הנוקלייזים הם אנזימים החותכים את חוטי הדנ"א על ידי קיטליזת ההידרוליז של קשרים פוספודיאסטר. נוקליאזים החותכים את הניוקלייוטידים מהקצוות של חוטי הדנ"א נקראים אקסונוקלייזים, בעוד שאנדונוקלייזים חותכים בתוך חוטים. נוקליאזים המשמשים לעתים קרובות ביותר בביולוגיה מולקולרית הם אנדונוקלייזים מגבילים, החותכים את הדנ"א ברצף ספציפי. לדוגמה, האנזים EcoRV המוצג משמאל מזהה את רצף 6 הבסיסים 5′-GATC-3′ ועושה חתך בקו האופקי. בטבע, אנזימים אלה מגינים על חיידקים מפני זיהום פאג על ידי עיבוד הדנ"א הפאג כאשר הוא נכנס לתא הבקטריאלי, כחלק ממערכת הגבלה. בטכנולוגיה, נוקליאזים ספציפיים אלה משמשים לקיצוב מולקולרי של הדנ"א ולקלונ
רצף 6 בסיסים 5′-GATATC-3