5. Tests d'immunofluorescence.
   5.1. Utiliser un antisérum d'une souche connue C. m. subsp. sepedonicus ATCC 33113 (NCPPB 2137) ou NCPPB 2140. Il devra avoir un titre d'immunofluorescence d'au moins 1 : 600. Inclure du tampon au phosphate sur la lame de test à titre de témoin, pour déterminer si l'immunoglobuline anti-lapin conjuguée avec l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) se combine non spécifiquement avec les cellules bactériennes. Le C. m. subsp. sepedonicus <ATCC 33113 (NCPPB 2137), NCPPB 2140> devrait être utilisé comme témoin antigène homologue sur une lame séparée. Du tissu naturellement infecté (conservé par lyophilisation ou congélation à - 20 °C) devrait, dans la mesure du possible, être utilisé à titre de témoin similaire sur la même lame (figure 2).
   5.2. Procédure.
   5.2.1. Préparer trois dilutions successives au dixième (101, 102 et 103) de l'extrait concentré final dans l'eau distillée (figure 1).    5.2.2. Déposer à la pipette dans les puits d'une lame multifenêtre un volume standard suffisant pour couvrir le puits (environ 25 micro l) de chaque dilution de l'extrait concentré ou de la suspension de C. m. subsp. sepedonicus (environ 106 cellules/ml), comme il est indiqué sur la figure 1.
   Figure 1 : Lame de l'échantillon et du puits témoin au tampon phosphate (cliché non reproduit, voir au Journal officiel).
   Figure 2 : Lame de témoin positif (cliché non reproduit, voir au Journal officiel).
   5.2.3. Laisser sécher à l'air à une température d'environ 37 °C et fixer avec de l'éthanol à 95 p. 100 ou en passant à la flamme.
   5.2.4 Couvrir les puits appropriés, comme indiqué sur la figure 1, avec de l'antisérum de C. m. subsp. sepedonicus dilué dans les proportions recommandées (dilution de travail) dans un tampon au phosphate 0,01 M de pH 7,2 (appendice 2) (utiliser un tampon au phosphate à titre de témoin pour le FITC). La dilution de travail de l'antisérum devrait être approximativement égale à la moitié du titre d'immunofluorescence. S'il faut inclure d'autres dilutions de l'antisérum, il y a lieu de préparer des lames séparées pour chaque dilution à utiliser.
   5.2.5. Laisser incuber trente minutes en chambre humide à température ambiante.
   5.2.6 Rincer soigneusement avec le tampon au phosphate 0,01 M de pH 7,2. Faire trois lavages successifs de cinq minutes avec le tampon de phosphate 0,01 M de pH 7,2. Changer la solution de lavage à chaque fois.
   5.2.7. Enlever soigneusement toute moisissure excessive.
   5.2.8. Couvrir chaque puits avec du conjugué FITC à la même dilution utilisée lors du titrage et laisser incuber trente minutes en chambre noire humide à température ambiante.
   5.2.9. Rincer et laver comme précédemment.
   5.2.10. Appliquer environ 5 à 10 micro l de solution de glycérine tamponnée au phosphate 0,1 M de pH 7,6 (ou un support similaire d'un pH d'au moins 7,6) sur chaque puits et recouvrir d'une lamelle couvre-objets (appendice 2).
   5.2.11. Examiner avec un microscope équipé d'une source lumineuse épifluorescente et de filtres adaptés pour travailler avec le FITC. Un grossissement de 400 à 1 000 fois est approprié. Balayer chaque puits selon deux diamètres perpendiculaires et en suivant le pourtour.
   Rechercher les cellules fluorescentes dans les témoins positifs et titrer. Rechercher les cellules fluorescentes dans le contrôle tampon FITC et, s'il n'y en a pas, passer aux puits échantillons. Déterminer sur un minimum de dix champs microscopiques le nombre moyen de cellules fluorescentes morphologiquement typiques par champ et calculer le nombre de ces cellules par millilitre d'extrait concentré non dilué (appendice 4).
   Il existe un certain nombre de problèmes inhérents aux tests d'immunofluorescence :
   - des populations de bactéries saprophytes peuvent montrer des cellules fluorescentes morphologiquement atypiques et provoquer des réactions croisées. D'autres peuvent être similaires par la taille et la morphologie au C. m. subsp. sepedonicus. Seules les cellules fluorescentes dont la taille et la morphologie sont typiques doivent être prises en considération.
   En raison de la possibilité de réactions croisées, les échantillons réagissant positivement au test d'immunofluorescence devraient être une nouvelle fois soumis au test, avec un antisérum différent.
   - la limite technique de détection de cette méthode se situe entre 103 et 104 cellules par millilitre d'extrait concentré non dilué. Les échantillons pour lesquels le décompte de cellules fluorescentes typiques est à la limite de détection sont généralement indemnes de C. m. subsp. sepedonicus mais peuvent être soumis au test sur aubergines.
   Le test d'immunofluorescence est négatif pour tous les échantillons dans lesquels on n'a trouvé aucune cellule fluorescente morphologiquement typique. On considère que ces échantillons ne sont "pas contaminés" par le C. m. subsp. sepedonicus.
   Il n'est pas nécessaire de les soumettre au test sur aubergines.    Le test d'immunofluorescence est positif pour tous les échantillons dans lesquels des cellules fluorescentes morphologiquement typiques sont décelées.
   On considère que les échantillons pour lesquels le test d'immunofluorescence est positif avec les deux antisérums sont "potentiellement contaminés" par le C. m.subsp. sepedonicus.
   Il est nécessaire d'effectuer un test sur aubergines pour tout échantillon considéré comme potentiellement contaminé.