В мае 1670 года, со смертью великого герцога Фердинандо II, Маргарита Луиза стала Великой герцогиней Тосканы.
Став великим герцогом Тосканы после смерти своего отца в 1670 году, Козимо III, находясь под властью своей матери, Виттории делла Ровере, отказал Маргарите Луизе в допуске в Тайный совет. Таким образом, не имея политического влияния, Маргарита Луиза распределяла образование своего старшего сына, великого принца Фердинандо.