לאחר שהוכיחו כי אנזימים יכולים לתפקד מחוץ לתא חי, הצעד הבא היה לקבוע את הטבע הביוכימי שלהם. עובדים מוקדמים רבים ציינו כי פעילות אנזימית הייתה קשורה לחלבונים, אך מספר מדענים (כמו זוכה פרס נובל ריצ'רד ווילסטטר) טענו כי חלבונים היו רק נושאים עבור האנזימים האמיתיים וכי חלבונים עצמם אינם מסוגלים לקטליזה. עם זאת, בשנת 1926, ג'יימס ב. סאמנר הראה כי האנזים אוראזה היה חלבון טהור וקרסטליז אותו; סאמנר עשה אותו הדבר עבור האנזים קטלאז בשנת 1937. המסקנה כי חלבונים טהורים יכולים להיות אנזימים הוכחה באופן סופי על ידי נורת'רופ וסטנלי, שעבדו על האנזימים העיכוליים פפססין (1930), טריפססין וכימוטריפססין. שלושת המדענים הללו זכו בפרס נובל בכימיה בשנת 1946. גילוי זה הוביל את דיוויד פיליפס, שיכול להיות קרי
פרס נובל בכימיה