydrate d'hydroxylamine : 

          13,9 NH2, OH HC1. 

          Eau distillée Q. S. P. 100 ml.

       2. Solution de soude : 

          14 g Na OH. 

          Eau distillée Q. S. P. 100 ml. 

             Mélanger les solutions 1 et 2 à parties égales. 

    g) Solution d'acide trichloracétique : 

       10 g d'acide trichloracétique.

       30 ml d'acide chlorhydrique pur. 

       70 ml d'eau distillée.

    h) Solution de perchlorure de fer : 

       10 g de Fe Cl3, 6 OH2 (ou 22,4 ml de solution Codex). 

       Acide chlorhydrique 0,1 N Q. S. P. 100 ml.

                             MODE OPERATOIRE 

                                Extraction 

    Dans une ampoule à décantation de 125 ml, introduire : 

       10 ml de vin ou de jus de raisin ; 

       20 ml de benzène. 

    Agitez modérément pendant cinq minutes. Laissez reposer. Agitez à nouveau et laissez reposer jusqu'à complète séparation des deux phases. Centrifugez les extraits si une légère émulsion persiste. Vidangez le vin ou le jus de raisin. Décantez la phase benzénique par l'orifice supérieur de l'ampoule dans un petit bécher sec. Prélevez respectivement 8 et 4 ml de l'extrait benzénique et introduisez-les dans deux tubes à essai à rodage émeri. Evaporez juste à sec au bain-marie sous un courant d'air froid projeté au niveau du solvant au moyen d'une canne de verre. 

                         Dosage colorimétrique 

    Dans une série de tubes à essai à rodage émeri numérotés, introduisez : 
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 :                    :     0     :
 :                    :   Tube    :
 :                    :  témoin   :
 :                    :-----------:
 : Eau distillée ..   :   1,8 ml  :
 : Eau de brome ..    :   0,2 ml  :
 : Solution           :           :
 : tampon ..          :   7   ml  :
 : Solution           :           :
 : cholinestérase ..  :   0   ml  :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     1     :
 :                    :  Minimum  :
 :                    :-----------:
 : Eau distillée ..   :   1,8 ml  :
 : Eau de brome ..    :   0,2 ml  :
 : Solution           :           :
 : tampon ..          :   2   ml  :
 : Solution           :           :
 : cholinestérase ..  :   2   ml  :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     2     :
 :                    :  Maximum  :
 :                    :-----------:
 : Eau distillée ..   :   1,8 ml  :
 : Eau de brome ..    :   0,2 ml  :
 : Solution           :           :
 : tampon ..          :   4   ml  :
 : Solution           :           :
 : cholinestérase ..  :   0   ml  :
 :                    :           :
 :================================:

 :================================:
 :                    :     3     :
 :                    : Résidu de :
 :                    :  4 ml de  :
 :                    :  boisson  :
 :                    :-----------:
 : Eau distillée ..   :   1,8 ml  :
 : Eau de brome ..    :   0,2 ml  :
 : Solution           :           :
 : tampon ..          :   2   ml  :
 : Solution           :           :
 : cholinestérase ..  :   2   ml  :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     4     :
 :                    : Résidu de :
 :                    :  2 ml de  :
 :                    :  boisson  :
 :                    :-----------:
 : Eau distillée ..   :   1,8 ml  :
 : Eau de brome ..    :   0,2 ml  :
 : Solution           :           :
 : tampon ..          :   2   ml  :
 : Solution           :           :
 : cholinestérase ..  :   2   ml  :
 :                    :           :
 :================================:
          Portez au bain-marie à 37,5° pendant trente minutes. 
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 :                    :     0     :
 :                    :   Tube    :
 :                    :  témoin   :
 :                    :-----------:
 : Solution           :           :
 : acétylcholine ..   :   0   ml  :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     1     :
 :                    :  Minimum  :
 :                    :-----------:
 : Solution           :           :
 : acétycholine ..    :   3   ml  :
 :                    :           :
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 :                    :     2     :
 :                    :  Maximum  :
 :                    :-----------:
 : Solution           :           :
 : acétylcholine ..   :   3   ml  :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     3     :
 :                    : Résidu de :
 :                    :  4 ml de  :
 :                    :  boisson  :
 :                    :-----------:
 : Solution           :           :
 : acétylcholine ..   :   3   ml  :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     4     :
 :                    : Résidu de :
 :                    :  2 ml de  :
 :                    :  boisson  :
 :                    :-----------:
 : Solution           :           :
 : acétylcholine ..   :   3   ml  :
 :                    :           :
 :================================:
           Portez au bain-marie à 37,5° pendant trente minutes. 
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 :                    :     0     :
 :                    :   Tube    :
 :                    :  témoin   :
 :                    :-----------:
 : Solution alcaline  :           :
 : d'hydroxylamine .. :   6   ml  :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     1     :
 :                    :  Minimum  :
 :                    :-----------:
 : Solution alcaline  :           :
 : d'hydroxylamine .. :   6   ml  :
 :                    :           :
 :================================:

 :================================:
 :                    :     2     :
 :                    :  Maximum  :
 :                    :-----------:
 : Solution alcaline  :           :
 : d'hydroxylamine .. :   6   ml  :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     3     :
 :                    : Résidu de :
 :                    :  4 ml de  :
 :                    :  boisson  :
 :                    :-----------:
 : Solution alcaline  :           :
 : d'hydroxylamine .. :   6   ml  :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     4     :
 :                    : Résidu de :
 :                    :  2 ml de  :
 :                    :  boisson  :
 :                    :-----------:
 : Solution alcaline  :           :
 : d'hydroxylamine .. :   6   ml  :
 :                    :           :
 :================================:
                          Attendre une minute. 
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 :                    :     0     :
 :                    :   Tube    :
 :                    :  témoin   :
 :                    :-----------:
 : Solution acide     :           :
 : trichloracétique ..:   3   ml  :
 : Solution           :           :
 : Fe Cl2 ...         :   3   ml  :
 :                    :           :
 :================================:

 :================================:
 :                    :     1     :
 :                    :  Minimum  :
 :                    :-----------:
 : Solution acide     :           :
 : trichloracétique ..:   3   ml  :
 : Solution           :           :
 : Fe Cl2 ...         :   3   ml  :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     2     :
 :                    :  Maximum  :
 :                    :-----------:
 : Solution acide     :           :
 : trichloracétique ..:   3   ml  :
 : Solution           :           :
 : Fe Cl2 ...         :   3   ml  :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     3     :
 :                    : Résidu de :
 :                    :  4 ml de  :
 :                    :  boisson  :
 :                    :-----------:
 : Solution acide     :           :
 : trichloracétique ..:   3   ml  :
 : Solution           :           :
 : Fe Cl2 ...         :   3   ml  :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     4     :
 :                    : Résidu de :
 :                    :  2 ml de  :
 :                    :  boisson  :
 :                    :-----------:
 : Solution acide     :           :
 : trichloracétique ..:   3   ml  :
 : Solution           :           :
 : Fe Cl2 ...         :   3   ml  :
 :                    :           :
 :================================:

     Filtrez et mesurez la densité optique à 540 mn dans des cuves de 1 cm d'épaisseur et par rapport au témoin tube n° 0.

 :================================:
 :                    :     0     :
 :                    :   Tube    :
 :                    :  témoin   :
 :                    :-----------:
 : Densité optique    :           :
 : lue ..             :   0,00    :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     1     :
 :                    :  Minimum  :
 :                    :-----------:
 : Densité optique    :           :
 : lue ..             :   Dm      :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     2     :
 :                    :  Maximum  :
 :                    :-----------:
 : Densité optique    :           :
 : lue ..             :   DM      :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     3     :
 :                    : Résidu de :
 :                    :  4 ml de  :
 :                    :  boisson  :
 :                    :-----------:
 : Densité optique    :           :
 : lue ..             :   Dx4     :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     4     :
 :                    : Résidu de :
 :                    :  2 ml de  :
 :                    :  boisson  :
 :                    :-----------:
 : Densité optique    :           :
 : lue ..             :   Dx2     :
 :                    :           :
 :================================:

 :================================:
 :                    :     0     :
 :                    :   Tube    :
 :                    :  témoin   :
 :                    :-----------:
 : Pourcentage        :           :
 : d'inhibition ..    :           :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     1     :
 :                    :  Minimum  :
 :                    :-----------:
 : Pourcentage        :           :
 : d'inhibition ..    :  0 p. 100 :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     2     :
 :                    :  Maximum  :
 :                    :-----------:
 : Pourcentage        :           :
 : d'inhibition ..    :100 p. 100 :
 :                    :           :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     3     :
 :                    : Résidu de :
 :                    :  4 ml de  :
 :                    :  boisson  :
 :               :----------------:
 : Pourcentage   : (Dx4 - Dm) 100 :
 : d'inhibition  : -------------- :
 :               :    (DM - Dm)   :
 :================================:
 :================================:
 :                    :     4     :
 :                    : Résidu de :
 :                    :  2 ml de  :
 :                    :  boisson  :
 :               :----------------:
 : Pourcentage   : (Dx2 - Dm) 100 :
 : d'inhibition  : -------------- :
 :               :    (DM - Dm)   :
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                        RESULTATS 

    1. Les densités optiques Dx 4 et Dx 2 indiquent une inhibition nulle ou inférieure à 5 p. 100.

    On peut considérer globalement que ces résultats indiquent que les prises d'essai renferment moins de 0,2 micron de gramme d'insecticide organophosphoré.

    Nous avons noté les valeurs suivantes : 

       0,05 micron de gramme de phosphamidon.

       0,14 micron de gramme de parathion.

       0,15 micron de gramme de malathion.

    En tenant compte de l'essai sur 4 ml de boisson, ce résultat exprime l'absence d'insecticide organophosphoré à des doses supérieures à 0,05 mg/l.

   2. Les densités optiques indiquent une inhibition supérieure à 90 p. 100.

    S'il est possible de donner une dose moyenne minimale d'insecticide organophosphoré pour la limite inférieure de sensibilité de la méthode, la diversité des produits ne permet pas de donner une dose moyenne pour une inhibition supérieure ou égale à 90 p. 100. Cette dose sera, par exemple, de : 

      0,5 micron de gramme pour le parathion. 

      5 microns de grammes pour le phosphamidon. 

     12 microns de grammes pour le malathion. 

    La définition de la dose réelle demande une identification parallèle du produit actif. 

    Dans le cas des quatre produits cités, si Dx 2 montre une inhibition supérieure à 90 p. 100, la teneur sera respectivement supérieure à 0,25-2,6 et 6 mg/kg. 

    Dans l'ignorance de la qualité de l'insecticide organophosphoré présent, ce résultat pourra être interprété comme l'indication d'une teneur en insecticide organophosphoré supérieure à 0,25 mg/kg. 

    3. L'une ou les deux mesures Dx 4 et Dx 2 indiquent les inhibitions comprises entre 5 et 90 p. 100. 

    L'interprétation du résultat dépend également ici de la connaissance du produit actif décelé. 

    Les deux volumes 2 et 4 ml ont été choisis de manière à augmenter les chances de se trouver, dans l'un des cas, au voisinage de 50 p. 100 d'inhibition. 

    L'inhibition 50 p. 100 est obtenue respectivement avec : 

       0,3  micron de gramme de parathion. 

       0,65 micron de gramme de phosphamidon. 

     1,8  microns de grammes de malathion. 

    Après identification du produit existant, sa teneur sera déduite de la droite : pourcentage d'inhibition (en unités probits) par rapport aux logarithmes des doses précisées expérimentalement pour cet insecticide.